1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Greta Lemešovaitė
Įvairių šunų veislių reprodukcinių savybių tyrimai
Research of various dog breeds reproductive characteristics
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. habil. dr. Henrikas Žilinskas
2 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Įvairių šunų veislių reprodukcinių savybių tyrimai“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 ĮVADAS... 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 81.1. Kalės lytinis ciklas ... 8
1.2. Kalių ovuliacijos laiko įvertinimo galimybės ...10
1.3. Šunų androloginio vertinimo įpatumai juos naudojant veisimui ...11
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ...12
2.1. Retrospektyvi veislyno analizė ...13
2.2. Kalių reprodukcinių rodiklių tyrimai ...15
2.3. Spermos tyrimas ...17
3. TYRIMO REZULTATAI ...19
3.1. Veislyno reprodukcinių duomenų analizė ...19
3.2. Kalių progesterono ir citologiniai tyrimai...24
3.3. Patinų tyrimai ...29 4. REZULTATŲ APTARIMAS ...32 IŠVADOS ...34 REKOMENDACIJOS ...35 PADĖKA ...36 LITERATŪROS SĄRAŠAS ...37
4 ĮVAIRIŲ ŠUNŲ VEISLIŲ REPRODUKCINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAI
Greta Lemešovaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Veisiant šunis svarbu įvertinti jų reprodukcinę būklę. Siekiant parinkti optimalų kergimo laiką kalėms tiriama makšties tepinėlių citologija ir progesterono koncentracija kraujyje. Taip pat tiriamas patinų vaisingumas ir spermos kokybė, įvertinama ar jie tinkami veisimui. Šio darbo tikslas ištirti viename šunų veislyne 2018 metais veisiamas kales bei patinus naudotus kergimui 2016-2018 metais. Palyginti tyrimų informatyvumą ir tikslumą nustatant ovuliacijos laiką kalėms.
Trims kalėms atlikti kraujo serumo tyrimai – nustatyta progesterono koncentracija. Taip pat tirta makšties tepinėlių citologija, tepinėliai dažyti Giemsa dažais, ir vertinti mikroskopuojant. Kiekvienai tirtai kalei imti mėginiai 3 kartus – 5,10 ir 15 rujos dienomis. Parinktas laikas kergimui ir įvertintos gimusios vados. Visos kalės buvo vaikingos. Jos atvedė vidutiniškai po 3,3 šuniukus vadoje, iš kurių vidutiniškai išgyveno po judrumas, morfologinės 2,6 šuniukus vadoje. Patinams atlikti spermos tyrimai(nustatytas spermos tūris, spermatozoidų patologijos formos) ir įvertinti jų kokybiniai parametrai. Tirta naudojantis mikroskopu, vertinta subjektyviai tyrėjo. Palyginti patinų spermos tyrimų rezultatai tarp tirtų veislių.
Taip pat atlikta retrospektyvi šunų X veislyno analizė. Analizuoti 2012-2018 metų reprodukciniai veislyno kalių duomenys. Buvo apskaičiuotas progesterono koncentracijos vidurkis kalių kergimo metu, kuris sudarė 26,4nmol/L(kalės kergtos tą pačią dieną atlikus tyrimą). Joms vadoje gimė vidutiniškai po 3 šuniukus, iš kurių išgyveno vidutiniškai po 2,6 šuniukus.
Tyrimai atlikti šunų X veislyne, LSMU VA reprodukcijos laboratorijoje, privačioje smulkių gyvūnų veterinarijos klinikoje 2017-2018 metais.
5 RESEARCH OF VARIOUS DOG BREEDS REPRODUCTIVE CHARACTERISTICS
Greta Lemešovaitė Master‘s Thesis
SUMMARY
Breeding dogs it is important to evaluate their reproductive condition. In order to select the optimal mating time for bitches, cytology of vaginal swabs and blood levels of progesterone are studied. Male fertility and sperm quality are also examined, whether they are suitable for breeding. The aim of this work is to investigate the bitches bred in 2018 and males mated to kennel females in the 2016-2018. Also compare the informativeness and accuracy of studies by determining the time of ovulation in bitches.
Blood serum tests performed on 3 bitches - progesterone concentrations were determined. Vaginal smear cytology was investigated, smears were stained with Giemsa paint, microscopically tested. Samples were sampled 3 times – at day 5, day 10 and day 15 of season for each female. Then selected time for mating and rated litters. All the bitches got pregnant. They delivered an average of 3.3 puppy in litters, survived 2.6 puppies in the litters. Male studies of sperm (capacity, mobility, pathologies of morphology) and quality were evaluated. Examined using a microscope, assessed subjectively by the investigator. Comparison of the results of males sperm tests among the varieties tested.
There was also a retrospective analysis of the dog kennel. Reproductive data of kennel bitches for 2012-2018 were analyzed. Estimated mean progesterone concentration during bitch mating was
26.4nmol / L (bitches mated the same day of progesterone study). They had an average of 3 puppies in their litters, with an average of 2.6 alive puppies.
Studies are made in X dog kennel, LSMU VA reproduction laboratory, private veterinary clinic 2017-2018.
6
ĮVADAS
Šunų veisimas turi ilgaamžę istoriją, kuri prasidėjo prieš tūkstančius metų. Tuo metu žmonės šunis augino dėl dviejų pagrindinių priežasčių – šunys padėjo medžioklėje bei saugojo naminius gyvulius. Jau tada žmonės pastebėję, kad kiekvienas šuo turi skirtingas savybes pradėjo kryptingai juos veisti. Vieni šunys greitai bėga, kiti puikiai plaukia, treti yra ištvermingi ir gali sugauti stambų grobį ar puikiai saugoti gyvulius nuo plėšrūnų. Taip ilgus metus kūrėsi skirtingos šunų veislės, kurios savo išvaizda, charakteriu ir specifinėmis savybėmis tapo labai skirtingi.(1,3)
Vystantis civilizacijoms kartu atsirado ir poreikis kad šunys būtų mažesni ir žmonėms būtų patogiau kartu su jais gyventi. XIXa. atsiradus veislynų klubams esamos veislės įgavo naujų bruožų – trumpesnes kojas, įvairesnių spalvų, naujų kailio tekstūrų, išpopuliarėjo šuniukai trumpomis, mielomis nosimis. Šunų parodos su laiku tapo pramoga, šou ir gyvūnai vis labiau vertinami ne pagal gebėjimus atlikti savo funkciją, o pagal mados ir grožio standartus. Vienas ryškiausių pavyzdžių yra vokiečių aviganiai – parodiniai veislės atstovai turi labai nuožulnias nugaras, o dirbančių linijų vokiečių aviganių nugaros yra kur kas tiesesnės.(2)
Šiuo metu, kai daugelis žmonių gali sau leisti įsigyti šunį, šunų veisimas įgavo ne tik veislės gerinimo prasmę tačiau dažnai tampa verslu. Profesionalūs veisėjai dirbantys su šunimis yra tarptautinių klubų nariai ir savo darbe laikosi taisyklių – vykdo selekciją, atlieka sveikatos tyrimus savo augintiniams, dalyvauja parodose, kur gyvūnai prieš juos veisiant yra įvertinami teisėjų. Taigi
užauginus šuniuką atitinkantį veislės standartą, atlikus jam visus reikiamus sveikatos
tyrimus(nustatytus pagal šuns veislę), gavus įvertinimus iš parodų ir atėjus laikui veisti labai svarbu ne tik parinkti eksterjeru tinkamą patiną, bet išmanyti kalės fiziologiją, nustatyti optimalų laiką kergimui bei įvertinti patino vaisingumą. Neatlikus tyrimų rizikuojama, kad kalė netaps vaikinga arba atves mažą vadą, o tai reiškia laiko ir investicijų praradimą. Jei patinas per savo gyvenimą gali turėti labai daug palikuonių, tai kalės galimybės yra kur kas mažesnės. Kalės veisiamos nuo 2-3 metų iki 8 metų amžiaus, per metus gali pagimdyti vieną vadą. (4,5)
Šiuo metu daugumoje Lietuvos miestų laboratorijų galima atlikti progesterono tyrimą, daugelis veterinarijos klinikų taip pat atlieka makšties epitelio citologinį tyrimą(pastarasis yra mažiau populiarus, nes vienkartinis tyrimas neduoda aiškaus rezultato, reikia tirti kalę dažnai, nuosekliai, vertinti ląstelių kaitą), o spermos tyrimai yra rečiau atliekami, daugiausiai specifinėms didžiųjų šunų veislėms, kurių patinų nevaisingumas yra dažnas. Tyrimus dažniausiai linkę atlikti patyrę veisėjai, o
7 naujokai dėl žinių ir patirties stygiaus paprastai bando kergti šunis vadovaudamiesi teoriniais
standartais. (4)
Darbo tikslas
Įvertinti įvairių šunų veislių reprodukcines savybes prieš kergimą.
Darbo uždaviniai
• Šunų veislyne įvertinti įvairių veislių kalių progesterono koncentracijos dinamiką, kergimo laiko parinkimą, šių veiksnių įtaką vados dydžiui.
• Tiriamoms kalėms nustatyti progesterono koncentraciją ir palyginti bei įvertinti citologinius makšties tepinėlius siekiant parinkti optimalų kergimo laiką.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Kalės lytinis ciklas
Kalių lytinė branda prasideda joms sulaukus tam tikro amžiaus ir svyruoja nuo 6 iki 24 mėnesių. Dažniausiai kalės pirmą kartą surujoja iki 14 mėnesių amžiaus, pasiekusios 70-100proc. suaugusio gyvūno svorio. (6,7). Mažųjų veislių kalės paprastai surujoja jaunesnės ir rujoja dažniau nei stambiųjų veislių kalės. Didelės įtakos turi ir paveldimumas, dažnai pastebimos tendencijos
perduodamos iš kartos į kartą(amžius kada pirmą kartą kalė surujoja, laikas tarp rujų, šuningumo trukmė). Geriausias reprodukcinis laikas nuo 2 iki 6 metų. Pirmąją vadą rekomenduojama turėti per trečią rują arba iki 3metų amžiaus. (8)
Kalės lytinis ciklas susideda iš keturių fazių: 1. Priešrujo(proestrus)
2. Tikrosios rujos(oestrus) 3. Porujo(metoestrus)
4. Ramybės periodo(anoestrus)
Vienas lytinis ciklas kalėms vidutiniškai trunka apie 6 mėnesius, tačiau gali trukti nuo 4 iki 12mėnesių. Ciklo trukmė 2-6metų kalėms kinta mažai, nepriklausomai nuo to ar kalė buvo šuninga, ar nesusikergė. Dauguma kalių rujoja nepriklausomai nuo sezoniškumo, bet yra veislių kurios dažniausiai rujoja pavasarį ir rudenį.
Priešrujis trunka maždaug apie savaitę, bet gali trukti nuo kelių dienų iki 3 savaičių. Priešrujį galima pastebėti iš pakitusio kalės elgesio – teritorijos žymėjimo(dažnesnio šlapinimosi) taip kalės skleidžia feromonus, vulvos patinimo, kraujingų išskyrų iš makšties. Šie pokyčiai vyksta dėl estradiolio koncentracijos kraujo plazmoje(didžiausia koncentracija likus 2 paroms iki priešrujo pabaigos, vėliau palaipsniui mažėja tikrosios rujos metu). Jei kartu gyvena patinai jie gali pradėti domėtis kale, konkuruoti tarpusavyje, intensyviai uostyti ir laižyti vietas, kuriose šlapinosi rujojanti kalė, dėl šlapime esančių lakiųjų junginių. Priešrujis baigiasi kai kalė ima prisileisti patinus. (7,9)
9 Tikroji ruja trunka taip pat apie savaitę laiko, išskirtiniais atvejais gali trukti nuo kelių dienų iki 3 savaičių. Prasidėjus tikrąjai rujai kalės elgesys akivaizdžiai pakinta. Kalė leidžiasi kergiama - tvirtai stovi, nesigūžia liečiant kryžiaus srityje, laiko uodegą aukštai pasukusi prie šono. Žaidžia su patinais, vizgina uodegą. Išskyros dažniausiai šiuo metu šviesios, tačiau pasitaiko atvejų kada išskyros dar būna kraujingos ir įvykus ovuliacijai. Šiuo metu estradiolio koncentracija mažėja, o progesterono – didėja. Dėl sumažėjusios estradiolio koncentracijos kyla LH banga, sukeliama ovuliacija ir kalė gali būti apvaisinta. (10) Šios lytinio ciklo fazės metu daugiau nei 80proc. makšties epitelinių ląstelių – paviršinės. Progesterono koncentracija ovuliacijos metu apie 12-14nmol/L, įvykus ovuliacijai koncentracija toliau kyla. (11)
Porujis trunka nuo 2 iki 3mėnesių. Vulvos pabrinkimas išnyksta, išskirų paprastai nebūna arba labai nedaug skaidrios spalvos. Kalė patinų nebedomina. Dažnai šiuo metu kalės prastai ėda, daugiau miega nepriklausomai nuo to ar yra šuningos ar ne. Šią fazę identifikuoti galima atlikus makšties gleivinės citologinį tyrimą(sumažėja epitelinių ląstelių, padaugėja parabazinių ląstelių). Dėl išlikusios aukštos progesterono koncentracijos išryškėja pieno liaukos, atsiranda pieno(jei kalė šuninga likus kelioms paroms iki gimdymo, jei kalė nekergta besibaigiant porujo fazei).
Ramybės periodas vidutinškai trunka apie 4 mėnesius, tačiau yra veislių, kurioms gali trukti nuo 2 iki 10 mėnesių. Šiuo metu patinai nesidomi kale, visiškai išnyksta požymiai būdingi
rujojančioms kalėms. (12)
Jei kartu gyvena keletas kalių, pastebima lytinio ciklo sinchronizacija, t.y. surujojus vienai kalei netrukus surujoja ir kita ar net keletas kalių. (13)
Veisiant šunis labai svarbi kalės sveikata – fizinė ir psichologinė būklė, dieta, aplinkos sąlygos. Tačiau net ir esant puikioms sąlygoms kartais kalės po kergimo netampa šuningos. Pagrindinė to priežastis yra netinkamas kergimo laikas. Norint teisingai parinkti kergimo laiką svarbu nustatyti kalės ovuliaciją ir ją sukergti ne vėliau kaip 4 paros po jos. (14,15)
Po ovuliacijos pirminiai ovocitai bręsta 2-3 paras kol tampa antriniais ovocitais, kurie gali būti
apvaisinti. Po apvaisinimo zigotos dar apie 10 dienų išlieka kiaušintakiuose ir tik tada patenka į gimdą. (16)
10
1.2. Kalių ovuliacijos laiko įvertinimo galimybės
Kalių ovuliacijos laikas skirtingas, vidutiniškai kalės ovuliuoja po 10-12 dienų nuo
priešrujo pradžios. Normalu kai ovuliacija įvyksta po 1-3savaičių nuo priešrujo pradžios. (15) Įpatingai svarbu tiksliai nustatyti tiklų ovuliacijos laiką jei planuojama kergti kalę, kuri po ankstesnių kergimų buvo nešuninga ar turėjo mažas vadas. Taip pat jei planuojama tolima kelionė pas patiną arba bus kergiama tik vieną kartą be kontrolinių kergimų. Žinant ovuliacijos laiką galima labai tiksliai apskaičiuoti šuniavimosi datą. (17)
Ovuliaciją galima nustatyti iš kalės elgsenos – kalė prisileidžia patiną, nesipriešina kergimui. Klinikinių požymių – šviesios išskyros iš makšties, minkšta vulva. Tačiau ne visi šie požymiai atsiranda visoms kalėms ir ne visada tiksliu laiku. Tai priklauso nuo kalės charakterio, hierarchijos principų gyvenamojoje aplinkoje, genetinių faktorių. Todėl tikslinga atlikti makšties gleivinės citologinius tyrimus bei nustatinėti progesterono koncentraciją kraujo serume. (18)
Progesterono koncentracija kraujo serume kalėms ima didėti likus 2-3 dienoms iki ovuliacijos. Nuo 3nmol/L pakyla iki 12-14nmol/L, kada įvyksta ovuliacija(normos gali svyruoti priklausomai nuo naudojamo analizatoriaus) ir toliau kyla iki >150nmol/L. (19)
Rujos metu hormonai paveikia kalės makšties epitelį. Padidėjus estradiolio koncentracijai epitelio sluoksnių padidėja iki 30 eilių. Priešrujo ir tikrosios rujos metu daug paviršinių epitelinių ląstelių patenka į makšties išskyras, todėl mikroskopuojant tepinėlį galima gana tiksliai identifikuoti šį periodą. Ląstelės skirstomos į parabazines, tarpines, paviršines, bebranduoles. (20) Kintant hormonų koncentracijoms kalės organizme atitinkamai kinta ir makšties epitelinės ląstelės, todėl įvertinus citologinį vaizdą galima nustatyti lytinio ciklo fazes, tiksliau parinkti kergimo laiką nei vertinant tik kalės elgesį.(21) Priešrujo ir porujo metu vyrauja ląstelės su branduoliais, o tikrosios rujos metu – bebranduolės ląstelės. Todėl svarbu įvertinti tyrimo teisingumą norint nustatyti optimalų kergimo laiką. Svarbu žinoti kada tiksliai kalė surujojo, tyrimą kartoti nuosekliai ir sekti ląstelių pokyčius. Atlikus tik vieną citologinį tyrimą greičiausiai rezultato nebus, nes kai kalę yra dar per anksti kergti ar jau per vėlu kergti citologinis vaizdas labai panašus. (22)
11 Kalė ovuliuoja pirminius ovocitus apie 2 paras užtrunka kol jie subręsta ir tampa antriniais ovocitais. Pastarieji 2-3 paras gali būti apvaisinti. Taigi kalė pastoti gali net 5 paros po ovuliacijos. Kokybiška patino sperma kalės organizme gyvybinga išlieka iki 9 parų. Taigi kergiant kalę ne daugiau kaip 4 paros iki ovuliacijos ir ne vėliau kaip 5 paros po ovuliacijos ji turėtų būti apvaisinta. Kuo kergimo laikas bus parinktas tiksliau, tuo didesnė tikimybė susilaukti didesnės vados šuniukų. (23)
1.3. Šunų androloginio vertinimo įpatumai juos naudojant veisimui
Šunų veisime svarbios ne tik kalės reprodukcinės savybės, tačiau ir patino, nes dėl nesėkmingo kergimo gali būti kaltas patino nevaisingumas. Todėl yra atliekami spermos kokybės vertinimo tyrimai ir nustatoma ar patinas yra tinkamas veisimui. Naudojant šviesinį mikroskopą vertinamas spermatozoidų judrumas, koncentracija, morfologinės patologijos. Kiekvienas rodiklis analizuojamas pagal specialią metodiką, vertinant judrumą svarbu spermos temperatūra, vertinant koncentracija sperma skiedžiama, naudojama Biurker kamera ir tada koncentracija apskaičiuojama pagal formulę, morfologija vertinama paruošus spermos tepinėlius, skaičiuojant iš eilės tam tikrą kiekį spermatozoidų galvučių ir uodegėlių apskaičiuojamas patologijų procentas. (24) Kadangi vertinama subjektyviai, todėl rezultatai labai priklauso nuo tyrėjo, jo praktikos ir kvalifikacijos, o skirtingų vertintojų rezultatai tam pačiam mėginiui dažniausiai skiriasi.(25)
Subrendusio patino organizme nuolat gaminami spermatozoidai, kiekvieną sekundę dešimtys-šimtai tūkstančių.(26) Spermatogenezė(iki subrendusio spermatozoido) trunka apie 62 paras. Spermatozoidą sudaro trys dalys – galvutė, vidurinioji dalis ir uodegėlė. (27) Galvutėje saugoma DNR, vidurinėje dalyje gaminama ATP energija reikalinga judėjimui, uodegėlė reikalinga spermatozoido judėjimui, užtikrinti jo funkciją nukeliauti iki oocito.
Ejakuliato tūris priklauso nuo šuns dydžio ir svorio bei siekia 2-25ml. Patinas gali būti kergiamas kas 2 dienas, toks periodas nepablogina spermos kokybės ir nesumažina tūrio. (28)
12
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Mūsų darbe atlikta viena analizė ir trys eksperimentiniai tyrimai (kalėms – makšties gleivinės citologiniai tyrimai, progesterono koncentracijos nustatymas; patinams - spermos kokybės tyrimai).
1 pav. Pagrindinė darbo schema.
Kalių reprodukcinių savybių tyrimai (n=3) Patinų reprodukcinės būklės tyrimas (n=7) X veislyno reprodukcinių duomenų analizė Makšties gleivinės citologiniai tyrimai Progesterono koncentracijos nustatymas Spermos tyrimai KERGIMAS Gimusių vadų įvertinimas
13
2.1. Retrospektyvi veislyno analizė
Surinkta informacija iš šunų X - veislyno:
Kergtų kalių progesterono koncentracijos(nmol/L) rezultatai, suapvalinti iki sveikų
skaičių(tyrimai atlikti “X” laboratorijoje);
Kergimo laikas(1 arba 2 kergimai);
Gimusių šuniukų skaičius, išgyvenusių šuniukų skaičius.
Veislyne 2012-2018 metais veistos 6 jorkšyro terjerų veislės kalės, viso gimė 18 vadų. Ir 7
maltos bišonų veislės kalės, viso gimė 19 vadų. Veisėja kergimo laiką parenka atlikus progesterono
tyrimą. Jei kalė kergiama užsienyje, dėl ilgos kelionės kergimo laikas gali būti ne optimalus, tačiau tikimybė, kad kalė taps šuninga – įvertinama kaip didelė. Jei norimu laiku patikrinti progesterono koncentracijos neįmanoma, tokiu atveju kalė yra kergiama ir tyrimas atliekamas po kergimo norint įsitikinti ar laikas buvo parinktas teisingai. Taigi, jei kalytė kergiama tą pačią dieną kai atliktas progesterono tyrimas lentelėje žymima 0, jei sekančią dieną – 1, jei po dviejų dienų ir t.t. 2,3,4. Jei kergiama iki atliekant tyrimą dienų skaičius žymimas su minuso ženklu. Nurodytas gimusių šuniukų skaičius, o išgyvenusiųjų skaičius skliausteliuose.
2 pav. Progesterono koncentracijos nustatymo protokolo pavyzdys iš laborotorijos, kurioje tirtas
14
1 lentelė. Jorkšyro terjerų veislės kalių reprodukciniai duomenys 2012-2018 metais.
Vardas Progesteronas, nmol/L Kergimas, d. po tyrimo Gimusių šuniukų sk.(išgyvenusių sk.) Ula 39 0, 2 1 Ula 4 1, 3 2 Ula 12 1, 3 2(1) Ula 124 0 4(3) Ula 21 0, 2 3(2) Ula 42 0 1 Leila 18 1 4 Leila 23 -1, 0 6(5) Leila 11 1, 3 - Leila 26 0, 2 1 Leila 19 1 5(3) Ella 39 0, 2 4 Ella 12 2, 4 4 Zara 34 −1 5 Unika 12 0, 2 2 Unika 5 3, 5 5(3) Tėja 12 0, 2 4(3) Tėja 16 0, 2 4
2 lentelė. Maltos bišonų veislės kalių reprodukciniai duomenys 2012-2018 metais.
Vardas Progesteronas, nmol/l Kergimas, d. po tyrimo Gimusių šuniukų sk.(išgyvenusiųjų sk.) Maya 15 0, 2 4(3) Maya 5 2, 4 3 Maya 11 0, 2 3(0) Vanilė 10 2, 4 1 Vanilė 11 0, 2 3(2) Vanilė 25 1, 3 1 Vanilė 23 0, 2 2 Vanilė 14 0, 2 3 Minnie 3 4, 6 1 Minnie 126 -1, 3 4 Minnie 12 2, 4 4 Dila 18 0 3 Dila 28 -1, 1 2 Milli 14 0, 2 3 Milli 36 −1, 1 3 Dolce 17 0, 2 3 Dolce 28 −2, 0 4 Letti 22 0, 2 5(4) Letti 20 2, 4 4
15 Analizuota – kergimo laiko parinkimo dinamika; kokiai progesterono koncentracijai esant kergta nedelsiant ir kada laukiama; gimusių šuniukų kiekis kalėms, kurios kergtos su tiksliai žinomu progesteronu(t.y. tą pačią dieną) ir gimusių šuniukų kiekis kalėms, kurios kergtos vėliau nei atliktas tyrimas, taigi preliminariai spėjant, kad būtent tas laikas tinkamiausias; analizuota su kokiu
progesteronu kergtoms kalėms gimė daugiausiai ir mažiausiai šuniukų.
Apskaičiuota- abiejoms veislėms vidutiniškai gimusių šuniukų skaičius, vidutiniškai išgyvenusių šuniukų skaičius.
Statistinė analizė – koreliacijos koeficientas, jo patikimumas.
2.2. Kalių reprodukcinių rodiklių tyrimai
Mikroskopuoti ir įvertinti citologiniai makšties tepinėliai, nustatyta progesterono koncentracija kraujo serume(nmol/L) 2018 metais veislyne kergtoms kalytėms(n=3). Mėginiai tyrimams imti veislyne 5, 10, 15 rujos dienomis, tuo pačiu metu.
Makšties gleivinės atspaudo paruošimas
1. Vatos tamponėlis sudrėkinamas lašu NaCl 0,9proc. tirpalo. Tamponėlis įvedamas į makštį, švelniai pasukamas ir ištraukiamas.
2. Švelniai ridenant tamponėlį ant objektinio stiklelio plonu sluoksniu paliekamas ląstelių antspaudas. Stiklelis džiovinamas kambario temperatūroje 10min.
3. Mėginys dažomas iš anksto paruoštais dažais(Giemsa dažų gamyklinis koncentratas atskiestas 9 kartus didesniu tūriu distiliuoto vandens).
1) Stiklelis padengiamas dažų tirpalu ir laikomas 10min. 2) Dažų perteklius nupilamas
3) Stiklelis plaunamas distiliuotu vandeniu 4) Džiovinama kambario temperatūroje.
16 Progesterono koncentracijos tyrimas
1. Kraująs imtas iš v.cephalica. Naudotas vakuuminis mėgintuvėlis be priedų skirtas serumo biocheminiams tyrimams(raudonu kamšteliu).
2. Mėginiai tirti LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Rezultatai ng/L perskaičiuoti į nmol/L (dauginant iš 3,18).
17
2.3. Spermos tyrimas
Ištirta patinų, su kuriais 2016-2018m. buvo kergtos veislyno kalytės, sperma. Viso 3 jorkšyro terjerų veislės patinai ir 4 maltos bišonų veislės patinai . Mėginiai imti veislyne, tirti LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje ir privačioje veterinarijos klinikoje.
Patinų spermos tyrimas
1. Sperma surenkama į sterilų plastmasinį indelį(spermos paėmimui buvo naudota rujojanti kalė). 2. Pirmiausia pamatuojamas tūris.
3. Mikroskopuojant įvertinamas judrumas procentais. Lašas spermos dedamas ant objektinio stiklelio, mikroskopuojama ir vertinama procentaliai(iki 100proc).
4. Ruošiami tepinėliai galvučių ir uodegėlių patologijų skaičiavimui, proc.
4.1. Spermatozoidų galvučių patologijų vertinimas. Paruošiamas tepinėlis(lašas Gimzos dažų, lašas spermos, dažoma, išdžiovinama), mikroskopuojant skaičiuojama 100 galvučių iš eilės,
apskaičiuojamas patologinių galvučių procentas.
18 4.2. Spermatozoidų uodegėlių patologijų vertinimas. Paruošiamas tepinėlis(lašas 1:10 formalino
tirpalu skiestos spermos dedamas ant objektinio stiklelio, uždengiamas dengiamuoju stikleliu), mikroskopuojant skaičiuojama 100 uodegėlių iš eilės, apskaičiuojamas patologinių uodegėlių procentas.
19
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Reprodukcinių duomenų analizė(X veislynas)
6 pav. Veislyne kergtų kalių(pirmas ir kontrolinis kergimai) pasiskirstymas pagal kergimo laiką
nuo progesterono tyrimo.
6 kalytės buvo kergtos iki nustatant progesterono koncentraciją. 20 kartų iš 37 kalės buvo kergtos tą pačią dieną kai nustatyta progesterono koncentracija, 18 iš jų tai buvo pirmas kergimas, 2 – kontrolinis. Praėjus parai po tyrimo kergtos 8 kalės, 6 iš jų tai buvo pirmasis kergimas. Po dviejų parų viso 20 kergimų, tačiau ¾ jų buvo kontroliniai ir tik ¼ t.y. 5 kergimai buvo pirmieji. Praėjus 3-4 dienoms pirmą kartą kergta tik po 1 kalę, kiti kergimai buvo kontroliniai. Vėliau nei po 4 dienų atlikti 2 kontroliniai kergimai. Taigi daugiausiai kalių pirmą kartą kergtos tą pačią dieną kai atliktas progesterono tyrimas, o daugiausiai kontrolinių kergimų atlikta po 2 parų. Mažiausiai pirmą kartą kergtų kalių po 3 ir daugiau parų nuo tyrimo atlikimo.
6 20 8 20 6 6 2 6 18 6 5 1 1 0 0 2 2 15 5 5 2 0 5 10 15 20 25
Iki tyrimo 0 d. 1 d. 2 d. 3 d. 4 d. Vėliau
K al ių s kaičiu s, vn t
20
7 pav. Progesterono koncentracijos(nmol/L) palyginimas tarp kalių kergtų tyrimo atlikimo dieną ir
kitą dieną.
Kalių, kergtų tą pačią dieną, progesterono koncentracijos vidurkis 26,27nmol/L. Kalių, kergtų kitą dieną, progesterono koncentracijos vidurkis 12nmol/L. Taigi galima spręsti, kad esant didesniam progesteronui kalės kergiamos tą pačią dieną, o gavus mažesnius tyrimo rezultatus pasirenkama pirmą kartą kergti kitą dieną. Iš kergtų tą pačią dieną kalių grupės nebuvo nei vienos kalės, kuri sukergta dar neįvykus ovuliacijai. Iš kalių grupės, kurios buvo kergtos ne tą pačią dieną kai atliktas progesterono tyrimas 7 kalėms dar nebuvo įvykusi ovuliacija ir 7-ioms jau buvo įvykusi.
39 18 124 21 42 26 39 12 12 16 15 11 11 23 14 22 14 17 4 18 11 19 12 5 5 10 25 3 12 20 12 0 35 70 105 140 Pr o ge st er o n o ko n ce n tr ac ij a, n m o l/L
21
8 pav. Vadų dydžių palyginimas tarp kalyčių, kurios buvo kergtos progesterono koncentracijos
nustatymo dieną ir vėlesnėmis dienomis.
3 kartus iš 4 daugiausiai t.y. 5 šuniukų susilaukė kalės kergtos vėliau nei atliktas progesterono tyrimas, t.y. jau tiksliai nežinant kokia buvo progesterono koncentracija kergimo metu. Daugiausiai vadų gimė, kuriose buvo po 4 šuniukus. 6 kartus iš 11 kalės taip pat buvo kergtos ne tą pačią dieną kai atliktas progesterono tyrimas. Mažiausiai t.y. po 1 šuniuką vadoje gimė 6 kartus, 3 kartus kalės buvo kergtos tą pačią dieną, kada nustatyta progesterono koncentracija ir 3 kartus kergtos parinkus kitą kergimo dieną.
1 2 4 3 1 1 4 2 4 4 4 3 3 2 3 3 3 3 5 2 4 5 0 4 5 5 3 1 1 1 4 4 2 3 4 4 Š u n iu kų s kai čiu s va d oj e
22
9 pav. Progesterono koncentracijų palyginimas tarp kalyčių, kurioms gimė didžiausios ir mažiausios
vados.
Atrinkus kales, kurios buvo pirmą kartą kergtos tą pačią dieną, kai atliktas progesterono tyrimas ir pagimdė didžiausias vadas(po 4-5 šuniukus) ir mažiausias vadas(po 1-2 šuniukus) palyginus progesterono koncentraciją galima teigti, kad vados dydis tiesiogiai nuo progesterono koncentracijos nepriklauso. Didžiausias vadas pagimdžiusių kalyčių progesterono vidurkis 38nmol/L, o mažiausias vadas pagimdžiusių kalyčių progesterono vidurkis 28,4nmol/L.
Dvi skirtingos kalės kergtos su tokia pat progesterono koncentracija, viena pagimdė didelę vadą, kita – mažą. Dvi skirtingos kalės kergtos su labai panašia progesterono
koncentracija(22-23nmol/L), taip pat viena pagimdė didelę vadą, kita – mažą.
39 42 26 12 23 124 39 12 16 15 22 0 35 70 105 140 Pr o ge st er o n o ko n ce n tr ac ij a, n m o l/L 1-2 šuniukai 4-5 šuniukai
23
10 pav. Bendras gimusių šuniukų skaičius(žalia spalva) ir jų vidurkis(mėlyna spalva) vadai.
18 jorkšyro terjerų veislės vadų viso gimė 57 šuniukai, vidutiniškai 3,2 šuniuko vadoje. 19 maltos bišonų veislės vadų viso gimė 56 šuniukai, vidutiniškai 2,9 šuniuko vadoje.
10 pav. Išgyvenusių šuniukų skaičius(žalia spalva) ir jų vidurkis(mėlyna spalva) vadai.
18 jorkšyro terjerų veislės vadų viso išgyveno 48 šuniukai, vidutiniškai 2,6 šuniuko vadoje. 19 maltos bišonų veislės vadų viso gimė 49 šuniukai, vidutiniškai 2,6 šuniuko vadoje.
3,2 2,9
57 56
Jorkšyro terjerai Maltos bišonai
2,6 2,6
48 49
24
3.2. Kalių progesterono ir makšties citologiniai tyrimai
Kalė nr. 1
Maltos bišonas, 3 metų amžiaus, 3.4kg. Antra vada.
I mėginys progesterono koncentracija1,79nmol/L (5 rujos dieną)
11 pav. Makšties tepinėlis 5 rujos dieną.
Pirmas kergimas 9 rujos dieną.
II mėginys progesterono koncentracija 27,96nmol/L (10 rujos dieną)
25 Antras kergimas 11 rujos dieną
III mėginys progesterono koncentracija 92,59nmol/L (15 rujos dieną)
13 pav. Makšties tepinėlis 15 rujos dieną
Gimė 2 kalytės.
Kale iki 6 rujos dienos patinas nesidomėjo, sekančias 3 dienas patiną kalė domino tačiau kalė patino neprisileido, gulėsi, urzgė. 9 rujos dieną noriai kergėsi. Sekančią dieną atliktas progesterono tyrimas patvirtino, kad atliktas pirmasis kergimas laiku, jau įvykusi ovuliacija. Nuspręsta atlikti kontrolinį kergimą po 2 dienų. Pirmoje vadoje šiai kalytei gimė 3 šuniukai nuo kito patino.
Kalė nr. 2
Maltos bišonas, 3 metai, 2.8kg. Antra vada.
26
14 pav. Makšties tepinėlis 5 rujos dieną
Pirmas kergimas 7 rujos dieną
II mėginys progesterono koncentracija 36.04nmol/L (10 rujos dieną)
15 pav. Makšties tepinėlis 10 rujos dieną
Antras kergimas 10 rujos dieną
27
16 pav. Makšties tepinėlis 15 rujos dieną
Gimė 2 kalytės ir 1 patinukas.
Atlikus pirmąjį progesterono tyrimą nustatyta ovuliacija. Taigi nuspręsta kalytę kergti po 2 parų. Kontrolinis kergimas atliktas ne standartiškai po 2 parų tačiau po 3 parų atlikus pakartotinį progesterono tyrimą. Kalytei pirmoje vadoje gimė 4 šuniukai nuo to pačio patino.
Kalė nr. 3
Jorkšyro terjeras, 5 metai, 3kg. Ketvirta vada.
I mėginys progesterono koncentracija 1,73nmol/L (5 rujos dieną)
28 II mėginys progesterono koncentracija 18.53nmol/L (10 rujos dieną)
18 pav. Makšties tepinėlis 10 rujos dieną
Kergimas 11 rujos dieną
III mėginys progesterono koncentracija >148,85nmol/L (15 rujos dieną)
19 pav. Makšties tepinėlis 15 rujos dieną
29 Atlikus pirmąjį progesterone tyrimą nustatyta kad kalytės ruja yra priešrujo fazėje, todėl nuspręsta laukti ir vertinant elgesį parinkti sekančio tyrimo laiką. Nuo 8 rujos dienos kalė pradėjo dominti patinas, tačiau pati nesileido kergiama. 10 rujos dieną atlikus progesterone tyrimą nustatyta, kad ką tik įvykusi ovuliacija. Kadangi kalės kergimas buvo suplanuotas užsienyje negalėjome kergti po 2 parų, todėl pasirinkome kergimą sekančią dieną po atlikto tyrimo. Kalytė pirmoje vadoje turėjo 4 šuniukus, antroje – 5, trečioje – 1. Taip pat kartą buvo kergta, tačiau šuniukų nebuvo.
3.3. Patinų spermos tyrimai
20 pav. Spermos tūrio palyginimas pagal veisles.
Jorkšyro terjerų veislės patinų spermos tūrio vidurkis 3.1ml Maltos bišonų veislės patinų spermos tūrio vidurkis 3.4ml
2,8 3,6 3,0 4,1 2,6 3,2 3,8 0 1 2 3 4 5 T ūr is , m l
30
21 pav. Spermos judrumo(proc.) palyginimas pagal veisles.
Jorkšyro terjerų veislės patinų spermatozoidų judrumo vidurkis 73,3proc. Maltos bišonų veislės patinų spermatozoidų judrumo vidurkis 70proc.
70 80 70 80 60 70 70 0 20 40 60 80 100 Judr um as , pr o c.
31
22 pav. Patologinių galvučių(proc.) ir patologinių uodegėlių(proc.) palyginimas pagal veisles.
Jorkšyro terjerų patinų:
Patologinių galvučių vidutiniškai 8,6proc. Patologinių uodegėlių vidutiniškai 10,6proc. Maltos bišonų patinų:
Patologinių galvučių vidutiniškai 8,25proc. Patologinių uodegėlių vidutiniškai 11,25proc.
10 8 14 10 12 8 15 8 8 10 7 7 9 10 0 4 8 11 15 19 0 3 5 8 10 13 P at ol ogi jų pr oc .
YT uodegėlių patologijos MB uodegėlių patologijos YT galvučių patologijos MB galvučių patologijos
32
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Mūsų bandymuose 18 kartų iš 37-ių kalytės buvo kergtos tą pačią dieną kada ir buvo atliktas progesterono tyrimas. Progesterono koncentracijos vidurkis sudarė 26,4nmol/L. Tirtoms kalėms iš viso gimė 53 šuniukai, vidutiniškai 2.9 šuniuko vadoje. Koreliacijos koeficientas 0,05. Koreliacija maža, teigiama, p – nepatikima.
13 kartų iš 37 kalytės buvo kergtos po 1 ar kelių dienų nuo progesterono koncentracijos tyrimo. Jų progesterono koncentracijos vidurkis 12nmol/L. Viso gimė 36 šuniukai. Vidutiniškai 2,8 šuniuko vadoje. Koreliacijos koeficientas 0,15. Koreliacija maža, teigiama, p – nepatikima.
6 kartus iš 37 kalytės buvo kergtos prieš progesterono koncentracijos tyrimą. Jų
progesterono koncentracijos vidurkis 45,8nmol/L. Viso gimė 24 šuniukai. Vidutiniškai po 4 šuniukus vadoje. Koreliacijos koeficientas -0,04. Koreliacija maža, neigiama, p – nepatikima.
7 kartus nustatant progesterono koncentraciją gautas rezultatas nurodė ovuliacijos laiką, t.y. 12-14nmol/L. 6 kalytės buvo kergtos 2 paros po ovuliacijos. 4 iš jų tai buvo antrasis kergimas, 2
pirmasis kergimas. Vienai kalytei dviejų parų po ovuliacijos laikas buvo diena tarp kergimų. Visos kalytės vaikingos ,jos vidutiniškai atsivedė po 3,1 šuniuko vadoje. Koreliacijos koeficientas -0,11 Koreliacija maža, neigiama, p – nepatikima. Vadovaujantis kitų mokslininkų tyrimais galima teigti kad, 2 paros po ovuliacijos yra optimaliausias laikas kergimui, kada didžiausia tikimybė sulaukti didžiausios vados. (29,30)
Tiriant kales nustatyti citologiniai makšties gleivinės pokyčiai, kuriuos vertinant kartu su progesterono koncentracija sėkmingai visoms kalėms parinktas kergimo laikas. Visos tapo vaikingos ir susilaukė įprasto dydžio vadų. Joms vadoje gimė vidutiniškai po 3 šuniukus, išgyveno vidutiniškai po 2,6 šuniuko vadoje.
Mūsų bandymuose tirtų patinų spermos tūrio vidurkiai buvo: jorkšyro terjerų 3.1ml, maltos bišonų - 3.4ml.Įprastai šunų spermos tūrio norma būna 2-25ml. Taigi tirtų patinų spermos kiekio vidurkis atitinka normą. Atsižvelgiant į mūsų tirtų šunų veisles ir jų dydį, svorį jų išskiriamas spermos kiekis yra normalus. Vertinant spermos judrumą jis nustatytas vidutiniškai 73,3proc. jorkšyro terjerų veislės patinams ir 70proc. spermos judrumas buvo pas maltos bišonų veislės patinus.
33 Bendrai priimtas spermatozoidų judrumas vertinimas sekančiai: >70proc. - labai gerai; 50-60proc. – gerai; 30-49proc. – vidutiniškai; <30proc. - blogai.
Tiriant morfologines spermatozoidų patologijas nustatyta vidutiniškai 8,6proc. patologinių galvučių ir 10,6proc. patologinių uodegėlių jorkšyro terjerų veislės patinams. Tiriant morfologines patologijas maltos bišonų spermoje buvo nustatyta vidutiniškai 8,25proc. spermatozoidų patologinių galvučių ir 11,25proc. patologinių uodegėlių. Leistinos spermatozoidų patologijų normos: patologinių galvučių <10proc., patologinių uodegėlių <15proc. Pagal tirtus spermos rodiklius remiantis literatūra visi tirti patinai įvertinti kaip tinkami veisimui. (31)
34
IŠVADOS
Apžvelgus atliktų tyrimų rezultatus galima daryti tokias išvadas:
1. Pastebėjus kada kalė pradėjo rujoti, tikslinga pirmą kartą atlikti progesterono koncentracijos tyrimą, bei esant galimybėms, makšties epitelio citologinį tyrimą, 5 rujos dieną.
2. Siekiant tiksliai parinkti kergimo laiką tyrimai turėtų būti kartojami kasdien. Tokiu būdu sekant progesterono dinamiką didžiausia tikimybė nustatyti, kada įvyksta ovuliacija. Tačiau reikėtų įvertinti kalei sukeliamą stresą imant mėginius ir galimą neigiamą įtaką šuningumui.
3. Visos 3 tirtos kalės kergtos po ovuliacijos, dviems atlikti kontroliniai kergimai, viena kalė kergta vieną kartą be kontrolinio kergimo. Visos tapo šuningos. Pagimdė nuo 2 iki 5 šuniukų. 4. Tirtų patinų(n=7) spermos rodikliai atitiko kokybinės normos ribas. Spermos tūris buvo virš
2ml, spermatozoidų judrumas – labai geras, patologinių galvučių ne daugiau 10proc, o patologinių uodegėlių ne daugiau 15proc.
5. Progesterono koncentracija kergimo metu ir gimusių šuniukų skaičius tarpusavyje koreliuoja nežymiai ir statistiškai nepatikimai, todėl galima teigti, kad būsimos vados dydis nėra tiesiogiai priklausomas nuo progesterono koncentracijos kergimo metu.
35
REKOMENDACIJOS
1. Optimaliam kergimo laikui nustatyti atlikti progesterono koncentracijos nustatymo ir citologinius tyrimus kalėms.
36
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui prof. habil. dr. Henrikui Žilinskui už idėjas, suteiktas žinias, pagalbą ir palaikymą.
Taip pat norėčiau padėkoti dr. Neringai Sutkevičienei ir kitiems LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijos darbuotojams už pagalbą tiriant ir vertinant patinų spermos mėginius bei kalių makšties tepinėlius.
37
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Trut L, Oskina I, Kharlamova A. Animal evolution during domestication: the domesticated fox as a model. Bioessays. 2009.
2. Udell A, Dorey N, Wynne C. What did domestication do to dogs? A new account of dogs' sensitivity to human actions. Biological Reviews. 2010.
3. Beaver B. Canine behaviour insights and answers. 2nd ed: Saunders, Elsevier; 2009. 4. Margaret V. Root Kustritz. The Dog Breeder‘s Guide to Successful Breeding and Health Management. DVM, PhD, DACT., 2005.
5. American Kennel Club. Official Publication, 20th edition. The Complete Dog book.2006 6. Johnston SD, Kustritz MVR, Olson PS. Canine and Feline Theriogenology. Philadelphia: Saunders; 2001.
7. Concannon PW. Reproductive cycles of the domestic bitch. Animal Reproduction Science. 2011.
8. Marthina L. Greer. Canine Reproduction and Neonatology, A Practical Guide for Veterinarians, Veterinary Staff, and Breeders. DVM, JD., 2014.
9. Feldman EC, Nelson RW. Disorders of the canine male reproductive tract. In: Feldman EC and Nelson RW (eds). Canine and Feline Endocrinology and Reproduction, Philadelphia: Saunders; 1987. 10. Thomas P. Breeding Management and Ovulation Timing in the Bitch, 2013.
11. Olson P. N., Thrall M. A., Wykes P.M. Vaginal cytology. Part I. A useful tool for staging the canine estrus cycle. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian. 1984. 12. Tract TR. Canine breeding and reproduction. Alabama Cooperative Extension. 2002.
13. Marthina L. Greer. Canine Reproduction and Neonatology, A Practical Guide for Veterinarians, Veterinary Staff, and Breeders. DVM, JD., 2014.
14. Grundy S. A., Feldman E., Davidson A. Evaluation of infertility in the bitch. Clinical Techniques in Small Animal Practice. 2002.
15. Johnston SD, Kustritz MVR, Olson PS. Canine and Feline Theriogenology. Philadelphia: Saunders; 2001.
38 16. Phemister R. D., Holst P. A., Spano J. S. Time of ovulation in the beagle bitch. Biology of Reproduction. 1973.
17. Newell J. F. Successwith frozen semen: brood bitch management. In Proceedings of the North American Veterinary Conference. January 7-11, Orlando, Florida. 2006.
18. Otzdorff CH., Kienzle B., brugger N., Hoffmann B., Braun J. Determination of progesterone (P4) in canine blood serum for detection of ovulation using an enzime-linked fluorescence assay (ELFA) in comparison to a validated radioimmuno assay (RIA). In Proceedings of the 6th International Symposium on Canine and Feline Reproduction. Vienna, 9-11 July 2008.
19. Gotwals S. Timing the Fertile Period of the Bitch. Canine Reproduction Seminar 2002. 20. Roszel J.R. Normal canine vaginal Cytology. Veterinary Clinics of North America. 1977. 21. Linde-Forsberg C, Persson G. Biology of Reproduction of the Dog and Modern Reproductive Technology. E O, editor: CABI; 2012.
22. Lopate C. Ovulation Timing in the Bitch. Reproductive Revolutions. 2005.
23. Concannon PW. Canine pregnancy and parturition. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 1986.
24. Oettle E. Sperm morphology and fertility in the dog. Journal of reproduction and fertility. 1993. 25. Iguer-ouada M, Verstegen JP. Validation of the sperm quality analyzer (SQA) for dog sperm analysis. Theriogenology. 2001.
26. Gavrilovic BB, Andersson K, Linde Forsberg C. Reproductive patterns in the domestic dog– a retrospective study of the Drever breed. Theriogenology. 2008.
27. Linde-Forsberg C, Persson G. Biology of Reproduction of the Dog and Modern Reproductive Technology. E O, editor: CABI; 2012.
28. Farstad W. Cryopreservation of canine semen - new challenges. Journal of reproduction and fertility. 2010.
29. Linde-Forsberg C, Persson G. Biology of Reproduction of the Dog and Modern Reproductive Technology. E O, editor: CABI; 2012.
30. Foster D, Staff SE. Hormone Levels: Determining Breeding Times and Whelping Dates. Figure 1. Hormone Levels During Estrus and Pregnancy. Veterinary & Aquatic Services Department. 2008.
39 31. England GCW, Heimendahl von A. BSAVA manual of canine and feline reproduction and neonatology. Gloucester: British Small Animal Veterinary Association; 2010.
