Raimondas Raudonis EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS – POKOLONĖLINĖS REAKCIJOS METODO VYSTYMAS ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMUI

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMACINĖS CHEMIJOS IR FARMAKOGNOZIJOS

KATEDRA

Raimondas Raudonis

EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS –

POKOLONĖLINĖS REAKCIJOS METODO VYSTYMAS

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO NUSTATYMUI

Magistro darbas

Darbo vadovas:

Doc. Dr. Valdas Jakštas

Kaunas 2008

TURINYS

SANTRUMPOS ...3

ĮVADAS ...4

1. LITERATŪROS APŢVALGA ...7

1.1. Efektyvioji skystinė chromatografija ...7

1.1.1. Efektyviosios skystinės chromatografijos raida ...7

1.1.2. Efektyviosios skystinės chromatografijos analizės principai ...8

1.1.3. Efektyviosios skystinės chromatografijos tyrimo objektai ...14

1.2. Antioksidantai ir jų tyrimas ...15

1.3. Pokolonėlinės reakcijos metodas antioksidantinio aktyvumo įvertinimui ...17

1.4. Literatūros apţvalgos apibendrinimas ...18

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ...19

2.1. Naudoti reagentai ...19

2.2. Naudota aparatūra ...19

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...22

3.1. Tiesioginio ESC-DPPH metodo vystymas ir optimizavimas ...22

3.1.1. Buferio parinkimas ...22

3.1.2. DPPH* tirpalo koncentracijos parinkimas ...23

3.1.3. DPPH* tirpalo tėkmės greičio optimizavimas ...24

3.1.4. Galutinio DPPH* tirpalo standartizavimas off-line ...25

3.2. Tiesioginio ESC-DPPH metodo įteisinimas ...26

3.2.1. Metodo pakartojamumas, atkuriamumas ir minimali nustatymo koncentracija ...26

3.2.2. Trolokso kalibracinė kreivė ...27

3.3. Pokolonėlinės reakcijos metodų taikymas ...28

3.3.1. Gudobelės vaistinės augalinės ţaliavos antioksidantinio aktyvumo tyrimas ...28

3.3.2. Raudonėlio vaistinės augalinės ţaliavos antioksidantinio aktyvumo tyrimas ...32

3.3.3. Kraujaţolės vaistinės augalinės ţaliavos antioksidantinio aktyvumo tyrimas ...36

3.4. Rezultatų apibendrinimas ...41

SANTRUMPOS

ABTS azinobisetilbenzotiazolinsulfo rūgšties katijonas (angl. 2,2„-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid).

ACN acetonitrilas.

DPPH difenilpikrilhidrazilo radikalas (angl. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl).

ESC efektyvioji skysčių chromatografija (angl. HPLC – high performance liquid chromatography).

TFA trifluoracto rūgštis (angl. trifluoracetic acid).

S/N analitės smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis chromatogramoje. MNK minimali nustatymo koncentracija.

Rs skiriamoji geba.

RSD santykinis standartinis nuokrypis (procentinis imties kitimo koeficientas, angl. relative standard deviation).

NF normalių fazių chromatografija. AF atvirkščių fazių chromatografija. N teorinių lėkštelių skaičius.

E etaloninio standarto trolokso kiekio ekvivalentas pasirinktam junginiui. A etaloninio standarto trolokso kiekio ekvivalentas ţaliavos kiekiui.

UV/DPPH sujungta UV skirstymo chromatograma (275 nm viršutinė) su DPPH radikalų išblukinimo chromatograma (520 nm apatinė).

ĮVADAS

Didėjanti aplinkos tarša, ultravioletiniai spinduliai, ţalingi įpročiai, neracionali mityba bei stresas sukelia ţmogaus sveikatai kenksmingų veiksnių. Vienas veiksnių: ypatingų molekulių – laisvųjų radikalų kiekio padidėjimas organizme sukeliantis oksidacinį stresą. Atlikta daug mokslinių tyrimų apie laisvųjų radikalų vaidmenį įvairiuose (pato)fiziologiniuose procesuose, ypač tokiuose kaip ligų vystymasis, senėjimas [1, 2]. Laisvieji radikalai ţaloja kraujagysles ir širdį, sukelia ląstelės DNR mutacijas, kurios ateityje gali tapti vėţio prieţastimi [3]. Nepaisant medicinos laimėjimų, sergamumas vėţiu, širdies ir kraujagyslių ligomis nuolat auga tiek Lietuvoje, tiek pasaulyje. Mirtingumas nuo šių ligų kurį laiką išlieka pirmoje vietoje. Kitais moksliniais tyrimais įrodyta, kad laisvieji radikalai yra viena pagrindinių organizmo senėjimo prieţasčių. Laisvieji radikalai atakuoja genetinės medţiagos dalis, vadinamas telomeromis, jos trumpėja ir ląstelė sensta. Senstant organizmo ląstelėms – sensta ir visas organizmas [2]. Minėtos prieţastys skatina ieškoti efektyvių junginių – antioksidantų, kurie maţintų ţalingą laisvųjų radikalų poveikį.

Antioksidantai – tai medţiagos, gebančios inaktyvuoti laisvuosius radikalus. Pastaruoju metu didėja dėmesys natūralios kilmės antioksidantams, kadangi sintetinių antioksidantų saugumo klausimas iki šiol lieka neišspręstas [4]. Daugiausia dėmesio skiriama antioksidantų paieškai ir įvertinimui augalinės kilmės vaistinėse ir maistinėse ţaliavose [5]. Mokslinių tyrimų objektais yra daugybė augalų, jų ekstraktų, maisto produktų ir vaistinių preparatų. Didelių apimčių tiriamųjų darbų našumas ir informatyvumas, be abejonės, priklauso nuo pasirinktų metodų tinkamumo, jautrumo ir efektyvumo.

Antioksidantiniam aktyvumui įvertinti daţnai taikomi etaloniniai stabilūs laisvieji radikalai: DPPH*, arba difenilpikrilhidrazilo (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) radikalas ir ABTS*+, kitaip azinobisetilbenzotiazolinsulfo rūgšties (2,2„-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) katijonas [5, 6]. Minėtų radikalų aktyvumo maţėjimas nustatomas fotokolorimetriniu metodu. Fotokolorimetrinis metodas nėra pakankamai atrankus, todėl, siekiant palyginti atskirų veikliųjų bandinio junginių aktyvumą, būtinas junginių gryninimas arba kitoks medţiagų atskyrimo metodas. Aktyvių junginių ar jų grupių gryninimas iš augalinės kilmės bandinių yra daug laiko, intensyvaus darbo reikalaujantis ir brangus sprendimas. Be to, taikant išskyrimo ir valymo procedūras, dėl antioksidantiškai aktyvių junginių suirimo (ar struktūrinės transformacijos) ir nepilnos išeigos netenkama dalies pradinio antioksidantinio aktyvumo [7]. Siekiant išvengti anksčiau minėtų

aktyvumą būtų galima tiesiogiai nustatyti tiriamajame bandinyje, kartu išlaikant proporcijas, būdingas tiriamai ţaliavai ar preparatui. Pastaruoju metu vystomi kombinuoti tiesioginio nustatymo metodai, kurių didţiausi privalumai yra atrankumas, trumpa analizės trukmė ir didelis jautrumas tiksliam aktyvumo nustatymui ir palyginimui. Tokiems metodams naudojamas tiriamųjų junginių skirstymas efektyviąja skystine chromatografija (ESC) kartu su pokolonėline reakcija. Pokolonėlinei reakcijai naudojami DPPH* ir ABTS*+ radikalai, išlaikant paplitusio fotokolorimetrinio metodo principą [5]. Tiesioginiai pokolonėliniai metodai taikomi greitam antioksidantų identifikavimui, aktyvumo nustatymui ir palyginimui yra ypač informatyvūs ir turi esminių pranašumų, lyginant su kolorimetriniais metodais [7].

Magistro diplominiame darbe „Efektyviosios skysčių chromatografijos – pokolonėlinės reakcijos metodo vystymas antioksidantinio aktyvumo nustatymui“ aprašomas tiesioginio pokolonėlinio metodo vystymas, optimizavimas, įteisinimas ir pritaikymas analičių antioksidantiniam įvertinimui, naudojant DPPH*

laisvuosius radikalus. Antioksidantinio aktyvumo standartizavimui naudojamas etaloninis antioksidantas troloksas ((R)-6-Methoxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid). Apskaičiuojamas trolokso aktyvumo ekvivalentas individualiam junginiui, tiriamai augalinei ţaliavai ir farmaciniam preparatui.

Darbo tikslas – sukurti ir išvystyti naują metodiką, taikant efektyviąją skysčių chromatografiją kartu su tiesiogine pokolonėline reakcija ir pritaikyti šią metodiką ţinomų ir neţinomų laisvuosius radikalus surišančių junginių, esančių vaistinėje augalinėje ţaliavoje, antioksidantinio aktyvumo nustatymui.

Norint įvykdyti numatytą tikslą, bei gauti išsamias ir teisingas išvadas, iškelti sekantys uţdaviniai:

1. Įvertinti galimybę taikyti pokolonėlinę reakciją vaistinių augalinių ţaliavų ir farmacinių preparatų antioksidantinio aktyvumo tyrimams.

2. Sukurti pokolonėlinės reakcijos metodiką.

3. Atlikti tyrimus metodikos optimizavimui, sistemos tinkamumo įvertinimui ir įteisinimui. 4. Ištirti ir įvertinti vienapiestės gudobelės (Crataegus monogyna) vaistinės augalinės ţaliavos bioaktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą.

5. Įvertinti paprastosios kraujaţolės (Achillea millefolium) vaistinės augalinės ţaliavos biologiškai aktyvių junginių – flavonoidų – antioksidantinį aktyvumą.

6. Atlikti tyrimus paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare) vaistinės augalinės ţaliavos flavonoidų antioksidantiniam įvertinimui.

Tiesioginis pokolonėlinis metodas antioksidantiniam aktyvumo nustatymui su DPPH* ir ABTS*+ laisvaisiais radikalais yra inovatyvus metodas augalinės kilmės antiradikalinių junginių tyrimams. Moksliniuose šaltiniuose nepateikta išsamių duomenų apie metodikų sąlygas, bei metodikų įteisinimo procedūras.

Sukurtas metodas yra informatyvus, paprastas, greitas, atrankus ir jautrus. Jis suteikia galimybę efektyviau ieškoti naujų originalių antioksidantų augalinės kilmės bandiniuose. Metodas nereikalauja išskirtinos aparatūros, sudėtingo bandinio ruošimo ir yra prieinamas daugumai laboratorijų ir mokslo įstaigų.

Diplominį darbą sudaro įvadas, literatūros apţvalga, eksperimentinė dalis, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas. Eksperimentiniai tyrimai atlikti 2006 – 2008 m. Kauno medicinos universiteto Farmacinės chemijos ir farmakognozijos katedros laboratorijoje.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Efektyvioji skystinė chromatografija

1.1.1. Efektyviosios skystinės chromatografijos raida

1901 metais rusų biologas Tswett„as studijuodamas augalų lapų pigmentų adsorbciją, pasiūlė atrankų adsorbcinės chromatografijos metodą. Vėliau, 1903 metais, jis pristatė savo tyrimų rezultatus, gautus panaudojant 100 skirtingų sorbentų. Tswett„as suprato adsorbcijos reiškinio ir sukurto metodo svarbą skirstant panašios struktūros ir savybių junginius tiek analizuojant, tiek valant juos preparatiniais tikslais. Jis skirstė spalvotus junginius, todėl šį metodą pavadino chromatografija (liet. spalvų raštas), nors ir suprato, jog šiuo metodu galėtų būti atskirti ir bespalviai junginiai. Šį atradimą 1931 metais iš naujo panaudojo Khun, Winterstein ir Lederer. Jie išplėtojo klasikinį kolonėlinės skysčių chromatografijos metodą. Klasikinei kolonėlinei skysčių chromatografijai atlikti daţniausiai naudojamos stiklinės kolonėlės, pripildytos didelių nejudrios fazės dalelių. Tokių kolonėlių skersmuo siekia kelis centimetrus. Judri fazė leidţiama per kolonėlę naudojant hidrostatinį slėgį arba ţemo slėgio siurblius. Pasiekiama maţa skiriamoji geba, o skirstymo trukmė labai ilga. Visų šių mokslininkų dėka adsorbcinė chromatografija suvaidino ypatingą vaidmenį vystant karotenoidų, augalų lapų flavonų ir kitų natūralių daţų chemiją. Ji buvo panaudota ir bespalvių junginių – steroidų atskyrimui [8, 9].

Plečiantis pritaikymo galimybėms įvairiose srityse, susidomėjimas skystine chromatografija nuolat augo. Metodas tobulėjo, didėjo skiriamoji geba, trumpėjo analizės trukmė, visai tai šį metodą darė patrauklesnį. 1970 metais buvo pasiūlyta nauja sąvoka efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), siekiant išskirti šį modernų metodą iš klasikinės kolonėlinės skysčių chromatografijos metodų, išplėtotų XX amţiaus 4-ajame dešimtmetyje [8, 10]. Moderniai efektyviajai skysčių chromatografijai naudojamos trumpos (5-15 cm) kelių milimetrų vidinio skesmens plieninės kolonėlės, pripildytos labai maţų (3-5 µm) nejudrios fazės granulių. Dėl maţų absorbento dalelių susidariusiam hidrodinaminiam pasipriešinimui įveikti naudojamas didelio slėgio siurblys, kuris per kolonėlę pompuoja judrią fazę. ESC kolonėlėse linijinis tėkmės greitis yra apie 100 kartų didesnis nei stiklinėse kolonėlėse, todėl skirstymas yra daug greitesnis, o analizės trukmė trumpesnė. Maţas absorbento dalelių skersmuo lemia daug efektyvesnį atskyrimą.

1.1.2. Efektyviosios skystinės chromatografijos analizės principai

Chromatografinė analizė sudaryta iš trijų atskirų dalių: analičių mišinio įleidimas, skirstymas ir detekcija. Kiekviena dalis turi savų ypatumų.

Analičių mišinio įleidimas. Bandinio įleidimas yra vienas iš kritiškiausių efektyviosios skystinės chromatografijos aspektų. Jei bandinys yra įleistas netinkamai, netgi turint puikią chromatografinę kolonėlę, skirstymo rezultatas bus nepatenkinamas. Yra keletas analičių mišinio įleidimo būdų: 1) sustabdţius judrios fazės srautą; 2) naudojant mikrošvirkštą ir praduriamąją pertvarą; 3) naudojant vienaeigį voţtuvą. 4) kilpinio injektoriaus pagalba; 5) autoinjektoriaus pagalba [8].

Judrios fazės srauto stabdymas yra gana komplikuotas būdas įleisti bandinį į sistemą, kadangi tam kaskart reiktų išardyti jungtį tarp siurblio ir kolonėlės. Daţnas jungties ardymas maţina jos sandarumą, bei didina tikimybę, kad į sistemą paklius oro, ištekėjus daliai judrios fazės. Sustabdţius siurblius neįmanoma akimirksniu pasiekti darbinį slėgį, todėl chromatografinės analizės pradţioje judrios fazės debitas būna maţesnis nei analizės metu. Tuomet sunku įvertinti analičių sulaikymo faktorius bei pasiekti gerą rezultatų atkuriamumą. Dėl šių prieţasčių efektyviojoje skysčių chromatografijoje naudojami injektoriai, nestabdantys judrios fazės tėkmės.

Praduriamosios pertvaros injektoriai plačiai naudojami dujų chromatografijoje, tačiau juos sunku pritaikyti efektyviajai skysčių chromatografijai dėl pernelyg didelio slėgio.

Vienaeigio vožtuvo injektorius savo konstrukcija primena praduriamosios pertvaros injektorių. Šis injektorius taip pat nesulaukė didelio dėmesio, kadangi nestabdant judrios fazės srauto, bandinys praskiedţiamas, todėl sumaţėja skirstymo efektyvumas izokratinėmis chromatografijos sąlygomis.

Kilpiniai injektoriai yra plačiausiai naudojami efektyviajai skysčių chromatografijai. Patį paprasčiausią kilpinį injektorių sudaro šešių kanalų statorius su pasukamu rotoriumi. Du priešingose pusėse esantys kanalai sujungiami fiksuoto tūrio kapiliarine kilpa, kurios tūris gali svyruoti nuo nanolitrų (nl) iki šimtų mikrolitrų (µl). Vienoje kilpos kanalus jungiančios įstriţainės pusėje yra lizdas švirkšto adatai bei kanalas, kuriuo išteka atliekos. Kitoje pusėje jungiama kolonėlė ir aukšto slėgio siurblys. Kilpos pripildymo metu rotorius pasukamas taip, kad kilpa atsiskirtų nuo slėgio grandinės, t.y. siurblys tiesiogiai tiektų judrią fazę į kolonėlę. Tuo pat metu švirkšto adatos lizdas sujungiamas su vienu kilpos galu, o kitas kilpos galas susijungia su kanalu, skirtu atliekoms ištekėti. Mikrošvirkštu į kilpą įleidţiamas bandinys. Po to pasukama injektoriaus rankenėlė iki injekcijos padėties ir rotorius sujungia siurblį su kilpos galu, iki tol jungusiu atliekų atšaką, o kilpos galas, pro

o bandinys, nestabdant judrios fazės srauto, patenka į kolonėlę. Ši sujungimo seka yra svarbi, siekiant įleisti bandinį kuo arčiau kolonėlės pradţios.

Naudojant kilpinius injektorius galimi du injekcijos reţimai:

1. Pilnas kilpos pripildymas. Atjungus aukšto slėgio siurblį nuo kolonėlės, kilpoje lieka judrios fazės, kuri gali praskiesti bandinį. Siekiant pilnai uţpildyti kilpą, reikia įšvirkšti 20% daugiau bandinio, nei kilpos tūris. Tuomet kilpoje esančio bandinio koncentracija praktiškai nesumaţėja, nes tirpiklis ir bandinio perteklius pašalinami į atliekas. Šis pripildymo būdas yra patogus atliekant kiekybinę analizę ar sudarant kalibracinius grafikus. Kadangi kilpos tūris yra fiksuotas, jis nekinta įleidţiant skirtingos koncentracijos bandinius ir nepriklauso nuo paklaidos, kuriai turi įtakos operatorius.

2. Dalinis kilpos pripildymas. Šis reţimas pasirenkamas, kai siekiama įleisti maţesnius bandinio kiekius ir sunku jį tiksliai praskiesti. Tada bandinio tūris matuojamas mikrošvirkštu. Tokios injekcijos paklaidos yra daug didesnės.

Kilpos pasirinkimas priklauso nuo chromatografinės kolonėlės dydţio. Paprastai į analizinę efektyviosios skysčių chromatografijos kolonėlę injekuojama iki 20 µl bandinio.

Autoinjektoriuose naudojami kilpiniai injektoriai, panašūs į rankinius injektorius. Tačiau juose kilpos uţpildymas bandiniu vykdomas automatiškai. Autoinjektoriai leidţia pilnai automatizuoti chromatografinę analizę, sumaţinti analizės paklaidas ir padidinti rezultatų atkuriamumą, nes eliminuojamos operatoriaus daromos klaidos [8, 10].

Skirstymas. Chromatografinėje analizėje svarbiausias yra skirstymo procesas. Mišinio komponentų atskyrimas ESC vyksta analitinėje kolonėlėje, kuri daţniausiai gaminama iš nerūdijančio plieno vamzdelio. Uţpildoma sorbento įkrova, kurią prilaiko du pralaidūs filtrai, įtvirtinti kolonėlės galuose. Populiariausias sorbentas ESC yra silikagelis, kuris gali būti chemiškai modifikuotas arba nemodifikuotas. Silikagelis gaunamas iš šarminių metalų silicio rūgšties druskų, veikiant jas stipriomis rūgštimis.

Chromatografinės analizės metu analitės eliuuojamos išilgai kolonėlės pastoviu greičiu. Atskirtos komponentės vėliau nustatomos detektoriumi, paţymint grafike koncentracijos priklausomybę nuo eliucijos trukmės, kuri vadinama chromatograma. Išskirstyti junginiai chromatogramoje atsispindi Gauso pavidalo chromatogramos smailėse. Eliucijos trukmė ties tokios smailės viršūne yra vadinama sulaikymo trukme (tR). Sulaikymo laikas reikalingas sulaikymo faktoriaus (k„) (1 pav.a) apskaičiavimui, kuris apibūdina fazių sistemą, kai medţiagų koncentracijos atitinka tarpfazinio pasiskirstymo izotermos tiesinę dalį, ir jokia funkcine priklausomybe nėra

susijęs su sorbcine nejudrios fazės geba. Atskiriamojo mišinio komponentų santykinį sulaikymą kolonėlėje nusako atrankumas (α) (1 pav.b). Kuo didesnė alfa reikšmė, tuo labiau atsiskyrusios analičių smailės chromatogramoje, geresnis atrankumas. Chromatografinės smailės plotis ties pagrindu (wb) parodo skirtingų analitės molekulių sulaikymo nuokrypą nuo vidurkio. Tai svarbu vertinant efektyvumą. Efektyvumas (1 pav.c) chromatografijoje išreiškiamas teorinių lėkštelių skaičiumi N arba lėkštelės aukščiu H, kuris yra atvirkščiai proporcingas lėkštelių skaičiui: H=L/N, kur L – kolonėlės ilgis. Kuo didesnis N ar maţesnis H, tuo didesnis kolonėlės efektyvumas, maţesnis medţiagų išsklaidymas kolonėlėje ir siauresnė smailė [11].

Skirstymo proceso kokybę ar atskyrimo laipsnį geriausiai atspindi skiriamoji geba (Rs), kuri susieja visus parametrus turinčius įtakos chromatografiniam procesui: sulaikymo faktorių, atrankumą ir efektyvumą [12].

a) b) c)

1 pav. Chromatografinio skirstymo parametrai. a) – sulaikymo faktorius, b) – atrankumas, c) –

efektyvumas.

ESC analičių skirstymui taikomi du chromatografijos reţimai, kurie tarpusavyje skiriasi santykiniu judrios ir nejudrios fazės poliškumu:

1. normalių fazių (NF) chromatografija. 2. atvirkščių fazių (AF) chromatografija.

Normalių fazių chromatografija. NF sistemoje nejudri fazė yra labiau polinė nei judri fazė. Klasikinis nejudrios fazės pavyzdys normalių fazių chromatografijoje yra nemodifikuotas silikagelis. Jo paviršiuje esančios hidroksilo grupės (silanolinės) atlieka aktyvių centrų vaidmenį. Šių polinių centrų sąveika su polinėmis bandinio molekulių sritimis yra svarbiausias veiksnys, lemiantis skirstymą. Daţniausiai naudojamos heptano, heksano, chloroformo judrios fazės ir įvairūs jų mišiniai. NF chromatografijoje junginiai yra eliuuojami didėjančio poliškumo tvarka.

Silikagelis yra higroskopinė medţiaga. Laisvos hidroksilo grupės gali adsorbuoti vandeniliniais ryšiais vandenį, kuris dezaktyvuoja paviršių ir pakeičia jo sąveika su analitėmis. Tai

įtakoja rezultatų pakartojamumą. Dėl šios prieţasties dabar vis plačiau naudojamos polinės chemiškai prijungtos fazės.

NF chromatografijoje pasiekiamas aukštas atrankumas, skirstant padėties izomerus. Tai svarbu molekuliniam atpaţinimui ir daţnai taikoma skirstant enantiomerus.

Atvirkščių fazių chromatografija. AF sistemoje nejudri fazė yra maţiau polinė negu judri fazė. Tipiškos nejudrios fazės atvirkščių fazių chromatografijoje yra silikagelio fazės su chemiškai prijungtais angliavandenilių ligandais. Kai alifatinė grandinė yra 18 anglies atomų ilgio, įkrova yra vadinama tiesiog C18, RP18 arba oktadecilsilano (ODS). Chemiškai modifikuotos nejudrios fazės gaunamos alifatinių grandinių silanų ir silikagelio paviršiaus cheminės reakcijos metu, kurios tikslas yra vienodas monomolekulinis sluoksnis. Cheminėms reakcijoms naudojami įvairūs silanų tipai. Silanai charakterizuojami kaip mono-, di- ar trifunkciniai, atsiţvelgiant į grupių, galinčių reaguoti su silikagelio paviršiumi, skaičių. Naudojant daugiafunkcinius silanus galima pasiekti didesnį ligandų tankį ir storesnį prijungtos dangos sluoksnį. Tačiau tuomet kyla problemų su jų sintezės ir savybių atkuriamumu. Todėl visos naujai sukuriamos C18 atvirkščių fazių įkrovos paprastai yra monofunkcinės. Būtina paminėti, kad vienodai paţymėti chemiškai modifikuoti silikageliai (pvz.: C18), priklausomai nuo naudojamos silikagelio matricos rūšies ir prigimties, gamybos proceso, prijungtų funkcinių grupių išsidėstymo labai skiriasi atrankumo ir sulaikymo atţvilgiu. Neretai susiduriama su keblumais pasirenkant konkrečiam skirstymui reikalingą kolonėlę.

Skirstymo mechanizmas pagrįstas nejudrios fazės nepolinių angliavandenilinių grandinių sąveika su nepolinėmis bandinio molekulių sritimis. Labiausiai polinės analitės yra eliuuojamos pirmos. Kaip eliuentai AF chromatografijoje daţniausiai naudojami metanolis, acetonitrilas ir jo mišiniai su vandeniu.

AF ESC yra paprastesnis ir universalesnis metodas lyginant su NF ESC. Šis metodas suteikia unikalią galimybę atlikti gradientinę eliuciją, kurią sunku atlikti NF chromatografijos reţimu. Taip pat AF chromatografijos metodas gali būti nesunkiai automatizuojamas. Šios rūšies chromatografija ypač tinka homologinių eilių bei junginių su skirtingo išsišakojimo pakaitais skirstymui. Galima atskirti ir junginius su nevienodu nesočių jungčių skaičiumi bei aromatinius junginius. AF chromatografija naudojama ne tik maţamolekuliniams junginiams, tokiems kaip organinės rūgštys, flavonoidai, procianidinai, antocianai, steroidai, alkaloidai, bet ir stambiamolekuliniams junginiams, tokiems kaip peptidiniai hormonai (pvz.: insulinas), baltymai ir nukleorūgštys, skirstyti. Farmacijoje, biochemijoje ir klinikinėje analizėje beveik 90% visų chromatografinių skirstymų atliekami naudojant chemiškai prijungtus atvirkščių fazių sorbentus [8, 12].

Detekcija. Kartu su eliuentu ištekėjusios iš kolonėlės išskirstytos analitės patenka į detektorių. Detektorius nustato judrios fazės sudėtį ir paverčia ją elektriniu signalu, kurį perduoda į registruojantįjį įrenginį (savirašį ar kompiuterį). Fiksuojamas rezultatas, kaip atsilenkimas nuo bazinės linijos. ESC naudojami koncentracijai jautrūs detektoriai su pratekančiomis kiuvetėmis. Kadangi signalas registruojamas nuolat, jo funkcija uţrašoma atsiţvelgiant į trukmę. Detektorius generuoja signalą, kuris chromatogramoje atitinka smailės plotą, proporcingą injektuotam analitės kiekiui. Šios detektoriaus savybės atspindi jo esminį vaidmenį nustatant mišinio kokybinę sudėtį (chromatografinių smailių eliucijos eiliškumą ir būdingas sulaikymo trukmes) ir kiekybinę sudėtį (chromatografinių smailių plotus).

Detektoriai vertinami remiantis šiais kriterijais: jautris, atrankumas, triukšmo lygis, trukmės konstanta, matavimo intervalas, kiuvetės tūris.

Detektoriaus jautris yra nusakomas signalo pokyčiu pakitus analitės koncentracijai vienu vienetu. Maţiausia analitės koncentracija, kurios sukeltas signalas yra 2 ar 3 kartus didesnis uţ triukšmo lygį, vadinama aptikimo riba. Šis parametras yra labai svarbus, kadangi nustato lygmenį, ţemiau kurio metodas būtų netinkamas duotos analitės įvertinimui. Aptikimo riba priklauso nuo naudojamo detektoriaus ir chromatografijos sąlygų (pvz.: netinkamai pasirinktas UV detektoriaus bangos ilgis). Kiekybinei analizei reikalingo signalo-triukšmo santykis turi būti 7 arba 10 (vieni autoriai teigia, kad uţtenka 7, kiti mano, kad santykis turi siekti 10). Analitės koncentracija, kurios generuojamas signalas atitinka šį santykį, vadinama nustatymo riba [12, 13].

Detektoriaus atrankumas – tai skirtingas jo jautris įvairioms mišinio analitėms. Pagal atrankumą detektoriai gali būti skirstomi į atrankiuosius ir universaliuosius. Universalieji detektoriai reaguoja į bendrąsias tirpalo savybes, kurių pokytį lemia bet kurios analitės. Universalaus detektoriaus pavyzdys yra lūţio rodiklio detektorius, kuris nustato pratekančio eliuato lūţio rodiklį. Judri fazė turi nuolatinį lūţio rodiklį, kuris kinta, kai eliuuojamas bet koks bandinio komponentas. Todėl aptinkamos ir registruojamos visos smailės. Universalūs detektoriai netinka gradientiniam metodui, kadangi keičiasi eliuentų sudėtis ir tai gali įtakoti analičių smailes. Atrankaus detektoriaus pavyzdys būtų UV detektorius, kuris nustato medţiagas pasiţyminčias UV šviesos absorbcija.

Bazinė linija nėra absoliučiai pastovi. Pastebimi jos kitimai net tada, kai nėra eliuuojamos chromatografinės smailės. Ne analičių sukelti bazinės linijos virpesiai yra vadinami triukšmu, o triukšmo lygis išreiškiamas šių virpesių amplitude. Triukšmą lemia keletas prieţasčių. Trumpalaikis (didelio daţnio) triukšmas atsiranda netinkamai įţeminus detektorių arba dėl signalo elektroninio stiprintuvo darbo. Ilgalaikį (ţemo daţnio) triukšmą lemia judrios fazės savybės: burbulai,

nešvarumai, nujudrios fazės dalelės, tėkmės greičio ir slėgio kitimai. Staigūs aplinkos temperatūros pokyčiai taip pat gali turėti įtakos ilgalaikiam triukšmui.

Detektoriaus trukmės konstanta parodo kaip greitai detektorius gali registruoti smailę. Trukmės konstanta gali būti apibrėţta kaip minimali trukmė, reikalinga pasiekti reikšmę, artimą registravimo amplitudei. Ši trukmė ESC turėtų būti ne ilgesnė kaip 0,3 s. Modernūs detektoriai leidţia patiems pasirinkti trukmės konstantos reikšmes. Labai maţos trukmės konstantos padidina detektoriaus triukšmo lygį. Todėl svarbu pasirinkti optimalią trukmės konstantą.

Teoriškai detektorius generuoja signalą, kuris chromatogramoje atitinka smailės plotą, proporcingą injektuotam analitės kiekiui. Tačiau šios priklausomybės tiesinis pobūdis nėra begalinis, nors ir stengiamasi, kad jis būtų kiek įmanoma platesnis. Yra dviejų tipų matavimo intervalai – tiesinis ir dinaminis. Tiesinis matavimo intervalas yra analitės koncentracijų sritis, kurioje detektoriaus signalo priklausomybė nuo analitės koncentracijos yra tiesinė. Dinaminis matavimo intervalas aprėpia koncentracijų sritį, kurioje signalas kinta priklausomai nuo koncentracijos nebūtinai tiesiškai. Pavydţiui, UV detektoriaus santykinės intervalo ribos atitinka 1:10000, t.y. viršutinė detekcijos riba 5×10-4

g/ml atitinka minimalią tiesinio matavimo intervalo ribą 5×10-8

g/ml.

Pratekančios kiuvetės tūris neturi daryti esminės įtakos chromatografinės smailės išsiplėtimui. Analizinei ESC pasirenkamų kiuvečių tūriai yra apie 5-8 µl. Per maţa kiuvetė sumaţina jautrį, nes signalui generuoti reikalingas atitinkamas analitės kiekis. Kiuvečių vidus turi būti aptakus, kad nesusidarytų eliuentų ir analičių sąstovis. Taip pat iš tokių kiuvečių lengviau pašalinti patekusius burbulus.

ESC naudojami įvairūs detektoriai (UV absorbciniai, fluorescenciniai, elektrocheminiai, lūţio rodiklio, radioaktyvumo ir kt.), kurie tarpusavyje skiriasi atrankumu, jautrumu.

Populiariausi ESC yra UV absorbciniai detektoriai. Juose naudojama prataki kiuvetė, kuria teka judri fazė. Per kiuvetėje esančią judrią fazę praleidţiama UV ar matomos šviesos spinduliuotė. Šio tipo detektoriai yra atrankūs, kadangi reaguoja tik į tas analites, kurios sugeria UV ar matomos šviesos spinduliuotę, t.y. turi chromoforus.

Išskiriami šie UV-matomos šviesos detektorių tipai: fiksuoto bangos ilgio, reguliuojamo bangos ilgio, skenuojantieji ir diodų matricos detektoriai.

Fiksuoto bangos ilgio detektoriuose naudojama ţemo slėgio gyvsidabrio garų lempa turinti 254 nm spinduliuotės maksimumą. Šios lempos spektro linija yra labai intensyvi ir siaura, kas lemia platų linijinį matavimo intervalą. Šie detektoriai iš visų UV detektorių išsiskiria didţiausiu jautrumu. Jie naudojami nustatyti organinius junginius su aromatinėmis grupėmis. Keičiant šių detektorių

interferencinius filtrus, galima naudoti kitas gyvsidabrio spinduliuotės linijas, pavyzdţiui, 280 nm arba net 436 nm. Pagrindinis trūkumas – ribota galimybė atlikti detekciją įvairiose spektro srityse.

Reguliuojamo bangos ilgio detektoriuose šviesos šaltinis yra deuterio arba volframo siūlelio lempos. Šie detektoriai gali būti naudojami šviesos spektro srityje nuo 190 iki 700 nm. Juose įmontuoti monochromatoriai, kurie leidţia pasirinkti norimą bangos ilgį. Daţniausiai monochromatoriuose naudojamos pasukamosios difrakcinės gardelės. Šių detektorių pritaikymo galimybės platesnės.

Skenuojantieji UV detektoriai yra panašūs į reguliuojamo bangos ilgio detektorius, tačiau juose difrakcinės gardelės mechaninė pavara per nustatytą trukmę pasuka gardelę ir grąţina atgal per pratekančią kiuvetę, periodiškai praleisdama šviesos spektrą. Tokiu būdu fotodiodas, esantis uţ kiuvetės, fiksuoja analitės spektrą. Šiuose detektoriuose kaip šviesos šaltinis gali būti naudojama aukšto slėgio gyvsidabrio lempa, deuterio lempa arba ksenono lempa. Bangos ilgių intervalas – 190-800 nm. Skenuojantieji detektoriai yra naudingi dėl jų teikiamos kokybinės informacijos, t.y. išskirstytų analičių UV-matomos šviesos spektrų. Tačiau dėl detalių judėjimo neišvengiama spektrų matavimo netikslumų, patys spektrai uţrašomi palyginti lėtai.

Diodų matricos UV detektoriuose pašalinti skenuojančiųjų detektorių esminiai trūkumai. Diodų matricos detektoriuose per kiuvetę leidţiama polichromatinė spinduliuotė, kurią išsklaido nejudanti difrakcinė gardelė. Išsklaidyta šviesa krenta į fotodiodų eilę. Kiekvienas diodas matuoja siaurą spektro juostos dalį. Visi spektro taškai matuojami vienu metu. Tokiu būdu ţymiai pagreitinamas duomenų (spektrų) uţrašymas. Kadangi konstrukcijoje nėra judančių dalių, sumaţinamos paklaidos. Diodų matricos detektoriais galima nustatyti kiekvienos chromatografinės smailės spektrą. Gautieji spektrai gali būti palyginti su etaloninių junginių spektrais ir tokiu būdu galima identifikuoti medţiagas. Taip pat šiais detektoriais paprasta nustatyti chromatografinių smailių grynumą. Diodų matricos detektoriai suteikia galimybę registruoti tridimensines chromatogramas, paţymint vienoje ašyje laiką, kitoje bangos ilgį, o trečioje – absorbciją. Taigi, šie detektoriai yra informatyvūs ir gana plačiai taikomi [8, 12, 13].

1.1.3. Efektyviosios skystinės chromatografijos tyrimo objektai

ESC tyrimo objektais daţniausiai pasirenkami nelakūs, labai poliški ir joniniai, didelės molekulinės masės bei termiškai neatsparūs junginiai. Tokiems junginiams galime priskirti ir polifenolius (flavonoidus, antocianus, procianidinus).

Flavonoidų nustatymui tiriamajame tirpale ESC metodu daţnai naudojamas gradientinis skirstymas. Taikoma atvirkštinių fazių chromatografija (C18 kolonėlė). Eliuavimui daţniausiai naudojamas vanduo ir acetonitrilas, kartais ir metanolis. Atskyrimo pagerinimui į eliuentus pridedama skruzdţių rūgšties, acto rūgšties, TFA (trifluoracto rūgštis) ar fosfatinių buferių [13]. Paskutiniu metu manoma, jog TFA labiau tinka flavonoidams atskirti nei fosforo, skruzdţių ar acto rūgštys [14]. Flavonoidų detekcijai daţniausia naudojami spektrofotometriniai UV ar diodų matricos detektoriai. Bangos ilgis pasirenkamas 340-370 nm intervale, daţniausiai naudojamas 360 nm [15].

1.2. Antioksidantai ir jų tyrimas

Antioksidantai – tai junginiai, neutralizuojantys laisvuosius radikalus, susikaupusius organizme. Antioksidantams priskiriamos šios medţiagos: vitaminai (E, C), karotenoidai (β karotinas), fermentai (superoksido dismutazė), kofermentai (koenzimas Q₁₀). Antioksidantams priskiriami ir kiti biologiškai aktyvūs augalinės kilmės junginiai, pvz.: flavonoidai, antocianai, procianidinai [16]. Ţmonės, kurių kraujo plazmoje antioksidantų yra sumaţėję, daţniau serga širdies ir kraujagyslių ligomis bei vėţiu. Antioksidantai labai svarbūs ţmonėms kenčiantiems nuo ţalingų aplinkos ir vidinių veiksnių, pvz.: oro uţterštumas, neracionali gyvensena, lėtinės ligos, senatvė, ultravioletiniai spinduliai, dėl kurių poveikio sumaţinamas antioksidantinis fermentų aktyvumas odoje ir padidinama rizika susirgti odos vėţiu, ţalojama imuninė sistema. Antioksidantai padeda išvengti kraujo krešulių ir uţdegimo [17, 18].

Antioksidantai būna dvejopi: organizme gaminami vidinių antioksidantinių sistemų komponentai ir gaunami iš išorės vartojant maistą, vaistinius preparatus. Organizme gaminami antioksidantai yra labai svarbūs. Pavyzdţiui, organizmo gaminama antioksidantinė medţiaga metionino reduktazė padeda nugalėti ypatingai pavojingus laisvuosius radikalus sukuriamus radiacijos metu. Tam, kad organizmui netrūktų medţiagų, reikalingų antioksidantų gamybai, reikia vartoti maistą, kuriame gausu vitaminų. Pagrindiniai antioksidantai, kuriuos ţmogus turi gauti su maistu yra beta karotinas, vitaminai C ir E, flavonoidai, antocianai bei selenas. Papildomas antioksidantų vartojimas sumaţina sergamumą ir mirštamumą nuo širdies ir kraujagyslių bei piktybinių ligų. Vitaminų, antioksidantų bei antioksidantinėmis savybėmis pasiţyminčių junginių nepatartina vartoti profilaktikai grynų labai didelėmis dozėmis ilgą laiką, nes galima organizmo intoksikacija. Imuninės sistemos veiklai sustiprinti ţmogaus mityboje papildomas ypač grynų antioksidantinių medţiagų vartojimas turėtų būti individualus. Jis priklauso nuo organizme esančių jų atsargų ir veikimo sąlygų [16, 17, 18].

Vaistiniuose ir kosmetiniuose preparatuose, maiste bei maisto papilduose esančius augalinės kilmės antioksidantus būtina įvertinti. Chemometrinis įvertinimas atspindi junginio ar junginių grupės kiekį produkte, tačiau neatspindi antioksidantinio aktyvumo, kuris yra svarbiausia šių junginių savybė. Antioksidantinis aktyvumas – tai medţiagos gebėjimas sustabdyti kitų junginių oksidacinės degradacijos procesus. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimui sukurta grupė metodų, kurie išsamiai aprašyti įvairiuose literatūros šaltiniuose[18, 19].

Naudojamus metodus augalinės kilmės junginių antioksidantinio aktyvumo ivertinimui galima suskirstyti į keletą grupių [20, 21]:

1. Metodai pagrįsti netiesioginiu lipidų peroksidacijos slopinimo įvertinimu.

2. Tiesioginis R-fikoeritrino fluorescencijos įvertinimas. Laisvieji radikalai ardo R-fikoeritriną ir taip slopina jo fluorescenciją. Nustatomas antioksidantų gebėjimas slopinti R-fikoeritrino degradaciją.

3. Superoksido anijono radikalų sujungimo gebėjimo įvertinimas. Šis spektrofotometrinis metodas pagrįstas fermentinėje ksantino oksidazės sistemoje susidariusių superoksido anijono radikalų reakcija su nitro ţydruoju tetrazolo indikatoriumi. Pagal redukuoto indikatoriaus mėlynos spalvos intensyvumą sprenţiama apie reakcijos tirpale esančių augalinės kilmės junginių gebėjimą sujungti superoksido anijono radikalus.

4. Vandenilio peroksido sujungimo gebėjimo įvertinimas. Metodas pagrįstas vandenilio peroksido šviesos absorbcijos matavimu prie 230 nm bangos ilgio. Pagal liekamąją absorbciją sprendţiama apie reakcijos tirpale esančių augalinės kilmės junginių aktyvumą sujungiant vandenilio peroksidą.

5. β-karotino blukinimo testas. Linoleno rūgšties oksidacijos metu emulsijoje susidarę reakcijos produktai oksiduoja karotiną. Pagal liekamąją reagento absorbciją nustatytas nesusioksidavusio β-karotino kiekis ir kartu į reakcijos mišinį pridetų augalinės kilmės junginių aktyvumas.

6. Augalinės kilmės junginių antiradikaliniam aktyvumo įvertintimui daţnai naudojami modeliniai DPPH* (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radikalo ir ABTS+* (2,2‟-azinobis(3-ethylbenzothiaziline-6-sulfonate) radikalo katijono sujungimo metodai. Šių metodų esmė yra spektrofotometrinis reakcijos tirpalo spalvos pokyčio matavimas, redukuojantis DPPH*

ar ABTS+* (t. y. reaguojant su antioksidantais, galinčiais atiduoti protoną). Ekstraktų aktyvumas išreiškiamas DPPH* (510-520 nm) ar ABTS+* (600–750 nm) tirpalų optinio tankio sumaţėjimu.

Flavonoidų ir kitų junginių antioksidantiniam aktyvumui įvertinti daţnai gali būti pasirenkami santykiniai vienetai, nustatant ekvivalentišką antioksidantinę galią. Duomenys gali būti

perskaičiuojami tam tikro etaloninio antioksidanto kiekiu ir atitinkamu jo stiprumu, pvz.: α-tokoferolio ar trolokso. Junginių aktyvumas taip pat gali būti palygintas su plačiai ţinomo gamtinio antioksidanto – rozmarino rūgšties – aktyvumu.

1.3. Pokolonėlinės reakcijos metodas antioksidantinio aktyvumo įvertinimui

Antioksidantų cheminiams tyrimams galima panaudoti nemodifikuotą ir modifikuotą efektyviąją skysčių chromatografiją.

Nemodifikuoti metodai – tai specifinių detektorių panaudojimas. Junginiams, gebantiems oksiduotis ar redukuotis, tirti gali būti naudojami elektrocheminiai detektoriai. Kai kurie mokslininkai antioksidantinį aktyvumą ESC metodu atlieka po detekcijos surinkdami iš chromatografinės sistemos išeinančias bandinio frakcijas ir antioksidantinį aktyvumą frakcijose matuodami spektrofotometriniais metodais. Toks metodas reikalauja daug darbo sąnaudų ir todėl nėra perspektyvus.

Siekiant išsiaiškinti atskirų junginių, esančių ekstraktuose, antioksidantinį poveikį, sukurta įvairių metodikų ir aparatūros sistemų. Modifikuoti ESC metodai įgalina efektyviai ir paprastai įvertinti atskirų flavonoidų ir kitų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą chromatografiškai skirstant vaistinių ţaliavų etanolines ištraukas. Metodai ypač perspektyvūs, nes tiesioginis antioksidantinio aktyvumo nustatymas patikimai ir tiksliai gali nurodyti aktyviausią komponentą, kurio išskyrimui ir tolesniam tyrimui reikia kreipti didţiausią dėmesį.

Modifikuotas ESC metodas, pagrįstas pokolonėline reakcija reaktoriuje, esančiame uţ detektoriaus, daţnai naudojamas vaistinės augalinės ţaliavos junginių antiradikalinio aktyvumo įvertinimui. Po chromatografinio ekstraktų junginių išskirstymo ir aptikimo UV ar kitu detektoriumi, papildomu siurbliu įvedamas DPPH* ar ABTS+* radikalo tirpalas į tekantį eliuentą. Abu tirpalai patenka į tuščiavidurio vamzdelio reaktorių, kuriame susimaišo. Reaktorius uţtikrina reikiamą sulaikymo laiką reakcijai įvykti. Jeigu eliuente esantys išskirstyti ekstrakto junginiai redukuoja laisvus DPPH* ar ABTS+* radikalus, keičiasi eliuento spalva ir kartu maţėja jo absorbcija. Toks pakitimas nustatytomas papildomu matomos šviesos detektoriumi ir chromatogramoje uţrašomas kaip neigiamos smailės. Tokių metodų pavyzdys yra tiesioginis ESC-ABTS metodas pritaikytas stambiašaknio snapučio vandeninių ištraukų tyrimui. Chromatografinis stambiašaknio snapučio junginių antioksidantinio aktyvumo (radikalų redukcijos) vaizdas pateiktas 2 pav. Neigiamos smailės chromatogramoje parodo aktyvius, su ABTS+*

2 pav. Antioksidantiškai aktyvių junginių aptikimas stambiašaknio snapučio vandeninėje

ištraukoje ESC-ABTS metodu. Viršutinė chromatograma – UV signalas (254 nm), apatinė chromatograma – ABTS+* redukcijos signalas (734 nm).

1.4. Literatūros apţvalgos apibendrinimas

Neabejotinai didţiausia dalis biologiškai aktyvių junginių analizių atliekama naudojant atvirkščių fazių efektyviąją skysčių chromatografiją. Šiam metodui būdinga didelė skiriamoji geba, didelis efektyvumas, geras atrankumas ir rezultatų atkuriamumas. Biologiškai aktyvių junginių nustatymui daţniau naudojamas gradientinis skirstymas, nei izokratinis. Praktiniam darbui paprastai naudojami UV absorbciniai detektoriai.

Antioksidantai – medţiagos, neutralizuojančios laisvuosius radikalus, susikaupusius organizme. Itin plačiai tyrinėjama augalinės kilmės antioksidantų įtaka apsauginių ląstelių savybių stiprinimui, įvairių ligų profilaktikai. Augalinės kilmės junginių antiradikalinio aktyvumo įvertintimui daţnai naudojami modeliniai DPPH*

radikalo ir ABTS+* radikalo katijono sujungimo metodai. Kitų junginių antioksidantiniam aktyvumui įvertinti daţnai pasirenkami santykiniai vienetai, nustatant ekvivalentišką antioksidantinę galią pagal etaloninį antioksidantą. Modifikuoti ESC metodai įgalina efektyviai ir paprastai įvertinti atskirų flavonoidų ir kitų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą chromatografiškai skirstant vaistinių augalinių ţaliavų etanolines ištraukas. Minėtų metodų vystymas, tobulinimas ir įteisinimas atima daug laiko ir lėšų, tačiau yra keletas labai svarbių prieţasčių diegti šiuos tyrimo metodus: 1) metodai gali įvertinti ne tik aktyvių junginių grupę, o ir atskirus veikliuosius junginius, kurie ir apsprendţia antioksidantinį efektą; 2) daţnai augalinėje ţaliavoje yra keletas stiprių ar reikšmingų antioksidantų, kuriuos svarbu įvertinti.

2. EKSPERIMENTINĖ DALIS

2.1. Naudoti reagentai

Naudoti analitinio švarumo eliuentai. Gradientinio švarumo acetonitrilas (ACN) įsigytas iš „Sigma-Aldrich GmbH“ (Buchs, Šveicarija), 99,8% trifluoracto rūgštis (TFA) iš „Riedel-de-Haen“ (Vokietija). Išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΩcm-1_{) ruošiamas „Millipore“ (JAV) vandens} valymo sistema. Prieš naudojimą eliuentai degazuojami.

DPPH* (95%) laisvasis radikalas gautas iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija); apigeninas, apigenin-7-gliukozidas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, epikatechinas, rutinas, kvercetinas, liuteolinas, liuteolin-7-gliukozidas, liuteolin-3„,7-digliukozidas ir viceninas-2 gauti iš „Roth“ (Vokietija); troloksas (97%) iš “Acros organics” (New Jersey, USA); etanolis (reaktifikuotas spiritas 96,3%) iš „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva); natrio citratas ir citrinos rūgštis iš „Fluka Chemie“ (Buchs, Šveicarija).

2.2. Naudota aparatūra

Pokolonėlinės aparatūros sistemos schema tiesioginiam laisvuosius radikalus surišančių junginių nustatymui pavaizduota 3 pav. Eliucijos gradiento formavimui naudotas chromatografas „Beckman solvent module 126“ (Fullerton, JAV). Chromatografinis skirstymas atliekamas judrios fazės tėkmės greičiui esant 0,4 ml/min. Eliucijos gradiento komponentas A – 0,1% TFA vandeninis tirpalas, komponentas B – 0,1% TFA tirpalas ACN. Taikytas tiesinis gradiento kitimas: 0 min. – 95% A ir 5% B; 45 min. – 55% A ir 45% B; 50 min. – 55% A ir 45% B; 55 min. – 95% A ir 5% B; 60 min. – 95% A ir 5% B. Bandiniams injektuoti naudojamas kilpinis injektorius su 20 µl injekcijos kilpa. Analitės skirstomos „X-Terra“ RP18 (Waters) analitinėje kolonėlėje (3,5 µm, 3,0×150 mm), prieškolonėle naudojant „X-Terra“ RP18 (3,5 µm, 3,0×20 mm, Waters). Išskirstyti junginiai nustatomi UV absorbciniu detektoriumi „Beckman System Gold 166“ (Fullerton, JAV) bangos ilgiui esant 275 nm. Iš detektoriaus judri fazė su išskirstytais junginiais per maišymo trišakį patenka į reakcijos kilpą, į ją taip pat tiekiamas DPPH*

reagento tirpalas. DPPH* tirpalo tiekimui naudojamas ESC siurblys „Gilson pump 305“ (Middleton, JAV). Tirpalo tėkmės greitis – 0,4 ml/min. Reakcijos kilpa pagaminta iš 3 m ilgio, 0,25 mm vidinio ir 0,36 mm išorinio diametro PEEK (polietereterketoninio) vamzdelio. Reakcijos kilpa sujungta su UV/Vis tipo detektoriumi „Gilson UV/Vis detector 118“ (Middleton, JAV), kuriuo matuojama pratekančio tirpalo absorbcija prie 520

3 pav . P okolonėlinė a pa ra tūros si stema ti es iogi niam laisvuosi us ra dikalus surišanč ių j ungini ų nust atym ui .

nm bangos ilgio. Gauti duomenys apdorojami ir aparatūra valdoma dviem kompiuteriais, naudojant originalias programines įrangas „System Gold“ (Beckman) ir „Unipoint“ (Gilson).

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Tiesioginio ESC-DPPH metodo vystymas ir optimizavimas

3.1.1. Buferio parinkimas

Augalinio antioksidanto reakcijos su DPPH* radikalu kinetikai įtakos turi terpės pH. Koleva ir kt. [23] paţymi, jog labai svarbu išlaikyti terpės pH tarp 5,0 ir 6,5, nes tai yra optimalios sąlygos vykti vandenilio elektronų atidavimo reakcijai. Atliekant gradientinį analičių skirstymą, terpės pH gali svyruoti. Svyravimai turi neigiamą įtaką chromatogramos bazinės linijos stabilumui, o kartu ir S/N (analitės smailės aukščio santykiui su bazinės linijos triukšmu) santykiui. Bazinės linijos nepastovumas įvardijamas kaip pagrindinė problema ESC-DPPH analizėje [7].

Pasirinkto gradiento eliuentų pH <2,3. Esant maţoms terpės pH reikšmėms maţėja DPPH* tirpalo absorbcija [23]. Padidinti reaguojančio mišinio pH reakcijos kilpoje įmanoma tik pridedant buferio į DPPH*

reagento tirpalą.

Buvo išbandyta fosfatinio buferio (Na2HPO4) sistema, kurią pasiūlė A. Dapkevičius ir kt. [24]. DPPH* kristalai ištirpinti ACN ir pridėta 0,03 M natrio hidrofosfato buferio tirpalo santykiu 1:2, pH 7,6. Gradientinės analizės metu, sumaţėjus vandeninės fazės procentui, reakcijos kilpoje ima formuotis natrio hidrofosfato kristalai, kurie didina bazinės linijos nepastovumą. Susikaupę hidrofosfato kristalai gali uţkimšti reakcijos kilpą. Nuspręsta fosfatinio bufero atsisakyti. A. Pukalskas ir kt. [25] savo straipsnyje aprašė amonio acetato buferio panaudojimą DPPH* tirpalui. Eksperimentui buvo pagamintas DPPH* tirpalas ACN ir pridėta 0,005 M amonio acetato (CH3COONH4) buferio tirpalo santykiu 1:2, pH 7,4. Naudojant amonio acetato buferį, reakcijos kilpoje kristalai nesusiformavo, tačiau nepavyko stabilizuoti chromatogramos bazinės linijos. Todėl amonio acetato buferio taip pat atsisakyta.

Naudojant natrio citrato – citrinos rūgšties buferį, kurį savo publikacijose aprašė M. Kosar ir kt. [4, 7], reakcijos kilpoje kristalai nesiformavo. Chromatogramos bazinė linija stabili. Nuspręsta optimalaus terpės pH išlaikymui taikyti citratinį buferį. Buferio talpos padidinimui, nuspręsta naudoti dvigubai didesnę natrio citrato koncentraciją, nei siūlo M. Kosar. Galutiniam metodui ruošiamas 0,1 M natrio citrato buferis, kurio pH koreguojamas 0,05 M citrinos rūgšties tirpalu (iki pH 7,6). Buferio tirpalas maišomas su DPPH*

reagento tirpalu acetonitrile. DPPH* tirpinamas ACN, nes ACN yra vienas judrios fazės komponentų. Abu tirpalai (buferio ir ragento) maišomi santykiu

1:1. Santykis pasirinktas siekiant išlaikyti pakankamą DPPH*

tirpumą judrioje fazėje gradientinio skirstymo metu.

3.1.2. DPPH* tirpalo koncentracijos parinkimas

Siekiant kiekybiškai įvertinti antioksidantinį aktyvumą, labai svarbu pasirinkti optimalią DPPH* tirpalo koncentraciją. Nustatyta, jog didinant DPPH* tirpalo koncentraciją, didėja aktyvaus junginio smailės plotas chromatogramoje. Ši priklausomybė pavaizduota 4 pav. Chlorogeno rūgšties, hiperozido ir kvercetino kreivių pobūdis panašus. Didţiausias smailės plotas pasiekiamas esant 0,02-0,03 mg/ml DPPH* tirpalo koncentracijai ir toliau didinant koncentraciją, nebedidėja ar didėja neţymiai (kvercetino kreivė). Trolokso kreivė „linksta“ esant 0,03-0,04 mg/ml DPPH* koncentracijai.

4 pav. Standartų smailės ploto priklausomybė nuo DPPH* tirpalo koncentracijos.

Etaloniniai junginiai: chlorogeno rūgštis 0,04 mg/ml; hiperozidas – 0,02675 mg/ml; troloksas – 0,04 mg/ml; kvercetinas – 0,025 mg/ml. Injektuotas tūris – 20 µl. λ=520 nm.

5 pav. Bazinės linijos triukšmo priklausomybė nuo DPPH tirpalo koncentracijos.

Etaloniniai junginiai: chlorogeno rūgštis 0,04 mg/ml; hiperozidas – 0,02675 mg/ml; troloksas – 0,04 mg/ml; kvercetinas – 0,025 mg/ml. Injektuotas tūris – 20 µl. λ=520 nm.

Didinant DPPH* tirpalo koncentraciją, kartu didėja ir bazinės linijos triukšmas (pavaizduota 5

pav.). Chromatogramos bazinės linijos nestabilumas gali turėti neigiamos įtakos kiekybinio

įvertinimo tikslumui bei minimaliai aktyvaus junginio nustatymo koncentracijai.

Nuspręsta, jog augalinės kilmės bandinių tyrimui labiausiai tinkama DPPH*

tirpalo koncentracija 0,02-0,03 mg/ml. Esant tokiai koncentracijai, chlorogeno rūgšties, hiperozido ir kvercetino (augalinių antioksidantų) smailių plotai yra didţiausi. Naudojant 0,02 mg/ml koncentraciją, bazinės linijos triukšmas yra maţesnis nei naudojant 0,03 mg/ml tirpalą, todėl tolesniems eksperimentams pasirinktas 0,02 mg/ml DPPH* tirpalas.

3.1.3. DPPH* tirpalo tėkmės greičio optimizavimas

Augalinio antioksidanto reakcijos kinetika su DPPH* radikalu yra skirtinga [26]. Vieni antioksidantai pasiţymi greita reakcijos kinetika, kiti – ţenkliai lėtesne. D.Bandonienė ir kt. [26] spektrofotometriškai nustatė, kad daugelio augalinių antioksidantų optimalus reakcijos su DPPH* radikalu laikas yra 30-40 s. Mūsų pasirinktame metode naudojama fiksuoto ilgio (3 m) reakcijos kilpa. Tokio ilgio pakanka išlaikyti reakcijos mišinį kilpoje minėtą laiką.

DPPH* tirpalo tiekimo į pokolonėlę greitis tiesiogiai lemia antioksidanto ir DPPH* reagento buvimo reakcijos kilpoje trukmę, o tai turi įtakos chromatogramos bazinės linijos triukšmui ir analitės smailės aukščiui bei plotui. Todėl, norint kiekybiškai įvertinti antioksidantų aktyvumą, būtina pasirinkti optimalų DPPH*

tirpalo tiekimo į pokolonėlę greitį.

6 pav. Smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykio (S/N) priklausomybė nuo DPPH*

tirpalo tėkmės greičio.

Etaloniniai junginiai: chlorogeno rūgštis 0,01 mg/ml; hiperozidas – 0,004 mg/ml; troloksas – 0,001 mg/ml; kvercetinas – 0,002 mg/ml. Injektuotas tūris – 20 µl. λ=520 nm.

Šiam eksperimentui pasirinktos nedidelės ţinomų junginių koncentracijos, kad būtų galima kuo tiksliau įvertinti DPPH*

tirpalo tiekimo į pokolonėlę greičio įtaką chromatogramos bazinės linijos triukšmui ir analitės smailės aukščiui (6 pav.). Didinant DPPH*

tirpalo tėkmės greitį, maţėja chromatogramos bazinės linijos triukšmas bei analitės smailės aukštis ir atvikščiai, maţinant tėkmės greitį – didėja triukšmas ir smailės aukštis.

Nuspręsta, kad kiekybiniam antioksidantų įvertinimui geriausia taikyti 0,4-0,6 ml/min DPPH* tirpalo tėkmės greitį. Taupant DPPH*

reagentą, tolimesniems tyrimams pasirinktas 0,4 ml/min DPPH* tirpalo tėkmės greitis.

3.1.4. Galutinio DPPH* tirpalo standartizavimas off-line

DPPH* tirpalui (0,02 mg/ml) pagaminti sveriami labai maţi DPPH kristalų kiekiai, kurie tirpinami tam tikrame ACN tūryje ir pridedamas tam tikras tūris buferio. Todėl kiekvieną kartą,

gaminant švieţų reagento tirpalą, galimos tam tikros paklaidos, kurios gali iškreipti kiekybinį antioksidantinio aktyvumo įvertinimą. To galima išvengti, antliekant galutinio DPPH tirpalo standartizavimą prieš kiekvieną tyrimų seriją. Standartizavimas atliekamas netiesioginiu (off-line) metodu, naudojant spektrofotometrą „Beckman“ (Fullerton, JAV) ir 10 mm kvarcinę kiuvetę. Bangos ilgis λ=520 nm. 0,02 mg/ml koncentracijos DPPH*

tirpalo optinis tankis koreguojamas iki 0,5 ± 0,005 AV (absorbcijos vienetų).

3.2. Tiesioginio ESC-DPPH metodo įteisinimas

3.2.1. Metodo pakartojamumas, atkuriamumas ir minimali nustatymo koncentracija Literatūroje trūksta duomenų apie pokolonėlinės reakcijos metodo įteisinimo kriterijus, kartu nėra vieningų įteisinimo įverčių. Pokolonėlinė reakcija tam tikra prasme yra ESC metodo tąsa. Jos metu skirstymas nevyksta, į reaktorių patenka jau išskirstytos analitės, todėl pokolonėlinio metodo įteisinimui nereikia taikyti pagrindinių ESC skirstymo parametrų (sulaikymo trukmės RSD%, efektyvumo, skiriamosios gebos). ESC skirstymo metodas turi būti įteisintas atskirai. Šiame darbe tiesioginio ESC-DPPH metodo įteisinimas atliktas vertinant DPPH chromatogramos neigiamų smailių plotus. Pasirinkti keli metodo įteisinimo kriterijai: metodo pakartojamumas ir atkuriamumas, minimali nustatymo koncentracija, kalibracinės kreivės lygtis ir koreliacijos koeficientas (R2). Būtent minėti kriterijai ir atspindi kritinius kiekybinio vertinimo taškus.

Metodo pakartojamumas ir atkuriamumas nustatytas analizuojant etanolinį (70%) etaloninių junginių tirpalą (7 pav.) (chlorogeno rūgštis 0,04 mg/ml; hiperozidas 0,027 mg/ml; troloksas 0,04 mg/ml; kvercetinas 0,025 mg/ml). Variacijos koeficientas (RSD%) paskaičiuotas atlikus 5 pakartotines injekcijas. Pakartojamumo (analizė po analizės „run to run“) RSD neviršija 0,76%, atkuriamumo (diena po dienos „day to day“) didţiausia RSD reikšmė 2,22% (1 lentelė). Taigi, gautas rezultatų glaudumas yra priimtinas ir galima atlikti kiekybinį junginių įvertinimą.

1 lentelė. Tiesioginio ESC-DPPH metodo pakartojamumo, atkuriamumo ir minimalios

nustatymo koncentracijos (MNK) reikšmės.

Standartas _{trukmė, min} Sulaikymo MNK, _µg/ml RSD, %

"Run to run" "Day to day"

Chlorogeno r. 15,50 10 0,76 1,33

Hiperozidas 27,03 4,3 0,65 1,55

Troloksas 35,52 1,0 0,61 2,22

Praskiedimo būdu nustatytos keleto etaloninių junginių minimalios nustatymo koncentracijos (MNK), kurias dar galima kiekybiškai įvertinti (S/N~7) (1 lentelė). Maţiausia MNK yra trolokso (1,0 µg/ml), didţiausia – chlorogeno rūgšties (10,0 µg/ml).

3.2.2. Trolokso kalibracinė kreivė

Vaistinių augalinių ţaliavų ekstraktuose ir farmaciniuose preparatuose esančių antioksidantiškai aktyvių junginių aktyvumas vertinamas pagal etaloninį antioksidantą – troloksą. Priklausomybė tarp trolokso kiekio (µg) ir jo suformuoto neigiamos smailės ploto koncentracijos intervale 0,001-0,07 mg/ml yra tiesinė (R2=0,997). Trolokso kalibracinė kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas parodyti 7 pav. Antioksidantiškai aktyvių junginių aktyvumo kiekybiniam įvertinimui skaičiuojamas trolokso ekvivalentas (ET). ET išreiškiamas trolokso kiekiu (µg), kuris tokiomis pat tyrimo sąlygomis formuoja atitinkamą laisvų DPPH*

radikalų surišimo aktyvumą, įvertintą pagal trolokso kalibracinę kreivę (y = ax + b).

7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė.

ET apskaičiuojamas pagal formulę:

ET = a

b S_jung.

, (µg)

čia Sjung. – antioksidantiškai aktyvaus junginio neigiamos smailės plotas DPPH chromatogramoje; a ir b – trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties (y=ax+b) reikšmės.

Antioksidantiškai aktyvių junginių aktyvumas augalinėje ţaliavoje įvertintas taikant antiradikalinio aktyvumo ekvivalentą (A). Viename augalinės ţaliavos masės kiekyje – grame - esančio pasirinkto junginio A išreiškiamas tokiu trolokso kiekiu (µg), kuris tokiomis pat tyrimo sąlygomis formuoja atitinkamą laisvų DPPH radikalų surišimo aktyvumą, įvertintą pagal trolokso kalibracinę kreivę, kaip ir pasirinktas junginys.

A= ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( g m ml V ml V g E žal ekst inj jung T , (µg/g)

čia ET(jung) – pasirinkto antioksidantiškai aktyvaus junginio trolokso kiekio ekvivalentas (µg); Vinj – injekuotas bandinio tūris (ml); Vekst – tiriamos augalinės ţaliavos ekstrakto kiekis (ml); mţal – tiriamos augalinės ţaliavos atsvertas (tikslus) kiekis.

3.3. Pokolonėlinės reakcijos metodų taikymas

3.3.1. Gudobelės vaistinės augalinės ţaliavos antioksidantinio aktyvumo tyrimas

Gudobelės vaistinė augalinė ţaliava, aprašoma daugelyje farmakopėjų (Europos, Didţiosos Britanijos, Vokietijos), yra gudobelių ţiedai ir lapai (Crateaegi folium cum flore) bei vaisiai (Crataegi fructus). Gudobelių preparatus rekomenduojama vartoti kaip širdį tonizuojančią priemonę, esant funkciniams širdies veiklos sutrikimams bei persirgus sunkiomis širdies veiklą sutrikdţiusiomis ligomis, padidėjus kraujospūdţiui. Europos šalyse vaistinė augalinė ţaliava daţniausia renkama nuo Crataegus monogyna Jacq., C. rhipidophylla ir C. laevigata. C. monogyna ţaliavose nustatyti įvairūs flavonoidai ir jų glikozidai: viteksinas, viteksin-2”-O-ramnozidas, izoviteksinas, orientinas, hiperozidas, rutinas, epikatechinas ir oligomeriniai procianidinai (katechino ir epikatechino įvairaus laipsnio polimerai). Literatūros šaltiniuose gausu duomenų apie flavonoidų (ir procianidinų) antioksidantines savybes [27]. Kardioprotekcinis flavonoidų veikimas siejamas ne tiks su vainikinių kraujagyslių spindţio didinimu, trombų formavimosi slopinimu, cholesterolio ir maţo tankio lipoproteinų koncentracijos kraujo plazmoje maţinimu bet ir minėtų junginių oksidacijos slopinimu, oksidacinio streso maţinimu kardiomiocituose [15].

Gudobelės vaistinė augalinė ţaliava (ţiedai ir lapai) susmulkinama elektrine smulkintuve. Atliekama maceracija 70 proc. etanoliu. Gauta etanolinė ištrauka filtruojama pro 0,22 μm porų dydţio membraninį filtrą ir naudojama analizei tiesioginiu ESC-DPPH metodu.

Atlikta etaloninių junginių tirpalo analizė (8 pav.). Nustatyta, kad chlorogeno rūgštis, hiperozidas ir kvercetinas, randami gudobelės vaistinėje augalinėje ţaliavoje, yra antioksidantiškai aktyvūs. Palyginimui į mišinį pridėta etaloninio antioksidanto trolokso, kuris formuoja didţiausią neigiamą smailę DPPH chromatogramoje.

8 pav. Etaloninių junginių UV/DPPH chromatograma.

1 – chlorogeno rūgštis (0,04 mg/ml); 2 – hiperozidas (0,027 mg/ml); 3 – troloksas (0,04 mg/ml); 4 – kvercetinas (0,025 mg/ml).

Ţiedų etanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma, gauta atlikus gudobelės ţieduose esančių bioaktyvių junginių tyrimą tiesioginiu ESC-DPPH metodu, pateikta 9 pav. UV chromatogramoje dominuoja hiperozido smailė, tačiau hiperozido antioksidantinis aktyvumas, vertinant pagal apskaičiuotą trolokso ekvivalentą, yra maţesnis nei chlorogeno rūgšties (2 lentelė). Chlorogeno rūgšties ET yra 2,2633 µg, hiperozido ET – 1,2973 µg.

9 pav. C. monogyna ţiedų etanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma.

2 lentelė. C. monogyna ţieduose esančių junginių antioksidantinio aktyvumo ekvivalentai.

Smailės Nr. chromatogramoje

Medţiagos pavadinimas

Sulaikymo

trukmė, min Smailės plotas E, µg A, µg/g

1 nežinoma 11,08 543130,50 0,7641 1857,55 2 nežinoma 12,65 152763,69 0,1954 474,91 3 nežinoma 13,85 929618,31 1,3272 3226,45 4 Chlorogeno r. 15,08 1572074,00 2,2633 5501,96 5 nežinoma 16,40 93651,83 0,1092 265,54 6 Epikatechinas 17,14 94529,11 0,1105 268,65 7 nežinoma 23,95 490308,38 0,6872 1670,46 8 Rutinas 25,87 101498,73 0,1207 293,34 9 Hiperozidas 26,83 909067,69 1,2973 3153,66 10 nežinoma 28,50 61341,23 0,0622 151,10 11 nežinoma 29,24 92753,63 0,1079 262,36 12 nežinoma 30,84 275392,62 0,3740 909,25 13 nežinoma 37,34 26283,78 0,0111 26,93 suma: 7,4301 18062,17

Gudobelės lapų etanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma pateikta 10 pav. Nustatyta, kad lapuose dominuojantis junginys viteksino ramnozidas nepasiţymi antiradikalinėmis savybėmis,

taikant tiesioginę ESC-DPPH metodiką. Visų antioksidantiškai aktyvių junginių trolokso ekvivalentai pateikti 3 lentelėje. Aktyviausiais antioksidantas gudobelės lapuose, kaip ir ţieduose, yra chlorogeno rūgštis (ET – 0,9445 µg).

10 pav. C. monogyna lapų etanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma.

3 lentelė. C. monogyna lapuose esančių junginių antioksidantinio aktyvumo ekvivalentai.

Smailės Nr. chromatogramoje

Medţiagos pavadinimas

Sulaikymo

trukmė, min Smailės plotas E, µg A, µg/g

1 nežinoma 8,65 114653,45 0,1398 302,33 2 nežinoma 9,85 154735,78 0,1982 428,59 3 nežinoma 13,55 59734,83 0,0598 129,33 4 nežinoma 14,74 458564,53 0,6409 1385,69 5 Chlorogeno r. 15,88 666903,94 0,9445 2041,99 6 Epikatechinas 17,07 98875,24 0,1168 252,62 7 Rutinas 26,21 127444,84 0,1585 342,62 8 Hiperozidas 27,24 311920,00 0,4272 923,74 9 nežinoma 28,10 61873,73 0,0629 136,07 10 nežinoma 29,62 80408,05 0,0899 194,45 11 nežinoma 31,18 219184,66 0,2921 631,61 suma: 3,1308 6769,05

Nustatytas suminis trolokso ekvivalentas gudobelės ţieduose – 7,43 µg, lapuose – 3,13 µg. Įvertinus tyrimų rezultatus galima teigti, kad vienas gramas susmulkintų sausų gudobelės ţiedų turi

tokį patį antiradikalinį aktyvumą kaip ir 18 mg etaloninio antioksidanto trolokso (2 lentelė), 1 g susmulkintų sausų gudobelės lapų atitinka 6,8 mg trolokso (3 lentelė).

Apibendrinant reikia paţymėti, kad gudobelės ţiedai pasiţymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu nei lapai. Ţiedų ţaliavoje svarbiausi antiradikaliniai junginiai yra chlorogeno rūgštis ir hiperozidas.

3.3.2. Raudonėlio vaistinės augalinės ţaliavos antioksidantinio aktyvumo tyrimas

Raudonėlio vaistinė augalinė ţaliava yra ţolė (Origani vulgaris herba). Paprastųjų raudonėlių preparatai pasiţymi antimikrobiniu, priešuţdegiminiu, raminamuoju ir skausmą maţinančiu veikimu. Skatina virškinimo ir bronchų liaukų sekreciją, didina ţarnyno peristaltiką, pakelia jo tonusą. Rekomenduojama vartoti nemigos, hipo- ir anacidinių gastritų, ţarnyno atonijos atvejais, lengvina atsikosėjimą (sergant bronchitu), ţadina apetitą [28]. O. vulgare augalinėje ţaliavoje nustatyta 14 fenolinių junginių: trys fenolkarboninės rūgštys (chlorogeno, kavos ir rozmarino) ir vienuolika flavonoidų (viteksinas, izoviteksinas, naringinas, rutinas, hiperozidas, astragalinas, eriodiktolis, liuteolinas, kvercetinas, naringeninas ir diosmetinas). Dominuojantis junginys yra rozmarino rūgštis, kuriam būdingas stiprus antioksidantinis aktyvumas [29]. Rozmarino rūgštis literatūros šaltiniuose minima kaip etaloninis junginys vertinant kitų antiradikalinių junginių aktyvumą.

Raudonėlio augalinės ţaliavos antioksidantinio aktyvumo tyrimui, taikant tiesioginę ESC-DPPH metodiką, buvo paruošti ţolės, lapų ir stiebų bandiniai. Išdţiovinta raudonėlio augalinė ţaliava (ţolė, lapai, stiebai) smulkinama elektriniu smulkintuvu. Susmulkinta ţaliava ekstrahuojama 70 proc. V/V etanoliu. Gautos etanolinės ištraukos filtruojamos pro 0,22 µm porų dydţio membraninį filtrą.

Raudonėlio lapai ir stiebai yra vaistinės augalinės ţaliavos sudedamosios dalys. Siekiant išsamių ţaliavos antioksidacinio aktyvumo tyrimų, tikslinga atskirai įvertinti lapų ir stiebų antiradikalinį aktyvumą.

Atlikus O. vulgare ţolės etanolinės ištraukos antioksidantinio aktyvumo tyrimus pagal tiesioginę ESC-DPPH metodiką, nustatyti du junginiai labiausiai įtakojantys ţaliavos antiradikalinį aktyvumą. Tai rozmarino rūgštis ir neţinomas junginys, kurio smailė UV/DPPH chromatogramoje paţymėta 2 numeriu (11 pav.). Ţolėje esančių junginių trolokso ekvivalentai pateikti 4 lentelėje. Pagal suminį trolokso ekvivalentą paskaičiuota, kad vienas gramas sausos raudonėlio ţolės atitinka

11 pav. O. vulgare ţolės etanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma.

4 lentelė. O. vulgare ţolėje esančių junginių antioksidantinio aktyvumo ekvivalentai.

Smailės Nr. Chromatogramoje

Medţiagos pavadinimas

Sulaikymo

trukmė, min Smailės plotas E, µg A, µg/g

1 nežinoma 10,07 185927,14 0,2437 1213,05 2 nežinoma 22,91 1349594,75 1,9391 9653,21 3 viteksinas 25,25 321897,62 0,4418 2199,26 4 rutinas 27,06 571311,49 0,8052 4008,27 5 hiperozidas 28,04 75511,98 0,0828 412,21 6 rozmarino r. 29,57 1402083,88 2,0156 10033,92 7 nežinoma 30,96 124611,75 0,1543 768,33 8 nežinoma 32,17 50798,95 0,0468 232,96 9 nežinoma 33,62 67791,07 0,0716 356,21 10 nežinoma 35,71 99061,89 0,1171 583,01 11 nežinoma 40,81 19474,79 0,0012 5,76 suma: 5,9192 29466,19

Raudonėlio lapų etanolinėje ištraukoje nustatyti tie patys antioksidantinį aktyvumą lemiantys junginiai, t.y. rozmarino rūgštis ir 2 numeriu chromatogramoje paţymėtas neţinomas junginys (12

pav.). Neţinomo junginio ir rozmarino rūgšties trolokso ekvivalentų įverčiai ţolės ir lapų

mėginiuose skiriasi neţymiai (4 ir 5 lentelės). Būtina paminėti, jog 4 ir 5 lentelėse nurodyti ekvivalentai ţaliavos kiekiui skiriasi, nes ţolės mėginio tyrimui naudotas dvigubai maţesnis injekcijos tūris (10 µl). Raudonėlio lapų augalinės ţaliavos antioksidantinį aktyvumą atspindi

trolokso ekvivalentas ţaliavos kiekiui (A), pagal kurį 1 gramas sausų lapų atitinka 15 mg gryno trolokso (5 lentelė).

12 pav. O. vulgare lapų etanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma.

5 lentelė. O. vulgare lapuose esančių junginių antioksidantinio aktyvumo ekvivalentai.

Smailės Nr. chromatogramoje Medţiagos pavadinimas Sulaikymo trukmė, min Smailės plotas E, µg A, µg/g 1 nežinoma 21,80 625604,44 0,8843 2204,54 2 nežinoma 23,03 1078805,25 1,5446 3850,71 3 viteksinas 25,36 69468,54 0,0740 184,48 4 nežinoma 25,96 94892,65 0,1110 276,83 5 rutinas 27,01 273483,53 0,3712 925,53 6 hiperozidas 28,13 439825,94 0,6136 1529,74 7 rozmarino r 29,64 1531188,88 2,2037 5493,91 8 nežinoma 34,43 18733,46 0,0501 90,19 9 nežinoma 35,74 135209,02 0,1698 423,27 10 nežinoma 40,71 22416,32 0,0054 13,57 suma: 5,9778 14992,78

Raudonėlio stiebų etanolinio ekstrakto UV/DPPH chromatogramoje (13 pav.) nustatyta, kad antioksidantiškai aktyviausias junginys yra rozmarino rūgštis (ET – 0,4123 µg). Remiantis 6

lentelėje pateiktais duomenis galima teigti, kad raudonėlio stiebų įtaka bendram vaistinės augalinės

13 pav. O. vulgare stiebų etanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma.

6 lentelė. O. vulgare stiebuose esančių junginių antioksidantinio aktyvumo ekvivalentai.

Smailės Nr. Chromatogramoje

Medţiagos pavadinimas

Sulaikymo

trukmė, min Smailės plotas E, µg A, µg/g

1 nežinoma 21,74 31717,28 0,0190 47,37 2 nežinoma 22,97 112937,02 0,1373 342,51 3 viteksinas 25,28 42421,90 0,0346 86,27 4 rutinas 26,99 64262,57 0,0664 165,64 5 hiperozidas 28,07 63612,33 0,0655 163,27 6 rozmarino r 29,53 301641,84 0,4123 1028,22 7 nežinoma 30,39 63598,28 0,0654 163,22 8 nežinoma 31,82 257239,62 0,3476 866,87 9 nežinoma 35,67 18817,37 0,0002 0,50 suma: 1,1483 2863,87

Apibendrinant tyrimų rezultatus, nustatyta, jog raudonėlio vaistinės augalinės ţaliavos antiradikalinį aktyvumą lemia rozmarino rūgštis. Taip pat nustatyta, kad bendrą raudonėlio ţolės antioksidantinį aktyvumą apsprendţia būtent lapuose esantys junginiai.