Įvairių veislių kalių intrauterinio sėklinimo efektyvumo tyrimas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Jovydas Bajorinas

Įvairių veislių kalių intrauterinio sėklinimo efektyvumo

tyrimas

Intrauterine artificial insemination effectiveness study in

different breeds of bitches

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ,,Įvairių veislių kalių intrauterinio sėklinimo efektyvumo tyrimas“.

1. Yra atliktas mano paties;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)

vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai:

1)______________________________________________________________________________

2)______________________________________________________________________________

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

TURINYS

SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Kalės lytinis ciklas ... 10

1.2. Patinų reprodukcinė sistema ... 14

1.2.1. Spermatozoido sandara ... 16

1.3. Kalių dirbtinis sėklinimas ... 16

2. DARBO MEDŽIAGA IR TYRIMŲ METODIKA ... 20

2.1. Spermos kokybės tyrimas ... 21

2.2. Kalių progesterono tyrimas ... 23

2.3. Kalių dirbtinis sėklinimas ... 23

2.4. Apklausa apie kalių dirbtinio sėklinimo rezultatus ... 23

2.5. Statistinė analizė ... 24

3. TYRIMO REZULTATAI ... 25

3.1. Tyrimo apimtis ... 25

3.2. Patinų spermos kokybės nustatymas lyginant pagal veislę ... 26

3.3. Patinų spermos kokybės nustatymas lyginant pagal amžių ... 29

3.4. Kalės dalyvavusios tyrime, kurioms buvo atliktas dirbtinis intrauterinis sėklinimas ... 34

3.5. Dirbtinio sėklinimo rezultatai ... 36

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 39

IŠVADOS ... 43

REKOMENDACIJOS ... 44

PADĖKA ... 45

SANTRAUKA

Įvairių veislių kalių intrauterinio sėklinimo efektyvumo tyrimas Jovydas Bajorinas

Magistro baigiamasis darbas

Tyrimas atliktas „x“ privačioje smulkiųjų gyvūnų veterinarijos klinikoje ir LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje, 2016-2017 metų laikotarpiu Kaune. Baigiamojo darbo apimtis 48 puslapiai, jame yra 25 paveikslai, viso panaudota 44 literatūros šaltiniai (straipsniai, statistiniai duomenys, moksliniai darbai, konferencijų medžiaga).

Baigiamojo darbo tikslas buvo išsiaiškinti ir įvertinti įvairių veislių ir amžiaus kalių intrauterinio sėklinimo efektyvumą. Tyrimą sudarė dvi dalys: patinų spermos kokybės tyrimas ir rodiklių analizė, ir kalių dirbtinio sėklinimo efektyvumo įvertinimas su progesterono kiekio kontrole. Viso tyrime dalyvavo 20 įvairių veislių ir skirtingo amžiaus šunys ir 41 įvairaus amžiaus ir veislės kalės. Tyrimui atlikti išsikėlėme uždavinius: nustatyti šviežios šunų spermos, skirtos kalių dirbtiniam sėklinimui, kokybinius rodiklius; įvertinti įvairių veislių ir amžiaus kalių progesterono lygio dinamiką artėjant jų ovuliacijai ir įvertinti įvairių kalių veislių ir amžiaus apsivaisinimą po jų dirbtinio sėklinimo, kurioms buvo atliktas progesterono koncentracijos nustatymas kraujo serume.

Tyrimo metu ištyrėme įvairius patinų spermos kokybinius rodiklius: tokius, kaip spermatozoidų judrumą, koncentraciją bei įvairias spermatozoidų galvučių bei uodegėlių patologijas ir vertinome jų kitimą tarp įvairių veislių bei amžiaus grupių. Įvairių veislių ir amžiaus kalėms atlikome progesterono koncentracijos nustatymą iš kraujo serumo ir apklausėme jų šeimininkus, vertinome dirbtinio apsėklinimo rezultatus.

Remiantis tyrimų rezultatais buvo padarytos išvados, kad įvairių veislių šunų spermatozoidų judrumas vidutiniškai sudarė 81,5 proc. ± 11,82 proc.; koncentracija vid. 423,75 mln/ml ± 316,51 mln/ml; spermatozoidų galvučių patologijų šunų spermoje vidutiniškai rasta 18,98 proc. ± 6,72 proc.; spermatozoidų uodegėlių patologijos vidutiniškai sudarė 18,97 proc. ± 6,72 proc. Taip pat gauti rezultatai, jog iš 41 tirtos kalės, kuriai buvo atlikta ši procedūra, apsivaisino 80,49 proc.. Atsižvelgiant į gautus rezultatus nustatyta, kad kalių intrauterinis sėklinimas su progesterono lygio kontrole yra efektyvi įvairių kalių veislių ir amžiaus veisimo priemonė.

Raktažodžiai: kalių dirbtinis sėklinimas, šunų spermos kokybiniai rodikliai, progesterono koncentracija, šunų reprodukcija

SUMMARY

Intrauterine artificial insemination effectivness study in different breeds of bitches Jovydas Bajorinas

Master’s Thesis

The research was performed in private animal clinic and in animal reproduction laboratory of Lithuanian University of Health Sciences, during the year of 2016 through 2017. The volume of the Master’s Thesis is 48 pages and it contains 25 illustrations. In total 44 literature sources were used (includes articles, statistic data sheets, scientific research publications and medium from conferences).

The objective of the Master’s Thesis was to ascertain and evaluate the effectiveness of intrauterine artificial insemination in different breeds of bitches. The research was divided into two parts: the study of the quality of sperm in males and evaluation of efficiency of intrauterine artificial insemination of bitches using progesterone quality control. In this research participated 20 male dogs and 41 female dogs of various breeds and ages. To perform the study several tasks were proposed: to determine quality characteristics of male dog sperm, dedicated for artificial insemination of bitches; to evaluate the dynamics of progesterone levels of bitches of various ages and breeds when their ovulation is approaching; evaluate fertility of bitches of various ages and breeds after artificially inseminating them, and which have been tested for serum progesterone concentrations. to whom the progesterone concentration determination in blood serum tests were performed.

During the time of the study, various characteristics of male dog sperm quality were researched, such as: mobility, concentration of spermatozoon and different pathological disorders of their heads and tails, also differences of spermatozoon in numerous breed and age groups. Progesterone concentration tests were performed using blood serum to bitches of various ages and breeds. Furthermore, the owners of the dogs who participated in the research were asked about the results of the artificial insemination performed to their pets and then we evaluated this kind of artificial insemination effectiveness.

According to the research results, the spermatozoon mobility of various dog breeds on average was 81.5 % (± 11.82%); concentration on average 423.75 million per 1 ml ± 316.51 million per 1 ml; amount of pathologies of spermatozoon heads found on average were 18.98 % ± 6.72 %;

According to the results obtained from the study, the intrauterine artificial insemination with the control of progesterone levels is an effective tool to inseminate bitches of different breeds and ages.

Keywords: artificial insemination, characteristics of dog sperm quality, progesterone concentration, canine reproduction.

SANTRUMPOS

proc – procentai; a – amžius; pab – pabaigoje; mm – milimetrai; ml – mililitrai; pranc – prancūzų; konc – koncentracija; vid – vidutiniškai; gr – grupė; LH – liuteinizuojantis hormonas; lot – lotynų; m – metai;

nmol/L – nanomoliai litre; cm – centimetrai;

min – minutės; µm – mikrometrai;

DNR – deoksiribonukleorūgštis; mln/ml – milijonai mililitre.

ĮVADAS

Šunų veisimas tampa viena iš pagrindinių platesnio gyvūnų auginimo šakų besivystančiose šalyse. Santykis tarp šunų ir žmonių kyla iš priešistorinių laikų, kada šuo buvo naudojamas medžioklei.

Anot istorinių šaltinių, skelbiama, jog pirmasis prijaukintas gyvūnas buvo šuo (Canis familiaris lot.). Senovės brėžiniai, paveikslai rodo, jog kontaktas šuns su žmogumi įvyko daugiau nei prieš pusę milijono metų. Ryšiams tarp šuns ir žmogaus stiprėjant, atsirado žmogaus veikla juos veisti, kurios pagalba atsirado gyvūnų įvairovė ir dabar skaičiuojama apie 350 skirtingų veislių šunų. FCI (Fédération Cynologique Internationale pranc.) duomenimis 2016 metais Europoje įregistruotų šunų skaičius viršijo 45 milijonus.

Šunų veisimas nėra lengva ar paprasta sritis, todėl nuolat taikoma ligų prevencija, genetinės medžiagos išsaugojimas ir t.t. pasitelkiant įvairius reprodukcijos gerinimo metodus, kurių vienas ir labai svarbus – tai dirbtinis sėklinimas. Apvaisinimas gali įvykti ne tik natūraliu būdu, bet ir dirbtinai. Yra keletas būdų dirbtinai apsėklinti kalę naudojant šviežią, šaldytą ir atvėsintą spermą. Dėl šio metodo išvengiama giminingo veisimo tarp šunų, išsaugojama genetinė medžiaga net po augintinio mirties bei užkertamas kelias lytiškai plintančioms įvairioms ligoms (Herpes virus; Brucella canis) (1). Ši sėklinimo praktika pradėta taikyti JAV ir šiaurės šalyse, kam davė pradžią XVIII a. pab. Spallanzani eksperimentai (2,3). Ji plačiai naudojama ir dabar siekant plėsti šią veiklą. Daugelis autorių teigia, jog yra žymiai didesnė tikimybė ir didesnis apvaisinimo procentas apsėklinant dirbtinai, negu kergiant natūraliu būdu. Bet tam įtakos turi įvairios sąlygos: šuns veislė, reprodukcijos sezoniškumas, apsėklinimų skačius, sėklinimo būdas (intravagininis, intrauterinis), sperma (šviežia, šaldyta ar atvėsinta) ir jos kokybė (4,5).

Lietuvoje buvo atlikta palyginus mažai tyrimų ar analizių, siekiančių išsiaiškinti dirbtinio intrauterinio kalių sėklinimo rezultatų, priklausančių nuo patinų spermos kokybės bei patelių progesterono koncentracijos lygio kraujo serume. Ši reprodukcijos efektyvumo priemonė itin svarbi gyvūnų veisėjams bei vet. gydytojams, kad neatsiliktų nuo pažangesnių tendencijų bei siektų geresnių rezultatų veisimo ir reprodukcijos srityse.

Norint sistemingai vykdyti šunų veisimą, atsižvelgiant tiek į ekonominius, tiek į fiziologinius gyvūnų aspektus, labai svarbu skirti daug dėmesio veiksniams, kurie įtakoja ar nulemia šunų geresnius reprodukcinius rezultatus.

Remiantis literatūros šaltiniais bei tendencijomis, suformulavome bei iškėlėme darbo tikslą: išsiaiškinti ir įvertinti kalių intrauterinio sėklinimo efektyvumą.

Tikslui pasiekti buvo iškelti šie darbo uždaviniai:

1. Nustatyti šviežios šunų spermos, skirtos kalių dirbtiniam sėklinimui, kokybinius rodiklius; 2. Įvertinti įvairių kalių veislių ir amžiaus progesterono lygio dinamiką artėjant jų ovuliacijai; 3. Įvertinti įvairių kalių veislių ir amžiaus apvaisinimą po jų dirbtinio sėklinimo, kurioms buvo

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Kalės lytinis ciklas

Lytinis ciklas – tai periodiškas reiškinys, kuris kalėms pasikartoja nepriklausomai ar ji susikergė, ar ne. Kalė yra ,,monoestrinis’’ gyvūnas, kurios ruja nepriklauso nuo sezoniškumo, bet dažniau pasitaiko pavasarį arba rudenį.

Kalės lytinio ciklo fazės:

 Priešrujis (lot. proestrus);

 Tikroji ruja (lot. oestrus);

 Porujis (lot. metoestrus);

 Ramybės periodas (lot. anoestrus).

1pav.Hipotalaminė - hipofizinė ašis, nurodanti hormonų gamybos ir grįžtamuosius ryšius (6)

Priešrujis (lot. proestrus) – fazė trunkanti vidutiniškai 9 dienas, tačiau gali pasitaikyti, kada trunka nuo 3 iki 17 dienų. Priešrujį galima įtarti, pastebėti įvairius klinikinius požymius: tokius, kaip vulvos gleivinės paraudimas, vulvos padidėjimas, o vėliau ir kraujingos išskyros. Taip pat galima pastebėti ir iš elgesio pokyčių – ima dažniau šlapintis (žymėti teritoriją), nerimauja, klajoja. Šie elgsenos pokyčiai yra susiję su estradiolio koncentracija kraujo plazmoje dėl kiaušidžių folikulų vystymosi. Estradiolis skatina įvairius procesus reprodukciniame trakte, stimuliuoja liaukos epitelio

augimą, aktyvumą bei skatina gleivinės vaskuliarizaciją ir edemą. Gleivinės kapiliarai tampa trapūs, o takios endotelio ląstelių jungtys leidžia patekti kraujo plazmai į gimdos spindį, tai lemia kraujingų išskyrų pasirodymą iš vulvos ir jos išbrinkimą. Priešrujo metu patinai domisi kale, bando ją kergti, bet ji nesileidžia (7).

Tikroji ruja (lot. oestrus) – fazė trunkanti vidutiniškai 9 dienas, bet gali trukti nuo 3 iki 21 dienos. Iš elgsenos pokyčių galima spręsti, kada prasideda. Kalė pradeda prisileisti patiną, leidžiasi kergti pasukdama uodegą į šoną. Klinikiniai požymiai, lemiantys tikrąją rują – suminkštėjusi vulva, ištakos šviesesnės spalvos taip pat tvirčiau laiko svorį paspaudus kryžiaus srityje (nesitraukia). Šios fazės metu įvyksta ovuliacija ir kalė gali būti apvaisinta (8).

Porujis (lot. metoestrus) – fazė vidutiniškai trunkanti 60 dienų, bet gali trukti nuo 50 iki 70 dienų. Kalės elgsena pasikeičia, ji nustoja prisileisti patinus, o patinai nustoja domėtis patele. Klinikiniai pasikeitimai porujo metu – sumažėja vulva, tampa ne tokia edemiška, neišbrinkusi.

Ramybes periodas (lot. anoestrus) – fazė vidutiniškai trunka 18-20 savaičių. Tai periodas, kuris nėščiosioms prasideda gimdymu, o nenėščiosioms liuteininės fazės pabaiga. Kaip ir kitoms fazėms didelės įtakos turi kalės amžius, veislė, aplinka, bendra organizmo būklė. Šio periodo metu vyksta gimdos atsistatymo procesai. Kiaušidėse ir toliau bręsta folikulai, tačiau jie regresuoja neovuliavę, o estrogenų kiekis yra nepakankamas, jog atsirastų klinikiniai požymiai (9).

sienelės liuteinizacija atsiranda prieš ovuliaciją ir tai yra reikšmingas padidėjęs progesterono kiekis kraujyje. Estrogeno kiekio sumažėjimas ir progesterono kiekio padidėjimas (dėl kurio ženkliai pasikeičia šių hormonų santykis) skatina LH bangą ir įtakoja seksualinio elgesio pokyčius (10). Nustatyta, kad progesterono koncentracija padidėja per kelias valandas prieš LH bangos pradžią arba bangos pradžioje. Padidėjęs folikulų progesteronas, greičiausiai, yra esminis ovuliacijos faktorius kalėms, kaip ir kitoms gyvūnų rūšims. Vidutiniškai 12 dienų nuo proestrus pradžios įvyksta ovuliacija, bet kai kuriais atvejais ji gali prasidėti jau 5 dieną nuo priešrujo pradžios arba net 25 dieną (11,12).

Apvaisinimas kalės – iš endokrinologinės pusės – dalinai skiriasi nuo kitų gyvūnų rūšių. Esminis skirtumas yra tas, jog kalėms LH lygis pakyla 2 dienos prieš ovuliaciją. Ovuliacijos metu oocitai nėra pakankamai subrendę, kad galėtų būti apvaisinti nedelsiant. Apvaisinimas gali įvykti tik po pirmojo poliarinio kūno ekstruzijos, ir po pirmojo mejozės pasidalinimo, kad susidarytų antrinis oocitas. Šis brendimas trunka 48-60 valandų ir vyksta distalinėje kiaušintakio dalyje. Oocitai nepradeda degeneruotis iki 9-10 dienų po ovuliacijos, bet įdomu tai, jog kalių vaisingas laikotarpis išsiskiria iš kitų gyvūnų rūšių, nes kalės vaisingos yra tik nuo 2 iki 5 dienos po ovuliacijos. Labiausiai vaisingos dienos yra 2-3 dienos po ovuliacijos (5,13).

Apvaisinimo periodas yra apytikslis laikotarpis maksimaliai apvaisinimo galimybei, nes vyksta oocitų degeneracija bei užsidaro gimdos kaklelis, kuomet sperma nebegali patekti į kalės reprodukcinį traktą. Svarbu tai, jog įmanoma apvaisinti kalę prieš ovuliaciją, nes spermatozoidai kalės lytiniuose takuose yra gyvybingi iki 7 dienų. Svarbu nesumaišyti dviejų periodų – vaisingumo periodo ir apvaisimo periodo.

3pav.Vaisingumo ir apvaisinimo periodų dinaminė kaita (6)

Nėštumas – šiuo periodu progesteroną gamina tik geltonkūnis ir taip visą vaikingumo laikotarpį. Vaikingumo metu progesterono koncentracija vidutiniškai yra šiek tiek aukštesnė, o tuo tarpu liuteininė fazė yra šiek tiek trumpesnė nėštumo metu. Tikėtina, kad progesterono gamyba nėštumo metu yra daug didesnė, tačiau plazmoje kintamumas nėra pastebimas, kadangi nėštumo metu pastebimas plazmos tūrio padidėjimas, kuris turi praskiedimo poveikį progesterono koncentracijai (14,15).

Nėščiosioms liuteininė fazė trunka 63 dienas nuo ovuliacijos iki gimdymo, o ne nėščiosioms apie 66 dienas. Antroje liuteininės fazės dalyje progesterono koncentracija pradeda mažėti ir analogiškai plazmoje didėja prolaktino koncentracija. Prolaktinas išskiriamas iš hipofizės, palaikydamas geltonkūnį, padeda išlaikyti pakilusią progesterono koncentraciją. Prolaktino koncentracija yra 4 kartus didesnė nėščiosioms lyginant su nenėščiosiomis. Relaksinas – tai hormonas, kurį produkuoja placenta. Maždaug 25 dienos po ovuliacijos jis sutinkama plazmoje, o didžiausia jo koncentracija vyrauja apie 50 dieną po ovuliacijos. Prieš gimdymą jis atpalaiduoja raiščius, tarpinikauja ir palengvina gimdymo eigą (16,17).

1.2. Patinų reprodukcinė sistema

Patinų reprodukcinė sistema yra gana sudėtinga, nes ji turi atlikti keturias funkcijas: 1. Patinų lytinių hormonų gamyba ir platinimas.

2. Spermos gamyba ir brandinimas sėklidėse.

3. Spermos brendimas, transportavimas ir laikymas antsėklidžio latake (lot. ductus epidydimis).

4. Spermos pristatymas į patelės reprodukcinį traktą.

Yra skiriamos dvi pagrindinės funkcijos: spermos gamyba ir steroidinių hormonų gamyba. Spermatozoidų gamyba (spermatogenezė) vyksta sėklidžių vingiuotuose kanalėliuose, kuriuose yra dviejų tipų ląstelės – Sertoli (somatinės) ir gemalinės. Skerspjūvyje skiriamos dvi zonos – bazinė, kurioje vyksta mitozė, dalijanti spermatogonijas. Antroji zona, kurioje pirminiai spermatocitai mejozės būdu padalinami į antrinius.

Steroidogenezė – steroidiniai hormonai reaguliuoja vystymosi etapus ir yra svarbūs homeostazei ir fiziologinėms funkcijoms atlikti (18). Hormonų gamyba vyksta sėklidės intersticiniuose audiniuose aplink vingiuotuosius kanalėlius. Ši zona sudaryta iš Leidygo ląstelių, kuri glaudžiai susijusi su krauju ir limfinėmis kraujagyslėmis. Vienintelės Leidygo ląstelės yra su LH receptoriais. LH prisijungia prie Leidygo ląstelių receptorių ir stimuliuoja steroidogenezę tarpininkaujama ciklinio adenozino monofosfato. Leidygo ląstelių gaminami androgenai (testosteronas) yra būtini antrinių vyriškų lytinių požymių vystymuisi, elgesiui, pagalbinių liaukų funkcijų atlikimui, spermatozoidų gamybai.

Spermatogenezė –šis procesas yra padalintas į tris etapus:

 Spermacitogenezę – procesas, kurio metu mitozės ir mejozės procesų pagalba iš pirminių spermatocitų susidaro antriniai. Antriniams spermatocitams dalijantis II mejozės dalijimusi susidaro spermatidės, turinčios haploidinį chromosomų rinkinį.

 Spermiogenezę – procesas, kuris apima diferencijavimą į subrendusius spermatidus, kurie išskiriami į vingiuotųjų kanalėlių spindį.

 Spermiacija – procesas, kurio metu gemalo ląstelės išskiriamos į vingiuotųjų kanalėlių spindį po spermiogenezės (6).

Spermatozoidų gamyba – nuolat vykstantis procesas, kuris veikia visą šuns reprodukcinį laikotarpį. Spermatogonijos mitoziškai dalijasi kelis kartus, sudarydamos pirminius spermatocitus,

kurie dalindamiesi mejozės būdu sudaro haploidinį chromosomų rinkinį turinčius spermatidus. Spermatidai po spermiogenezės tampa spermatozoidais. Per šį laikotarpį susiformuoja spermatozoido galvutė, akrosoma, išsidėsto mitochondrijos vidurinėje spermatozoido dalyje, sutankėja DNR, suformuojami mikrofilamentai uodegėlėje. Procesas vyksta vingiuotųjų kanalėlių epitelyje. Spermatogenezės procesas nuo spermatogonijų iki subrendusio spermatozoido trunka apie 62 dienas (19).

.

1.2.1. Spermatozoido sandara

Subrendęs spermatozoido sandaroje skiriamos trys dalys:

 Galvutė, kurioje yra branduolys ir akrosoma;

 Vidurinioji dalis, kurioje yra mitochondrijos reikalingos metabolizmui;

 Uodegėlė, kuri reikalinga atlikti judėjimo funkciją.

Šunų spermatozoidai yra vidutiniškai 70m ilgio. Galvutė sudaro apie 10 proc. spermatozoido ilgio, vidurinė dalis apie 20 proc., o uodegėlė likusius 70 proc..

5 pav. Spermatozoido sandara (6)

1.3. Kalių dirbtinis sėklinimas

Tai procesas, kurio metu spermatozoidai patalpinami į patelės reprodukcinį traktą, siekiant apvaisinti naudojant kitokias nei natūralias poravimosi priemones. Dirbtinis apvaisinimas yra pagalbinė reprodukcinė technika, kuri gali būti naudojama kai kurioms šunų nevaisingumo priežastims kompensuoti (20). Indikacijos dirbtinio sėklinimo yra labai įvairios – nenoras kergti natūraliai, norima kergti skirtingose vietose, gerų genų išsaugojimas ir po šuns mirties, nesugebėjimas kergti natūraliai dėl ligų (pvz. patinams dėl artrito), patelėms dėl įgimtų gimdos kaklelio anomalijų, noras sumažinti riziką plintančioms ligoms, dėl geresnių vaisingumo rezultatų (21). Spermos paėmimas yra ganėtinai nesudėtingas procesas, jeigu šuo yra susijaudinęs. Sperma

paimama iš patino, kai jis bando varpą įstatyti į makštį, ji nukreipiama į surinkimo indą arba dirbtinę makštį. Tuomet digitaliai manipuliuojama, kad būtų sukelta ejakuliacija (22). Privaloma naudoti tinkamą surinkimo indą, kad nepažeistų gleivinės bei reikia palaukti, kol patinas galutinai išskirs spermą. Ejakuliatas sudarytas iš trijų frakcijų. Pirmosios ir trečiosios frakcijos sperma susideda iš prostatos skysčio, o antrosios frakcijos spermoje yra daug spermatozoidų. Prostatos sekretas sudaro 95 proc. ejakuliato tūrio. Yra dvi skirtingos teorijos apie prostatos sekretą, viena – jog prostatos sekretas slopina spermatozoidų funkcijos atlikimą, o kita, kad – prostatos sekretas pagerina šaldytos ir atvėsintos spermos kokybę (23). Jeigu ejakuliatas gerai frakcionuojamas, reikia surinkti tik antrąją frakciją (turinčią daug spermatozoidų), jei sperma bus transportuojama. Jeigu sperma apvaisinimui naudojama iškart, patartina ją skiesti su 1-2 ml prostatos sekretu. Sperma gali būti paimama du kartus, kas 30min. Jeigu antrasis mėginys atrodo atskiestas, rekomenduojama centrifūguoti, pašalinti supernatantą ir pridėti į pirmąjį ejakuliatą (3).

Spermos vertinimas – surinkus spermą prieš tolesnį naudojimą rekomenduojama įvertinti jos spalvą. Normali spermos spalva yra nugriebto pieno, kreminė, priklausomai nuo spermatozoidų tankio. Neturėtų būti geltonos spalvos, kadangi geltona spalva rodo užterštumą šlapimu ar uždegiminėmis ląstelėmis. Taip pat neturėtų būti ir raudonos spalvos, kuri nurodo tikriausiai esantį kraują joje. Jei pasireiškia nenormali spalva, reikalauja centrifūguoti ir mikroskopuoti, siekant išsiaiškinti priežastį. Esant tinkamai spalvai, sperma vertinama subjektyviai mikroskopiniu tyrimu, vertinamas jos judrumas (aktyvumas) uždėjus lašą antrosios frakcijos spermos ant objektinio stiklelio, jis gali būti vertinamas balais arba procentais. Rekomenduojama naudoti šildomą padėklą stikleliui, nes žema temperatūra mažina spermatozoidų judrumą, įprastai ejakuliatai turi turėti 75-90 proc. progresyviai ir greitai judančių spermatozoidų. Kiti spermos tyrimai buvo atlikti LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Buvo tiriama spermos koncentracija bei jos patologijos. Bendras spermatozoidų kiekis šunų ejakuliate svyruoja nuo 200 iki 1200 milijonų viename ml 100-700 milijonų. Koncentracijos vertinimas atliekamas mikroskopuojant, naudojant specialią kamerą arba naudojant fotometrus, kurie kalibruoti šunų spermai, kurie suteikia skaitmeninį matavimą koncentracijos milijonais spermatozoidų viename ml. Taip pat buvo tirtos spermatozoidų morfologinės savybės subjektyviu mikroskopiniu tyrimu. Ieškota spermatozoidų galvučių ir uodegėlių defektų (patologijų). Abiem grupėms tirta po 200 spermatozoidų – normaliai patologinių spermatozoidų skaičius negali viršyti 30 proc. tiriamųjų (24,25).

6pav.Įvairių sėklinimo būdų palyginamieji duomenys (27)

Dirbtinis sėklinimas gali būti vaginalinis arba intrauterinis (26).

Intrauterinis dirbtinis sėklinimas gali būti atliekamas naudojant norvegišką (skandinavišką) kateterį arba naudojant standų makšties endoskopą. Taip pat intrauterinis dirbtinis sėklinimas gali būti atliekamas invaziniais metodais, tokiais, kaip laparoskopija arba laparatomija. Kai kuriose šalyse šie metodai gali būti neteisėti arba laikomi neetiškai priimtini (28).

Magistrinio darbo tyrimo metu naudotas intrauterinis dirbtinis sėklinimas norvegišku (skandinavišku) kateteriu, kuris susideda iš plieninio vamzdelio ir stileto, prie kurio prijungiamas sterilus švirkštas su antrosios frakcijos sperma. Kateteris gali būti trijų skirtingų dydžių 20, 30 arba 40 cm. Dažniausiai naudojamas vidutinio dydžio, kuris tinka tiek mažų, tiek didelių veislių šunims. Kalė pastatoma ant stalo arba ant grindų, šiai procedūrai sedacija retai reikalinga, dauguma kalių estruso fazėje laisvai priima šią procedūra. Viena ranka plieninis vamzdelis įvedamas į makštį, kita ranka palpuojant pilvo sieną fiksuojamas gimdos kaklelis. Kateteris vedamas pro gimdos kaklelį, jo kanalas 5-10mm, daugeliu atveju apibūdinamas, kaip liečiant kremzlę, t.y. ,,traškus’’. Patekus į gimdą, kateteris fiksuojamas, prijungiamas stiletas, o prie stileto prijungiamas švirkštas su antrosios frakcijos sperma. Sperma lėtai infuzuojama į gimdą, infuzija priklauso ir nuo to, ar kateteris yra spaudžiamas gimdos sienele, ar ne, jeigu infuzija vyksta nesklandžiai, rekomenduojama truputį patraukti gimdos kaklelį ar gimdos kūną šiek tiek žemyn, tuomet infuzija atliekama sklandžiai. Norėdami patikrinti ar kateteris yra kalės gimdoje, rekomenduojama suleisti 1-2 ml fiziologinio tirpalo, jei kateteris tinkamoje vietoje, skystis lengvai suleidžiamas. Kateteris pašalinamas ir kalė pakeliama už galinių kojų, laikoma 5-10 min., kad sumažinti galimybę spermos išsiliejimui, tada palengvinamas spermatozoidų kelias į gimdos ragus. Norint išmokti šios technikos, reikia praktinių įgūdžių. Manoma, kad lengviau įvesti kateterį kalei, kuri jau yra gimdžiusi keletą kartų. Sunkiausia

Apsivaisinimo rodiklis ir vados dydis po vagininio ar intrauterinio dirbtinio sėklinimo, naudojant šviežią, atvėsintą ar šaldytą šunų spermą (n=2041)

Spermos tipas Apsivaisinimo procentas Vados dydis

Vagininis dirbtinis sėklinimas Intrauterinis dirbtinis sėklinimas Vagininis dirbtinis sėklinimas Intrauterinis dirbtinis sėklinimas Šviežia 47,8 65,2 5,8 ± 2,8 6,5 ± 2,5 Atvėsinta 45,1 65,6 5,8 ± 3,0 5,4 ± 3,2 Šaldyta 34,6 52,0 4,7 ± 2,6 5,0 ± 3,2

įvesti kateterį yra nervingiems ir nutukusiems gyvūnams. Atlikti tyrimai parodė, jog naudojant norvegišką (skandinavišką) kateterį, buvo vos 2-3,5 proc. nesėkmingų bandymų. Taip pat ši technika gali būti naudojama, suleidus kontrastą į gimdą, histerografiniam patikrinimui (22,25,26,28,29,30).

2. DARBO MEDŽIAGA IR TYRIMŲ METODIKA

Tyrimą sudarė dvi dalys:

 Spermos mėginių surinkimas ir jos vertinimas;

 Progesterono tyrimas, kalių dirbtinis sėklinimas bei apklausa apie kalių dirbtinio sėklinimo rezultatus.

7pav.Principinė bandymo schema.

Spermos mėginių rinkimas buvo atliktas klinikoje, kurioje atliekamas dirbtinis intrauterinis kalių sėklinimas. Spermos vertinimas atliktas LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Progesterono tyrimai atlikti klinikoje, kurioje vykdžiau praktiką ir rinkau spermos mėginius. Informaciją apie kalių dirbtinio sėklinimo rezultatus, kurioms buvo darytas progesterono tyrimas iš kraujo serumo, surinkau apklausęs veisėjus.

2.1. Spermos kokybės tyrimas

Tyrimo tipas, atsitiktinių imčių analizė. Tyrimas buvo atliktas 2016-2017 metais. Buvo renkami mėginiai klinikoje – iš kurių ištirta 20 šunų spermos mėginių. Spermos tyrimai – mėginiai buvo renkami ,,x’’ klinikoje 2016-2017 metais. Mėginiai imti atsitiktiniu būdu, kurie atvyko intrauteriniam kalės sėklinimui. Per šį likotarpį surinkta 20 šunų spermos mėginių. Spermos judrumas (aktyvumas) buvo tirtas ,,x’’ klinikoje ir įvertintas procentais. Spermatozoidų koncentracija, galvučių patologijos, uodegėlių patologijos tirtos LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Tirtos įvairios šunų veislės: Bordo dogai (n=2), Čiau čiau (n=5), Vokiečių dogai (n=3), Ilgaplaukiai koliai (n=3), Anglų spanieliai (n=3), Karaliaus Karolio spanieliai (n=1), Didieji pudeliai (n=2) ir Veimaranerio veislės (n=1).

Mėginių tyrimo metodika – mėginiai imti ,,x’’ klinikoje, į kurią patinai atvyko dirbtiniam intrauteriniam sėklinimui. Patinui sukelti erekciją buvo naudojama rujojanti kalė, kuri po to buvo dirbtinai sėklinama. Kol nepilnai sukelta erekcija, patinui apnuoginama varpa, atitraukiant apyvarpę. Patinas stengiasi ,,užlipti’’ ant kalės, bet jo varpa nukreipiama ir digitaliai stimuliuojama, o kai patinas nustoja atlikti kergimo judesius, stebimas ejakuliatas. Ejakuliatas surenkamas į tris atskirus mėgintuvėlius, kad atskirti tris spermos frakcijas. Pirmoji ir trečioji frakcija – skaidrus prostatos sekretas, antroji – su spermatozoidais.

Antroji frakcija tiriama iškart laboratorijoje, kurioje paimtas mėginys. Ant objektinio stiklelio uždedamas lašas (10l) spermos ir naudojant šildomą stalelį bei šviesinį mikroskopą subjektyviu tyrimu nustatomas spermatozoidų judrumas (aktyvumas). Spermatozoidų morfologinių pakitimų nustatymui, tuoj pat po spermos judrumo nustatymo, 10l spermos užlašinama ant objektinio stiklelio ir nudažoma metileno mėlynaisiais dažais pagal gamintojo instrukcijas (Sperm Blue, MICROPTIC S.L., Ispanija). Mikroskopuojama naudojant imersiją bei 1000 kartų padidinimą fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija). Spermatozoidų morfologinių pažeidimų nustatymui vertinama 200 spermatozoidų iš įvairių tepinėlio vietų. Registruojamos tokios spermatozoidų galvučių patologijos: kriaušės formos, siauru pagrindu, nenormaliais kontūrais, neišsivysčiusios, nenormalios galvutės be uodegėlių, siauros, didelės, mažos normalios, trumpos plačios galvutės ir spermatozoidai su paracentriniu viduriniosios dalies prisitvirtinimu. Įvertinus 200 spermatozoidų būklę, apskaičiuojama procentinė kiekvienos patologijos dalis mėginyje ir bendras galvučių patologijų procentas.

hematocitometrinė kamera. Spermatozoidai skaičiuojami 5 dideliuose kvadratuose (80 mažų kvadratėlių) arba 0,2 mm2

plote. Spermatozoidai skaičiuojami tris kartus skirtinguose kvadratuose ir suskaičiuojamas trijų skaičiavimų vidurkis.

8pav.Koncentracijos nustatymui naudojo mehematocitometrinę kamerą

Spermatozoidų koncentracija nustatoma pagal formulę: K = S × Pr × 5 ×10 × 1000

K – spermatozoidų koncentracija t.y. spermatozoidų skaičius viename spermos mililitre, S – spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratų,

Pr – praskiedimo laipsnis,

5 – koeficientas, nes spermatozoidai buvo skaičiuoti 0,2 mm2 kameros plote, 10 – daugiklis, nes kameros gylis yra 0,1 mm.,

1000 – daugiklis, spermatozoidus perskaičiuojant į 1 ml.

Spermatozoidų uodegėlių įvertinimui buvo naudojamas Hancock’o (šlapio preparato) metodas. Sperma skiedžiama buferinio formalino tirpalu santykiu 1:10. Lašas atskiestos spermos (10μl) dedamas ant objektinio stiklelio, uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Iš viršaus lengvai nusausinamas filtriniu popieriumi. Keletą minučių leidžiama nusėsti spermatozoidams ant stiklelio dugno, tada mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), naudojant 400 kartų padidinimą. Įvertiname 200 spermatozoidų. Registruojami

tokie spermatozoidų uodegėlių pažeidimai: proksimaliniai ir distaliniai lašeliai, palaidos galvos, akrosomos pakitimai ir defektai, vakuolės, vidurinės dalies pakitimai, paprastai suktos ir po galva susisukusios uodegėlės ir dvigubai sulinkusios uodegėlės. Apskaičiuojama procentinė kiekvienos patologijos dalis mėginyje ir bendras uodegėlių patologijų procentas.

2.2. Kalių progesterono tyrimas

Kraujas progesterono tyrimui prieš dirbtinį kalių sėklinimą buvo paimtas ,,x’’ klinikoje, siekiant nustatyti tikslų ovuliacijos laiką. Kraujas imtas kalėms iš v.cephalica. Kraujo mėginys patalpinamas į centrifūgą, kad būtų galima gauti kraujo serumą. Paimamas kraujo serumas, kuris patalpinamas tyrimui į ,,Beckman Coulter Inc. Access 2 Immunoassay Analyzer’’ aparatą. Progesterono koncentracija kraujo serume nmol/L ištiriama vidutiniškai per 45min. Viso tyrime dalyvavo 41 kalė, kurioms buvo atliktas progesterono koncentracijos kiekio nustatymas prieš dirbtinį intrauterinį sėklinimą. Šeimininkai progesterono tyrimo pageidavo savo nuožiūra. Dalis šeimininkų tiksliai žinojo kalės rujos dieną. Tyrime taip pat atskirai suskirstytos kalės, kurių aiški rujos diena, siekiant išsiaiškinti progesterono koncentracijos dinamiką. Tiriamosios kalės buvo įvairaus amžiaus nuo 1,5m iki 7m. Taip pat įvairių veislių Akita (n=4), Bordo dogai (n=4), Čiau čiau (n=4), Kaukazo aviganiai (n=4), Vakarų Škotijos baltieji terjerai (n=4), Vokiečių dogai (n=4), Niufaundlendai (n=3), Prancūzų buldogai (n=3), Sibiro haskiai (n=3) ir kitos veislės (n=8).

2.3. Kalių dirbtinis sėklinimas

Dauguma kalių šeimininkų dirbtinį sėklinimą klinikoje rinkosi dėl geresnių vaisingumo rezultatų. Dirbtinį intrauterinį sėklinimą ,,x’’ klinikoje atlikome naudojant norvegišką (skandinavišką) kateterį. Kalę pastatydavome ant procedūrinio stalo arba ant grindų. Viena ranka gydytojas įveda plieninį vamzdelį pro makštį, o kita fiksuoja gimdos kaklelį. Kateteris pro gimdos kaklelį įvedamas į gimdą. Patekus į gimdą kateteris fiksuojamas, prijungiamas stiletas, o prie stileto prijungiamas švirkštas su antrosios frakcijos sperma. Sperma lėtai suleidžiama į gimdą, kateteris pašalinamas ir kalė pastatoma ant priekinių kojų ir laikoma 10 min.

tų pačių kalių, kurioms buvo nustatyta progesterono konc. kraujo serume (n=41). Buvo siekiama išsiaiškinti, ar kalė apsivaisino ir koks vaisių pasiskirstymas pagal lytį.

2.5. Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta statistinių programų paketu „SPSS Statistics for Mac, Version 21.0“ (SPSS Inc., JAV, 2012). Aprašomajai statistikai atlikti aritmetinių vidurkių, standartinių vidurkių nuokrypių, koreliacijos bei statistinio patikimumo skaičiavimai. Koreliacinių ryšių patikimumas vertintas pagal Pearson’o koreliacinę matricą. Duomenys buvo vertinami, kaip turintys patikimą statistinį ryšį, kai p≤0,05, p≤0,01. Skaičiavimai apdoroti Microsoft Excel for Mac programa (Microsoft Inc., 2015), SPSS, duomenys pildyti bei darbas parengtas Microsoft Word for Mac (Microsoft Inc., 2015).

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1. Tyrimo apimtis

Mūsų tyrimai atlikti smulkių gyvūnų privačioje klinikoje, į kurią klientai savo augintinius atvesdavo atlikti dirbtinį sėklinimą. Tyrimo imtyje dalyvavo dėl jų pageidavimo įvarių veislių ir amžiaus patinai bei kalės.

Įvairių metų laikotarpiu atvykę klientai, su būsimajame tyrime dalyvaujančiomis kalėmis (n=41), kurioms buvo atliktas progesterono koncentracijos nustatymas iš kraujo serumo. Po tyrimo jos sugrupuotos pagal veislę, amžių ir rujos dieną, kurią tyrimas buvo atliktas. Duomenys apdoroti ir palyginti naudojant statistinius vertinimo metodus  kokią įtaka tai turi dirbtinio sėklinimo rezultatams.

Tolimesniu tyrimu išsiaiškinta patinų (n=20) spermos kokybė. Patinai sugrupuoti dviem būdais – pagal amžių į tris grupes: jaunesni negu 2 metų, 2-4 amžiaus bei vyresni negu 4 amžiaus, taip pat sugrupuoti pagal skirtingas veisles. Rezultatai statistiškai apskaičiuoti ir palyginti tarp skirtingų grupių bei palyginti su moksliniuose straipsniuose rastais duomenimis.

Dirbtinis sėklinimas atliktas klinikoje naudojant tik šviežią spermą. Norint gauti apvaisinimo rezultatus, po atlikto intrauterinio dirbtinio sėklinimo, apklausti visų kalių tyrime dalyvavusių šeimininkai, kurie atsakė į užduodamus klausimus – kiek atsivedė palikuonių? Ar visi išgyveno? Koks buvo atvestų palikuonių pasiskirstymas pagal lytį?

Tyrimu siekta išsiaiškinti  nuoseklaus progesterono tyrimo įvairiomis rujos dienomis bei spermos kykybės naudą bei įtaką kergimo rezultatams.

3.2. Patinų spermos kokybės nustatymas lyginant pagal veislę

9pav. Tyrime dalyvavusių šunų veislės ir skaičius

Spermos paėmimo ir vertinimo tyrime dalyvavo įvairių veislių šunys (n=20). Didžiąją dalį sudarė čiau čiau veislės patinai (n=5), šiek tiek mažiau tyrime buvo vokiečių dogų (n=3), ilgaplaukių kolių (n=3), anglų spanielių (n=3), bei kitos veislės (n=6).

10pav. Tyrime dalyvavusių patinų spermos judrumas procentais lyginant pagal veisles

2 5 3 3 1 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6

Bordo dogas Čiau čiau Vokiečių dogas Ilgaplaukis kolis

Karaliaus Karolio spanielis

Anglų spanielis Didysis pudelis Veimaraneris

73 86 7 1 .6 7 _{90 85} 9 1 .6 7 58 95 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 B o rd o d o g a s Či a u či au Vo ki eči ų dog as Ilg a p la u ki s ko lis Ka ra lia us K arolio spa nie lis A ng lų sp a ni el is Di d ysis p u d e lis V e im a ra n e ri s Judru mas pro c.

Mikroskopuojant visų patinų šviežią spermą (n=20) buvo vertintas jos judrumas (aktyvumas) procentais ir tai sudarė vidutiniškai 81,50 proc. ± 11,82 proc.. Lyginant tarp įvairių veislių. Didžiausias spermos judrumas buvo Veimaranerio (n=1) 95,00 proc., mažiausias spermos judrumas nustatytas pas Didžiojo pudelio veislės patinus (n=2) 57,50 proc. ± 3,54 proc.

11pav.Tyrime dalyvavusių patinų spermos koncentracija mln/ml lyginant pagal veisles

Spermos koncentracija vertinta LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje ir vidutiniškai sudarė 423,75 mln/ml ± 316,51 mln/ml. Didžiausia spermos koncentracija buvo pas Veimaranerio veislės šuns (n=1) 1021,00 mln/ml. Mažiausia spermos koncentracija Didžiojo pudelio veislės šunų (n=2) 233,00 mln/ml ± 182,43 mln/ml. Reikia pripažinti, kad nedidelis atskirų veislių šunų skaičius neleidžia padaryti statistiškai tvirtesnių išvadų.

317 ₂₉₁ 45 5. 33 563 800 3 4 8 .3 3 233 1021 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 B o rd o d o g a s Či a u či au V oki ečių d o g a s Ilg a p lau ki s ko lis K a ra lia u s K a ro lio sp a n ielis A ng lų sp a n ielis Di d ysis p u d e lis Ve im a ra ne ris Ko nc e nt ra c ij a mln/ ml

12pav. Tyrime dalyvavusių patinų spermatozoidų galvučių patologijos procentais lyginant

pagal veisles.

Patologinės spermatozoidų galvutės tirtos LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje – visumoje rasta 18,98 proc. ± 6,72 proc. patologinių spermatozoidų. Daugiausia patologinių spermatozoidų buvo rasta pas Vokiečių dogo veislės patinus (n=3) 29,67 proc. ± 10,15 proc., nes itin daug rasta laisvų patologinių galvučių, net 21,0 ± 17,35, tai beveik 3 kartus viršija visų tiriamųjų vidurkį. Mažiausias skaičius proc. buvo rastas pas Didžiojo pudelio veislės patinus 13,00 proc. ± 0,71 proc. 24 17 2 9 .6 7 1 5 .3 3 24 1 4 .6 7 13 20 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 B o rd o d o g a s Či a u či au Vo ki eči ų dog as Ilg a p lau ki s ko lis K a ra lia u s K a roli o sp a n ielis A ng lų sp a ni el is Di d ysis p u d e lis V e im a ra n e ri s Ga lv učių pato logij os proc.

13pav. Tyrime dalyvavusių patinų spermatozoidų uodegėlių patologijos procentais lyginant

pagal veisles.

Patologinės spermatozoidų uodegėlės tirtos LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje ir vidutiniškai rasta 17,85 proc. ± 7,60 proc.. Daugiausia patologinių spermatozoidų uodegėlių buvo rasta pas Bordo dogų veislės šunis (n=2) 27,75 proc. ± 6,01 proc., pas kuriuos itin daug buvo rasta distalinių lašelių ant spermatozoidų uodegėlių, net 35,00 ± 5,65 tai net 3 kartus viršija visą tiriamųjų vidurkį. Mažiausias skaičius proc. buvo rastas pas Karaliaus Karolio spanielių veislės patinus (n=1) 8,00 proc.

3.3. Patinų spermos kokybės nustatymas lyginant pagal amžių

Remiantis moksliniais darbais ir straipsniais išsiaiškinta, jog amžiaus įtaka spermos kokybe ne visuomet yra tiesiogiai proporcinga ir susijusi su spermos judrumu, koncentracija ir patologijomis (31). Spermos kokybę dažniau veikia kiti veiksniai, įskaitant sujaudinimo laipsnį, ejakuliacijos dažnumą, surinkimo techniką ir mėginių tvarkymą (32). Bet spermos bankų duomenimis patartina patinų reproduktorių sperma naudoti amžiaus intervale nuo 2 iki 6 metų. Atsitiktinai į kliniką atvykusius patinus, kurie atvyko dirbtiniam sėklinimui, mūsų tyrime suskirstėme į tris amžiaus grupes, siekiant išsiaiškinti, ar tai turi įtakos mūsų tyrimo rezultatams.

2 7 .7 5 17 2 4 .8 3 1 6 .6 7 08 09 2 2 .7 5 13 0 5 10 15 20 25 30 35 40 B o rd o d o g a s Či a u či au V oki ečių do g as Ilg a p lau ki s ko lis K a ra lia u s K a roli o sp a n ielis A ng lų sp a ni el is Di d ysis p u d e lis V e im a ra n e ri s U od egė lių pato logij os proc.

14pav. Tyrime dalyvavusių šunų skaičius pagal amžiaus grupes

Spermos paėmime ir vertinime buvo išskirtos trys patinų grupės pagal amžių: mažiau negu 2 metų amžiaus (n=8), 2-4 metų amžiaus (n=6) ir daugiau negu 4 metų amžiaus (n=6).

15pav. Tyrime dalyvavusių patinų spermos judrumas procentais lyginant pagal amžių

Atvykusiems į kliniką patinams, vieną iš pirminių parametrų, tyrėme spermatozoidų judrumą. Tikslesniems tyrimo rezultatams gauti naudojome reikiamos temperatūros mėgintuvėlius bei

8 6 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 < 2 m. 2 - 4 m. > 4 m. 88 _85.83 69.17 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 < 2 m. 2 - 4 m. > 4 m. Judru mas pro c.

subjektyviai mikroskopuodami ant šildomo stalelio vertinome spermos judrumą. Tiriamos spermos judrumą vertinome procentais pagal tiesiogiai judančių spermatozoidų skaičių. 15pav. pateikiame tyrimų duomenis spermatozoidų judrumo, kai tiriamieji patinai suskirstyti į tris grupes – iki 2 metų, 2-4 metų ir patinai, kurių amžius buvo virš 4 metų. Jeigu vertinti visų trijų grupių tirtų spermatozoidų judrumą, tai jis vidutiniškai siekė 81,50 proc. ± 11,82 proc.. Pirmoje amžiaus grupėje, kurioje buvo 8 šunys, spermatozoidų judrumas sudarė 88,00 proc. ± 4,62 proc. ir buvo didžiausias lyginant su kitomis grupėmis. Antroje amžiaus grupėje, kurioje buvo 6 šunys, spermatozoidų judrumas sudarė 85,83 proc. ± 6,65 proc. ir nuo pirmos grupės skirtumas buvo 2,17 proc. (p>0,05). Trečioje grupėje analizavome 6 patinus ir čia spermatozoidų judrumas buvo žemiausias ir sudarė 69,17 proc. ± 13,93 proc. ir nuo pirmos grupės skyrėsi 18,83 proc. (p≤0,05), o nuo antrosios skyrėsi 16,66 proc. (p≤0,05). Šis bandymo rodiklis indikuoja, kad amžius turi tendenciją į spermatozoidų judrumo mažėjimą.

16pav.Šunų amžiaus ir spermatozoidų judrumo ryšys (n=20)

Analizuojant šunų spermatozoidų ir amžiaus tarpusavio ryšį galima teigti esančią tiesioginę priklausomybę. Amžiui didėjant kas 1 metai, spermatozoidų judrumas mažėja 0,05 proc.. Gautas statistiškai nepatikimas rezultatas (p>0,05) R2

=0,381. y = -0.0448x + 0.9662 R² = 0.3311 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0 1 2 3 4 5 6 7

Ju

d

ru

ma

s

p

ro

c.

Amžius m.

17pav.Įvairaus amžiaus šunų spermatozoidų koncentracija

Spermos koncentracija vertinta LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje vidutiniškai sudarė 423,75 mln/ml ± 316,51 mln/ml. Suskirščius į grupes pagal amžių – didžiausia spermos koncentracija buvo jaunesnių, negu 2 metų amžiaus šunų (n=8) 687,75 mln/ml ± 334,89 mln/ml. 2-4 metų amžiaus grupės (n=6) vid. 320,33 mln/ml ± 98,22-4 mln/ml vyresnių, negu 2-4 metai amžiaus šunų grupėje (n=6) spermos koncentracija vid. 175,17 mln/ml ± 124,57 mln/ml. Lyginant jauniausiųjų ir vyriausiųjų spermos vidurkių skirtumas 512,58 mln/ml, jų koncentracijos skirtumas statistiškai patikimas (p≤0,05). Vertinant tarp <2 metų amžiaus grupės ir 2-4 metų amžiaus grupės, skirtumas statistiškai patikimas (p≤0,05) tarp antrosios ir trečiosios grupių nepatikimas (p>0,05).

687.75 320.33 175.17 0 200 400 600 800 1000 1200 < 2 m. 2 - 4 m. > 4 m. Konce nt ra c ij a mln/ ml

18pav.Šunų amžiaus ir spermatozoidų koncentracijos ryšys (n=20)

Analizuojant šunų spermos koncentracijos ir amžiaus tarpusavio ryšį, galima teigti esančią tiesioginę priklausomybę. Amžiui didėjant kas 1 metai, spermos koncentracija mažėja 128,65 mln/ml, gautas statistiškai nepatikimas rezultatas (p>0,05) R2=0,381.

y = -128.65x + 857.96 R² = 0.381 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 1 2 3 4 5 6 7 K on ce nt ra ci ja mln/ml Amžius m. 18.19 _16.33 22.67 0 5 10 15 20 25 30 35 40 < 2 m. 2 - 4 m. > 4 m. Ga lv učių patalogij os proc.

Patologinės spermatozoidų galvutės tirtos LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje visumoje rasta 18,98 proc. ± 6,72 proc.. Daugiausia patologinių spermatozoidų galvučių buvo rasta vyresnių nei 4 metų amžiaus grupėje (n=6) 22,67 proc. ± 10,85 proc. Jaunesnių nei 2 metai amžiaus grupėje šunų (n=8) rasta 18,19 proc.± 3,41 proc. mažiausiai spermatozoidų patologinių galvučių rasta 2-4 metų amžiaus grupėje (n=6) 16,33 proc. ± 3,41 proc. Lyginant tarp amžiaus grupių patologines spermatozoidų galvutes procentais gaunamas ryšys yra statistiškai nepatikimas (p>0,05).

20pav.Įvairių amžiaus grupių šunų spermatozoidų uodegėlių patologijos lygis

Patologinės visų veislių šunų spermatozoidų uodegėlės tirtos LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje vidutiniškai rasta 17,85 proc. ± 7,60 proc.. Daugiausia patologinių spermatozoidų uodegėlių buvo rasta vyresnių nei 4 metų amžiaus grupėje (n=6) 24,67 proc. ± 9,29 proc. 2-4 metų amžiaus grupėje (n=6) patologinių uodegėlių rasta 17,00 proc.± 5,02 proc. Mažiausiai spermatozoidų patologinių uodegėlių rasta jaunesnių nei 2 metai amžiaus grupėje (n=8) 13,38 proc. ± 3,71 proc.. Lyginant jaunesiųjų ir vyriausiųjų grupes gautas skirtumas 11,29 proc., kuris statistiškai patikimas (p≤0,05).

3.4. Kalės dalyvavusios tyrime, kurioms buvo atliktas dirbtinis

intrauterinis sėklinimas

Mūsų tyrimuose dalyvavo kalės, kurias šeimininkai atvesdavo dirbtinai apsėklinti į privačią veterinarijos kliniką. Kalės suskirtytos į keletą grupių tikslesniems tyrimo rezultatams gauti. Buvo

13.38 17 24.67 0 5 10 15 20 25 30 35 40 < 2 m. 2 - 4 m. > 4 m. U od egė lių patalog ijos proc.

išskirtos patelės pagal veislę, amžių ir rujos dieną, kurioms buvo atliktas progesterono koncentracijos nustatymas kraujo serume. Nustatymas atliktas ,,Beckman Coulter Inc. Access 2 Immunoassay Analyzer’’. Literatūros duomenimis, ovuliacija vyksta progesterono koncentracijai esant 6-10 ng/ml (19,08-31,8 nmol/L), nes tai priklauso nuo analizatoriaus gamintojo, modelio, pagaminimo datos, naudojamų reagentų bei analizatoriaus kalibracijos. Mūsų tyrimuose ,,x’’ klinikos duomenimis, kurioje vykdytas tyrimas, ovuliacija įvyksta intervale tarp 20-25 nmol/L (33).

21pav.Tyrime dalyvavusių kalių pasiskirstymas pagal veisles

Tyrime dalyvavo įvairių veislių patelės, kurioms buvo atliktas progesterono tyrimas ir intrauterinis dirbtinis sėklinimas (n=41). Didžiąją dalį tiriamųjų sudarė: Akita (n=4), Bordo dogai (n=4), Čiau čiau (n=4), Kaukazo aviganiai (n=4), Vakarų Škotijos baltieji terjerai (n=4), Vokiečių dogai (n=4) ir kitos veislės (n=17).

4

4

4

4

4

4

3

3

3

2

2

1

1

1

1

0

1

2

3

4

5

22pav.Kalių rujos dienos ir progesterono koncentracijos lygio kraujo serume ryšys

Kalėms surujojus ir rujos dienoms didėjant kas dieną, progesterono koncentracija didėja atitinkamai šiuo atveju 1,784 nmol/L R2

=0,606, koreliacijos koeficiento patikimumo tikimybės laipsnis statistiškai patikimas (p≤0,05). Progesterono koncentracijos dinamika pas atskirų veislių kales, artėjant jų ovuliacijai, dėsningai kito. Septintą rujos dieną kraujo serume progesterono vidutiniškai buvo rasta 5,07 nmol/L ± 4,04 nmol/L, o tuo tarpu septynioliktą rujos dieną, progesterono lygis ženkliai pakilo ir vidutiniškai sudarė 25,06 nmol/L ± 4,95 nmol/L. 22 pav. pavaizduota didėjančio progesterono koncentracija priklausomai nuo kalės surujojimo dienos.

3.5. Dirbtinio sėklinimo rezultatai

Mūsų tyrime dalyvavusios kalės buvo atvestos į kliniką intrauteriniam dirbtiniam sėklinimui, kurioms prieš tai buvo atliktas progesterono koncentracijos nustatymas, norint sužinoti tikslesnį ovuliacijos laiką. Siekiant išsiaiškinti dirbtinio sėklinimo naudą buvo apklausti visi tyrime dalyvavusių kalių šeimininkai. Dirbtinis sėklinimas atliktas įvairioms veislėms bei įvairaus amžiaus kalėms (n=41). Mūsų gauti rezultatai pranoko moksliniuose staipsniuose aprašytus rezultatus, kurie aptarti tolesniuose mūsų statistiniuose skaičiavimuose (27).

y = 1.784x - 1.1229 R² = 0.6056 0 5 10 15 20 25 30 35 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Proges ter on as nmo l/L Dienos (d.)

23pav. Kalių dirbtinio intrauterinio sėklinimo rezultatai

Apklausus kalių šeimininkus, kurie atliko dirbtinį sėklinimą ,,x’’ klinikoje, iš 41 kalės, dalyvavusios tyrime, apsivaisino 33 ir tai sudaro 80,49 proc., o neapsivaisino 8 ir tai sudaro 19,51 proc. Apsivaisino 80.49% Neapsivaisino 19.51% Apsivaisino Neapsivaisino y = -0.5266x + 5.8539 R² = 0.0647 0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Šuniu kų sk ai či us Amžius m.

Tiriant atsivestų šuniukų skaičių, tarp kalių amžiaus, gautas nepatikimas ryšys (p>0,05), amžiui didėjant kas metai, palikuonių skaičius mažėja 0,527 palikuonio. R2=0,065. Vidutiniškai skaičiuojant 1 kalė atsivedė 4,02 ± 2,91 palikuonio, iš kurių išgyveno 3,85 ± 2,81.

25pav.Atsivestų palikuonių pasiskirstymas pagal lytį

Kalės, kurioms buvo atliktas dirbtinis sėklinimas, atsivedė viso 159 palikuonis, 84 patinus ir 75 pateles, kurių santykis procentais sudaro 52,83 proc. ir 47,17 proc. patinėlių buvo daugiau 5,66 proc. vertinant pasiskirstymą pagal lytį, vidutiniškai vienai kalei teko 2,05 ± 1,64 patino ir 1,83 ± 1,74 patelės.

Patinai, 52.83% Patelės, 47,17%

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šunų veisimas tiek Lietuvoje, tiek kitose šalyse siejamas su mokslu ir verslu, kuris yra kasmet besivystantis ir besiplečiantis. Taip pat šunys – geras objektas vykdyti mokslo pažangai bei moksliniams bandymams. Kadangi šunys dažniausiai pasitaikantys kompanijos gyvūnai, todėl gauti tyrimo rezultatai labai aktualūs nespecializuotiems gyvūnų augintojams, tiek veisėjams. Norint įvertinti intrauterinio sėklinimo efektyvumą, atlikome įvairių rodiklių tarpusavio priklausomybes, kurias lyginome su moksliniais darbais, straipsniais bei statistiniais duomenimis.

Atlikus statistinę tyrime dalyvavusių šunų (n=20) spermos analizę pagal tirtus kokybinius rodiklius siekta išsiaiškinti jų tarpusavio priklausomybes ir ryšius. Vadovaujantis literatūros šaltiniais, spermos kokybiniai rodikliai tendencingos įtakos vados dydžiui ir apvaisinimui ne visuomet turi. Tiriant patinų spermos kokybę juos suskirstėme pagal veisles ir amžių, siekta įvertinti ir išsiaiškinti galimus skirtumus. Palyginimui pasirinktos veislės, kurių buvo daugiausiai: Čiau čiau (n=5), Vokiečių dogus (n=2), Ilgaplaukius kolius (n=3) ir Anglų spanielius (n=3).

Tiriant visų tyrime dalyvavusių šunų (n=20) spermos judrumą, nustatyta, kad vidutiniškai jis siekė 81,50 proc. ± 11,82 proc. ir aptiktas statistiškai reikšmingas judrumo rodiklio skirtumas tarp veislių (x2=15,736 p≤0,05). Nagrinėjant duomenis atidžiau aptikti skirtumai tarp Čiau čiau ir Vokiečių dogų veislės patinų – spermatozoidų judrumas buvo 14,33 proc. didesnis pas Čiau čiau veislės šunis, skirtumas patikimas (p≤0,05). Lyginant spermatozoidų judrumą Vokiečių dogų su kitomis bandymuose dalyvavusiomis veislėmis – Ilgaplaukiais koliais (skirtumas 18,33 proc.) ir Anglų spanieliais (skirtumas 20 proc.) – gauti statistiškai patikimi skirtumai (p≤0,05). Tarp kitų veislių statistiškai patikimi spermatozoidų judrumo skirtumai nenustatyti (p>0,05). Literatūroje neradome duomenų apie spermatozoidų judrumo priklausomybė nuo veislės. Nepatartina kergti kalių, jeigu spermatozoidų judrumas nesiekia 70 proc.(34,35).

Analizuojant tiriamųjų patinų spermatozoidų judrumą ir suskirsčius juos pagal amžiaus grupes, kurias sudarė jaunesni nei 2 metų amžiaus patinai (n=8), 2-4 metų amžiaus (n=6) ir vyresni nei 4 metų amžiaus patinai (n=6). Buvo siekta išsiaiškinti, ar spermatozoidų judrumas susijęs su amžiaus kitimu. Didžiausias spermatozoidų judrumas procentais buvo pirmoje amžiaus (jauniausiųjų) grupėje ir siekia 88,00 proc. ± 4,62 proc., antrosios amžiaus grupės spermatozoidų judrumo vidurkis nedaug skyrėsi nuo pirmosios ir sudarė 85,83 proc. ± 6,65 proc. (skirtumas 2,17 proc.) skirtumas tarp pirmosios ir antrosios grupių – nepatikimas (p>0,05). Vyriausiųjų grupės patinų spermatozoidų vidurkis buvo mažiausias 69,17 proc. ± 13,93. Lyginant pirmąją ir trečiąją

spermatozoidų judrumas 80,00 proc., nedaug skyrėsi 1-2 metų amžiaus patinų 79,00 proc.. Prasčiausias spermatozoidų judrumas nustatyas pas 2-3 metų amžiaus patinus ir sudarė 68,00 proc. (36). Tačiau mūsų tyrimų rezultatai ganėtinai skiriasi lyginant šiuos du tyrimus tarpusavyje, galimi veiksniai, lemiantys skirtumus: spermatozoidų judrumo nustatymas – subjektyvus tyrimas, ejakuliato paėmimo metų laikas, nežinomas ejakuliatų paėmimo dažnis, galimai per maža tyrimo imtis. Į šiuos veiksnius nebuvo atsižvelgta tiriant gautus rezultatus.

Patinų spermos kokybiniai rodikliai nustatyti LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Naudojant fazių kontrastinį mikroskopą (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 100 kartų padidinantį objektyvą ir hematocitometrinę (NewBauer) kamerą nustatyta spermatozoidų koncentracija. Koncentracijos nustatymui šunys buvo suskirstyti į grupes pagal veislę ir amžių (1gr. mažiau 2 metų amžiaus, 2gr. 2-4 amžiaus, 3gr. daugiau 4 metų amžiaus). Ištyrus visų (n=20) patinų spermatozoidų koncentraciją, jos vidurkis buvo 423,75 mln/ml ± 316,51 mln/ml. Didžiausia spermos koncentracija buvo pas Veimaranerio veislės patiną, bet tai buvo tik vienas respondentas 1021,00 mln/ml, o mažiausia koncentracija buvo Didžiojo pudelio veislės šunų (n=2) 233,00 mln/ml ± 182,43 mln/ml. Pasirinktos lyginti veislės tarpusavyje, kurių dalyvavo tyrime didžiausias skaičius – tai Čiau čiau (n=5), Vokiečių dogai (n=2), Ilgaplaukiai koliai (n=3) ir Anglų spanieliai (n=3). Patikimas koncentracijų skirtumas gautas tik lyginant Ilgaplaukių kolių ir Anglų spanielių (p≤0,05). Lyginant kitas veisles tarpusavyje gauti nepatikimi skirtumai (p>0,05). Reikia pripažinti, kad nedidelis atskirų veislių šunų skaičius, neleidžia padaryti statistiškai tvirtesnių išvadų. Remiantis ir lyginant spermatozoidų koncentracijos vidurkį su kitais atliktais moksliniais statistiniais darbais galima daryti išvadą, jog rezultatai iš dalies panašūs (37). Literatūros duomenimis normali spermatozoidų koncentracija siekia > 300 mln/ml. Apsivaisinimui pakankama koncentracija 150-200 mln/ml (tai gali būti mažųjų šunų veislių atstovai). Lyginant su tiriamųjų patinų vidurkiu – spermatozoidų koncentracija atitinka normas (6,38,39). Lyginant tarp amžiaus grupių patinų spermatozoidų koncentraciją didžiausia buvo jaunesnių, negu 2 metų amžiaus šunų (n=8) 687,75 mln/ml ± 334,89 mln/ml, 2-4 metų amžiaus grupės (n=6) vid. 320,33 mln/ml ± 98,24 mln/ml, o vyresnių, negu 4 metai amžiaus šunų grupėje (n=6) spermos koncentracija siekė vid. 175,17 mln/ml ± 124,57 mln/ml. Lyginant didžiulį jauniausiųjų ir vyriausiųjų patinų spermos vidurkių skirtumą, kuris buvo 512,58 mln/ml ir be abejonės statistiškai patikimas (p≤0,05). Vertinant tarp <2 metų amžiaus grupės ir 2-4 metų amžiaus grupes skirtumas irgi statistiškai patikimas (p≤0,05), o tarp antrosios ir trečiosios grupių jau nepatikimas (p>0,05). Analizuojant šunų spermos koncentracijos ir amžiaus tarpusavio ryšį, galima teigti esančią tiesioginę priklausomybę. Amžiui didėjant kas 1 metai, spermos koncentracija mažėja 128,65 mln/ml, gautas statistiškai nepatikimas rezultatas (p>0,05) R2

=0,381. Remiantis literatūros duomenimis galima teigti, jog šunų amžiui didėjant, spermatozoidų koncentracija taip pat palaipsniui mažėja (24,32,36).

Tiriant spermatozoidų patologijas tiek galvučių, tiek uodegėlių – buvo skaičiuota matymo laukuose atsitiktinai po 200 spermatozoidų. Analizuojant galvučių patologijas tai pat buvo suskirstyti patinai pagal veisles ir amžiaus grupes. Apibendrinant visų tiriamųjų duomenis – rasta 18,98 proc. ± 6,72 proc. patologinių spermatozoidų galvučių. Daugiausia patologinių spermatozoidų galvučių buvo rasta pas Vokiečių dogo veislės patinus (n=3) 29,67 proc. ± 10,15 proc., o mažiausias skaičius proc. buvo rastas pas Didžiojo pudelio veislės patinus 13,00 proc. ± 0,71 proc. Lyginant skirtumus tarp veislių, kurių atstovų dalyvavo daugiausiai, gauti nepatikimi rodikliai (p>0,05). Suskirsčius į anksčiau minėtas amžiaus grupes, daugiausia patologinių spermatozoidų galvučių buvo rasta vyresnių nei 4 metų amžiaus grupėje (n=6) 22,67 proc. ± 10,85 proc. Jaunesnių nei 2 metai amžiaus grupėje šunų (n=8) rasta 18,19 proc.± 3,41 proc., o mažiausiai spermatozoidų patologinių galvučių rasta pas 2-4 metų amžiaus grupės patinus (n=6) 16,33 proc. ± 3,41 proc. Lyginant šį rodiklį tarp amžiaus grupių patinų, gautas ryšys statistiškai nepatikimas (p>0,05).

Patologinių spermatozoidų uodegėlių pas tirtuosius patinus vidutiniškai rasta 17,85 proc. ± 7,60 proc.. Nagrinėjant duomenis atidžiau daugiausia patologinių spermatozoidų uodegėlių buvo rasta Bordo dogų veislės šunyse (n=2) 27,75 proc. ± 6,01 proc., o mažiausias skaičius procentais buvo rastas pas Karaliaus Karolio spanielių veislės patinus (n=1) 8,00 proc. Lyginant tarp veislių, kurių tyrime dalyvavo daugiausiai, gauti statistiškai patikimi skirtumai (p≤0,05) tarp Ilgaplaukių kolių ir Anglų spanielių bei Čiau čiau ir Anglų spanielių veislės patinų. Analizuojant pagal amžiaus grupes daugiausia patologinių spermatozoidų uodegėlių buvo rasta vyresnių nei 4 metų amžiaus grupėje (n=6) 24,67 proc. ± 9,29 proc.. Tuo tarpu 2-4 metų amžiaus grupėje (n=6) patologinių uodegėlių rasta 17,00 proc.± 5,02 proc.. Mažiausiai spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis rasta jaunesnių nei 2 metai amžiaus grupėje (n=8) ir tai sudarė 13,38 proc. ± 3,71 proc. Lyginant jaunesiųjų ir vyriausiųjų grupes gautas skirtumas 11,29 proc., yra statistiškai patikimas (p≤0,05). Literatūroje bei moksliniuose darbuose nerasta aiškios priklausomybės tiriant patologines galvutes ir uodegėles, lyginant tarp veislių ir amžiaus (36,40).

Siekiant gerų dirbtinio sėklinimo rezultatų patartina, jog patologinių spermatozoidų skaičius nebūtų didesnis kaip 30 proc. (5). Remiantis kito autoriaus duomenimis, manoma, kad daugiausiai įtakos patologinių spermatozoidų skaičiui turi spermatogenezės procesas. Anot autoriaus, sėkmingam apvaisinimui turi būti mažiausiai 60-80 proc. normalių spermatozoidų (35).

Tiriant atvykusių į ,,x’’ veterinarijos kliniką kalių progesterono koncentraciją iš kraujo serumo, jos sugrupuotos pagal pasireiškusią rujos dieną. Rujos dienoms didėjant kas dieną,

moksliniais darbais rastas atitikmuo, kad progesterono koncentracija kraujo serume kyla, didėjant rujos dienai (41).

Mūsų bandymuose, į privačią veterinarijos kliniką atvykusioms kalėms, atlikus dirbtinį intrauterinį sėklinimą jos sėkmingai apsivaisino, o gauti apsivaisinimo rezultatai sudarė 80,49 proc.. Lyginant su kitais atliktais tyrimais, gautas rezultatas yra vidutinio efektyvumo, bet kiti lemiantys veiksniai nebuvo tirti (19,42).

Apklausus visus tyrime dalyvavusius kalių šeimininkus, kurioms buvo atliktas dirbtinis intrauterinis sėklinimas, nustatyta, jog vados dydžiui turėjo įtakos kalės amžius. Tiriant atsivestų šuniukų skaičių tarp kalių amžiaus grupių, gautas nepatikimas ryšys (p>0,05), amžiui didėjant kas 1 metai, palikuonių skaičius mažėja 0,527 palikuonio. R2

=0,065. Vidutiniškai skaičiuojant 1 kalė atsivedė 4,02 ± 2,91 palikuonio, iš kurių išgyveno 3,85 ± 2,81. Kiti veiksniai įtakojantys lizdo dydį nebuvo tirti (43,44).

IŠVADOS

1. Mūsų atlikto bandymo metu tirtų įvairių veislių šunų spermatozoidų judrumas vidutiniškai sudarė 81,5 proc. ± 11,82 proc.; koncentracija vid. 423,75 mln/ml ± 316,51 mln/ml; spermatozoidų galvučių patologijų šunų spermoje vidutiniškai rasta 18,98 proc. ± 6,72 proc.; spermatozoidų uodegėlių patologijos vidutiniškai sudarė 18,97 proc. ± 6,72 proc. 2. Gauti spermos kokybinių rodiklių skirtumai lyginant skirtingų veislių ir amžiaus patinus.

Spermatozoidų judrumas patikimai skyrėsi lyginant Vokiečių dogų veislės patinus, Čiau čiau, Anglų spanielių ir Ilgaplaukių kolių patinais (p≤0,05). Spermatozoidų judrumą lyginant tarp amžiaus grupių – gauti rezultatai rodo, jog patikimas skirtumas tarp jauniausiųjų (<2m. amžiaus) ir vyriausiųjų (>4m. amžiaus) tiriamųjų grupių (p≤0,05). Spermatozoidų koncentracija, lyginant tarp veislių, ženkliai nesiskyrė, tačiau koncentraciją lyginant tarp amžiaus grupių, pirmąją amžiaus grupę su antrąja (2-4m. amžiaus) ir trečiąja (>4m. amžiaus) gauti statistiškai patikimi skirtumai (p≤0,05).

3. Patologinių galvučių lyginant tiek tarp veislių, tiek tarp amžiaus grupių nebuvo gauta patikimų skirtumų. Patologinių uodegėlių skaičius statistiškai patikimai skyrėsi lyginant Ilgaplaukių kolių veislę su Anglų spanieliais bei Čiau čiau su Anglų spanielių veislės patinais. Taip pat spermatozoidų uodegėlių skaičius statistiškai patikimai skyrėsi tarp jauniausiųjų (<2m. amžiaus) ir vyriausiųjų (>4m. amžiaus) grupių (p≤0,05).

4. Progesterono koncentracijos dinamika pas atskirų veislių kales, artėjant jų ovuliacijai, dėsningai kito. Septintą rujos dieną kraujo serume progesterono vidutiniškai buvo rasta 5,07 nmol/L ± 4,04 nmol/L, tuo tarpu, septynioliktą rujos dieną progesterono lygis ženkliai pakilo ir vidutiniškai sudarė 25,06 nmol/L ± 4,95 nmol/L.(p≤0,05).

5. Iš 41 tirtos kalės, kurioms buvo atliktas intrauterinis dirbtinis sėklinimas su progesterono kiekio kontrole, apsivaisino 80,49 proc. lygiu. Jos atsivedė vitutiniškai 4,02 palikuonis, iš kurių išgyveno vid. 3,85, o palikuonių lytis buvo atitinkamai: vid. 2,05 patinai ir 1,83 patelės.

6. Kalių intrauterinis sėklinimas su progesterono lygio kontrole yra efektyvi įvairių kalių veislių ir amžiaus veisimo priemonė. Rujos dienoms didėjant kas dieną, progesterono koncentracija atitinkamai didėja vid. 1,784 nmol/L, R2

=0,606. Koreliacijos koeficientas statistiškai patikimas (p≤0,05).

REKOMENDACIJOS

1. Rekomenduojama atlikti išsamią spermos kokybinių rodiklių analizę prieš kergimą ir dirbtinį sėklinimą (nustatyti spermatozoidų judrumą; spermatozoidų koncentraciją bei patologinių spermatozoidų skaičių).

2. Siekiant sužinoti tinkamą kalės kergimo ar sėklinimo laiką, būtina atlikti progesterono koncentracijos tyrimą iš kraujo serumo.

3. Įvairių veislių ir amžiaus kales reiktų sėklinti: šviežia ir atvėsinta sperma 1-3 dienos po ovuliacijos, giliai šaldyta sperma 2,5-3,5 dienos po ovuliacijos.

PADĖKA

Norėčiau nuoširdžiai padėkoti:

Prof. habil. dr. Henrikui Žilinskui – už rūpestingumą, palaikymą, atsidavimą bei įvairiapusę pagalbą viso baigiamojo darbo rengimo metu;

Dr. Sauliui Aidui Laurusevičiui – už suteiktą galimybę rinkti mėginius ir duomenis, už nuoširdžią pagalbą, suteiktą informaciją bei patarimus;

LSMU VA gyvūnų reprodukcijos laboratorijos darbuotojams – už suteiktą pagalbą ir pamokas tiriant mėginius.