LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Laura Babonytė

Kampilobakterijų paplitimas importuotoje vištienoje The prevalence of Campylobacter spp. in imported chicken

Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: dr. Sigita Ramonaitė, Maisto saugos ir kokybės katedra

2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kampilobakterijų paplitimas importuotoje vištienoje“

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-04-28 Laura Babonytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-04-21 Aistė Zigmantaitė

(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-04-22 dr. Sigita Ramonaitė

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

3 Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Prof. Dr. Mindaugas Malakauskas

(aprobacijos data) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

4

TURINYS

1.2. Kampilobakterijų paplitimas paukštienoje Europoje ... 11

1.2.1. Kampilobakterijų paplitimas Lenkijoje ... 13

1.3. Sergamumas kampilobakterioze Europoje ... 13

1.3.1. Sergamumas kampilobakterioze Lenkijoje ... 16

1.4. Kampilobakterijų virulentiškumo veiksniai ... 16

1.4.1. Judrumas ... 16

1.4.2. Prisitvirtinimas prie žarnyno ląstelių ... 17

1.4.3. Invazija ... 17

1.4.4. Toksinų gamyba ... 18

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI…….………..19

2.1. Tyrimo eiga ir metodai ... 19

2.1.1. Kampilobakterijų išskyrimas ... 20

2.1.2. DNR išskyrimas ... 21

2.1.3. Kampilobakterijų identifikavimas naudojant dauginį PGR metodą ... 21

2.1.4. PGR produktų elektroforezė ... 22

2.1.5. Virulentiškumo genų identifikavimas naudojant PGR metodą ... 23

2.2. Statistinė duomenų analizė ... 23

3. TYRIMO REZULTATAI…..………..25

3.1. Broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis... 25

3.2. Kampilobakterijų paplitimas skirtingose pardavimo vietose ... 27

3.3. Sezoniškumo įtaka kampilobakterijų paplitimui broilerių produktuose ... 28

3.4. Kampilobakterijų virulentiškumas ... 28

5

5. IŠVADOS…..………..32

6

SANTRAUKA

Kampilobakterijų paplitimas importuotoje vištienoje Laura Babonytė

Magistro baigiamasis darbas

Magistro baigiamasis darbas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, Gyvūninių maisto žaliavų saugos ir kokybės tyrimų laboratorijoje, 2018 10–2019 11 laikotarpiu.

Darbo tikslas – įvertinti kampilobakterijų paplitimą importuotoje vištienoje.

Metodai ir medžiagos. Iš viso per tiriamąjį laikotarpį buvo paimta ir ištirta 138 importuotos vištienos mėginiai (atvėsinti sparneliai ir blauzdelės) iš įvairių pardavimo vietų skirtingais metų laikais. Importuotiems broilerių produktams buvo atliktas kampilobakterijų išskyrimas ir identifikavimas, taikant tiesioginį ir pagausinimo metodus. Išskirti kampilobakterijų izoliatai buvo identifikuojami iki rūšies, taikant modifikuotą dauginės polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą. Gauti PGR produktai buvo analizuojami agarozės gelyje taikant elektroferezę. Po epidemiologinio tyrimo buvo atrinktos C. jejuni ir C. coli padermės ir įvertintas virulentiškumo genų paplitimas.

Tyrimo rezultatai. Atlikus tyrimą buvo nustatyta, jog kampilobakterijų buvo 36 mėginiuose (26,1 proc.) – iš jų 19 atvėsintų sparnelių (52,7 proc.) ir 17 atvėsintų blauzdelių (47,2 proc.). Daugiausia kampilobakterijų buvo rasta mėginiuose, rinktuose rudens ir žiemos laikotarpiais.

Ištyrus kampilobakterijų paplitimą importuotoje vištienoje daugiausia buvo aptikta C. coli (35 proc.) ir C. jejuni (48 proc.). C. jejuni atvėsintose blauzdelėse buvo 12 proc. daugiau nei C. coli, o atvėsintuose sparneliuose – 37 procentais daugiau.

Įvertinus kampilobakterijų paplitimą skirtinguose pardavimo taškuose nustatyta, kad atvėsintų broilerių produktų užkrėstumui kampilobakterijomis neturėjo didelės įtakos pardavimo vieta (p>0,05).

Išanalizavus kampilobakterijų, išskirtų iš atvėsintų broilerių produktų, virulentiškumo faktorius, tyrimo rezultatai parodė, jog C. jejuni ir C. coli padermėse yra CadF ir CdtA virulentiškumo genų. CadF virulentiškumo genas buvo paplitęs mažai – 16,6 proc. mėginių, o CdtA genas rastas beveik visuose tirtuose vištienos mėginiuose (94,4 proc.).

7

SUMMARY

The prevalence of Campylobacter spp. in imported chicken Laura Babonytė

Master's thesis

In 2018 10 – 2019 11 Master's thesis has been performed at Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Department of Food Safety and Quality, at Raw Animal Origin Foodstuffs Safety and Quality Testing Laboratory.

The aim of the thesis – to estimate the prevalence of Campylobacter in imported chicken.

Methods and materials. In period of investigation 138 imported chicken samples (raw wings and drumsticks) were collected and tested from various selling places in different seasons. Campylobacter spp. were isolated and identificated from imported chicken products using direct and enrichment methods. Isolated Campylobacter spp. were identified up to species using a modified multiplex polymerase chain reaction (PCR) method. PCR products were analyzed by agarose gel using electrophoresis. After epidemiological investigation C. jejuni and C. coli strains were selected and prevalence of virulance genes was evaluated.

Results. This study revealed that Campylobacter spp. was in 36 (26.1 %) samples of which: 19 cooled wings (52.7 %) and 17 cooled drumsticks (47.2 %). Most of Campylobacter spp. samples were found during autumn and winter.

After evaluating of Campylobacter spp. prevalence in imported chicken the highest prevalence was C. coli (35 %) and C. jejuni (48 %). C. jejuni in cooled drumsticks was 12 % more than C. coli, cooled wings – 37 % more.

After evaluating the prevalence of Campylobacter at different sales places, we found out that contamination of cooled broilers products was not significantly impacted by sale place (p>0,05).

Cooled drumsticks had 12 % more of C. jejuni than C. coli, while cooled wings had 37 % more of C. jejuni than C. coli.

After examination virulence factors of Campylobacter spp. isolated from chilled broiler products, it revealed that C. jejuni and C. coli strains contain CadF and CdtA virulence genes. The CadF virulence gene was low in 16.6 % of samples, while the CdtA gene was found in almost all chicken samples (94.4 %).

8

SANTRUMPOS

EFSA (European Food Safety Authority) – Europos maisto saugos tarnyba ES – Europos Sąjunga

ULAC – Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras PGR – Polimerazinė grandininė reakcija ksv – kolonijas sudarantys vienetai

9

ĮVADAS

Nuo 2005 m. Europos Sąjungoje kampilobakteriozė įvardijama kaip dažniausia žmonių virškinamojo trakto liga (1). Naujausiais duomenimis, 2018 m. patvirtintų kampilobakteriozės atvejų skaičius buvo 246 571, o tai atitinka 64,1 pranešimo atvejų 100 000 gyventojų (1). Ligos sunkumas labai skiriasi, atsižvelgiant į padermės virulentiškumą ir paciento jautrumą. Pagrindiniai simptomai yra viduriavimas, pilvo skausmai ir karščiavimas. Taip pat pranešama apie vėmimą ir viduriavimą su krauju (2). Dažniausiai pasaulyje kampilobakteriozę sukelia Campylobacter jejuni (90 proc. susirgimo atvejų) ir Campylobacter coli ( mažiau nei 10 proc. susirgimo atvejų).

Naminiai paukščiai yra natūralus Campylobacter rūšių rezervuaras, kuris yra svarbiausias žmonių infekcijos šaltinis. Tinkamai termiškai neapdorotos vištienos vartojimas arba netinkamas žalių broilerių produktų tvarkymas yra laikomi pagrindiniais rizikos veiksniais, susijusiais su žmonių kampilobakterioze. Paukštienos užkrėstumas kampilobakterijomis bei jų paplitimas broilerių pulke dažnai lemia jų paplitimą ir visoje gamybos grandinėje bei užkrėstos vištienos patekimą į mažmeninę prekybą (3). Kampilobakterioze užsikrėsti gali pakakti nedidelio kiekio kampilobakterijų nuo 500 iki 800 ksv/g (4).

Lietuvos statistikos departamento duomenimis, 2018 m. sausio–kovo mėn. paukštienos ir jos subproduktų importas Lietuvoje sudarė 10,049 tūkst. ir, palyginti su tuo pačiu praėjusių metų laikotarpiu, padidėjo 10,6 proc. Didžiąją dalį importuotos produkcijos, kaip ir ankstesniais metais, sudarė lenkiška paukštiena – 6,966 tūkst. t. (5).

Šiomis dienomis Lietuvoje yra pateikta įvairių mokslinių publikacijų susijusių su paukštienos užkrėstumu kampilobakterijomis, tačiau tyrimų apie šių bakterijų paplitimą importuotoje vištienoje mažai. Lietuvoje didelė dalis vištienos importuojama iš Lenkijos ir pakankamai duomenų, apie joje randamų kampilobakterijų paplitimą nėra. Todėl šiame darbe siekta ištirti mažmeninėje prekyboje parduodamų atvėsintų broilerių produktų užkrėstumą kampilobakterijomis.

Darbo tikslas – įvertinti kampilobakterijų paplitimą importuotoje vištienoje. Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti vištienos (atvėsintų sparnelių ir blauzdelių) užkrėstumą kampilobakterijomis. 2. Palyginti kampilobakterijų paplitimą skirtingose pardavimo vietose.

3. Identifikuoti Campylobacter spp., išskirtas iš importuotos vištienos. 4. Įvertinti virulentiškumo genų paplitimą importuotoje vištienoje.

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Campylobacter spp. charakteristika

Kampilobakterijos (Campylobacter spp.) yra viena iš dažniausių bakterinės kilmės žmonių gastroenterito priežasčių ne tik Europoje, bet ir pasaulyje. Šios bakterijos tai gramneigiamos, plonos, spiralės formos mikroaerofilinės bakterijos, aptinkamos daugelio naminių ir laukinių paukščių bei žinduolių virškinimo trakte. Taip pat jų gausu ir paukštynus supančioje aplinkoje: dirvožemyje, vandens šaltiniuose, dulkėse, ant pastatų paviršiaus ir ore (7). Būtent šios bakterijos ir sukelia kampilobakteriozę (6).

Broilerių pulkai gali būti užsikrėtę kampilobakterijomis horizontaliu arba vertikaliu būdu. Labiausiai tikėtina, kad iš aplinkos broileriai bakterijomis užsikrečia horizontaliu būdu, kuomet pulke yra pavienių užsikrėtusių paukščių (8). Didelis pulko dydis, aplinkos vandens ištekliai, kraikas, vabzdžiai, laukiniai paukščiai, graužikai, kontaktas su išmatomis, personalas arba kiti gyvūnai gali padidinti kampilobakterijų paplitimo riziką. Šie šaltiniai tai vertikalus užsikrėtimo būdas.

Dažniausiai kampilobakterioze susergama tada, kai vartojama žalia ar nepakankamai termiškai apdorota paukštiena, nepasterizuotas pienas, bakterijomis užterštas vanduo. Didžioji dalis (50–70 proc.) žmonių susirgimų kampilobakterioze atvejų įvyksta dėl naminių paukščių (broilerių, dedeklių vištų, kalakutų, ančių ir stručių) netinkamo vartojimo (6). Užsikrėtusiems šia liga asmenims dažniausiai pasireiškia viduriavimas, galintis trukti 5–7 dienas. Kampilobakterioze susirgti didesnę riziką turi vaikai, vyresnio amžiaus žmonės ir tie, kurių silpnesnė imuninė sistema (9).

Aukšta paukščių kūno temperatūra sukuria optimalią aplinką kampilobakterijoms augti. Termofilinės Campylobacter rūšys gali augti 37–42 °C temperatūroje, tačiau nesugeba augti ir daugintis esant žemesnei kaip 30 °C temperatūrai. Optimali augimo temperatūra – 41,5 °C (10).

Campylobacter genčiai priklauso 22 rūšys, iš kurių dažniausiai paplitusios yra C. jejuni ir C. Coli. Būtent jos yra pagrindinė žmonių žarnyno infekcinio susirgimo priežastis, nors kitos rūšys, tokios kaip C. concisus, C. upsaliensis, C. ureolyticus, C. hyointestinalis ir C. sputorum, šiomis dienomis apibūdinamos kaip naujos, taip pat siejamos su gastroenteritu ir periodontitu (11).

Didžioji dalis kampilobakterijų rūšių yra judrios ir pasižymi spiraliniu judėjimu, kurį sukelia poliariniai žiuželiai, esantys viename arba abiejuose bakterijos galuose. Vienintelės išimtys yra Campylobacter gracilis, kuri nejuda, ir Campylobacter showae, turinti daugybę žiuželių.

11 Dauguma kampilobakterijų yra mikroaerofilinės arba iš dalies anaerobinės, kurios, esant nepalankioms sąlygoms, ypač oksidacijai, gali pakeisti savo formą į kokoidinę (12). Kai kurios kampilobakterijos šaltame vandenyje gali išgyventi kelias savaites ar net mėnesius. Apskritai šios bakterijos yra jautrios karščiui, radiacijai, dezinfekavimo medžiagoms ir rūgštims (12).

1.2. Kampilobakterijų paplitimas paukštienoje Europoje

Naminių paukščių mėsa, ypač paukštiena ar užteršta žalios paukštienos skerdena, yra laikoma viena iš pagrindinių kampilobakterijų šaltinių ir kelia didžiausią riziką susirgti kampilobakterioze (11). Kiti galimi šaltiniai – tokie kaip vanduo, neapdorotas pienas, galvijai, avys, kiaulės, katės, šunys, transporto priemonės, graužikai ir vabzdžiai – yra žinomi kaip galimi ne tik žmonių, bet ir naminių paukščių užsikrėtimo kampilobakterijomis šaltiniai (11).

Žmonių kampilobakteriozę dažniausiai sukelia C. jejuni ir C. coli bakterijos. Europos maisto saugos tarnybos (EFSA) duomenimis, minėtos kampilobakterijų rūšys, aptiktos šviežioje broilerių mėsoje bei jų produktuose, sudarė 73,6 proc. (C. jejuni) ir 26,3 proc. (C. coli). Aptariamų rūšių kampilobakterijos, aptiktos šviežioje kalakutų mėsoje ir jų produktuose, pasiskirstė taip: 60 proc. C. jejuni ir 40 proc. C. coli (13).

Kampilobakterijomis užkrėstoje naminių paukščių skerdenoje gali būti 100–100 000 kampilobakterijų. Atsižvelgiant į tai, kad iki 500 Campylobacter ląstelių gali sukelti infekciją žmonėms, užkrėstos paukštienos vartojimas didina riziką susirgti kampilobakterioze, ypač jei mėsa netinkamai tvarkoma paruošimo arba apdorojimo metu (14).

Broilerių mėsa yra svarbus kampilobakterijų šaltinis. Šių bakterijų paplitimas broilerių mėsoje 2017 m. ES šalyse buvo 24,2 proc. (13). Remiantis naujausiais EFSA duomenimis, didžiausias kampilobakterijų paplitimas 2017 m. fiksuotas šviežioje broilerių mėsoje (37,4 proc.) ir šviežioje kalakutų mėsoje (31,5 proc.) (1 lentelė).

12 1 lentelė. Campylobacter spp. paplitimas skirtingose maisto grupėse ES šalyse 2017 m. (13)

Maisto

kategorija Gyvūnų rūšis

Pranešimų skaičius (ES valstybių narių / narių ne valstybių) Tirtų mėginių skaičius ES (proc.) Teigiami mėginiai ES (proc.) Šviežia mėsa Broileriai 18/1 13,455 37,4 Kalakutai 10/1 1,028 31,5 Paukštiena 8/0 1,425 27,7 Kiaulės 6/0 843 6,9 Galvijai 6/0 1,456 1,4 Mėsos produktai Broileriai 3/1 101 0 Kalakutai 1/0 11 0 Kiaulės 5/0 178 1,1 Galvijai 2/0 16 0 Neįvardinta 5/0 74 0

Tačiau, remiantis to paties šaltinio – EFSA – duomenimis, pateiktais 1 paveiksle, ES šalyse skirtingais metais kampilobakterijų paplitimas šviežioje broilerių mėsoje svyravo nuo 36,7 iki 46,7 proc.

1 pav. Vidutinis kampilobakterijų paplitimas šviežioje broilerių mėsoje 2014–2017 metais ES šalyse (13)

13 Didelis rizikos faktorius naminių paukščių mėsą užkrėsti kampilobakterijomis yra kryžminė tarša skerdimo metu. Campylobacter paplitimas, nustatytas skerdykloje esančiose skerdenose, svyruoja nuo 34,9 proc. iki 100 proc. Remiantis įvairiais duomenimis, gautais atliktus rizikos įvertinimą, galima teigti, kad, sumažinus broilerių skerdenų užkrėstumą kampilobakterijomis, sumažės ir žmonių kampilobakteriozių atvejai (15).

1.2.1. Kampilobakterijų paplitimas Lenkijoje

Lenkijoje 2013–2015 m. buvo atliktas mokslinis tyrimas, kurio metu nustatyta, kad Campylobacter spp. paplitusios daugiausia antienoje, vištienoje, žąsų mėsoje ir kalakutienoje. Kampilobakterijų buvo rasta 64 proc. mėginių. Didžiausias paplitimas aptiktas antienoje (80 proc.), o mažiausias – kalakutienoje (38 proc.). C. jejuni paukštienoje buvo aptinkama dažniau nei C. Coli (2 lentelė).

2 lentelė. Campylobacter paplitimas Lenkijos paukštienoje (16) Mėsos rūšis Mėginių sk. Teigiami mėginiai,

proc.

Rūšinė įvairovė, proc.

C. jejuni C. coli Vištiena 70 70 31 11 Kalakutiena 47 38 10 5 Antiena 54 80 23 14 Žąsiena 10 60 3 2 Iš viso: 181 64 68 32

1.3. Sergamumas kampilobakterioze Europoje

Kampilobakteriozė yra viena iš dažniausiai pasitaikančių zoonozių ES per pastaruosius dvylika metų (8). 2017 metais daugiausia susirgimų kampilobakterioze užregistruota Čekijos Respublikoje (230,0 atvejų 100 000 gyventojų), Slovakijoje (127,8 atvejų 100 000 gyventojų), Švedijoje (106,1 atvejų 100 000 gyventojų) ir Liuksemburge (103,8 atvejų 100 000 gyventojų). Mažiausias susirgimų kampilobakterioze skaičius nustatytas Bulgarijoje, Kipre, Latvijoje, Lenkijoje, Portugalijoje ir Rumunijoje (mažiau nei 5,8 atvejų 100 000 gyventojų) (13).

Palyginus daugiau nei vienų metų duomenis matyti, kad apskritai Europoje žmonių kampilobakteriozės atvejų skaičius per pastaruosius 5 metus neženkliai keitėsi – išaugo nuo 61,4 atvejų 100 000 tūkst. gyventojų 2013 metais iki 64,8 atvejų 100 000 tūkst. gyventojų 2017 metais (2 pav.).

14 2 pav. Patvirtintų kampilobakteriozės atvejų skaičius 100 000 gyventojų 2013–2017 metais ES šalyse

Sergamumas kampilobakterioze Europoje pasireiškia įvairiose amžiaus grupėse, bet didžiausi sergamumo rodikliai užfiksuojami 0–4 metų amžiaus vaikų grupėje (3 pav.). 2017 m. vaikai iki penkerių metų sudarė 13,4 proc. iš 249 776 patvirtintų žinomo amžiaus atvejų skaičiaus. Penkiose iš šešių amžiaus grupių vyrai, sergantys kampilobakterioze, sudarė didesnę dalį nei moterys. Bendras vyrų ir moterų santykis buvo 1,2:1 (3 pav.).

15 3 pav.Patvirtintų kampilobakteriozės atvejų pasiskirstymas 100 000 gyventojų pagal amžių ir lytį 2017 m. (17)

EFSA duomenimis, 2013–2017 metais Europoje sergamumui kampilobakterioze buvo būdingas sezoniškumas. Vasaros laikotarpiu užregistruojamas didžiausias kampilobakteriozės atvejų skaičius. Nuo 2012 m. pastebimas susirgimų skaičiaus padidėjimas žiemą – sausio mėnesį, nors ir ne taip stipriai išreikštas kaip vasaros mėnesiais (4 pav.).

4 pav.Patvirtintų kampilobakteriozės atvejų pasiskirstymas 100 000 gyventojų pagal sezoniškumą 2008–2017 m. (13)

16 1.3.1. Sergamumas kampilobakterioze Lenkijoje

Lenkijoje patvirtintų kampilobakteriozės atvejų kasmet vis daugėja. Nuo 2012 iki 2017 metų susirgimų kampilobakterioze išaugo 443 atvejais (5 pav.). Tačiau, atsižvelgiant į kitų Europos šalių sergamumo rodiklius, Lenkija yra viena iš tų šalių, kuriose sergamumo kampilobakterioze rodiklis yra žemas.

5 pav. Užregistruotų kampilobakteriozės atvejų pasiskirstymas 2012–2017 m. Lenkijoje (13)

1.4. Kampilobakterijų virulentiškumo veiksniai

Nepaisant daugiau nei 30 metų trunkančių tyrimų, kampilobakteriozė išlieka labiausiai per maistą plintanti infekcinė liga Europoje bei Jungtinėse Amerikos Valstijose. Tačiau mažai yra žinoma apie Campylobacter virulentiškumo veiksnius, dėl kurių mikroorganizmas gali išgyventi maisto grandinėje su padidėjusiu patogeniškumu (18). Pagrindiniai C. jejuni virulentiškumą parodantys veiksniai: judrumas, prisitvirtinimas prie žarnyno ląstelių, invazija į tikslines ląsteles ir toksinų gamyba.

1.4.1. Judrumas

Kampilobakterijoms judėti reikalingi yra žiuželiai ir chemosensorinė sistema, kuri skatina žiuželių judėjimą priklausomai nuo aplinkos sąlygų (18).

Campylobacter pasižymi neįprastu judrumu, ypač klampiosiose medžiagose. Tai lemia vienas arba du poliniai žiuželiai ir spiralinės ląstelės formos. Žiuželiai lemia sukimosi momentą ir / arba ląstelių sukamąjį judėjimą, o spiralės formos ląstelės – spiralinį sukimąsi (18). Tokios savybės leidžia kampilobakterijoms prasiskverbti į žarnyno ląsteles ir jas dengiantį gleivių sluoksnį (19).

17 Žiuželį sudaro kabliuko formos kūnas ir tarpląstelinių siūlų struktūros komponentai. Kūną sudaro:

1) pagrindas, įterptas į ląstelės citoplazmą ir vidinę membraną; 2) periplazminė lazdelė su žiedu;

3) paviršiuje esantis kabliukas.

Kabliuko formos kūną sudaro keli skirtingi baltymai: FliF, FlhA, FlhB, FliO, FliP, FliQ, FliR ir kt. O tarpląstelinis siūlas susideda iš baltymo flagelino multimerų, įskaitant pagrindinį flagelino baltymą (FlaA) ir nedidelį flagelino baltymą (FlaB) (18).

1.4.2. Prisitvirtinimas prie žarnyno ląstelių

Adhezinai, esantys ant Campylobacter paviršiaus, yra svarbūs virulentiškumo veiksniai, kurie leidžia bakterijai prisitvirtinti prie virškinimo trakto epitelio ląstelių.

Kampilobakterijų sukibime su fibronektinu tarpininkauja CadF, 37-kDa fibronektiną surišančios išorinės membranos baltymas, užkoduotas labai konservuoto chromosomų CadF geno (18). Jungiantis prie fibronektino, virškinimo trakto epitelio ląstelėse esantis glikoproteinas sukelia įspėjamąjį signalą, kuris suaktyvina GTPazes Rac1 ir Cdc42, o jos išprovokuoja Campylobacter bakterijų internalizavimą (18). Kiti genai ir jų produktai, kurie gali turėti įtakos tam, kad bakterija prisitvirtintų prie žarnyno ląstelių, yra Peb1A, koduojantis 21 kDa baltymą Peb1 – periplazminį rišamąjį baltymą, dažniausiai randamą C. jejuni ir C. coli (18).

1.4.3. Invazija

Daugelis virulentiškumo genetinių požymių, susijusių su kampilobakterijų invaziškumu, yra randami pV ir plazmidėje. Pavyzdžiui, virB11 genas, koduojantis IV sekrecinės sistemos baltymą.

Vienas iš svarbiausių genų, atsakingų už Campylobacter invaziją, yra CiaB genas, kuris dalyvauja bakterijai patenkant į šeimininko ląsteles bei prisitvirtinant prie paukščių aklojo žarnyno sienelių (19).

Su invazija susijęs žymens genas yra vienas svarbiausių veiksnių, atsakingų už kampilobakterijų sugebėjimą patekti į šeimininko organizmą ir jame daugintis. Pirmą kartą šis genas buvo nustatytas 85 proc. invazinių rūšių ir 20 proc. neinvazinių (19). PldA genas taip pat turi didelę reikšmę kampilobakterijų invaziškumui ir yra atsakingas už fosfolipazės sintezę išorinėje membranoje.

18 1.4.4. Toksinų gamyba

Kampilobakterijos gamina kelis skirtingus citotoksinus, iš kurių tik citoletalus toksinas (CDT) yra nuodugniai ištirtas. Daugelis gramneigiamų bakterijų turi savybę gaminti CDT, susidedantį iš trijų subvienetų – cdtA, cdtB ir cdtC. Visos trys sudedamosios dalys yra reikalingos, kad toksinas būtų aktyvus (18).

CdtA ir cdtC yra heterodimeriniai subvienetai, kurie atsakingi už toksinų prasiskverbimą į ląstelių membraną ir už cdtB geno pernešimą (18).

19

2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI

Magistro baigiamasis darbas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, Gyvūninių maisto žaliavų saugos ir kokybės laboratorijoje 2018 10–2019 11 laikotarpiu.

Iš viso per tiriamąjį laikotarpį buvo paimta ir ištirta 138 importuotos vištienos mėginiai (atvėsinti sparneliai ir blauzdelės) iš įvairių pardavimų vietų (3 lentelė) skirtingais metų laikais.

3 lentelė. Mėginių skaičius ir produkto paėmimo vieta Produktas Mėginio paėmimo

vieta

Mėginių sk.

Mėginių sk. (proc.) Atvėsinti sparneliai Firminė parduotuvė 22 32,35

Turgus 24 35,29 Prekybos centras 22 32,35 Iš viso: 68 100 Atvėsintos blauzdelės Firminė parduotuvė 22 31,43 Turgus 24 34,29 Prekybos centras 24 34,29 Iš viso: 70 100 Bendras mėginių sk.: 138 100

2.1. Tyrimo eiga ir metodai

Importuotiems broilerių produktams buvo metus tirti epidemiologiškai siekiant įvertinti kampilobakterijų paplitimą nelietuviškoje vištienoje ir taikant klasikinius mikrobiologinius bei molekulinius tyrimo metodus. Po epidemiologinio tyrimo buvo atrinktos C. jejuni padermės ir įvertintas virulentiškumo genų paplitimas. Tyrimo planas ir eiga pateikiami 6 paveiksle.

20 6 pav. Tyrimo planas ir eiga

2.1.1. Kampilobakterijų išskyrimas

Kampilobakterijos buvo išskiriamos taikant tiesioginį ir pagausinimo metodus. Taikant tiesioginį kampilobakterijų išskyrimo metodą kiekvienas mėginys buvo pasėtas į sterilias Petri lėkšteles su mCCDA terpe, o atlikus pagausinimą į sterilius mėgintuvėlius su Boltono sultiniu, mėginys pasėtas į Petri lėkšteles su mCCDA terpe.

Broilerių produktuose kampilobakterijos buvo tiriamos nuo jų paviršiaus, todėl kiekvienas produktas buvo įdėtas į vienkartinį homogenizavimo maišelį su 100 ml buferinio peptono vandens (Oxoid, Jungtinė Karalystė) ir rankiniu būdu maišomas bei masažuojamas 30 s. Vėliau buvo atlikti 2 dešimtkarčiai praskiedimai buferiniame peptono vandenyje. Taikant tiesioginį sėjimo metodą į sterilias vienkartines Petri lėkšteles su selektyvia mCCDA terpe buvo pasėta 0,1 ml mėginio iš atitinkamų praskiedimų ir lėkštelės, inkubuotos 37 ˚C temperatūroje 48 val. termostate mikroaerofilinėmis sąlygomis (85 proc. azoto, 10 proc. anglies dioksido, 5 proc. deguonies).

Atliekant kampiloakterijų išskyrimą pagausinimo metodu, mėginiai buvo sėjami po 1 ml į mėgintuvėlį su 9 ml selektyviu Boltono pagausinimo sultiniu (Oxoid, Jungtinė Karalystė). Tuomet

Mėginių rinkimas

DNR išskyrimas

Kampilobakterijų aptikimas ir išskyrimas

Kampilobakterijų identifikavimas naudojant dauginį PGR metodą

PGR produktų elektroforezė

Virulentiškumo genų identifikavimas naudojant PGR metodą

Virulentiškumo genų analizavimas agarozės gelyje elektroforezės metodu

21 mėginiai mėgintuvėliuose inkubuoti tokiomis pat mikroaerofilinėmis sąlygomis, tik su Campygen priedu (Oxoid, Jungtinė Karalystė), 42 ˚C temperatūroje 24 val.

Po 24 val. inkubacijos periodo mėgintuvėlių turinys buvo sumaišytas automatine sūkurinio tipo maišykle (Bio Vortex, Biosan, Vokietija) ir su 10 µl kilpele persėtas į selektyvią mCCDA terpę. Pasėti mėginiai buvo inkubuojami 37 ˚C temperatūroje 48 val. termostate mikroaerofilinėmis sąlygomis.

Po tiesioginio sėjimo praėjus 2 paroms, buvo atsirenkamos lėkštelės, kuriose rasta būdingų kampilobakterijoms kolonijų. Kampilobakterijų kolonijos buvo įvertinamos pagal morfologinius bakterijų požymius ant selektyios terpės. Atsirinktos būdingos kolonijos buvo persėtos su 1 µl kilpele į lėkšteles su kraujo agaru (Blood Agar Base No.2, Liofilchem, Italija) ir inkubuotos 37 ˚C temperatūroje 48 val. termostate mikroaerofilinėmis sąlygomis. Po inkubacijos grynos kampilobakterijų kultūros buvo surinktos naudojant 10 µl kilpelę ir sušaldytos mėgintuvėliuose su 1 ml BHI sultiniu (Brain Heart Infusion) (Oxoid, Jungtinė Karalystė), kuriame buvo 30 proc. glicerolio. Vėliau šios kultūros buvo kaupiamos šaldiklyje, kuriame palaikoma –80 ˚C temperatūra iki tolimesnių tyrimų.

2.1.2. DNR išskyrimas

Kampilobakterijų DNR išskyrimas buvo atliktas vadovaujantis protokolu Nr.1 „DNR išskyrimas naudojant PrepMan reagentą (Applied Biosystems, USA)“.

Nuo lėkštelių su kraujo agaru (Blood Agar Base No.2) 1 µl sterilia kilpele buvo surenkamos užaugintos kampilobakterijų kultūros ir perkeltos į 1,5 ml mėgintuvėlį su 0,2 ml PrepMan tirpalo. Vėliau mėgintuvėlių turinys buvo sumaišytas naudojant atomatinę sūkurinio tipo maišyklę (BioVortex, Biosan, Vokietija) ir perkeltas į termociklerį, kuriame temperatūra buvo 99 ˚C. Praėjus 10 min. mėgintuvėliai buvo centrifiguojami 16 000 g /3 min greičiu. Po centrifugavimo viršutinė mėgintuvėlio skysčio dalis buvo perkelta į naujus 1,5 ml mėgintuvėlius ir vėl centrifiguota tuo pačiu greičiu. Po 3 min. viršutinė skysčio dalis buvo perkelta į naują 0,2 ml mėgintuvėlį ir išskirta DNR buvo užšaldoma iki PGR tyrimo.

2.1.3. Kampilobakterijų identifikavimas naudojant dauginį PGR metodą

Kampilobakterijų identifikavimas buvo atliktas naudojantis modifikuotu dauginiu PGR metodu pagal Wang ir kt. (20).

22 Tyrimui buvo naudoti sterilus bidistiliuotas vanduo, Dreamtaq Green PCR mišinys ir pradmenų mišinys. Pradmenų mišinys buvo ruošiamas į 1,5 ml sterilų vienkartinį mėgintuvėlį supilant pradmenų poras (4 lentelė): po 25 μl CJF bei CJR ir po 12,5 μl CCF, CCR, 23SF ir 23SR.

4 lentelė. Pradmenų poros

Pradmenys DNR seka PGR produkto

ilgis CJF 5‘ –ACTTCTTTATTGCTTGCTGC – 3‘ 323 bp CJR 5‘ – GCCACAACAAGTAAAGAAGC – 3 CCF 5‘ – GTAAAACCAAAGCTTATCGTG – 3‘ 126 bp CCR 5‘ – TCCAGCAATGTGTGCAATG – 3‘ 23SF 5‘ – TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG – 3‘ 650 bp 23SR 5‘ – ATCAATTAACCTTCGAGCACCG – 3‘

Paruoštas PGR mišinys po 24 µl buvo supilstomas į vienkartinius PGR mėgintuvėlius ir į kiekvieną iš jų pridėta iš kampilobakterijų išskirta DNR (1 µl), kuri prieš tai buvo atšildyta. Tuomet PGR mėgintuvėliai centrifuguoti 3 min. Po centrifugavimo PGR mėgintuvėliai buvo sudėti į termociklerį ir pasirenkta atitinkama programa, kurios sąlygos:

1. 95 oC – 6 min. 2. 95 oC – 0,5 min.

3. 53 oC – 0,5 min. 2–4 žingsniai kartojami 30 kartų 4. 72 oC – 0,5 min.

5. 72 oC – 7 min. 6. 4 oC – ∞ 7. Pabaiga

2.1.4. PGR produktų elektroforezė

PGR produktų buvo aptinkama agarozės gelyje, kuriam paruošti buvo naudota 2,2 g agarozės, 110 ml TAE buferio ir 6,5 µl Ethidium bromido tirpalo. Paruošus gelį jis buvo patalpintas į buferio vonelę ir 11 µl PGR produkto perkelta į šulinėlius gelyje. Šulinėlių eilės centre buvo dedama 3 µl markerio 100–1 000 bp (GeneRuler 100 bp DNA Ladder fermentas) susidariusiems produktams identifikuoti. Atlikus elektroforezę (50 min., 105 V) pagal nuotraukas, padarytas UV šviesoje, buvo

23 analizuojami susidarę produktai. Susidariusių PGR produktų ilgiai: 323 bp (C. jejuni), 126 bp (C. coli), 650 bp (Campylobacter spp.).

2.1.5. Virulentiškumo genų identifikavimas naudojant PGR metodą

Kampilobakterijų virulentiškumo genai (5 lentelė) buvo identifikuojami naudojant PGR metodą. Tyrimui atlikti pirmiausiai buvo pasiruoštas PGR mišinys naudojant sterilų bidistiliuotą vandenį (15,75 µl), Dreamtaq Green PCR Master Mix (7,25 µl), pradmenų poras (1 µl). Reagentai buvo supilami pagal tūrį: nuo didžiausio iki mažiausio. Paruoštas PGR mišinys po 24µl buvo supiltas į vienkartinius PGR mėgintuvėlius ir į kiekvieną iš jų pridėta iš kampilobakterijų išskirtos DNR (1 µl), kuri prieš tai buvo atšildyta. Tuomet PGR mėgintuvėliai centrifuguojami 1 minutę 4 000 aps./min greičiu. Po centrifugavimo PGR mėgintuvėliai buvo sudėti į termociklerį ir nustatyta programa pagal pasirinktą geną. CadF genų termociklerio sąlygos – 94 °C 5 min., 95 °C 1 min. kartojant 30 kartų, 1 min. specifinės temperatūros – 45 °C, 71 °C 1 min. ir 72 °C 5 min. (21), CdtA termociklerio sąlygos – 94 °C 1 min., 94 °C 1 min., kartojant 30 kartų, 42 °C 2 min., 72 °C 3 min., 72 °C 5 min. (22). CeuE termociklerio sąlygos – 95 °C 3min., 95 °C 30 s kartojant 30 kartų, 57 °C 30 s, 72 °C 1 min., 72 °C 5 min. (23).

5 lentelė. Virulentiškumo genų pradmenų poros

Vėliau buvo vykdomas virulentiškumo genų analizavimas agarozės gelyje elektroforezės metodu kuris aprašytas 2.1.4 poskyryje.

2.2. Statistinė duomenų analizė

Tyrimų duomenys buvo įvertinti naudojant SPSS paketą (versija 25.0 SPSS Ibm.) ir 2019 m. Microsoft Office Excel programą. Duomenims sisteminti buvo naudotas aprašomosios statistikos

Genas DNR seka PGR produkto ilgis

CeuE F – CCTGCTCGGTGAAAGTTTTG R – GATCTTTTTGTTTTGTGCTGC 794 bp CadF F – TTGAAGGTAATTTAGATATG R – CTAATACCTAAAGTTGAAAC 400 bp CdtA F – GGAAATTGGATTTGGGGCTATACT R – ATCACAAGGATAATGGACAAT 165 bp

24 metodas, o kokybiniam rodiklių patikimumui nustatyti – taikomas Chi kvadrato kriterijus (X²). Duomenys laikomi statistiškai patikimais, kai p <0,05.

25

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1. Broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis

Per tiriamąjį laikotarpį iš trijų skirtingų pardavimo vietų buvo surinkta 138 atvėsinti broilerių produktų mėginiai – iš jų 68 atvėsinti sparneliai (49,3 proc.) ir 70 atvėsintų blaudelių (50,7 proc.). Surinktuose mėginiuose buvo identifikuotos kampilobakterijos naudojan dauginį PGR metodą (7 pav.). Tyrimo rezultatai parodė, jog iš viso kampilobakterijomis buvo užsikrėsti 36 (26,1 proc.) mėginiai – 19 atvėsintų sparnelių (52,7 proc.) ir 17 atvėsintų blauzdelių (47,2 proc.).

7 pav. Kampilobakterijų rūšinė įvairovė (M – DNR ilgio standartas nuo 100 bp iki 1 000 bp (MBI, Fermentas); 1, 2, 3, 5, 9, 10, 11, 17, 18 – C. jejuni (323 bp); 4, 12, 13, 14, 15, 16, 19 – C. coli (126 bp); 8 – Campylobacter spp. (650 bp))

Atlikus dauginį PGR metodą buvo nustatyta kampilobakterijų rūšinė įvairovė atvėsintuose sparneliuose (8 pav.) ir atvėsintose blauzdelėse (9 pav.).

3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 19

26 8 pav. Atvėsintų sparnelių užkrėstumas kampilobakterijomis

9 pav. Atvėsintų blauzdelių užkrėstumas kampilobakterijomis

Rūšinė įvairovė tarp atvėsintų sparnelių ir blauzdelių skyrėsi nežymiai. Daugiausia produktai buvo užkrėsti C. jejuni (atvėsintose blauzdelėse – 47 proc., sparneliuose – 58 proc.) ir C. coli (atvėsintuose sparneliuose – 21 proc., o blauzdelėse – 35 proc.) kampilobakterijų rūšimis. Nors vištienos sparneliai kampilobakterijomis buvo užkrėsti 3,6 proc. daugiau nei blauzdelės buvo užsikrėtę kampilobakterijomis, atlikus statistinę analizę, buvo nustatyta, jog bakterijų kiekis nepriklauso nuo broilerio produkto rūšies (p>0,05). Išanalizavus kampilobakterijų paplitimą importuotoje vištienoje daugiausia buvo aptikta taip pat C. coli (35 proc.) ir C. jejuni (48 proc.) kampilobakterijų rūšių (10 pav.).

27 10 pav. Importuotos vištienos užkrėstumas kampilobakterijomis

3.2. Kampilobakterijų paplitimas skirtingose pardavimo vietose

Siekiant ištirti kampilobakterijų paplitimą skirtinguose pardavimo taškuose buvo pasirinktos trys skirtingos pardavimo vietos: turgus, firminė parduotuvė ir prekybos centras, o šiose vietose – parduodama lenkiška paukštiena. Iš kiekvienos pardavimo vietos buvo atsitiktinai pasirinkta po vieną atvėsintą sparnelį ir atvėsintą blauzdelę. Iš viso surinkti 138 mėginiai. Tyrimo metu išaiškėjo, kad daugiausia kampilobakterijomis užkrėstų mėginių buvo paukštienoje iš firminės parduotuvės (31,8 proc.), o mažiausiai – iš prekybos centro (19,6 proc.) (11 pav.). Visgi atlikus statistinę analizę buvo nustatyta, kad paukštienos užkrėstumas kampilobakterijomis nuo pardavimo vietos nepriklauso (p>0,05).

28 Kad ir kaip būtų, reikėtų atsižvelgti į tai, kad per tiriamąjį laikotarpį firminėse parduotuvėse tris kartus nebuvo pardavimui skirtų sparnelių ir vienos atvėsintos blauzdelės. „Norfoje“ – dviejų atvėsintų sparnelių. Šie mėginiai galėjo kiek pakoreguoti galutinius tyrimo rezultatus.

3.3. Sezoniškumo įtaka kampilobakterijų paplitimui broilerių produktuose

Atlikus tyrimą buvo nustatyta, kad lenkiškos vištienos užkrėstumas kampilobakterijomis priklausomai nuo sezono skiriasi. Daugiausia kampilobakterijų buvo aptikta rudens ir žiemos laikotarpiais (12 pav.). Rudenį tirtuose mėginiuose užkrėstų aptikta 47,2 proc., o pavasarį ir vasarą – tik po 5,5 proc. mėginių iš 36 užkrėstų mėginių. Tarp užkrėstų mėginių rudens ir žiemos sezonais skirtumas nežymus: rudenį užkrėstumas didesnis vos 5,6 proc.

12 pav. Užkrėstų mėginių pasiskirstymas pagal sezoniškumą

Įvertinus surinktus duomenis statistiškai, buvo nustatyta, kad vištienos užkrėstumas kampilobakterijomis priklauso nuo sezoniškumo (p<0,05).

3.4. Kampilobakterijų virulentiškumas

Atlikus kampilobakterijų paplitimo tyrimus dalyje lenkiškos broilerių produkcijos, iš sukauptos kolekcijos buvo atrinktos C. jejuni ir C. coli padermės ir įvertintas virulentiškumo genų paplitimas jose, naudojant PGR metodą (13 pav.).

29 13 pav. CdtA virulentiškumo geno vizualizacija (M – DNR ilgio standartas nuo 100 bp iki 1 000 bp (MBI, Fermentas); 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 – cdtA (165 bp))

Iš viso tyrimui pasirinkti trys virulentiškumo genai: CeuE, CadF ir cdtA, kurių paplitimas įvertintas kampilobakterijose, išskirtose iš importuotos paukštienos. Iš tirtų trijų virulentiškumo genų (CeuE, CadF, cdtA) pasitvirtino tik 2 – CadF ir cdtA (14 pav.). CadF virulentiškumo genas vištienos mėginiuose buvo paplitęs mažiau (16,6 proc.), o didesnis paplitimas buvo nustatytas cdtA geno (94,4 proc.). CeuE virulentiškumo geno tirtuose mėginiuose neaptikta.

14 pav. Užkrėstų mėginių virulentiškumas

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 17 18

30

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Remiantis naujausiais EFSA duomenimis, kampilobakteriozė yra dažniausiai pasitaikanti zoonozinė liga Europos Sąjungoje. ES valstybės narės 2018 metais užregistravo 64,1 kampilobakteriozės atvejų 100 000 gyventojų (1). 2018 m. didžiausias užregistruotas kampilobakteriozės atvejų skaičius buvo Čekijoje (215,8/10 000 gyventojų), Slovakijoje (153,2/10 000 gyventojų), Liuksemburge (103,8/100 000 gyventojų) ir Jungtinėje Karalystėje (98,4/100 000 gyventojų). Mažiausiai susirgimo kampilobakterioze atvejų nustatyta Bulgarijoje, Kipre, Graikijoje, Latvijoje, Lenkijoje, Portugalijoje ir Rumunijoje (≤5,9/100 000 gyventojų).

Šio tyrimu metu siekta ištirti Lietuvoje parduodamos importuotos vištienos užkrėstumą kampilobakterjomis. Taip nutarta dėl 2018 metais atliktų tyrimų rezultatų, kai kampilobakterijų daugiausia buvo rasta šviežioje broilerių mėsoje (37,5 proc.) (1). Remiantis Lietuvos statistikos departamento duomenimis, į Lietuvą daugiausia yra importuojama lenkiškos vištienos. Tyrimo laikotarpiu buvo surinkta 138 atvėsinti broilerių produktų mėginiai – 68 atvėsinti sparneliai (49,3 proc.)

ir 70 atvėsintų blauzdelių (50,7 proc.). Mėginių kiekis skiriasi, nes jie buvo reguliariai renkami du kartus per mėnesį trijose skirtingose pardavimo vietose, tačiau ne visada buvo galima rasti abiejų rūšių atvėsintų broilerių produktų.

Tyrimo rezultatai parodė, jog iš viso kampilobakterijomis buvo užkrėsti 36 (26,1 proc.) mėginiai, iš kurių 19 – atvėsintų sparnelių (52,7 proc.), o 17 – atvėsintų blauzdelių (47,2 proc.). 2017 metais Lenkijoje buvo atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta, kad iš 70 vištienos mėginių 49 proc. buvo užkrėsti Campylobacter spp. (16). Estijoje 2012 metais, kuomet buvo tiriamas vištienos užkrėstumas kampilobakterijomis, atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad kampilobakterijomis buvo užkrėsti 20,8 proc. tirtų mėginių (24). Lyginant šiame darbe gautus duomenis su tyrimo, atliktų Lenkijoje, duomenimis, galima matyti, kad užkrėstumas kampilobakterijomis yra 1,8 karto mažesnis, o palyginus su Estijoje tirtavištiena – 5,3 proc. didesnis.

Ištyrus mėginius taip pat nustatyta rūšinė kampilobakterijų įvairovė. Išanalizavus

kampilobakterijų paplitimą importuotoje vištienoje daugiausia buvo aptikta C. coli (35 proc.) ir C. jejuni (48 proc.). Rūšinė įvairovė tarp atvėsintų sparnelių ir blauzdelių skyrėsi. Atvėsintose blauzdelėse

C. jejuni aptikta 12 proc. daugiau nei C. coli, o atvėsintuose sparneliuose C.coli – net 37 procentais daugiau.

Airijoje taip pat buvo tirta kampilobakterijų rūšinė įvairovė vištienoje ir gauti panašūs rezultatai: C. jejuni buvo aptikta daugiau (64,6 proc.) nei C. coli (27,4 proc.) (25).

31 Šio tyrimo metu išsiaiškintas kampilobakterijų paplitimas skirtinguose pardavimo taškuose. Buvo pasirinktos trys pardavimo vietos, kuriose parduodama lenkiška vištiena: turgus, firminė parduotuvė ir prekybos centras. Atlikus tyrimą išaiškėjo, kad atvėsintų broilerių produktų užkrėstumui kampilobakterijomis pardavimo vieta didelės įtakos neturėjo. Skirtumas tarp firminės parduotuvės, kurioje rasta daugiausia užkrėstų mėginių, ir prekybos centro, kuriame tokių rasta mažiausiai, yra nedidelis – 12,2 proc. Pagal tai, jog firminėje parduotuvėje nustatytas didesnis atvėsintų broilerių užkrėstumas kampilobakterijomis, galima spręsti, kad firminėje parduotuvėje galėjo būti didesnė kryžminės taršos rizika ar nesilaikoma higienos reikalavimų.

Atlikus tyrimą su importuotos vištienos mėginiais, pastebėta sezono įtaka kampilobakterijų paplitimui atvėsintų broilerių mėginiuose. Didžiausias kampilobakterijų paplitimas (88 proc.) buvo rastas mėginiuose, rinktuose rudens ir žiemos laikotarpiais. Tačiau Vakarų šalyse, kurios yra vidutinio klimato juostoje, didesnis kampilobakterijų paplitimas vištienoje pastebimas vasarą (liepos–rugpjūčio mėnesiais), o žiemą – mažesnis (26). Iš Turkijoje atlikto tyrimo duomenų matyti, jog didesnis C. jejuni ir C. coli paplitimas (77,3 proc.) šalyje parduodamoje vištienoje pastebėtas taip pat vasarą (birželio– rugpjūčio mėn.), o mažiausias (30 proc.) nustatytas vasario mėn. (27). Lyginant šiame magistro darbe gautus duomenis su tyrimų, atliktų kitose šalyse, duomenimis, galima matyti skirtingų metų laikų įtaką kampilobakterijų paplitimui.

Analizuojant kampilobakterijų, išskirtų iš atvėsintų broilerių produktų, virulentiškumo faktorius, tyrimo rezultatai parodė, jog C. jejuni ir C. coli padermėse yra cadF ir cdtA virulentiškumo genų. CadF virulentiškumo genas, vaidinantis svarbų vaidmenį Campylobacter infekcijos proceso metu, šiai bakterijai prisijungiant prie žmogaus žarnyno ląstelių matricos (28), buvo paplitęs mažai – 16,6 proc. mėginių. CdtA geno, atsakingo už citotoksinų gamybą, rasta beveik visuose tirtuose vištienos mėginiuose (94,4 proc.).

2014–2016 metais Lenkijoje buvo atliktas tyrimas, kuriame buvo tiriama C. jejuni padermės, išskirtos iš paukštienos, virulentiškumo faktoriai. CadF genas buvo rastas visuose vištienos mėginiuose, o cdtA genas – 96 proc. mėginių (29). Palyginus tyrimo rezultatus sugautais šiame magistro darbe, matyti, kad kampilobakterijų savybė prisijungti prie žarnyno epitelių lastelių vištienoje, tirtoje šiame darbe, yra silpniau išsivysčiusi, o kampilobakterijų gebėjimas gaminti toksinus pasitvirtino beveik visuose mėginiuose.

32

5. IŠVADOS

1. Atvėsintų broilerių produktų (sparnelių ir blauzdelių) užkrėstumas kampilobakterijomis buvo pasiskirstęs panašiai iš 36 užkrėstų mėginių 52,7 proc. sudarė sparneliai, o 47,3 proc. – atvėsintos blauzdelės.

2. Daugiausia užsikrėtusių kampilobakterijomis mėginių buvo aptikta firminėje parduotuvėje (31,8 proc.), o prekybos centre paplitimas mažiausias – 19,6 proc.

3. Importuotos vištienos mėginiuose dažniausiai paplitusios Campylobacter spp. rūšys buvo – C. jejuni ir C. coli – 48 ir 35 proc. C. coli ir C. jejuni kartu aptinkamos buvo 8 proc. tirtos paukštienos, o nenustatyta Campylobacter spp. rūšis sudarė 2 proc. tirtų mėginių.

4. Kampilobakterijos (C. jejuni ir C. coli padermių), išskirtos iš atvėsintų broilerių produktų, turi cadF ir cdtA vireulentiškumo genus. CadF aptikta 16,6 proc. mėginių, o cdtA – 96 proc. tirtų mėginių.

33

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. EFSA and ECDC (European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control). The European Union One Health 2018 Zoonoses Report. EFSA Journal 2019;17(12):5926, 276 pp.

2. Meunier, M., Guyard‐ Nicodème, M., Dory, D. and Chemaly, M. Control strategies against Campylobacter at the poultry production level: biosecurity measures, feed additives and vaccination. J Appl Microbiol. 2016; 120: 1139–1173.

3. Skarp, C.P.A. et al. Campylobacteriosis: the role of poultry meat. Clinical Microbiology and Infection. 2016 Feb; 22(2): 103–109.

4. Nielsen, H., Steffensen, R. and Ejlertsen, T. Risk and Prognosis of Campylobacteriosis in Relation to Polymorphisms of Host Inflammatory Cytokine Genes. Scandinavian Journal of Immunology. 2012; 75: 449–454.

5. Valstybės įmonė Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras. 2018-06-12 Didėja paukštienos importas iš kitų ES šalių [Žiūrėta 2020 m. sausio 18 d.]. Prieiga per internetą: http://www.vic.lt/zumpris/2018/06/12/2018-06-12-dideja-paukstienos-importas-is-kitu-es-saliu/.

6. Franciska M. Schets, Wilma F. Jacobs-Reitsma, Rozemarijn Q. J. van der Plaats, Lianne Kerkhof-De Heer, Angela H. A. M. van Hoek, Raditijo A. Hamidjaja, Ana Maria de Roda Husman, Hetty Blaak; Prevalence and types of Campylobacter on poultry farms and in their direct environment. J Water Health; 1 December 2017; 15 (6): 849–862.

7. Kaakoush NO, Castaño-Rodríguez N, Mitchell HM, Man SM. Global epidemiology of Campylobacter infection. Clinical Microbiology Reviews. 2015; 28(3): p. 687-720.

8. Sibanda Nompilo, McKenna Aaron, Richmond Anne, Ricke Steven C., Callaway Todd, Stratakos Alexandros Ch., Gundogdu Ozan, Corcionivoschi Nicolae. A Review of the Effect of Management Practices on Campylobacter Prevalence in Poultry Farms. Frontiers in Microbiology. 2018 August; 9: p. 2002.

34 10. Silva Joana, Leite Daniela, Fernandes Mariana, Mena Cristina, Gibbs Paul, Teixeira Paula. Campylobacter spp. as a Foodborne Pathogen: A Review. Frontiers in microbiology. 2011 September; 2.

11. Facciolà A, Riso R, Avventuroso E, Visalli G, Delia SA, Laganà P. Campylobacter: from microbiology to prevention. Journal of Preventive Medicine and Hygiene. 2017 June; 58(2): p. 79-92.

12. Ban M Allos, MD. Microbiology, pathogenesis, and epidemiology of Campylobacter infection. 2019.

13. The European Union summary report on trends and sourcesof zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2017. EFSA Journal. 2018; 16(12).

14. DG Health and Food Safety. Mitigation measures in place for Campylobacter spp. in poultry : overview report. Luxembourg; 2017.

15. Perez-Arnedo, I.; Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. in Poultry in ThreeSpanish Farms, A Slaughterhouse and A Further Processing Plant. FOODS. 2019; 8(3): p. 12.

16. Anna Szosland-Fałtyn; Beata Bartodziejska; Joanna Królasik; Beata Paziak-Domańska; Dorota Korsak; Magdalena Chmiela. The Prevalence of Campylobacter spp. in Polish Poultry Meat. Polish Journal of Microbiology. 2018; 67(1): 117-120.

17. EFSA and ECDC (European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control).. Campylobacteriosis. Annual epidemiological report for 2017. Stockholm; 2019.

18. Bolton DJ. Campylobacter virulence and survival factors. Food Microbiology. 2015; 48: p. 99-108.

19. Hassan. WM. Review on Some Virulence Factors Associated with Campylobacter Colonization and Infection in Poultry and Human.. American Journal of Biomedical Science & Research. 2019; 3(5): p. 460-463.

20. Wang G., Clark C. G., Taylor M. T., Pucknell C., Barton C., Price L., Woodward D. L.,Rodgers f. G. Colony Multiplex PCR Assay for Identification and Differentiation of Campylobacter jejuni,

35 C.coli, C.lari, C.upsaliensis, and C. fetus subsp. fetus. Journal of clinical microbiology. 2002. Vol. 40 (12). P. 4744-4747.

21. Beata Wysok JW. Detection of virulence genes determining the ability to adhere and invade in Campylobacter spp. from cattle and swine in Poland. Microbial Pathogenesis. 2018; 115: 257-263

22. Bang, D., Nielsen, E.M., Scheutz, F., Pedersen, K., Handberg, K. and Madsen, M. PCR detection of seven virulence and toxin genes of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates from Danish pigs and cattle and cytolethal distending toxin production of the isolates. Journal of Applied Microbiology. 2003; 64(6).

23. González‐ Domínguez, M., Méndez‐ Carro, C. and Esperanza Cerdán, M. Isolation and Characterization of the KlHEM1 Gene in Kluyveromyces lactis. Yeast. 1997.

24. Mihkel Mäesaar, Kristi Praakle, Kadrin Meremäe, Toomas Kramarenko, Jelena Sõgel, Arvo Viltrop, Kaisa Muutra, Kaspars Kovalenko, Darja Matt, Ari Hörman, Marja-Liisa Hänninen, Mati Roasto. Prevalence and counts of Campylobacter spp. in poultry meat at retail level in Estonia. Food Control. 2014; 44: 72-77.

25. LYNN MORAN, PAM SCATES, ROBERT H. MADDEN. Prevalence of Campylobacter spp. in Raw Retail Poultry on Sale in Northern Ireland. J Food Prot 1. 2009 September; 72(9): 1830–1835.

26. Jaap A. Wagenaar, Nigel P. French, Arie H. Havelaar. Preventing Campylobacter at the Source: Why Is It So Difficult? Clinical Infectious Diseases. 2013 December; 57(11): 1600–1606.

27. Gokben Ozbey BT. Seasonality and antibiotic resistance of Campylobacter in Turkish chicken meat. Veterenaria Italiana. 2014 December; 50(4).

28. Reddy Samantha, Zishiri Oliver T. Genetic characterisation of virulence genes associated with adherence, invasion and cytotoxicity in Campylobacter spp. isolated from commercial chickens and human clinical cases. Onderstepoort j. vet. res. 2018; 85( 1 ): 1-9

29. Wieczorek K, Wołkowicz T and Osek J. Antimicrobial Resistance andVirulence-Associated Traits of Campylobacter jejuni Isolated From Poultry Food Chain and Humans With Diarrhea. Front. Microbiol. 2018; 9:1508.