LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Dovydas Gečys
HSA-MIR-24-3P IR HSA-MIR-34A-5P GENŲ RAIŠKOS POKYČIAI PACIENTŲ SERGANČIŲ STABILIA KRŪTINĖS ANGINA KRAUJO PLAZMOJE
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas dr. Vacis Tatarūnas
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 6
INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 9
SANTRUMPOS ... 10
ĮVADAS... 12
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 13
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 14
1.1. Mikro-RNR biologija ... 14
1.1.1. Mikro-RNR biosintezė ... 14
1.1.2. Mikro-RNR funkcija ... 15
1.1.3. Mikro-RNR ir ţmogaus ligos ... 17
1.1.4. Mikro-RNR kaip širdies ir kraujagyslių sistemos ligų bioţymenys ... 17
1.2. Išeminė širdies liga ... 20
1.2.1. Epidemiologija ir etiologija ... 20
1.2.2. Aterosklerozės patogenezės ryšys su mikro-RNR pokyčiais ... 21
1.3. Genetiniai ţymenys aterosklerozės procese ... 22
1.3.1. Arachidono r. metabolizmas ir biologiškai aktyvių darinių sintezė ... 22
1.3.2. HNF4α genas ... 23 1.3.3. hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p ... 23 2. Tyrimo metodika ... 25 2.1. Tyrimo planavimas ... 25 2.2. Tyrimo objektas ... 25 2.3. Tiriamųjų atranka ... 25 2.4. Tyrimo metodai ... 26
2.4.1. Kraujo plazmos surinkimas ... 26
2.4.2 Plazmos šviesos absorbcijos matavimas spektrofotometru ... 26
2.4.3. Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) gryninimas ... 27
2.4.4. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru ... 28
2.4.5. Visuminės RNR išgryninimas iš kraujo plazmos ... 28
2.4.6.CYP4F2 fermento nustatymas kraujo plazmoje ELISA metodu ... 29
2.4.7. Atvirkštinės transkripcijos reakcija ... 30
2.4.8. Kiekybinė tikro-laiko PGR ... 31
3
2.4.10. Statistinė analizė ... 32
3. REZULTATAI ... 33
3.1. Mikro-RNR genų raiškos kraujo plazmoje tyrimas kontrolinėje ir SKA sergančių pacientų grupėse ... 33
3.2. CYP4F2 fermento koncentracijos kraujo plazmoje tyrimas ... 34
3.3.CYP4F2 (rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102) vieno nukleotido polimorfizmų nustatymas ... 35
3.4. Lyties, amţiaus, diabeto ir CYP4F2rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 įtaka CYP4F2 fermento koncentracijai, hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškai kraujo plazmoje ... 35
3.5. Vaistų įtaka CYP4F2 fermento koncentracijai, hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškai SKA sergančių pacientų kraujo plazmoje ... 38
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 40
5. IŠVADOS ... 44
4
SANTRAUKA
Magistro baigiamojo darbo autorius: Dovydas Gečys
Magistro baigiamojo darbo pavadinimas: hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškos pokyčiai pacientų sergančių stabilia krūtinės angina kraujo plazmoje
Magistro baigiamojo darbo vadovas: dr. Vacis Tatarūnas
Darbo tikslas buvo ištirti hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raišką pacientų, sergančių stabilia krūtinės angina, kraujo plazmoje, ir įvertinti šių molekulių, CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 variantų, bei negenetinių veiksnių įtaką CYP4F2 geno koduojamo fermento aktyvumui kraujo plazmoje.
Darbo uţdaviniai:
1. Įvertinti ir palyginti hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raišką ir CYP4F2 koncentraciją pacientų, sergančių stabilia krūtinės angina, ir sveikų asmenų kraujo plazmoje.
2. Įvertinti CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 variantų, lyties, amţiaus ir cukrinio diabeto įtaką hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškai.
3. Įvertinti CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 variantų, lyties, amţiaus ir cukrinio diabeto įtaką CYP4F2 koncentracijai kraujo plazmoje.
4. Įvertinti pacientų vartojamų vaistų įtakąhsa-miR-24-3p, hsa-miR-34a-5p ir ώ-hidroksilazės kiekiui tiriamųjų kraujo plazmoje.
Ištirti 34 stabilia krūtinės angina sergantys pacientai, bei 15 sveikų asmenų. Visuminė RNR buvo išgryninta iš kraujo plazmos naudojant komercinį rinkinį. CYP4F2 koncentracija tiriamųjų kraujo plazmoje buvo nustatyta naudojant komercinį rinkinį. Mikro-RNR genų raiškos kiekybinė analizė ir tiriamųjų asmenų genotipavimas atlikti naudojant tikro-laiko polimerazės grandinės reakcijos metodą. Rezultatai. hsa-mir-24-3p ir hsa-mir-34a-5p genų raiška atitinkamai buvo 5,5 karto (p=0,0001) ir 4,3 karto (p=0,002) aukštesnė SKA pacientų kraujo plazmoje palyginus su sveikais asmenimis. SKA pacientams buvo nustatyta vidutiniškai 2 kartus maţesnė CYP4F2 koncentracija palyginus su sveikais tiriamaisiais (p=0,0001). Hsa-miR-24-3p genų raiška buvo atvirkščiai proporcingai susijusi su CYP4F2 koncentracija kraujo plazmoje (Spearman koreliacijos koeficientas r= -0,346, p=0,016).
SKA sergantiems vyrams buvo nustatyta 1,6 karto maţesnė CYP4F2 koncentracija kraujo plazmoje palyginus su moterimis (p=0,04). CYP4F2 rs2108622 CC genotipą turintiems pacientams nustatyta 2 kartus maţesnė CYP4F2 koncentracija palyginus su CT variantą turinčiais (p=0,04). CYP4F2 rs1558139 AA turintys pacientai, turėjo 4 kartus maţesnę CYP4F2 koncentraciją kraujo plazmoje, nei AG genotipą turintys pacientai (p=0,04) ir 3 kartus maţesnę šio fermento koncentraciją nei GG turintys pacientai (p=0,01). Statistiškai reikšmingo ryšio tarp lyties, amţiaus, cukrinio diabeto, bei CYP4F2 genetinių variantų ir tirtų mikro-RNR molekulių neaptikta.
5 Pacientams, vartojusiems atorvastatiną ir AKF inhibitorius, buvo nustatytas hsa-miR-24-3p geno raiškos padidėjimas kraujo plazmoje, atitinkamai, 2,9 (p=0,02) ir 2,1 (p=0,05) karto palyginus su minėtų vaistų nevartojusiais pacientais. AKF inhibitorius vartojančių pacientų kraujo plazmoje hsa-miR-34a-5p geno raiška buvo 5,8 karto aukštesnė, nei nevartojančių (p=0,09).
Išvados. Hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiška buvo aukštesnė SKA pacientų kraujo plazmoje. CYP4F2 koncentracija šių pacientų kraujo plazmoje buvo maţesnė. hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškai CYP4F2 variantai bei negenetiniai veiksniai nedarė reikšmingos įtakos. SKA sergantys vyrai turėjo maţesnę CYP4F2 koncentraciją kraujyje palyginus su moterimis. CYP4F2rs2108622 CC varianto nešiotojai turėjo maţesnę fermento koncentraciją palyginus su CT genotipą turinčiais pacientais. CYP4F2 rs1558139 AA varianto nešiotojai turėjo maţesnę CYP4F2 koncentraciją kraujo plazmoje palyginus su AG ir GG genotipą turinčiais pacientais. Atorvastatiną ir AKF inhibitorius vartojantys pacientai turėjo aukštesnę hsa-mir-24-3p geno raišką kraujo plazmoje. Kiti vartojami vaistai CYP4F2 koncentracijos pokyčiams statistiškai reikšmingos įtakos nedarė.
6
SUMMARY
Dovydas Gečys. Alterations of hsa-miR-24-3p and hsa-miR-34a-5p gene expression in blood plasma of the patients with stable angina pectoris
Supervisor: Ph.D Vacis Tatarūnas
The aim of this study was to investigate the expression of hsa-miR-24-3p and hsa-miR-34a-5p genes in blood plasma of the patients with stable angina pectors and to evaluate the impact of these molecules, CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135, rs20749102 genetic variants and non-genetic factors on CYP4F2 enzyme levels.
Objectives:
1. To determine and to compare the expression levels of hsa-miR-24-3p and hsa-miR-34a-5p genes, and CYP4F2 enzyme concentration in blood plasma of the patients with stable angina pectoris patients and in healthy subjects.
2. To evaluate the impact of CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135, rs20749102 genetic variants, gender, age and diabetes mellitus on the expression levels of miR-24-3p and hsa-miR-34a-5p genes inblood plasma.
3. To evaluate the impact of CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135, rs20749102 genetic variants, gender, age and diabetes mellitus on CYP4F2 enzyme concentration in blood plasma. 4. To evaluate the impact of drugs on hsa-miR-24-3p, hsa-miR-34a-5p, and ώ-hydroxilase levels in
blood plasma of patients with stable angina pectoris.
Totally 34 patients with stable angina pectoris (SA) and 15 control subjects were examined. Total RNA was extracted from blood plasma using commercial kit. The CYP4F2 enzyme levels were analyzed using commercial kit. Gene expression analysis and genotyping were performed using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) method.
Results. The expression of hsa-miR-24-3p and hsa-miR-34a-5p genes was upregulated by 5,5 (p=0,0001) and 4,3-fold (p=0,002), respectively, in the patients with SA as compared to healthy subjects. The concentration of CYP4F2 enzyme was 2 fold lower (p=0,0001) in blood plasma of the patients compared to healthy individuals. Hsa-mir-24-3p expression levels were inversely proportional to CYP4F2 levels (Spearman correlation coeficient r=-0,346, p=0,016). Male patients had 1,6 times lower CYP4F2 concentration as compared to female patients (p=0,04). CYP4F2 rs2108622CC carriers had 2 fold lower enzyme concentration in blood plasma as compared to CT carriers (p=0,04). CYP4F2 rs1558139 AA carriers had 4-fold (p=0,04) and 3-fold (p=0,01) lower enzyme concentrations as compared to AG and GG variant carriers. No significant associations were found among sex, age, DM, CYP4F2 genetic variants and micro-RNA levels. SA patients, users of atorvastatin and ACE inhibitors, had 2,9 (p=0,02) and 2,1 fold (p=0,05), respectively, higher hsa-miR-24-3p gene expression in plasma as compared to
non-7 users. Hsa-miR-34a-5p levels were higher by 5,8 fold (p=0,09) in blood plasma of the patients users of ACE inhibitors.
Conclusions. Hsa-miR-24-3p and hsa-miR-34a-5p expression was higher in blood plasma of the patients with SA. CYP4F2 levels were lower in the patients. Variants of CYP4F2 and non-genetic factors had no significant effect on hsa-miR-24-3p and hsa-miR-34a-5p gene expression levels. SA males had lower CYP4F2 concentration than females. CYP4F2 rs2108622CC carriers had lower enzyme concentration as compared to the carriers of CT variant. The carriers of CYP4F2 rs1558139 AA variant, had lower CYP4F2 enzyme concentration as compared to AG and GG variant carriers. Users of atorvastatin andACE inhibitors had higher hsa-miR-24a-3p gene expression in blood plasma. Other drugs had nosignificant effect on CYP4F2 concentration in blood plasma.
8
INTERESŲ KONFLIKTAS
9
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Magistro baigiamojo darbo tyrimai buvo atliekami LSMU KI Molekulinės kardiologijos laboratorijoje, gavus Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (Nr. BE-2-42), bei LSMU bioetikos centro patvirtinimą (Nr. BEC-LMB(M)-291).
10
SANTRUMPOS
20-HETE -(angl. 20-hydroxyeicosatetraeonic acid) 20-hidroksieikosatetrenoinė rūgštis 3'UTR – (angl. 3‘ untranslated region) – 3' netransliuojamas regionas
AGO – (anlg. argonaute) – argonauto baltymas ANG II – angiotenzinas 2
bp – bazių poros
CAR –(angl. constitutive androstane receptor) konstutyvusis androstano receptorius CCR4 – (angl. carbon catabolite repression 4 ) – anglies katabolitų slopintojas COX1 / COX2 – (angl. cyclooxigenases 1 and 2) – ciklooksigenazė 1 ir 2
DCP1-DCP2 – (angl. mRNA decapping proteins 1 and 2) – iRNR kepurę ardantis baltymas dCT –slenkstinių ciklų skirtumas
DNR – deoksiribonukleorūgštis EDTA – etilendiamintetraacetatas
eIF4F – eukariotų iniciacijos veiksnys 4F
EPc – (angl. endothelial progenitor cells) endotelio pirmtakų ląstelėse ESR1 – estrogeno receptorius 1
FC – (angl. fold change) – pokytis kartais
HBP1 – (angl. high mobility group box transcription factor 1) – didelio judrumo baltymų transkripcijos veiksnys 1
HNF4a – (angl. hepatocyte nuclear factor 4α) – hepatocitųbranduolio veiksnys 4 alfa ICAM – (angl. intercellular adhesion molecule) – tarpląstelinėsadhezijos molekulė iRNR – informacinė ribonukleorūgštis
kDNA – komplementari deoksiribonukleorūgštis IŠL – išeminė širdies liga
LTB4 – leukotrienas B 4 LTs – leukotrienai LXs – lipoksinai
m7G – 7 -metilguanozinas MI – miokardo infarktas
MIF – (angl. macrophage migration inhibitory factor) – makrofagus slopinantis veiksnys
miRISC – (angl. micro-RNR induced silencing complex) – mikro-RNR indukuotas slopinimo kompleksas
11 NF-kβ – (angl.nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) – branduolio veiknys lengvųjų -kappa-grandinių-stiprintojas aktyvuotuose B limfocituose
NKA – nestabili krūtinės angina NOT – (angl. Negative on TATA)
NR1I3 – branduolio receptorių pošeimės, 1 grupės, 3 veiksnys NRC1/NRC2– Bendras branduolio receptoriaus slopintojas 1 ir 2 NSTEMI – miokardo infarktas be ST segmento pakilimo
PABC – (angl. the polyA-binding protein complex) – pre poliadenilinto ribonukleorūgšties galo besijungiantis baltymų kompleksas
PACT –(angl. protein activator of the interferon-induced protein kinase)interferono indukuotos baltymų kinazės aktyvatorius
PAN2-PAN3– (anlg. poly a nuclease 2 and 3 complex) – poliadenilintogalo nukleazės kompleksas PGR – polimerazės grandininė reakcija
PGRMC1 – progesterono receptoriaus membranos komponentas 1 PGs – prostaglandinai
pre-miRNR – (angl. premature micro RNA) – nebrandusmikro-RNR transkriptas pri-miRNR – (anlg. primary micro RNA) – pirminis mikro-RNR transkriptas PXR – pregano receptorius X
RISC – (anlg. RNA induced silencing complex) – ribonukleorūgščių indukuotas slopinimo kompleksas
Rnazė III – ribonukleazė III RNR pol II – RNR polimerazė II RNR pol III – RNR polimerazė III ROS – reaktyvus deguonis
SKA – stabili krūtinės angina
ŠKL – širdies ir kraujagyslių sistemos ligos
TNFα – (angl. tumour necrosis factor α) – naviko nekrozės faktorius alfa
TRBP – (angl. TAR RNA binding protein) - prie ribonukleorūgščių besijungiantis baltymas tRNR – transportinė ribonukleorūgštis
TXA2 – tromboksanas A2
VCAM-1 – (angl. vascular cells adhesion molecule 1) – kraujagyslės ląstelių adhezijos molekulė 1 VSCM – (angl. vascular smooth muscle cells) kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelės
XPO5 – (anlg. exportin 5) – eksportinas 5 Xrn1 – egzoribonukleazė 1
12
ĮVADAS
Širdies ir kraujagyslių sistemos ligos (ŠKL) išlieka pirmaujanti mirties prieţastis tiek Lietuvoje, tiek pasaulyje. Vien nuo išeminės širdies ligos (IŠL) ir jos sukeltų komplikacijų kiekvienais metais miršta apie 7,4 milijonai ţmonių (1). Išeminė širdies liga išskiriama į stabilią krūtinės anginą (KA) ir ūmų koronarinį sindromą (angl. acute coronary syndrome) (2). Pagrindinis IŠL išsivystymo patogenezinis mechanizmas yra vainikinių arterijų aterosklerozė. Aterosklerozės išsivystymui turi įtakos ne tik aplinkos ir etiologiniai rizikos veiksniai, tokie kaip rūkymas, maţas fizinis aktyvumas, netinkama mityba, lytis, amţius, bet ir genetiniai veiksniai, lemiantys sutrikusį lipidų metabolizmą, bei rezistentiškumą insulino poveikiui (3).
Aterosklerozė - lėtinis uţdegiminis procesas kylantis dėl kraujagyslių endotelio paţeidimo. Aterosklerozė yra charakterizuojama arterijų sienose besikaupiančiais lipidais, fibrininiais elementais, bei uţdegiminėmis molekulėmis. Susiformavusi aterosklerotinė plokštelė siaurina vainikinių arterijų spindį ir lemia miokardo išemiją (4).
Neseniai atrastos mikro-RNR molekulės dalyvauja potranskripcinėje genų reguliacijoje ir yra susijusios su įvairiais organizmo fiziologiniais, bei patologiniais procesais, įskaitant ląstelių apoptozę, migraciją, diferenciaciją, bei signalinių kelių reguliaciją (5). Išaugus įvairių mikro-RNR molekulių tyrimų skaičiui, daugėja įrodymų, kad šios molekulės atlieka svarbų vaidmenį uţdegiminiame procese ir gali turėti įtakos aterosklerozės išsivystyme. Išsiaiškinus tikslius mikro-RNR molekulių ryšio su ateroskleroze mechanizmus, bus palengvinta šios ligos diagnostika ir gydymas, bei pagerinta ŠKL prevencija.
Mikro-RNR yra stabilios molekulės ir gali būti aptiktos įvairiuose organizmo skysčiuose, įskaitant kraują, šlapimą, limfą ir likvorą (6). Cirkuliuojančių mikro-RNR molekulių raiška gali būti įvertinama pritaikant paţangius genetinius metodus, tokius kaip tikro-laiko kiekybinę PGR, mikro gardelių (angl. miRNA micro-arrays) tyrimus ar naujos kartos sekoskaitą. Manoma, kad cirkuliuojančios mikro-RNR molekulės gali būti potencialūs ligų diagnostikos bioţymenys, bei terapinės priemonės ateities medicinoje.
13
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raišką pacientų, sergančių stabilia krūtinės angina, kraujo plazmoje, ir įvertinti šių molekulių, CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 variantų bei negenetinių veiksnių įtaką CYP4F2 geno koduojamo fermento aktyvumui kraujo plazmoje.
Darbo uţdaviniai:
1. Įvertinti ir palyginti hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raišką ir CYP4F2 koncentraciją pacientų, sergančių stabilia krūtinės angina, ir sveikų asmenų kraujo plazmoje.
2. Įvertinti CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 variantų, lyties, amţiaus ir cukrinio diabeto įtaką hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškai.
3. Įvertinti CYP4F2 rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 variantų, lyties, amţiaus ir cukrinio diabeto įtaką CYP4F2 koncentracijai kraujo plazmoje.
4. Įvertinti pacientų vartojamų vaistų įtakąhsa-miR-24-3p, hsa-miR-34a-5p ir ώ-hidroksilazės kiekiui tiriamųjų kraujo plazmoje.
14
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Mikro-RNR biologija 1.1.1. Mikro-RNR biosintezė
Mikro-RNR – yra 19–25 nukleotidų (nt) ilgio nekoduojančios RNR grandinės, kurių pagrindinė ţinoma funkcija yra po-transkripcinė genų reguliacija (5). Didţioji dalis mikro-RNR genų yra uţkoduota koduojančių ir nekoduojančių genomo regionų intronuose. Ţinduolių organizme mikro-RNR genų transkripciją vykdo RNR polimerazė II, tačiau kai kurių mikro-RNR genų transkripcijai reikalinga RNR polimerazė III (7) (1 pav.).
Mikro-RNR sintezė vyksta dviem etapais: (i) mikro-RNR genų transkripcija ir brendimas branduolyje, (ii) ir mikro-RNR transkriptų apdorojimas ląstelės citoplazmoje. Ląstelės branduolyje RNR polimerazė II arba III susintetina pirminį mikro-RNR transkriptą (angl. pri-miRNA). Pri-miRNA molekulė yra sudaryta iš 33-35 bazių porų (bp) kamieno (angl. stem), galinės kilpos (angl. terminal loop) ir viengrandţių RNR sekų segmentų 5„ ir 3„ galuose. Po transkripcijos pri-miRNA yra apdorojama RNazės III Drosha ir kofaktoriaus DGCR8 (Pasha) komplekso, kuris nukerpa pri-miRNA dvigrandę dalį vidutiniškai 11 bp nuo dvigrandės RNR išsišakojimo, taip suformuodamas 22 bp nebrandţios mikro-RNR (angl. pre-miRNA) kamieną (8). Sekantis mikro-RNR biosintezės etapas vyksta ląstelės citoplazmoje. Branduolio transporto receptorius XPO5 (angl. exportin 5) atpaţįsta pre-miRNA kamieną, ją prisijungia ir per branduolio poras perneša į ląstelės citoplazmą (9). Citoplazmoje pre-miRNA yra apdorojama kito RNazės III tipo fermento – Dicer. Dicer nukerpa pre-miRNA galinę kilpą ir suformuoja 22 bp subrendusią dvigrandę mikro-RNR (10). Subrendusios mikro-RNR dupleksas yra sudarytas iš dviejų komplementarių RNR grandinių - 3p ir 5p. Viena iš grandinių yra laikoma funkcine (angl. guide strand), o kita neveiklia grandine (angl. passenger strand), kuri vėliau yra suardoma, tačiau ţinoma, kad tiek 3p, tiek 5p grandinės gali suformuoti funkcionalias subrendusias mikro-RNR (11,12). Dicer apdorota dvigrandė RNR išsivynioja, ir remiantis termodinaminiu bazių stabilumu RNR duplekso 5„ galuose, stabilesnė RNR grandinė pašalinama ir suardoma (13). Viengrandė RNR grandinė susijungia su RISC (angl. RNA induced silencing complex) kompleksu, kuris yra sudarytas iš PACT, TRBP, Dicer, AGO (AGO1, AGO2, AGO3 ir AGO4) ir GW182 baltymų (14,15).
Didţiosios dalies mikro-RNR molekulių biosintezė vyksta anksčiau aprašytu būdu (kanoniniu), tačiau kai kurių mikro-RNR biosintezė vyksta aplenkiant Drosha ir DGCR8 kompleksą. Yra ţinomi 4 alternatyvūs mikro-RNR sintezės keliai – mirtronų (angl. mirtron), mikro-RNR sintezė iš maţų branduolio RNR (angl. Small nucleolar RNA-derived miRNAs), mikro-RNR sintezė iš endogeninių maţų
15 kilpinių RNR (angl. miRNAs from endogenous short hairpin RNAs), tRNR-mikro-RNR konversija (angl. miRNAs from tRNAs) (16).
1 pav. Kanoninis mikro-RNR biosintezės kelias (Winters et al, 2009)
1.1.2. Mikro-RNR funkcija
Subrendusios mikro-RNR yra maţos, nekoduojančios viengrandės RNR molekulės. Susijungusios su RISC jos suformuoja efektorinį mikro-RNR ir RISC (angl. miRISC)kompleksą.Ţmonių organizme yra ţinomos 8 RISC klasės, kurios viena nuo kitos skiriasi baltymų kompozicija aplink AGO baltymus. AGO2 yra vienintelis AGO šeimos baltymas galintis aktyvuoti iRNR sukarpymą ţmonių organizme, tačiau visi 4 AGO baltymai dalyvauja genų nutildyme (17). Pagal viengrandės mikro-RNR seką prisijungusią prie AGO baltymo, miRISC atpaţįsta ir prisijungia prie baltymus koduojančios
16 informacinės RNR (iRNR, angl. messenger RNA) grandinės ir vienu iš dviejų mechanizmų slopina koduojamo baltymo transliaciją (18).
MiRISC gali prisijungti prie bet kurio iRNR segmento, tačiau genų raiškos slopinimas daţniausiai vyksta tada, kai miRISC prisijungia prie koduojančios iRNR 3' netransliuojamo (angl. 3'UTR) regiono (19). Baltymų transliacijos slopinimo mechanizmas priklauso nuo miRISC komplekse esančios viengrandės mikro-RNR atrankinės sekos (angl. seed sequence) komplementarumo iRNR. Atrankinė seka – 6-8 nukleotidų ilgio domenas mikro-RNR grandinės 5„ gale, pagal kurį AGO baltymas atpaţįstą iRNR taikinius ir prijungia miRISC kompleksą (20). Esant visiškam miRISC-iRNR komplementarumui inicijuojamas iRNR sukarpymas dėl AGO2 endonukleazinio aktyvumo, tačiau ţinduolių genome yra tik keletas visiško miRISC-iRNR komplementarumo sričių (5).
Ţinduolių organizme po-transkripcinė genų reguliacija daţniausiai vyksta esant daliniam komplementarumui tarp miRISC ir 3„UTR iRNR regiono. Dalinis miRISC-iRNR komplementarumas lemia iRNR transliacijos slopinimą, iRNR deadenilinimą, 5' kepurės hidrolizę (angl. Decapping) ir iRNR suardymą (21) (2 pav.). AGO baltymai indukuoja GW182 sąveiką su PABC (angl. poly-a binding protein) ir citoplazmos deadenilazės kompleksais PAN2-PAN3 ir CCR4-NOT. Minėti kompleksai deadenilina iRNR poliadenilintą galą (angl. poly-A tail). Toliau fermentų DCP1-DCP2 kompleksas hidrolizuoja 5' m7G (7-metilguanizinas) iRNR kepurę (decapping). Deadenilinta ir 5' monofosforilinta iRNR suskaldoma Xrn1 5'-3' egzoribonukleaze (18).
Remiantis Bazzini su bendraautoriais, kai kurios mikro-RNR slopina iRNR transliaciją prieš deadenilimo ir iRNR suskaidymo iniciaciją, tačiau kol kas tikslus tokio veikimo modelis nėra aiškus (22). Manoma, kad miRISC slopina transliacijos iniciaciją sąveikaudamas su eIF4F-kepurės atpaţinimo vienetu taip sutrikdydamas ribosomų prisijungimą (22).
2 pav. miRISC komplekso valdoma po-transkripcinė genų reguliacija
(Jonas S, Izaurralde E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing, 2015)
17 1.1.3. Mikro-RNR ir ţmogaus ligos
Daugėjant informacijos apie RNR, mokslinių tyrimų tematika buvo nukreipta mikro-RNR charakterizavimui ţmogaus ligų kontekste. Buvo įrodyta, kad mikro-mikro-RNR yra susijusi su ląstelės ciklu, proliferacija, organizmo metaboliniais procesais, hematopoetine diferenciacija, imuniniu atsaku ir kitais procesais. Buvo nustatyta, kad reikšminga dalis mikro-RNR koduojančių genų yra išsidėstę mutacijoms jautriuose genomo regionuose. Maţdaug 50 proc. ţmogaus mikro-RNR genų yra chromosominių mutacijų karštuosiuose taškuose (angl. hot-spots) (23). Yra ţinomi keli mikro-RNR genų raiškos pokyčių mechanizmai, įskaitant epigenetinę reguliaciją, branduolio receptorių signalinius kelius, vieno nukleotido polimorfizmus. Pakitus RNR reguliaciniams mechanizmams, keičiasi mikro-RNR genų-taikinių raiška, kas lemia ligų išsivystymą (24) .
Nagrinėjant mikro-RNR vaidmenį onkologinėse ligose buvo nustatyta, kad mikro-RNR genų raiškos profiliai skiriasi tarp navikinio ir sveiko audinio, taip pat skirtumai buvo pastebėti ir tarp skirtingų navikų tipų (25). Onkologijoje mikro-RNR yra suskirstytos į du tipus. Dėl genų raiškos pokyčių, kai kurios mikro-RNR gali veikti kaip onkogenai (angl. onco-miRs) arba kaip naviką slopinančios mikro-RNR (angl. ts-miRs) (26).
Daugelis mikro-RNR yra svarbios nervų sistemos funkcijai palaikyti. Apie 70 proc. visų mikro-RNR yra aptinkama smegenyse ir didţioji jų dalis yra specifiškos neuronams (27). Mikro-RNR yra susijusios su nervų sistemos vystymuisi ir šių molekulių raiškos nuokrypiai yra būdingi daugeliui neurologinių sutrikimų (28).
Yra ţinoma,kad mikro-RNR genų raiškos pokyčiai yra susiję suširdies ir kraujagyslių sistemos ligomis. miR-21, miR-29a, miR-129, miR-210, miR-211, miR-320, miR-423, ir let-7c atlieka svarbų vaidmenį širdies ir kraujagyslių sistemos susiformavime fetogenezės metu (29). Keletas autorių susiejo mikro-RNR genų raiškos pokyčius su širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimais, tokiais kaip aterosklerozė, IŠL, miokardo infarktas (MI) ir širdies funkcijos nepakankamumas (30).
1.1.4. Mikro-RNR kaip širdies ir kraujagyslių sistemos ligų bioţymenys
Mikro-RNR molekulės yra labai stabilios ir gali būti aptinkamos visuose audiniuose, įskaitant ir organizmo skysčius – šlapimą, seiles, kraują. Kraujyje cirkuliuojančios mikro-RNR molekulės yra laikomos potencialiais įvairioms ligoms specifiškais bioţymenimis. Pastebėta, kad sergant širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis reikšmingai kinta cirkuliuojančių mikro-RNR kiekiai (31).
Hoeckstra su bendraautoriaisvieni iš pirmųjų atliko cirkuliuojančių mikro RNR tyrimus pacientams sergantiems stabilia krūtinės angina (SKA). Iš 157 tirtų mikro-RNR, buvo nustatyta, kad SKA
18 pacientams miR-135a ir miR-147 kiekiai kraujyje yra reikšmingai padidėję palyginus su sveikų asmenų grupe (32). Taurino su bendraautoriais nustatė kraujyje cirkuliuojančių miR-140-3p ir miR-182 sumaţėjimą SKA pacientams (33). Fichtlscherer su kolegomis aptiko cirkuliuojančių endotelinės kilmės 126, miR-92a, miR-17), lygiųjų raumenų kilmės 145) ir uţdegiminių ląstelių kilmės (miR-155) mikro-RNR molekulių sumaţėjimą. Taip pat buvo nustatytas širdies raumenų kilmės miR-133 ir miR-208 padidėjimas SKA pacientams (34). Šiuo metu yra atlikta daug pavienių IŠL mikro-RNR genų raiškos studijų. Schulte su kolegomis susistemino įvairių mikro-RNR molekulių tyrimus IŠL sergančių pacientų kraujyje (1 lentelė). Įvardintos mikro-RNR molekulės pateiktos kaip potencialūs ateities bioţymenys SKA ir nestabilios krūtinės anginos (NKA) diagnostikai (31).
Hoekstrasu bendraautoriais taip pat aptiko, kad miR-134, miR-198 ir miR-370 raiška buvo didesnė NKA sergantiems pacientams palyginus su SKA pacientais (32). Taip pat buvo nustatytas stiprus miR-208b ir miR-499-5p ryšys su miokardo infarktu. Abiejų mikro-RNR kiekis kraujo plazmoje buvo susijęs su kairiojo skilvelio išmetimo frakcija. Įdomu tai, kad miR-499-5p tiksliau nei širdies troponinai diferencijavo NSTEMI nuo ūmaus širdies funkcijos nepakankamumo (35).Ţinant,kad miR-499-5p yra aptinkama išskirtinai širdyje, ši molekulė galėtų tapti papildomu MI bioţymeniu (36).
Įvairių tyrimų rezultatai rodo, kad mikro-RNR genų raiška kinta esant širdies audinio išemijai ir šios molekulės galėtų būtų diagnostinis bioţymuo IŠL ir MI. Taip pat, remiantis prieš tai minėtomis studijomis, manoma, kad mikro-RNR molekulės turi ne tik diagnostinę, bet ir prognostinę vertę, ypač sergant IŠL ir MI.
1 lentelė. Mikro-RNR molekulių raiškos pokyčiai kraujyje sergant IŠL (įskaitant KA ir NKA (Schulte C, Zeller T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease—Summing
up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 2015;5(1):17-36)
mikro-RNR Tiriamoji medţiaga
Pokyčio kryptis Bioţymens tipas Šaltinių skaičius
miR-1 plazma ↑ sergant SKA diagnostinis 1
miR-17 plazma ↓sergant IŠL diagnostinis 1
miR-19a kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-21 plazma ↑ sergant NKA diagnostinis 1
miR-25 plazma ↑ sergant NKA diagnostinis 1
miR-29a kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-30e-5p
plazma ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
19 mikro-RNR Tiriamoji
medţiaga Pokyčio kryptis Bioţymens tipas
Šaltinių skaičius
miR-92a plazma ↑ sergant NKA diagnostinis 1
miR-106b plazma ↑ sergant NKA diagnostinis 2
miR-126 plazma ↑ sergant SKA diagnostinis 1
miR-133 plazma ↑ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-133a plazma ↑ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-135a PKVL* ↑ sergant SKA diagnostinis 1
miR-140-3p kraujas ↑ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-145 kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-146 PKVL ↑ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-147 PKVL ↓ sergant SKA diagnostinis 1
miR-150 kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-155 plazma, PKVL* ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-181d kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-182 kraujas ↑ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-208a plazma ↑ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-214 plazma ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-221 PKVL* ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-222 kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-342 kraujas ↑ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-378 kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-484 kraujas ↓ sergant IŠL diagnostinis 1
miR-485-3p plazma ↑ sergant SKA diagnostinis 1
miR-590-5p plazma ↑ sergant NKA diagnostinis 1
20 1.2. Išeminė širdies liga
1.2.1. Epidemiologija ir etiologija
Širdies ir kraujagyslių sistemos ligos išsivysčiusiose vakarų šalyse, o taip pat ir Lietuvoje, yra daţniausia mirties prieţastis. Pasaulyje nuo širdies ir kraujagyslių sistemos ligų kiekvienais metais miršta daugiau nei 17 milijonų ţmonių, kas sudaro 30 proc. visų mirčių (3 pav.). Išeminė širdies liga – daţniausia širdies ir kraujagyslių sistemos liga pasaulyje. Išeminė širdies liga išskiriama į stabilią krūtinės anginą ir ūmų koronarinį sindromą (2) . Pagrindinė mirties prieţastis sergant IŠL – ūmus koronarinis sindromas. Nuo IŠL ir jos sukeltų komplikacijų 2015 metais pasaulyje mirė 7,4 milijonai ţmonių (1). Nuo 1990 metų iki 2010 mirtingumas nuo IŠL padidėjo 35 proc. (37). Remiantis Nacionalinio Higienos instituto duomenimis, dėl IŠL 2016 metais Lietuvoje mirė 1330 gyventojų (38).
Liga diagnozuojama įvairiame amţiuje, tačiau vyresniems pacientams daţniausiai nustatoma jau paţengusi ligos forma (39). IŠL daţniau serga vyrai, nei moterys. Vyrams rizika susirgti IŠL didėja sulaukus 45-erių, o moterims 55-erių (40).
Pagrindinis IŠL išsivystymo patogenezinis mechanizmas yra aterosklerozė. Skirtingi veiksniai, tokie kaip hipertenzija, dislipidemija, nutukimas, rūkymas, maţas fizinis aktyvumas, padidėjęs maţo tankio lipoproteinų (MTL), cholesterolio, gliukozės kiekis kraujyje, diabetas, lėtinė inkstų liga, bei genetiniai veiksniai yra susiję su ateroskleroze bei IŠL išsivystymu (3).
3 pav. Tarptautinis mirčių nuo ŠKL žemėlapis standartizuotas pagal amžių, 2015 m. (Roth, G.A. et ak. J Am Coll, Cardiol. 2017;70(1):1-25)
21 1.2.2. Aterosklerozės patogenezės ryšys su mikro-RNR pokyčiais
Kiekvienais metais daugėja įrodymų patvirtinančių mikro-RNR svarbą aterosklerozės vystymosi procese. Aterosklerozė – lėtinis uţdegiminis procesas kylantis dėl endotelio paţeidimo arterijos sienoje. Aterosklerozinis procesas yra charakterizuojamas arterijų sienose besikaupiančiais lipidais, fibrininiais elementais, bei uţdegiminėmis molekulėmis (30).
Kepenys atlieka labai svarbų vaidmenį lipoproteinų homeostazėje. Per pastarąjį dešimtmetį buvo aptikta keletas mikro-RNR, susijusių su lipoproteinų metabolizmu (41). Sutrikus lipidų homeostazei, arterijų šakose susikaupę maţo tankio lipoproteinai įsiurbiami į subendotelinį tarpą, kur vyksta jų modifikacija ir oksidacija. Modifikuotos MTL dalelės yra potencialios chemotaktinės molekulės, kurios indukuoja endotelio paviršinių ir intraląstelinių adhezinių molekulių VCAM-1 (angl.Vascular cell adhesion protein 1), P ir Eselektinų raišką (3,42).Harris ir Suárez kartu su kolegomis aprašė, kad VCAM-1 ir E selektino raiška yra neigiamai reguliuojama miR-126 ir TNFα (angl. tumor necrosis factor alpha) suţadintos miR-31. (43,44). Padidėjusi endotelio adhezinių molekulių raiška lemia suaktyvėjusią leukocitų adheziją ir migraciją į subendotelinį tarpą. Kraujagyslės intimoje monocitai virsta makrofagais. Makrofagai prisijungia prie modifikuotų MTL ir virsta putotomis ląstelėmis (angl. foam cells) kurios sintetina uţdegiminius citokinus, įskaitant interleukinus ir TNFα (45). Makrofagų brendimas ir uţdegiminio fenotipo įgijimas yra reguliuojamas mikro-RNR molekulių. MiR-125a-5p ir miR-146a maţina lipidų pasisavinimą ir uţdegiminių citokinų sintezę makrofaguose (46,47). MiR-155 ir miR-19a reguliuoja makrofagų virtimą putotomis ląstelėmis veikdama per transkripcijos faktorių HBP1 (angl. HMG box-transcriptional protein 1), kuris neigiamai reguliuoja makrofagus slopinantį baltymą MIF (angl. macrophage inhibitory factor) (48,49). Skirtingi autoriai aprašė keletą mikro-RNR molekulių reguliuojančių makrofagų fenotipo pasikeitimą (41).
Besitęsiant uţdegiminiam procesui kraujagyslės sienoje, aktyvuoti leukocitai ir intersticinės arterijų sienos ląstelės sintetina fibrinogeno mediatorius bei augimo faktorius. Progresuojant ateroskleroziniams paţeidimams vyksta putotųjų ir lygiųjų raumenų ląstelių apoptozė, paţeistose zonose susiformuoja ţuvusių ląstelių nuosėdos ir lipidų depai (50). Jungiamasis audinys palaipsniui praranda fibroceliulinę funkciją ir yra pakeičiamas daug kolageno turinčiu fibrininiu audiniu, kuris yra dominuojantis aterosklerozinės plokštelės elementas - susiformuoja fibrininis stogelis. Yra ţinoma, kad mikro-RNR molekulės atlieka svarbų vaidmenį aterosklerozinės plokštelės plyšime, trombozėje ir ūmių koronarinių įvykių išsivystyme (51).
22 1.3. Genetiniai ţymenys aterosklerozės procese
1.3.1. Arachidono r. metabolizmas ir biologiškai aktyvių darinių sintezė
Uţdegimas yra viena iš organizmo imuninės sistemos fiziologinio atsako išraiškų. Arachidono r. (kuri gaunama iš ląstelės plazminės membranos) metabolizmo dariniai atlieka svarbų vaidmenį uţdegiminių reakcijų reguliavime (4 pav.). Prostaglandinai (PGs) yra vieni svarbiausių arachidono r. darinių, kurie aptinkami visose organizmo ląstelėse. Šiuo metu yra ţinomos 5 prostaglandinų klasės – TXA2, PGE2, PGI2, PGD2, PGF2a. TXA2 pagrindinė funkcija – kraujagyslių sutraukimas (vazokonstrikcija) ir trombocitų agregacijos skatinimas (52). PGE2 reguliuoja keletą organizmo funkcijų, įskaitant imuninį atsaką ir kraujospūdį (53). PGI2 yra svarbus širdies ir kraujagyslių homeostazės palaikymui ir veikia kaip kraujagysles plečiantis veiksnys (vazodilatatorius), taip pat yra ţinoma, kad PGI2 slopina trombocitų agregaciją, leukocitų adheziją ir VSMC proliferaciją (54). PGD2 reguliuoja organizmo atsaką į alergenus ir yra potencialus bronchokonstriktorius ir vazodilatatorius (55). PG sintezę iš arachidono r. vykdo ciklooksigenazės (COX1 ir COX2) (56). Kita grupė arachidono r. metabolizuojančių fermentų yra lipooksigenazės (LOX). Arachidono r. metabolizmo LOX fermentais produktai yra uţdegiminiai mediatoriai leukotrienai (LTs) ir uţdegimą slopinantyslipoksinai (LXs) (57) (4 pav.).
Arachidono r. gali būti metabolizuojama dar vienu keliu – dalyvaujant CYP450 šeimos fermentams (58). CYP4F ir 4A genų pošeimės koduoja fermentą – ω-hidroksilazę (59). Arachidono r. veikiant ω-hidroksilaze susiformuoja 20-hidroksieikosatetrenoinė rūgštis (angl. 20-hydroxyeicosatetraenoic acid, 20-HETE), kuri laikoma uţdegiminiu mediatoriumi ir siejama su kraujagyslių reaktyvumu, remodeliacija, angiogeneze ir kraujagysliniu uţdegimu (60). Uţdegimas kraujagyslėse tiesiogiai prisideda prie aterosklerozės išsivystymo. Atliktos in vitro studijos parodė, kad 20-HETE padidina reaktyvaus deguonies (angl. reactive oxygen species, ROS) kiekį ir NF-kβ aktyvumą endotelio ląstelėse, kas lemia ląstelių aktyvaciją ir adhezinių molekuliųICAM ir VCAM1, bei uţdegiminių mediatorių sintezę (61). NF-kβ yra uţdegiminis transkripcijos aktyvatorius ir susijungęs su ROS atlieka esminį vaidmenį uţdegimui palankios aplinkos kraujagyslėse palaikyme (62). Taip pat yra įrodymų, jog 20-HETE molekulė svarbi hipertenzijos išsivystyme (63).
Ţinoma, kad pagrindiniai ω-hidroksilazę koduojantys genai priklauso CYP4F ir CYP4A pošeimėms. Lasker su kolegomis nustatė, kad CYP4F2 genas gali būti atsakingas uţ 70 proc. visos 20-HETEsintezės inkstuose (64). Įdomu tai, kad CYP4F2 geno koduojama ω-hidroksilazė metabolizuoja uţdegiminiams mediatoriams priskiriamą leukotrienų šeimos molekulę LTB4, kuri yra sintetinama leukocitų ir veikia kaip potenciali chemotaksinė molekulė (58,65). Nuo CYP4F2 geno koduojamos ω-hidroksilazės priklausoma 20-HETE sintezė ir LTB4 deaktyvavimas rodo, kad šis genas yra svarbus ne tik uţdegiminių reakcijų aktyvavime, bet ir slopinime.
23
4 pav. Arachidono rūgšties metabolizmo schema
1.3.2. HNF4α genas
Kaip ir kitų genų, CYP450 aktyvumas gali kisti dėl keleto prieţasčių, įskaitant mutacijas, transkripcinių veiksnių aktyvumą ir epigenetinius pokyčius, tokius kaip DNR metilinimas, histonų modifikacija, bei mikro-RNR aktyvumas (66). Yra aprašyta keletas polimorfizmų, turinčių poveikį 20-HETE ir LTB4 metabolizmui. Pavyzdţiui, funkcinis CYP4F2 geno vieno nukleotido polimorfizmas (rs2108622) lemia sumaţėjusią 20-HETE koncentraciją (67,68).
Didţioji dalis CYP450 šeimos genų yra reguliuojami transkripcijos faktorių, tokių kaip HNF4A, ESR1, NR1I3, NCOR1, NCOR2, PGRMC1 ir kitų. Yra identifikuota keletas CYP450 šeimos genų, kurie yra reguliuojami HNF4α (69). HNF4α veikia per pregano receptorių X (PXR) ir konstitutatyvinį androstano receptorių (CAR) (70).
Bolotin ir kolegų atlikta HNF4α genų-taikinių analizė parodė, kad CYP4F2 geno promotorius turi HNF4α prisijungimo sritį, tačiau jokių funkcinių CYP4F2 ir HNF4α tyrimų nėra atlikta (71).
1.3.3. Hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p
Ţmogaus miR-24-3p nėra plačiai ištyrinėta, tačiau keletas studijų šią molekulę susiejo su keliomis skirtingomis ligų grupėmis, įskaitant onkologines, neurologines, bei ŠKL.
Fidler su kolegomis nustatė, jog hipoksijos indukuota miR-24 yra vienas iš esminių lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijos slopintojų (72). Hsa-miR-24-3p geno raiškos padidėjimas taip pat buvo pastebėtas pacientams su miego arterijos stenoze bei IŠL (73,74).
24 Hsa-miR-34a-5p vaidmuo ŠKL taip pat nėra plačiai ištyrinėtas. Yra ţinoma, kad miR-34a raiška didėja senstant ir šią molekulę koduojančio geno delecija arba nutildymas sumaţina nuo amţiaus priklausomą kardiomiocitų ţūtį. Įdomu ir tai, kad miR-34a nuslopinimas lėtina ląstelių nekrozę ir fibrozę MI metu ir pagerina širdies miokardo gijimą (75).
Neseniai pasirodţiusioje Asfar ir kolegų atliktoje studijoje, miR-24-3p ir miR-34a-5p įvardintos kaip potencialios HNF4a efektorinės molekulės. MiR-24-3p ir miR-34a-5p reguliavo ne tik HNF4α geno raišką, bet irkrešėjimo sistemos veiksnių kiekį (76).
Šiame moksliniame tyrime, remdamiesi Bolotin ir Asfar bei kolegų gautais rezultatais, įvertinsime hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p molekulių vaidmenį CYP4F2, bei HNF4α genų raiškos reguliavime.
25
2. Tyrimo metodika
2.1. Tyrimo planavimas
Magistro baigiamojo darbo tyrimai buvo atliekami LSMU KI Molekulinės kardiologijos laboratorijoje, gavus Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (Nr. BE-2-42), bei LSMU bioetikos centro patvirtinimą (Nr. BEC-LMB(M)-291).
2.2. Tyrimo objektas
Magistro baigiamojo darbo tyrimų metu buvo ištirta hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genųraiška tiriamųjų, sergančių stabilia krūtinės angina ir kontrolinės sveikų asmenų grupės kraujo plazmoje.
2.3. Tiriamųjų atranka
Tiriamieji pacientai – LSMU KK Kardiologijos klinikos pacientai, kuriems pirmą kartą diagnozuota SKA ir paskirtas planinis operacinis gydymas. Kontrolinių asmenų grupę sudarė asmenys, per paskutinius 2 mėnesius neturėję nusiskundimų sveikata, nevartojantys antibiotikų, antiagregantų ir antikoaguliantų. Visi moksliniame tyrime dalyvavę asmenys pasirašė informuoto asmens sutikimo formą. SKA grupės ligoniams buvo skiriamas standartinis gydymas. Intervencija į šių ligonių gydymą nebuvo atliekama. Pacientų vartojami vaistai buvo suskirstyti į grupes, pateiktas 2-oje lentelėje.
2 lentelė. Pacientų vartotų medikamentų grupės
Medikamentai Medikamentų grupė Vartojantys
n (proc.) metroprololis, nebivololis, bisoprololis β blokatoriai 26 (76,5)
perindoprilis, ramiprilis AKF inhibitoriai 21 (61,8)
gliklazidas, metforminas Prieš-diabetiniai 6 (17,6)
omeprazolis Protonų siurblio inhibitoriai 12 (35,3)
26
torazemidas, furozemidas, indapamidas Diuretikai 6 (17,6)
alprazolamas, lorazepamas Psichotropiniai vaistai 4 (11,8)
ranitidinas H2 receptorių blokatoriai 5 (15,6)
izosorbido mononitratas Nitratų grupės vaistai 7 (26,6)
fraksiparinas Maţos molekulinės masės
heparinas 14 (41,2)
atorvastatinas Statinai 25 (73,5)
moksonidinas, trimetazidinas, ivabradinas, rilmenidinas, L-tiroksinas,
valsartanas, spironolaktonas, prednizolonas
Kiti vaistai (vartojo maţiau nei
10 proc. pacientų) 9 (26,5)
2.4. Tyrimo metodai
2.4.1. Kraujo plazmos surinkimas
Visuminės RNR gryninimui veninis kraujas buvo surinktas į vakuuminius mėgintuvėlius su antikoaguliantu K3 EDTA. Vakuuminiai mėgintuvėliai per vieną valandą nuo kraujo paėmimo buvo
nucentrifuguojami 1900 xG, 10 min, kambario temperatūroje. Į 2 eppendorf tipo mėgintuvėlius buvo surenkama po 550-660 μl plazmos. Surinkta plazma pakartotinai centrifuguota 3000 xG, 5 min, 4°C temperatūroje siekiant pašalinti pirmojo centrifugavimo metu neatsiskyrusias kraujo ląsteles. Pakartotinai nucentrifuguota plazma buvo nusiurbiama į naujus eppendorf tipo mėgintuvėlius, paliekant 50-100 μl plazmos mėgintuvėlio dugne ir nepaliečiant susiformavusių nuosėdų.
2.4.2 Plazmos šviesos absorbcijos matavimas spektrofotometru
Buvo nustatyta, kad hemolizė – laisvas hemoglobinas plazmoje, iškreipia mikro-RNR tyrimų rezultatus. Laisvą hemoglobiną galima nustatyti tiriant kraujo plazmą spektrofotometru, 414 nm bangos ilgyje (77). Remiantis Kirschner ir kt., mėginiai, kurių absorbcija ties 414 nm bangos ilgiu viršija 0,2 nėra tinkami tolimesniems tyrimams (78,79). Tiriamųjų plazmos ėminių absorbcija buvo nustatyta Thermo Scientific „NanoDrop 2000“prietaisu, pasirenkant "UV-Vis" programą ir nustatant 414 nm
27 matuojamą bangos ilgį. Paruošti ir atrinkti plazmos mėginiai buvolaikomi -80°C temperatūroje iki ištyrimo.
2.4.3. Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) gryninimas
DNR gryninimui buvo naudojamas kraujas, gautas prieš tai nucentrifugavus vakuuminius mėgintuvėlius paveiktus K3 EDTA antikoaguliantu. DNR buvo gryninama naudojant komercinį Thermo
Scientific „GeneJet Genomic DNA Purification Kit“ rinkinį, vadovaujantis gamintojo rekomendacijomis. Metodas:
1. Į 200 μl kraujo įpilama 400 μl Lysis buferio ir 20 μl proteinazės K. Mišinys gerai išmaišomas. 2. Mėginiai inkubuojami šildančioje purtyklėje, 56°C, 10min.
3. Į mėgintuvėlius pridedama 200 μl 96 proc. etanolio. Mėginiai gerai išmaišomi.
4. Paruoštas lizatas perkeliamas į originalią silikagelinę kolonėlę. Kolonėlė centrifuguojama 6000 xG, 1min, kambario temeperatūroje. Surenkamasis mėgintuvėlis su skysčiu pašalinamas. Kolonėlė perkeliama į naują surenkamajį mėgintuvėlį.
5. Į kolonėles įpilama 500 μl plovimo buferio I (angl. wash buffer I). Kolonėlės centrifuguojamos 8000 xG, 1min, kambario temperatūroje. Surenkamajame mėgintuvėlyje susikaupęs skystis nupilamas.
6. Į kolonėles įpilama 500 μlplovimo buferio II (angl. wash buffer II). Centrifuguojama 12000 xG, 3 min, kambario temperatūroje. Surenkamasis mėgintuvėlis pašalinamas. Silikagelinė kolonėlė įdedama į sterilų 1,5 ml eppendorf tipo mėgintuvėlį.
7. Ant kolonėles membranos uţpilama 200 μl nuplovimo (angl. elutionbuffer) buferio. Mėginiai inkubuojami 2 min, kambario temperatūroje. Po inkubacijos kolonėlės centrifuguojamos 8000 xG, 1 min.
8. Nucentrifugavus silikagelinė kolonėlė pašalinama. Eppendorf tipo mėgintuvėliai su išgryninta genomine DNR saugomi -20°C temperatūroje.
28 2.4.4. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru
Tolimesniems DNR tyrimams būtina nustatyti išgrynintos DNR koncentraciją ir grynumą. Koncentracija ir DNR švarumas buvo nustatomi naudojant Thermo Scientific„NanoDrop 2000“ spektrofotometrą, pasirinkus nukleorūgščių koncentracijos matavimo programą (angl. Nucleic Acid).DNR grynumas įvertinas pagal mėginio 260/280 nm ir 260/230 nm bangų ilgių absorbcijos santykius.
2.4.5. Visuminės RNR išgryninimas iš kraujo plazmos
Visuminė RNR iš kraujo plazmos buvo išgryninta naudojant komercinį Qiagen „miRneasy serum/plasma kit“ rinkinį, vadovaujantis gamintojo rekomendacijomis
Metodas:
1. Iš -80°C ištraukta plazma buvo inkubuojama kambario temperatūroje 20 min. Atšilusi plazma centrifuguojama 3000 xG, 5 min, 4°C temperatūroje.
2. Į sterilius eppendorftipo mėgintuvėlius perpilama 200 μl nucentrifuguotos plazmos vidurinės porcijos, neįsiurbiant susiformavusių nuosėdų.
3. Į kiekvieną mėgintuvėlį pilama 1000 μl QiaZol lysis reagento ir gerai išmaišoma (~15 s). Inkubuojama 5 min, kambario temperatūroje.
4. Po inkubacijos į mėgintuvėlius įpilama po 200 μl chloroformo ir gerai išmaišoma (~15-20 s). Inkubuojama 3 min, kambario temperatūroje.
5. Mėginiai centrifuguojami 12000 xG, 15 min, 4°C temperatūroje. Susidaręs skaidrus supernatantas perkeliamas į sterilius eppendorf tipo mėgintuvėlius.
6. Į mėgintuvėlius įpilama, 1,5 karto daugiau (~900 μl) nei buvo nusriubta supernatanto, 100 proc.etanolio. Mišinys gerai sumaišomas pipetuojant.
7. 700 μl išmaišyto supernatanto ir etanolio mišinio perkeliama į originalias silikagelines kolonėles. Kolonėles centrifuguojamos 10000 xG, 15 s, kambario temperatūroje. Surenkamajame mėgintuvėlyje susikaupęs turinys pašalinamas ir centrifugavimas kartojamas,kol per silikagelinės kolonėlės membraną perfiltruojamas visas supernatanto – etanolio mišinys.
8. Į silkagelines kolonėles įpilama 700 μl RWT plovimo buferio, centrifuguojama 10000 xG, 15 s, kambario temperatūroje. Surenkamajame mėgintuvėlyje susikaupęs turinys pašalinamas.
9. Į silkagelines kolonėles įpilama 500 μl RPE plovimo buferio, centrifuguojama 10000 xG, 15 s, kambario temperatūroje. Surenkamajame mėgintuvėlyje susikaupęs turinys pašalinamas.
29
10. Į silikagelines kolonėles įpilama 500 μl 80 proc. etanolio, centrifuguojama 10000 xG, 2 min, kambario temperatūroje.
11. Kolonėlė perkeliama į naują surenkamajį mėgintuvėlį. Kolonėles centrifuguojamos atvirais dangteliais 13000 xG, 5 min, kambario temperatūroje siekiant pašalinti visą susikaupusį skystį ir išdţiovinti membraną.
12. Kolonėlės perkeliamos į naujuseppendorftipo mėgintuvėlius. Ant kolonėlės membranos centro uţpilama 16 μl sterilaus vandens be Rnazių. Kolonėlės centrifuguojamos 13000 xG, 1 min, kambario temperatūroje.
13. Eppendorf tipo mėgintuvėliuose nusėdusi visuminė RNR išpilstyta po 6 μl į 0,5 ml mėgintuvėlius. Visuminės RNR mėginiai saugomi -80°C temperatūroje.
2.4.6.CYP4F2 fermento nustatymas kraujo plazmoje ELISA metodu
CYP4F2 fermento koncentracija kraujo plazmoje buvo nustatyta naudojant komercinį Cloud-Clone CorpELISArinkinį „Enzyme-linked immunosorbent Assay Kit“ (http://www.cloud-clone.com/products/SEL399Hu.html). Mėginių absorbcija buvo nustatyta „StatFax 4200“ (Awaraness Technologies, JAVhttps://gmi-inc.com/awareness-technologies-stat-fax-4200-microplate-reader.html) prietaisu,taikant 450 nm bangos ilgio filtrą.
Metodas:
1. Plazma atšildoma +4°C.
2. Įpirmus 8 šulinėlius supilstomi 7 skirtingos koncentracijos standartiniai mėginiai ir vienas neigiamos kontrolės mėginys. Į likusius mėgintuvėlius supilama po 100 μl atšildytos kraujo plazmos. Plokštelė uţdengiama originalia plėvele ir inkubuojama 37°C, 1 h.
3. Iš kiekvieno plokštelės šulinėlio pašalinamas skystis.
4. Į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 μl reagento A (angl. detection reagent A). Plokštelė uţklijuojama originalia plėvele ir inkubuojama 37°C temperatūroje, 1 h.
5. Iš kiekvieno plokštelės šulinėlio nusiurbiamas skystis. 8 kanalų pipete, kiekvienas šulinėlis plaunamas 350 μlplovimo buferiu (angl. 1x wash Solution). Uţpildţius šulinėlius, plokštelė inkubuojama 2 min kambario temperatūroje. Po inkubacijos iš kiekvieno šulinėlio nusiurbiamas skystis ir plokštelė nukrečiama ant absorbcinio popieriaus. Plovimas kartojamas 3 kartus.
30 6. Į kiekvieną šulinėlį įpilama reagento B (angl. detection reagent B). Plokštelė uţklijuojama
originalia plėvele ir inkubuojama 37°C, 1 h.
7. Atliekamas plovimas aprašytas 5-ame punkte. Plovimas kartojamas 4 kartus.
8. Į kiekvieną šulinėlį įpilama 90 μl substrato tirpalo (angl. substrate solution). Plokštelė uţklijuojama originalia plėvele ir inkubuojama tamsoje, 37°C, 20 min.Po inkubacijos šulinėliuose esantys skystis nusidaţys mėlyna spalva.
9. Plokštelė įdedama į analizatorių. Išmatuojama mėginių absorbcija taikant 450 nm bangos ilgio filtrą.
2.4.7. Atvirkštinės transkripcijos reakcija
Atvirkštinės transkripcijos reakcija buvo atlikta vadovaujantis gamintojo rekomendacijomis, naudojant komercinį Exiqon „cDNA synthesis kit“ („Qiagen“, Vokietija, https://www.qiagen.com/us/shop/pcr/primer-sets/mircury-lna-rt-kit/). Visa mėginyje esanti mikro-RNR buvo transkribuota į komplementarią DNR (kDNA). Poly-A polimerazė naudota poliadenilinti subrendusias mikro-RNR. Atvirkštinės transkriptazės fermentas panaudotas oligo-Dt pradmenims transkribuoti subrendusią mikro-RNR į kDNR. Pagal 3-oje lentelėje pateiktą pavyzdį buvo ruošiamas reakcijos mišinys. Buvo naudota neskiesta visuminė RNR.Paruošti mėginiai perkelti į termociklerį „Biometra TAdvanced“ ir paleistas reikiamas laiko / temperatūrinis reţimas: 40°C – 60 min, 95°C – 5 min. Po reakcijos kDNR uţšaldyta -30°C.
3 lentelė. Atvirkštinės transkripcijos reakcijos mišinio sudėtis
Reagentai 1 pvz.,μl
5x Reakcijos buferis
(5x miRCURY RT Reaction Buffer) 2 μl
10 x Fermentų mišinys (10x miRCURY RT Enzyme Mix) 1 μl
Sterilus vanduo 1 μl
Išgryninta visuminė RNR 6 μl
31 2.4.8. Kiekybinė tikro-laiko PGR
Tiriamųjų mėginių kDNA buvo gausinama „Applied biosystems 7900HT“ (Thermo Fischer Scientific, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4329001) termocikleriu. Tyrimams naudoti „Exiqon“ LNA (angl. Locked Nucleic Acid) technologijos komerciniai pradmenys („Qiagen“, Vokietija, https://www.qiagen.com/us/shop/pcr/primer-sets/mircury-lna-mirna-pcr-assays/). PGR mišinio sudėtis pateikta 4-ioje lentelėje. Į kiekvieną šulinėlį buvo įnešama 2 μl, 3,6 karto praskiestos kDNA. Reakcija atlikta trijų pakartojimų būdu. Reakcijos sąlygos pateiktos 4-oje lentelėje. Remiantis gamintojo rekomendacijomis, mikro-RNR genų raiškos duomenys buvo normalizuotinaudojant hsa-miR-103a-3p kaip endogeninę kontrolę. Santykinė hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiška buvo apskaičiuota pagal ∆∆Ctmetodą (80):
1. ∆Ct= Ct (tiriamoji. miR) – Ct (referentinė. miR)
2. ∆∆Ct = ∆Ct (SKA tiriamoji. miR) - ∆Ct(Kontr. referentinė. miR) 3. FC (angl. foldchange, pokytis kartais) = 2-∆∆CT
Metodas
1. Pagal pateiktą lentelę, kiekvienai tiriamajai RNR paruošiami atskiri reakcijos mišiniai su specifiniais pradmenimis.
2. Į tiriamuosius 96 plokštelės šulinėlius įpilama po 3 μl PGR mišinio. 3. Į kiekvieną tiriamąjį šulinėlį įpilama po 2 μl praskiestos kDNA. 4. Plokštelė uţklijuojama originalia optine plėvele ir centrifuguojama.
5. Nustatomas lentelėje pateiktas temperatūrinis reţimas ir paleidţiama reakcija (5 lentelė).
4 ir 5 lentelės. Kiekybinio TL-PGR mišinio sudėtis ir temperatūrinis režimas
Reakcijos mišinio sudėtis 1 pvz.
2x SYBR Green reakcijos mišinys (2x miRCURY SYBR Green Master
Mix) 5 μl PGR pradmenų mišinys 1 μl kDNR 4 μl Viso 10 μl Reakcijos sąlygos 95°C 10 min 95°C 15 s 40 ciklų 60°C 60 s 60°C → 95°C Lydymosi kreivė
32 2.4.9. Kokybinė tikro-laiko PGR
CYP4F2 geno vieno nukleotido polimorfizmai buvo nustatyti naudojant tikro-laiko PGR
metodą „Applied biosystems 7900HT“ (Thermo Fischer Scientific,
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4329001) termocikleriu. Genotipavimui naudoti originalūs „Applied Biosystems“ pradmenys ir fluorescenciniai zondai „TaqMan SNP assays“ (Thermo Fisher Scientific, https://www.thermofisher.com/lt/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/snp-genotyping-taqman-assays.html). Kiekvienai reakcijai buvo naudojama 1 μl genominės DNR ir 9 μl reakcijos mišinio. Genotipavimo mišinio sudėtis ir PGR sąlygos pateiktos 6-oje ir 7-oje lentelėse.
6 ir 7 lentelės. Genotipavimo TL-PGR mišinio sudėtis ir temperatūrinis režimas
2.4.10. Statistinė analizė
Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojant „IBM SPSS Statistics v 23.0” programinės įrangos paketą. Skirtumams tarp dviejų nepriklausomų grupių įvertinti naudotas Mann-Whitney U testas. CYP4F2 genetinių variantų pasiskirstymui tarp SKA ir kontrolinės grupės įvertinti taikytas χ² skaičiavimas. CYP4F2 koncentracijos skirtumams tarp CYP4F2 genetinių variantų įvertinti naudotas Kruskal Wallis H kriterijus. Ryšiui tarp mikro-RNR genų raiškos ir CYP4F2 koncentracijos nustatyti pritaikytas Spearman koreliacijos testas. Skirtumai vertinti kaip statistiškai reikšmingi kai p<0,05.
Reakcijos mišinio sudėtis 1 pvz. TaqMan Universal Master Mix 5 μl
TaqMan SNP assay 0,5 μl Sterilus vanduo 3,5 μl Viso 9 μl Reakcijos sąlygos 50°C 2 min 95°C 10 min 95°C 15 s. 40 ciklų 60°C 90 s
33
3. REZULTATAI
Į tyrimą įtraukti asmenys (n=49) buvo suskirstyti į dvi grupes: kontrolinė sveikų asmenų grupė (n=15) ir SKA sergančių asmenų grupė (n=34). Tiriamųjų duomenys pateikti 8-oje lentelėje. Lyginant lyčių pasiskirstymą grupėse reikšmingų skirtumų nenustatyta (p=0,980). Tiriamųjų amţius grupėse buvo nevienodas: kontrolinės grupės amţiaus vidurkis buvo 53,67±11,9 metai, sergančių asmenų grupės – 62,47±11,52 metai. Skirtumas tarp SKA pacientų ir sveikų asmenų amţiaus buvo statistiškai reikšmingas (p=0,012).
8 lentelė. Tiriamųjų duomenys
Stabilia krūtinės angina sergantys pacientai n=34 Kontrolinė grupė n=15 p* Vyrai n (proc.) 18 (52,9) 8 (53,3) 0,980 Moterys n (proc.) 16 (47,1) 7 (46,7) CD n (proc.) 6 (17,6) - 0,179 Amţius
mediana / min.- maks. 61 (27-85) 51 (35-80) 0,012
* Mann-Whitney U kriterijus
3.1. Mikro-RNR genų raiškos kraujo plazmoje tyrimas kontrolinėje ir SKA sergančių pacientų grupėse
Ištyrus hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raišką kraujo plazmoje, kontrolinėje ir SKA grupėse buvo nustatyta, jog mikro-RNR genų raiška buvo maţesnė kontrolinėje grupėje, nei SKA sergančių pacientų grupėje (5 pav.). SKA sergančių pacientų kraujo plazmoje hsa-miR-24-3p geno raiška buvo 5,5 kartų aukštesnė nei kontrolinėje grupėje (FC = 5,49 (0,80-170); p=0,0001); hsa-miR-34a-5p geno raiška buvo aukštesnė vidutiniškai 4,26 kartų (FC = 4,26, (0,1-198,85) (p=0,002).
34
5pav. hsa-miR-24-3p ir hsa- miR-34a-5p genų raiškos skirtumai tarp tiriamųjų grupių (normalizuotos ∆CT reikšmės pateiktos logaritminėje skalėje)
3.2. CYP4F2 fermento koncentracijos kraujo plazmoje tyrimas
CYP4F2 fermento koncentracija kontrolinės grupės asmenų kraujo plazmoje buvo vidutiniškai 2 kartus didesnė nei SKA sergančių pacientų (16,0 ng/ml, (7,9-33,7) vs. 7,6 ng/ml(0,1-40,2); p=0,0001) (6 pav.). Taip pat buvo nustatyta, kad CYP4F2 koncentracija yra atvirkščiai proporcingai susijusi su miR-24-3p geno raiška kraujo plazmoje (Spearman koreliacijos koeficientas r=-0,346, p=0,016).
35 3.3. CYP4F2 (rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102) vieno nukleotido polimorfizmų nustatymas
Visiems tiriamiesiems buvo nustatyti CYP4F2 (rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102) geno vieno nukleotido polimorfizmai. Polimorfizmų pasiskirstymas ir daţnis (proc.) pateikti 9-oje lentelėje.
9 lentelė. Genotipų pasiskirstymas tiriamosiose grupėse
CYP4F2 VNP Genotipai Kontrolinė grupė n (proc.) (n=15) SKA grupė n (proc.) (n=34) p* rs2108622 CC CT TT 9 (60,0) 5 (33,3) 1 (6,7) 17 (50,0) 15 (44,1) 2(5,9) 0,778 rs1558139 AA AG GG 2 (13,3) 9 (60,0) 4 (26,7) 9(26,5) 14 (41,2) 11 (32,4) 0,428 rs3093135 AA AT TT 1 (6,7) 3 (20,0) 11 (73,3) 3 (8,8) 7 (20,6) 24 (70,6) 0,965 rs20749102 CC CT TT 1 (6,7) 3 (20,0) 11 (73,3) 2 (5,9) 8 (23,5) 24 (70,6) 0,961 * χ2testas
3.4. Lyties, amţiaus, diabeto ir CYP4F2rs2108622, rs1558139, rs3093135 ir rs20749102 įtaka CYP4F2 fermento koncentracijai, hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškai kraujo plazmoje
Buvo įvertinta lyties, amţiaus, cukrinio diabeto ir CYP4F2 (rs2108622, rs1558139, rs3093135, rs20749102) variantų įtaka CYP4F2 fermento koncentracijos irhsa-miR-24-3p beihsa-miR-34a-5p genų raiškos pokyčiams SKA sergančių asmenų (10 lentelė)irkontrolinės grupės tiriamųjų kraujo plazmoje (11 lentelė). Nustatyta, kad SKA sergantys vyrai turėjo ţemesnę CYP4F2 fermento koncentraciją, palyginus su moterimis (6,45 ng/ml (0,1-18,2) vs. 10,4 ng/ml (1,7-40,5); p=0,04). CYP4F2 rs2108622 CC genotipą turintys pacientai turėjo ţemesnę CYP4F2 fermento koncentraciją kraujo
36 plazmoje palyginus su CT genotipą turinčiais pacientais (5,3 ng/ml (0,1-27,6) vs. 10,1 ng/ml (2,5-40,5); p=0,01). CYP4F2 fermento koncentracija skyrėsi CYP4F2 rs1558139 AA ir AG, bei AA ir GG variantus turinčių asmenų grupėse. AA turintys pacientai, turėjo 4 kartus maţesnę CYP4F2 koncentraciją kraujo plazmoje, nei AG genotipą turintys pacientai (2,5 ng/ml (0,1-9,6) vs. 11,0 ng/ml (2,2-40,5); p=0,04) ir 3 kartus maţesnę fermento koncentraciją, nei GG turintys pacientai (2,5 ng/ml (0,1-9,6) vs. 8,0 ng/ml (2,5-11,4); p=0,01). Lytis, amţius, cukrinis diabetas, bei CYP4F2 variantai įtakos mikro-RNR genų raiškai kraujo plazmoje nedarė.
10 lentelė. CYP4F2 konc., hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p raiškos pokyčiai tarp skirtingų lyčių, amžiaus grupių, CD ir CYP4F2 vieno nukleotido polimorfizmų (rs2108622, rs1558139, rs3093135,
rs20749102) variantų, pacientų sergančių SKA kraujo plazmoje
CYP4F2 konc. ng/ml Log2(2-∆CT hsa-miR-24-3p) Log2(2-∆CT hsa-miR-34a-5p) Mediana (min./maks.) p Mediana (min./maks.) p Mediana (min./maks.) p Vyrai 6,5 (0,1 / 18,2) 0,04* 4,4 (1,8 / 9,1) 0,26* -2,5 (-5,4 / 1,1) 0,30* Moterys 10,4 (1,7 / 40,5) 3,6 (3,6 / 8,7) -2,9 (-6,9 / 2,9) Amţius<60 7,1 (0,1 / 27,6) 0,46* 4,4 (1,4 / 5,8) 0,47* -2,7 (-6,9 / 2,9) 0,48* Amţius>60 8,2 (1,7 / 40,5) 4,0 (2,0 / 9,1) -2,7 (-6,2 / -0,7) CD - 7,1 (,01 / 39,8) 0,42* 3,9 (2,3 / 9,1) 0,23* -2,4 (-6,2 / 1,2) 0,19* + 10,4 (1,9 / 40,5) 4,8 (2,3 / 9,1) -3,0 (-6,20 / -1,2) rs2108622 CC 5,3 (0,1 / 27,6) 0,03** 3,7 (1,4 / 8,7) 0,76** -2,5 (-6,9 / 0,6) 0,93** CT 10,1 (2,5 / 40,5) 4,3 (1,8 / 9,1) -2,7 (-6,2 / 2,9) TT 6,2 (3,7 / 8,7) 3,3 (2,0 / 4,5) -2,2 (-5,4 / 1,1) rs1558139 AA 2,5 (0,1 / 9,6) 0,01** 3,64 (2,4 / 6,7) 0,97** -3,0 (-6,9 / -0,3) 0,70** AG 11,0 (2,2 / 40,5) 4,4 (1,4 / 8,7) -2,4 (-6,2 / 2,9) GG 8,0 (2,5 / 11,4) 4,3 (1,8 / 9,1) -3,0 (-5,7 / 1,1) rs3093135 AA 3,7 (2,5 / 8,7) 0,62** 4,5 (2,0 / 6,3) 0,35** -3,0 (-5,4 / 1,1) 0,36** AT 7,6 (3,8 / 27,6) 4,9 (2,0 / 9,1) -1,7 (-3,6 / 2,9) TT 8,0 (0,1 / 40,5) 3,7 (1,4 / 8,7) -2,9 (-6,9 / 0,7)
37
CYP4F2 konc. ng/ml Log2(2-∆CT hsa-miR-24-3p) Log2(2-∆CT hsa-miR-34a-5p) Mediana (min./maks.) p Mediana (min./maks.) p Mediana (min./maks.) p rs20749102 CC 6,2 (3,7 / 8,7) 0,92** 3,3 (2,0 / 4,5) 0,16** -2,2 (-5,4 / 1,1) 0,43** CT 7,0 (2,5 / 27,6) 4,9 (2,0 / 9,1) -2,3 (-3,6 / -2,9) TT 8,0 (0,1 / 40,5) 3,7 (1,4 / 8,7) -2,9 (-6,9 / 2,9)
* Mann-Whitney U kriterijus; ** Kruskal-Wallis H kriterijus
11 lentelė. CYP4F2 konc., hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p raiškos pokyčiai tarp skirtingų lyčių, amžiaus grupių, CD ir CYP4F2 vieno nukleotido polimorfizmų (rs2108622, rs1558139, rs3093135,
rs20749102) kontrolinės grupės asmenų kraujo plazmoje
CYP4F2 konc. ng/ml Log2(2-∆CT hsa-miR-24-3p) Log2(2-∆CT hsa-miR-34a-5p
) Mediana (min./maks.) p Mediana (min./maks.) P Mediana (min./maks.) p vyrai 15,0 (11,2 / 25,4) 0,69* 1,5 (-1,1 / 4,7) 0,86* -4,9 (-8,3 / -1,4) 0,53* moterys 18,6 (7,9 / 33,7) 1,1 (0,3 / 4,1) -4,7 (-8,0 / -1,9) Amţius<60 15,7 (11,2 / 25,3) 0,37* 1,0 (-1,1 / 4,7) 0,37* -5,5 (-5,3 / -1,9) 0,12* Amţius>60 22,8 (7,9 / 33,7) 2,0 (0,7 / 4,1) -3,7 (-5,3 / -1,92) rs21086 22 CC 18,6 (7,9 / 25,4) 0,71* 2,03 (-1,1 / 4,7) 0,35** -4,3 (-8,0 / -1,4) 0,62** CT 15,5 (13,1 / 33,7) 1,0 (0,8 / 3,2) -5,4 (-8,3 / -2,8) TT 13,9 (13,9 / 13,9) 0,7 (0,72 / 0,72) -7,2 ( -7,2 / -7,2) rs15581 39 AA 18,3 (13,9 / 22,7) 0,19** 2,1 (-1,12 / 4,7) 0,96** -5,4 (-7,2 / -3,6) 0,50** AG 15,5 (7,9 / 25,3) 1,0 (-1,1 / 4,7) -5,4 (-8,3 / -1,4) GG 24,1 (13,9 / 33,7) 1,1 (0,7 / 2,0) -3,7 (-5,3 / -2,8) rs30931 35 AA 13,9 (13,9 / 13,9) 0,31** 0,7 (0,7 / 0,7) 0,62** -7,2 (-7,2 / -7,2) 0,21** AT 14,5 (13,1 / 15,5) 0,9 (-1,1 / 4,7) -5,5 (-8,3 / -3,7) TT 19,3 (7,9 / 33,7) 1,1 (-1,1 / 4,7) -4,3 (-8,0 / -1,4) rs20749 CC 13,9 0,31** 0,7 0,62** -7,2 0,21**
38 CYP4F2 konc. ng/ml Log2(2-∆CT hsa-miR-24-3p) Log2(2-∆CT hsa-miR-34a-5p
) Mediana (min./maks.) p Mediana (min./maks.) P Mediana (min./maks.) p 102 (13,9 / 13,9) (0,72 / 0,72) (-7,23 / -7,23) CT 14,5 (13,1 / 15,1) 0,9 (0,8 / 3,2) -5,5 (-8,3 / -3,7) TT 19,3 (7,9 / 33,7) 1,1 (-1,1 / 4,7) -4,3 (-8,0 / -1,4)
* Mann-Whitney U kriterijus; ** Kruskal-Wallis H kriterijus
3.5. Vaistų įtaka CYP4F2 fermento koncentracijai, hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p genų raiškai SKA sergančių pacientų kraujo plazmoje
Įvertinus mikro-RNR genų raiškos ir CYP4F2 fermento koncentraciją SKA sergančių pacientų kraujo plazmoje pagal vartojamus medikamentus (12 lentelė), nustatyta, kad pacientų, vartojusių atorvastatiną hsa-miR-24-3p geno raiška kraujo plazmoje buvo 2,9 kartų aukštesnė palyginus su atorvastatino nevartojusiais pacientais (FC: nevartojantys – mediana: 2,4 (0,8-9,6) vs. vartojantys – mediana: 6,9 (1,02-170,4); p=0,02). Panašūs rezultatai gauti palyginus AKF inhibitorius vartojančių ir nevartojančių pacientų hsa-miR-24-3p genų raišką kraujo plazmoje: AKF inhibitorius vartojusiems pacientams nustatyta 2,1 kartų aukštesnė hsa-miR-24-3p geno raiška (FC: nevartojantys – mediana: 3,2 (0,8-24,0) vs. vartojantys – mediana: 6,9 (1,02-170,4); p=0,05).
Kiti kartu vartojami vaistai CYP4F2 fermento aktyvumui, bei hsa-miR-34a-5p geno raiškai kraujo plazmoje įtakos nedarė.
12 lentelė. CYP4F2,hsa-miR-24-3p ir hsa-miR-34a-5p raiškos pokyčiai kraujo plazmoje tarp skirtingus vaistusvartojusių SKA pacientų
CYP4F2 konc. ng/ml (mediana) Log2(2-∆CT hsa-miR-24-3p) (mediana) Log2(2-∆CT hsa-miR-34a-5p) (mediana)
Vaistų grupė Nevartoja Vartoja p* Nevartoja Vartoja p* Nevartoja Vartoja p*
β blokatoriai 7,00 7,80 0,50 4,0 4,2 0,59 -2,31 -2,70 0,94
AKF
39 CYP4F2 konc. ng/ml (mediana) Log2(2-∆CT hsa-miR-24-3p) (mediana) Log2(2-∆CT hsa-miR-34a-5p) (mediana)
Vaistų grupė Nevartoja Vartoja p* Nevartoja Vartoja p* Nevartoja Vartoja p*
Priešdiabetiniai 7,10 10,4 0,42 3,85 4,80 0,23 -2,44 -3,00 0,19 Protonų siurblio inhibitoriai 6,70 9,50 0,15 4,04 4,33 0,79 -2,72 -2,17 0,36 Kalcio kanalų blokatoriai 7,35 8,70 0,89 4,00 4,88 0,61 -2,44 -2,95 0,73 Diuretikai 7,10 22,90 0,18 4,02 4,17 0,58 -2,69 -1,99 0,91 Psichotropiniai vaistai 7,60 7,50 0,54 4,3 3,46 0,21 -2,48 -3,47 0,13 H2 receptorių blokatoriai 8,30 6,70 0,22 4,34 3,70 0,96 -2,58 -2,72 0,51 Izosorbido mononitratas 7,05 8,30 0,24 4,35 3,70 0,35 -2,83 -2,40 0,74 Statinai 8,30 6,90 0,23 2,98 4,51 0,02 -3,33 -2,54 0,41 Fraksiparinas 7,80 7,00 0,65 4,17 4,04 0,87 -2,72 -1,98 1,00 * Mann-Whitney U kriterijus
