Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Patricija Girdauskaitė

Augalinių ekstraktų poveikis galvijų I tipo herpes

virusams

Antiviral effect of herbal extracts on bovine herpes

virus type 1

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: prof. dr. Algirdas Šalomskas

2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Augalinių ekstraktų poveikis galvijų I tipo herpes virusams“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Patricija Girdauskaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Algirdas Šalomskas

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Saulius Petkevičius

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.2 Galvijų herpes virusai ... 13

1.2.1 Sukelėjas ... 13

1.2.2 Paplitimas ir patogenezė ... 14

1.2.3 Virusas ir ląstelės ... 14

1.2.4 Sukeliamos ligos ir klinikiniai požymiai ... 14

1.2.5 Gydymas ir prevencija ... 15

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 17

2.1 Tyrimo etapai ... 20

2.2 Tyrime naudoti metodai ... 21

3. REZULTATAI ... 25

3.1 Augalinių ekstraktų poveikis GHV-1 ... 25

3.2 D. canadense ekstrakto skirtingų kiekių tyrimas ... 26

3.3 D. canadense ekstrakto poveikio laiko dinamikos tyrimas ... 26

3.4 D. canadense ekstrakto I, II ir III frakcijų tyrimas ... 27

3.5 D. canadense ekstrakto poveikis po užkrėtimo GHV-1... 29

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 31

IŠVADOS ... 34

REKOMENDACIJOS ... 35

PADĖKA ... 36

4 AUGALINIŲ EKSTRAKTŲ POVEIKIS GALVIJŲ I TIPO HERPES VIRUSAMS

Patricija Girdauskaitė Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Veterinarinėje medicinoje augalinių ekstraktų poveikio efektyvumas mažai žinomas. Augaliniai ekstraktai daugiausiai naudojami žmonių medicinoje. Literatūroje yra aprašomas tokių medžiagų poveikis prieš virusus, tačiau mažai informacijos apie augalų ekstraktų poveikį prieš galvijų herpes virusus. Medicinoje plačiau tyrinėtos kanadinės jakšūnės poveikio efektyvumas prieš galvijų I tipo herpes virusus iš viso nėra aprašytas. Todėl atlikto tyrimo tikslas buvo laboratoriniais metodais ištirti augalų ekstraktų poveikį gyvūninės kilmės ląstelėms ir galvijų pirmojo tipo herpes virusams, siekiant nustatyti prieš virusą veiksmingus augalinius ekstraktus.

Tyrimas atliktas LSMU VA Veterinarinės patobiologijos katedroje bei Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Buvo ištirta 16 augalinių ekstraktų, iš kurių kanadinės jakšūnės poveikis prieš galvijų I tipo herpes virusus analizuotas išsamiau, taip pat tirtos trys skirtingos šio ekstrakto frakcijos.

Tyrimo pradžioje buvo nustatyta kiekvieno augalinio ekstrakto citotoksinė koncentracija (CC50), naudojant MDBK ląstelių kultūrą ir MTT testą. Augalinių ekstraktų poveikis buvo vertinamas vizualiai, naudojant invertinį mikroskopą. Virusų titras buvo apskaičiuotas Kerberio metodu pagal audinių kultūrų infekcinių dozių (AKID50) kiekį. Taip pat buvo atliekamas realaus laiko PGR tyrimas.

Rezultatai parodė, kad iš visų tirtų augalinių ekstraktų ryškiausią poveikį prieš GHV-1 turėjo kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense) ekstraktas, o vidutinišku poveikiu pasižymėjo kalninio dašio (Saturea montana) ekstraktas ir paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare) ekstraktas. Kiti 13 ekstraktų nepasižymėjo efektyviu poveikiu prieš GHV-1.

5 ANTIVIRAL EFFECT OF HERBAL EXTRACTS ON BOVINE HERPES VIRUS TYPE 1

Patricija Girdauskaitė Master‘s Thesis

SUMMARY

The effectiveness of herbal extracts used in veterinary medicine is not well-known. Herbal extracts are mainly used in human medicine. The effects of such substances against viruses are described in literature, but there is very little information available on the effects of such extracts against the animal herpes viruses. The antiviral efficacy of the Desmodium canadense extract to bovine herpes virus type I (BoHV1) is not described at all. The aim of the study was to investigate the antiviral effect of plant extracts on bovine herpes virus.

The research was done at the Department of Veterinary Pathobiology of the Lithuanian University of Health Sciences and the Institute of Microbiology and Virology. Sixteen plant extracts were studied, from which the effect of Desmodium canadense on bovine herpes viruses type I was analyzed more detailed.

Before study the cytotoxic concentration (CC50) of each plant extract was determined using MDBK cell culture and MTT test. The effect of herbal extracts was assessed visually using an inverted microscope, tissue culture infective dose (TCID50) deterimination and the real time PCR techniques. TCID50 was estimated using the Spearman-Kaerber calculation method.

The results showed that from all investigated herbal extracts the Canadian tick-trefoil

(Desmodium canadense) hydroalcoholic extract had the most significant effect on BoHV-1. Saturea montana and Origanum vulgare extracts exhibited moderate antiviral effect. Other 13 extracts did

not show an efficient effect against BoHV-1.

6

SANTRUMPOS

VDU – Vytauto Didžiojo universitetas GHV-1 – galvijų I tipo herpes virusas GHV-2 – galvijų II tipo herpes virusas GHV-5 – galvijų V tipo herpes virusas HSV-1 – herpes simplex I tipo virusas HSV-2 – herpes simplex II tipo virusas ADV-11 – 11 tipo adenovirusas

IFN-ω – omega interferonas

IPV – infekcinis pustulinis vulvovaginitas IPB – galvijų balanopostitas

MDBK – galvijų embriono inkstų ląstelių kultūrų linija FVS – fetalinis veršelių serumas

DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium terpė DMSO – dimetilsulfoksidas

PBS – fosfato buferinis tirpalas NaOCl – natrio hipochloritas AC – acikloviras

VK – viruso kontrolė LK – ląstelių kontrolė

CPE – citopatogeninis efektas CC50 – citotoksinė koncentracija

AKID50 – audinių kultūrų infekcinė dozė

MOI – daugybinė viruso infekcija log10 – dešimtainis logaritmas

DNR – deoksiribonukleorūgštis

PGR – polimerazinė grandininė reakcija

ORF (angl. open reading frame) – atviras skaitymo rėmelis Ct – ciklų skaičius

Sd – standartinis nuokrypis CI – pasikliautinis intervalas R – koreliacijos koeficientas

7 MGB (Minor Groove Binder) – molekulės, kurios jungiasi prie nekovalentinių DNR jungčių

MTT – kolorimetrinis (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromidas) tetrazolio redukcijos metodas

8

ĮVADAS

Nuo senų laikų yra tiriamos augalų gydomosios savybės ir dažnai tokiomis savybėmis pasižymintys augalai yra naudojami liaudies medicinoje. Šiais laikais vėl pradėta domėtis ir tyrinėti augalinės kilmės biologiškai aktyviomis medžiagomis (1). Augalinių ekstraktų poveikio efektyvumas tampa svarbus ne tik žmonių, bet ir gyvūnų gydyme (2,3). Deja, bet veterinarinėje medicinoje augalinės kilmės medžiagų pritaikymas ir efektyvumas gydyme nėra išsamiai ištirtas. Lietuvoje augantys vaistiniai augalai daugiausiai naudojami žmonių gydymui (4). Yra aprašytas ir kanadinės jakšūnės efektyvus poveikis prieš žmonių paprastojo herpes viruso sukeltas infekcijas (5,6), tačiau šio vaistinio augalo efektyvumas prieš gyvūnų herpes virusus nėra ištirtas.

Herpes virusai priklauso Herpesviridae šeimai, kuri skirstoma į Alphaherpesvirinae,

Betaherpesvirinae ir Gammaherpesvirinae pogrupius (7). Dažniausiai sukeliamos infekcijos,

susijusios su kvėpavimo takų ligomis, lytinių takų ligomis ir abortais (8). GHV-1 plinta kontakto metu ir per orą, jį platina sergantys gyvuliai, o užsikrėtę tampa nešiotojais visą gyvenimą. Šio viruso sukeliamos infekcijos paplitusios visame pasaulyje, taip pat ir Lietuvoje. GHV-1 gali sukelti įvairius klinikinius pokyčius, priklausomai nuo to, kuri kūno dalis yra paveikta šio viruso (7).

GHV-1 infekcijos profilaktikai daugelyje šalių, taip pat ir kai kuriose Lietuvos fermose, naudojamos efektyvios vakcinos (9). Tačiau didžioji dauguma galvijų vis dėlto lieka nevakcinuoti ir būna imlūs šiems virusams, o susirgusiems taikomas simptominis gydymas, nes specifinio gydymo priemonių veterinarinėje medicinoje nėra. Žmonių herpes virusų sukeltoms infekcinėms ligoms gydyti dažniausiai naudojamas acikloviras (10). Šiuo metu veterinarinėje medicinoje virusinių ligų terapijai leidžiama naudoti tik kačių omega interferoną (IFN-ω). Naminių augintinių gydymui dažnai ne pagal paskirtį naudojami žmonėms skirti priešvirusiniai vaistai. Ūkinės paskirties gyvūnų gydymui priešvirusiniai vaistai ilgą laiką nebuvo naudojami dėl brangumo, nors antivirusinės chemoterapijos efektyvumas buvo daugelį kartų patvirtintas eksperimentiškai (11). Tačiau antivirusinių preparatų neteisėtas naudojimas paukštininkystėje galimai padėjo atsirasti gripo virusų padermėms, atsparioms priešvirusiniams vaistams (12). Dėl tokių virusų padermių keliamo pavojaus žmonių sveikatai kai kurios šalys apskritai uždraudė tokių vaistų naudojimą veterinarijoje (13), o Europos Komisija 2011 metais iškėlė užduotį apriboti ir griežtai kontroliuoti antibiotikų (taip pat ir priešvirusinių preparatų) naudojimą (14). Dėl šios priežasties viena iš saugių alternatyvių būdų gyvūnų virusinių ligų kontrolei ir gydymui būtų augalų arba augalinės kilmės medžiagų naudojimas. Kaip augalinės kilmės medžiagų priešvirusinio efektyvumo tyrimo modelis tiktų

9 galvijų herpes virusai, pasižymintys geromis reprodukcinėmis savybėmis ląstelių kultūrose ir palyginti paprasta replikacijos kontrole laboratorinėmis sąlygomis (15).

Darbo tikslas: laboratoriniais metodais ištirti augalų ekstraktų poveikį gyvūninės kilmės ląstelėms ir galvijų pirmojo tipo herpes virusams.

Darbo uždaviniai:

1. In vitro metodais ištirti ir atrinkti didžiausią antivirusinį poveikį turinčius augalų ekstraktus. 2. Ištirti veiksmingo augalinio ekstrakto (D. canadense) virucidinį poveikį prieš GHV-1,

naudojant skirtingas preparato dozes ir ekspozicijos laiką.

3. Ištirti D. canadense ekstrakto trijų skirtingų frakcijų virucidinį poveikį prieš GHV-1. 4. Ištirti D. canadense ekstrakto antivirusinį poveikį po ląstelių užkrėtimo GHV-1.

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Augaliniai ekstraktai

Augalų gydomosios savybės žinomos nuo senų laikų ir tokiomis savybėmis pasižymintys augalai dažnai naudojami liaudies medicinoje. Tačiau paskutiniu metu ieškant naujų veiksmingų vaistinių medžiagų vėl susidomėta augalinės kilmės biologiškai aktyviomis medžagomis (1). Augalų gydomųjų savybių efektyvumas priklauso nuo to, kiek ir kokias biologiškai aktyvias medžiagas savyje jie sukaupia. Augaliniai ekstraktai yra plačiai naudojami pasaulyje ir turi didelę reikšmę ne tik žmonių, bet ir gyvūnų sveikatai (2,3). Ekstrakcijos metu yra išskiriami biologiškai aktyvūs junginiai, išgaunant tirpius augalo metabolitus. Augalo sukaupti junginiai yra ištirpinami pasirinktame tirpiklyje, pavyzdžiui, alkoholyje, ir tai vadinama skystuoju ekstraktu. Alkoholis taip pat pasižymi apsauginėmis savybėmis ir yra naudojamas siekiant išvengti mikrobų augimo (16,17,18).

Nors augalinės kilmės medžiagos dažnai naudojamos įvairioms žmonių ligoms gydyti, tačiau veterinarinėje medicinoje nėra atlikta išsamesnių tokių preparatų efektyvumo tyrimų. Lietuvoje auginama daug vaistinių augalų rūšių ir įvairiomis formomis jie yra naudojami dažniausiai žmonių gydymui. Paskutiniu metu atlikti tyrimai rodo ir visos eilės augalinės kilmės medžiagų galimą priešvirusinį poveikį. Tyrimai parodė, kad Lietuvos sąlygomis užauginti augalai turi medžiagų, slopinančių paukščių infekcinio bronchito virusų reprodukciją (4). Didelį potencialą turi kanadinės jakšūnės ekstraktų panaudojimas žmonių paprastojo herpeso infekcijos gydymui (5,6). Tačiau šio efektyvaus antiherpetinio preparato poveikis gyvūnų herpes virusams nėra tyrinėtas ir jo efektyvumas nežinomas.

1.1.1 Kanadinė jakšūnė

Kanadinė jakšūnė (Desmodium canadense (L.) DC.) yra pupinių šeimos daugiametis žolinis bei vaistinis augalas, kurio augalinė žaliava yra žolė. Šis augalas kilęs iš Šiaurės Amerikos (Kanados ir JAV), tačiau Lietuvoje jis savaime neauga, nors ir yra tinkamos augimo sąlygos. Atlikti tyrimai rodo, jog daugiausiai lakiųjų junginių yra šio augalo lapuose, žieduose, stiebuose, šiek tiek mažiau sėklose. Taip pat pastebėta, jog didžiausias kiekis veikliųjų junginių susikaupia augalų žydėjimo pradžios tarpsnyje. Nustatyta, kad šio augalo žaliava– žolė, kaupia fenolinius junginius, iš kurių yra gaminami vaistiniai preparatai (19,20,21,22).

11 1.1.1.1 Savybės ir panaudojimas medicinoje

Nuo 1994 metų, kanadinė jakšūnė Lietuvoje, VDU Kauno botanikos sodo Vaistinių ir prieskoninių augalų kolekcijų sektoriuje, vaistinių augalų kolekcijose, pradėta auginti kaip perspektyvus gydomosiomis savybėmis pasižymintis ir plačiai netyrinėtas augalas (19,20). Pradininkas buvo prof. V. Janulis ir jo bendraminčiai, kartu su juo atlikę fitocheminius ir farmakologinius tyrimus, nustatė veikliųjų junginių sudėtį. Po šių pasiekimų, buvo sukurtas preparatas Helepinum D, kuris pasižymi priešvirusiniu, priešuždegiminiu, imunostimuliuojančiu, antimikrobiniu bei kitais įvairiais poveikiais. Nustatyta, kad šio preparato poveikis prilygsta acikloviro („Zovirax“ ir „Acic“) preparatams. Nagrinėjant sukurtą preparatą, dr. G. Šimonienė 2000 metais nustatė platų Helepinum D veikimo spektrą. Manoma, kad naudojant šį preparatą gydymui medicinoje, galima išvengti alergizuojančių savybių, įvairaus šalutinio poveikio ir toksiškumo, skirtingai nei naudojant sintetinius preparatus (23,24). Šis preparatas ir kanadinės jakšūnės žolės vartojami Rusijoje, gydant herpes virusų sukeltas dermatozes, oftalmoherpesą, adenovirusines akių infekcijas. Ukrainoje kanadinė jakšūnė taip pat naudojama kaip vaistinis augalas. Mokslininkai sukūrė preparatą „Fladex“, kuris pasižymi priešvirusiniu poveikiu, ir yra naudojamas virusinių dermatitų ir tropinių opų gydymui (23,25).

1 pav. Kanadinės jakšūnės eskizas (22)

1.1.1.2 Kaupiamos aktyvios farmokologinės medžiagos

Farmakologinį poveikį sukelia dviejų klasių augaliniai junginiai, kuriuos kaupia kanadinė jakšūnė. Tai – fenolinės rūgštys ir flavonoidai. Flavanoidai – tai fenolinių junginių grupė, taip pat žinomi kaip augalų pigmentai, suteikiantys spalvas skirtingoms augalų dalims (24,25). Atlikus

12 tyrimus, pastebėta, kad fenoliniai junginiai kaupiasi aglikonų ir glikozidų pavidalu, o tyrimo metu nustatyti 15 flavonoidų, chlorogeno rūgštis ir kavos rūgštis, kuri pasižymi stipriu farmakologiniu poveikiu (20). Vienas iš svarbiausių– antivirusinis poveikis (18). Ištirta, jog ir chlorogeno rūgščiai būdingas antivirusinis poveikis. Nustatyta, kad ši rūgštis veikia prieš Herpes simplex ir adenovirusus (ADV-11) (26,27). Tačiau apie šių medžiagų ar preparatų galimybes panaudoti veterinarinėje medicinoje duomenų nėra.

13

1.2 Galvijų herpes virusai

1.2.1 Sukelėjas

Herpes virusai priklauso Herpesviridae šeimai, kuri skirstoma į Alphaherpesvirinae,

Betaherpesvirinae ir Gammaherpesvirinae pošeimius (7). Galvijų herpes virusai skirstomi į Alphaherpesvirinae pošeimiui, Simplexvirus genčiai priklausančius GHV-2, Varicellovirus genčiai

priklausančius GHV-1, GHV-5, ir pošeimiui Gammaherpesvirinae priklausančius GHV-4 (28). Galvijų I tipo herpes viruso izoliatus galima suskirstyti į kelis potipius: GHV-1 pirmojo potipio (GHV-1.1) izoliatai, dažniausiai susiję su kvėpavimo takų ligomis ir abortais. Antrojo potipio, GHV-1.2, labiau susiję su lytinių takų infekcijomis ir abortais. GHV-1.2 dar skirstomi į 2a ir 2b potipius, tačiau 2b potipis nesusijęs su abortais (8).

GHV-1 priklauso Herpesviridae šeimai, Alphaherpesvirinae pogrupiui, Varicellovirus genčiai ir yra glaudžiai susijęs su galvijų ligomis visame pasaulyje (29). Galvijų I tipo herpes virusas yra didelis ir turi apvalkalą bei dvigrandę DNR. Paprastai, GHV-1 virionai susideda iš branduolio, sudaryto iš linijinės dvigrandės DNR, maždaug 100 nm diametro ikosaedro simetrijos kapsidės, sudarytos iš 162 kapsomerų, matrikso (angl. tegument) baltymų, supančių kapsidę, ir lipidinio apvalkalo, ant kurio paviršiaus yra viruso glikoproteino molekulės (2pav.; 30, 31). Apvalkalo pagrindą sudarantys lipidai lemia šio viruso jautrumą dezinfekcinėms medžiagoms, tokioms kaip eteris, acetonas, alkoholis ir chloroformas. GHV-1 yra lengvai paveikiamas šilumos ir inaktyvuojamas +50˚C temperatūroje per 30 minučių. Virusas stabilus esant žemiau -65˚C temperatūrai, o esant +37˚C jis išgyvena apie 10 dienų. GHV-1 stabilus pH esant 6-9 (7).

Galvijų reprodukcinė liga, sukelta galvijų I tipo herpes viruso (GHV-1), pirmą kartą buvo aprašyta XIX amžiuje, Vokietijoje. Vėliau, nuo 1950 metų vidurio, buvo aptiktas virusas (GHV-1.1), susijęs su kvėpavimo takų ligomis Jungtinėse Amerikos Valstijose. Apie 1970 metus buvo aptikti infekcinio galvijų rinotracheito (IGR) klinikiniai požymiai Europoje (8).

14 1.2.2 Paplitimas ir patogenezė

Įvairaus amžiaus galvijai yra jautrūs šiam virusui, ypač naujagimiai. GHV-1 plinta kontakto metu ir per orą, jį platina sergantys gyvuliai, o užsikrėtę tampa nešiotojais visą gyvenimą. Šis virusas išskiriamas per nosies, akių išskyras, abortuotų vaisių placentas, plinta kontakto metu ir apsėklinimo metu. Virusas dažniausiai į organizmą patenka per viršutinių kvėpavimo takų gleivines, lytinių takų gleivines ir per konjuktyvas. Leukocitai virusą perneša į kitus audinius, o užkrėstas organizmas virusą išskiria į aplinką maždaug 10–16 dienų (7). GHV-1 sukelia organizmo imunosupresiją, o dėl to gali išsivystyti antrinės bakterinės infekcijos, kurios gali sukelti, pavyzdžiui, pneumoniją, o tokiais atvejais gyvūnas gali ir nugaišti. Taip pat, antrinės infekcijos metu susilpnėja CD8+ T-ląstelių funkcija, skirta atpažinti virusu užkrėstas ląsteles (32).

1.2.3 Virusas ir ląstelės

Galvijų I tipo herpes virsas yra išskiriamas naudojant galvijų inkstų ar sėklidžių ląstelių kultūras. Užkrėstos ląstelės suapvalėja ir formuojasi sincitijos (7). Be ląstelės, kaip gyvybės formos, virusas negali egzistuoti ir vykdyti reprodukcijos ciklo už ląstelės ribų. GHV-1 paveikti gali tik tam tikras ląsteles, kadangi ląstelės gamina skirtingus baltymus, kurie padeda virusui patekti į ląstelės vidų, ir prisideda prie viruso replikacijos. Yra nustatyta, kad šis virusas paveikia viršutinių kvėpavimo takų epitelines ląsteles, lytinių organų gleivinės ląsteles, tonziles, konjuktyvas, CD+4 ląsteles, makrofagus ir monocitus (30).

Herpes virusai į ląstelę patenka susiliedami su ląstelės plazmine membrana, vykstant sudėtingam prisitvirtinimui ir įsiskverbimui. Yra įrodyta GHV-1 glikoproteinų svarba viruso patekimui į ląstelę (30). Penki iš daugybės glikoproteinų yra reikšmingi viruso patekimui į ląstelę. Tai gB, gD, gD, gL ir gC glikoproteinai. Manoma, kad šie glikoproteinai veikia kartu, kad sukeltų viruso apvalkalo ir ląstelės plazminės membranos susiliejimą. Ant ląstelės paviršiaus esančios molekulės reaguoja ir jungiasi su viruso glikoproteinais. Įvykus prisitvirtinimui ir įsiskverbimui, viruso nukleorūgštis patenka į ląstelę, o viruso apvalkalas lieka ląstelės išorėje. Nukleorūgštis ląstelėjė yra pernešama mikrotubulių į branduolį, kur vyksta replikacija naudojant ląstelės baltymus. Viruso genetinė medžiaga tampa apgaubta, nes prasiskverbia pro branduolio apvalkalą, ir toliau transportuojama su viduląstelinėmis pūslelėmis iki plazminės membranos ir išskiriama į išorę (33). 1.2.4 Sukeliamos ligos ir klinikiniai požymiai

GHV-1 sukeliamos infekcijos paplitusios visame pasaulyje, taip pat ir Lietuvoje. Šis virusas gali sukelti įvairius klinikinius pokyčius. Yra išskiriamos kelios klinikinės formos, priklausomai nuo to, kokia kūno dalis yra paveikiama viruso (7). Virusas gali pažeisti suaugusių galvijų kvėpavimo takus, lytinius organus, sukelti abortus (32).

15 Viena iš ligų, kurias sukelia GHV-1, yra infekcinis galvijų rinotracheitas. Ši liga pradžioje pasižymi lengva forma, tačiau vėliau sunkėja, priklausomai nuo to, ar yra antrinė bakterinė infekcija (34). Galvijams pakyla kūno temperatūra, pasireiškia apetito stoka, depresija, jie kosėja. Pastebimas padidėjęs seilėtekis, nosies gleivinės pažeidimai, atsirandantis dusulys, paraudusios šnervės bei nosies veidrodėlis (kitaip vadinamas “raudona nosimi”), akių uždegimas. Labai stipriai serga jauni veršeliai, kurie infekcijos protrūkio atveju gali nugaišti. Paprastai gyvuliai, praėjus maždaug 5 dienoms po to, kai pasirodė pirmieji klinikiniai požymiai, pasveiksta, jei liga nesikomplikuoja antrine bakterine infekcija (32,34).

GHV-1 gali paveikti ir lytinius takus, sukeldamas karvėms infekcinį pustulinį vulvovaginitą (IPV) arba vyriškos lyties galvijų balanopostitą (IPB). Lytinių takų forma gali plisti tiesioginio kontakto metu poruojantis arba per užkrėstą spermą, naudojamą sėklinimui (35). Ankstyvosiose infekcijos stadijose karvėms pasireiškia ūmus vaginitas, matoma paraudusi gleivinė. Pastebimos kreminės konsistencijos, nuo baltos iki geltonos spalvos, išskyros. Sergančios karvės dažniau šlapinasi, laiko pakeltą uodegą. Neilgai trukus šie pažeidimai virsta erozijomis ir opomis, plinta į gimdą. Intrauterinė forma sukelia nekrozinį endometritą ir cervicitą (36). Jei liga nekomplikuota, paprastai ji gali trukti nuo 5 iki 10 dienų (35).

1.2.5 Gydymas ir prevencija

GHV-1 infekcijos profilaktikai daugelyje šalių, taip pat ir kai kuriose Lietuvos fermose, naudojamos efektyvios vakcinos (9). Tačiau didžioji dauguma galvijų vis dėlto lieka nevakcinuoti ir būna imlūs šiems virusams, o susirgusiems taikomas simptominis gydymas, nes specifinio gydymo priemonių veterinarinėje medicinoje nėra. Žmonių herpes virusų sukeltoms infekcinėms ligoms gydyti dažniausiai naudojamas acikloviras (10).

Šiuo metu veterinarinėje medicinoje virusinių ligų terapijai leidžiama naudoti tik kačių omega interferoną (IFN-ω). Naminių augintinių gydymui dažnai ne visai pagal paskirtį naudojami žmonėms skirti priešvirusiniai vaistai. Ūkinės paskirties gyvūnų gydymui priešvirusiniai vaistai ilgą laiką nebuvo naudojami dėl brangumo, nors antivirusinės chemoterapijos efektyvumas buvo daugelį kartų patvirtintas eksperimentiškai (11). Tačiau antivirusinių preparatų neteisėtas naudojimas paukštininkystėje galimai padėjo atsirasti gripo virusų padermėms, atsparioms priešvirusiniams vaistams (12). Dėl tokių virusų padermių keliamo pavojaus žmonių sveikatai kai kurios šalys apskritai uždraudė tokių vaistų naudojimą veterinarijoje (13), o Europos Komisija 2011 metais iškėlė užduotį apriboti ir griežtai kontroliuoti antibiotikų (taip pat ir priešvirusinių preparatų) naudojimą (14). Dėl šios priežasties viena iš saugių alternatyvių būdų gyvūnų virusinių ligų kontrolei ir gydymui būtų augalų arba augalinės kilmės medžiagų naudojimas. Kaip augalinės

16 kilmės medžiagų priešvirusinio efektyvumo tyrimo modelis tiktų galvijų herpes virusai, pasižymintys geromis reprodukcinėmis savybėmis ląstelių kultūrose ir palyginti paprasta replikacijos kontrole laboratorinėmis sąlygomis (15).

17

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Tyrimas atliktas 2017–2018 metais LSMU VA Veterinarinės patobiologijos katedroje bei Mikrobiologijos ir virusologijos institute.

Augaliniai ekstraktai. Tyrime buvo naudota šešiolika vaistinių augalų etanolio ekstraktų (40 proc). Augalai užauginti Vytauto Didžiojo universitete, Kauno botanikos sodo vaistinių augalų kolekcijoje. Augalai buvo parinkti pagal antimikrobinį aktyvumą ir etnomedicininį ar tradicinį naudojimą gydant infekcines ligas. Žolės, lapai ar jų šaknys ekstraktų gamybai buvo pasirenkami priklausomai nuo to, kurioje augalo dalyje kaupiasi aktyviosios medžiagos (1 lentelė). Ekstraktai buvo gaminami Vytauto Didžiojo universitete, naudojant etanolį kaip tirpiklį, praskiestą su bidistiliuotu vandeniu iki 40 proc. koncentracijos. Džiovintos augalinės medžiagos buvo ekstrahuojamos naudojant 10 ml tirpiklio. Šis procesas buvo vykdomas 24 valandas, 20˚C temperatūroje, naudojant orbitinę purtyklę. Toliau ekstraktai buvo filtruojami pro specialius filtrus. Ekstraktų koncentracija buvo 50 mg/ml, atsižvelgiant į pradinę medžiagą. Tyrime taip pat tirtos trys

D. canadense ekstrakto frakcijos, kurios buvo pagamintos skirtingomis koncentracijomis: 10 proc.

etanolio (pirmoji frakcija), 50 proc. etanolio (antroji frakcija) ir 90 proc. etanolio (trečioji frakcija). Visi šie ekstraktai iki tyrimo buvo laikomi +4˚C temperatūroje.

1 lentelė. Eksperimente naudoti ir tirti augaliniai ekstraktai

Augalo pavadinimas Žaliava Savybės

Naudotas necitotoksinis

kiekis Kalninis dašis (lot.

Saturja montana) Žolė

Pasižymi antibakterinėmis, antigrybinėmis, priešuždegiminėmis savybėmis, gerina

virškinimą (37).

74 µl/ml

Kilnioji blezdingūnė (lot.

Chamaemelum nobile) Žolė Pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis,

gerina virškinimą (38). 16 µl/ml

Krūminė perilė (lot.

Perilla frutescens) Žolė Mažina uždegimą, alergines reakcijas (39). 76 µl/ml

Pankolinė kinmėtė (lot.

Agastache foeniculum) Žolė Naudota gydyti karščiavimui, diarėjai, gerina _{virškinimą (40).} 6 µl/ml

Paprastasis raudonėlis

(lot. Origanum vulgare) Žolė Pasižymi antimikrobiniu veikimu (41). 52 µl/ml

Pipirmėtė (lot. Mentha

piperita) Žolė Naudota gydyti paraudimams ir patinimams,

18

1 lentelės tęsinys. Eksperimente naudoti ir tirti augaliniai ekstraktai

Augalo pavadinimas Žaliava Savybės

Naudotas necitotoksinis kiekis Stambiašaknis snaputis (lot. Geranium macrorrhizum) Žolė

Pasižymi stipriomis antimikrobinėmis

savybėmis (43). 18 µl/ml

Vaistinė melisa (lot.

Melissa officinalis) Žolė

Pasižymi antimikrobinėmis savybėmis, naudotina virškinamojo trakto sutrikimams

gydyti (44).

58 µl/ml Vaistinė šventagaršvė

(lot. Angelica

archangelica) Lapai

Naudotini gydyti plaučių ligoms,

virškinamojo trakto sutrikimams (45). 24 µl/ml Vaistinė šventagaršvė

(lot. Angelica

archangelica) Šaknys

Naudotina gydyti plaučių ligoms, virškinamojo trakto sutrikimams, infekcijoms ir peršalimams (45).

32 µl/ml

Vaistinis čiobrelis (lot.

Thymus vulgaris) Žolė

Pasižymi antimikrobinėmis savybėmis, naudotina gydyti virškinamojo trakto ligas,

šlapimo sistemos ir bronchų ligas (46).

63 µl/ml Vaistinis isopas (lot.

Hyssopus officinalis) Žolė Pasižymi antioksidacinėmis ir

antimikrobinėmis savybėmis (47). 63 µl/ml Parastoji katžolė (lot.

Nepeta cataria) Žolė Naudotina gydyti virškinamojo trakto

ligoms, mažina karščiavimą, patinimą (48). 31 µl/ml Rausvažiedė ežiuolė (lot.

Echinacea purpurea) Žolė

Stiprina imuninę sistemą, mažina karščiavimą ir uždegimą. Poveikis prieš

žmonių Herpes simplex virusą (49).

49 µl/ml Vaistinis šalavijas (lot.

Salvia officinalis) Žolė Pasižymi antioksidacinėmis, antivirusinėmis, _{antibakterinėmis savybėmis (50).} 11 µl/ml

Kanadinė jakšūnė (lot.

Desmodium canadence) Žolė

Pasižymi antivirusinėmis, antibakterinėmis savybėmis, antihistamininiu,

imunostimuliuojančiu ir priešuždegiminiu poveikiu (51).

29 µl/ml

Ląstelės ir virusas. Tyrime naudotas GHV-1 (4016 padermė) ir MDBK (galvijų embriono inkstų) ląstelių kultūrų linija (3 pav.) buvo gauta iš Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto, virusologinių tyrimų laboratorijos, kuruojamos dr. I. Jacevičienės. Ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM: F-12, Lonza, Šveicarija) kartu pridėjus

19 10 proc. fetalinio veršelių serumo (FVS, Biochrom GmbH, Vokietija) 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2 inkubatoriuje. Mikrobinio užteršimo prevencijai buvo naudojamas penicilinas ir streptomicinas.

3 pav. Sveikų neužkrėstų MDBK ląstelių vientisas sluoksnis. 48 valandos po persėjimo

Ląstelės buvo kultivuojamos T25 flakonuose ir užkrėstos GHV-1, kurių užkrėtimo kiekis buvo (priklausomai nuo tyrimo tikslo) 0,1 – 10 virusų dalelių vienai laistelei (1-10 MOI, multiplicity of infection). Po 48 valandų inkubacijos su palaikančiąja 2 proc. terpe ir antibiotikais, flakonai buvo mikroskopuojami ir tiriami dėl citopatogeninio efekto (CPE, 4 pav). Po tyrimo flakonai su užkrėstomis ląstelėmis buvo užšaldyti ir atšildyti tris kartus. Viruso alikvotai buvo paruošti centrifuguojant 15 minučių 2000 x g ir patalpinami laikymui iki -80 ºC temperatūroje iki panaudojimo.

20

4 pav. MDBK ląstelės po 72 val. nuo užkrėtimo GHV-1. Matomas tipiškas herpes virusų

poveikis, pasireiškiantis ląstelių suapvalėjimu, atsiskyrimu nuo indo paviršiaus ir susigrupavimu, primenančiu vynuogių kekes.

2.1 Tyrimo etapai

Pirmas etapas (virucidinės savybės)

Augalinių ekstraktų citotoksiškumo ir priešvirusinio efektyvumo tyrimas

(16 augalinių ekstraktų tyrimas dėl poveikio prieš GHV-1. Ieškomas efektyviausią poveikį sukeliantis augalinis ekstraktas)

Antras etapas

Desmodium canadense ekstrakto virucidinio poveikio tyrimas

Antras etapas. I dalis

Desmodium canadense ekstrakto skirtingų kiekių poveikio tyrimas

Antras etapas. II dalis

Desmodium canadense ekstrakto poveikio tyrimas skirtingais laiko intervalais

Antras etapas. III dalis

Desmodium canadense ekstrakto ir I, II ir III jos frakcijų tyrimas

Trečias etapas (priešvirusinės savybės)

Desmodium canadense ekstrakto poveikis po ląstelių užkrėtimo

5 pav. Bendroji atliktų tyrimų schema

Pirmasis etapas. Pirmiausia buvo atliktas augalų ekstraktų kolorimetrinis citotoksiškumo tyrimas. Siekiant ištirti augalinių ekstraktų poveikį GHV-1, MDBK ląstelių kultūra buvo

21 užkrečiama galvijų herpes virusu ir įpilamas nustatytas necitotoksinis skirtingų augalinių ekstraktų kiekis. Šis tyrimas buvo atliekamas per vieną tyrimą ištiriant du skirtingus ekstraktus.

Antrasis etapas. Nustačius, kad D.canadense poveikis prieš GHV-1 efektyviausias, tyrimas tęsiamas analizuojant šio augalinio ekstrakto savybes. Buvo tyrinėjama panaudojant skirtingus šio ekstrakto kiekius, tiriama laiko dinamika, trys skirtingos frakcijos.

I dalis. Tiriant skirtingų kiekių poveikį, buvo pasirinkti tokie kiekiai: 58 μl/ml, 29 μl/ml, 14 μl/ml ir 7 μl/ml D.canadense ekstrakto.

II dalis. Tiriant laiko dinamiką buvo pasirinkti tokie laiko intervalai: 0 min., 15 min., 30 min., 45 min. ir 60 min. D. canadense ekstrakto naudota 29 μl/ml.

III dalis. Trijų tiriamųjų frakcijų kiekis, naudotas tyrime, buvo toks pat kaip ir D.canadense ekstrakto – 29 μl/ml.

Trečias etapas. Šiam tyrimui buvo naudotas kanadinės jakšūnės ekstraktas ir nustatyta veiksminga II-oji frakacija. Ekstrakto poveikis vertinamas po ląstelių kultūros užkrėtimo GHV-1. Tyrimas atliekamas siekiant nustatyti, kiek lieka laisvojo GHV-1, kuris nėra ląstelėse. Acikloviras naudotas kaip teigiama priešvirusinio vaisto kontrolė. Taip pat, kaip virucidinio poveikio teigiama kontrolė, buvo naudojamas natrio hipochlorito (NaOCl) tirpalas skirtingomis koncentracijomis: 0,05 proc. (500 p.p.m.), 0,025 proc. (250 p.p.m.) ir 0,0125 proc. (125 p.p.m.). Siekiant išsiaiškinti, kaip greitai natrio hipochloritas neutralizuoja virusą, buvo pasirinkti skirtingi laiko intervalai natrio hipochlorito kontaktui su GHV-1 (0 min., 15 min., 30 min., 45 min. ir 60 min.). Natrio hipochlorito veikimo sustabdymui panaudotas 1 proc. natrio tiosulfato tirpalas. Viruso inaktyvavimo ir replikacijos stabdymo efektyvumui įvertinti buvo atliekamas viruso titravimas ląstelių kultūrose ir realaus laiko polimerazinė grandininė reakcija (PGR).

2.2 Tyrime naudoti metodai

Viruso titro nustatymas. Prieš naudojant virusą eksperimentuose, buvo nustatomas viruso titras. Tam tikslui buvo naudojamas MDBK ląstelių monosluoksnis 96 duobučių mikrotitravimo plokštelėje. Tiriamasis virusas buvo atskiedžiamas nuo 10-1 iki 10-8 ir įvairiomis tiriamojo viruso koncentracijomis buvo užkrečiamos ląstelės. Mažiausias virusų kiekis, sukeliantis citopatogeninį poveikį 50 proc. MDBK ląstelių mėginių, buvo laikomas viruso titru, kuris buvo išreiškiamas audinių kultūrų infekcinėmis dozėmis (AKID50) dešimtainiais logaritmais (log10). Virusų titras buvo apskaičiuotas Kerberio metodu, naudojant Marco Binder AKID kalkuliatorių (52).

Citotoksiškumo nustatymas. Kiekvieno ekstrakto citotoksinė koncentracija (CC50) buvo ištirta naudojant MDBK ląstelių kultūrą. Šiam tyrimui buvo naudojamas MTT testas (53). Iš pradžių, ląstelės buvo sėjamos koncentracija 1×104 _{ląstelių per duobutę 96 duobučių plokštelėje ir}

22 augintos 37°C temperatūroje 1 dieną. Kiekvienam ekstrakto atskiedimui buvo naudojamos 8 duobutės su ląstelių kultūromis. Po 72 valandų pridėta MTT reagento (10 μl, 5 mg/ml, Sigma-Aldrich) ir inkubuojama 4 valandas 37°C temperatūroje. Tada į kiekvieną duobutę įpilama 0,1 ml dimetilsulfoksido (DMSO, Carl Roth, Vokietija) ir plokštelės dedamos ant kratytuvo 5 minutėms. Kiekvienos duobutės absorbcija matuojama 620 nm mikroplokštės skaitytuvu (Multiskan™ FC mikroplokštės fotometras), skaičiuojamas ląstelių išgyvenamumo procentas ir apskaičiuojamas citotoksiškumas (CC50), sukeliantis 50 proc. ląstelių lizę ir mirtį.

Virucidinis aktyvumas. Bandymo tirpalai buvo paruošiami DMEM: F12 terpėje su 2 proc. FVS, sumaišant su GHV-1 (vidutiniškai 108,5 AKID50/ml) ir su nustatytais necitotoksiškais augalinių ekstraktų kiekiais (1 lentelė). Viruso ir ekstraktų mišiniai 1 valandą inkubuojami 20°C temperatūroje ir titruojami, kaip aprašyta aukščiau. Įtraukta ląstelių, viruso ir ekstraktų kontrolė. Po 96 val. inkubacijos plokštelės buvo tiriamos naudojant invertinį mikroskopą ("Leica", Vokietija) CPE aptikimui. Kaip teigiama kontrolė buvo naudojamas natrio hipochloritas (Sigma Aldrich, JAV), kurio galutinė koncentracija buvo 0,05–0,1 proc. Natrio hipochloritas buvo praskiestas standartinio kietumo vandeniu iki naudojamos koncentracijos. Natrio tiosulfatas (Sigma Aldrich, JAV) distiliuotame vandenyje buvo naudojamas neutralizuoti natrio hipochlorito aktyvumui.

Viruso kiekio sumažėjimo tyrimas. Sumažėjimas buvo tiriamas naudojant titravimą ir realaus laiko PGR. Lątelės buvo pasėtos 24 duobučių plokštelėje ir inkubuojamos 48 valandas. Tyrimui naudojami tirpalai buvo paruošiami sumaišant 0,1 ml GHV-1 su 0,9 ml DMEM: F12, kurioje buvo 2 proc. FVS, ir atitinkamus ekstraktų ir kontrolinių medžiagų kiekius. Mišiniai 1 valandą inkubuojami 20±2°C temperatūroje. Prieš inokuliavimą terpė buvo dekantuojama, o ląstelės buvo inokuliuotos su tiriamosiomis medžiagomis, kai MOI buvo 1. Po 1 valandos kontakto bandymo mišiniai buvo nusiurbti nuo paviršiaus ir naudojami toliau aptikti likusį neprisijungusių prie ląstelių virusų užkrečiamumą ir/ar virusinės DNR kiekį, nustatomą pagal realaus laiko PGR. Ląstelės plokštelėje buvo tris kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), po to palaikymui įpilta 0,6 ml DMEM: F12 su 2 proc. FVS. Po 24 valandų inkubacijos, ląstelės buvo mikroskopuojamos. Po mikroskopavimo plokštelės buvo užšaldytos ir 3 kartus atšildytos. Tyrimo mišinių ir viruso alikvotai buvo paruošti centrifuguojant 10 minučių 2000 x g. Paruošti alikvotai buvo patalpinami į -80°C temperatūrą ir buvo naudojami viruso titrui nustatyti pagal AKID50 bei atlikti realaus laiko PGR.

Ekstrakto priešvirusinis (poinfekcinis) poveikis. Tyrime kaip teigiama kontrolė buvo naudotas acikloviras, kuris prieš naudojimą buvo tirpinamas dimetilsulfokside (DMSO) ir po to atskiedžiamas PBS iki reikiamos koncentracijos. Tyrime buvo panaudotas kanadinės jakšūnės ekstraktas (29 μl/ml), acikloviro skirtingi kiekiai (100 μl/ml, 50 μl/ml ir 25 μl/ml), ląstelių ir viruso

23 kontrolės. Ląstelės buvo užkrėstos GHV-1, kurių koncentracija buvo 0,1 viruso ląstelei (0,1 MOI; 10 viruso dalelių 100 ląstelių). Ląstelės buvo inkubuojamos 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2 termostate 1 valandą. Po to, neadsorbuotas virusas buvo nusiurbiamas, ląstelės du kartus nuplaunamos fosfato buferiniu tirpalu (PBS) ir į kiekvieną virusu užkrėstą duobutę buvo įpilama iš anksto pasiruošto ekstrakto ir acikloviro tirpalų. Į kontrolines duobutes įpilama ląstelių kultūrų terpė. Ląstelės dedamos į termostatą, inkubuojamos 48 valandas 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2 termostate. Po inkubacijos buvo mikroskopuojama ir vertinama dėl CPE. Iš kiekvienos duobutės po mikroskopavimo buvo paimamas 0,1 ml skysčio (laisvojo viruso). Visa plokštelė užšaldoma ir 3 kartus atšildoma. Po to turinys perkeliamas į mėgintuvėlį ir centrifuguojama, tiriamas virusų titras kaip aprašyta aukščiau.

Realaus laiko polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) tyrimas. Realaus laiko PGR buvo atliekama taip, kaip aprašyta C. Abril (54). DNR (deoksiribonukleorūgščių) išskyrimas buvo atliekamas naudojant „Genomic DNA purification kit“ (Thermo Fisher Scientific, USA, K0721), vadovaujantis gamintojo instrukcija, A protokolu:

Į mėgintuvėlį su 20 μl tiriamosios medžiagos (MDBK ląstelių kultūros, paveiktos GHV-1) įpilta 180 μl virškinamojo tirpalo ir 20 μl proteinazės K tirpalo. Mėgintuvėlis vartomas, siekiant, kad tirpalai tolygiai susimaišytų. Paruošti mėginiai įdėti į termomikserį, kur buvo inkubuojami 15 minučių 56 °C temperatūroje. Po inkubacijos, į mėgintuvėlius buvo dedama 20 µl RNazė A tirpalo ir išmaišoma. Inkubuota kambario temperatūroje 10 minučių. Į taip paruoštus mėginius buvo dedama 0,2 ml lizuojančio tirpalo. Mėgintuvėliai vartomi 15 sekundžių, kad susidarytų homogeniškas mišinys. Toliau įpilta 0,4 ml 50 proc. etanolio ir vėl pavartyta, kad susimaišytų.

Paruoštas mėgintuvėlio turinys buvo perpilamas į specialius „GeneJET genomic DNA Purification“ mėgintuvėlius. Turinys centrifuguotas 1 minutę 6000 x g jėga. Po centrifugavimo prasifiltravusi dalis buvo pašalinta, kita dalis toliau naudota ir dedama į naują 2 ml surenkamąjį mėgintuvėlį. Į mėgintuvėlį įpilta 0,5 ml pirmojo plovimui skirto buferio (Wash Buffer I) ir centrifuguota 1 minutę 8000 x g. Po centrifugavimo prasifiltravusi dalis pašalinta, o kita dalis grąžinta į surenkamąjį mėgintuvėlį. Toliau buvo įpilta 0,5 ml antrojo plovimui skirto buferio (Wash Buffer II) ir centrifuguota 1 minutę 12000 x g. Po centrifugavimo prasifiltravusi dalis pašalinta, o kita dedama į naują 1,5 ml talpos mėgintuvėlį. Toliau buvo įpilama 0,2 ml eliuavimo buferio (buferis su atsiskyrusiomis dalelėmis), skirto išplauti DNR iš filtro, ir inkubuota 2 minutes kambario temperatūroje, kad būtų išskirta DNR. Mėginiai buvo centrifuguoti 1 minutę 8000 x g. Išgryninta DNR naudota iš karto atlikti PGR arba laikoma -20°C.

Realaus laiko PGR. Pradmenys ir zondai kiekybinei realaus laiko PGR buvo gauti/sukurti su „Primer Express“ įranga (1.0 versija, Applied Biosystems [AB], Foster City, CA) tam, kad būtų

24 galima ilginti GHV-1 glikoproteino B sekas su atviru skaitymo rėmeliu (open reading frame - ORF) pagal Abril ir kt. (54) Oligonukleotidiniai pradmenys ir MGB žymimi zondai buvo sintezuoti naudojant „Invitrogen“ (JAV). Prailginimai buvo atlikti pagal standartinį protokolą. Kiekybinės realaus laiko PGR tyrimo metu prailginimai atlikti 25,0 μl tūryje, kuriame buvo 12,5 μl Master Mix (TaqMan Universal master mix II), sudarytas iš 1,6 μl pradmenų mišinio ir zondo ir 10,9 μl DNR mėginio. Galutinės pradmenų ir zondų koncentracijos buvo tokios: BHV-1 priekinis pradmuo, GHV-1 priešingas pradmuo (kiekvienas 240 nM), o GHV-1 zondas 160 nM (2 lentelė). PGR reakcijų sąlygos buvo tokios: 2 min. 50°C temperatūroje, 10 min. 95°C temperatūroje, po to 40 ciklų, susidedančių iš denatūravimo pakopų 95°C temperatūroje 15 sek., o 60°C temperatūroje elongacijos etapas 1 minutę. Prailgėjimai buvo įrašyti, išanalizuoti ir slenkstinis ciklas nustatytas su Mastercycler (Eppendorf). Realaus laiko PGR buvo pakartota keturis kartus ir buvo įrašytas slenkstinis ciklas, o pasikliautinis intervalas ir standartiniai nuokrypiai buvo apskaičiuoti.

2 lentelė. Pradmenys ir zondai, reikalingi PGR gB lokusui nustatyti

Oligonukleotidai Sekos (5'  3') Produkto

dydis (bp) GHV-1 priekinis pradmuo TGT GGA CCT AAA CCT CAC GGT

97

GHV-1 zondas a _{AGG ACC GCG AGT TCT TGC CGC}

GHV-1 priešingas pradmuo GTA GTC GAG CAG ACC CGT GTC a _{– MGB (Minor Groove Binder)}

Statistinė duomenų analizė. Skirtumai tarp metodų ir ekstraktų buvo įvertinti pagal Fisher kriterijus ir Stjudento t-testą. Taip pat buvo apskaičiuojamas Pearson koreliacijos koeficientas R. Duomenys buvo laikomi reikšmingais, kai p <0,05. Statistinė analizė atlikta naudojanti Microsoft „Excel“ 2010 programą ir veterinarinės epidemiologijos statistinių tyrimų apskaičiavimo programą „Epitools Epidemiological calculators“.

25

3. REZULTATAI

3.1 Augalinių ekstraktų poveikis GHV-1

Tiriant 16 augalinių ekstraktų tiesioginio kontakto metu su virusu, ne visi ekstraktai pasižymėjo viruso replikaciją stabdančiu poveikiu. Buvo nustatyta, jog efektyviausiai prieš GHV-1 veikė kanadinės jakšūnės (D. canadense) ekstraktas. Titras, nustatytas po poveikio GHV-1, kai D.

canadense ekstraktas buvo panaudotas prieš užkrečiant ląsteles, buvo 3,75 log10, o titro sumažinimo faktorius buvo 5,00±0,25 log10 AKID50. Taip pat buvo nustatytas vidutiniškas poveikis prieš GHV-1, kuriuo pasižymėjo kalninio dašio (Saturea montana) ir paprastojo raudonėlio (Origanum

vulgare) ekstraktai. Titrai, nustatyti po poveikio GHV-1 buvo: S. montana 5,75 log10 (sumažinimo faktorius 3,00±0,21 log10 AKID50), O. vulgare 5,75 log10 (sumažinimo faktorius 2,25±0,27 log10 AKID50). Kiti likusieji ekstraktai nepasižymėjo efektyviu poveikiu prieš GHV-1 (titro sumažėjimo faktorius ≤2.0 log10; 6 pav.).

6 pav. Tirtų augalinių ekstraktų efektyvumo palyginimas po poveikio GHV-1

Kadangi tik Desmodium canadense etanolio ekstraktas turėjo aukštą viruso titro sumažinimo faktorių (≥5,0±0,25 log10), šis ekstraktas buvo pasirinktas tolesniam tyrimui. MDBK ląstelėms

Desmodium canadense etanolio ekstrakto CC50 buvo ≥ 58,0 μl/ml, todėl tyrimams buvo naudojamas 1:2 CC50 ekstrakto koncentracija, t.y. 29,0 μl/ml.

Tolimesni tyrimai buvo atliekami dėl išsamesnės kanadinės jakšūnės poveikio analizės, tiriant skirtingus šio ekstrakto kiekius, tiriant laiko dinamiką, naudojant tris skirtingas šio ekstrakto

5,75 8,00 8,75 7,75 5,75 8,75 8,25 7,00 7,00 8,50 7,75 7,75 8,25 8,25 _7,50 3,75 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 Ti tr as, log 10 Augaliniai ekstraktai

26 frakcijas, taip pat tiriant D. canadense poveikį po užkrėtimo GHV-1, nustatant laisvojo viruso kiekį, kontrolėje naudojant aciklovirą ir natrio hipochloritą.

3.2 D. canadense ekstrakto skirtingų kiekių tyrimas

Tiriant skirtingus D. canadense ekstrakto kiekius (58 μl/ml, 29 μl/ml, 14 μl/ml, 7 μl/ml), nustatyta, kad šis ekstraktas pasižymi nuo kiekio priklausomu poveikiu (R = 0,8976). Nustatyta, kad virusą veikiant 7 μl/ml ir 14 μl/ml ekstrakto GHV-1 titras sumažėja 3 - 4 log10, o 29 μl/ml ir 58 μl/ml - ≥ 5 log10 (p=0,039; 7 pav.).

7 pav. D. canadense ekstrakto skirtingų kiekių poveikio efektyvumas, įtraukiant neigiamą ir

teigiamą kontroles

3.3 D. canadense ekstrakto poveikio laiko dinamikos tyrimas

Atlikus tyrimą buvo išsiaiškinta, kad D. canadense poveikis GHV-1 stipriai koreliavo su ekspozicijos trukme (R=0,9321). Pasirinkti laiko intervalai buvo 0 min., 15 min., 30 min., 45 min. ir 60 min. Šio ekstrakto poveikis pastebėtas jau po 15 minučių (sumažinimo faktorius 2,75 log10 AKID50, p<0.01), o aukštas poveikis pastebėtas jau po 30 minučių (sumažinimo faktorius 4,83 log10 AKID50, p<0.01). D. canadense ekstraktas efektyviausiai paveikė GHV-1 po 45 minučių ̶ viruso titras sumažėjo iki 2,2 log10 (8 pav.).

1,5 3,17 4,33 5,17 8,33 1,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

58 µl 29 µl 14 µl 7 µl Neig. kontrolė Teig. kontrolė

Ti

tr

as,

log

27

8 pav. D. canadense ekstrakto tyrimas skirtingais laiko intervalais. Teigiamą kontrolę parodo

tyrimas su NaOCl, o neigiamą kontrolę rodo niekuo nepaveiktas GHV-1. Vaizduojami dviejų nepriklausomų tyrimų rezultatai

Virusus paveikus natrio hipochloritu, poveikis buvo pastebimas iškart (8 pav.), o viruso titro sumažėjimo faktorius buvo 3,92 log10. Po 15 minučių sumažėjimo faktorius jau buvo 5,25 log10 AKID50. Didžiausias NaOCl poveikis buvo stebimas po 60 minučių ekspozicijos (R = 0,9529, p = 0,012).

3.4 D. canadense ekstrakto I, II ir III frakcijų tyrimas

Ištyrus tris skirtingas D. canadense ekstrakto frakcijas, buvo nustatyta, kad efektyviausią poveikį prieš GHV-1 turėjo II-oji (50 proc. etanolio) frakcija, kai viruso aktyvumas sumažėjo iki 3,00 log10 (sumažinimo faktorius 5,5 log10 AKID50; 9 pav.).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 min. 15 min. 30 min. 45 min. 60 min.

Ti tr as, l og 10 D. canadense Neig. kontrolė Teig. kontrolė

28

9 pav. D. canadese ekstrakto trijų frakcijų tyrimas. Kaip teigiama kontrolė buvo naudotas D.

canadense ekstraktas (29 μl/ml), o kaip neigiama kontrolė buvo panaudotas nepaveiktas tiriamąja medžiaga GHV-1

Viruso tirto sumažėjimo tyrimas parodė, kad D. canadense ekstraktas veiksmingai sumažino viruso titrą nuo 8,33 log10 iki 4,67 log10 (p<0,01). Virucidinis aktyvumas buvo patvirtintas ir realaus laiko PGR. Reakcijos ciklų skaičius realaus laiko PGR buvo atvirkščiai proporcingas viruso titrui AKID50 ir rodė ryškią neigiamą koreliaciją (R = -0.9462). NaOCl, 0,1 proc., visiškai inaktyvavo GHV-1, o 0,05 proc. sumažino viruso titrą 4,5 log10 (3 lentelė).

3 lentelė. D. canadense ekstrakto virucidinių savybių įvertinimas po titravimo ir realaus laiko PGR

Tiriamoji medžiaga

GHV-1 kiekis, įvertintas po titravimo ir realaus laiko PGR 24 valandos po adsorbcijos ir

inkubavimo

Nerezorbuotas virusas (laisvasis virusas)

AKID50 Realaus laiko PGR AKID50 Realaus laiko PGR

Ct±sd1 _CI2 _Ct±sd1 _CI2 D. canadense ekstraktas, 29µl/ml 4,67±0,17 33,87±2,47 30,5-35,3 3,5±0,45 33,24±0,94 32,3-34,2 Viruso kontrolė 8,33±0,17 22,45±1,18 21,3-23,6 4,83±0,21 33,95±1,40 32,6-35,3

NaOCl, 0,1 proc. ≤1,53 ≥404 - Netirta Netirta Netirta

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 frakcija 2 frakcija 3 frakcija Teig. kontrolė Neig. kontrolė

Ti

tr

as,

log

29 NaOCl, 0,05 proc. 3,83±0,21 29,92±0,67 29,2-30,7 Netirta Netirta Netirta

Pagrindinė viruso

kontrolė 8,75±0,16 20,98±0,43 20,5-21,5 Netirta Netirta Netirta

Paaiškinimai: 1_{Ct±sd – ciklų skaičius ± standartinis nuokrypis;} 2_{CI – pasikliautinis intervalas;} 3 _{1.5 log10 – aptikimo}

riba; 4 _{maksimalus ciklų skaičius}

3.5 D. canadense ekstrakto poveikis po užkrėtimo GHV-1

Toliau buvo tiriamas kanadinės jakšūnės priešvirusinis efektyvumas po ląstelių užkrėtimo GHV-1, t.y. kaip D. canadense ekstraktas sumažina viruso titrą po infekcijos. Kaip teigiama kontrolė buvo naudotas acikloviras skirtingomis koncentracijomis, o GHV-1 užkrėstos ląstelės kaip neigiama kontrolė. Buvo vertinamas virusų, esančių ląstelės viduje ir palikusių jas, titras ir taip pat tuo pačiu metu buvo tirtas virusų, asocijuotų su ląstele ir palikusių ląsteles (laisvųjų virusų) titras.

Nustatinėjant laisvojo viruso kiekį (kai dalis viršutinio terpės sluoksnio iš duobučių po inkubacijos buvo paimta tyrimui), pastebėta, kad mažiausias viruso titras buvo aptiktas ląsteles veikiant 100 μg/ml acikloviro (2,75±0,25 log10) ir 29 μl/ml D. canadense ekstrakto (2,5±0,01 log10; 10 pav.).

10 pav. Ekstraceliulinio (laisvojo) viruso titro palyginimas, esant skirtingiems acikloviro (AC,

teigiama kontrolė) kiekiams, D. canadense ekstraktui ir viruso kontrolei (VK, neigiama kontrolė)

Nustačius likusio viruso, esančio ląstelių viduje ir palikusio ląsteles, kiekį, pastebėta, kad mažiausias viruso kiekis buvo nustatytas paveikus užkrėstas ląsteles D. canadense ekstraktu (29

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 AC 100 μg/ml AC 50 μg/ml AC 25 μg/ml D. canadense 29 μl/ml VK Ti tr as, L og 10

30 μl/ml; 4,25±0,38 log10). Virusų titras buvo ženkliai mažesnis, nei kontroliniame mėginyje ar mėginiuose, kur buvo naudojamas acikloviras (p< 0,01; 11 pav.).

11 pav. Viruso replikacinės savybės veikiant skirtingiems aciklovirui (AC, teigiama kontrolė) ir D.

canadense ekstraktui. Nustatytas bendras viruso kiekis (ekstraceliulinis laisvasis virusas ir intraceliulinis virusas, esantis ląstelės viduje). Kaip neigiama kontrolė (VK) buvo tiriamas nepaveiktas medžiagomis virusas

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 AC 100 μg/ml AC 50 μg/ml AC 25 μg/ml D. canadense 29 μl/ml VK Ti tr as, Log 10

31

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Yra nustatyta, kad nemažai medicininių augalų ir žolelių pasižymi ir priešvirusiniu poveikiu. Šiame tyrime buvo analizuotas poveikis prieš GHV-1, naudojant 16 skirtingų augalinių ekstraktų, priklausančių 15 rūšių augalų, auginamų Lietuvoje. Pradžioje buvo atlikta atranka, kuri parodė, kad du augaliniai ekstraktai pasižymi vidutinišku virucidiniu poveikiu (S. montana, O. vulgare), o

Desmodium canadense ekstraktas – aukštu poveikiu prieš GHV-1 (6 pav.).

Mūsų tyrimuose augalų ekstraktų priešvirusinėms savybėms tirti buvo panaudota patogeninė laboratorinė GHV-1 4016 padermė (15). Ši viruso padermė pasižymi tuo, kad yra adaptuota MDBK ląstelių kultūroje ir po replikacijos viruso titras gali siekti 108,75 _{AKID50/ml. Būtent įvairių} medžiagų priešvirusinėms, o ypač virucidinėms savybėms įvertinti rekomenduojama naudoti viruso padermes, pasižyminčias aukštu replikaciniu titru ląstelių kultūrose (55).

Yra tikimybė, kad poveikį prieš GHV-1 turi O. vulgare eteriniai aliejai. Tai buvo tirta naudojant žmonių I tipo herpes virusą, kurio apvalkalas buvo pažeistas atliekant gydymą O. vulgare eteriniu aliejumi. (56) Taip pat yra atliktų tyrimų su įvairiais kitais augaliniais ekstraktais, pavyzdžiui Prunus myrtifolia ir Symphyopappus compressus, kurių metu buvo nustatytas efektyvus poveikis prieš GHV-1, kai didžiausia necitotoksinė koncentracija siekia 1000 μg/ml (57).

Anksčiau atlikti tyrimai parodė, kad preparatai su S. montana pasižymėjo poveikiu prieš žmonių I tipo imunodeficito virusą (58). Šio tyrimo autoriai mano, kad veikliosios sudėtinės dalys ekstrakte yra vandenyje tirpios poliarinės medžiagos.

Mūsų atliktame tyrime M. piperita ir T. vulgaris ekstraktai nepasižymėjo poveikiu prieš GHV-1. Tačiau kiti tyrimai parodė, kad M. piperita ir T. vulgaris hidroalkoholiniai ir vandeniniai ekstraktai pasižymėjo reikšmingu poveikiu prieš žmonių herpes virusus HSV-1 ir HSV-2 (59). Vandeninis T. vulgaris ekstraktas pastebimai sumažina viruso titrą, jei Vero ląstelių kultūra apdorojama šiuo ekstraktu prieš užkrečiant ląsteles HSV-1, tymus ir kiaulytę sukeliančiais virusais (60).

Nėra daug informacijos apie tyrimus, atliktus analizuojant D. canadense poveikį prieš virusus. Yra žinoma, kad D. canadense sudėtyje esantys polifenoliai slopina žmonių Herpes zoster ir Herpes

simplex vystymąsi (61, 62). Yra nustatyta, kad Lietuvoje auginama kanadinė jakšūnė kaupia daug

flavanoidų, kurie pasižymi poveikiu prieš Herpes simplex virusus (19, 63). Mūsų tyrimas su skirtingais D. canadense augalinio ekstrakto kiekiais rodo, kad kuo didesnė šio ekstrakto koncentracija, tuo efektyvesnis herpes viruso titro sumažinimas, t.y. šio augalo ekstraktas pasižymi stipriu virucidiniu poveikiu net nedidelėje koncentracijoje (7 pav.). Yra aprašyta, kad tyrinėjant

32

Phyllanthus orbicularis vandeninio ekstrakto poveikį GHV-1, jo poveikio efektyvumas taip pat

priklausė nuo koncentracijos (64).

Tiriant kanadinės jakšūnės ekstrakto poveikio efektyvumą skirtingais laiko intervalais ir lyginant su natrio hipochlorito poveikiu (teigiama kontrolė), galime pastebėti, kad šio ekstrakto poveikis yra lėtesnis nei NaOCl, tačiau poveikis pakankamai stiprus ir jau po 30 minučių buvo reikšmingai aukštas (6 pav.) Mūsų nuomone, tokiems rezultatams reikšmės turėjo D. canadense kaupiamos aktyvios farmokologinės medžiagos, tokios kaip fenoliniai junginiai. Prieš tyrimą buvo tikėtasi, kad NaOCl poveikis turėtų būti kur kas efektyvesnis nei augaliniai ekstraktai, tačiau lyginant jų poveikius, skirtumas buvo nedidelis (3 lentelė). Tokiems rezultatams reikšmės galėjo turėti galvijų serumo baltymai, esantys ląstelių kultūrų terpėje, nes būtent terpė su 2 proc. fetalinio veršelių serumo (FVS) buvo naudojama viruso atskiedimų paruošimui ir tiriamųjų medžiagų mišiniuose. Kitais tyrimais šis efektas jau buvo pastebėtas, kai buvo nustatyta, kad NaOCl poveikis prieš žmogaus imunodeficito virusus gali būti sumažintas dėl kraujo serume esančių baltymų (65).

Mūsų atliktas tyrimas parodė, kad D. canadense ekstraktas pasižymėjo panašiu (bet žymiai lėčiau veikiančiu) viruso inakyvavimo poveikiu kaip ir NaOCl (0,05-0,1 proc. konc.). Panaudojus 0,05 proc. NaOCl koncentraciją, viruso titras buvo 3,8 log10, todėl tokia koncentracija nebuvo visiškai reikšminga, priešingai nei 0,1 proc. koncentracijos NaOCl (≤1,53 _{log10). Mūsų nuomone,} 0,1 proc. koncentracijos NaOCl visiškai inaktyvavo GHV-1 per 1 valandą (nustatytas kontakto laikas). Viruso titro tyrimai koreliavo su realaus laiko PGR tyrimo rezultatais, kurie buvo išreikšti ciklų skaičiumi, reiškiančiu, kad kuo daugiau ciklų skaičių, tuo viruso DNR mėginyje yra mažiau (3 lentelė).

Tyrinėjant skirtingas D. canadense ekstrakto frakcijas, mūsų tyrimas parodė, jog efektyviausiai prieš GHV-1 veikia antroji (50 proc. etanolio) frakcija (9 pav.). Literatūra nurodo, kad naudojant etanolį, praskiestą su vandeniu, tokio tirpalo poliškumas tampa kur kas didesnis. Todėl, augale vyraujantys poliški junginiai gali būti išskirti geriau (66). Mūsų nuomone, lyginant trijų D. canadense ekstrakto frakcijų skirtingas koncentracijas, frakcija su 90 proc. etanolio buvo nepakankamai atskiesta vandeniu, kad efektyviai išskirtų poliškus junginius. Kai vandens kiekis tirpiklyje viršija 30 proc., gautas lignanų (augalinių hormonų, fenolių junginių) kiekis sumažėja. Yra žinoma, kad etanolis yra geras organinis tirpiklis, kuriame tirpsta organiniai junginiai, o esant dideliam kiekiui neorganinio tirpiklio t.y. vandens, junginių tirpumas ir išskyrimas sumažėja (67). Todėl frakcija su 10 proc. etanolio galėjo nepakankamai gerai ištirpinti augale esančias veikliąsias chemines medžiagas.

Tiriant, kiek lieka laisvo ekstraceliulinio GHV-1 panaudojus žinomą antiherpetinį vaistą - aciklovirą (teigiama kontrolė), efektyviausią poveikį pastebėjome panaudojus 100 μg/ml šio

33 preparato. Literatūroje yra aprašoma, kad acikloviras slopina Herpes simplex viruso DNR polimerazę. Yra aprašyta, kad acikloviras efektyviai stabdė žmonių herpes virusų replikaciją koncentracijose nuo 0,5 iki 0,8 μg/ml HSV-1 ir nuo 1,3 iki 2,2 μg/ml HSV-2 infekcijos atvejais (68). Pagal mūsų tyrimą, acikloviras (100 μg/ml) ir kanadinės jakšūnės ekstraktas pasižymėjo panašiu poveikiu, tačiau D. canadense ekstraktas efektyviau stabdė viruso pumpuravimą iš ląstelių (10 pav.). Nustačius likusio viruso, esančio ląstelių viduje ir viruso, palikusio ląsteles, D. canadense ekstrakto poveikis užkrėstoms ląstelėms buvo taip pat didesnis nei acikloviro (100 μg/ml, 11 pav.) Įdomu tai, kad mūsų atlikto tyrimo metu acikloviras nebuvo efektyvus prieš GHV-1. Tai gali būti dėl to, kad ši viruso padermė pasižymėjo atsparumu šiam preparatui. Mokslininkų nuomone, herpes virusų padermės laikomos atspariomis aciklovirui tuo atveju, jei preparato efektyvi dozė yra ≥ 2 µg/ml (69). Mūsų nuomone, atsparumą galėjo lemti tai, kad naudojome viruso laboratorinę padermę, persėtą ląstelių kultūroje daug kartų. Dėl persėjimų metu vykstančios viruso atenuacijos galėjo išsivystyti viruso atsparumas aciklovirui. Literatūroje yra aprašomi atvejai, kai persėjant ląstelių kultūrose atsiranda viruso mutacijos, jos kaupiasi ir išsivysto atsparumas gydymui naudojamiems aciklovirams (70). Herpes viruso atsparumas aciklovirui gali susiformuoti dėl pokyčių TK gene, TK geno aktyvumo sumažėjimo ar net dėl visiško TK geno netekimo. Būtent su šiuo herpes virusų genu siejamas tiek patogeniškumas, tiek ir šių virusų atsparumas aciklovirui (70, 71).

Šiame mūsų atliktame tyrime buvo nustatyta, kad didelė dalis augalinių ekstraktų pasižymėjo virucidinėmis savybėmis. Augalų etanoliniai ekstraktai yra sudaryti iš įvairiausių biologiškai aktyvių medžiagų ar junginių mišinių. Todėl yra tikimybė, kad antivirusinis poveikis pasireiškia dėl kelių junginių derinių. Ateityje verta atlikti tyrimus, leisiančius nustatyti augalų ekstraktų antivirusinio poveikio mechanizmą. Taip pat būtų naudinga identifikuoti veikliąsias medžiagas ar junginius, turinčius virucidinį ar/ir antivirusinį poveikį. Be abejo, taikant klasikinius virusologinio tyrimo metodus dešimtims, o gal net šimtams biologiškai aktyvių komponentų identifikuoti būtų pernelyg sudėtingas darbas. Todėl daugybinei duomenų analizei atlikti praverstų neseniai pradėta taikyti hierarchinė klasterizacija (72).

Apibendrinant šio tyrimo rezultatus, galime teigti, kad D. canadense hidroalkoholinis ekstraktas veiksmingai mažina viruso aktyvumą ir replikaciją užkrėstose ląstelėse, o ateityje galėtų būti naudojamas kuriant veiksmingus antivirusinius vaistus, tinkamus gydyti aciklovirui atsparių herpes virusų sukeltas infekcijas.

34

IŠVADOS

1. Efektyviausiai prieš GHV-1 veikė kanadinės jakšūnės (D. canadense) ekstraktas (viruso titro sumažinimo faktorius 5,00±0,25 log10 AKID50). Vidutinišku poveikiu prieš GHV-1 pasižymėjo kalninio dašio (Saturea montana) ir paprastojo raudonėlio (Origanum vulgare) ekstraktai (viruso titro sumažinimo faktorius 3,00±0,21 ir 2,25±0,27 log10 AKID50 atitinkamai).

2. D. canadense ekstrakto virucidinis poveikis priklausė nuo ekstrakto kiekio ir efektyviausiai veikė naudojant 29 μl/ml ir 58 μl/ml koncentraciją (viruso titro sumažinimo faktorius 5 log10).

3. D. canadense ekstrakto virucidinis poveikis buvo pastebimas jau po 15 min. ekspozicijos, o dižiausias poveikis nustatytas po 45 minučių.

4. Efektyviausią poveikį prieš GHV-1 turėjo II-oji (50 proc. etanolio) frakcija (viruso titro sumažinimo faktorius 5,5 log10 AKID50).

5. D. canadense ekstraktas pasižymėjo ir stipriomis antivirusinėmis savybėmis. Po ląstelių užkrėtimo GHV-1 šis ekstraktas veiksmingai sumažino viruso replikaciją nuo 8,33 log10 (viruso kontrolė) iki 4,67 log10, kas prilygo ar net viršijo etaloninio priešherpesvirusinio preparato acikloviro efektyvumą.

35

REKOMENDACIJOS

Atsižvelgiant į mūsų atliktą tyrimą ir kitus pasaulyje atliktus tyrimus, kuriais patvirtinamas efektyvus augalinių ekstraktų poveikis prieš gyvūnų herpes virusus, atlikus papildomus tyrimus, rekomenduojame augalinius ekstraktus naudoti kaip priešvirusinių preparatų sudedamąsias dalis.

36

PADĖKA

Norėčiau nuoširdžiai padėkoti Valstybinės maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Virusologinių tyrimų skyriaus vedėjai dr. Ingridai Jacevičienei už pagalbą vykdant mūsų pasirinktą tyrimą.

Taip pat, Vytauto Didžiojo universiteto prof. habil. dr. Audriui Sigitui Maruškai ir prof. dr. Onai Ragažinskienei už pagalbą ir už galimybę panaudoti augalinius ekstraktus mūsų tyrime.

Nuoširdžiai dėkoju dr. Raimundui Lelešiui už skirtą laiką PGR atlikimui ir analizei, naudingos informacijos ir žinių dalinimąsi.

Didžiausią padėką reiškiu savo darbo vadovui prof. dr. Algirdui Šalomskui už kantrybę, dėmesį, pagalbą ir skirtą laiką atliekant tyrimą bei ruošiant baigiamąjį darbą. Taip pat, už pagalbą lavinti laboratorinius įgudžius ir savo žinių perteikimą. Ačiū, kad esate puikus mokytojas.

37

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Tilburt J.C, Kaptchuk T.J. Herbal medicine research and global health: an ethical analysis. Bull World Health Organ. 2008 Aug; 86(8): 594–599.

2. Bisset N.G, Wichtl M. Herbal drugs and phytopharmaceuticals: a handbook for practice on a scientific basis. [edited and translated from the second German edition] Stuttgart: Medpharm; Boca Raton; London: CRC, 2001.

3. The Scientific Foundation for Herbal Medicinal Products. Escop, European Scientific Cooperative on Phytotherapy, Thieme, 2003.

4. Drevinskas T, Mickienė R, Maruška A ir kt. Confirmation of the antiviral properties of medicinal plants via chemical analysis, machine learning methods and antiviral tests: a methodological approach. Analytical Methods, Issue 16, 2018. DOI: 10.1039/C8AY00318A. 5. Janulis V. Naujas biologiškai aktyvių junginių, pasižyminčių priešvirusiniu ir hipoazoteminiu

veikimu, augalinis šaltinis – Desmodium Canadense D.C. [darbas habilituoto daktaro laipsniui įgyti] Kauno medicinos universitetas. Kaunas, 1993. 9-76 p.

6. Šimonienė G. Desmodium canadense D.C. preparato Helepino D imuno stimuliuojančių savybių eksperimentiniai tyrimai [daktaro disertacija: biomedicinos mokslai, biologija]. Kauno medicinos universitetas. Kaunas 2000. 6-9 p.

7. Adlakha S.C, Sharma S.N. Textbook Of Veterinary Virology. Ibcp Publisher, India, 2009. 8. Graham D.A. Bovine herpes virus-1 (BoHV-1) in cattle–a review with emphasis on

reproductive impacts and the emergence of infection in Ireland and the United Kingdom. Ir Vet J. 2013; 66(1): 15. DOI: 10.1186/2046-0481-66-15.

9. Jacevičius E. Galvijų infekcinio rinotracheito epidemiologinė padėtis, diagnostika, profilaktika ir prevencija Lietuvoje. Daktaro disertacijos santrauka, Žemės ūkio mokslai, veterinarinė medicina, Kaunas, 2012.

10. Arvin A, Campadelli-Fiume G, Mocarski E et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Cambridge University Press, Aug 16, 2007.

11. Pozzo D.F, Thiry E. Antiviral chemotherapy in veterinary medicine: current applications and perspectives. Rev Sci Tech. 2014 Dec; 33(3):791-801.

12. Parry J. Use of antiviral drug in poultry is blamed for drug resistant strains of avian flu. BMJ. 2005 Jul 2; 331(7507):10. DOI: 10.1136/bmj.331.7507.10.

13. FDA prohibits use of human anti-influenza drugs in poultry. JAVMA, May 01, 2006.

14. Cogliani C, Goossens H, Greko C. Restricting antimicrobial use in food animals: lessons from Europe. Microbe 6, 274–279, 2011.