Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „MAISTO PAPILDŲ, SUDĖTYJE TURINČIŲ L – ARGININO, TYRIMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS – MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU“.

5 priedas

DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „MAISTO PAPILDŲ, SUDĖTYJE TURINČIŲ L – ARGININO, TYRIMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS – MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas)

vardas, pavardė) Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

KRISTINA ŠADŽIŪTĖ

MAISTO PAPILDŲ, SUDĖTYJE TURINČIŲ L–ARGININO, TYRIMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS–MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. Andrejus Ževžikovas _________ _______

(Parašas) (Data)

Kaunas, 2020

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data

MAISTO PAPILDŲ, SUDĖTYJE TURINČIŲ L–ARGININO, TYRIMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS–MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. Andrejus Ževžikovas _________ _______

(Parašas) (Data)

Kaunas, 2020

Darbą atliko Magistrantė Kristina Šadžiūtė Data

Recenzentas Vardas Pavardė Parašas

Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 7

SUMMARY ... 8

SANTRUMPOS ... 10

ĮVADAS ... 12

TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 14

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 15

1.1 L-arginino charakteristika ... 15

1.2 Fiziologinė ir biologinė funkcija ... 16

1.3 L-arginino poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 18

1.4 L-argininas ir nėštumas ... 19

1.5 L-argininas ir fizinis našumas sporte ... 20

1.6 Analizės metodai ... 22

1.6.1 Analizė taikant ESC metodus ... 23

1.6.2 Analizė taikant DC-MS metodus ... 25

2. TYRIMO METODIKA ... 28

2.1 Tyrimo objektas ... 28

2.2 Maisto papildų atranka ... 28

2.3 Tiriamų maisto papildų sudėtis ... 28

2.4 Priemonės ir prietaisai ... 29

2.5 Medžiagos ... 29

2.6 Chromatografavimo sąlygos ... 29

2.7 Standartinio tirpalo paruošimas... 30

2.8 Kapsulių mėginių paruošimas ... 30

2.9 Duomenų analizės metodai ... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1 Metodo ir sąlygų parinkimas ... 31

3.2 Metodo validacija ... 32

3.2.1 Specifiškumas ... 32

3.2.2 Glaudumas ... 34

3.2.3 Tiesiškumas ... 35

3.2.4 Aptikimo ir kiekinio nustatymo ribos ... 35

3.3 DC-MS analizės rezultatai ... 36

IŠVADOS... 38

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40

SANTRAUKA

MAISTO PAPILDŲ, SUDĖTYJE TURINČIŲ L–ARGININO, TYRIMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS–MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU K. Šadžiūtės magistro baigiamasis darbas; mokslinis vadovas prof. A. Ževžikovas;

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.

Darbo tikslas: Atlikti Lietuvoje notifikuotų maisto papildų, kurių sudėtyje yra L–arginino, kokybinę ir kiekinę analizę pasitelkus dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodą.

Tyrimo objektas: 3 skirtingi Lietuvos Respublikoje notifikuoti maisto papildai, kurių sudėtyje yra L–arginino, pirkti vaistinėse ir internetinėse parduotuvėse.

Tyrimo metodai: Analizė atlikta taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodą.

Naudota dujų chromatografinė sistema Shimazdu GC-2010 plus su masių spektrometrijos detektoriumi. Gaminti metanoliniai mėginių tirpalai, derivatizacijai naudojant derivatizacijos reagentą BSTFA + TMCS. Naudota spausto silikagelio kolonėlė (Rxi

-5ms): 30 m ilgio ir 0,25 µm skersmens, nejudančios fazės sluoksnio storis - 0,25 µm. Kolonėlės temperatūra 75 °C.

Rezultatai ir išvados: Analizės metu dujų chromatografijos sistemos buvo užfiksuotas L/D–

ornitinas vietoj L–arginino, rezultatai vėliau perskaičiuoti pasitelkus 80 proc. reakcijos išeigą, rastą literatūros šaltiniuose. Didžiausias L–arginino kiekis buvo rastas K3 maisto papilde - 482,74 mg/kaps, , mažiausias - K2 maisto papilde - 180,7 mg/kaps.

Raktiniai žodžiai: maisto papildai; L–argininas, dujų chromatografija-masių spektrometrija;

ornitinas.

SUMMARY

Analysis of food supplements containing L–arginine using gas chromatography–mass spectrometry method

Aim: To perform qualitative and quantitative analysis of food supplements containing L–

arginine, which are notified in Lithuania.

Object: 3 different food supplements, notified in Lithuania and aquired at a pharmacy and through online shops.

Methods: Gas chromatography-mass spectrometry method was used , analysis carried out using gas chromatography system Shimadzu GC-2010 plus paired with mass spectrometry detector.

Analytes were made using methanol as the solvent and derivatization was done using BSTFA + TMCS reagent. Column used - Rxi

-5ms: 30 m lenght, 0,25 µm i.d, 0,25 µm stacionary phase layer thickness, column temperature was 75 °C.

Results and conclusions: During the chromatographic analysis, the gas chromatography system registered L/D–ornithine rather than L–arginine. The results were later calculated using an 80 percent yield, that was found in literary sources. K3 food supplement had the highest amount of L–arginine - 482,74 mg per caps, and K2 food supplement had the lowest - 180,7 mg per caps.

Keywords: food supplements; gas chromatography-mass spectrometry; L–arginine; ornithine.

PADĖKA

Už suteiktą pagalbą ir palaikymą dėkoju savo darbo vadovui prof. A. Ževžikovui, taip pat

už suteiktą visokeriopą pagalbą (tiek laboratorijoje, tiek ekstremalios situacijos metu) iš visos

širdies dėkoju prof. L. Ivanauskui ir lekt. M. Marksai.

SANTRUMPOS

3 - MPA - 3-merkaptopropioninė rūgštis (angl. 3 – mercaptopropionic acid)

9 - FMOC Cl - 9 - fluorenilmetoksikarbonilo chloridas (angl. fluorenylmethoxycarbonyl chloride)

ACN - acetonitrilas

ADP - adenozino difosfatas

AF ESC - atvirkščiųjų fazių efektyvioji skysčių chromatografija ATP - adenozino trifosfatas

BSTFA + TMCS - N,O-bis(trimetil-silil)-trifluoroacetamidas + trimetilchlorsilanas (angl. N,O- bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide + trimethylchlorosilane)

cGMP - ciklinis guanozino monofosfatas

DC-MS - dujų chromatografija – masių spektrometrija DEPC - dietilpirokarbonatas (angl. diethyl pyrocarbonate)

EDTA - etilendiamintetraacto rūgštis (angl. ethylenediaminetetraacetic acid) ESC - efektyvioji skysčių chromatografija

ESI - elektrinė purškiamoji jonizacija (angl. electrospray ionization)

HILIC - hidrofilinės sąveikos chromatografija (angl. hydrophylic interaction chromatography) HOMA-IR - atsparumo insulinui homeostazinis vertinimo modelis (angl. homeostasis model assessment insuline resistance)

JAV - Jungtinės Amerikos Valstijos JK - Jungtinė Karalystė

MBTFA - N-metil-bis(trifluoracetamidas) (angl. N-methyl-bis(trifluoroacetamide))

MMP - matrikso metaloproteinazė

MS/MS - tandeminė masių spektrometrija

MSTFA - N-trimetilsilil-N-metiltrifluoracetamidas (angl. N-trimethylsilyl-N-methyl trifluoroacetamide)

MTBSTFA - N-metil-N-(tret-butildimetilsilil)trifluoroacetamidas (angl. N-tert- butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide)

NO - azoto oksidas (angl. nitric oxide)

NOS - azoto oksido sintazė (angl. nitric oxide synthase) OPA-O - ftalaldehidas (angl. o-phthalaldehyde)

PITC - fenilizotiocianatas (angl. phenylisothiocyanate)

PWC

- fizinis pajėgumas ties nuovargio slenksčiu (angl. physical working capacity at the fatigue treshold)

SSN - santykinis standartinis nuokrypis TFA - trifluoracil (angl. trifluoroacyl) TMS - trimetilsilil (angl. trimethylsilyl)

VEGF - kraujagyslių endotelio augimo faktorius (angl. vascular endothelial growth factor)

ĮVADAS

L–argininas yra alfa amino rūgštis, viena iš 20 pagrindinių, baltymus sudarančių amino rūgščių. Pirmą kartą 1886 metais išskirta iš Geltonųjų lubinų (Lupinus luteus) gemalų dviejų chemikų – E. Schulze ir E. Steiger, o S. G. Hedin 1895 metais šią amino rūgštį išskyrė iš gyvūnų ragų. Pavadinimas kilęs nuo graikų kalbos žodžio „argiros“ (liet. – sidabras, baltas metalas), kurį suteikė E. Schulze dėl medžiagos panašumo į sidabrą [50].

L–argininą galima sutikti įvairių maisto papildų sudėtyje – dažniausiai skirtuose sportininkams padidinti jų darbo našumui, bet taip pat papilduose, kurie skirti gerinti širdies ir kraujagyslių sistemos veiklai, kompleksiniuose papilduose, skirtuose pagerinti smegenų veiklą ir atmintį ar papilduose, kurie skirti vyrams didinti potenciją. L–argininas taip pat dažnai įeina ir į kosmetikos bei odos priežiūros priemonių sudėtį - skatina žaizdų gijimą, odos ląstelių regeneraciją.

Klinikinių studijų, kurių metu buvo tiriama L–arginino vartojimo įtaka sportininkų fiziniam našumui, išvados gana skirtingos – dalis jų pažymi, kad šių papildų vartojimas (tiek vienkartinėmis dozėmis, tiek ilgesnį laiką) fizinį našumą didina minimaliai, kartais net statistiškai nereikšmingai [5, 34, 42], o kita dalis – kad L–argininas iš tiesų pasižymi ergogeniniu poveikiu [12, 28, 39]. L–arginino papildų vartojimo nauda pastebėta širdies ir kraujagyslių sistemai [20], taip pat nėštumo metu – preeklampsijos ir eklampsijos prevencija [11], tačiau vis dar trūksta tyrimų su didesnėmis imtimis ir trunkančių ilgesnį laiko tarpą.

L–arginino paklausa pasaulyje didėja, 2020 metų pasaulinės rinkos kaina siekė 572 milijonus JAV dolerių, prognozuojama, jog ji tik kils ir sieks 954,3 milijonus JAV dolerių 2026 metų gale [43]. Susidomėjimas L–arginino maisto papildais didėja dėl to, kad tai reklamuojama kaip medžiaga, kuri teigiamai veikia širdies ir kraujagyslių sistemą, didina fizinį našumą, taip pat lėtina senėjimo procesus, mažina uždegimą, padeda valdyti migrenas, stiprina imunitetą, tačiau trūksta tyrimų ir įrodymų kai kuriems tokiems pareiškimams pagrįsti [33].

Tinkami ir jautrūs kiekinės ir kokybinės analizės metodai yra svarbūs ne tik L–arginino

maisto papildų sudėčiai įvertinti ir nustatyti, kiek skiriasi nuo deklaruojamos ant pakuotės, tačiau

kadangi ši amino rūgštis yra sintetinama ir mūsų organizme, jos (ir metabolitų) kiekiai kraujo

plazmoje reikalingi genetinių, metabolinių ir onkologinių ligų diagnozavimui. Dažniausiai taikomi

instrumentinės analizės metodai – chromatografiniai [35]. Platus pasirinkimas ir pritaikymas,

greitumas, paprastumas ir jautrumas daro šiuos metodus patraukliais tiek kokybinei, tiek kiekinei

maisto papildų ir biologinių skysčių analizei.

TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Atlikti L–arginino skirtingų, Lietuvoje notifikuotų, maisto papildų kokybinę ir kiekinę analizę pasitelkiant dujų chromatografijos - masių spektrometrijos metodiką ir palyginti juose nustatytos amino rūgšties kiekius su gamintojo deklaruojamais ant maisto papildų pakuočių.

Darbo uždaviniai:

1. Išanalizavus įvairius literatūros šaltinius, atrinkti tinkamiausią metodiką L–arginino kokybinei ir kiekinei analizei.

2. Pritaikyti ir validuoti atrinktą dujų chromatografijos - masių spektrometrijos metodiką L- arginino turinčių maisto papildų kokybinei ir kiekinei analizei.

3. Pasitelkus modifikuotą dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodiką atlikti maisto papildų, kurių sudėtyje yra L–arginino kokybinę ir kiekinę analizę įvairios sudėties Lietuvoje notifikuotuose maisto papilduose.

4. Palyginti skirtingų Lietuvoje notifikuotų maisto papildų, kurių sudėtyje yra L–arginino,

kiekinę sudėtį su gamintojo deklaruojama ant maisto papildų pakuočių.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 L-arginino charakteristika

L-argininas (2–amino–5–guanidinpentano rūgštis) – tai yra viena iš 20 pagrindinių, baltymus sudarančių, amino rūgščių. Struktūriškai tai klasifikuojama kaip alfa amino rūgštis, pasižymi bazinėmis savybėmis, yra iš dalies pakeičiama [9,10]. Poreikis priklauso nuo organizmo būklės ir augimo stadijos – naujagimiams, patyrusiems traumas, sepsį ar nudegimus yra būtina ir nepakeičiama. Egzogeninio arginino reikia gauti daugiau, nes endogeninio arginino sintezės nepakanka patenkinti organizmo poreikius [4]. L-argininas organizme yra azoto oksido (NO) prekursorius.

1 pav. L–argininas [3]

Tai balti ar beveik balti kristaliniai milteliai, kurie lengvai tirpsta vandenyje ir nedaug tirpūs alkoholyje [22]. Bazines savybes suteikia šoninė guanidino grupė, kuri išlaiko teigiamą krūvį neutralioje, rūgštinėje ir bazinėje aplinkoje. Dėl konjugacijos tarp dvigubųjų ryšių ir nesuporuotų azoto grupių, teigiamas krūvis delokalizuotas. Guanidino grupė gali formuoti net kelis vandenilinius ryšius. pKa – 12,48 [28].

Absorbcija vyksta plonajame žarnyne, L-argininas aktyviosios pernašos būdu patenka į

enterocitus, ten dalis jo metabolizuojama, kita dalis metabolizuojama kepenyse, pusinis

eliminacijos laikas 1,5 – 2 val. [6,9], transportuojamas ta pačia sistema kaip ornitinas, lizinas ir

cisteinas. 5 proc. gauto arginino yra sunaudojama šlapalo sintezei, mažiau negu 5 proc. azoto

oksido sintazės (NOS) konvertuojama į NO, likusi dalis naudojama baltymų sintezei [4].

Fermentai atsakingi už L-arginino katabolizmą – I ir II arginazės, plačiai pasiskirstę visame organizme. I tipo arginazė yra citozolinis fermentas, daugiausiai jo yra kepenų ląstelėse, taip pat žaizdų fibroblastuose. II tipo arginazė yra mitochondrinis fermentas, jo organizme yra mažiau, jo yra inkstuose, smegenyse, plonajame žarnyne, makrofaguose [4, 10, 15]. Abi

fermento izoformos katalizuoja arginino hidrolizę į ornitiną ir šlapalą [4]. Azoto oksido sintazės (NOS) yra 3 tipų – endotelinė (eNOS), esanti kraujagyslių endotelyje, neuroninė (nNOS), kuri vyrauja nervų sistemos audiniuose ir citokinų indukuojama (iNOS), kurios yra imuninės sistemos ląselėse [15].

L-argininas yra gaunamas su maistu, daugiausiai jo yra mėsoje, žuvyje, sojos baltymuose ir riešutuose, taip pat susidaro endogeninių baltymų apykaitos metu (apie 80 proc.) ir

sintetinamas de novo iš citrulino (10-15 proc). Sveiko organizmo poreikiams patenkinti

reikalinga 15-20 g arginino kasdien, todėl su maistu turėtų būti gaunama 4-6 g. Tipinė arginino koncentracija plazmoje turi būti 80-120 µM [4].

Pagrindiniai metaboliniai keliai, kuriuose dalyvauja argininas: [4]

1. Ornitino ir šlapalo ciklas (azoto atliekų detoksikacija).

2. Azoto oksido sintezė (vazodilatacija, antiaterosklerotinis poveikis).

3. Kreatinino sintezė (dalyvauja ADP perdirbime į ATP, pildomos energijos atsargos).

4. Poliaminų sintezė (agmatino prekursorius - reguliuojama ląstelių proliferaciją).

1.2 Fiziologinė ir biologinė funkcija

Pagrindiniai audiniai ir ląstelės, kuriuos veikia L-argininas ir jo metabolitai – kraujagyslių endotelis, smegenų ląstelės, imuninės uždegiminės ląstelės – limfocitai, makrofagai, neutrofilai, trombocitai, hepatocitai [15].

 Baltymų sintezė ir degradacija:

Argininas yra baltymų sintezės substratas, taip pat dalyvauja baltymų kokybės kontrolėje

– veikia kaip žymeklis baltymams, kuriuos reikia sunaikinti [4].

 Rūgščių – bazių homeostazė:

L-argininas yra anaplerotinių Krebso ciklo medžiagų prekursorius, dalyvauja šlapalo cikle – šiame metaboliname cikle yra detoksikuojamos azotos atliekos, taip pat šlapalo cikle sunaudojamas bikarbonatas padeda palaikyti optimalią rūgsčių ir bazių pusiausvyrą organizme [4].

 Imuninė sistema:

L-argininas yra reikalingas imuninių ląstelių metabolizmui, T limfocitų proliferacijai ir aktyvacijai, B limfocitų brendimui, citokinų gamybai ir aktyvacijai (šiuose procesuose dalyvauja abiejų grupių fermentai – araginazės ir azoto oksido sintazės) [4].

 Žaizdų gyjimas:

L-arginino trūkumas gali sąlygoti prastesnį žaizdų gyjimą, šiuo metu vis dar nėra žinomas tikslus veikimo mechanizmas, tačiau yra kelios teorijos: L-argininas skatina kolageno sintezę (veikdamas kaip NO substratas), stimuliuoja T limfocitų atsaką, skatina kolageno sintezę veikdamas kaip prolino substratas [4, 18].

 Širdies ir kraujagyslių sistema:

Azoto oksidas (NO), susintetintas iš L-arginino, yra labai reaktyvios dujos, kurios veikia kaip parakrininė signalinė molekulė – sąlygoja vazodilataciją, mažina trombocitų

agregaciją, pasižymi antiaterosklerotiniu poveikiu, taip reguliuojama kraujotaka ir kraujagyslių tonusas [4, 15].

 Neurologinė funkcija:

NO, kuris sintetinamas neuroninių azoto oksido sintazių, yra svarbus tinkamai smegenų kraujotakai palaikyti, taip pat svarbus kognityvinei funkcijai, atminčiai, informacijos įsisavinimui, uoslei ir miego ciklui palaikyti. Klinikinių studijų nėra atlikta daug, tačiau manoma, kad NO veikia neuroprotekciškai ir gali pagerinti Alzheimerio ir demencijos pacientų būkles [4, 48].

 Seksualinė funkcija

L-argininas reikalingas normaliai spermatogenezei [23], taip pat dėl azoto oksido sukelta vazodilatacija gali padėti esant erekcijos disfunkcijai [4].

 Endokrininė sistema

L-arginininas stimuliuoja prolaktino, žmogaus augimo hormono sekreciją, taip pat didina

ląstelių jautrumą insulinui (mechanizmas nėra tiksliai aiškus, tačiau manoma, kad tai

vyksta azoto oksido dėka) [4]. Atliktas dvigubai aklas tyrimas – antro tipo diabetu

sergantys žmonės, kurie vartojo 3 g per dieną L-arginino papildus mėnesį, jų periferinis ir hepatinis jautrumas insulinui padidėjo, tačiau nesinormalizavo [23].

2012 metais atliktas tyrimas, kuriame dalyvavo 60 nutukusių pacientų, sergančių antro tipo diabetu. Jie vartojo arba 9 g L-arginino, arba placebo 3 mėnesius. Jautrumas insulinui buvo vertinamas pagal HOMA – IR protokolą (homeostasis model assessment insuline resistance). Rezultatai parodė, jog L-arginino vartojimas taip pat statistiškai reikšmingai padidino ląstelių jautrumą insulinui [8].

 Fizinis našumas

L-argininas, veikdamas per AMPK kelią, didina energijos perdirbimą ir ATP atsargas. L- argininas skatina AMP defosforilinimą ir adenozino gamybą, taip didina ATP

regeneraciją aktyvinant AMP kinazę [27].

1.3 L-arginino poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai

Pasak Pasaulio Sveikatos organizacijos (WHO) širdies ir kraujagyslių ligos kasmet nusineša 17,9 milijonus gyvybių [13]. Anot 2016 metų statistikos nuo širdies ir kraujagyslių ligų Lietuvoje mirė daugiau kaip 23 tūkstančiai žmonių [14]. Atlikta metaanalizė – apžvelgti 11 randomizuotų, dvigubai aklų su placebo tyrimų, kuriuose iš viso dalyvavo 387 žmonės, kuriems buvo skirti L-arginino maisto papildai. Lyginant su placebo, L-arginino vartojimas statistiškai reikšmingai sumažino sistolinį (5,39 mm Hg) ir diastolinį (2,66 mm Hg) kraujo spaudimą. Parinkti tyrimai buvo tie, kurių dalyviai nevartojo papildomai jokių antihipertenzinių vaistų ir tyrimas vyko ilgiau nei 4 savaites. Skirtos L-arginino dozės buvo 4-24 g per dieną [20].

Veikimo mechanizmas – L-argininas yra azoto oksido (NO) prekursorius. NO yra signalinė

molekulė, kuri atsakinga už vazodilataciją. L-argininas yra hidroksilinamas ir vėliau oksiduojamas

į NO ir citruliną, susidaręs azoto oksidas difunduoja į lygiųjų raumenų ląsteles, kur veikdamas per

cGMP aktyvina proteino kinazę G, tuomet vyksta kalio kanalų fosforilinimas, sumažėja

viduląstelinis kalcio kiekis ir vyksta miozino skaidulų defosforilinimas – lygieji raumenys

atsipalaiduoja ir kraujagyslė išsiplečia, dėl to ir mažėja spaudimas [26].

Atliktas tyrimas, kurio metu buvo vertinama lėtiniu širdies nepakankamumu sergančių žmonių pagrindinių angiogeninių reguliatorių ir matrikso metaloproteinazės (MMP) aktyvumas serume. Tyrime dalyvavo 33 pacientai, 13 iš jų buvo gydomi standartiškai, 20 – gavo L-arginino intravenines infuzijas 4,2 g/100 ml pirmas 7 dienas ir vėliau kasdien po 6 g L-arginino per os 3 mėnesius. Padidėjusi laisvo VEGF (kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus) koncentracija pastebėta grupėje, kuri vartojo L-argininą, serumo MMP-2 ir MMP-9 aktyvumas šioje grupėje reikšmingai sumažėjo. Sumažėjo ir laisvo angiostatino koncentracija, bei fibronektino degradacijos produktų, todėl panašu, jog L-argininas stumia angiogeninį balansą link neovaskuliarizacijos [47].

1.4 L-argininas ir nėštumas

Preeklampsija yra nėštumo metu (nuo 20 savaitės) atsiradusi hipertenzinė būklė, kuri pasireiškia arteriniu kraujo spaudimu, kuris didesnis nei 140 mm Hg (sistolinis), 90 mm Hg (diastolinis) ir proteinurija. Preeklampsija pasitaiko 2-8 proc. nėštumų. Nevaldoma preeklampsija gali pereiti į eklampsiją. Eklampsija – nėštumo, gimdymo metu ar kelios dienos po gimdymo atsiradę viso kūno traukuliai. Ūminės preeklampsijos komplikacijos gali būti insultas, ūminis inkstų funkcijos nepakankamumas, plaučių edema ir mirtis, ilgalaikės pasėkmės – lėtinė hipertenzija, lėtinis inkstų funkcijos nepakankamumas, koronarinių arterijų ligos ir priešlaikinė mirtis. Visame pasaulyje nuo preeklampsijos ir eklampsijos miršta daugiau kaip 50000 moterų kasmet [24].

Atlikta randomizuotų tyrimų su placebo metaanalizė, kur buvo lyginamas intraveninio arba per os vartojamų L-arginino papildų poveikis nėščiųjų kraujo spaudimui. Apžvelgti 7 tyrimai, iš viso 916 pacienčių. Nustatyta, kad L-argininas sumažina preeklampsijos ir eklampsijos riziką lyginant su placebo, mažina diastolinį kraujo spaudimą, tačiau sistolinio kraujo spaudimo mažėjimas nėra statistiškai reikšmingas. Taip pat tik 3 tyrimuose buvo užfiksuotas šalutinis poveikis, tačiau jis nebuvo teratogeninis ar pavojingas gyvybei – nei nėščiosios, nei vaisiaus [25].

2014 metais atliktas tyrimas, kurio metu buvo aiškinamasi, ar mažesnė L-arginino

koncentracija nėščiųjų serume turi įtakos gestacinės hipertenzijos atsiradimui. Tyrime dalyvavo

186 moterys, I trimestre apie 12 savaitę kraujo mėginiai paimti iš visų, vėliau II ir III trimestro metu kraujo mėginiai buvo atsitiktinai paimti iš 64 moterų. Buvo išsiaiškinta, kad mažesnė L- arginino koncentracija (< 70 µM), bei tokie veiksniai kaip pirmas nėštumas ir viršsvoris, nėštumo pradžioje gali didinti gestacinės hipertenzijos ir preeklampsijos atsiradimo riziką [49].

2016 metais Meksikoje atliktas randomizuotas dvigubai aklas tyrimas su placebo, kuriame dalyvavo 100 moterų aukštos preeklampsijos rizikos grupėje (hipertenzija, pirmas nėštumas, KMI

≥ 30). Nuo 20 nėštumo savaitės 47 pacientės vartojo 3 g placebo, o 49 – 3 g L-arginino per os.

Placebo grupėje preeklampsija pasireiškė 11 moterų, o L-arginino – tik 3. Naujagimių svoriai buvo didesni L-argininą vartojusių moterų grupėje, todėl padaryta išvada, jog L-argininas negydo preeklampsijos, tačiau veikia kaip prevencinė priemonė. Vienintelis užfiksuotas šalutinis poveikis buvo dispepsija [11].

2019 metais atliktas tyrimas, kuriame taip pat buvo tiriamas L-arginino koncentracijos serume ryšys su preeklampsija. Tirta 88 nėščiųjų III trimestre, 46 dalyvių nėštumai buvo normalūs, 30 dalyvių preeklampsija buvo sunkios formos, 12 dalyvių preeklampsija buvo su komplikacijomis. Mažiausias L-arginino koncentracija serume buvo preeklampsijos su komplikacijomis – 28,33 ng/mL, sunkios preeklampsijos grupėje – 34,66 ng/mL, didžiausia L- arginino koncentracija buvo normalaus nėštumo grupėje – 60,91 ng/mL, todėl šis tyrimas parodo, kad gydant ir bandant užkirti kelią preeklampsijos atsiradimui, svarbu įvertinti ir L-arginino koncentracijas serume [45].

1.5 L-argininas ir fizinis našumas sporte

2008 metai atlikto tyrimo metu buvo tiriama trumpalaikio L-arginino maisto papildų

vartojimo įtaka fiziniam našumui. Tyrime dalyvavo 10 elitinių dziudoistų, tyrimas buvo

randomizuotas su placebo – dalyviai 3 dienas vartojo 6 g L-arginino tabletėmis arba placebo. Po

trijų dienų dalyviai atliko aerobinę mankštą su pertraukomis ant dviračio – ergometro (20 s fizinė

veikla maksimaliu individo pajėgumu, 15 s pertrauka, kartota 13 kartų iš eilės – taip buvo bandoma

imituoti dziudo kovą). Kraujo mėginiai iš dalyvių buvo imti prieš, per ir po fizinės veiklos. Tiek

L-arginino, tiek placebo grupėje nitratų ir nitritų koncentracija serume buvo padidėjusi,

lygiagrečiai su citrulino. Nebuvo statistiškai reikšmingo nitratų ir nitritų, amoniako ir laktato koncentracijos skirtumo maksimalaus ir vidutinio pajėgumo metu, todėl šis tyrimas parodė, kad trumpalaikis L-arginino maisto papildų vartojimas neturi įtakos azoto oksido produkcijai, laktato ir amoniako metabolizmui ir bendram atletų sportiniam našumui [35].

Tačiau 2010 metais atliktas tyrimas parodė, kad ilgesnį laiką vartojami L-arginino papildai gali būti naudingi individams be sportinio pasiruošimo – šio dvigubai aklo su placebo tyrimo metu dalyvavo 50 vyrų, kurie neužsiėmė sportu. Dalyviai buvo suskirstyti į 3 grupes – 19 gavo placebo, 14 – 1,5 g L-arginino + 300 mg vynuogių kauliukų ekstrakto, 17 – 3 g L-arginino + 300 mg vynuogių kauliukų ekstrakto 4 savaites kasdien. Dalyviai turėjo minti ergometro pedalus iki kol visiškai pavargo, buvo matuojamas darbo pajėgumas ties nuovargio slenksčiu – PWC

– prieš ir po 4 savaičių papildų vartojimo. PWC

reikšmingai padidėjo 1,5 g grupėje – 22,4 proc., ir 3 g grupėje – 18,8 proc. Placebo grupėje statistiškai reikšmingų pokyčių nebuvo [12].

2011 metų randomizuotame dvigubai aklame tyrime su placebo dalyvavo 15 vyrų, buvo vertinamas raumenų kraujo tūris ir jų aprūpinimas deguonimi, taip pat L-arginino papildų vartojimo įtaka fiziniam našumui. Iš dalyvių buvo paimti kraujo mėginiai prieš tyrimą, skirta vienkartinė 6 g L-arginino arba placebo dozė ir atliekami fiziniai pasipriešinimo pratimai – izokinetiniai koncentriniai alkūnės ištiesimai (3 kartus kartojama po 10 maksimalaus pajėgumo stūmimų), kraujo mėginiai imti pratimų metu ir pabaigus. Rezultatai parodė, jog nitratų kiekis kraujyje ir raumenų aprūpinimas deguonimi tarp grupių statistiškai reikšmingai nesiskyrė, L- arginino papildų vartojimas padidino tik raumenų aprūpinimą krauju, tačiau jėga ir fizinis našumas nepadidėjo [5].

2014 metais Norvegijoje buvo atliktas randomizuotas dvigubai aklas tyrimas, kuriame

dalyvavo 9 slidininkai. Jie gavo vienkartines 6 g L-arginino + 614 mg nitrato, 614 mg nitrato +

placebo arba tik placebo, tuomet turėjo atlikti du 5 minučių trukmės submaksimalaus bėgimo

testus ant bėgtakio, bėgti 180 m ir 5 km su laiko fiksavimu stadione. Ištyrus kraujo plazmą L-

arginino + nitrato grupėje ir nitrato + placebo grupėje, nitritų koncentracija buvo padidėjus

lyginant su placebo grupe, tačiau fiziologinis atsakas nei submaksimalaus, nei 5 km bėgimo metu

nebuvo pakitęs – nepadidėjo nei fizinis našumas, nei ištvermė, nei fizinis pajėgumas [44].

2014 metų tyrimas, kuriame dalyvavo 9 profesionalūs imtynininkai, jiems atsitiktiniu būdu skirta vienkartinė dozė L-arginino (1,5 g x 10 kg

kūno masės) arba placebo po 12 valandų badavimo, fizinių pratimų metu buvo matuojamos deguonies sąnaudos. Tiek L-arginino, tiek placebo grupėje matuotoje laktato koncentracijoje, deguonies sąnaudose ir širdies susitraukimo dažnyje nebuvo skirtumo. Išvargimas L-arginino grupėje (1386,8 ± 69,8 s) ilgiau užtruko nei placebo (1313 ± 90,8 s), todėl pagal rezultatus galima teigti, jog L-arginino papildai gali nežymiai didinti ištvermę [29].

2016 metais Irane atliktas dvigubai aklas, randomizuotas tyrimas su placebo, kuriame dalyvavo 56 futbolininkai, buvo tiriama L-arginino įtaka kūno sudėčiai. Tyrimas vyko 45 dienas, 25 dalyviai kasdien vartojo po 2 g L-arginino, 27 - placebo. Matuotas kūno masės indeksas, riebalinis audinys, liesa kūno masė prieš ir po tyrimo, taip pat matuotas maksimalus deguonies suvartojimas (VO

max). Rezultatai parodė, kad VO

max L-argininą vartojusioje grupėje reikšmingai padidėjo (4,12 ± 6,07) lyginant su placebo (1,23 ± 3,36), tačiau reikšmingų pokyčių antropometriniuose rodikliuose nebuvo užfiksuota. L-arginino papildų vartojimas galėtų padidinti fizinį našumą, tačiau neturi įtakos kūno kompozicijai [41].

Maisto papildai, į kurių sudėtį įeina amino rūgštys, yra labai populiarūs tarp sportininkų ir kultūristų, L-argininas – ne išimtis. Anot šaltinių, L-argininas gali tiek teigiamai, tiek neigiamai veikti inkstų funkciją (jeigu ji jau yra sutrikusi), tačiau esant normaliai inkstų funkcijai saugiai galima vartoti 3-100 g per dieną. L-argininas yra gana gerai toleruojamas, galimas šalutinis poveikis yra lengvas ir retas – pykinimas, vėmimas, viduriavimas [17].

1.6 Analizės metodai

Jautrūs ir specifiški instrumentinės analizės metodai, kuriais yra tiriamas L-argininas, yra

ne tik svarbūs maisto papildų kokybinei ir kiekinei analizei, augalų amino rūgsčių profiliui

įvertinti, tačiau ir nustatyti L-arginino bei jo metabolitų koncentracijai kraujo plazmoje – tai gali

pasitarnauti diagnozuojant genetines, onkologines, širdies ir kraujagyslių sistemos ligas [36].

Apžvelgtoje literatūroje dažniausiai buvo naudojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodai (ESC) – atvirkščiųjų fazių, naudojant hidrofilinę stacionarią fazę, taip pat ir dujų chromatografiją (DC) bei kapiliarinę elektroforezę (KE).

1.6.1 Analizė taikant ESC metodus

Naudojant nepolines kolonėles, L-argininas nėra sėkmingai sulaikomas, nes tai – polinė medžiaga, todėl išeitis yra derivatizacija [37]. Derivatizacija – tai procesas, kurio metu prie junginio prijungiama speciali funkcinė grupė, kuri iš esmės keičia junginio savybes – tirpumą, lakumą, virimo temperatūrą, spalvą, gebėjimą fluorescuoti ar absorbuoti UV spindulius. ESC galima prieškolonėlinė ir pokolonėlinė derivatizacija. Prieš – gali būti spalvota arba UV absorbuojanti medžiaga, po – derivatizatorius įvedamas į chromatografinę sistemą prieš detektorių, didinamas jautrumas ir selektyvumas. Norint atlikti pokolonėlinę derivatizaciją, sistema turi būti modifikuota ir joje turi būti integruota antrinė skysčio padavimo sistema, tekėjimo greičiai turi būti suderinti taip, kad reakcija spėtų įvykti [19].

 Spalvoti ir UV absorbuojantys derivatyvai: amino rūgštys silpnai absorbuoja UV spinduliuotę, todėl pasitelkus derivatizatorius šios medžiagos yra verčiamos į aromatinius derivatyvus, kurie daug stipriau absorbuoja UV ir lengvai aptinkami ESC detektorių net esant ir mažoms koncentracijoms analitėje. Naudojami reagentai – acil-chloridai, izotiocianatai, nitrobenzenai. Derivatizuojamos pirminės amino grupės [19].

 Fluorescencinė derivatizacija: prijungiamas fluorescuojantis ligandas. Amino rūgščių pirmines amino grupes derivatizuoti naudojamas fluorescaminas. Piridoksalio junginiai formuoja Shiff‘o bazes reaguodami su pirminiais aminais, šiam derivatizacijos tipui taip pat naudojama OPA [19].

ESC su hidrofiline stacionare faze (HILIC) yra tinkamas metodas polinių junginių kokybinei

ir kiekinei analizei. Kartu analizei pritaikant tandeminę masių spektrometriją sėkmingai galima

atskirti, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti amino rūgštis analitėje. Lai X ir kolegų (2015)

sukurtoje metodikoje mobili fazė A buvo sudaryta iš 5 mM amonio formiato ir 0,1 proc. forminės

rūgšties vandeninio tirpalo, B fazė buvo sudaryta iš acetonitrilo ir 0,1 proc. forminės rūgšties, taip

sėkmingai buvo nustatyta ne tik L-arginino, tačiau ir ornitino bei citrulino koncentracija plazmos mėginiuose [32], o Li J et al. (2019) sugebėjo atskirti ir kiekybiškai įvertinti net 24 laisvas amino rūgštis (viena iš jų buvo L-argininas) iš MGC803 ląstelių mėginių, šiame tyrime buvo naudota amidinė kolonėlė, fazė A - 10 mM amonio actetatas, B - acetonitrilas [34]. Abiem atvejais derivatizacijos neprireikė. Obreshkova D et al. pasitelkę AF ESC kartu su UV detektoriumi sėkmingai atliko L-arginino maisto papildų kokybinę ir kiekinę analizę taip pat išvengiant derivatizacijos. Mobili fazė buvo 20 mM amonio acetato tirpalas [40].

Derivatizacijos neprireikė ir taikant jungtinį (angl. unified) superkritinių skysčių chromatografijos metodą kartu su ESI masių spektrometrija. Naudojant cviterjonų kolonėlę ir superkritinį anglies dioksidą kartu su papildomu tirpikliu – metanolio tirpalu su 2 proc. vandens ir 20 mM metansulfoninės rūgšties buvo nustatyta, atskirta ir kiekybiškai įvertinta 21 į įvairių maisto papildų sudėtį įeinanti amino rūgštis (19 iš jų buvo baltymus sudarančios, įskaitant ir L-argininą).

Kolonėlė buvo tinkama sulaikyti ir atskirti tiek hidrofobines, tiek polines nejonines, tiek rūgštinę ar bazinę šoninę grandinę turinčias amino rūgštis, tačiau apskaičiuotos koncentracijos skyrėsi tiek nuo autorių prognozių, tiek nuo deklaruojamų ant maisto papildų pakuočių, manoma, kad taip atsitiko dėl matricos efekto – teigiamo ir neigiamo [42].

Prieškolonėlinė derivatizacija reikalinga norint taikyti įprastines nepolines kolonėles analizei naudojant atvirkštinių fazių chromatografijos metodą. 2011 metais atliktame tyrime derivatizacijai buvo naudojamas 9 – fluorenilmetoksikarbonilo chloridas (9 – FMOC Cl), vykdoma laisvų amino rūgščių analizė maisto papilduose (arginino, glutamino ir beta alanino). Amino rūgštys derivatizacijos metu buvo paverstos į fluorescencinius junginius ir pasitelkus fluorescencinį detektorių buvo įvertintos kokybiškai ir kiekybiškai. Mobili fazė A - 0,046 M natrio citrato ir acetonitrilo santykiu 70:30, o mobili B fazė – išgrynintas vanduo ir acetonitrilas santykiu 20:80.

Derivatizacijos procedūra buvo lengva ir greita – gamintas mėginio vandeninis tirpalas, į jį pridedama natrio borato ir FMOC Cl, paliekama stovėti 5 minutes kambario temperatūroje ir tuomet mėginys paruoštas chromatografinei analizei. Metodas selektyvus, tikslus ir jautrus [7].

Fluorescencinė derivatizacija buvo taikoma ir 2019 metų arbatų amino rūgščių profilio tyrimui,

tačiau šiuo atveju buvo naudotas o – ftalaldehido (OPA) ir 3 – merkaptopropioninės rūgšties

(3MPA) mišinys santykiu 3:1. Derivatizacijos procedūra taip pat paprasta ir greita, užtrunkanti

keletą minučių, L-argininas buvo paverstas į fluorescencinį izoindolą. Mobili fazė A – 20 mM

acetatinis buferis, į kurio sudėtį įėjo 3 proc. tetrahidrofurano, B – 100 mM acetatinio buferio, acetonitrilo ir metanolio santykiu 1:2:2 [31].

Plazmos L-arginino ir jo metabolitų koncentracijai nustatyti mėginiams Mao H. Ir kt. (2010) derivatizacijai sėkmingai panaudojo fenilizotiocianatą (PITC), taikė atvirkščiųjų fazių ESC su UV detektoriumi. Mobili fazė A - 0,12 M natrio acetato, 2,5 µM EDTA buferio su 2,5 proc acetonitrilo, mobili B fazė – 15 proc. metanolio, 45 proc. acetonitrilo ir 40 proc. išgryninto vandens.

Derivatizacijos procedūra taip pat užtruko neilgai – pridėjus derivatizacijos reagento mėginys paliekamas stovėti kambario temperatūroje 20 min, tuomet mėginys išdžiovinamas po azoto srove [35]. Sotgia S. ir kt. (2019) taip pat taikė atvirkščiųjų fazių ESC, tačiau derivatizacijai naudojo dietilpirokarbonatą (DEPC) – susidarė karbetoksi- derivatyvai, detekcijai naudota ESI ir tandeminė masių spektrometrija. Mobili fazė – vandeninis 0,4 proc. forminės rūgšties tirpalas ir acetonitrilas santykiu 95:5. Derivatizacijos procedūra užtruko trumpai – pašalinus iš mėginio baltymus, į supernatantą įpilama fosfatinio buferio ir DEPC, paliekama minutei pastovėti kambario temperatūroje [46].

1.6.2 Analizė taikant DC-MS metodus

Dujų chromatografija (kartu su masių spektrometrija) – greitas, paprastas ir jautrus instrumentinės analizės metodas, dažnai naudojamas amino rūgščių kiekinei ir kokybinei analizei, tačiau čia nelakių junginių derivatizacija yra būtina. Derivatizacijos tipai:

 Sililinimas: aktyvaus vandenilio hidroksi- ar amino- grupėje keitimas sililo- grupe.

Dažniausiai taikomi reagentai – BSTFA su katalizatoriumi TMCS, MTBSTFA [38].

 Acilinimas: aktyvus vandenilis keičiamas acilo- grupe, taip junginys tampa labiau lakus, galima apsaugoti termolabilias funkcines grupes. Taikomi reagentai – rūgščių anhidridai, rūgščių halidai, derivatyvai labiau atsparesni hidrolizei palyginus su sililo- derivatyvais [38].

 Taip pat alkilinimas ir esterifikacija, tačiau šie metodai naudojami derivatizuoti organines

rūgštis ir nėra tinkami L-argininui, kadangi tai amino rūgštis, kuri pasižymi bazinėmis

savybėmis [38].

Analitė privalo būti termiškai stabili ir lengvai virstanti į dujas. L-argininas yra polinė medžiaga, todėl visiškai nelaki, o derivatizacijos metu (dėl reagentų ir/ar aukštų kaitinimo temperatūrų) skyla, susidaro šalutinių produktų, kurie trukdo tiksliai atlikti tiek kokybinę, tiek kiekinę analizę [38].

Corso G et al. nutarė ištirti, kas vyksta prieškolonėlinės derivatizacijos metu, tai juos pastūmėjo padaryti skirtinguose publikacijose aptikti labai skirtingi ir kontraversiški kiekinės L-arginino analizės kraujo plazmoje rezultatai [16]. Vandeniniai L-arginino ir L-ornitino standartų tirpalai buvo išdžiovinti po azoto srove, derivatizacijai buvo naudojamas MTBSTFA ir ACN santykiu 1:1, kaitinama 100 °C temperatūroje 2,5 valandos [16]. Derivatizacijos metu atskyla guanidino grupė ir susidaro tert – butildimetilsililornitinas (tBDMS - ornitinas) ir karbodiimidas ir/ar cianamidas [16].

2 pav. Derivatizacijos metu vykstantys pokyčiai [16]

Yoon H (2013) sukurtoje metodikoje buvo tiriamos dibazinių amino rūgščių koncentracijos plazmoje taikant TMS – TFA derivatizaciją. Tiek kokybinė, tiek kiekinė analizė atlikta sėkmingai (L-argininas neskilo derivatizacijos metu). Karboksilo funkcinė grupė derivatizuota pasitelkus MSTFA, o amino grupė – MBTFA. Derivatizacijos procedūra buvo sudaryta iš 2 žingsnių – pašalinus iš plazmos mėginių baltymus ir juos išdžiovinus po azoto srove, pirmiausia buvo pilamas MSTFA, pridėjus metiloranžo, kol spalva pasikeitė iš raudonos į geltoną. Kaitinama 60 °C 10 min.

Antras žingsnis – pridedama MBTFA ir kaitinama 80 °C 20 min [30].

Apibendrinant – L-arginino kokybinei ir kiekinei analizei galima pritaikyti tiek ESC, tiek DC metodus, juos poruojant kartu su masių spektrometrija. Derivatizacija dažniausiai neišvengiamas Karbodiimidas

Cianamidas

žingsnis, jis lengvina junginio aptikimą, tačiau susidarę šalutiniai produktai gali apsunkinti analizę

[37].

2. TYRIMO METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Šio tyrimo objektas – 3 skirtingi Lietuvos Respublikoje notifikuoti maisto papildai, į kurių sudėtį įeina L–argininas.

2.2 Maisto papildų atranka

Tiriamų maisto papildų paieška buvo atlikta Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos internetiniame puslapyje – LR notifikuotų maisto papildų sąraše (nuo 2014-01-01). Buvo ieškoma į paieškos laukelį įvedus „argin“ – rasta 49 maisto papildai. Pasirinkti skirtingų gamintojų maisto papildai, į kurių sudėtį įėjo viena maistinė medžiaga (L–argininas). 2 iš 3 maisto papildų nagrinėjimas buvo baigtas. Visų pasirinktų maisto papildų farmacinės formos – kapsulės.

Gamintojai ir kilmės šalys – JAV, JK ir Vengrija [2].

Pirmi maisto papildai įsigyti vaistinėje, antri – internetinėje parduotuvėje, o treti – specializuotoje maisto papildų ir natūralios kosmetikos internetinėje parduotuvėje.

Darbe maisto papildai bus šifruojami raide K (kapsulės) ir numeriu.

2.3 Tiriamų maisto papildų sudėtis

Ant pakuočių nurodyta kiekinė sudėtis ir pagalbinės medžiagos:

 K1 – 500 mg L-arginino. Pagalbinės medžiagos: želatina, magnio stearatas.

 K2 – 500 mg L-arginino. Pagalbinės medžiagos: riebalų rūgščių magnio druskos, želatina, titano dioksidas.

 K3 – 720 mg L-arginino. Pagalbinės medžiagos: želatina, titano dioksidas, magnio

stearatas, silicio dioksidas.

2.4 Priemonės ir prietaisai

L-arginino maisto papildų analizei buvo naudojami šie prietaisai ir priemonės: dujų chromatografinė sistema Shimadzu GC-2010 plus (Shimadzu Corporation, Japonija) su masių spektrometrijos detektoriumi, analitinės svarstyklės Libra UniBloc AUW120D (Shimadzu, Japonija), termostatinė ultragarso vonelė WiseClean WUC – A06H (Witeg Labortechnik GmbH, Vokietija), automatinės pipetės, membraniniai filtrai.

2.5 Medžiagos

Kapsulės, kuriose yra 500 – 720 mg L-arginino, standartizuoti L-arginino kristaliniai milteliai (Sigma – Aldrich, Vokietija), metanolis (99,99 proc.) (Sigma – Aldrich, Vokietija), acetonitrilas (99,99 proc.) (Sigma – Aldrich, Vokietija), derivatizacijos reagentas BSTFA + TMCS (99:1) (Sigma – Aldrich, Vokietija), azotas, helis.

2.6 Chromatografavimo sąlygos

Naudota dujų chromatografinė sistema Shimazdu GC-2010 plus su masių spektrometrijos detektoriumi: spausto silikagelio kolonėlė (Rxi

-5ms): 30 m ilgio ir 0,25 µm skersmens,

nejudančios fazės sluoksnio storis - 0,25 µm. Kolonėlės temperatūra 75 °C. Tekėjimo greitis: 1,5 ml/min, slėgis 100,0 kPa, bendras tekėjimo greitis: 34,4 ml/min.

Temperatūra kolonėlėje: pradinė kolonėlės temperatūra 75 °C, išlaikant pastovią t°C 5 min, po to didinant 10 °C/min ir keliama iki 290 °C, laikoma pastovi t°C 5 min, toliau temperatūra keliama kas 20 °C/min iki 320 °C ir laikoma pastovi t°C 5 min. Mėginiai injekuoti taikant srauto

dalinimą (angl. Split) santykiu 1:10. Injekcijos tūris 1 µl. Injekavimo temperatūra 260 °C.

2.7 Standartinio tirpalo paruošimas

Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama 50 mg standartizuotų L-arginino kristalinių miltelių ir perkeliama į 50 ml matavimo kolbą, tirpinama nedideliame kiekyje metanolio, vėliau metanolio pripilama iki ribos. Kolba dedama į ultragarso vonelę, laikoma, kol vizualiai nesimato kietų dalelių tirpale. Gaunamas 1 mg/ml standartinis tirpalas. Automatine pipete paimama 200 μl paruošto standartinio tirpalo ir džiovinama po azoto dujų srove iki sauso likučio. Tada pridedama 100 μl acetonitrilo ir 100 μl derivatizacijos reagento BSTFA + TMCS. Gautas tirpalas kaitinamas 100 °C temperatūros glicerolio vonioje 2,5 valandos.

2.8 Kapsulių mėginių paruošimas

Imama po kapsulę kiekvieno tiriamo maisto papildo, ji atidaroma ir turinys išberiamas.

Sveriama 100-150 mg ir tirpinama 10 ml metanolio. Dedama į ultragarso vonelę, ten laikoma, kol milteliai visiškai ištirpsta ir vizualiai tirpale nesimato kietųjų dalelių. Automatine pipete imama 200 μl paruošto tirpalo ir džiovinama po azoto dujų srove iki sauso likučio. Tada pridedama 100 μl acetonitrilo ir 100 μl derivatizacijos reagento BSTFA + TMCS. Gauti tirpalai kaitinami 100 °C temperarūtos glicerolio vonioje 2,5 valandos.

2.9 Duomenų analizės metodai

Gauti analizės duomenys (matavimų mėginiuose vidurkiai, standartinis nuokrypis ir santykinė

paklaida) buvo apskaičiuojami Microsoft Office elektronine skaičiuokle Microsoft Excel 2016

(Microsoft Corporation, JAV).

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Metodo ir sąlygų parinkimas

Tirpikliai: išgrynintas vanduo, metanolis, išgrynintas vanduo pašarmintas 1 ml NaOH, metanolis pašarmintas 1 ml NaOH. Tirpalų šarminimas nepasiteisino analizės metu. Bandymų metu pastebėta, kad nors išgrynintame vandenyje L-arginino kristaliniai milteliai tirpsta geriau, tačiau metanoliniai tirpalai duoda geresnius rezultatus taikant DC metodą (metanolinio tirpalo lyginant su vandeniniu buvo didesnis plotas po smaile).

Nutarta išbandyti DC metodą, nes jis dažnai naudojamas amino rūgščių kokybinei ir kiekinei analizei. Derivatizacijai buvo naudojami MTBSTFA ir BSTFA + TMCS reagentai.

Mėginiai ruošiami gaminant jų metanolinį tirpalą (1 mg/ml), imant 200 μl tirpalo, džiovinant po azoto srove iki sauso likučio, tuomet pridedant 100 μl acetonitrilo bei derivatizatoriaus, gerai užsukus buteliuką šildoma glicerolio vonioje.

Buvo naudojama skirtingą šildymo temperatūra (70-100 °C) ir skirtingi šildymo intervalai – 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 1 val., 2,5 val., 3 val. Nustatyta, kad optimaliausios šildymo sąlygos – 100 °C ir 2,5 valandos.

Derivatizacijai taikant MTBSTFA dujų chromatografo pagal duomenų bazę ir sulaikymo

laiką buvo aptiktas arginino artefaktas – karbodiimidas, derivatizacijai naudojant BSTFA + TMCS

– L/D - ornitinas.

3.2 Metodo validacija

Metodo validacija yra svarbi analizės metodo tinkamumui įvertinti, validuojama pagal šiuos parametrus [21]:

 Specifiškumas (angl. Specificity)

 Glaudumas – tarpinis preciziškumas (angl. Intermediate precision) ir pakartojamumas (angl. Reproducibility)

 Tiesiškumas (angl. Linearity)

 Minimali aptikimo riba (angl. LoD – Limit of detection)

 Minimali kiekinio nustatymo riba (angl. LoQ – Limit of quantitation)

3.2.1 Specifiškumas

Tai metodo gebėjimas nustatyti tiriamą medžiagą mėginyje net ir esant priemaišoms ar degradacijos produktams [21].

Specifiškumas nustatytas palyginus standarto ir pasirinkto maisto papildo chromatogramas

bei sulaikymo laikus. Standarto sulaikymo laikas – 18,293 min, K1 maistinės medžiagos – 18,263

min, K3 – 18,268 min ir K2 – 18,268 min. Didžiausias skirtumas tarp sulaikymo laikų yra 0,03

min, todėl galima teigti, jog metodas tinkamas analizei. Standarto sulaikymo laikas yra pažymėtas

3 pav., tirtų maisto papildų maistinių medžiagų – 4, 5, 6 pav.

3 pav. Standarto chromatograma

4 pav. K1 maisto papildo chromatograma

5 pav. K2 maisto papildo chromatograma 6 pav. K3 maisto papildo chromatograma

18.293

18.263

K1

K2 K3

18.268

18.268

Maistinės medžiagos tiriamuose maisto papilduose buvo identifikuojamos remiantis ne tik sulaikymo laikais, bet ir masių spektrometro duomenimis - 7 pav. matomas standarto masių spektras.

7 pav. standarto masių spektras

3.2.2 Glaudumas

Preciziškumas – tai parametras, kuris rodo rezultatų panašumą kartojant tyrimą kelis kartus iš eilės [21]. Tarpiniui preciziškumui nustatyti, mėginys buvo injekuojamas po 5 kartus dvi dienas iš eilės.

Pakartojamumas – parametras, kuris rodo analizės pakartojimo tikslumą esant tom pačiom sąlygom per trumpą laiko tarpą [21]. Pakartojamumui nustatyti, mėginys buvo injekuojamas tą pačią dieną 5 kartus iš eilės nekeičiant sąlygų.

Abu parametrai vertinami santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN) ir išreiškiami procentais.

Tarpinis preciziškumas: 0,05 proc. (neviršijama 10 proc. riba, todėl metodas tinkamas).

Pakartojamumas: 0,016 proc. (neviršijama 5 proc. riba, todėl metodas yra tinkamas).

3.2.3 Tiesiškumas

Tai metodo gebėjimas gauti rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi analičių koncentracijai mėginyje. Matavimai kartojami mažiausiai 3 kartus, ne mažiau 5 skirtingų koncentracijų standarto tirpalus [21].

Buvo gaminami 5 skirtingų koncentracijų tirpalai, sudaroma kalibracinė kreivė, tirpalų koncentracijos – nuo 62,25 µg/ml iki 1000 µg/ml.

Kalibracinės kreivės lygtis: f(x)=4033,8354x – 378883,9257

Koreliacijos koeficientas R

= 0,995727 (kadangi jis artimas vienetui ir ne žemesnis nei 0,98, tai reiškia, kad metodas yra tinkamas analizei).

8 pav. L-arginino kalibracinė kreivė

3.2.4 Aptikimo ir kiekinio nustatymo ribos

Aptikimo riba – tai mažiausias tiriamos medžiagos kiekis aptinkamas mėginyje.

-500000 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000

0 200 400 600 800 1000 1200

Plotas

koncentracija, µg/ml

L - arginino kalibracinė kreivė

Nustatymo riba – tai mažiausias tiriamos medžiagos kiekis mėginyje, kurį galima įvertinti kiekybiškai analizės metu [21].

Minimali aptikimo riba: 3,890 µg/ml

Minimali kiekinio nustatymo riba: 15,563 µg/ml

3.3 DC-MS analizės rezultatai

Tirtų mėginių koncentracijos buvo paskaičiuotos pagal kalibracinės kreivės lygtį.

Kadangi analizės metu buvo gautos L/D-ornitino koncentracijos analitėse, jos buvo perskaičiuotos pagal 80 proc. L-arginino hidrolizės reakcijos išeigą ir taip gautas L-arginino kiekis kapsulėse [39].

9 paveikslėlyje – diagramoje matyti, kaip skiriasi L-arginino kiekiai, deklaruojami ant pakuotės ir nustatyti analizės metu.

9 pav. Nustatytų analizės metu ir deklaruojamų ant pakuotės L-arginino kiekių palgynimas

K1 K2 K3

Deklaruojamas L-arginino kiekis

ant pakuotės 1 kapsulėje, mg 500 500 720

Nustatytas L-arginino kiekis 1

kapsulėje, mg 261.1 180.7 482.74

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Didžiausias gautas L-arginino kiekis buvo maisto papildo K3 kapsulėse – 482,74 ± 1,25 mg/kaps. (gamintojo deklaruota 720 mg/kaps.), o mažiausias maisto papildo K2 kaspulėse – 180,7

± 3,23 mg/kaps. (gamintojo deklaruota 500mg/kaps.); maisto papildo K1 kapsulėse buvo nustatyta 261,1 ± 2,74 mg/kaps. (gamintojo deklaruota 500 mg/kaps.).

Procentais išreiškus maisto papildo K1 kapsulėse nustatytas L-arginino kiekis atitinka 52,22 proc. deklaruojamo, maisto papildo K2 kaspulėse – mažiausiai – 36,14 proc. deklaruojamo, maisto papildo K3 kapsulėse – daugiausiai – 67,04 proc. deklaruojamo.

1 lentelė. L-arginino statistiniai duomenys Maisto

papildas

Deklaruojamas kiekis mg

Nustatytas kiekis mg

Nustatytas kiekis procentais

Standartinis nuokrypis

K1 500 261,1 52,22 2,74

K2 500 180,7 36,14 3,23

K3 720 482,74 67,04 1,25

Analizės metu tokius sąlyginai mažus kiekius ir didelį skirtumą tarp deklaruojamų ir nustatytų kiekių gali lemti derivatizacijos metu, dėl aukštos temperatūros ir derivatizatoriaus, vykusi hidrolizė (L-arginino skilimas į ornitiną ir šlapalą) ir susidarę šalutiniai produktai.

Tikslesniems rezultatams gauti reikalingas metodikos tobulinimas ir tolimesni tyrimai.

IŠVADOS

1. Išanalizavus literatūros šaltinius, tinkamiausi L-arginino kokybinės ir kiekinės analizės metodai yra: a) efektyviosios skysčių chromatografijos (dažniausiai atvirkščiųjų fazių, taip pat taikant derivatizatorius ir atitinkamai detektorių – UV arba fluorescencinį) ir b) dujų chromatografijos su masių spektrometrija, atliekant derivatizaciją sililinačiais arba acilinančiais reagentais.

2. Pritaikyta dujų chromatografijos metodika (naudota dujų chromatografinė sistema Shimazdu GC-2010 plus su masių spektrometrijos detektoriumi, derivatizacija atlikta su BSTFA + TMCS derivatizacijos reagentu, taikyta spausto silikagelio Rxi

-5ms kolonėlė), metodika validuota, pasižymėjo specifiškumu, glaudumu ir tiesiškumu, minimali aptikimo riba – 3,890 µg/ml, o minimali kiekinio nustatymo riba – 15,563 µg/ml.

3. Atlikta pasirinktų L-arginino turinčių maisto papildų kokybinė ir kiekinė analizė. Dujų chromatografinės sistemos kartu su masių spektrometru užfiksuotos L/D-ornitino koncentracijos buvo perskaičiuotos į L-arginino, taikant 80 proc. išeigą, rastą literatūros šaltiniuose.

4. Didžiausias L-arginino kiekis buvo rastas maisto papildo K3 sudėtyje - 482,74 mg/kaps., ant pakuotės deklaruojama - 720 mg/kaps.; mažiausias – maisto papildo K2 sudėtyje – 180,7 mg/kaps., ant pakuotės deklaruojama - 500 mg/kaps.

5. Analizės metu nustatyti L-arginino kiekiai kapsulėse labai skiriasi nuo gamintojų

deklaruojamų, todėl įvertinus derivatizacijos metu vykusią hidrolizę, metodiką reikėtų

tobulinti ir taip pat atlikti tolimesnius tyrimus, kad būtų gaunami dar tikslesni rezultatai.

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Renkantis dujų chromatografijos metodą kartu su masių spektrometrija, būtų verta

pabandyti atlikti derivatizaciją su kitais reagentais (rinktis acilinančius reagentus vietoje

sililinančių) bei atlikti derivatizaciją žemesnėje temperatūroje.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Gaivenis M. Laisvų amino rūgščių nustatymas augalinėje žaliavoje dujų chromatografijos metodu. Kaunas: 2018.

2. Notifikuoti maisto papildai Lietuvoje [Internet]. Vet.lt. 2020 [cited 23 April 2020].

Available from:

http://www.vet.lt/maistopapildai/index.php?gaminys=argin&platintoj=&gamintojas=&pl at_adres=&kilme=.

3. [Internet]. [cited 4 May 2020]. Available from:

https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/larginine174207479311?lang=en&regio n=LT.

4. Albaugh V, Stewart M, Barbul A. Cellular and Physiological Effects of Arginine in Seniors. Nutrition and Functional Foods for Healthy Aging. 2017;:317-336.

5. Álvares T, Conte C, Paschoalin V, Silva J, Meirelles C, Bhambhani Y et al. Acute L- arginine supplementation increases muscle blood volume but not strength performance.

Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 2012;37(1):115-126.

6. Arginine - DrugBank [Internet]. Drugbank.ca. 2020 [cited 21 April 2020]. Available from:

https://www.drugbank.ca/drugs/DB00125

Available from: https://hmdb.ca/metabolites/HMDB0000517

Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q-2- r1-validation-analytical-procedures-text-methodology-step-5_en.pdf.

7. Baxter J, Johns P. Determination of Free Arginine, Glutamine, and β-alanine in Nutritional Products and Dietary Supplements. Food Analytical Methods. 2011;5(4):821-827.

8. Bogdanski P, Suliburska J, Grabanska K, Musialik K, Cieslewicz A, Skoluda A, et al.

Effect of 3-month L-arginine supplementation on insulin resistance and tumor necrosis factor activity in patients with visceral obesity. European review for medical and pharmacological sciences. U.S. National Library of Medicine; 2012.

9. Böger R, Bode-Böger S. THE CLINICAL PHARMACOLOGY OF L-ARGININE.

Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 2001;41(1):79-99.

10. Böger R. The Pharmacodynamics of L-Arginine. The Journal of Nutrition.

2007;137(6):1650S-1655S.

11. Camarena Pulido E, García Benavides L, Panduro Barón J, Pascoe Gonzalez S, Madrigal Saray A, García Padilla F et al. Efficacy of L-arginine for preventing preeclampsia in high- risk pregnancies: A double-blind, randomized, clinical trial. Hypertension in Pregnancy.

2016;35(2):217-225.

12. Camic C, Housh T, Zuniga J, Hendrix R, Mielke M, Johnson G et al. Effects of Arginine- Based Supplements on the Physical Working Capacity at the Fatigue Threshold. Journal of Strength and Conditioning Research. 2010;24(5):1306-1312.

13. Cardiovascular diseases [Internet]. Who.int. 2020 [cited 21 April 2020]. Available from:

https://www.who.int/health-topics/cardiovascular-diseases/#tab=tab_1.

14. Causes of death - diseases of the circulatory system, residents, 2016 Health 2019.png - Statistics Explained [Internet]. Ec.europa.eu. 2020 [cited 21 April 2020]. Available from:

https://ec.europa.eu/eurostat/statistics-

explained/index.php?title=File:Causes_of_death_%E2%80%94_diseases_of_the_circulat ory_system,_residents,_2016_Health2019.png.

15. Chetty S. The do’s and don’ts of arginine supplementation. South African Journal of Clinical Nutrition. 2010;23(sup1):25-28.

16. Corso G, Esposito M, Gallo M, Russo A, Antonio M. Transformation of arginine into ornithine during the preparation of itstert-butyldimethylsilyl derivative for analysis by gas chromatography/mass spectrometry. Biological Mass Spectrometry. 1993;22(12):698-702.

17. Davani-Davari D, Karimzadeh I, Sagheb M, Khalili H. The Renal Safety of L-Carnitine, L-Arginine, and Glutamine in Athletes and Bodybuilders. Journal of Renal Nutrition.

2019;29(3):221-234.

18. Debats I, Wolfs T, Gotoh T, Cleutjens J, Peutz-Kootstra C, van der Hulst R. Role of arginine in superficial wound healing in man. Nitric Oxide. 2009;21(3-4):175-183.

19. Derivatization Reagents: Selective Response & Detection [Internet]. [cited 4 May 2020].

Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma- aldrich/migrationresource4/Derivatization%20Rgts%20brochure.pdf.

20. Dong J, Qin L, Zhang Z, Zhao Y, Wang J, Arigoni F et al. Effect of oral l-arginine supplementation on blood pressure: A meta-analysis of randomized, double-blind, placebo-controlled trials. American Heart Journal. 2011;162(6):959-965.

21. Ema.europa.eu. [Internet]. [cited 25 April 2020].

22. European Pharmacopoeia 9.0 Council of Europe. Arginine hydrochloride.

23. Gad M. Anti-aging effects of L-arginine. Journal of Advanced Research. 2010;1(3):169- 177.

24. Ghulmiyyah L, Sibai B. Maternal Mortality From Preeclampsia/Eclampsia. Seminars in Perinatology. 2012;36(1):56-59.

25. Gui S, Jia J, Niu X, Bai Y, Zou H, Deng J et al. Arginine supplementation for improving maternal and neonatal outcomes in hypertensive disorder of pregnancy: A systematic review. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 2013;15(1):88-96.

26. Heffernan K, Fahs C, Ranadive S, Patvardhan E. Review Article: L-Arginine as a Nutritional Prophylaxis Against Vascular Endothelial Dysfunction With Aging. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 2010;15(1):17-23.

27. Hristina K, Langerholc T, Trapecar M. Novel metabolic roles of L-arginine in body energy metabolism and possible clinical applications. The journal of nutrition, health & aging.

2014;18(2):213-218.

28. Human Metabolome Database: Showing metabocard for L-Arginine (HMDB0000517) [Internet]. Hmdb.ca. [cited 21 April 2020].

29. Yavuz H, Turnagol H, Demirel H. PRE-EXERCISE ARGININE SUPPLEMENTATION INCREASES TIME TO EXHAUSTION IN ELITE MALE WRESTLERS. Biology of Sport. 2014;31(3):187-191.

30. Yoon H. Determination of plasma dibasic amino acids following trimethylsilyl–

trifluoroacyl derivatization using gas chromatography–mass spectrometry. Archives of Pharmacal Research. 2013;36(3):366-373.

31. Kazan R, Seddik H, Marstani Z, Elsutohy M, Yasri N. Determination of amino acids content in tea species using liquid chromatography via pre-column fluorescence derivatization. Microchemical Journal. 2019;150:104103.

32. Lai X, Kline J, Wang M. Development, validation, and comparison of four methods to simultaneously quantify l-arginine, citrulline, and ornithine in human plasma using hydrophilic interaction liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. 2020.

33. L-Arginine Market 2020 Global Industry Brief Analysis by Top Countries Data, Market

Size, Defination, Industry Trends, News and significant Growth With Regional Trends By

Forecast 2026 [Internet]. MarketWatch. [cited 3 May 2020]. Available from:

https://www.marketwatch.com/press-release/l-arginine-market-2020-global-industry- brief-analysis-by-top-countries-data-market-size-defination-industry-trends-news-and- significant-growth-with-regional-trends-by-forecast-2026-2020-03-24.

34. Li J, Wang Q, Liu Y, Ke Y, Fan Q, Zhou P et al. Simultaneous determination of 24 free amino acids in MGC803 cells by hydrophilic interaction liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2019;1132:121792.

35. Liu T, Wu C, Chiang C, Lo Y, Tseng H, Chang C. No effect of short-term arginine supplementation on nitric oxide production, metabolism and performance in intermittent exercise in athletes. The Journal of Nutritional Biochemistry. 2009;20(6):462-468.

36. Mao H, Wei W, Xiong W, Lu Y, Chen B, Liu Z. Simultaneous determination of l-citrulline and l-arginine in plasma by high performance liquid chromatography. Clinical Biochemistry. 2010;43(13-14):1141-1147.

37. Martens-Lobenhoffer J, Bode-Böger S. Mass spectrometric quantification of L-arginine and its pathway related substances in biofluids: The road to maturity. 2013.

38. McNair H, Miller J, Snow N. Basic gas chromatography.

39. MURRAY K, STROIER RASMUSSEN P, NEUSTAEDTER J, MURRAY LUCK J. The Hydrolysis of Arginine. The Journal of Biological Chemistry 1965.

40. Obreshkova D, Tsvetkova D, Ivanov K. VALIDATION OF HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF L - ARGININE IN TONOTYL ® SOLUTION [Internet].

Semanticscholar.org. 2012 [cited 3 May 2020]. Available from:

https://www.semanticscholar.org/paper/VALIDATION-OF-HPLC-METHOD-FOR- DETERMINATION-OF-L-IN-Obreshkova-

Tsvetkova/47eafd27cbe84cb12e44fae0902a397295990ce0.

41. Pahlavani N, Entezari M, Nasiri M, Miri A, Rezaie M, Bagheri-Bidakhavidi M et al. The effect of L-arginine supplementation on body composition and performance in male athletes: a double-blinded randomized clinical trial. European Journal of Clinical Nutrition.

2017;71(4):544-548.

42. Raimbault A, Noireau A, West C. Analysis of free amino acids with unified

chromatography-mass spectrometry application to food supplements. Journal of

Chromatography A. 2020;1616:460772.