LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Justė Urbonaitė
Įvairių veislių šunų apvaisinimo kriterijų tyrimas ir
vertinimas
The study on evaluation of insemination criteria in
different dog breeds
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. habil. dr. Henrikas Žilinskas
1 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Įvairių veislių šunų apvaisinimo kriterijų tyrimas ir vertinimas“:
1) yra atliktas mano pačios,
2) nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje,
3) nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas,
pavardė)
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data) (darbo vadovo vardas,
pavardė)
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo
(-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas,
pavardė)
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 ĮVADAS ... 8 SANTRUMPOS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Šunų kokybiniai ir kiekybiniai rodikliai ... 10
1.1.1 Spermos spalva ... 10 1.1.2 Spermos tūris ... 10 1.1.3 Spermatozoidų judrumas ... 11 1.1.4 Spermos koncentracija ... 11 1.1.5 Spermatozoidų gyvybingumas ... 12 1.1.6 Spermatozoidų morfologija ... 13 1.1.7 Pašalinės ląstelės ... 14 1.1.8 Prostatinio skysčio pH ... 14
1.2 Šunų spermos kokybę veikiantys faktoriai ... 15
1.2.1 Amžius ... 15
1.2.2 Svoris ... 15
1.2.3 Veislė ... 15
1.2.4 Mityba ... 16
1.3 Kalių oogenezė ... 17
1.3.1 Progesterono svarba ir jo koncentracijos matavimas kraujo serume ... 18
1.3.2 Sezoniškumo įtaka rujos trukmei ... 19
2. METODIKA ... 20
2.1 Bandymų atlikimo schema ... 20
2.2 Spermos mėginių tyrimas ... 21
2.2.1 Spermos mėginių ėmimas ... 21
2.2.2 Spermos mėginių tyrimas ... 21
2.2.3 Spermatozoidų gyvybingumas ... 22
2.2.4 Spermos koncentracija ... 22
2.2.5 Spermatozoidų uodegėlių morfologija ... 22
2.2.6 Spermatozoidų galvučių morfologija ... 23
2.2.7 Spermos pašalinių ląstelių skaičiavimas ... 23
2.2.8 Prostatos pH ... 23
3
2.4 Statistinė duomenų analizė ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI ... 25
3.1 Tyrimo apimtis ... 25
3.2 Šunų spermos kokybės nustatymas tarp skirtingų svorio grupių ... 25
3.3 Šunų spermos kokybės nustatymas tarp skirtingų amžiaus grupių ... 30
3.4 Kalių rujos dinamikos tyrimai ... 35
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
IŠVADOS ... 41
PADĖKA ... 42
4 ĮVAIRIŲ VEISLIŲ ŠUNŲ APVAISINIMO KRITERIJŲ TYRIMAS IR VERTINIMAS
Justė Urbonaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Mūsų darbo tyrimui reikalingi mėginiai rinkti privačioje smulkių gyvūnų klinikoje bei šunų veislyne 2018 – 2019 m. laikotarpiu, gauti mėginiai analizuoti LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Baigiamojo darbo apimtis 49 puslapiai, jį sudaro 20 paveiklų, 1 lentelė, iš viso panaudoti 77 literatūros šaltiniai (moksliniai straipsniai, statistiniai duomenys, konferencijų medžiaga).
Baigiamojo darbo tikslas buvo ištirti ir palyginti įvairių veislių patinų ir kalių reprodukcinės būklės rodiklius. Spermos mėginių (n = 31) tyrimą sudarė antros spermos frakcijos tūrio ištyrimas, spermos koncentracijos nustatymas, spermatozoidų judrumo, gyvybingumo nustatymas, spermatozoidų patologijų nustatymas, prostatinio skysčio pH tyrimas. Kalių progesterono rezultatai (n = 69) rinkti pagal vaisingo periodo pradžią ir duomenys išanalizuoti pagal vaisingo periodo pasireiškimo dieną ir mėnesį.
Remiantis tyrimų rezultatais padarytos išvados, kad mūsų tirtai šunų imčiai svoris daro įtaką spermos kiekiui – antros spermos frakcijos tūris mažo svorio šunų grupėje (0,5 ± 0,52 ml) lyginant su didelio svorio šunų grupe (2,8 ± 0,31 ml) skyrėsi statistiškai reikšmingai (p<0,05), spermos koncentracija statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi tarp vidutinio svorio šunų grupės (446,93 ± 80,6 x 106/ml) ir didelio svorio šunų grupės (237,0 ± 53,6 x 106/ml); patologinių spermatozoidų galvučių, išskirtinai laisvų galvučių skaičius mažo svorio grupėje (55,9 ± 29,9) statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,05) nuo didelio svorio grupėje rastų laisvų galvučių skaičiaus (4,9 ± 2,3) bei spermatozoidų patologinių uodegėlių, išskirtinai paprastai susisukusių uodegėlių mažo svorio grupėje rasta (10,9 ± 3,8) ir statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi nuo vidutinio svorio grupėje rasto šios patologijos skaičiaus (23,5 ± 4,3). Taip pat pastebėta vidutiniškai stipri teigiama koreliacija (r=0,437) tarp patologinių uodegėlių procentinės dalies ir šunų svorio (p<0,05). Šunų amžius mūsų tirtai imčiai darė įtaką spermos kokybiniams rodikliams: spermatozoidų judrumas jaunų šunų grupėje (69,0 ± 3,3 proc.) statistiškai patikimai (p<0,05) skyrėsi nuo senų šunų grupės (45,63 ± 4,9 proc.) bei spermatozoidų judrumas vidutiniškai stipriai koreliuoja (r= -0,694) su šunų amžiumi (p<0,01); spermatozoidų galvučių patologijų skaičius, išskirtinai siaurų spermatozoido galvučių skaičius jaunų šunų grupėje (61,0 ± 32,0) statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo suaugusių šunų grupės (15,67 ± 8,8);
5 patologinių spermatozoidų su proksimaliais lašeliais skaičius suaugusių šunų grupėje (1,5 ± 0,4) statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,01) nuo senų šunų grupės (9,6 ±4,6); prostatos skysčio pH reikšmė statistiškai patikimai (p<0,05) skyrėsi lyginant jaunų šunų amžiaus grupę (6,5 ± 0,08) su senų šunų amžiaus grupe (7,05 ± 0,16). Mūsų tirtoms kalėms metų laikas nedarė įtakos vaisingo periodo pasireiškimo laikui.
Raktažodžiai: šunų spermos kokybė, kalių vaisingas periodas, šunų reprodukcija, šunų veisimas.
6 THE STUDY ON EVALUATION OF INSEMINATION CRITERIA IN DIFFERENT DOG
BREEDS
Justė Urbonaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
Samples required for our study were collected in a private small animal clinic and dog kennel in 2018 - 2019. The samples were analyzed at the LUHS VA Animal Reproduction Laboratory. The volume of the final work is 49 pages, it consists of 20 illustrations, 1 table, 77 references (scientific articles, statistics, conference proceedings).
The aim of this thesis was to investigate and compare the reproductive status of different breeds of males and bitches. The analysis of semen samples (n = 31) consisted of: examination of the volume of the second semen fraction, determination of sperm concentration, motility, viability, detection of sperm defects, pH of the prostatic fluid. Progesterone results of the bitches (n = 69) were collected at the onset of the fertile period and analyzed by oestrus day and month of onset of the fertile period.
Based on the results of the research, we concluded that the weight of the sample of dogs we examined influenced the sperm volume - the volume of the second semen fraction in the small weight dog group (0.5 ± 0.52 ml) compared to the large weight dog group (2.8 ± 0.31 ml) differed significantly (p<0.05), sperm concentration was statistically significant (p<0.05) between medium weight dog group (446.93 ± 80.6 x 106/ml) and high weight dog group (237.0 ± 53.6 x 106/ml); The number of defected sperm heads, exclusively free heads in the small weight group (55.9 ± 29.9) was significantly different statistically (p<0.05) from the number of free heads in the large weight group (4.9 ± 2.3) and the amount of coiled tails between the small weight group (10.9 ± 3.8) and medium weight group (23.5 ± 4.3) were significantly different (p<0.05). A moderately strong positive correlation (r = 0.437) between the percentage of pathological tails and the weight of dogs was also observed (p<0.05). The age of dogs in our sample influenced the quality of sperm: sperm motility in the young dog group (69.0 ± 3.3%) was statistically different (p<0.05) from the old dog group (45.63 ± 4.9%); sperm motility had a negative correlation which was moderately strong (r = -0.694) with the age of dogs (p<0.01); the number of narrow sperm heads in the young dog group (61.0 ± 32.0) was statistically different (p<0.05) from the adult dog group (15.67 ± 8.8); the number of pathological spermatozoa with proximal droplets in the adult dog group (1.5 ± 0.4) was significantly different (p<0.01) from the old dog group (9.6 ± 4.6); the pH value of the prostatic fluid was statistically significantly different (p<0.05) comparing the group of young dogs (6.5 ± 0.08) with the group of old
7 dogs (7.05 ± 0.16). In our sample of bitches, the time of year (by month) did not influence the time of onset of the fertile period.
Keywords: dog sperm quality, bitch fertile period, reproduction in dogs, dog breeding.
8
ĮVADAS
Veterinarijos klinikinėje praktikoje šeimininkų konsultavimas veisimo klausimais bei taisyklingo veisimo planavimas tampa vis dažnesne veterinarijos gydytojų darbo dalimi. Ši užduotis tampa sudėtinga nesuprantant pagrindinių reprodukcijos biologijos principų, todėl svarbu žinoti bei suprasti, kokie šunų spermos rodikliai ir kalės reprodukciniai funkciniai rodikliai nurodo, jog šuo yra tinkamas reproduktorius. Žinoti ir suprasti pagrindinius veisimui reikalingus šunų bei kalių rodiklius yra efektyvus šunų reprodukcinių savybių valdymas.
Šiomis dienomis pasaulyje stebimas mažėjantis vaikų gimstamumas išsivysčiusiose šalyse dėl įvairių ekonominių, politinių ir ekologinių priežasčių. Žmonėms šunys vis dažniau tampa naminiais augintiniais, draugais, pagalbininkais darbe, terapijose, o kartais net atstoja vaikus šeimoms, kurios negali jų susilaukti ar nenori dėl įvairiausių priežasčių.
Taip pat neretai šunys yra naudojami kaip mokslinių tyrimų objektas reprodukciniais tikslais, jų rezultatai vėliau pritaikomi žmonių reprodukcijoje tiriant žmonių nevaisingumą. Visuomenė vis geriau supranta šunų genetinių ligų klausimus, tinkamo šunų veisimo principus.
Dėl šių priežasčių šunų veisimas yra vienas didžiausių verslų, susijusių su naminiais augintiniais pasaulyje. Tinkama veislininkystė užtikrina žmonių poreikius naminiams augintiniams, naminių augintinių sveikatą, išvengiant genetinių ligų bei ligų, plintančių lytiniais takais. Kergiant ar sėklinant kales dažniausiai daromos dvi klaidos – kalės kergiamos su patinais nežinant pastarųjų spermos kokybės bei nenustačius kalių vaisingo periodo pradžios. Šiame darbe pristatomi tyrimo rezultatai susieti su įvairių veislių skirtingo svorio ir amžiaus šunų spermos kokybe bei dažniausiai atliekamų progesterono rodiklių kitimu prieš kalių kergimą ar sėklinimą.
Darbo tikslas: Ištirti ir palyginti įvairių veislių patinų ir kalių reprodukcinės būklės rodiklius.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti spermos kiekybinių ir kokybinių rodiklių palyginimą tarp skirtingų svorio grupių šunų.
2. Atlikti spermos kiekybinių ir kokybinių rodiklių palyginimą tarp skirtingų amžiaus grupių šunų.
3. Palyginti rujojusių kalių skaičių skirtingais metų laikais bei vaisingo periodo pradžios laiką skirtingais metų mėnesiais.
9
SANTRUMPOS
CASA – (angl. Computer Assisted Sperm Analyzer) kompiuterinė spermatozoidų analizės sistema
HOS – (angl. Hypo-osmotic swelling) – hipoosmotinio rezistentiškumo testas nmol/l – nanomoliai litre
m – metai
mėn – mėnesis(iai) kg – kilogramai proc – procentai
u/l – fermento vienetai litre µm – mikrometrai
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Šunų kokybiniai ir kiekybiniai rodikliai
Kad būtų išvengiama nuostolių, svarbu prieš kiekvieną kergimą ar dirbtinį sėklinimą atlikti ne tik kalės ovuliacijos laiko nustatymą, bet ir tinkamai įvertinti šuns spermos pajėgumą apsėklinti kiaušialąstę. Norint nustatyti potencialią spermatozoido gebą apvaisinti kiaušialąstę, reikia atsiminti, jog kiekvienas spermatozoidas yra atskirai veikianti ląstelė, turinti daug įvairių savybių, kurios reikalingos apvaisinti kiaušialąstę (1). Dėl to spermos kokybės nustatymui reikia atlikti daug tyrimų, tokių kaip spermos frakcijų kiekio matavimas, spalvos įvertinimas, antros frakcijos spermos judrumo, gyvybingumo, koncentracijos skaičiavimas, antros frakcijos spermos galvučių bei uodegėlių, taip pat pašalinių ląstelių vertinimas. Ne mažiau svarbu patikrinti trečios spermos frakcijos Ph, ypač jei kalė bus kergiama, o ne sėklinama. Prastą spermos kokybę predisponuoja labai daug faktorių, kurių vieni yra paveldimi (sėklidžių hipoplazija, chromosomų patologijos, kriptorchizmas), kiti - prostatos patologijos: gerybinė prostatos hipertrofija, prostatinės cistos, prostatitas, prostatos neoplazijos (2). Vienos ilgametės studijos metu pastebėta, jog šunų su prasta spermos kokybe palikuonims dažniau pasireikšdavo kriptorchidizmas nei veisiamų šunų su tinkamos kokybės sperma palikuonims (3).
1.1.1 Spermos spalva
Vertinama antros frakcijos spalva, kuri fiziologiškai turėtų būti balta, pieniška, tačiau peršviečiama. Jei stebimas jos drumstumas, matyt, kartu su spermatozoidais pateko riebalų lašelių. Jeigu sperma yra gelsvos spalvos, tikriausiai kartu pateko ir šlapimo; esant žalsvai spalvai, dažnai randama uždegiminių ląstelių, kurios dažniausiai į spermą patenka iš apyvarpės, šlaplės ar prostatos. Raudonos spalvos sperma dažnai būna šunims, kuriems pirmą kartą imama sperma, dėl varpos paviršinių kraujagyslių išsiplėtimo ir pralaidumo įvykus erekcijai, tačiau taip pat gali atsirasti šunims, kuriems per daug grubiai manipuliuojama varpa digitalinės stimuliacijos metu, ar esant varpos traumai ar prostatos uždegimui (4).
1.1.2 Spermos tūris
Šis rodiklis labai daug priklauso nuo spermos rinkėjo įgūdžių. Kadangi sperma yra sudaryta iš trijų skirtingų frakcijų, esant per mažam jos kiekiui, reikia spręsti, ar tūris mažas, nes maža spermatozoidų dalis spermoje, ar šuo išskiria mažai ar visai neišskiria prostatinės frakcijos. Pastebima, jog spermos tūris didžiausias būna šunų, kurių amžius yra nuo 2 iki 3 metų. Senstant šis rodiklis palaipsniui mažėja. Didelių šunų sėklidės yra gerokai didesnės nei mažų šunų, tai tiesiogiai susiję su išskiriamos spermos kiekiu (5).
11 1.1.3 Spermatozoidų judrumas
Šio tyrimo metu skaičiuojama procentinė tiesiai judančių spermatozoidų dalis. Rezultatai yra subjektyvūs ir skiriasi tarp skirtingų vertintojų. Geros spermos kokybės spermatozoidas 100x padidinimo matymo lauką turėtų „perplaukti“ per 2-3 sekundes. Tokioje spermoje aptinkama 70 procentų ir daugiau tiesiai judančių spermatozoidų. Studijose atrasta, jog progresyviai, greitai ir tiesiai judančių spermatozoidų skaičius turi tiesioginį ryšį su membranos vientisumu ir morfologiškai nepakitusiais spermatozoidais (6).
Dažniausiomis sumažėjusio judrumo priežastimis įvardijamos netinkamos spermos rinkimo įrangos naudojimas, pvz., lateksinės pirštinės ar lateksiniai piltuvėliai bei vandeniu užteršti piltuvėliai, taip pat sėklidžių, prostatos ligos ar bruceliozė (7).
Patologinės astenozoospermijos priežastys dažniausiai būna susijusios su pakitusia spermatozoidų morfologija. Be to, spermatozoidų judrumo sumažėjimą sukelia ir nejudrių žiuželių sindromas, kuris yra autosominė recesyvinė liga, lemianti kvėpavimo takų žiuželių nejudrumą, taip sumažėja mukociliarinis klirensas ir būna nejudrūs spermatozoidų žiuželiai - toks šuo būna nevaisingas ir neturėtų būti veisiamas (8,9). Taip pat tik spermatozoidų judrumo sumažėjimą sukelia užsikrėtimas Leishmania chagasi, toks šuo taip pat neturėtų būti veisiamas, nes mikroorganizmus gali perduoti per spermą į patelės organizmą (8,10).
1.1.4 Spermos koncentracija
Nepaisant to, jog stambių gyvūnų reprodukcijoje kompiuterinės technologijos spermos koncentracijai skaičiuoti yra sėkmingos, smulkių gyvūnų reprodukcijoje nėra plačiai naudojamas dėl spermos skysčių dinamikos skirtingose kamerose, naudojamose CASA sistemoje. Šunų spermos koncentracijai skaičiuoti patikimiausiu standartu laikomas skaičiavimas hematocitometru (11). Dėl šunų veislių įvairovės ir didelių gyvūnų dydžio skirtumų spermos koncentracijos normos turi plačias ribas. Kai kurie mokslininkai teigia, jog bendras spermatozoidų kiekis ejakuliate turėtų būti ne mažiau kaip 300 milijonų, nors kai kurių mažos ar miniatiūrinės veislės vaisingų šunų spermoje randama iki 200 milijonų spermatozoidų. Kelių mokslininkų pastebėta, jog spermos koncentracija didžiausia būna maždaug 2-3 metų amžiaus šunims, o senstant progresiškai mažėja (12).
Mažesnis spermatozoidų skaičius ejakuliate yra laikomas oligospermija, o spermatozoidų nebuvimas spermoje yra laikomas azoospermija. Spermatozoidų skaičiaus mažėjimas spermoje galimas dėl dažno spermos ėmimo, kadangi yra išskiriami antsėklidyje subrendę spermatozoidai ir išnaudojami sukaupti rezervai (13). Azoospermija praktikoje aptinkama pakankamai dažnai ir jos pasireiškimui turi įtakos labai daug faktorių. Vienos priežasčių gali būti menko diagnostinio reikšmingumo - šuo neišskiria spermatozoidų, nes yra išsigandęs, nepatyręs, neseniai buvo imta sperma ar nebuvo pakankamos seksualinės stimuliacijos, ypač jei šalia nėra rujojančios kalės. Kitos priežastys galėtų būti suskirstytos į priešsėklidines, sėklidžių ar posėklidines (14). Priešsėklidinės
12 priežastys galėtų būti endrokrininiai sutrikimai, tokie kaip hipotiroidizmas, kušingo sindromas bei įvairios sėklidžių patologijos: kriptorchidizmas, sėklidžių hipoplazija, orchitas, trauma, sėklidžių neoplazijos. Posėklidinės priežastys būna susijusios su negalėjimu ejakuliuoti dėl sėklatakių obstrukcijos esant antsėklidžio aplazijai, antsėklidžio cistai. Kad galėtume diagnozuoti, jog šuo turi azoospermiją, reikėtų tirti spermą 3-4 kartus per porą dienų ir įsitikinti, jog šuo visiškai ejakuliavo (15). Tuo įsitikinti galime ištirdami spermos plazmos šarminę fosfatazę - visiškai ejakuliavusių šunų plazmoje šarminės fosfatazės koncentracija bus aukštesnė nei 5000 u/l (16). Azoospermija dažniau diagnozuojama grynaveisliams 3-7 metų amžiaus šunims, tokie šunys dažniausiai turėjo vieną ar kelias vadas šuniukų. Keliuose literatūros šaltiniuose paminėta, jog labradoro retriverių veislės šunims ši patologija pasitaiko dažniau nei kitų veislių šunims, ir yra pastebėta, jog ji genetiškai paveldima.
1.1.5 Spermatozoidų gyvybingumas
Spermatozoidų gyvybingumu laikomas membranos struktūrinis ir funkcinis vientisumas. Struktūrinis vientisumas yra nustatomas dažant spermatozoido išorinę membraną specialiais dažais - eozino nigrozino dažų mišiniu. Vientisa membrana nenusidažo, nes nėra pažeidimų, per kuriuos dažai galėtų įsiskverbti į membraną, pažeista membrana nusidažo rožine spalva. Funkcinis membranos vientisumas vertinamas hipoosmotinio rezistentiškumo testu (HOS), kurio metu spermatozoidai su vientisa membrana, patalpinti į hipoosmotinį tirpalą, išsipučia, įvyksta uodegėlės invaginacija. Spermatozoidai su pakitusia membrana bus nereaktyvūs šiam testui - ląstelė lieka nepakitusi (17). Šio testo metu įsitikinama, ar spermatozoido membrana geba palaikyti balansą tarp skirtingų aplinkos koncentracijų (18). Geros kokybės spermoje gyvų spermatozoidų turėtų būti bent 80 proc. (19). Esant mažesniam gyvų spermatozoidų skaičiui stipriai paveikiamas spermos gebėjimas apvaisinti kiaušialąstę (20).
13 1.1.6 Spermatozoidų morfologija
Spermatogenezė, priklausomai nuo šunų veislės, prasideda 6-8 mėnesių šunims ir pikąpasiekia 10-12 mėnesių. 5 mėnesių amžiaus šunims pradeda sparčiau vystytis sėkliniai kanalėliai, jau stebimas didėjantis spermatidų skaičius. Spermatogenezės laikotarpiu spermatogeninis epitelis kinta ir jo ciklas gali būti suskirstytas į 8 modifikacijos stadijas, kurios skirstomos pagal tai, kokios formos yra spermatidų branduoliai, kokia yra spermatidų ir spermatozoidų lokacija nuo bazinės membranos, spermatozoidų išskyrimo į kanalėlių spindį bei akrosominės sistemos vystymosi. Kiekviena iš šių stadijų trunka apie 14 d. (21,22). Visas spermatogenezės procesas vyksta vidutiniškai 60 d., nors amerikiečių pitbulių veislės šunims šis procesas trunka 55 - 57 d. (23). Spermiogenezės metu vyksta paprasto apvalaus spermatido transformacija iki spermatozoido, gebančio judėti ir apvaisinti. Šis procesas vyksta 5 etapais: akrosomos formavimasis; branduolio kondensacija; uodegėlės vystymasis; ląstelinių organelių, tokių kaip mitochondrija, centriolės, reorganizacija bei citoplazmos redukcija (24).
Vienas iš spermos kokybinių parametrų tyrimų yra morfologinis spermatozoidų tyrimas. Skaičiuojamas randamų patologinių galvučių ir uodegėlių skaičius ir išvedama fiziologiškai normalių spermatozoidų procentinė dalis (25). Geros kokybės spermoje morfologiškai normalių spermatozoidų kiekis turėtų būti didesnis nei 80 proc. visų skaičiuotų spermatozoidų (26). Šios patologijos gali būti skirstomos į pirmines, antrines ir tretines pagal tai, kuriame etape jos atsirado, arba didelio reikšmingumo ir mažo reikšmingumo defektus (25). Pirminės patologijos, tokios kaip galvutės formos pakitimai (angl. abnormal head), dviguba galvutė (angl. twin head), proksimaliniai lašeliai bei distaliniai lašeliai (angl. proximal and distal cytoplasmic droplets) ir po savimi susisukusi uodegėlė (angl. dag defect), atsiranda dar sėklinių kanalėlių epitelyje besiformuojant spermatozoidui (25,27). Antrinės patologijos atsiranda bręstant spermatozoidui antsėklidžio latakuose spermiogenezės metu, taip pat ilgo spermatozoidų buvimo patino lytiniuose takuose metu ar ejakuliacijos metu esant nenormaliai prostatos sekreto sudėčiai (25,28). Tokioms patologijoms priklauso uodegėlės apsisukimas aplink galvutę (angl. tail coiled around head), laisvos galvutės ir atsiskyrusios akrosomos. Tretinių patologijų rūšiai priklauso patologijos, atsiradusios dėl netinkamo spermos surinkimo, šaltos aplinkos temperatūros, mėginio kontaminacijos šlapimu, vandeniu ar netinkamo mėginio paruošimo tyrimams metu (25,27). Šios patologijos stebimos kaip galvutė be uodegėlės (angl. detached head), paprastai sulenkta uodegėlė (angl. simple bent tail) ir paprastai susisukusi uodegėlė (angl. simple coiled tail). Didelio reikšmingumo galvučių patologijos yra iš plazminės membranos išsiveržusi akrosoma, maža galvutė, didelė galvutė, vakuolės („krateriai“) galvutėje; uodegėlių defektai - per vidurį sulenkta uodegėlė, po savimi susisukusi uodegėlė ir proksimalinis lašelis. Šios patologijos neleidžia spermatozoidui atlikti savo funkcijos - neapvaisina
14 kiaušialąstės (20). Mažo reikšmingumo patologijos - spermatozoido galvutės, netekusios uodegėlių, distaliniai citoplazminiai lašeliai (29).
Nors kai kurie spermatozoidų defektų atsiradimo patofiziologiniai procesai iki šiol nėra aiškūs, mokslininkai bando išsiaiškinti pagrindinių patologijų, turinčių didelę reikšmę apvaisinimui, atsiradimą. Siauros spermatozoidų galvutės yra siejamos su didesne kapšelio temperatūra - eksperimentiškai sukelta kapšelio hipertermija per 6 - 24 mėnesius nuo 2 iki 10 proc. padidino siaurų spermatozoidų galvučių pasireiškimą spermoje (30). Manoma, jog makrocefalija atsiranda spermatogenezės pirmo ar antro mitotinio dalijimosi metu bei yra siejama su astenozoospermija (sumažėjusiu spermatozoidų judrumu) (31).
Didesnė procentinė dalis spermatozoidų su defektais yra randami patinų ejakuliate po ilgesnės seksualinės pertraukos, dėl ilgo spermatozoidų užsibuvimo antsėklidyje. Tačiau atliktuose tyrimuose pastebėta, jog mažesnė nei 6 savaičių pertrauka įtakos spermatozoidų kokybei nedaro (32).
1.1.7 Pašalinės ląstelės
Pašalinės ląstelės arba spermos citologija tiriama iš antros frakcijos bei gali būti tiriamas trečios frakcijos skystis. Kadangi šunų sperma natūraliai yra praskiesta prostatos skysčiu, dažnai iš visos spermos paruoštas tepinėlis gali būti neinformatyvus, todėl rekomenduojama spermą centrifuguoti ir sedimentus tirti mikroskopiškai (33). Taip pat siūloma, mikroskopuojant gryną spermą, skaičiuoti ląstelių skaičių šimtui spermatozoidų, tuomet ląstelių koncentracija spermos mėginyje skaičiuojama padauginant rastų ląstelių skaičių su spermos koncentracija bei gautą skaičių padalinant iš šimto (34). Antros frakcijos normalia citologija laikoma, jei randami 2 - 4 baltieji kraujo kūneliai per maksimalaus objektyvo padidinimo lauką (angl. hpf- high power field), raudonųjų kraujo kūnelių, epitelinių ląstelių bei bakterijų (12,35). Viename iš tyrimų, ištyrus 55 šunų spermos citologiją mikroskopiškai, sperma buvo apibūdinta kaip neuždegiminė, tačiau, atlikus spermos kultūrą, paaiškėjo, kad net 78 proc. šunų turėjo kliniškai reikšmingą aerobinių bakterijų, anaerobinių bakterijų bei mikoplazmų augimą. Taigi, spermos citologijos tyrimas neturėtų būti naudojamas kaip tyrimas, kuris lemia, ar reikia atlikti spermos kultūrą reprodukcinio ištyrimo metu (36).
1.1.8 Prostatinio skysčio pH
Prostatos skystyje randama citrinos rūgšties, kalcio, cinko ir įvairių fermentų, saugančių spermatozoidą, užtikrinančių spermatozoidų judrumo, išgyvenamumo bei apvaisinimo galimybes. Taip pat atrasta, jog prostatinis skystis veikia progesterono daromą įtaką akrosominei reakcijai (37). Sėklinant kales pageidaujama, jog sperma būtų sumaišyta kartu su bent šiek tiek prostatinio skysčio, nes atrasta, jog progresyvus judrumas padidėja daugiau negu 30 proc., įveikto kelio greitis taip pat viršija 30 proc. bei įveiktas kelias didėja daugiau negu 10 proc. (38).
15 Normalus šuns prostatos skysčio pH yra tarp 6,0 ir 7,4, vidutiniškai 6,5 - 6,8 (26). Studijose rekomenduoja rūgščių-šarmų pusiausvyrą (pH) nustatinėti iškart po spermos surinkimo bei naudoti pH-metrą, o ne pH juostelių metodą dėl galimai klaidingų pH rezultatų. Prostatinio skysčio pH nustatymas gali padėti nustatyti ne tik patino prostatos būklę, bet ir užkirsti kelią bakterijų perdavimui į patelės reprodukcinį traktą suradus stipriai šarminį prostatos skysčio pH (39).
1.2 Šunų spermos kokybę veikiantys faktoriai
1.2.1 Amžius
Nors didėjant šuns amžiui yra pastebėtas spermos kokybės mažėjimas, jų atsiradimo mechanizmai nėra iki galo išaiškinti ir diferencijuoti. Yra didelė tikimybė, kad patologinius-fiziologinius mechanizmus lemia keli veiksniai, susiję su amžiumi, tokie kaip nutukimas, priedinių liaukų disfunkcija, kraujagyslių ligos, lėtinės infekcijos, toksinų susikaupimas ir dar daug kitų priežasčių, kurios veikia sėklidžių ir antsėklidžio audinius ir sutrikdo spermatogenezę ir spermatozoidų brendimą (40). Senų šunų spermoje pastebimas didesnis spermatozoidų skaičius su proksimaliniais lašeliais bei asimetriškai prisitvirtinusi uodegėlė nei jaunų ar suaugusių šunų spermoje (41,42). Šios vidurinės dalies patologijos ypač svarbios apvaisinimui: in vitro atliktuose bandymuose pastebėta, jog tokie spermatozoidai negeba kapacituoti ir negali prisijungti prie oocito skaidriosios zonos (43).
1.2.2 Svoris
Studijose pastebėta tiesioginė koreliacija tarp šunų svorio bei bendro spermatozoidų skaičiaus ejakuliate, tačiau jų morfologinės – funkcinės savybės tarp veislių ir dydžių dar nėra tiksliai suprantamos (40,44). Vienoje didelėje studijoje pastebėta, kad yra stipri koreliacija tarp šuns svorio ir išskiriamo spermos kiekio bei stipri neigiama koreliacija tarp svorio ir progresinio judėjimo greičio (45). Taip pat nustatytas bendro spermatozoidų greičio sumažėjimas tarp didelių veislių šunų ir nutukusių šunų. Tam yra pateikiamos kelios priežastys. Padidėjęs kūno svoris (riebalų atsidėjimas sėklidėse) sumažina išgarinamo karščio kiekį sėklidės srityje, dėl to padidėja sėklidės vidinė temperatūra, neigiamai veikianti spermatogenezę. Kita priežastis galėtų būti ta, jog didelių veislių šunų spermatozoidų morfometrinai parametrai yra didesni, dėl to, kaip teigia Rijsselaere (45), spermatozoidai juda ne taip grakščiai ir ne taip greitai.
1.2.3 Veislė
Neseniai atliktose studijose buvo tirta septynių skirtingų veislių su gerai išreikštais skirtingais fenotipo bruožais spermatozoidų galvučių morfometriniai parametrai. Išanalizavus gautus duomenis, išskirti 4 dydžių bei 4 formų parametrai. Labiausiai informatyvūs parametrai, leidžiantys diferencijuoti skirtingų veislių šunų spermatozoidus, buvo šie: spermatozoido galvutės ilgis,
16 eliptiškumas bei išilgėjimas. Iš pasirinktų veislių (anglų buldogas, čihuahua, vokiečių aviganis, Labradoro retriveris, ispanų mastifas, Stafordšyro terjeras, Valencijos žiurkinis terjeras) labiausiai izoliuotos nuo grupės buvo anglų buldogo ir vokiečių aviganio veislės. Anglų buldogo spermatozoido galvos ilgis (5,59 µm), eliptiškumas ir išilgėjimas buvo mažiausi, o vokiečių aviganio spermatozoido galvos eliptiškumas ir išilgėjimas buvo didžiausi, nors galvos ilgis buvo vidutinis (5,86 µm), lyginant su kitomis veislėmis (46).
Kitoje studijoje, kurioje tirtos šešios skirtingos veislės (Stafordšyro bulterjerai, Labradoro retriveriai, ispanų mastifai, Valencijos žiurkiniai terjerai, anglų buldogai bei čihuahua), atrasta, jog taip pat didžiuliai skirtumai tarp veislių atsiranda lyginant spermatozoidų judėjimo parametrus, tokius kaip kreivinis greitis, judėjimo tiesia linija greitis, vidutinis įveikto kelio greitis ir kitus. Pavyzdžiui, Stafordšyro bulterjero veislės šunų spermatozoidai tiek tiesia, tiek kreiva linija plaukė greičiausiai, įveikto kelio greitis taip pat buvo didžiausias. Čihuahua veislės šunų spermatozoidai turėjo lėčiausiai judančius spermatozoidus iš visų tirtų veislių - net du kartus lėtesnius, lyginant visus rodiklius, už Stafordšyro bulterjero veislės šunų spermatozoidus (47). Manoma, jog tiek morfometrinių, tiek kinematinių parametrų skirtumai gali būti siejami su patelių lytinio trakto biologija, žinant, jog spermatozoidas turi išgyventi patelės lytiniame trakte, išlaikydamas savo energetinius resursus, ląstelės gyvybingumą ir gebėjimą apvaisinti (48).
1 lentelė. Skirtingų šunų veislių spermatozoidų galvučių morfometrinės vertės (46)
Veislė Spermatozoido
galvos ilgis (µm) Eliptiškumas (ilgis/plotis) ([ilgis-plotis]) / Elongacija ([ilgis+plotis]) Anglų buldogas 5,59±0,35 1,48±0,03 0,19±0,03 Čihuahua 5,90±0,31 1,61±0,15 0,23±0,04 Labradoro retriveris 5,84±0,30 1,60±0,11 0,23±0,03 Ispanų mastifas 5,95±0,27 1,58±0,10 0,22±0,03 Stafordšyro terjeras 6,07±0,29 1,64±0,14 0,24±0,04 Valencijos žiurkinis terjeras 6,10±0,44 1,68±0,16 0,25±0,06 Vokiečių aviganis 5,86±0,38 1,70±0,11 0,26±0,03 1.2.4 Mityba
Visavertis, subalansuotas pašaras daro didelę įtaką ne tik šuns bendrai sveikatos būklei, bet ir spermos kokybei. Norint maksimalizuoti veisiamų šunų spermos kokybę, rekomenduojama ne tik šerti aukščiausios kokybės pašarais, bet dar ir papildomai skirti maisto papildų: vitamino E, seleno, cinko, folio rūgšties bei polinesočiųjų riebalų rūgščių. 2019 metais atliktu tyrimu įrodyta, kad būtent toks kompleksas maisto papildų padidina ne tik spermos judrumą, progresyvų spermatozoidų judėjimą, bet ir kitus spermos kokybinius parametrus (49).
17
1.3 Kalių oogenezė
Kalių rujos periodas yra ilgas lyginant su kitomis gyvūnų rūšimis, be to, oocitai iškart po ovuliacijos nebūna visiškai subrendę ir dar nėra pasiruošę būti apvaisinti (50). Vienose studijose teigiama, jog apvaisinimui tinkami oocitai tampa tik praėjus dviem - trims dienoms po ovuliacijos (51). Kitoje studijoje minima, jog oocitai 2-oje metafazės stadijoje būna tik 109 valandas po ovuliacijos (52). Tam, kad suprastume, kodėl yra 2 d. laiko tarpas po ovuliacijos iki spermatozoido gebėjimo apvaisinti kiaušialąstę, reikia prisiminti kalių oogenezės stadijas (1 pav.) Mejozės metu pirmapradė gemalo ląstelė (2N) pereina per mitozę, kad suformuotų oogoniją (2N), kuri vėliau dalijasi mitozės metu ir suformuoja pirminį oocitą (2N). Mejozės profazės metu šie oocitai replikuojasi iki 4N ląstelių ir sustoja. Pirminiai oocitai dominantiniuose folikuluose yra sulaikomi, tai vadinama branduolių sulaikymu (angl. nuclear arrest) iki LH piko, kuris eliminuoja mejozės inhibitorius ir tuomet pirminis oocitas išleidžia pirmąjį polarinį kūną ir vėl tampa diploidine ląstele - šioje stadijoje jis vadinamas antriniu oocitu. Visose žinduolių rūšyse šioje stadijoje įvyksta ovuliacija ir antrasis polarinis kūnas yra išskiriamas, padarydamas antrinį oocitą į haploidinę (1N) ląstelę, kuri yra pasiruošusi susijungti su spermatozoidu ir suformuoti diploidinę zigotą.
Kalės yra unikalios tuo, jog, kitaip nei dauguma žinduolių, jos ovuliuoja pirminį oocitą, o ne antrinį, kuris vis dar turi praeiti mejozę, iki kol tampa antriniu oocitu, galinčiu prisijungti spermatozoidą (53). Ovuliacijos metu progesterono koncentracija būna daugiau kaip 16 nmol/l (54). Kai oocitas subręsta iki antrinio oocito, jis lieka vaisingas dar kelias dienas, anot kai kurių studijų, net iki 200 valandų po ovuliacijos (55). Mokslininkų teigimu, oocitas po ovuliacijos dar ilgai gali būti apvaisinamas, tačiau vaisingo periodo pabaiga ateina tuomet, kai progesterono koncentracijai kylant yra sukeliamas kaklelio užsivėrimas. Vaisingo periodo pradžioje progesterono koncentracija svyruoja apie 25 – 30 nmol/l, o pabaigoje būna apie 72 nmol/l, tačiau šis skaičius yra svarbus tik tuomet, jei kalė kergiama yra natūraliai ar dirbtinis sėklinimas atliekamas į kranialinę makšties dalį. Tokie būdai, kaip transcervikalinis sėklinimas ar operacinis sėklinimas, kuomet sperma yra tiesiogiai suleidžiama į gimdą, yra alternatyvūs kalių apvaisinimo būdai praėjus gerokai ilgesniam laikui po ovuliacijos (54,55).
Neteisingas vaisingo periodo pradžios nustatymas lemia neteisingą hipovaisingumo ar nevaisingumo diagnozės nustatymą. Šis faktas itin svarbus tuomet, kai yra vykdomas vienas kergimas ar sėklinimas bei sėklinant su šaldyta ar prastos kokybės sperma. Pakitimai, kurie vyksta kiaušidėse periovuliatoriniame periode, ir perėjimas iš rujos į porujį yra du svarbiausi reiškiniai sėkmingam kalių apvaisinimui. Šiuo metu šunų veisimo praktikoje yra naudojami du metodai, leidžiantys patikimai spręsti apie kalės vaisingo periodo pradžią, - tai makšties citologijos derinimas kartu su progesterono koncentracijos matavimu (56).
18 1.3.1 Progesterono svarba ir jo koncentracijos matavimas kraujo serume
Progesteronas žinduolių organizme yra vienas svarbiausių lytinių hormonų, nes jis svarbus ovuliacijai, vaikingumo įvedimui ir palaikymui, pieno liaukos vystymuisi bei seksualinio elgesio pasireiškimui (57). Neseniai atrasta, jog progesteronas taip pat atsakingas ir už spermatozoidų hiperaktyvaciją, chemotaksį ir akrosomos reakciją (54,58).
Progesterono koncentracijos nustatymas kraujo serume yra naudojamas ovuliacijos monitoringui, atvedimo laiko prognozavimui bei hipo-liuteoidizmo kontroliavimui. Norint pasiekti geriausio rezultato tiek natūraliai kergiant, tiek dirbtinai sėklinant kales, reikia tiksliai nustatyti ovuliacijos laiką bei laiką, tinkamą kergti ar sėklinti kales. Netikslus vaisingo periodo nustatymas yra
19 aprašytas kaip viena labiausiai pasireiškiančių kalių nevaisingumo priežasčių, ypač tuomet kai yra kergiama vieną kartą ar sėklinama su šaldyta sperma (35,59).
Vienoje didelio masto prospektyvioje studijoje įvertinta progesterono koncentracija kalių kraujo serume, kuri ovuliacijos metu buvo 15,26 ± 2,9 nmol/l – 22,9 ± 4,13 nmol/l (po LH piko praėjus 2 - 3 dienoms). Reikšmingo skirtumo tarp šių reikšmių, lyginant progesterono koncentracijas tarp skirtingų svorio kalių, nepastebėjo. Nors, didėjant kalių amžiui, progesterono koncentracijos profilis smarkiai nekito, pastebėta, jog, didėjant amžiui, vidutinė progesterono koncentracija pirmąją LH piko dieną padidėja vidutiniškai po 0,32 nmol/l (60).
Lyginant mažo ir didelio svorio kalių progesterono koncentraciją kraujo serume po LH piko, aptikta, jog didelio svorio kalių (20 - 40 kg) progesterono kilimas yra lėtesnis nei mažo svorio kalių (< 9kg) (61). Tačiau didesnės apimties tyrime aptikta, jog nei kūno svoris, nei veislė neturi įtakos progesterono koncentracijos kilimo greičiui (60). Vienas svarbesnių aptiktų veiksnių tame pačiame tyrime buvo, kad vados dydis buvo mažesnis kalių, kurios apvaisintos su šaldyta sperma ir kurių progesterono kreivė buvo lėtai didėjanti (3,9 ± 1,8 šuniukų vadoje), nei kalių, kurios apvaisintos šaldyta sperma, bet progesterono kreivė buvo sparčiai didėjanti (5,6 ± 3,1 šuniukų vadoje). Šių rodiklių statistinis patikimumas buvo p < 0,001 (60).
1.3.2 Sezoniškumo įtaka rujos trukmei
Tarprujo periodo ilgis yra reguliuojamas, kai kankorėžinė liauka išskiria melatoniną dėl šviesos poveikio, taip stimuliuodama gonadotropinio hormono išskyrimą (62). Nors yra priimta, jog dienos ilgis yra vienas pagrindinių faktorių, reguliuojančių daugelio gyvūnų rūšių, tarp jų ir Basendži veislės šunų veisimąsi, eksperimentinių ir tiriamųjų studijų metu su kitų veislių šunimis šis faktorius yra smarkiai kvestionuotinas. Keliose mažiau išsivysčiusių šalių studijose teigiama, jog dažnesnis rujos pasireiškimas pasitaiko vėlyvą rudenį ar žiemą laisvai besidauginančioms kalėms, kitose, kad ruja taip pat dažnai pasireiškia visais metų sezonais ir sezoniškumas neturi reikšmės rujos pasireiškimui (63,64). Labiau išsivysčiusiose šalyse, Anglijoje bei Velse, atliktose studijose pažymima, kad kalėms, laikomoms namuose, pastebėta sezono įtaka jų lytiniam ciklui – dažniausiai ruja pasireiškė vasario-gegužės mėnesiais (65). Viename didelės imties tyrime, atliktame Didžiojoje Britanijoje su kalėmis, gyvenančiomis namų sąlygomis, pastebėta, kad jokio statistiškai patikimo ryšio tarp metų laiko ir rujos laiko nėra, visų tirtų kalių ruja pasireiškė nepriklausomai nuo sezono ir pasireiškė proporcingai per visus metus (66).
20
2. METODIKA
2.1 Bandymų atlikimo schema
Šunų spermos mėginiai imti X klinikoje Kaune iš šunų, atvežtų sėklinimui ar profilaktiniam spermos tyrimui prieš kergimą ar sėklinimą, taip pat iš šunų, esančių X veislyne Kauno rajone, kur profilaktiškai kas pusę metų yra atliekami spermos tyrimai. Kalių progesterono koncentracijos kraujo serume nustatymui buvo paimtas kraujas kalėms, kurios buvo atvežtos į kliniką X prieš kergimą ar prieš intrauterinio sėklinimo atlikimą.
Tirti šunys buvo įvairių veislių bei įvairaus amžiaus, todėl buvo suskirstyti į skirtingas grupes: pagal svorį:
1) mažo svorio (<15 kg) (n = 7);
2) vidutinio svorio (15 - 40 kg) (n = 15); 3) didelio svorio (>40 kg) (n = 9);
21 bei pagal amžių:
1) jauni (6 - 24 mėn. (iki 2 m.) (n = 5)); 2) suaugę (25 - 84 mėn. (2 – 7 m.) (n = 18)); 3) seni (>84 mėn. (>7 m.) (n = 8)).
Iš viso tyrėme 18 skirtingų šunų (patinų) veislių: Labradoro retriveriai, Jorkšyro terjerai, auksaspalviai retriveriai, senasis anglų aviganis (bobteilas), vokiečių dogas, prancūzų buldogas, taksas, samojedas, Bordo dogas, Berno zenenhundas, dobermanas, akita, vokiečių aviganis, Maltos bišonas, Pomeranijos špicas, garbanotasis bišonas, bulmastifas bei Sibiro haskis.
Kalių progesterono koncentracijos tyrimo rezultatai buvo renkami klinikoje dvejus metus, atsižvelgiant į kalių vaisingo periodo pradžios laiką, rujos dieną bei kraujo mėginio ėmimo mėnesį. Tyrimui surinkta 69 kalių duomenys, daugiausia tyrime buvo Vakarų Škotijos terjerų (n = 8), vokiečių aviganių (n = 8), Jorkšyro terjerų (n = 6), vokiečių dogų (n = 4), Stafordšyro terjerų (n = 3) ir kitų veislių šunų.
2.2 Spermos mėginių tyrimas
2.2.1 Spermos mėginių ėmimas
Visi spermos mėginiai buvo paimti iš lytiškai ir fiziologiškai subrendusių šunų varpos ir bulbus
glandis digitalinės manipuliacijos metu. Patinams erekcijai sukelti buvo naudojamos rujojančios
kalės, kurios buvo pastatomos prieš juos, arba tamponėlis, su rujojančios kalės makšties ekskretu, kuris buvo duodamas patinams uostyti. Po sukeltos erekcijos atitraukiama apyvarpė ir prilaikoma už
bulbus glandis, ją lengvai masažuojant. Išskiriamos trys frakcijos (uretralinė, spermatinė ir prostatinė)
buvo surenkamos į tris skirtingus falkono tipo mėgintuvėlius su piltuvėliais iš „minitube“ kompanijos, kurie iki pat rinkimo buvo laikomi 37° temperatūroje (67).
2.2.2 Spermos mėginių tyrimas
Iškart po mėginioėmimo X klinikos laboratorijoje tirtas išskirtas kiekis, visų išskirtų frakcijų spalva bei antroje frakcijoje esančių spermatozoidų judrumas. Kiekis ir spalva tirti apžiūrint sugraduotą mėgintuvėlį. Spermatozoidų judrumas iškart po spermos ėmimo vertinamas klinikoje ar veislyne ant pašildyto objektinio stiklelio užlašinus ką tik paimtos antros frakcijos spermos bei uždengus dengiamuoju stikleliu ir mikroskopuojant 40 padidinimo objektyvu su šviesiniu mikroskopu. Judrumas vertinamas procentais. Spermatozoidų gyvybingumas, spermos koncentracija, uodegėlių, galvučių patologijos, pašalinės ląstelės bei trečios spermos frakcijos pH nustatytasLSMU Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje.
22 2.2.3 Spermatozoidų gyvybingumas
Spermatozoidų gyvybingumui nustatyti ant objektinio stiklelio buvo dedamas lašas eozino-nigrozino dažų ir lašas antros frakcijos turinio, sumaišoma pipete ir paskleidžiama per visą objektinį stiklelį. Leidus mėginiui nudžiūti, dedamas lašas imersinio aliejaus ir mikroskopuojama su fazės kontrasto mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija) su 100 padidinimo objektyvu. Skaičiuojama šimtas spermatozoidų, kurie skirtingai nusidažo, priklausomai nuo to, ar jų membrana pažeista, ar ne (68). Sveiką, vientisą membraną turinčių spermatozoidų galvutė bei uodegėlė nenusidažo ir lieka baltos spalvos tamsiame nigrozino dažų fone, o spermatozoidai, turintys suardytą membraną, nusidažo rožine spalva. Iš šimto spermatozoidų išvedama gyvų spermatozoidų su nepažeista membrana procentinė dalis (39).
2.2.4 Spermos koncentracija
Spermos koncentracijai nustatyti imama 10 mikrolitrų (μl) antros frakcijos bei 90 mikrolitrų (μl) buferinio formalino tirpalo ir sumaišoma ependorfo mėgintuvėlyje. Sumaišius imamas lašas tirpalo ir dedamas į hematocitometrinę “Neubauer” kamerą. Leidžiama spermatozoidams nusėsti ir po 5 minučių mikroskopuojama naudojant fazės kontrasto mikroskopą (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija) su 10 – 20 padidinimo objektyvais. Skaičiuojamas spermatozoidų skaičius, esantis pasirinktuose 5 dideliuose kvadratuose – iš viso 80 mažų langelių. Skaičiuojama tik spermatozoido galvutė, jei matoma atskira spermatozoido uodegėlė, ji neįtraukiama į galutinį skaičių (26). Spermos koncentracija apibūdinama spermatozoidų skaičiumi viename spermos mililitre.
Spermatozoidų koncentracija nustatoma pagal formulę: K = S × P × 5 ×10 × 1000
K – spermatozoidų koncentracija viename mililitre, S – spermatozoidų skaičius 80 - tyje mažų kvadratėlių, P – praskiedimo laipsnis,
5 – koeficientas, nes spermatozoidai buvo skaičiuoti penkių 0,2 mm 2 kameros ploto, 10 – daugiklis, nes kameros gylis yra 0,1 mm.,
1000 – daugiklis naudojamas norint spermatozoidus perskaičiuoti į 1 ml. 2.2.5 Spermatozoidų uodegėlių morfologija
Šunų, kurie naudojami veisimui ir jų sperma yra laikoma kokybiška, morfologiškai normalių spermatozoidų ejakuliate turėtų būti 80 proc. ir daugiau (20). Uodegėlių patologijoms nustatyti naudojamas tas pats spermos ir buferinio formalino tirpalas. Paruošiamas šlapias preparatas, užlašinamas lašas tirpalo ant objektinio stiklelio, dengiama dengiamuoju stikleliu. Leidžiama preparatui nusistovėti porą minučių, kad spermatozoidai nusėstų, ir mikroskopuojama su fazės
23 kontrasto mikroskopu 20 padidinimu. Skaičiuojama 200 spermatozoidų, iš jų aptikti spermatozoidai su uodegėlių patologijomis yra išreiškiami procentine išraiška nuo visų suskaičiuotų spermatozoidų bei apskaičiuojamas bendras patologinių uodegėlių skaičius ir išreiškiamas procentais (69).
2.2.6 Spermatozoidų galvučių morfologija
Galvučių patologijų nustatymui yra imamas lašas anilino dažų, dedamas ant objektinio stiklelio, taip pat imamas didelis lašas antros frakcijos spermos ir sumaišomas su ant objektinio stiklelio esančiais anilino dažais bei paskleidžiama ant objektinio stiklelio. Leidus nudžiūti ir užlašinus lašą imersinio aliejaus mikroskopuojama su 100 padidinimo objektyvu fazės kontrasto mikroskopu. Skaičiuojama 500 galvučių ir rastų atskirų patologinių galvučių skaičius, visų patologinių galvučių skaičius išreiškiamas procentais (69).
2.2.7 Spermos pašalinių ląstelių skaičiavimas
Pašalinių ląstelių skaičiavimams ant objektinio stiklelio buvo paskleidžiamas didelis lašas antros frakcijos spermos ir leidus nudžiūti dažomas Diff-Quik metodu (4). Iš pradžių preparatas fiksuojamas su fiksažo tirpalu, laikant jame preparatą 10 sekundžių, leidžiama preparatui nudžiūti, dažoma su eozino buferiniu tirpalu, laikant 10 sekundžių, vėl leidžiama nudžiūti ir galiausiai preparatas laikomas 5 sekundes buferiniame tiazino dažų tirpale. Išėmus praplaunama su distiliuotu vandeniu ir leidžiama nudažytam preparatui nudžiūti. Ant preparato dedamas imersinio aliejaus lašas ir mikroskopuojama su fazių kontrasto 100 padidinimo objektyvu. Mikroskopuojant pasižymima, kokio tipo ląstelių rasta, tačiau jų kiekis neskaičiuojamas (70).
2.2.8 Prostatos pH
Trečios frakcijos pH buvo nustatomas LSMU reprodukcijos laboratorijoje esančiu pH-metru Fisherbrand™ accumet™ AB150 pH Benchtop Meters, ThermoFisher. Ph-metras praplaunamas distiliuotu vandeniu ir jutiklis panardinamas į mėgintuvėlį su trečia spermos frakcija. Rezultatas vertinamas, kuomet pH vertė stabilizuojasi.
2.3 Kalių progesterono tyrimas
Progesterono kiekio kraujo serume nustatymui buvo paimtas kraujas kalių, kurios buvo atvestos į kliniką prieš kergimą ar prieš intrauterinio sėklinimo atlikimą. Kraujas imtas iš paviršinės kojos kraujagyslės v.cephalica į mėgintuvėlį su raudonu dangteliu, prieš centrifugavimą leidžiama nusistovėti ir susiformuoti kraujo krešuliui. Centrifuguojama 2500 aps/min. 5 - 10 minučių. Iškart po to atskiriamas kraujo serumas ir patalpinamas į ,,Beckman Coulter Inc. Access 2 Immunoassay Analyzer’’ analizatorių. Gauti rezultatai interpretuojami pagal žinomą lytinio ciklo dieną. Vertinome
24 kalių vaisingo periodo pradžios dieną nuo rujos pradžios skirtingais metų laikais, norėdami išsiaiškinti, ar metų laikas turi įtakos vaisingo periodo pradžios laikui.
2.4 Statistinė duomenų analizė
Tiek spermos kokybinių ir kiekybinių rezultatų duomenys, tiek progesterono koncentracijos duomenys analizuoti naudojant SPSS (angl. Statistical Package for Social Science) programos 26.0 versiją. Duomenų analizavimui buvo naudoti aprašomosios statistikos metodai (vidurkiai bei jų paklaidos), vidurkių skirtumų tarp amžiaus bei svorio grupių nustatymui naudota daugiafaktorinė dispersinė analizė (angl. ANOVA), imčių vidurkiai vertinti pagal Fišerio LSD (angl. Least Significant
Differrence) kriterijus. Rezultatų koreliaciniai ryšiai nustatyti naudojant Pearson‘o koreliacijos
koeficientą. Statistiškai reikšminga laikoma, kai p<0,05. Gauti statistinės analizės duomenys buvo vaizduojami grafiškai naudojant Microsoft Office Professional Plus Excel 2016 programą.
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Tyrimo apimtis
Tirti patinai buvo suskirstyti į tris grupes pagal svorį: mažų šunų tyrime dalyvavo 7 šunys, vidutinio dydžio šunų – 15, o didelių šunų – 9 - bei pagal amžių: jaunų šunų grupėje tyrime dalyvavo 5 šunys, suaugusių šunų grupėje - 18 šunų, senų šunų – 8. Tyrimais išsiaiškinti spermos kokybę lemiantys rodikliai, kurie statistiškai palyginti tarp amžiaus bei svorio grupių.
3.2 Šunų spermos kokybės nustatymas tarp skirtingų svorio grupių
Suskaičiavę tyrime dalyvavusių šunų skaičių pagal skirtingas svorio grupes, nustatėme, kad didžiausia imtis buvo vidutinio svorio šunų grupėje - 48,4 proc. (n = 15), mažiausia imtis mažo svorio šunų grupėje - 22,6 proc. (n = 7). Didelių šunų grupėje imties dydis - 29,0 proc, (n = 9) (4 pav.).
0,5 1,3 2,8 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
mažo vidutinio didelio
A ntro s f ra kc ijo s tū ris (m l)
Šunų svorio grupės 7 15 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16
mažo vidutinio didelio
Šunų s
ka
ič
ius
Šunų svorio grupės
4 pav. Tyrime dalyvavusių šunų pasiskirstymas pagal svorio grupes
26 Savo darbe, tirdami antros spermos frakcijos pH, nustatėme šios reikšmės vidurkį iš visų tirtų šunų (n = 31), kuris buvo 1,5 ± 0,21 ml, o didžiausias antros frakcijos tūris buvo pastebėtas didelio svorio šunų grupėje (2,8 ± 0,31 ml), mažiausias antros frakcijos tūris pastebėtas mažo tirtų šunų svorio grupėje (0,5 ± 0,52 ml). Tarpusavyje lyginant antros frakcijos spermos tūrį tarp šunų svorio grupių yra statistiškai patikimas skirtumas (p<0,05), kad mažo svorio grupėje esančių šunų antros frakcijos tūris bus mažesnis nei vidutinio svorio grupės šunų ir statistiškai patikima (p<0,01), kad mažo svorio grupėje esančių šunų antros frakcijos spermos tūris bus mažesnis nei didelio svorio grupės šunų antros spermos frakcijos tūris (5 pav.).
Ištyrę trijų skirtingų svorio grupių šunų spermos koncentraciją bei spermatozoidų judrumą, stebime vidutinę spermos koncentraciją 344,14 ± 45,4 x 106/ml spermos, didžiausia spermos koncentracija pastebėta vidutinio svorio šunų grupėje (446,93 ± 80,6 x 106/ml), o mažiausia koncentracija pastebėta didelio svorio šunų grupėje, kurioje vidutinė spermos koncentracija buvo 237,0 ± 53,6 x 106/ml. Vidutinio svorio šunų grupėje spermos koncentracijos vidurkis buvo net 41,4 proc. didesnis nei mažo svorio šunų spermos koncentracijos vidurkis bei 46,97 proc. didesnis už didelio svorio šunų grupės spermos koncentracijos vidurkį. Šių rodiklių skirtumas buvo statistiškai patikimas (p<0,05). Spermatozoidų judrumo vidurkis nepriklausomai nuo svorio grupės buvo 62,74 ± 3,3 proc., didžiausias spermatozoidų judrumas buvo vidutinio svorio grupės šunų (64,67 ± 5,4 proc.), mažiausias spermatozoidų judrumas buvo mažo svorio grupės šunų (59,29 ± 6,8 proc.), (6 pav.). Šie vidurkiai nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05).
261,86 446,93 237,00 59,29 64,67 62,22 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 100 200 300 400 500
mažo vidutinio didelio
Spe rm at oz oi dų j udr um as (pr oc .) Sp er m os ko ncen traci ja (x10 6/m l)
Šunų svorio grupės
koncentracija judrumas
6 pav. Spermos koncentracijos bei spermatozoidų judrumo pasiskirstymas skirtingose šunų svorio
27 Nors skirtumas tarp skirtingų svorio grupių šunų lyginant spermoje esančių spermatozoidų galvučių ir uodegėlių patologijas nebuvo statistiškai patikimas (p>0,05), vidutiniškai patologinių galvučių rasta 21,9 ± 3,2 proc., o uodegėlių rasta 32,5 ± 2,9 proc. Daugiausiai spermatozoidų patologinių galvučių rasta mažo svorio grupės šunų spermoje (28,5 ± 8,4 proc.), tai yra net 38,9 proc. daugiau nei didelio svorio grupės šunų spermoje (17,4 ± 3,1 proc.). Patologinių uodegėlių, atvirkščiai nei galvučių, daugiausiai rasta didelio svorio šunų grupėje (35,8 ± 7,3 proc.), tai yra 34,1 proc. daugiau nei mažo svorio šunų grupėje rastų patologinių spermatozoidų uodegėlių (23,6 ± 4,6 proc.) (p>0,05) (7 pav.). 28,5 21,4 17,4 23,6 34,6 35,8 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0
mažo vidutinio didelio
Spe rm at oz oi dų pa tol goi jos (pr oc .)
Šunų svorio grupės
galvučių uodegėlių 5,1 15,9 25,8 12,1 12,2 17,3 52,3 18,1 25,1 12,7 27,5 26,2 55,9 22,0 4,9 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0
mažo vidutinio didelio
Pa tol ogi ni ų ga lvuč ių ska ič us
Šunų svorio grupės
nenormalių kontūrų kriaušės formos siaura galvutė siauro pagrindo laisvos galvutės
7 pav. Spermatozoidų patologijų pasiskirstymas skirtingų svorio grupių šunų tarpe
28 Tarp tirtų skirtingų svorio grupių aiškiai galima išskirti, kurių spermatozoidų galvučių patologijų pasitaikė daugiausiai mažo svorio šunų grupėje – laisvų spermatozoidų galvučių 55,9 ± 29,9, kurių didelio svorio šunų grupėje pasitaikė mažiausiai (4,9 ± 2,3) – 91,2 proc. mažiau nei mažo svorio šunų grupėje, šis skirtumas tarp šių svorio grupių buvo statistiškai patikimas (p<0,05) lygmeniu (8pav.).
Lyginant patologinių uodegėlių skaičiaus pasiskirstymą tarp skirtingų svorio grupių, stebime, jog paprastai susisukusių uodegėlių rasta daugiausiai visose svorio grupėse, didelio svorio šunų grupėje rastas didžiausias jų skaičius (24,4 ± 6,4), vidutinio svorio grupėje šiek tiek mažiau (23,5 ± 4,3) ir skirtumas tarp vidutinio svorio šunų grupėje rastų bei mažo svorio šunų grupėje rastų paprastai susisukusių uodegėlių skaičiaus (10,9 ± 3,8) buvo statistiškai patikimas (p<0,05) lygmeniu – 53,6 proc. daugiau rasta vidutinio svorio nei mažo svorio grupėje. Visose svorio grupėse mažiausiai rasta asimetriškai prisitvirtinusių uodegėlių (9pav.).
9,7 2,2 2,7 11,1 9,1 9,2 4,9 13,1 9,0 10,9 23,5 24,4 10,1 20,7 22,9 1,4 4,3 2,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0
mažo vidutinio didelio
Pa tol ogi ni ų uode gė lių ska ič ius
Šunų svorio grupės
proksimaliniai lašeliai distaliniai lašeliai
nenormali vidurinė dalis paprastai susisukusi uodegėlė
po galvute susisukusi uodegėlė asimetriškai prisitvirtinusi uodegėlė
29 Stebint patologinių uodegėlių pasiskirstymą spermos mėginyje pagal šunų svorį, stebima teigiama koreliacija: didėjant svoriui, didėja ir patologinių uodegėlių procentinė dalis spermos mėginyje. Nors ši koreliacija rodo tik vidutiniškai stiprų ryšį tarp šių rodiklių (r = 0,437), ji yra statistiškai patikima (p<0,05) lygmeniu (10 pav.).
30
3.3 Šunų spermos kokybės nustatymas tarp skirtingų amžiaus grupių
Mūsų tyrime dalyvavo įvairaus amžiaus šunų, iš jų jaunų šunų amžiaus grupėje buvo 16,1 proc. šunų, suaugusių šunų amžiaus grupėje tirta 58,1 proc. šunų, iš senų šunų amžiaus grupės buvo tirta 25,8 proc. šunų (11pav.).
0,760 1,878 1,313 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
jauni suaugę seni
A ntro s s pe rm os fra kc ijo s tū ris (m l)
Šunų amžiaus grupės
5 18 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
jauni suaugę seni
Tyr im e da lyva vus ių šunų s ka ič ius
Šunų amžiaus grupės
11 pav. Tyrime dalyvavusių šunų pasiskirstymas pagal svorio grupes
31 Tirdami antros spermos frakcijos tūrį skirtingose šunų amžiaus grupėse, nustatėme, kad vidutiniškai tarp trijų tirtų amžiaus grupių 2 frakcijos tūris buvo 1,5 ± 0,2 ml, didžiausias tūris buvo suaugusių amžiaus grupėje esančių šunų spermoje - 1,9 ± 0,3 ml, net 59,4 proc. daugiau nei jaunų šunų amžiaus grupėje, kur buvo mažiausias tūris - 0,8 ± 0,3 ml. Šie duomenys nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05) (12 pav.).
Ištyrus skirtingo svorio šunų grupes atsižvelgiant į spermos koncentraciją, paaiškėjo, kad didžiausia koncentracija buvo suaugusių šunų amžiaus grupėje - 387,4 ± 73,5 x 106/ml, kuri lyginant su jaunų šunų amžiaus grupės spermos koncentracija buvo 34,5 proc. didesnė už jaunų šunų grupėje esančių šunų spermos koncentraciją - 253,8 ± 19,3 x 106/ml. Šie skirtumai tarp koncentracijos skirtingų šunų amžiaus grupių nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05). Tačiau, lyginant spermatozoidų judrumą, didžiausias jis buvo jaunų šunų amžiaus grupėje (69,0 ± 3,3 proc.) ir buvo didesnis 33,9 proc. už senų amžiaus grupėje esančių šunų spermatozoidų judrumą (45,63 ± 4,9 proc.). Šie skirtumai tarp skirtingų amžiaus grupėje esančių šunų spermatozoidų judrumo buvo statistiškai patikimi (p<0,05) lygmeniu (13 pav.). 253,80 387,39 303,50 69,00 68,61 45,63 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00
jauni suaugę seni
Spe rm at oz oi dų j udr um as (pr oc .) Sp er m os ko ncen traci ja (x10 6/m l)
Šunų amžiaus grupės
Koncentracija Judrumas
13 pav. Spermos koncentracijos bei spermatozoidų judrumo pasiskirstymas tarp skirtingų amžiaus
32 Taip pat pastebėjome, jog spermatozoidų judrumas neigiamai koreliuoja su šunų amžiumi, ši koreliacija rodo vidutiniškai stiprų (r = 0,694) ryšį tarp spermatozoidų judrumo ir svorio. Didėjant amžiui, mažėja šunų spermatozoidų judrumas. Ši koreliacija yra patikima (p<0,01) lygmeniu.
29,6 18,4 24,8 25,5 36,7 27,3 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0
jauni suaugę seni
Spe rm at oz oi dų pa tol ogi jos (pr oc .)
Šunų amžiaus grupės
galvutės uodegėlės
14 pav. Spermatozoidų judrumo koreliacija su šunų amžiumi
33 Nors skirtumas tarp skirtingų amžiaus grupių lyginant spermoje esančių spermatozoidų galvučių ir uodegėlių patologijas nebuvo statistiškai patikimas, vidutiniškai patologinių galvučių rasta 21,9 ± 3,2 proc., o uodegėlių rasta 32,5 ± 2,9 proc. Daugiausiai spermatozoidų patologinių galvučių rasta jaunų šunų spermoje (29,6 ± 13,4 proc.), o mažiausiai – suaugusių šunų spermoje (18,4 ± 2,9 proc.). Patologinių uodegėlių, atvirkščiai nei galvučių, daugiausiai rasta suaugusių šunų grupėje (36,7 ± 3,8 proc.), o mažiausiai jaunų šunų (25,5 ± 9,5). Senų šunų spermoje, atvirkščiai nei jaunų bei suaugusių, daugiau rasta patologinių uodegėlių (27,3 ± 3,4) nei galvučių (24,8 ± 6,6). Šie skirtumai nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05) (15 pav.).
Ištyrę dažniausiai pasitaikiusias spermatozoidų galvučių patologijas tarp skirtingų amžiaus grupių šunų, pastebėjome, jog yra didelis skirtumas lyginant patologijas toje pačioje amžiaus grupėje bei tarp amžiaus grupių. Daugiausiai jaunų šunų grupėje buvo siaurų spermatozoidų galvučių (61,0 ± 32,0), suaugusių šunų amžiaus grupėje siaurų galvučių pasitaikė 74,3 proc. mažiau (15,67 ± 8,8) nei jaunų šunų grupėje. Šių galvučių patologijų skirtumas tarp jauno amžiaus bei suaugusių amžiaus grupių yra statistiškai patikimas (p<0,05) lygmeniu. Suaugusiųjų grupėje daugiausiai rasta siauro pagrindo spermatozoidų (35,78 ± 11,8), nors šis skirtumas tarp siauro pagrindo galvučių pasiskirstymo jaunų bei suaugusiųjų grupėje nebuvo reikšmingas (p>0,05), jų suaugusiųjų šunų grupėje buvo 80,4 proc. daugiau nei jaunų šunų grupėje. Mažiausiai šioje grupėje buvo rasta nenormalių kontūrų galvučių (10,33 ± 2,2), skirtumas tarp nenormalių kontūrų galvučių lyginant
7,00 35,78 7,38 61,00 15,67 34,50 17,80 13,06 15,63 52,80 10,33 10,38 21,60 13,17 52,50 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00
jauni suaugę seni
G al vuč ių pa tol ogi jų ska ič ius
Šunų amžiaus grupės
siauro pagrindo siaura galvutė kriaušės formos nenormalių kontūrų laisvos galvutės
34 suaugusiųjų bei jaunų šunų grupę buvo statistiškai patikimas (p<0,05) ir buvo mažesnis už jaunų šunų grupėje rastą rezultatą - 80,4 proc. Senų šunų grupėje stebėjome atvirkštinį pasiskirstymą – didžiausias buvo laisvų galvučių skaičius (52,5 ± 46,8) bei, lyginant suaugusiųjų šunų grupėje ir senų šunų grupėje rastų laisvų galvučių skaičių, skirtumas buvo patikimas (p<0,05) lygmeniu ir jų rasta net 74,9 proc. daugiau nei suaugusiųjų šunų grupėje (16 pav.).
Lygindami spermatozoidų patologinių uodegėlių skaičiaus pasiskirstymą tarp skirtingų amžiaus grupių, stebime, kad daugiausiai visose amžiaus grupėse rasta paprastai susisukusių uodegėlių - 20,9 ± 3,0. Mažiausiai tiek jaunų šunų grupėje (4,2 ± 1,6), tiek suaugusiųjų (1,5 ± 0,4) rasta proksimalinių lašelių, tačiau rastas statistiškai patikimas skirtumas (p<0,01) tarp suaugusiųjų grupės ir senų šunų grupės (9,6 ± 4,6): senų šunų grupėje net 84,4 proc. daugiau proksimalinių lašelių nei suaugusiųjų šunų grupėje (17 pav.).
4,2 7,6 1,5 9,6 8,8 12,5 6,6 12,6 6,4 16,0 25,1 14,6 14,2 23,7 11,3 4,6 2,0 4,3 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0
jauni suaugę seni
Spe rm at oz oi dų pa tol ogi ni ų uode gė lių sk ai či us
Šunų amžiaus grupės
proksimaliniai lašeliai distaliniai lašeliai
nenormali vidurinė dalis paprastai susisukusi uodegėlė
po galvute susisukusi uodegėlė asimetriškai prisitvirtinusi uodegėlė
35 Vidutinis prostatinio skysčio pH tarp visų amžiaus grupių buvo 6,72 ± 0,07, didžiausias prostatinio skysčio pH buvo seno amžiaus grupėje esančių šunų (7,05 ± 0,16), o mažiausias buvo jauno amžiaus grupėje esančių šunų (6,5 ± 0,08). Senų šunų prostatos pH yra 7,8 proc. didesnis nei jaunų šunų - šie duomenys yra statistiškai patikimi (p<0,05) lygmeniu (18 pav.).
3.4 Kalių rujos dinamikos tyrimai
Iš mūsų tirtų kalių skaičiaus vidutiniškai kas mėnesį rujojo 7,45 ± 2,8 kalių, mažiausiai kalių rujojo žiemos mėnesiais – išskirtinai mažai vasario mėnesį – tik viena kalė, daugiausiai kalių rujojo vasaros mėnesiais, ypač daug birželio mėnesį – 12 kalių bei rudens mėnesiais, išskirtinai rugsėjo
6,50 6,63 7,05 6,00 6,20 6,40 6,60 6,80 7,00 7,20 7,40
jauni suaugę seni
Pr os ta tos skys či o pH
Šunų amžiaus grupės
4 1 2 2 5 12 8 8 10 5 7 5 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ruj oj us ių ka lių ska ič ius Mėnuo
18 pav. Prostatos skysčio pH reikšmės pasiskirstymas tarp skirtingų šunų amžiaus grupių
36 mėnesį rujojo 10 kalių. Birželio mėnesį kalių rujojo 91,6 proc. daugiau nei vasario mėnesį. Statistinio patikimumo tarp šių duomenų skirtumo nepastebėta (p>0,05) (19 pav.).
Vidutiniškai, nepriklausomai nuo mėnesio, vaisingas periodas kalėms prasideda maždaug 10,23 ± 0,35 rujos dieną. Anksčiausiai vaisingas periodas prasidėjo kalėms, kurios rujoti pradėjo kovo mėnesį (7 ± 0,5) rujos dieną, vėliausiai vaisingas periodas prasidėjo kalėms, kurios pradėjo rujoti rugsėjo mėnesį (13 ± 1,5) rujos dieną. Rugsėjo mėnesį kalių vaisingas periodas prasidėjo 46,2 proc. vėliau nei kovo mėnesį. Statistinio patikimumo tarp šių skirtumų nepastebėjome (p>0,05) (20 pav.).
12 10 7 10 12 10 11 9 13 10 9 9 0 2 4 6 8 10 12 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ruj os di ena Mėnuo
37
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Vertinant šunų reprodukciją visi faktoriai yra svarbūs. Mes savo tyrimuose didesnį dėmesį kreipėm į įvairių šunų veislių amžių ir svorį, tai siedami su jų spermos kokybe. Išskiriamos spermos tūris priklauso ne tik nuo sėklidžių dydžio, bet ir nuo šunų amžiaus. Nors mūsų tyrimo imtis buvo nedidelė, bet pakankama statistiniam vertinimui. Savo tyrimuose nustatėme statistiškai reikšmingus rezultatus lyginant antros šunų spermos frakcijos tūrį tarp skirtingų svorio grupių – didžiausias tūris nustatytas didelio svorio šunų grupėje. Moksliniais tyrimais įrodyta, jog antros spermos frakcijos tūris teigiamai koreliuoja su šunų sėklidžių dydžiu, o šis priklauso nuo šuns svorio (71). Taip pat literatūroje teigiama, jog kiekvieno šuns didžiausias antros frakcijos tūris būna 2 – 3 metų amžiuje (5). Tiriant antros frakcijos tūrį tarp skirtingų amžiaus grupių statistiškai reikšmingų skirtumų nepastebėjome, gal tai lėmė didelis amžių skirtumas pačiose grupėse (suaugusių šunų grupei priklausė šunys nuo 2 iki 7 metų).
Analizuodami spermos koncentraciją, statistiškai reikšmingą skirtumą pastebėjome tirdami skirtingo svorio šunų grupes – vidutinio svorio grupėje spermos koncentracija mililitre buvo didžiausia ir skyrėsi nuo mažo svorio grupės šunų bei nuo didelio svorio šunų (p<0,05). Viename iš didelės imties mokslinių tyrimų, kuriame buvo analizuojama, ar svoris ir amžius turi įtakos spermos kokybiniams rodikliams, nebuvo pastebėta, kad svoris daro įtaką spermos koncentracijai mililitre spermos, tačiau statistiškai reikšmingi rezultatai, gauti analizuojant bendrą spermatozoidų skaičių spermoje, rodo, kad didžiausias jų kiekis rastas didelio svorio šunų grupėje ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo mažo svorio grupės (5). Nors ir mūsų tyrime gauti statistiškai patikimi rezultatai lyginant vidutinio svorio šunų grupę su didelio svorio šunų grupe, tačiau atsižvelgiant į atliktus kitų autorių mokslinius tyrimus, didžiausias spermos kocentracijos skaičius stebimas didelio svorio šunų grupėje, kadangi jų sėklidžių dydis ir svoris yra didžiausias. Savo tyrime neužfiksavome, ar didelis šuns svoris yra atsiradęs dėl nutukimo, ar toks jo svoris turėtų būti fiziologiškai bei ar tiriami šunys neturėjo kitų veiksnių, darančių įtaką spermatozoidų išskyrimui. Šios priežastys galėtų paaiškinti, kodėl savo tyrime analizuotų didelio svorio šunų spermoje neužfiksavome didžiausios spermos koncentracijos. Analizuodami spermatozoidų judrumą, nustatėme, kad statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi jaunų ir senų šunų grupėse esančių šunų spermatozoidų judrumas bei pastebėjome neigiamą koreliaciją (r = -0,69) tarp spermatozoidų judrumo ir šunų amžiaus. Mokslinių tyrimų metu rasta statistiškai reikšminga neigiama koreliacija tarp šunų amžiaus ir vidutinio spermatozoidų įveikto kelio greičio (72). Nors savo tyrimo metu šio rodiklio neskaičiavome, tačiau, analizuojant spermatozoidų judrumą subjektyviai, senų šunų grupėje rastas 34 proc. mažesnis spermatozoidų judrumas nei jaunų šunų grupėje. Kadangi tarp senų šunų yra dažnesni nutukimai, įvairios sisteminės ligos, šarmingesnis spermos pH, todėl yra daugiau veiksnių, kurie gali daryti įtakos spermatozoidų
