FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
JUSTINA ARMALYTĖ
Fenolinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo palyginamoji
analizė šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) ţaliavose
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Audronė Dagilytė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
Fenolinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo palyginamoji
analizė šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis) ţaliavose
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Darbą atliko
Lekt. dr. Audronė Dagilytė Magistrantė
Justina Armalytė
Recenzentas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1. SANTRUMPOS ... 7
2. ĮVADAS ... 8
3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
4. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
4.1. Pupinių (Fabaceae L.) šeimos augalai ...11
4.2. Šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.) ...11
4.3. Panaudojimas medicinoje ...13
4.4. Oksidacinis stresas ...13
4.4.1. Oksidacinio streso sukeliamos ligos ...14
4.4.2. Antioksidantai ...15
4.5. Fenolinių junginių charakteristika ...16
4.5.1. Fenolinių junginių naudojimas medicinoje ...17
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 19
5.1. Tiriamasis objektas ...19
5.2. Naudota aparatūra ...19
5.3. Naudotos tyrimui medţiagos ir reagentai ...19
5.4. Suminis fenolinių junginių nustatymas spektrofotometriniu metodu ...20
5.5. Suminis flavonoidų nustatymas spektroskopiniu metodu ...21
5.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu...22
5.7. Chelatinio aktyvumo nustatymas fotometriniu Fe2+ surišimo metodu ...23
5.8. Duomenų analizė ...23
6. REZULTATAI ... 24
6.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ...24
6.2. Suminis fenolinių junginių nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje sprektrofotometriniu metodu ...26
6.3. Suminis flavonoidų kiekio nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje sprektrofotometriniu metodu ...28
6.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje fotometriniu
DPPH radikalų surišimo metodu ...31
6.5. Chelatinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje fotometriniu Fe2+ surišimo metodu ...32
6.6. Suminio fenolinių junginiu, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo koreliacijos įvertinimas šlaitinio dirvenio (Ononis Arvensis L.) ţaliavose ...34
7. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36
7.1. Bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio aptarimas ...36
7.2. Antioksidacinio ir chelatinio aktyvumo aptarimas ...36
7.3 Duomenų koreliacijos aptarimas ...37
8. IŠVADOS ... 38
9. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
SANTRAUKA
Justinos Armalytės magistro baigiamasis darbas/mokslinė vadovė lekt. dr. Audronė Dagilytė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra, Kaunas.
Fenolinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo palyginamoji analizė šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) ţaliavose.
Darbo tikslas: Ištirti skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L) augalų dalių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį ir antichelatinį aktyvumą.
Uţdaviniai: 1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavose. 2. Nustatyti flavonoidų kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavose. 3. Įvertinti antioksidacinį ir antichelatinį aktyvumą skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavose. 4. Atlikti skirtingų augalų dalių, biologiškai aktyvių junginių palyginamąją analizę ir identifikuoti optimalią šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) vaistinės augalinės ţaliavos sudėtį.
Tyrimo metodika: Šis tyrimas atliktas naudojant Kauno rajono ir Kėdainių rajono 2014-2015m., šlaitinio dirvenio augalines ţaliavas. Ekstrakcija buvo atliekama vandens vonelėje veikiant ultragarsu. Suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatomas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais (mg/g). Flavonoidų kiekis buvo nustatomas spektrofotometriškai vykdant reakciją su AlCl3, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais (mg/g).
Antioksidacinis aktyvumas vertinamas DPPH radikalų surišimo metodu (%) ir antichelatiniu Fe(II) surišimo metodu (%).
Rezultatai ir išvados: Gauti rezultatai parodė, kad šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) augalinėse ţaliavose bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis buvo pasiskirstęs plačiose ribose pagal morfologines augalo dalis. Didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis sukauptas 2015m. Kauno rajone ţieduose (22,82 ± 2,8 mg/g), o maţiausias 2015m. Kėdainių rajone stiebuose. Nustatinėjant flavonoidų kiekį didţiausias – 2015m. Kauno rajone ţieduose (70 ± 0,002 mg/g), maţiausias 2015m. Kėdainių rajone stiebuose. Vertinant antioksidacines Ononis arvensis L. augalinių ţaliavų savybes DPPH metodu didţiausias aktyvumas 2015m. Kauno rajone (34,97 – 89%), maţiausias 2015m. Kėdainių rajone. Tyrimas parodė stiprų chelatų susidarymą ekstraktuose su Fe(II) jonais (39,53 - 62,11%). Atlikus statistinę rezultatų analizę pastebėta stipri koreliacija tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo (0,99, p<0,05). Nustatyta, kad didėjantis fenolinių junginių kiekis ţaliavoje tiesiogiai didina ir antioksidacinį aktyvumą.
SUMMARY
The supervisor of the final master‘s thesis/research prepared by Justina Armalytė is assoc. lect. Dr. Audronė Dagilytė; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas.
The comparative analysis of the phenolic compounds and antioxidant activity in the herbal materials of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.)
Research aim: To investigate different parts of plant Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.) phenolic compounds, flavonoids and antioxidant, antichelating activity.
Objectives: 1. To determine the total phenolic compounds in different parts of pitched restharrow (Ononis arvensis L.) of the herbal materials. 2. To determine the amount of flavonoids in different parts of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.) of the herbal materials. 3. To evaluate the antioxidant ant antichelating activity in different parts of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.) of the herbal materials. 4. To carry out a comparative analysis of biologically active compounds for different parts of plants and to identify the optimal medicinal herbal material composition of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.)
Research methodology: This research was carried out using Kaunas and Kėdainiai district 2014-2015m. herbal materials of Pitched Restharrow (Ononis arvensis L.). Extraction method – ultrasound extraction. The total phenolics content was determined spectrophotometrically by the Folin-Ciocalteu method, the results are expressed as gallic acid equivalents (mg/g). Flavonoids were determined spectrophotometrically by reaction with AlCl3, the results are expressed as rutin
equivalents (mg/g). Antioxidant activity measured DPPH radical binding assay (%) and antichelating FIC binding assay (%).
Results and conclusions: The experiment results has showed that in the herbal materials of the Pitched Restharrow the total amount of phenolics and flavonoids had spread over a wide range by the morphological parts of the plant. The largest amount of common phenolic compounds was accumulated in 2015m. in the flowers around Kaunas district (22,82 ± 2,8 mg/g) and the least in stem around Kėdainiai district in 2015m. In the research of flavonoids the highest amount was also found in the extract of flowers around Kaunas district in 2015m (70 ± 0,002 mg/g) and the lowest in stems around Kėdainiai district. Evaluating antioxidant herbal materials properties by DPPH method, the highest activity was detected around Kaunas district in 2015m. (34,97 – 89%), the lowest around Kėdainiai district in 2015m. The study showed a strong chelating with Fe (II) ions (39,53-62,11%). The statistical analysis of results was observed a strong correlation between phenolics and antioxidant activity (0.99, p <0.05). Determined that the increasing amount of phenolic compounds directly increase antioxidative activity in the herbal materials.
1
.SANTRUMPOS
IR – infraraudonieji spinduliai UV – ultravioletiniai spinduliai
HPLS – aukšto slėgio skysčių chromatografija
ROS – reaktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) DNR – deoksiribonukleorūgštis
TRP – trumpalaikis receptorių potencialas (angl. transient receptor potential) CAT – katalazė
GPx – glutationo peroksidazė GRx – glutationo reduktazė SOD – superoksido dismutazė
V/V – tūrio procentai (išreikšti etanolio koncentracija) F-C – Folin-Ciocalteu analizės metodas
FIC - geleţies (II) jonų surišimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay) DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
2. ĮVADAS
Vis daţniau kalbama apie antioksidantus, jų reikšmę ir svarbą organizmui. Pastaruoju metu, tyrimai vis daţniau įrodo, kad didelė dalis struktūrinių ląstelių bei audinių paţeidimų ar kitokių organizmo sutrikimų priklauso būtent nuo oksidacinio streso poveikio. Oksidacinis stresas apibrėţiamas kaip disbalansas tarp ţemo aktyvumo antioksidantų ir padidėjusių reaktyvių deguonies formų (ROS), laisvųjų radikalų kiekio[25]. Tam, kad organizme tinkamai vyktų visos fiziologinės funkcijos yra būtina pusiausvyra tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų. Kitu atveju, laisvieji radikalai gali neigiamai paveikti lipidų, baltymų ir DNR struktūras, padidinti ţmogui gręsiančių ligų skaičių [16,18].
Oksidaciniui stresui atkreipus dėmesį ir sukėlus didelį susidomėjimą bei norą natūraliai jį maţinti, buvo aktyviai nagrinėjamos biologiškai aktyvios medţiagos ir tiriamos jų antioksidacinės savybės. Bene geriausiomis antioksidacinėmis savybėmis pasiţymi fenoliniai junginiai, iš jų daugiausia flavonoidai. Be antioksidacinio poveikio jie dar maţina kapiliarų pralaidumą ir laikomi kaip kraujagysles apsaugantys vaistai [14].
Šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.) – tai daugiametis, krūminis augalas, ţydintis birţelio – rugpjūčio mėnesiais [31]. Dirvenis ţinomas jau tūkstančius metų. Jo šaknų ekstraktų poveikis pasiţymi diuretinėmis savybėmis. Savo diureziniu poveikiu, palyginus su kitais tokio paties poveikio augalais, pasiţymi vidutiniškai stipriai [9,38]. Dirvenis kaupia nemaţą kiekį fenolinių junginių bei kitų biologiškai aktyvių medţiagų, kurios pasiţymi antioksidacinėmis, antiuţdegiminėmis, antimikrobinėmis savybėmis, ekstraktus, tinktūras ar nuovirus galima naudoti esant kepenų ar skrandţio nedidelėms problemoms [4]. Ţinomas panaudojimas norint pagerinti ţaizdų gijimą, egzemų, podagros, reumatinių būklių, įvairių odos paţeidimų, odos vėţio gydymui, kaip pagalbinė priemonė. Naudojama taip pat lokaliai kaip antiseptinė, antimikrobinė priemonė [28, 35]. Literatūroje kaip tyrimų ţaliava nurodomi dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.) ir šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.), deja šlaitinio dirvenio nėra registruoto valstybėse narėse kaip vaistinės ţaliavos. Europos rinkoje dirvenio šaknų galima rasti tik keliose šalyse, kur jis yra kaip komponentas augalinėse arbatose: tai Belgijoje, Čekijos Respublikoje, Vokietijoje, Italijoje ir Lenkijoje [9]. Pagal gautų tyrimų duomenis, šlaitinis dirvenis galėtų būti įtrauktas į augalinių arbatų ar ekstraktų sudėtį.
Darbo aktualumas: Lietuvoje šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) augalinių ţaliavų cheminė sudėtis tirta pirmą kartą. Aktualu tai, kad norima gauti daugiau išsamių duomenų apie maţiau ţinomą šios rūšies augalą, jo kokybines savybes. Tyrimo metu buvo tirtos skirtingų morfologinių augalo dalių augalinės ţaliavos (ţiedai, lapai, stiebai, ţolė), optimizuoti augalinių ţaliavų ekstraktai,
nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis, įvertintos antioksidacinės ir antichelatinės augalinių ţaliavų savybės naudojantis spektrofotometriniais metodais.
Darbo tikslas: Ištirti skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą.
3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas:
Ištirti skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L) augalų dalių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį ir antichelatinį aktyvumą.
Uţdaviniai:
1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavose.
2. Nustatyti flavonoidų kiekį skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavose.
3. Įvertinti antioksidacinį ir chelatinį aktyvumą skirtingų šlaitinių dirvenių (Ononis arvensis L.) augalų dalių ţaliavose.
4. Atlikti skirtingų augalų dalių, biologiškai aktyvių junginių palyginamąją analizę ir identifikuoti optimalią šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) vaistinės augalinės ţaliavos sudėtį.
4. LITERATŪROS APŢVALGA
4.1. Pupinių (Fabaceae L.) šeimos augalai
Pupinių (Fabaceae L.) šeima yra trečia pagal dydį pasaulyje iš ţydinčių augalų, po orchidėjinių (Orchidaceae) ir astrinių (Asteraceae) šeimų. Pupinių šeimoje yra priskaičiuojama 730 genčių ir daugiau kaip 19400 rūšių [10,31]. Dauguma šių augalų auga nerūgščiuose (pH 6,0-6,5) dirvoţemiuose. Šios šeimos augalai geba gyventi simbiozėje kartu su atmosferos azotą fiksuojančiomis bakterijomis Rhizobium [1]. Pupinių šeimos augalai plačiai paplitę ne vien Lietuvoje, bet ir Vidurţemio jūros srityse, Europoje [23,31].
4.2. Šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.)
Morfologiniai poţymiai. Šlaitinis dirvenis (Ononis arvesis L.) pupinių šeimos atstovas (1pav.). Daugiametis, krūminis augalas, uţaugantis 30-80 cm aukščio, padengtas paprastaisiais mechaniniais ir liaukiniais plaukeliais. Šaknis liemeninė, ilga, maţai šakota. Stiebas tiesus, išilgai briaunotas, gausiai išsišakojęs, be dyglių. Lapai praţanginiai, apatiniai ir viduriniai - trilapiai, viršūninėje dalyje paprasti, ovalios ar pailgai elipsiškos formos, dantyti, iš abiejų pusių apaugę liaukiniais plaukeliais. Lapo dydţiai vyrauja 15-30*5-15 mm, dideli prielapiai kurie suaugę į lapkočius 6-10mm ilgio. Lapų paţastyse yra po du ţiedus, o stiebo viršūnėje ir šoninėse šakelėse jie susitelkę į varpiškas kekes. Ţiedą sudaro 5 vainiklapiai 10-20mm ilgio, raudonos, roţinės, labai retai – baltos spalvos. Subrandina plačias kiaušinio formos ankštis 7*5-6mm kuriose būna 2-4 sėklos. Ţydi birţelio – rugpjūčio mėnesiais [32].
Cheminė sudėtis. Šlaitiniui dirveniui atlikus cheminius tyrimus, buvo nustatyta, kad jis savo sudėtyje kaupia triterpeninį alkoholį α-onoceriną, izoflavonus, oksikumarinus – skopoletiną ir skopoliną [34]. Atlikus instrumentinės analizės metodus, tokius kaip IR, UV, HPLC spektroskopijas, iš izoflavonoidų, visais atvejais yra aptinkamas onogeninas [15]. Taip pat formononetinas, ononinas, biochaninas A, genisteinas, trifolirizinas, rotinidinas. Iš triterpenų aptinkami α-onocerinas, daţniausiai ţinomas kaip onokolis [9]. Toliau nagrinėjant dirvenį, pasirinkus UHPLC-ESI-Q-TOF-MS (angl.) metodą (atvirkštinių fazių ultra-efektyvioji skysčių chromatografija, sujungtas su elektropurkštuvine jonizuota kvadrupoline laiko-skrydţio masės spektrometrija), jo cheminė sudėtis ištirta itin smulkiai. Rastuose polifenoliniuose junginiuose labiausiai dominavo eriodiciolis. Fenolinės rūgštys rastos – galo, kofeino, vanilino, cinamono, chlorogeninė, ferulinė, p-kumarino ir salicilo rūgštys [4,9]. Iš flavononų aptikti naringeninas ir eriodiktolis, flavonolių – dihidro-kvercetinas, rutinas, kvercetinas ir kemferolis, flavonai – apigeninas ir liuteolinas, flavan-3-oliai – katechinas ir epikatechinas, dilaktonai – elago rūgštis, dihidrochalkonas florizinas, taip pat stilbenoido produktai – piceidas ir trans-resveratrolis [4]. Nagrinėjant sterolius dirvenio sudėtyje, buvo aptikta jų keletas. Iš sterolių didţiausią koncentraciją sudarė β-sitosterolis, tačiau taip pat aptikti ir stigmasterolis, kampesterolis, cholesterolis ir α-spinasterolis, jų koncentracija maţesnė lyginant su sitoteroliu [9, 28]. Kaip manoma, dirvenio poveikį nulemia bendras aktyviųjų sudedamųjų dalių kiekis, tai izoflavonoidai, flavonoidai ir fenolinės rūgštys. Šlaitinio dirvenio ţolėje izoflavonoidų randama apie 2,54 %, flavonoidų apie 2,32% ir fenolinių rūgščių apie 2,41% [30].
Šlaitinis dirvenis turi ir antioksidacinių savybių. Dėl kaupiamų polifenolinių junginių eteriniuose aliejuose šios savybės pasireiškia vidutiniškai, priklausomai nuo koncentracijos. Eterinio aliejaus kiekis ţaliavoje svyruoja nuo 0,02 – 0,2% [9]. Esant didesnei koncentracijai antioksidacinės savybės pasireiškia stipriau. Eterinių aliejų mišinyje buvo išskirta net septyniasdešimt septyni komponentai, tai sudarė 95,6% - 97,11% viso eterinio aliejaus masės. Didţiausia koncentracija
deguonį turinčių seksviterpenų 66,29% ir seksviterpeninių angliavandenilių 20,1%. Likusiame kiekyje randami maţesni kitų komponentų pėdsakai: selin-11-en-4-α-olis, α-selinenas, dodekanas ir 2-fenil etilo tiglatas [3].
4.3. Panaudojimas medicinoje
Dirvenis ţinomas jau tūkstančius metų. Jo šaknų ekstraktų poveikis pasiţymi diuretinėmis savybėmis ir kaip vaistaţolinis augalas, dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.) yra įtrauktas į daugelį farmakopėjų [10]. Literatūroje kaip ţaliava nurodoma ne tik dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.), bet ir šlaitinis dirvenis (Ononis arvensis L.), deja šlaitinio dirvenio nėra registruoto kaip vaistinės ţaliavos valstybėse narėse. Medicinoje ir tyrimuose naudojamas dygusis dirvenis (Ononis spinosa L.). Europos rinkoje dirvenio šaknų galima rasti tik keliose šalyse, kur jis yra kaip komponentas augalinėse arbatose: tai Belgijoje, Čekijos Respublikoje, Vokietijoje, Italijoje ir Lenkijoje [9].
Šiomis dienomis produktai, kurių sudėtyje yra dirvenio šaknų ar vien tik dirvenis, vartojami diurezės skatinimui, esant šlapimo takų infekcijoms, apatinių šlapimo takų ir inkstų sutrikimams, tokiems kaip susidariusiam smėliui ar maţiems akmenukams inkstuose. Šios indikacijos jau yra įrodytos atliekant tyrimus su gyvūnais, tačiau dar nėra klinikinių studijų [10,11,22]. Savo diureziniu poveikiu, palyginus su kitais tokio paties poveikio augalais, pasiţymi vidutiniškai stipriai [39].
Dėl savo sudėtyje turimų biologiškai aktyvių medţiagų, kurios pasireiškia antiuţdegiminėmis, antimikrobinėmis savybėmis, yra naudojami dirvenio uţpilai, nuovirai, ekstraktai, tinktūros. Taip pat dirvenis dar yra naudojamas esant kepenų ar skrandţio nedidelėms problemoms [4]. Ţinomas panaudojimas norint pagerinti ţaizdų gijimą, gydyti chroniškoms odos ligoms, egzemų, podagros, reumatinių būklių, įvairių odos paţeidimų, odos vėţio gydymui, kaip pagalbinė priemonė. Naudojama taip pat lokaliai kaip antiseptinė, antimikrobinė priemonė [29,36].
4.4. Oksidacinis stresas
Oksidacinis stresas apibrėţiamas kaip disbalansas tarp ţemo aktyvumo antioksidantų ir padidėjusių reaktyvių deguonies formų (ROS), laisvųjų radikalų. Padidėjęs oksidacinis stresas gali skatinti ląstelių struktūros paţeidimus ir net sunaikinti audinius [16]. Nesuporuoti elektronai, laisvieji radikalai yra nestabilūs, tačiau labai reaktyvūs junginiai [17]. Tam, kad organizme tinkamai vyktų
visos fiziologinės funkcijos yra būtina pusiausvyra tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų. Kitu atveju, laisvieji radikalai gali neigiamai paveikti lipidų, baltymų ir DNR struktūras, padidinti ţmogui gręsiančių ligų skaičių [16,18]. Įvairūs tyrimai rodo, kad organizme, kuris patiria oksidacinį stresą yra ţenkliai padidėjęs malondialdehido, superoksiddismutazės, glutationo peroksidazės ir katalazės kiekis [13].
Visos šios reakcijos sukeltos dėl naujų laisvųjų radikalų susidarymo vyksta grandininės reakcijos principu, kuris vyksta tol, kol yra nutraukiamos dėl bi-radikalų malšinimo. Bi-radikalų malšinimas yra stipresnis nei laisvųjų radikalų reakcijos su kitais ląstelės komponentais. Tačiau nors ir nusistovėjus koncentracijai ir esant maţam laisvųjų radikalų kiekiui, jų reakcijų greitis yra gana didelis ir gaunami produktai gali sukelti oksidacinę paţaidą [17].
Labiausiai reaktyvūs ir didţiausią biologinę ţalą DNR, baltymų, angliavandenių ir lipidų membranoms gali padaryti: hidroksilo radikalas, superoksido anijono radikalas, vandenilio peroksidas, hipochloritas, ozonas, azoto oksido radikalas ir peroksinitrito radikalas [16,18].
Pagrindiniai vidiniai laisvųjų radikalų šaltiniai yra mitochondrijos, ksantino oksidazė, peroksisomos, fagocitozė, uţdegimas, mankšta, išemija/reperfuzija [18].
Pagrindiniai išoriniai laisvųjų radikalų šaltiniai yra cigarečių dūmai, alkoholis, radiacija, aplinkos teršalai, kai kurie vaistai, pesticidai, pramoniniai tirpikliai, ozonas [18, 35].
4.4.1. Oksidacinio streso sukeliamos ligos
Reaktyviosios deguonies formos (ROS), manoma, kad sukelia uţdegimus ir virusines infekcijas, įvairius virškinamojo trakto sutrikimus, jo opas, taip pat vėţinius susirgimus ir neurodegeneracines ligas tokias kaip: Parkinsono liga, Alzheimerio liga ir Dauno sindromas [13,16,17].
Tokios patologinės būklės kaip uţdegimas ir reperfuzinė išemija susidaro dėl deguoniui jautrių trumpalaikio receptorių potencialo (TRP) kanalų, kurie skirstomas į šešis pošeimius (C, V, M, P, ML, A). TRP kanalai identifikuojami susidarius jautriems ryšiams tarp reaktyvaus deguonies ir kalcio jonams pralaidţių kanalų. Esant kuriai nors iš šių patologijų ląstelėse pasigamina dideli kiekiai aktyvių deguonies formų. Vykstant kalcio jonų antplūdţiui per deguoniui jautrius TRP kanalus – įrodytas šių ligų pablogėjimas. TRPA1 kanalo tipas laikomas kaip „deguonies jutiklis“ kuris vaidina svarbų vaidmenį palaikydamas deguonies homeostazę. TRPA1 išreikštas sensoriniuose neuronuose, tarpininkauja neuropeptido atpalaidavime ir chemokino gamyboje kvėpavimo takuose, nuo ko
priklauso astmos pablogėjimas. TRPM2 kanalo tipai reaguodami į aktyvųjį deguonį sukelia kalcio jonų antplūdţius per TRPM2 monocituose/makrofaguose ir alveolinio epitelio ląstelėse kur ima gamintis citokinai ir inflamasomos, dėl kurių taip pat pablogėja uţdegiminiai procesai. Taip pat, yra įrodyta, kad TRPM2 prisideda prie acetaminofeno sukelto kepenų paţeidimo, radiacijos sukelto audinių paţeidimo bei Alzheimerio ligos, ką ir nulemia oksidacinio streso vystymasis [38].
Oksidacinis stresas vaidina svarbų vaidmenį Alzheimerio ligos patogenezėje. Smegenys yra labiau paţeidţiamos oksidacinio streso dėl aktyvesnės medţiagų apykaitos nei kiti organai. Neuronų komponentai (lipidai, baltymai, nukleorūgštys) gali būti oksiduojami Alzheimerio ligos metus dėl mitochondrijų funkcijos sutrikimo, padidėjusio metalų kiekio, uţdegimo ir β-amiloid (Aβ) peptidų. Mitochondrijų funkcijos sutrikimas ir vėlesnis metabolinis sutrikimas buvo nustatytas hipokampo neuronuose pasireiškus citochromo oksidazės trūkumui, kuri atsakinga uţ ROS gamybos padidėjimą ir energijos sandėliavimą. Aβ peptidas sutrikdo elektronų transporto grandinę, todėl silpnėja pagrindinių fermentų veikla ir sutrikdoma mitochondrijų dinamika [6]. Aβ peptidams sąveikaujant su metalais (variu, cinku, geleţimi) vyksta elektronų perkėlimo procesas, jo metu susidaro ROS, indukuoti amiloid-peptido radikalai ir chelatai, kurie ir sukelia oksidacinį stresą [6, 12].
Genetiniai pakitimai genuose, kurie turi įtakos vėţinių ląstelių susidarymui neretai susidaro dėl laisvųjų radikalų, kurie sukelia oksidacinį stresą pakitus ląstelės metabolizmui [34]. Vėţinėse ląstelėse susidaręs redokso disbalansas, lyginant su normaliomis ląstelėmis, gali stimuliuoti onkogeniškų ląstelių susidarymą. Dėl oksidacinio paţeidimo vykstantis nuolatinis genetinės medţiagos keitimas dalyvauja mutageniniame, kancerogeniniame ir senėjimo procesuose. DNR mutacija yra svarbus aspektas kancerogenezei bei įvairių auglių susidarymui. ROS sukelti DNR paţeidimai apima viengrandės ir dvigradės DNR lūţius, purino, pirimidino, deoksiribozės ar skersinių jungčių modifikacijas [37].
Pagal PSO XXI amţiaus sindromu laikomas diabetas. Manoma, kad didţiausios diabeto komplikacijos įvyksta dėl oksidacinio streso. Hiperglikemijos organizme metu iš įvairių šaltinių yra stimuliuojamas reaktyvių deguonies formų susidarymas. Šie šaltiniai yra – lipooksigenazė, citochromo 450 monooksigenazė, azoto oksido sintazė, gliukozės autooksidacija [37].
4.4.2. Antioksidantai
Vis daţniau yra kalbama apie antioksidantų svarbą ir reikalingumą. Antioksidantų veikimo principai yra - neutralizuoja susidariusius laisvuosius radikalus, dezaktyvuoja molekulinį deguonį,
pašalina oksiduotus metalų jonus, prisijungia vandenilį ir sugeria UV spindulius. Taip pat gali būti naudojami kaip konservantai norint išvengti lipidų oksidacijos [2,25].
Endogeniniai antioksidantai gali būti skirstomi i fermentinius ir nefermentinius. Fermentiniai yra tokie, kaip superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT), gliutationo peroksidazė (GPx) ir gliutationo reduktazė (GRx). Nefermentiniai antioksidantai susidaro metabolizmo organizme metu, tai melatoninas, bilirubinas, lipolinė rūgštis, gliutationas, L-argininas, kofermentas Q10 ir kt. Antioksidantai kurie nesusidaro organizme, bet gaunami su maistu ar papildais vadinami egzogeniniais. Daţniausiai tai yra vitaminas E, vitaminas C, karotinoidai, selenas, manganas, cinkas, flavonoidai, omega-3 ir omega-6 riebiosios rūgštys [25].
Natūralūs antioksidantai randami augaluose daugiausia yra fenoliniai junginiai kurių didţiąją dalį sudaro flavan-3-oliai (>50%), flavonolglikozidai ir dihidrochalkonai. Antioksidantų komponentai pasiţymi hidrofilinėmis ir lipofilinėmis savybėmis, kurių dauguma yra hidrolifiliai flavonoidai kurie pasiţymi vidutiniu ar stipriu poliariškumu tokie kaip, katechinai, (+)-katechinas ir (-)-epikatechinas bei kvercetino glikozidai. Teigiama, kad oligomeriniai procianidinai kurie pasiţymi vidutiniu ir ţemu poliškumu taip pat gali prisidėti prie bendrojo antioksidacinio veikimo kaip lipofiliniai komponentai [20].
4.5. Fenolinių junginių charakteristika
Fenoliniai junginiai – sudaryti iš vieno ar kelių aromatinių ţiedų ir turi vieną ar daugiau hidroksilo grupių. Jie vadinami fenoliniais junginais dėl savo struktūros, nes šiuo metu yra ţinoma daugiau nei 8000 junginių, ir visi savo struktūroje turi fenolį. Didţiausios grupės fenolinių junginių yra fenolinės rūgštys, flavonoidai, taninai, stilbenai ir lignanai [8].
Fenolinės rūgštys skirstomos į dvi klases: benzoinės rūgšties dariniai, pavyzdţiui, galo rūgštis ir cinamono rūgšties dariniai, pavyzdţiui, kavos rūgštis (2pav.) [7].
Benzoinė rūgštis R1=R2=R3=H Cinamono rūgštis R1=R2=H
Vanilino rūgštis R1=OH, R2=CH3O, R3=H [5]
2pav. Pagrindinės fenolinės rūgštys
Flavonoidai, tai didţiulė antrinių metabolitų augaluose grupė, kurios struktūros pagrindas yra 2-fenilbenzopiranas (3pav.) [19]. Jie skirstomi į šešis pogrupius, tai flavonai, flavonoliai, flavanoliai, flavanonai, izoflavonai ir antocianinai. Trečia didelė polifenolių grupė yra taninai, kurie skirstomi į dvi klases, tai hidrolizuoti taninai ir kondensuoti taninai. Hidrolizuoti taninai savo sudėtyje turi gliukozės ar kito monosacharido esterį su galo rūgštimi, kurie kitaip vadinami galotaninais ar esterį su heksahidroksidifenilo rūgštimi – elagitaninais. Kondensuoti taninai yra oligomerai ar polimerai iš flavan-3-olių sujungtų anglies jungtimi [7].
3pav. Flavonoidų struktūros pagrindas [19]
4.5.1. Fenolinių junginių naudojimas medicinoje
Augaluose kaupiami fenoliniai junginiai, jie plačiai paplitę visoje augalų karalystėje. Labiausiai paplitę augaluose antriniai jų metabolitai, kurių kiekis varijuoja plačiame intervale priklausomai nuo morfologinės augalo dalies ar sąlygų, kuriose augalas auga [8,14]. Polifenoliai, tai junginių grupė varijuojanti plačiame fiziologinio aktyvumo spektre, naudojami tradicinėje ir moderniojoje medicinoje. Jie yra prekursoriai chalkonams, katechinams, flavonams, antocianams [14].
Pastaruoju metu polifenoliniai junginiai atkreipia daugiau dėmesio dėl savo stiprių antioksidacinių savybių, ir jų poveikis pasiţymi kaip prevencija ligoms, kurios susijusios su oksidaciniu stresu, pavyzdţiui, vėţys, širdies ir kraujagyslių bei neurodegeneracinės ligos [7,8]. Fenoliniai junginiai, daugiausia flavonoidai, pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis, maţina kapiliarų pralaidumą ir laikomi kaip kraujagysles apsaugantys vaistai. Flavonoidų 3‘4‘-dihidroksi grupės
(kvercetinas, miricetinas, liuteolinas, ir kiti glikozidai) junginiai pasiţymi ir P-vitamininiu poveikiu [14].
Antioksidaciniu poveikiu, flavonoidai yra daug efektyvesni nei vitaminai C ir E, ir laisvųjų radikalų ţalą gali uţkirsti šiais mechanizmais: tiesioginis reaktyviųjų deguonies formų (ROS) inaktyvavimas, antioksidacinių fermentų aktyvavimas, metalų kompleksų sudarymas, α-tokoferolio radikalų sumaţinimas, oksidazės slopinimas, azoto oksido sukelto oksidacinio streso sušvelninimas, šlapimo rūgšties kiekio padidinimas, padidina maţų molekulių antioksidantų antioksidacines savybes [27].
Greitai ir paprastai vykstanti reakcija, kurios metu flavonoidai inaktyvuoja laisvuosius radikalus ·R atpalaiduodami vandenilio atomą kaip donorą (4pav.) [27].
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI
5.1. Tiriamasis objektas
Tyrime buvo tirtos šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) morfologinės dalys: stiebai, lapai, ţiedai, ţolė. Tiriamieji objektai buvo renkami 2014 – 2015metais.
Nustačius ekstrakcines sąlygas, buvo pasirinkta ekstrakciją vykdyti ultragarso vonelėje (Elmasonic S40H (U=230V, V=40 Hz), Elma, Vokietija), 50 C temperatūroje, veikiant ultragarsu 10min. Ekstrahentas pasirinktas 70% (V/V) etanolio vandens mišinys.
0,1 g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos dedame į stiklinį buteliuką ir uţpilame 20ml 70% etanoliu, buteliukas uţsukamas kamščiu.
Gauti ekstraktai atvėsinami, filtruojami pro popierinius, 70% etanoliu sudrėkintus filtrus. Nufiltruoti ekstraktai laikomi tamsaus stiklo buteliukuose, tamsioje nuo saulės spindulių apsaugotoje vietoje, kambario temperatūroje.
5.2. Naudota aparatūra
Tiriamųjų ekstraktų gamybai buvo naudota ultragarso vonelė – „ElmaSonic S40H“ (U=230V) iš Elma Schmidbauer (Vokietija) ir orbitalinė kratyklė „IKA®KS 130 basic“ iš IKA-WERKE (Vokietija). Spektroskopinei bandinių analizei naudotas spektrofotometras „Cary 8454 UV-Vis“ iš Agilent Technologies (JAV).
5.3. Naudotos tyrimui medţiagos ir reagentai
Išgrynintas vanduo;
Maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96proc. (UAB „Sumbras“, Kaunas, Lietuva); Folin&Ciocalteu fenolinis reagentas 2N (Sigma-Aldrich, Šveicarija);
Acto rūgštis 100 proc. (Carl Roth, Vokietija);
Bevandenės geleţies (II) chloridas 99,5proc. (Alfa Aesar, Vokietija); Aliuminio chlorido heksahidratas ≥95proc. (Carl Roth, Vokietija); Natrio karbonatas 99,5-100,5proc. (Sidma-Aldrich, Prancūzija);
Galo rūgšties monohidratas ≥98proc. (Sigma-Aldrich, Kinija); Rutino trihidratas ≥95proc. (Carl Roth, Vokietija)
Heksametilentetraminas ≥99proc. (Carl Roth, Vokietija)
DPPH (2,2difenil-1-pikrilhidrazilas) 95proc, (Carl Roth, Vokietija); Ferozino mononatrio druska ≥97proc. (Sigma-Aldrich, JAV)
5.4. Suminis fenolinių junginių nustatymas spektrofotometriniu metodu
Fenolinių junginių kiekis buvo nustatomas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Gaminant tiriamąjį tirpalą buvo imamas 1ml tiriamojo etanolinio ekstrakto, 5ml 0,2N Folin-Ciocalteu reagento ir pridedami 4ml 7,5% Na2CO3 tirpalo. Optinis tankis matuojamas spektrofotometru (Cary 8454 UV-Vis,
Agilent Technologies, JAV), esant 765nm šviesos bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Suminis fenolinių junginių kiekis tiriamojoje augalinėje ţaliavoje apskaičiuojamas iš gauto rezultato. Fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (mg galo rūgšties/ 100g bandinio) pagal kalibracinę kreivę.
Kalibracinė kreivė sudaryta ruošiant etaloninius galo rūgšties tirpalus 96% etanolyje. Ruošiami 0,35; 0,175; 0,0875; 0,0475; 0,021875; 0,010938 mg/ml koncentracijų tirpalai. 1ml atitinkamos koncentracijos galo rūgšties tirpalas maišomas su 5ml Folin-Ciocalteu reagentu ir 4ml Na2CO3 tirpalais. Optinis tankis matuojamas po 30min, 60min ir 90min esant 765nm bangos ilgiui ir
naudojant palyginamąjį tirpalą išgrynintą vandenį (5pav.).
Suminis fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas naudojantis galo rūgšties kalibracine kreive.
Apskaičiuojama reikšmė x pagal formulę: y = 9.3076x + 0.1377
y – etanolinio ekstrakto optinis tankis
C – fenolinių junginių kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentais mg/g; c – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;
m – augalinės ţaliavos masė paimta ekstrakto gamybai, g.
Eksperimentiškai buvo nustatyta, kad didţiausia absorbcija 765nm šviesos bangos ilgyje, buvo pasiekiama po 30min nuo reagentų sumaišymo. Šis absorbcijos rezultatas buvo naudojamas fenolinių junginių kiekio nustatymui. Palyginamasis tirpalas- išgrynintas vanduo.
5.5. Suminis flavonoidų nustatymas spektroskopiniu metodu
Suminis flavonoidų kiekis nustatomas gaminant tiriamąjį tirpalą iš paruošto augalinio ekstrakto, aliuminio chlorido, heksametilentetramino, parūgštinant terpę acto rūgštimi.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas 25ml matavimo kolboje. Į kolbą pilame 1ml 70% etanolinio ekstrakto, 10ml 96% etanolio, 1,5ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2ml 5% heksametilentetramino tirpalo ir parūgštiname 0,5ml 33% acto rūgšties tirpalu. Gautas tirpalas skiedţiamas išgrynintuoju vandeniu iki ţymės, sumaišoma. Eksperimentiškai nustačius absorbcija matuojama po 30min esant šviesos bangos ilgiui 407nm. Gautas absorbcijos dydis lyginamas su palyginamuoju tirpalu.
Palyginamasis tirpalas ruošiamas 25ml matavimo kolboje. Į kolbą pilame 1 ml 70% etanolinio ektrakto, 10ml 96%etanolio ir parūgtiname 0,5ml 33% acto rūgšties tirpalu. Gautas tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki ţymės, sumaišoma.
Gaminant etaloninį, tiriamąjį ir palyginamąjį rutino tirpalą gamyba vyksta analogiškai, tik vietoj 1ml augalinės ţaliavos ekstrakto, pilame 1ml rutino tirpalo. Etanolinis rutino tirpalas ruošiamas 0,05g rutino tirpinant 100ml etanolio.
Flavonoidų suminis kiekis perskaičiuojamas rutinu ir išreiškiamas mg/g:
mR – rutino masė gramais, panaudota etanoliniams rutino tirpalui ruošti;
A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – augalinio ekstrakto tūris, ml;
m – augalinės ţaliavos masė g, paimta ektrakto ruošimui; AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
VR – etaloninio rutino tirpalo tūris, ml.
5.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas fotometriniu DPPH radikalų surišimo
metodu
Antioksidacinio aktyvumo įvertinimui taikomas elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas. Kiekvieną dieną ruošiamas švieţias DPPH 6×10-5
M DPPH tirpalas ir laikomas tamsaus stiklo butelyje apsaugančiame nuo saulės spindulių.
Tirpalas ruošiamas 1cm kvarco kiuvetėje. 50 µl tiriamojo etanolinio ekstrakto sumaišoma su 2ml 6×10-5 M DPPH tirpalu 96% etanolyje. Tuščias bandinys paruošiamas su 50 µl 70% etanoliu, vietoj etanolinio ekstrakto. Absorbcijos maţėjimas išmatuojamas spektrofotometru 515 nm bangos ilgyje, iki kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra, t.y. po 30min. Laikas buvo nustatytas eksperimentiškai matuojant ekstraktus pas 1min.
Antiradikalinis augalinių ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais:
DPPH = [(A
B– A
a/A
B] * 100%
AA – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (t = 30min)
5.7. Chelatinio aktyvumo nustatymas fotometriniu Fe
2+surišimo metodu
Chelatinis aktyvumas nustatomas remiantis fotometriniu Fe2+ surišimo metodu, jį pakoregavus ir pritaikius savo tyrimui. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės priklauso nuo jiems būdingos savybės surišti pereinamųjų metalų (Fe 2+
, Cu 2+) jonus. Chelatinės savybės tiriamuosiuose ekstraktuose įvertinamos matuojant Fe(II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumaţėjimą esant šviesos bangos ilgiui 562 nm.
Tirpalas ruošiamas 1cm kvarco kiuvetėje. 1ml tiriamojo ekstrakto sumaišome su 50 µl 2mM FeCl2 tirpalo. Reakcijai inicijuoti pridedame 0,2ml 5mM ferozino tirpalo. Sumaišius absorbcija
matuojama po 10min esant 562nm šviesos bangos ilgiui. Tuščias bandinys paruošiamas identiškai, vietoj tiriamojo ekstrakto pilant 70% etanolį.
Fe2+ jonų surišimas išreiškiamas procentais:
Fe
2+= [(A
B– A
a/A
B] * 100%
AA – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (t = 10min)
AB – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min)
5.8. Duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė ir grafinis vaizdavimas atlikti „MS Exel 2010“ (Microsift, JAV) ir „IBN SPSS Statistics 19“ (IBM Corporation, JAV). Gauti tyrimų duomenys statistiškai įvertinti apskaičiuojant matematinį vidurkį, standartinę paklaidą, standartinį nuokrypį, Pirsono koreliacijos koeficientą. Statistiniam patikimumui įvertinti buvo pasirinkta 0,05 reikšmė, todėl gauti rezultatai kurių p<0,05 laikomi statistiškai reikšmingais.
6. REZULTATAI
6.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Prieš atliekant tyrimą, buvo eksperimentiškai nustatomos tinkamiausios ekstrakcinės sąlygos tiriamųjų ekstraktų ruošimui.
Ekstrahento koncentracijos parinkimas. Pirmiausia, parenkama etanolio koncentracija, kuri geriausiai išekstrahuoja ţaliavas. Etanolio koncentracija nustatoma maceracijos būdu. Etanolio koncentracijos imamos 40%, 50%, 60%, 70% ir 80%. Ekstrakto gamybai imama 0,1g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml ekstrahento, tiriamos koncentracijos etanolio ir vandens mišinio.
Uţpylus ţaliavą ekstrahentu ją purtome 1val., purtytuvo greitis 320 apsisukimų per minutę. Paliekame ekstraktą maceruotis 24h ir po jų purtome dar 1val. 320 apsisukimų per minutę greičiu. Pagamintą ekstraktą filtruojame pro popierinį etanoliu sudrėkintą filtrą. Nustatome bendrą fenolinių junginių kiekį pagal GRE – galo rūgšties ekvivalentą (6pav.).
6pav. Suminis fenolinių junginių kiekis pagal GRE, nustatant optimalią etanolio koncentraciją
Nustatant eksperimentiškai fenolinius junginius tiriamuosiuose ekstraktuose, pagal gautus rezultatus tinkamiausia etanolio koncentracija - 70 proc., gautas suminis fenolinių junginių kiekis yra didţiausias (16,12 ± 0,74mg/g).
Ekstrahavimo laiko nustatymas ultragarso vonelėje. Tiriamųjų ekstraktų ruošimui imame 0,1g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml 70% etanolio ir vandens mišinio. Ektraktus veikiame ultragarsu kambario temperatūroje ir suminį fenolinių junginių kiekį matuojame po 5, 10, 15, 20 min. (7pav.)
7pav. Fenolinių junginių kiekis nustatant tinkamiausią ektrahavimo laiką
Eksperimentiškai nustatant suminį fenolinių junginių kiekį tiriamuosiuose ekstraktuose, pagal gautus rezultatus (13,62 ± 0,22 mg/g), geriausias laikas ekstrahavimui yra 10min.
Ekstrahavimo temperatūros parinkimas ultragarso vonelėje. Tiriamųjų ekstraktų ruošimui imame 0,1g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml 70% etanolio. Ekstrahuojame 30˚C, 40 ˚C, 50 ˚C, 60 ˚C ir 70˚C temperatūroje. Atvėsinus ekstraktus filtruojame per popierinį, etanoliu sudrėkintą filtrą. (8pav.)
8pav. Fenolinių junginių kiekis nustatant tinkamiausią ektrahavimo temperatūrą
Eksperimentiškai nustatant suminį fenolinių junginių kiekį tiriamuosiuose ekstraktuose, pagal gautus rezultatus (12,31 ± 0,33 mg/g), tinkamiausia ekstrahavimui temperatūra yra 50˚C.
Atlikus sąlygų parinkimą eksperimentiškai pagal gautus duomenis, geriausios sąlygos ekstraktų gamybai yra: 1:200 arba 0,1g išdţiovintos ir susmulkintos augalinės ţaliavos ir 20ml 70% etanolio ir vandens mišinio. Ekstrahuojama ultragarsu vandens vonioje 10min, 50˚C temperatūroje.
6.2. Suminis fenolinių junginių nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje
sprektrofotometriniu metodu
Tiriamojoje augalinėje ţaliavoje buvo nustatytas suminis fenolinių junginių kiekis naudojantis spektroftometriniu metodu. Augalinės ţaliavos surinktos Kauno ir Kėdainių rajonuose. Iš kiekvienos morfologinės augalo dalies buvo gaminama po 3 ekstraktus iš kurių atliekama po 3 pakartojimus. Eksperimentui atlikti naudojama F-C metodika, gauti rezultatai pateikti diagramoje. (9,10pav.)
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 11,73 – 21,66 mg/g Kauno rajone, ir nuo 13,27 - 19,58 mg/g Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas aiškus fenolinių junginių pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius maţiausias kiekis fenolinių junginių sukaupiamas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 11,73 ± 0,44 mg/g , Kėdainių rajono ţaliavose 13,27 ± 0,19 mg/g. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 21,66 ± 0,5 mg/g Kauno rajono ţaliavose ir 19,58 ± 0,31 mg/g Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant suminį fenolinių junginių kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 21,66 ± 0,5 mg/g (Kauno raj.), 19,58 ± 0,31 mg/g (Kėdainių raj.); lapai 18,57 ± 0,04 mg/g (Kauno raj.), 19,12 ± 0,14 mg/g (Kėdainių raj.); ţolė 17 ± 0,56 mg/g (Kauno raj.), 14,4 ± 0,72 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 11,73 ± 0,48 mg/g (Kauno raj.), 13,27 ± 0,19 mg/g (Kėdainių raj.)
Vidutiniškai tarp visų augalo dalių rajone, didesnį fenolinių junginių kiekį sukaupė augalai rinkti Kauno rajone 17,16 ± 4,18 mg/g nei Kėdainių rajone 15,86 ± 2,84 mg/g.
9pav. Suminis fenolinių junginių kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2014m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. GRE – galo rūgšties ekvivalentai (n=3)
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai įvairuoja 12,05 – 22,82 mg/g Kauno rajone, ir nuo 5,4 – 19,4 mg/g Kėdainių rajone.
Eksperimentiškai nustačius maţiausias fenolinių junginių kiekis taip pat sukaupiamas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 12,05 ± 1,62 mg/g, Kėdainių rajono ţaliavose 5,4 ± 0,84 mg/g. Didţiausi kiekiai randami lapuose 22,82 ± 2,8 mg/g Kauno rajono ţaliavose ir Kėdainių rajono ţaliavų ţieduose 19,4 ± 0,28 mg/g.
Lyginant suminį fenolinių junginių kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: lapai 22,82 ± 2,8 mg/g (Kauno raj.) ir ţiedai 19,4 ± 0,28 mg/g (Kėdainių raj.); ţiedai 21,4 ± 0,28 mg/g (Kauno raj.) ir lapai 18,26 ± 0,08 mg/g (Kėdainių raj.); ţolė 16 ± 3,39 mg/g (Kauno raj.), 10,2 ± 0,56 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 12,05 ± 1,62 mg/g (Kauno raj.), 5,4 ± 0,89 mg/g (Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesnį fenolinių junginių kiekį sukaupė augalai rinkti Kauno rajone 16,67 ± 5,44 mg/g nei Kėdainių rajone 12,32 ± 6,16 mg/g.
10pav. Suminis fenolinių junginių kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2015m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. GRE – galo rūgšties ekvivalentai (n=3)
Apţvelgus gautus rezultatus, galima daryt išvadą, kad fenoliniai junginiai daugiausiai kaupiami yra ţieduose (2014m. 21,66 ± 0,5 mg/g. 2015m. 22,82 ± 2,8 mg/g) ir lapuose (2014m. 19,58 ± 0,3 mg/g, 2015m. 19,4 ± 0,28 mg/g), jų kiekiai yra sąlyginai panašūs. Maţiausi kiekis randami stiebuose.
6.3. Suminis flavonoidų kiekio nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje
sprektrofotometriniu metodu
Tiriamojoje augalinėje ţaliavoje buvo nustatytas suminis flavonoidų kiekis naudojantis spektroftometriniu metodu. Augalinės ţaliavos buvo renkamos Kauno ir Kėdainių rajonuose. Iš kiekvienos morfologinės augalo dalies buvo gaminama po 3 ekstraktus iš kurių atliekama po 3 pakartojimus. Eksperimentui atlikti naudojamas aliuminio chlorido tirpalas dėl savybės sudaryti kompleksus su flavonoidais ir taip juos nustatyti. Gauti rezultatai pateikti diagramoje (11,12pav.).
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 11,14 – 34,15 mg/g Kauno rajone, ir nuo 11,92 – 36,65 mg/g Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas aiškus
flavonoidų pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius maţiausias kiekis flavonoidų sukaupiamas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 11,14 ± 0,22 mg/g , Kėdainių rajono ţaliavose 11,92 ± 0,11 mg/g. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 34,15 ± 1,06 mg/g Kauno rajono ţaliavose ir 36,65 ± 0,64 mg/g Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant suminį flavonoidų kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 34,15 ± 1,06 mg/g (Kauno raj.), 36,65 ± 0,64 mg/g (Kėdainių raj.); lapai 28,55 ± 0,77 mg/g (Kauno raj.), 31,6 ± 1,55 mg/g (Kėdainių raj.); ţolė 14,35 ± 0,21 mg/g (Kauno raj.), 16,33 ± 1,52 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 11,14 ± 0,22 mg/g (Kauno raj.), 11,92 ± 0,11 mg/g (Kėdainių raj.).
Staičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesnį flavonoidų kiekį sukaupė augalai rinkti Kauno rajone 20,03 ± 12,98 mg/g nei Kėdainių rajone 19,62 ± 10 mg/g. Tačiau nagrinėjant rezultatus tik tarp lapų ir ţiedų kur sukaupiamas pagrindas visų flavonoidų, daugiau flavonoidų buvo sukaupta Kėdainių rajono ţaliavose.
11pav. Suminis flavonoidų kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2014m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. RE – rutino ekvivalentai (n=3)
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo 10 - 70 mg/g Kauno rajone, ir nuo 8,2 – 52,7 mg/g Kėdainių rajone.
Eksperimentiškai nustačius maţiausias flavonoidų kiekis taip pat sukaupiamas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 10 ± 0,002 mg/g, Kėdainių rajono ţaliavose 8,2 ± 0,28 mg/g.
Didţiausi kiekiai randami ţieduose 70 ± 0,002 mg/g Kauno rajono ţaliavose ir Kėdainių rajono ţaliavų ţieduose 52,7 ± 0,84 mg/g.
Lyginant suminį flavonoidų kiekį nuo daugiausiai sukaupiančių iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 70 ± 0,002 mg/g (Kauno raj.) ir 52,7 ± 0,84 mg/g (Kėdainių raj.); lapai 25 ± 7,07 mg/g (Kauno raj.) ir lapai 26,85 ± 1,2 mg/g (Kėdainių raj.); ţolė 15 ± 7,07 mg/g (Kauno raj.), 7,15 ± 0,21 mg/g (Kėdainių raj.); stiebai 10,00 ± 0,002 mg/g (Kauno raj.), 8,2 ± 0,28 mg/g (Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesnį flavonoidų kiekį sukaupė augalai rinkti Kauno rajone 30 ± 25,63 mg/g nei Kėdainių rajone 23,663 ± 19,74 mg/g. Tačiau nagrinėjant rezultatus tik tarp lapų ir ţiedų kur sukaupiamas pagrindas visų flavonoidų, jų kiekis buvo lapai panašus Kauno rajono (43 ± 24,89 mg/g) ir Kėdainių rajone (42,36 ± 14,17 mg/g)
12pav. Suminis flavonoidų kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida) 2015m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje Kauno ir Kėdainių rajonuose. RE – rutino ekvivalentai (n=3)
Apţvelgus gautus rezultatus, galima daryt išvadą, kad didţiausias kiekis flavonoidų yra kaupiamas ţieduose (2014m 36,65 ± 0,64 mg/g. 2015m. 70 ± 0,002 mg/g) ir lapuose (2014m. 31,6 ± 1,55 mg/g. 2015m. 26,85 ± 1,20 mg/g). Jų kiekiai ţenklai didesni uţ maţiausią aptinkamą kiekį stiebuose.
6.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje
fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu
Atlikus antioksidacinio aktyvumo tyrimą buvo nustatytas ţaliavoje jo kiekis procentais atskirai kiekvienoje morfologinėje augalo dalyje. Iš kiekvienos morfologinės augalo dalies buvo gaminama po 3 ekstraktus iš kurių atliekama po 3 pakartojimus. Fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu galime vertinti teigiamą fenolinių junginių poveikį ląstelėms maţinant jų paţeidimą bei paties oksidacinio streso maţinimą (13,14pav.).
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 35,19 – 49,62 % Kauno rajone, ir nuo 37,17 – 54,66 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius maţiausias antioksidacinis akytvumas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 35,19 ± 0,3 % , Kėdainių rajono ţaliavose 37,17 ± 0,23 %. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 49,62 ± 1,73 % Kauno rajono ţaliavose ir 54,66 ± 1,76 % Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant antioksidacinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 49,62 ± 1,73 % (Kauno raj.), 54,66 ± 1,76 % (Kėdainių raj.); lapai 42,94 ± 4,77 % (Kauno raj.), 43,35 ± 1,48 % (Kėdainių raj.); ţolė 37,96 ± 1,06 % (Kauno raj.), 44,54 ± 3,64 % (Kėdainių raj.); stiebai 35,19 ± 0,3 % (Kauno raj.), 37,17 ± 0,23 % (Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi augalai rinkti Kėdainių rajone 44,89 ± 6,58 % nei Kauno rajone 41,42 ± 6,18 %.
13pav. DPPH radikalų surišimo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) 2014m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 34,97 – 89,0 % Kauno rajone, ir nuo 20,68 – 58,33 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Eksperimentiškai nustačius maţiausias antioksidacinis aktyvumas stiebuose. Kauno rajono ţaliavose vidurkis 34,97 ± 0,04 % , Kėdainių rajono ţaliavose 20,68 ± 0,31 %. Didţiausi kiekiai randami ţieduose 89,0 ± 0,14 % Kauno rajono ţaliavose ir 58,33 ± 0,96 % Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant antioksidacinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 89,0 ± 0,14 % (Kauno raj.), 58,33 ± 0,96 % (Kėdainių raj.); lapai 45,07 ± 0,33 % (Kauno raj.), 36,05 ± 1,49 % (Kėdainių raj.); ţolė 35,7 ± 0,55 % (Kauno raj.), 30,02 ± 0,76 % (Kėdainių raj.); stiebai 34,97 ± 0,04 % (Kauno raj.), 20,68 ± 0,31 % (Kėdainių raj.)
Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi augalai rinkti Kauno rajone 51,19 ± 23,73 % nei Kėdainių rajone 36,27 ± 14,84 %.
14 pav. DPPH radikalų surišimo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) 2015m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)
6.5. Chelatinio aktyvumo nustatymas Ononis arvensis L. augalinėje ţaliavoje
fotometriniu Fe
2+surišimo metodu
Šiuo tyrimu nustatomas gebėjimas surišti pereinamųjų (Fe2+
ir Cu2+) metalų jonus. Nuo šio gebėjimo priklauso fenolinių junginių antioksidacinės savybės, tiriamas Fe(II) ir ferozino komplekso absorbcijos maţėjimas. Gauti rezultatai pateikti diagramoje (15,16pav.).
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2014m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 34,17 – 47,52 % Kauno rajone, ir nuo 35,03 – 50,76 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Visose augalo dalyse chelatinis aktyvumas vyravo panašus, didelio reikšmių skirtumo nėra kaip kituose tyrimuose. Maţiausias kiekis stiebuose, Kauno rajono ţaliavose vidurkis 34,17 ± 4,29 % , Kėdainių rajono ţaliavose 35,03 ± 1,35 %. Didţiausias chelatinis aktyvumas ţieduose 47,52 ± 2,37 % Kauno rajono ţaliavose ir 50,76 ± 0,81 % Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant chelatinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 47,52 ± 2,37 % (Kauno raj.), 50,76 ± 0,81 % (Kėdainių raj.); lapai 41,86 ± 5,4 % (Kauno raj.), 47,82 ± 2,53 % (Kėdainių raj.); ţolė 40,86 ± 7,32 % (Kauno raj.), 37,61 ± 7,57 % (Kėdainių raj.); stiebai 34,17 ± 4,29 % (Kauno raj.), 35,03 ± 1,35 % (Kėdainių raj.) Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu chelatiniu aktyvumu pasiţymi augalai rinkti Kėdainių rajone 42,23 ± 7,9 % nei Kauno rajone 40,98 ± 6,39 %.
15pav. Chelatinio aktyvumo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) Fe2+ jonų surišimo metodu 2014m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)
Ekstraktai, kurie buvo gaminami iš 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 39,53 – 62,11 % Kauno rajone, ir nuo 19,31 – 56,04 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas pasiskirstymas tam tikroje morfologinėje augalo dalyje. Maţiausias kiekis stiebuose, Kauno rajono
ţaliavose vidurkis 39,53 ± 12,22 % , Kėdainių rajono ţaliavose 19,31 ± 1,81 %. Didţiausias chelatinis aktyvumas ţieduose 62,11 ± 2,12 % Kauno rajono ţaliavose ir 56,04 ± 4,12 % Kėdainių rajono ţaliavose.
Lyginant chelatinį aktyvumą nuo labiausiai pasireiškiančio iki maţiausiai, pagal morfologinę augalo dalį galima suskirstyti: ţiedai 62,11 ± 2,12 % (Kauno raj.), 56,04 ± 4,12 % (Kėdainių raj.); lapai 48,06 ± 2,77 % (Kauno raj.), 42,04 ± 2,21 % (Kėdainių raj.); ţolė 43,1 ± 15,35 % (Kauno raj.), 32,1 ± 1,13 % (Kėdainių raj.); stiebai 39,53 ± 12,22 % (Kauno raj.), 19,31 ± 1,81 % (Kėdainių raj.) Skaičiuojant vidurkį tarp visų augalo dalių rajone, didesniu chelatiniu aktyvumu pasiţymi augalai rinkti Kauno rajone 48,2 ± 11,87 % nei Kėdainių rajone 37,37 ± 14,51 %.
16pav. Chelatinio aktyvumo įvertinimas (vidurkis ± standartinė paklaida) Fe2+ jonų surišimo metodu 2015m. Ononis arvensis L. augalinėje žaliavoje (n=3)
6.6. Suminio fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo
koreliacijos įvertinimas šlaitinio dirvenio (Ononis Arvensis L.) ţaliavose
Atlikus tyrimą pastebėta, kad didţiausias kiekis, biologiškai aktyvių medţiagų sukaupiama tose pačiose morfologinėse augalo dalyse (ţiedai, lapai). Iš gautų rezultatų svarbu nustatyti koreliaciją tarp kintamųjų ir statistiškai įvertinti gautų duomenų statistinį reikšmingumą. Koreliacijai įvertinti buvo pasirinkta skaičiuoti Pirsono koeficientą, kuris įvertina tiesioginę priklausomybę tarp dviejų atsitiktinių kintamųjų. Kuo gauta reikšmė yra arčiau 1 (-1), tuo stipresnis ryšys tarp kintamųjų ir
atvirkščiai – kuo gauta reikšmė arčiau 0, tuo koreliacija yra silpnesnė ( <0,3 – ryšys silpnas, 0,3-0,7 – ryšys vidutinis, >0,7 – ryšys stiprus) [22].
Atlikus statistinę šlaitinio dirvenio ekstraktų analizę, pastebėta labai stipri koreliacija tarp fenolinių junginių kiekio ir flavonoidų abiejų metų ţaliavų ekstraktuose. Tai 2014m. Kauno rajono (0,894, p<0,05), Kėdainių rajono (0,99, p<0,05) ir 2015m. Kauno rajono (0,784, p<0,05), Kėdainių rajono (0,856, p<0,05). Lyginant fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą, matomas stiprus ryšys abiejų metų ţaliavų ekstraktuose 2014m. Kauno rajono (0,877, p<0,05), Kėdainių rajono (0,913, p<0,05) ir 2015m. Kauno rajono (0,749, p<0,05), Kėdainių rajono (0,859, p<0,05). Taip pat statistiškai reikšmingi rezultatai ir stipri koreliacija matoma tarp flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo abiejų metų ţaliavų ekstraktuose. 2014m. Kauno rajono (0,93, p<0,05), Kėdainių rajono (0,731, p<0,05) bei 2015m. Kauno rajono (0,988, p<0,05) ir Kėdainių rajono (0,959, p<0,05). Nustatyta labai silpna koreliacija tarp bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio augalinėse ţaliavose ir antichelatinio aktyvumo duomenų.
Apibendrinus statistinius duomenis gautus iš Ononis arvensis L. ţaliavų ekstraktų, galima daryti išvadą, kad fenolinių junginių (0,913, p<0,05) ir flavonoidų (0,988, p<0,05) kiekiai stipriai koreliuoja su antioksidaciniu aktyvumu. Gauti rezultatai leidţia spręsti, kad ţaliavoje sukaupti didesni kiekiai fenolinių junginių ir flavonoidų nulemia didėjantį antioksidacinį aktyvumą.
7. REZULTATŲ APTARIMAS
7.1. Bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio aptarimas
Šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) augalinių ţaliavų veikimas nėra tiksliai ţinomas ir nustatytas, tačiau manoma, kad jo diurezinį ir antiuţdegiminį poveikį nulemia bendras aktyviųjų ingredientų kiekis, tai izoflavonoidai, flavonoidai ir fenolinės rūgštys. Šlaitinio dirvenio ţolėje izoflavonoidų randama apie 2,54 %, flavonoidų apie 2,32% ir fenolinių rūgščių apie 2,41% [30].
Tyrimo metu buvo nustatomas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis atskirose morfologinėse augalo dalyse (ţieduose, lapuose, ţolėje, stiebuose). Gauti rezultatai parodė, kad augalinėje ţaliavoje procentinis fenolinių junginių kiekis 2014metais Kauno rajone buvo: ţieduose 2,17%, lapuose 1,86%, ţolėje 1,7%, stiebuose 1,17%, Kėdainių rajone 2014metais – ţieduose 1,96%, lapuose 1,91%, ţolėje 1,44%, stiebuose 1,33%. 2015metų rezultatai parodė Kauno rajone ţieduose 2,14%, lapuose 2,28%, ţolėje 1,6%, stiebuose 1,25%, o Kėdainių rajone ţieduose 1,94%, lapuose 1,83%, ţolėje 1,02% ir stiebuose 0,54%. Flavonoidų kiekis augalinėje ţaliavoje taip pat tirtas atskirose morfologinėse augalo dalyse. 2014metais Kauno rajone flavonoidų kiekis ţieduose siekė 3,42%, lapuose 2,86%, ţolėje 1,44%, stiebuose 1,11%, Kėdainių rajone ţieduose 3,67%, lapuose 3,16%, ţolėje 1,63%, stiebuose 1,19%. 2015metų Kauno rajono ţaliavose flavonoidų kiekis ţieduose siekė 7%, lapuose 2,5%, ţolėje 1,5%, stiebuose 1%, o Kėdainių rajone ţieduose 5,27%, lapuose 2,69%, ţolėje 0,72% ir stiebuose 0,82%.
Pagal gautus tyrimų rezultatus vidutinis fenolinių junginių kiekis ţaliavose įvairuoja nuo 0,54 – 2,17% ir didţiausi kiekiai kaupiami ţieduose (2,17%) ir lapuose (1.91%), o maţiausi stiebuose. Flavonoidų kiekis ţieduose ir lapuose yra ţenkliai didesnis, svyruoja nuo 2,86 – 3,67%, maţiausias kiekis stiebuose. Lyginant gautus rezultatus su atliktais tyrimai matomas didesnis bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis ţiedų ir lapų augalinėse ţaliavose.
7.2. Antioksidacinio ir chelatinio aktyvumo aptarimas
Atlikus DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodą buvo nustatytas skirtingų morfologinių augalo dalių antioksidacinis aktyvumas. Gauti rezultatai parodė vidutiniškas antioksidacines savybes, kurių rezultatai panašūs su rastais literatūroje [21]. Gauti 2014m. įvairavo nuo 35,19 – 54,66% ir 2015m. nuo 20,68 – 89%. Stipriausiai antioksidacinis aktyvumas pasireiškė
ţiedų ir lapų morfologinėse dalyse, tai 2014m. ţieduose – 49,62%, lapuose 43,35%, 2015m. ţieduose 89,00% ir lapuose 36,05%. Šie kiekiai parodo, kad O. arvensis augalinės ţaliavos gali būti potencialūs antioksidantų šaltiniai.
Taip pat tirtas chelatinis Fe(II) jonų surišimas. Šis tyrimas taip pat parodo antioksidacinio aktyvumo gebą surišti pereinamuosius metalus sudarant kompleksus. Tyrimo rezultatai parodė, kad chelatinis aktyvumas įvairavo 2014m. nuo 34,17 – 47,52 % Kauno rajone, ir nuo 35,03 – 50,76 % Kėdainių rajone. Iš gautų tyrimo rezultatų matomas neţymiai didesnis aktyvumas ţiedų (47,52 ± 2,37 % Kauno raj., 50,76 ± 0,81 % (Kėdainių raj.) ir lapų (41,86 ± 5,4 % Kauno raj., 47,82 ± 2,53 % Kėdainių raj.) morfologinėse augalo dalyse. 2015m. ţaliavų rezultatai svyravo nuo 39,53 – 62,11 % Kauno rajone, ir nuo 19,31 – 56,04 % Kėdainių rajone. Ţenkliai didesnis chelatinis aktyvumas pastebėtas ţieduose (62,11 ± 2,12 % Kauno raj., 56,04 ± 4,12 % Kėdainių raj.) ir lapuose (48,06 ± 2,77 % Kauno raj., 42,04 ± 2,21 % Kėdainių raj.), o maţiausi kiekiai stiebuose. Chelatinis aktyvumas parodo gebėjimą surišti pereinamuosius metalus, ši savybė apsaugo nuo DNR paţeidimų, oksidacinio streso ir jo sukeliamų ligų [24].
7.3 Duomenų koreliacijos aptarimas
Vertinant duomenų tarpusavio ryšį pastebėta labai stipri koreliacija tarp fenolinių junginių kiekio ir flavonoidų abiejų metų ţaliavų ekstraktuose. Tai 2014m. (0,99, p<0,05) ir 2015m. (0,856, p<0,05). Lyginant fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą, stiprus ryšys abiejų metų ţaliavų ekstraktuose 2014m. (0,913, p<0,05) ir 2015m. (0,859, p<0,05). Taip pat statistiškai reikšmingi rezultatai ir stipri koreliacija matoma tarp flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo abiejų metų ţaliavų ekstraktuose. 2014m. (0,93, p<0,05), bei 2015m. (0,988, p<0,05). Nustatytas labai silpnas ryšys tarp bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio augalinėse ţaliavose ir antichelatinio aktyvumo duomenų.
Apibendrinant gautus rezultatus, galima daryti prielaidą, kad 2014 -2015 metų tirtos augalinės ţaliavos ţymiu biologiškai aktyvių medţiagų kiekiu nesiskyrė. Gauti reikšmingi fenolinių junginių kiekiai bei stiprus antioksidacinis aktyvumas. Didţiausi kiekiai nustatyti ţiedų ir lapų augalinėse ţaliavose, maţiausi – stiebuose.
8. IŠVADOS
1. Didţiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis stebimas ţiedų ekstraktuose, maţiausias – stiebuose. Suminis fenolinių junginių kiekis šlaitinio dirvenio ţaliavose įvairavo 2014m. 11,73-21,66 mg/g, ir 2015m. 5,4-22,82mg/g. Flavonoidų kiekis įvairuoja 2014m. 11,4- 36,65 mg/g, 2015m. 8,2-70 mg/g.
2. Stipriausias antioksidacinis aktyvumas stebimas ţiedų ekstraktuose, maţiausias - stiebuose. Nustačius antioksidacinį aktyvumą Ononis arvensis L. ţaliavų ekstraktuose rezultatai įvairavo 2014m. 35,19 – 54,66 %, 2015m. 20,68 – 89.9%.
3. Stipriausias gebėjimas chelatuoti Fe(II) jonus nustatytas ţiedų ekstraktuose, silpniausias - stiebuose. Gauti rezultatai šlaitinio dirvenio ţaliavose įvairavo 2014m. 34.14 – 50,76%
,
2015m. 19,31 – 62,11 %.4. Įvertinus rezultatus statistiškai, nustatyta stipri koreliacija tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir flavonoidų kiekio 2014m 0,99, p<0,05; 2015m. 0,86, p<0,05. Antioksidacinis aktyvumas ekstraktuose tiesiogiai priklauso nuo fenolinių junginių kiekio 2014m. 0,91, p<0,05; 2015m. 0,86, p<0,05 ir flavonoidų kiekio 2014m 0,93, p<0,05, 2015m (0,99, p<0,05).
9. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Atlikus šlaitinio dirvenio (Ononis arvensis L.) augalinių ţaliavų tyrimus buvo nustatyta, kad yra sukaupiamas ţenklus polifenolinių junginių kiekis. Dirvenio augaliniai ekstraktai pasiţymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Pagal gautus rezultatus, galima teigti, kad šlaitinio dirvenio ţiedus bei lapus būtų galima naudoti kaip vaistinę augalinę ţaliavą ekstraktų ar vaistaţolių arbatų gamybai dėl reikšmingo fenolinių junginių, flavonoidų kiekio bei antioksidacinio aktyvumo.
Detaliau ištyrus šlaitinio dirvenio ţiedų bei lapų ţaliavas, jas būtų galima naudoti kaip pagalbinę priemonę šlapimo takų sutrikimams, antioksidantus kosmetikos ar maisto pramonėje, taip pat įtraukti į organizmą detoksikuojančių arbatų sudėtį.
10. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Arlauskienė A., Šlepetys J., Šarūnaitė L., Inovatyvios pupinių augalų auginimo technologijos praturtinančios pašarą vietiniais baltymais bei dirvoţemį biologiniu azotu. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas ţemdirbystės institutas, 2015
2. Aguiar J., Costa R., Rocha F., Estevinho B. N., Santos L., Design of microparticles containing natural antioxidants: Preparation, characterization and controlled release studies, Power technology 313, 2017, p. 287-292
3. Al-Qudaha M. A., Al-Ghoula A. M., Trawenhb I. N., Al-Jaberc H. I., Al Shbould T. M., Zargae M. H. A., Abu orabia A. T., Antioxidant Activity and Chemical Composition of Essential Oils from Jordanian Ononis Natrix L. and Ononis Sicula Guss. Journal of Biologically Active Products from Nature, 2014, Vol. 4, Issue 1, p. 52-61
4. Borbala B., Tunde D., Felinger A., Kaszas A., Marton K., Papp N., Varga E., Polyphenol Content of Ononis arvensis L. and Rhinanthus serotinus (Schönh. Ex Halácsy & Heinr.Braun) Oborny Used in the Transylvanian Ethnomedicine. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2015, Vol.30, Issue.1 p.1301-1307
5. Bravo H. R., Copaja S. V., Lamborot M., Phytotoxicity of Phenolic Acids From Cereals [online]. Chile
6. Chen Z., Zhong C., Oxidative stress in Alzheimer’s disease. Neurosciense Bulletin 2014, Vol, 30, p. 271-281
7. D’Archivio M., Filesi C., Di Benedetto R., Gargiulo R., Giovannini C., Masella R., Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Ist Super Sanita, 2007, Vol. 43, No. 4, p. 348 – 361
8. Dai J., Mumper R. J., Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules, 2010, No. 15, p. 7313-7351
9. EMEA. Assessment report on Ononis spinosa L., radix. Prieiga per internet:
http://www.ema.europa.eu
10. Gampe N., Darcsi A., Lohner S., Beni S., Kursinszki L. Characterization and identification of isoflavonoid glycosides in the root of Spiny restharrow (Ononis spinosa L.) by HPLC-QTOF-MS, HPLC–MS/MS and NMR. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2016, Vol. 23, p. 74–81
11. Ghribia L., Waffo-Téguob P., Cluzetb S., Marchalc A., Marquesb J., Mérillonb J. M., Janneta H. B., Isolation and structure elucidation of bioactive compounds from the roots of the
