KASOS VĖŽINIŲ LĄSTELIŲ ENERGETINĖS BŪSENOS TYRIMAS

(1)

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

KRISTINA PALIULIONYTĖ

KASOS VĖŽINIŲ LĄSTELIŲ ENERGETINĖS BŪSENOS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

KASOS VĖŽINIŲ LĄSTELIŲ ENERGETINĖS BŪSENOS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė

Kristina Paliulionytė

(3)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

1. ĮVADAS ... 9

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

3.1. Kasos vėžys ... 12

3.2. Kasos vėžio patogenezė ... 12

3.3. Kasos vėžio gydymas ... 13

3.4. Gydymo metodai ... 13

3.5. Kasos vėžio atsparumas ... 14

3.6. Tyrimams naudotos kasos vėžinių ląstelių linijos ... 15

3.7. Gemzar (gemcitabinas) ... 15

3.8. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis mitochondrijoms ... 17

3.9. Mitochondrijų struktūra ir funkcija ... 17

3.10. Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas ... 19

3.11. Pažeistų mitochondrijų atsakas kasos vėžinėms ląstelėms ... 22

4. METODIKA ... 24

4.1. Aparatūra, indai ... 24

4.2. Medžiagos ... 24

4.3. Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos ... 24

4.4. Ląstelių paveikimas GEM ir IC50 matavimai ... 25

4.5. MTT gyvybingumo testas ... 25

4.6. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas ... 26

4.7. Statistinė duomenų analizė ... 27

(4)

5.1. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžinių ląstelių gyvybingumui ... 28

5.2. Skirtingų kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų endogeninio kvėpavimo palyginimas ... 29

5.3. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžio ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiui ... 30

5.4. Gemcitabino poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams kasos vėžinėse ląstelėse ... 37

6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 39

7. IŠVADOS ... 41

(5)

SANTRAUKA

Kristinos Paliulionytės magistro baigiamasis darbas „Kasos vėžinių ląstelių energetinės būsenos tyrimas“/ mokslinė vadovė prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Tyrimo tikslas. Ištirti kasos vėžinių ląstelių (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu – gemcitabinu) energetinę būseną.

Uždaviniai. Ištirti ir palyginti skirtingų kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2, paveiktų ir nepaveiktų gemcitabinu, endogeninio kvėpavimo greičius; Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms; Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos pralaidumui.

Metodai. Kasos vėžinių ląstelių linijos buvo skirstomos į kontrolines grupes ir tiriamąsias, paveiktas gemcitabinu. Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis, oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą, registruojamas oksigrafiniu metodu, kuris atliekamas su „Oroboros Oxygraph-2k“ aparatu. Ląstelių gyvybingumas nustatytas MTT metodu.

Rezultatai. Gemcitabinas padidino endogeninį kvėpavimo greitį MIAPaCa-2 ir SU.86.86 ląstelių linijose apie 2,4 ir 1,5 kartus, lyginant su kontrole. Gemcitabinas apie 2 kartus padidino mitochondrijų kvėpavimo greitį oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą MIAPaCa-2, Capan-1 ir SU.86.86 kasos vėžinėse ląstelių linijose, tačiau slopino mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą (13-15 %). Gemcitabinas neturėjo poveikio mitochondrijų išorinės membranos laidumui, bet padidino MIAPaCa-2 ir Capan-1 mitochondrijų vidinės membranos laidumą.

Išvados. Endogeninio ir mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčiai kasos vėžinėse ląstelėse gali būti sąlygojami gemcitabino poveikio mitochondrijų biogenezei. Atspariausia gemcitabinui buvo Capan-2 kasos vėžio ląstelių linija.

(6)

SUMMARY

Kristina Paliulionytė Master degree thesis „Investigation of energetic state of pancreatic cancer cells“/ study supervisor prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lithuanian university of health sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy, Kaunas.

The aim of the study. To investigate the energy state of the cancer cells (impacted and not impacted by chemotherapic drug – gemcitabine) .

Tasks. To compare endogenous respiration rates of different pancreas cell lines: Capan-1, Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2, impacted and not impacted by gemcitabine, to study the impact of gemcitabine on respiratory functions of mitochondria of pancreatic cancer cells lines; to study the impact of gemcitabine on the permeability of inner and outer mitochondrial membrane of pancreatic cancer cell lines.

Methods. Pancreatic cancer cell lines were divided into control and test groups, which were impacted by gemcitabine. The respiration rate of pancreatic cancer cells with glutamate/ malate and succinate as substrates was registered by oxygraphic method using „Oroboros Oxygraph-2k“ device.

Results. Gemcitabine increased (app. 2,4 and 1,5-folds) the endogenous respiration rate in MIAPaCa-2 and SU.86.86 cell lines in comparison with control group. Gemcitabine increased (app. 2 – folds) the mitochondrial respiration rate in MIAPaCa-2, Capan-1 and SU.86.86 cancer cell lines, respiring on glutamate/malate and succinate as substrates but suppressed the mitochondrial respiratory control index by 13-15 %. Gemcitabine had no impact on the permeability of outer mitochondric membrane, but increased the permeability of mitochondrial inner membrane in MIAPaCa-2 ir Capan-1 cell line.

Conclusions. The revealed changes in endogenous and mitochondrial respiration rates in pancreatic cancer cells could be due to gemcitabine impact on biogenesis of mitochondria. Capan-2 pancreatic cancer cell line was the most resistant to gemcitabine pre-treatment.

(7)

Padėka

Nuoširdžiai dėkoju šio darbo vadovei prof. dr. Sonatai Trumbeckaitei už labai vertingas konsultacijas, kantrybę, visuomet suteiktą pagalbą ir paaiškinimus/patarimus rašant šį mokslinį darbą. Taip pat dėkoju Neuromokslų Instituto Biochemijos laboratorijos, Virškinimo sistemos tyrimų instituto Chirurginės gastroenterologijos laboratorijos darbuotojams ir ypač Aldonai Jakštaitei už pagalbą vykdant tyrimus.

(8)

SANTRUMPOS

GEM – gemcitabinas

ADP – adenozino 5′ – difosfatas ATP – adenozino 5′ – trifosfatas

FAD – flavinadenino dinukleotido oksiduota forma FADH2 – flavino adenino dinukleotido redukuota forma KoQ – kofermentas Q (ubichinonas)

KoQH2 – kofermento Q (ubichinono) redukuota forma NAD – nikotinamido adenino dinukleotido oksiduota forma NADH – nikotinamido adenino dinukleotido redukuota forma KKK – mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas

(9)

1. ĮVADAS

Visame pasaulyje diagnozuojama labai daug vėžinių susirgimų. Dažniausiai pasireiškia plaučių, gimdos, stemplės, krūties, stemplės vėžiai ir kt. Lietuva taip pat pasižymi pakankamai dideliu vėžio sergamumu – kasmet registruojama daugiau nei 2000 vėžio atvejų. Neretai pasitaiko kasos vėžys. Ši žmogaus vėžio forma yra labai agresyvi ir sunkiai pasiduoda chemoterapiniam ir radioterapiniam gydymui. Kasos vėžys yra vienas iš pavojingiausių. Apie rizikos faktorių, kuris sukelia kasos vėžį, nėra žinoma, tačiau kava, alkoholis, dietos, rūkymas yra vieni iš galimų kasos vėžio atsiradimo rizikos faktorių. Manoma, kad epigenetiniai kasos vėžio pakitimai gali būti viena iš priežasčių, dėl padidėjusio kasos vėžio atsparumo gydymui ir apoptozei [1, 2].

Dažniausiai chemoterapiniame kasos vėžio gydyme vartojamas gemcitabinas, kurio veikimo mechanizmas remiasi tuo, kad slopina DNR sintezę ir vėžinių ląstelių dalijimąsi. Kai ląstelės nebegali dalintis, jos žūsta ir tokiu būdu navikas yra slopinamas. Atlikus tris chemoterapijos kursus gemcitabinu, 41 % pacientų po diagnozės išgyvena ilgiau negu 12 mėnesių [3].

Mitochondrijos yra ląstelės organelės, dalyvaujančios ne tik ATP sintezėje, bet ir ląstelės žūties procesuose apaptozės ar nekrozės būdu.

Kasos vėžys patenka į penketuką mirtingiausių ligų Jungtinėse Amerikos Valstijose [2]. Mažiau nei 20 % ligonių išgyvena 2 metus po ligos diagnozavimo ir tik apie 5 % gyvena ilgiau nei 5-erius metus. Išplitusio kasos vėžio tikimybės išgyventi mediana yra apie 6 mėnesius [2]. Norint pagerinti gydymo rezultatus, reikia ieškoti naujų metodų, tinkamų kasos vėžio gydymui. Šia ligos forma vis dažniau suserga jauni žmonės, o ir tikimybė išgyventi menka dėl blogo kasos vėžio atsako į gydymą, todėl tai yra aktuali problema. Šiuo metu nėra pakankamai daug informacijos apie kasos vėžinių ląstelių energetinę būklę bei jų atsparumo chemoterapijai mechanizmus, todėl mes ir atlikome šį tyrimą, ištirdami kasos vėžinių ląstelių endogeninį kvėpavimą, mitochondrijų kvėpavimo greičius, mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos pralaidumus.

Šiame darbe išnagrinėta ir apibendrinta literatūra apie kasos vėžį, jo gydymą, kasos vėžines ląsteles, bei įvertintas gydymui naudojamo chemoterapinio vaisto Gemzar (gemcitabino, slopinančio DNR sintezę ir vėžinių ląstelių proliferaciją) poveikis kasos vėžinių ląstelių energetikai. Eksperimentiniu būdu buvo ištirtos kasos vėžinių ląstelių: Capan-1 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), Capan-2 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), SU.86.86 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), MIAPaCa-2 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), kvėpavimo funkcijos (be vaisto ir su juo). Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo registravimas (deguonies suvartojimo, mitochondrijų kvėpavimo grandinės aktyvumo įvertinimas) – oksigrafinis metodas, atliekamas su „Oroboros Oxygraph-2k“ aparatu.

(10)

Darbe siekiama išsiaiškinti kasos vėžinių ląstelių atsparumą cheminio preparato Gemzar poveikiui ir turimą įtaką ląstelių energetikai.

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė

Šiuo metu nėra tyrimų apie kasos vėžinių ląstelių energetinę būklę (poveikį mitochondrijų kvėpavimo greičiams, vidinės ir išorinės membranos pralaidumui) bei jų atsparumo chemoterapijai mechanizmus. Šiame tyrime nustatėme, kad gemcitabino poveikyje didėja mitochondrijų kvėpavimo greičiai okiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą MIAPaca-2, Capan-1 ir SU.86.86 kasos vėžinėse ląstelių linijose, ir slopinamas mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas. Atspariausia gemcitabino poveikiui buvo Capan-2 kasos vėžio ląstelių linija. Endogeninio ir mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčiai kasos vėžinėse ląstelėse gali būti sąlygojami gemcitabino poveikio mitochondrijų biogenezei. Šie tyrimai atskleidė naujų žinių apie gemcitabino poveikį skirtingų kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijoms ir apie galimus kasos vėžinių ląstelių atsparumo gemcitabinui mechanizmus.

(11)

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti kasos vėžinių ląstelių (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu-gemcitabinu) energetinę būseną.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti ir palyginti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2, endogeninio kvėpavimo greičiams.

2. Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių: Capan-1, Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2, mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.

3. Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2, mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos pralaidumui.

(12)

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Kasos vėžys

Kasos adenokarcinoma – labai rimta, mirtina liga. Kol kas nėra veiksmingų, efektyvių gydymo būdų arba jų yra labai mažai. Kasos vėžiu sergančių pacientų tikimybė išgyventi yra pati prasčiausia, palyginus su kitų vėžinių formų ligomis sergančiais pacientais. Ligai progresavus, gyventi lieka apie 6 mėnesius. Kasos vėžys yra ketvirtas pagal pacientų mirtingumą, tad yra tik 5 % tikimybė, kad pacientas, sergantis kasos vėžiu, išgyvens 5-erius metus [2]. Nepaisant pažangios chirurgijos ir medicinos terapijos, nuo kasos vėžio Jungtinėse Amerikos Valstijose per metus miršta 31 000 žmonių. Situacija Lietuvoje yra tokia, jog paskutiniuosius 20 metų pacientų sergamumas kasos vėžiu auga – per metus vyrų sergamumas padidėja 2 %, o moterų – 1,6 %. Nustatyta, kad Lietuvoje 2002–2005 m. išgyveno 5,2 % pacientų, sergančių kasos vėžiu 5-erius metus. Vienas iš pagrindinių kasos vėžio požymių – plati vietos naviko invazija ir ankstyva sisteminė sklaida [1, 2].

3.2. Kasos vėžio patogenezė

Pirmiausia, vardijami etiopatogenezės rizikos faktoriai, kurie gali nulemti kasos vėžio atsiradimą ar aktyvėjimą. Tai gali būti aplinkos veiksniai, tokie kaip nesaikingas kavos bei alkoholio vartojimas, įvairių dietų laikymasis bei diabeto požymiai [4]. Verta paminėti, kad rūkymas yra bene vienas svarbiausių rizikos faktorių. Taip pat išskiriami ir demografiniai veiksniai, tokie kaip rasė, lytis, amžius, gyvenamoji vietovė. Ligonių paveldimumas taip pat yra vienas iš rizikos faktorių, kuris gali didinti tikimybę susirgti kasos vėžiu. Visi etiologiniai rizikos faktoriai gali būti skirstomi į endogeninius ir egzogeninius [4]. Jie veikia DNR, todėl dar yra vadinami genotoksinais. Veikdami jie sukelia tiesioginį ir netiesioginį poveikį ląstelei. Poveikio sistema prasideda tuo, jog jie pradžioje būna prokancerogenais, vėliau virsta kancerogenais ir galiausiai jungiasi prie DNR, sudarydami toksiškus junginius, dėl kurių atsiranda genų mutacijos [4].

Kasos vėžio onkogenezėje dalyvauja kelios genų grupės, kurios yra suskirstytos į onkogenus bei naviką slopinančių genų grupes. Onkogenai: K-ras, c-erbB-2, c-c-eebB-3, c-myc, c-fos. Naviką slopinantys genai: p53, p16, p15, DCC, DPC4, Rb, APC [4]. Onkogenai susidaro iš protoonkogenų, taip sukeldami mutacijas. Ras genai: K-ras, N-ras, H-ras, yra vieni iš pagrindinių genų, kurių mutaciją nustatant galime įtarti kasos vėžį. Konkrečiau kasos vėžio audinyje yra nustatoma K-ras geno 12 kodono mutacija. Pasitelkus PGR (polimerazės grandininės reakcijos) tyrimo metodą, nustatomos genų mutacijos kasos vėžio audinyje, kasos sultyse, kraujo plazmoje, o šių genų koduojami pakitę baltymai

(13)

nustatomi imunohistochemiškai, imunologiškai bei molekulinės biologijos metodais [4]. Jeigu kartu nustatomas ras mutavęs onkogenas su c-myc, tokiu atveju nustatoma piktybiškesnė kasos vėžio stadija. Iš naviką slopinančių genų, svarbiausias yra p53, kuris randamas 17 chromosomos trumpajame petyje. Šio geno koduojamas baltymas neigiamai veikia proliferaciją bei ląstelės augimą [4].

3.3. Kasos vėžio gydymas

Kasos vėžio, kaip ir daugelio kitos rūšies vėžių, gydymo efektyvumas priklauso nuo to, kokioje stadijoje jis yra diagnozuojamas. Du trečdaliai kasos vėžio atvejų būna kasos galvoje ir vienas trečdalis kasos kūne arba uodegoje. Didžiausią tikimybę išgyti turi tie pacientai, kurie savo sveikatą tikrinasi dažniau ir vėžys yra diagnozuojamas ankstyvoje stadijoje [5]. Duomenys rodo, kad dažniausiai kasos vėžys diagnozuojamas per vėlai. Tik 10-20 % pacientų turi galimybę išgyti po auglio šalinimo operacijos. Dauguma pacientų išgirsta diagnozę, kad gyventi liko mažiau nei metai. Mokslininkai stengiasi tobulėti šioje srityje, atlikdami įvairius bandymus ir tyrimus, kad pacientų, sergančiu kasos vėžiu, mirtingumas būtų kuo mažesnis [6].

Kasos vėžio stadijos:

1. Ankstyvoji stadija. Netgi šioje stadijoje nustačius vėžį, prognozės nėra itin geros. Jeigu vėžys nėra išplitęs į kitus organus ar audinius ir įmanoma atlikti operaciją, tik 7-25 % pacientų gyvens 5 metus ir ilgiau. Dažniausiai vėžio ląstelės būna jau išplitusios prieš operaciją. Ląstelės yra pernelyg mažos, kad būtų pastebėtos tyrimų metu, tačiau palaipsniui išauga į kitos rūšies vėžius [7].

2. Pažengusi stadija – tai stadija, kai vėžys jau yra nebeoperuojamas ir tikimybės išgyventi vidurkis siekia maždaug 6-11 mėnesių. Jeigu vėžys jau išplitęs, tikimybė išgyventi sumažėja iki 2-6 mėnesių. Tačiau tai priklauso nuo to, kiek stipriai vėžys yra išaugęs ir išplitęs [7].

3.4. Gydymo metodai

Gydymo metodas parenkamas priklausomai nuo ligos stadijos (kuo ankstyvesnė tuo geriau), kasos vėžio tipo (cistiniai ir endokrininiai kasos vėžiai dažniau išoperuojami), nuo amžiaus ir bendros sveikatos būklės (pacientas turi būti pakankamai lieknas, kad, prireikus, būtų galima lengviau pasiekti auglį) [5].

1. Chirurginis (operacijos metu pašalinama visa ar dalis kasos ir šalia esantys audiniai) metodas. Šis metodas atliekamas pacientams su 1 ir 2 stadijos kasos vėžiu. Chirurginis kasos vėžio

(14)

gydymas netaikomas, kai auglio neįmanoma rezekuoti arba yra metastazių, išplitusių į kitus organus ar audinius. Dažniausiai pasirenkamos organą išsaugančios operacijos [5, 6].

2. Radioterapinis (vėžio ląstelės naikinamos lokalizuotoje vietoje) metodas. Šis gydymo metodas neskiriamas taip dažnai, palyginus su navikų operacijomis ar chemoterapija, tačiau padeda sumažinti ligos simptomus. Kai chirurginė operacija negalima, taikomas radioterapijos ir chemoterapijos (kombinuotas) derinys. Radioterapijos metu naudojami stiprių bangų spinduliai, kurie žudo vėžines ląsteles. Tačiau šis metodas nėra visiškai patikimas, todėl, kad jos metu gali žūti ir sveikos ląstelės bei atsirasti šalutinių poveikių [5, 6].

3. Chemoterapinis (vėžio ląstelės naikinamos visame kūne) metodas. Šis metodas paprastai skiriamas jau po chirurginės operacijos, užtikrinti, kad vėžys nepasikartos. Dažniausiai skiriama gemcitabino arba 5-fluorouracilo chemoterapija. Jei kasos vėžys jau pažengęs, chemoterapija padeda ne visada ir net nėra matomų akivaizdžių pagerėjimo požymių. Pažengusiam kasos vėžiui gydyti būna paskiriama chemoterapinių vaistų kombinacija, tai sukelia daugiau šalutiniu poveikių negu vartojant vieną vaistą, tačiau tai didina tikimybę išgyventi ilgiau [5, 6].

Kadangi kasos vėžys yra labai atsparus chemoterapiniam gydymui, yra ieškoma naujų, efektyvių gydymo metodų ir galimybių, kurios padėtų padidinti gydymo veiksmingumą ir pagerinti tikimybes išgyventi rezultatus.

3.5. Kasos vėžio atsparumas

Kasos vėžio sukeliami pokyčiai molekuliniame lygmenyje nėra visiškai išaiškinti ir suprantami. Manoma, kad epigenetiniai pakitimai gali būti viena iš priežasčių, dėl padidėjusio kasos vėžio atsparumo gydymui ir apoptozei [2]. Vienas jų – DNR metilinimas. Vėžinėse ląstelėse aptinkamas padidintas Apaf-1 koduojančio geno metilinimo lygis. Šis genas dalyvauja apoptosomos susidaryme, dėl to randama sumažėjusi jo raiška [8].

Ląstelių proliferacijai ir apoptozei reikalinga potranskripcinė genų reguliacija, kuri yra siejama su kasos adenokarcinomos atsparumu chemoterapijai. „Žinoma, kad vėžinėse ląstelėse potranskripcinė genų reguliacija keičiasi dėl RNR surišančių baltymų. HuR (ELAV1) yra RNR surišantis baltymas, reguliuojantis daugelio molekulių ekspresiją, prisijungdamas jų iRNR ir skatindamas baltymų sintezę nuo jų“ [9].

Kasos vėžinių ląstelių atsparumas tradiciniam gydymui, chemoterapijai priklauso nuo jų sugebėjimo inicijuoti apoptozę. Todėl reikia suprasti kasos vėžinių ląstelių apoptozės mechanizmų anomalijas, kad būtų sumažintas šių vėžinių ląstelių atsparumas chemoterapijai [10].

(15)

3.6. Tyrimams naudotos kasos vėžinių ląstelių linijos

Šiais laikais ląstelių ar audinių kultūros yra labai svarbios medicininiuose tyrimuose. Bene kiekvieną diena ląstelių linijos naudojamos įvairiems tyrimams, pvz.: tiriant preparatų veiksmingumą, norint persodinti gyvą audinį, esant odos nudegimams, kamieninių ląstelių naudojimas prieš transplantaciją. Ląstelių linijos, užaugintos in vitro sąlygomis, leidžia išlaikyti joms būdingas biologines savybes. Santykinai didelis skaičius labai gerai apibūdinamų žmogaus kasos vėžio ląstelių linijų yra prieinamos naudoti ikiklinikiniams tyrimams [11].

Capan-1 – tai kasos adenokarcinomos ląstelių linija, išskirta iš žmogaus. Vėžio somatinių mutacijų duomenų bazėse įrašyta, jog su šia ląstelių linija iš viso buvo atlikti 652 tyrimai ir nustatyta, kad 380 genų turėjo mutacijas. Ši ląstelių linija tinkama transfekcijoms. Capan-1 išskiria skrandžio tipo muciną ir išreiškia cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatorių.

SU.86.86 – kasos adenokarcinomos ląstelės išskirtos iš metastazės kepenyse. Pavienės, adherentinės, tipas: epitelinės, dvigubėjimo trukmė – 28-48 h. Mutacijos: p53.

Capan-2 – tai žmogaus kasos adenokarcinomos ląstelių linija. Capan-2 pirma kartą buvo išskirtos 1975m. iš pirminio naviko, kurį turėjo 56 metų kaukazietis vyras, sergantis kasos duktaline adenokarcinoma. Šios ląstelės auga limpančių/adhezinių audinių kultūroje, kurios augdamos formuoja vieną sluoksnį ir pasižymi epitelio sandara. Ši ląstelių linija suformuoja gerai diferencijuotus auglius, kai šių ląstelių yra suleidžiama į imuninių pelių organizmus.

MIAPaCa-2 – kasos adenokarcinomos ląstelės išskirtos iš pirminio auglio. Pavienės, adherentinės, tipas: epitelinės, dvigubėjimo trukmė - apie 26 h. Tai yra hypotriploidinė žmogaus ląstelių linija. Modalinis chromosomų skaičius yra 61. Mutacijos: p53, p16, K-ras.

3.7. Gemzar (gemcitabinas)

Gemzar (gemcitabinas) yra priešvėžinis chemoterapinis vaistas. Jis skiriamas kasos vėžio, nesmulkialąsteliniam plaučių vėžio, šlapimo pūslės vėžio, minkštųjų audinių sarkomos, kiaušidžių vėžio gydymui ir profilaktikai. Gemcitabinas yra antimetabolitas, purino antagonistas. Jo formulė pateikta 1 paveiksle. Jis skiriamas kaip standartas kasos vėžiui gydyti, nors jo efektyvumas nėra didelis.

(16)

1 pav. Gemcitabino hidrochlorido formulė [12]

Gemtabicino veikimo mechanizmas remiasi tuo, kad jis slopina DNR sintezę ir vėžinių ląsteliu dalijimąsi. Kai ląstelės nebegali dalintis, jos žūsta ir tokiu būdu navikas yra slopinamas. Antimetabolitai yra panašūs į įprastas medžiagas. Kai ląstelės įtraukia šias medžiagas į vidų, į medžiagų apykaitą, ląstelės praranda galimybę dalintis [13]. Gemzar vaistas veikia ląsteles konkrečiu ląstelės ciklo momentu – tik tuomet, kai ląstelės dalijasi.

Su Gemzar vaistu buvo atliktas tyrimas: „Kasos adenokarcinomos ląstelių in vitro atsakas į chemoterapinį vaistą gemcitabiną, nuslopinus HuR geno raišką“ [6]. Tyrimas buvo atliekamas su SU.86.86 ląstelių linija bei su Capan-2 ląstelių linija, kurios bus naudojamos ir šiame tyrime. Buvo naudojamos tokios gemcitabino koncentracijos: 0, 3, 5, 7, 10, 50, 100, 500, 1 000, 2 000, 5 000 ng/ml, tačiau nustatyta, kad inhibuojančioji gemcitabino dozė SU.86.86 ląstelių linijai yra 25 ng/ml, o Capan-2 ląstelių linijai – 5 µg/ml. Po poveikio gemcitabinu, ląstelių gyvybingumas siekė SU.86.86 ląstelėse – 59,80 %, o Capan-2 ląstelėse – 79,64 %. Gauti rezultatai, naudojant MTT metodą gyvybingumui nustatyti, parodė, kad mažiausias ląstelių gyvybingumas buvo toje ląstelių grupėje, kurios buvo paveikiamos gemcitabinu dar prieš tai jose nuslopinus HuR geno raišką: SU.86.86 ląstelių gyvybingumas siekė 25,64 %, o Capan-2 ląstelių gyvybingumas – 72,18 %. Autoriai daro išvadą, kad sumažėjus baltymo HuR kiekiui, kasos vėžio ląstelės yra jautresnės chemoterapiniam vaistui, ką parodo jų gyvybingumo sumažėjimas. SU.86.86 ląstelių linija buvo žymiai jautresnė gemcitabinui, nutildžius HuR geno raišką [9].

Kiti autoriai teigia, kad kasos vėžio gydymas vienu gemcitabinu yra žymiai mažiau veiksmingas, negu gydant kombinacijoje su KML001(natrio meta-arsenitu). Kartu jie stipriau slopina

(17)

ląstelių proliferaciją, invaziją ir žymiai sumažina epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) ir matricos metiloproazės-2 (MMP2) išraišką [14].

Įvairiose kasos vėžio ląstelių linijose gemcitabino sukeltą ląstelių augimo slopinimą stiprina P276-00 (nuo ciklinų priklausomas kinazės inhibitorius). Nukleozidų analogas gemcitabinas yra dažniausiai naudojamas kasos vėžio gydymui, tačiau jis visiškai jo neišgydo, tik prailgina žmogaus, sergančio kasos vėžiu, gyvenimą keliais mėnesiais [15].

Kadangi gemcitabinas yra vienas iš pagrindinių vaistų kasos vėžiui gydyti, tai su šiuo vaistu buvo atliktas tyrimas ir žiūrėta, kiek prailgėja paciento gyvenimas, atlikus chemoterapiją šiais vaistais [9]. Buvo tiriami 49 pacientai su pažengusiu kasos vėžiu ir buvo pastebėta, kad gemcitabinas prailgina paciento gyvenimo trukmę. 41 % pacientų išgyvena ilgiau negu 12 mėnesių po diagnozės, atlikus tris chemoterapijos kursus gemcitabinu. Pacientams, kurių kasos vėžio navikas yra mažas, o BUN (kreatinino ir kraujo šlapalo azoto) serumo kiekis normalus, gemcitabinas gali būti efektyvus ir prailginti tų pacientų gyvenimą [16].

Schniewind ir kt. parodė, kad kasos vėžio jautrumas gydymui gemcitabinu siejamas su nuo mitochondrijų priklausomos apoptozės keliu. Buvo atlikti tyrimai, kaip nuo mitchondrijų 2 signalinio transdukcinio kelio aktyvavimo priklauso apoptozės skatinimas bei kaip chemoterapinis vaistas gemcitabinas indukuoja apoptozę [17]. Tyrimas buvo atliekamas su kasos vėžinių ląstelių linijomis: Colo357, PancTu1 ir Panc1, tiriant jų jautrumą gemcitabinui. Jautriausia gemcitabinui buvo Colo357, toliau Panc1, o visiškai atspari – PancTul ląstelių linija. Norint molekuliniame lygmenyje įvertinti gemcitabino įtaka apoptozei, buvo tiriamas ir apoptozinų baltymų aktyvavimas. Nors skirtingas jautrumas gemcitabinui skiriasi tarp kasos vėžio ląstelių linijų, nustatyta, kad gemcitabinas skatina ląstelių apoptozės vyksmą nuo mitochondrijų priklausomu signaliniu keliu [17].

3.8. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis mitochondrijoms

Tyrimų kaip gemcitabinas veikė kasos vėžio mitochondrijų funkcijas nėra. Todėl mūsų darbo tikslas buvo ištirti ir aprašyti, kaip šis vaistas veikia mitochondrijų kvėpavimo greičius, ar turi poveikį mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui.

3.9. Mitochondrijų struktūra ir funkcija

Mitochondrijų kiekis ląstelėse dažnai skiriasi ir priklauso nuo ląstelės tipo bei ląstelės energijos poreikio. Aukštesniųjų augalų ląstelėse dažniausiai randama nuo 50 iki 2000 mitochondrijų.

(18)

Mitochondrijos – judrios, dinamiškos organelės, esančios ląstelėje, užtikrinančios ląstelės kvėpavimą, kurio rezultatas – energija, organizmo panaudojama įvairių procesų vyksmui, atpalaiduojama arba akumuliuojama adenozintrifosfato rūgšties (ATP) pavidale. Kitos mitochondrijų funkcijos: hemo, lipidų, amino rūgščių ir nukleotidų sintezė, neorganinių jonų homeostazės palaikymas, ląstelės žūties valdymas.

2 pav. Mitochondrijų struktūra [18]

Mitochondrija yra dvimembranė organelė. Tai reiškia, kad ji yra dukart apsupta membranos sistemos, sudarytos iš vidinės ir išorinės mitochondrijų membranų, atskirtų tarpmembranine erdve. Tarpmembraninė erdvė dažniausiai būna nuo 6 iki 8 nm storio. Mitochondrijos ilgis dažniausiai siekia 1-7 µm, o plotis 0,5-1 µm. Vidinė ir išorinė membranos skiriasi baltymų-lipidų santykiu pagal masę. Vidinėje membranoje santykis 4:1, o išorinėje 1:1 [19]. Išorinė membrana yra pusiau pralaidi jonams ir mažoms molekulėms. Ją sudaro 6 % visų mitochondrijos baltymų. Vidinė membrana yra nepralaidi, todėl medžiagos patenka veikiant įvairioms specialioms pernašų sistemoms. Vidinę membraną sudaro 21 % baltymų, o tarpmembraninę erdvę 6 % visų mitochondrijos baltymų. Net iki 67 %, t.y. didžiausią dalį, baltymų turi mitochondrijų užpildas.

(19)

Kiekviena iš mitochondrijos struktūros dalių atlieka skirtingas funkcijas (žr. 2 pav.). Vidinė membrana matrikse išsidėsto sudarydama vingiuotas klostes, kurios vadinamos kristomis. Kristos padidina vidinės membranos paviršiaus plotą, o tai leidžia aktyviau vykdyti oksidacinį fosforilinimą [19]. Užpilde yra mitochondrijų genetinė sistema, taip pat kaip ir fermentai, atsakinga už pagrindines oksidacinio metabolizmo reakcijas. Gliukozė ir riebalų rūgštys yra pagrindinis energijos šaltinis ląstelėse. Piruvato ir riebalų rūgštys paverčiamos į acetil-KoA mitochondrijų užpilde. Trikarboksirugščių ciklo metu acetil-KoA yra oksiduojamas į CO2. Acetyl-KoA pavertimas CO2 yra siejamas su NAD+ ir FAD redukcija į NADH ir FADH2 atitinkamai, kuriuos oksiduojant mitochondrijose oksidacinio fosforilinimo proceso metu sintetinama ATP [20].

Išorinė mitochondrijų membrana, priešingai nei vidinė, laisvai praleidžia mažas molekules. Taip yra dėl baltymų, kurie sudaro kanalus ir leidžia medžiagoms, mažesnėms nei 600 daltonų, pro ją praeiti. Vidinė mitochondrijų membrana palaiko protonų gradientą, kuris skatina oksidacinį fosforilinimą [20].

Medžiagų oksidacija visuose organizmuose vyksta trijomis stadijomis [21]. Pirmoje stadijoje išlaisvinama nedaug energijos, čia įvairūs substratai oksiduojami iki acetil-KoA. Antroje stadijoje dviangliai fragmentai (acetil-KoA pavidale) matrikse oksiduojami Krebso cikle, tai susiję su didelių energijos kiekių išlaisvinimu redukuotų kofermentų NADH ir FADH2 pavidale. Trečiojoje stadijoje mitochondrijų kvėpavimo grandinėje oksiduojami redukuoti nikotinamidų ir flavino kofermentai, šiuo metu susidaro vanduo ir išlaisvinama daugiausiai energijos, kuri panaudojama ATP sintezei [21].

3.10. Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas

Oksidacinis fosforilinimas – tai vidinėje mitochondrijų membranoje vykstantis procesas, kai energija, kuri išsiskiria oksiduojantis NADH ir FADH2, yra panaudojama ATP sintezei.

Membraninio proceso metu (pernešant elektronus mitochondrijose) energija paverčiama į elektrocheminį protonų gradientą, kuris panaudojamas ATP sintezei. Tokiu būdu elektronų pernaša mitochondrijų kvėpavimo grandine (oksidacija) susijusi su ADP fosforilinimu, todėl tai vadinama oksidaciniu fosforilinimu [21]. Galima išskirti keturis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksus: I kompleksas – NADH dehidrogenazė, II kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, III kompleksas – citochromo bc1, IV kompleksas – citochromo c oksidazė. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai pavaizduoti 3 paveiksle. Tarp šių kompleksų elektronus perneša mažesni, judrūs elektronų nešikliai (KoQ ir citochromas c), kurie į kompleksų sudėtį neįeina (žr. 4 pav.) [21].

Kvėpavimo grandinė – tai vidinėje mitochondrijų membranoje esanti sudėtinga oksidacijos-redukcijos sistema, kuri perneša elektronus deguoniui (susidarant vandeniui) [21]. Pagrindinė

(20)

kvėpavimo grandinės funkcija – laipsniškai išlaisvinti energiją iš kvėpavimo grandinės substratų (redukuotų kofermentų (NADH ir FADH2)) [21].

3 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai [22]

Kompleksai turi vieną arba kelias prostetines grupes, kurios grįžtamai prijungia elektronus. Labai svarbi elektronų pernašos kvėpavimo grandinėje savybė yra tai, jog ji susijusi su protonų pernaša iš mitochondrijų užpildo į tarpmembraninę erdvę. Kvėpavimo grandinėje protonus išmeta kompleksai I, III ir IV [47]. ADP fosforilinimas nėra savaiminis, šiam procesui būtina energija, kuri gaunama skylant kitam makroerginiam junginiui. Todėl šis fosforilinimo būdas – substratinis fosforilinimas. Oksidaciniu fosforilinimas – kai fosforilinimui reikalingą energiją teikia, vykstantys oksidacijos-redukcijos procesai membranoje, veikiančioje kvėpavimo grandinėje [23].

Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas sudarytas iš 46 baltymų subvienetų, kurių masė siekia 1000 kDa. Antrasis sudarytas iš 4 baltymų subvienetų: A, B, C, D. Pirmieji du yra hidrofiliniai, o C ir D yra transmembraniniai. Trečiajį kvėpavimo kompleksą sudaro du dimerai, kurie turi po 11 subvienetų. Paskutinis ketvirtasis mitochondrijų kvėpavimo kompleksas sudarytas iš 13 subvienetų.

(21)

4 pav. Mitochondrijų elektronų transporto grandinės kompleksų kodavimas dvejomis genetinėmis sistemomis. Genetinės sistemos: mitochondrijų DNR (MtDNR) ir branduolio DNR

(nDNR). MtDNR koduoja 7 NADH dehidrogenazės subvienetus kompleksui I, citochromo B kompleksui III, 3 citochromo c oksidazės (COX) subvienetus kompleksui IV ir 2 ATPazės kompleksui V. Tik kompleksas II yra užkoduotas nDNR. Nepunktyrinės rodyklės žymi elektronų srautą kvėpavimo

grandinės kryptimi; punktyrinės rodyklės rodo genetinės informacijos iš MtDNR ar nDNR į RNR ir į baltymą; skaičiai rodo faktinį skaičių baltymų subvienetų koduotų kiekvienos genetinės sistemos. Specifiniai inhibitoriai RNR transkripcijos arba baltymų transliacijos nurodomi violetine spalva [24]

Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo kompleksas, NADH dehidrogenazė, greitina elektronų pernašą nuo NADH ant KoQ, kur vėliau KoQ tampa redukuotas – susidaro KoQH2. Ubichinonas perneša elektronus į trečią kompleksą iš pirmojo. Pirmojo komplekso du elektronai bei protonai pradžioje pernešami nuo NADH ant FMN, kol galiausiai pasiekia KoQ. Į tarpmembraninę erdvę pernešami 4 protonai iš mitochondrijų užpildo [25].

Trikarboksirūgščių ciklo reakcijose, oksidacinio fosforilinimo reakcijose dalyvauja antrasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, kuris jungiasi su vidine mitochondrijų membrana. Antrasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas katalizuoja sukcinato oksidaciją ir KoQ redukciją, kurios metu susidaro produktas – fumaratas. Tokiu būdu elektronai ir protonai patenka ant KoQ nuo sukcinato [26]. Elektronai ir protonai yra pernešami ant FAD nuo sukcinato, galiausiai susidaro KoQH2. Šis kompleksas reguliuoja Krebso ciklo aktyvumą, pernešdamas elektronus i kvėpavimo grandinę [26, 27].

Elektronai, nuo redukuoto KoQ (KoQH2) per trečiąjį kvėpavimo grandinės kompleksą (citochromas bc1 kompleksą), pernešami citochromui c. Elektronų pernaša vykdoma nuo ubichinolio

(22)

iki citochromo b, vėliau jie pernašami Fe-S bei citochromui c1, kol galiausiai pasiekiamas citochromas c ir jis redukuojamas. Šis kompleksas yra kaip protonų pompa, nes į citozolį per membraną iš užpildo pernešami 4 protonai [25, 27, 28].

Paskutinis, ketvirtasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas (citochromo c oksidazė), prisijungęs prie vidinės mitochondrijų membranos išorinės pusės, perneša elektronus nuo citochromo c molekuliniam deguoniui. IV kompleksas turi keturis redokso centrus: CuA, CuB ir du hemus (a ir a3). Pradinis citochromo c elektronų akceptorius – CuA. Nuo CuA ant hemo a3 elektronus perneša hemas a, o hemas a3, kartu su CuB, prijungia deguonį ir jį redukuoja susidarant vandeniui. Prijungus keturis elektronus ir keturis protonus, susidarius dviem vandens molekulėms yra redukuojamas deguonis. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės IV kompleksas, priešingai nei I ir III, perneša du protonus iš mitochondrijų užpildo į tarpmembraninę erdvę [27, 28].

Yra išskiriamas ir penktasis kvėpavimo grandinės kompleksas, kuris katalizuoja ATP sintezę iš ADP ir neorganinio fosfato, panaudojant elektrocheminį protonų gradientą. Jis vadinamas mitochondrijų ATP sintaze [28].

3.11. Pažeistų mitochondrijų atsakas kasos vėžinėms ląstelėms

Vienas pirmųjų, teigusių, kad mitochondrijų defektai gali turėti poveikį vėžiui – O. Warburg. Mitochondrijos vaidina svarbų vaidmenį ląstelių energijos apykaitos procese, laisvųjų radikalų susidaryme ir apoptozėje [29]. Manoma, kad mitochondrijų disfunkcija prisideda prie vėžio vystymosi ir progresavimo. Vėžinės ląstelės savo energetiniams poreikiams naudoja glikolizės metu, o ne oksidacinio fosforilinimo metu gautą ATP, kas būdinga sveikoms ląstelėms. Mitochondrijų defektai vėžinėse ląstelėse apima mitochondrijų kvėpavimo grandinės ir glikolizės fermentų pasikeitusią raišką ir aktyvumą, sumažėjusią oksidaciją su NADH susijusiais substratais taip pat mitochondrijų DNR (mtDNR) mutacijas. Vis dar nėra visiškai aišku, kas turi įtakos mitochondrijų DNR mutacijoms, kokie mechanizmai yra atsakingi už tai, kaip tai veikia vėžio vystymąsi, vėžinių ląstelių atsparumą vaistams ir ligos progresavimą [24].

Kai kurie mokslininkai mano, kad mitochondrijų disfunkcija yra susijusi su vėžinių ląstelių atsparumu apoptozei. Manoma, kad stipriai sumažėjusi mitochondrijų funkcija sukelia svarbius vėžinių ląstelių metabolinių funkcijų pakitimus [29, 30]. Deaktyvuojant mitochondrijų funkcijas, gali būti skatinama specialiai užprogramuota vėžinių ląstelių mirtis, kad padėtų stabdyti vėžio plėtimąsi [31]. Vėžinių ląstelių proliferacija ir naviko agresyvumas koreliuoja su padidintu glikolizės naudojimu bei sumažėjusia mitochondriju kvėpavimo grandinės veikla [32]. Atlikto tyrimo metu naudota krūties vėžio ląstelių linija MDA-MB-231, kuri buvo užauginta ribojant gliukozės prieinamumą, bei kai

(23)

kuriuos inhibitorius, reikalingus normaliai mitochondrijų veiklai. Gauti rezultatai parodė, kad slopinant gliukozės naudojimą mitochondrijų kvėpavimo grandinėje sukeliama vėžinių ląstelių mirtis. Toks pat tyrimas buvo atliktas su kasos vėžinių ląstelių linija MIAPaCa-2. Rezultatai parodė, kad ir šiai vėžinių ląstelių linijai sukėlus mitochondrijų funkcijos sutrikimus, padidėja ląstelių mirtis [32].

1990 metais, kuomet tapo prieinami eksperimentai su žinduolių ląstelių mtDNR, pasikeitė supratimas apie vėžinių ląstelių ir mitochondrijų kvėpavimo funkcijų sasają. Buvo atlikti tyrimai, kuriais buvo įrodytas ilgalaikis poveikis žmogaus ląstelėms. Nedidelėmis koncentracijomis naudojamas etidijaus bromidas stipriai sumažina mitochondrijų DNR kiekį – taip nusilpnindamas oksidacinio fosforilinimo veiklą [33]. Kai oksidacinio fosforilinimo veikla buvo slopinama, vėžinės ląstelės pakeitė savo elgesį ir sutriko gebėjimas augti nepriklausomu būdu, pradėjo mažėti vėžio piktybiškumo potencialas. Svarbu tai, kad auglio ląstelės, su pažeistu oksidaciniu fosforilinimu, tapo itin jautrios citotoksiniams vaistams. Šie duomenys rodo, kad auglių atsiradimas dalinai priklauso nuo pokyčių mitochondrijų kvėpavimo grandinėje [33].

Kadangi vėžio ląstelės ATP gamybai dažniausiai naudoja glikolizę, o ne oksidacinį fosforilinimą, todėl jos yra jautresnės glikolizės slopinimui ir gliukozės netekimui [32]. Pastarųjų metų tyrimai rodo, kad slopinant glikolizę ir naudojant mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų inhibitorius, vėžinės ląstelės pasidaro jautresnės oksidacinio fosforilinimo inhibitoriams. Taigi, oksidacinio fosforilinimo inhibitoriais blokuojant oksidacinį fosforilinimą vėžinėse ląstelėse, slopinamas kasos vėžio ląstelių augimas [32].

(24)

4. METODIKA

4.1. Aparatūra, indai

Oroboros Oxygraph-2k; magnetinė maišyklė (VARIOMAG); pH-metras (pH-Meter 766); Analitinės svarstyklės (KERN ABJ-220-4M); vandeninis termostatas 37 C (GRANT GD120); Hamilton mikrošvirkštai; automatinės pipetės; antgaliai; kolbos; kiuvetės; mėgintuvėliai; cilindrai; stiklinėlės.

4.2. Medžiagos

Glutamatas (glutamato rūgštis) (SIGMA); malatas 99 % grynumo (L–obuolių rūgšties natrio druska) (SIGMA); digitoninas (SIGMA); ADP 98 % grynumo (SIGMA); amitalis (SIGMA); sukcinatas 99 % grynumo (SIGMA); citochromas c 99 % grynumo (SIGMA); atraktilozidas (Na– druska) (SIGMA); dinitrofenolis (SIGMA); EDTA (SIGMA); EGTA 99 % grynumo (ROTH); etanolis; HEPES 99,5 % grynumo (SIGMA); KCl 99,5 % grynumo (ROTH); KH2PO4 98 % grynumo (ROTH); K–laktobionatas (ALDRICH); MgCl2∙6H2O (ROTH); sacharozė 99,5 % grynumo (ROTH); taurinas (SIGMA).

4.3. Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos

Tyrimams in vitro naudojamos kasos vėžio ląstelės ir linijos yra gautos komerciniu būdu. Analizei buvo naudojamos žmogaus kasos vėžio ląstelių linijos: Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 ir SU.86.86. Ląstelės buvo auginamos vienasluoksnėse, steriliose, 75 cm2 talpos, lėkštelėse, RPMI terpėje (5 ml) su 10 % FBS (fetalinis jaučio serumas). Lėkštelės su ląstelėmis buvo laikomos inkubatoriuje. Capan-1, MIAPaCa-2, SU.86.86 ląstelių linijos buvo auginamos RPMI terpėje (Gibco/ Invitrogen) su 10 % FBS (fetalinis jaučio serumas) (Gibco/ Invitrogen) ir 1 % penicilino/ streptomicino tirpalu (Gibco/ Invitrogen). Capan-2 ląstelės buvo auginamos RPMI medium terpėje su 20 % FBS (fetalinis jaučio serumas) ir 1 % penicilino/ streptomicino tirpalu. Ląstelės buvo auginamos palaikant drėgmę: oro temperatūra siekė apie 37 ˚C, o aplinka buvo prisotinta 5 % CO2.

Ląstelės augintos ir MTT testas atliktas Virškinimo sistemos tyrimų instituto Chirurginės gastroenterologijos laboratorijoje.

(25)

4.4. Ląstelių paveikimas GEM ir IC50 matavimai

Ląstelės buvo pasodintos į specialias lėkšteles su 96 šulinėliais (3*103_{ląstelių/ šulinėlyje),} ląstelių kultūroms auginti. Ląstelės buvo veikiamos chemoterapiniu vaistu gemcitabinu (Eli Lilly, Indianapolis), į kiekvieną šulinėlį naudojant skirtingas koncentracijas: 0, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000 ir 5000 ng/ml, tam, kad apskaičiuoti ir sužinoti vidutinę gemcitabino inhibuojančią koncentraciją (IC50). Paveiktos ląstelių linijos gemcitabinu buvo laikomos 72 valandas 37 ˚C temperatūroje, o aplinka buvo prisotinta 5 % CO2. Po 72 valandų inkubacijos, MTT metodas buvo naudojamas norint nustatyti ląstelių gyvybingumą.

Nustatyta gemcitabino vidutinė inhibuojanti (slopinanti) koncentracija: IC50 MIAPaCa-2 ląstelių linijai buvo 50 ng/ml, SU.86.86– 25 ng/ml, Capan-1– 5 µg/ml. Capan - 2 ląstelėms IC50 nebuvo pasiekta, naudota dozė tebuvo IC40– 5 µg/ml.

4.5. MTT gyvybingumo testas

MTT metodas priklauso ląstelės funkcijų tyrimo metodų grupei, kurių metu tiriami ląstelių augimui reikalingi metobolitai – tai ląstelių gyvybingumo nustatymas. Metodas grindžiamas tuo, jog redukuotų piridino dinukleotidų NAD(P)H kiekis ląstelėje parodo viduląstelinių energetinių procesų efektyvumą, o pažeistosios ląstelės nesugebės panaudoti redukuotų NAD(P)H metaboliniams procesams ir augimui. Tetrazolio druska MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) redukuojama NAD(P)H susidarant chromoforui-formazanui. Susidariusio formazano kiekis yra tiesiog proporcingas gyvoms/gyvybingoms ląstelėms. MTT vandeninis tirpalas yra gelsvas, o jį redukavus, susidaro violetinės spalvos formazano druskos, kurių koncentracija išmatuojama spektrofotometru.

Ląstelių gyvybingumo testas buvo atliekamas su MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio bromidu) (Invitrigen). Ląstelės buvo inkubuojamos su MTT (5 mg/ml) 4 valandas prie 37 ˚C temperatūros. Po 4 valandų inkubacijos, MTT tirpalas su terpe buvo pašalinamas, tuomet violetinės formazano druskos buvo tirpinamos įpilant į šulinėlį 200 ml dimetilsulfoksido (DMSO) (Carl ROth GmbH) ir švelniai purtant purtyklėje plokštelę 15 minučių. Absorbcija buvo matuojama spektrofotometru (Tecan Sunrise) prie 550 nm ir 620 nm bangos ilgio ir apskaičiuojamas optinis tankis. Duomenys apdorojami naudojant „Microsoft Offise Excel“ programą.

(26)

4.6. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas

Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas atliktas LSMU Neuromokslų Institute. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio matavimai atliekami naudojant poliarografinę sistemą Oxygraph-2K (Oroboros, Austrija). Oksigrafiniu metodu galima įvertinti deguonies sunaudojimo greitį per minutę bei kasos vėžinėse ląstelėse (kontrolinėse ir paveiktose chemoterapiniu vaistu gemcitabinu) ištirti pokyčius patologijos metu, išanalizuoti endogeninio mitochondrijų kvėpavimo greičius. Naudijant Oroboros oksigrafą matuojami deguonies srauto pokyčiai laike, nustatome jų kinetiką, panaudojant atitinkamus mitochondrijų kvėpavimo grandinės substratus ir slopiklius.

Analizė buvo atliekama naudojant uždarą kiuvetę, kurios temperatūra buvo palaikoma apie 37 ˚C. Joje įmontuotas Klark tipo deguonies elektrodas. Kadangi vėžinėms ląstelėms naudojant deguonį kinta sunaudoto deguonies koncentracija terpėje, taip pat kinta ir jo redukcija ant platinos elektrodo bei srovės stiprumas, einantis per tirpalą. Gautų poliarografinių kreivių pokyčiai, vėžinėms ląstelėms naudojant deguonį, rodo srovės stiprumo pokytį, iš ko ir galime spręsti apie ląstelių (mitochondrijų) sunaudoto deguonies koncentraciją laiko bėgyje. 5 paveiksle matoma originali kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo kreivė.

5 pav. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo kreivė. Dig – 8 µl digitonino, Glu+Mal – 5 mM

ir 2 mM atitinkamai, ADP – 1 mM adenozino difosfato, AMI – 2 mM amitalio, Succ – 15 mM sukcinato, Cyt C – 32 µM citochromo c, ATR – 0,12 mM atraktilozido, DNF – 0,3 mM dinitrofenolio.

MiR06 terpės sudėtis: 0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2∙6H2O, 60 mM K–laktobionatas (pH 7,0, 25 ˚C temperatūroje), 20 mM taurinas, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozė; pH 7,1 (37 ˚C temperatūroje).

(27)

Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio nustatymas pradedamas į termostuojamą kiuvetę įpilant 2 ml terpės MiR06. Matavimai atliekami 37 °C termastatuojamoje kiuvetėje. Kiuvetė uždaroma specialiu kamščiu ir ~40 minučių registruojamas deguonies sunaudojimo greitis. Įpylus terpę ir neįdėjus ląstelių, deguonis nėra sunaudojamas, nes terpėje ląstelių nėra. Pridėjus ląstelių (1mln/1ml) suspensijos, kurios yra paveiktos arba nepaveiktos chemoterapiniu vaistu gemcitabinu, stebimas endogeninis deguonies sunaudojimo pokytis (kvėpavimo intensyvumas). Užregistravus deguonies sunaudojimo pokytį, į terpę pridedama 5 µg/ml digitonino, 5 mM glutamato ir 5 mM malato – matuojamas bazinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (antroji mitochondrijų metabolinė būsena (V0)). Kreivei nusistovėjus, pridedame 10 µl ADP. Pastebimas staigus kvėpavimo padidėjimas. Mitochondrijos pereina į trečiąją metabolinę būseną (VADP(Glu/Mal)) ir tai reiškia, kad esant ADP ir substratų pertekliui, mitochondrijų kvėpavimo greitis yra maksimalus. Mitochondrijų intensyvus kvėpavimas vyksta dėl oksidacinio fosforilinimo ir ATP sintezės. Vėliau įdedama 2 mM amitalio, užslopiname I mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksą, laukiame kol kvėpavimo greitis nusistovės ir dedame 15 mM II mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substrato – sukcinato. Tuomet pridedame 32 µM citochromo c (VCyt c) ir vertiname išorinę mitochondrijų membraną – pažeista ar ne. Jeigu pastebimas mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas (dėl citochromo c trūkumo), tai rodo, kad išorinė mitochondrijų membrana yra pažeista, o jeigu kvėpavimo greitis nėra stimuliuojamas, vadinasi membrana nėra pralaidi citochromui c ir tai reiškia, kad ji nėra pažeista. Trečioji mitochondrijų metabolinė būsena pereina į ketvirtąją (VATR), pridėjus ADP/ATP nešiklio inhibitoriaus 0,12 mM atraktilozido. Atraktilozidas blokuoja ADP patekimą, būtent tai turi įtakos mitochondrijų kvėpavimo greičio sumažėjimui. Pabaigoje į mitochondrijas įdedama 0,3 mM DNF, oksidacijos ir fosforilinimo procesų aktyvumui.

Skaičiavimams naudotos formulės: Citochromo C efektas= VADP(Succ)+cytc / VADP; KKKGlu/Mal= V3 / V0; KKKSucc= VADP(Succ)+cytc / VATR

Duomenys apdorojami naudojant „Microsoft Offise Excel" programą. Ląstelių kvėpavimo greitis išreiškiamas pmolO/s/mln ląstelių.

4.7. Statistinė duomenų analizė

Rezultatų vidurkiai pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Skirtumai tarp vidurkių statistiškai reikšmingi, jeigu p < 0,05. Pateikti nemažiau keturių eksperimentinių tyrimų vidurkiai su paklaidomis. Duomenų patikrinimui įvesti naudojamas „Student-t“ testas. Statistinė analizė buvo atliekama naudojant „SigmaPlot“ 11.0 programą.

(28)

5. REZULTATAI

Tyrimą atlikus kruopščiai, sistemiškai ir tiksliai, gauti rezultatai, kurie parodo gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių bei mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Tyrimo metu įvertinome štai tokius parametrus: kasos vėžinių ląstelių endogeninio kvėpavimo greitį, mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje (V0), trečioje (V3), ketvirtoje (VATR) metabolinėse būsenose. Apskaičiavome mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą, kuris padeda įvertinti mitochondrijų funkcinę kokybę. Be to, nustatėme išorinės membranos pažeidimą pagal citochromo C efektą ir įvertinome vidinės membranos pralaidumą.

5.1. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžinių ląstelių gyvybingumui

Lyginant kontrolines ląstelių linijų grupes be gemcitabino, mažiausias kiekis negyvų ląstelių buvo pastebimas MIAPaCa-2 ląstelių linijoje – 3,5 % (žr. 6 pav.). Didžiausias kiekis negyvų ląstelių nustatytas Capan-2 ląstelių linijoje (14,2 ± 5,6 %).

6 pav. Gemcitabino (Gemzaro) įtaka kontrolinių ir tiriamųjų ląstelių linijų gyvybingumui. * - statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p< 0,05; ** - statistiškai

(29)

Tyrimo rezultatai parodė, kad eksperimentuose naudotų kasos vėžinių ląstelių linijų paveiktų gemcitabinu, gyvybingumas visose grupėse sumažėjo (žr. 6 pav.). MIAPaCa-2 ląstelių linijos tiriamojoje grupėje negyvų ląstelių kiekis sudarė 9,8 %. Capan-1 kasos vėžio ląstelių liniją paveikus gemcitabinu, negyvų ląstelių kiekis sudarė 11,5 %. Eksperimento rezultatai parodė, kad veikiant Capan-2 ląstelių linija gemcitabinu, negyvų ląstelių kiekis sudarė 30,5 %, tačiau statistiškai patikimo skirtumo tarp kontrolinių ir paveiktų gemcitabinu ląstelių, nebuvo. SU.86.86 kasos vėžinių ląstelių linijoje gemcitabinas negyvų ląstelių skaičių padidino 1,5 karto ir sudarė 14,4 %.

Tiriamosiose grupėse, paveiktose gemcitabinu, labiausiai įtakos turėta Capan-2 ląstelių linijai. Šioje grupėje negyvų ląstelių skaičius siekė 30,5 ± 12 %. Iš gautų rezultatų matome, kad atspariausia gemcitabinui buvo Capan-1 kasos vėžio ląstelių linija.

5.2. Skirtingų kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų endogeninio kvėpavimo

palyginimas

Kasos vėžio ląstelių endogeninio kvėpavimo greitis (deguonies sunaudojimas) matuotas poliarografiniu metodu. Kadangi tokių tyrimų su kasos vėžio ląstelėmis nėra, atliekant tyrimą nustatinėjome skirtingų kontrolinių grupių ląstelių linijų endogeninį kvėpavimą (žr. 7 pav.).

7 pav. Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų endogeninis kvėpavimas. * - statistiškai reikšmingas

skirtumas, lyginant su atitinkama kontroline grupe be gemcitabino, p< 0,05, ** - statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su MIAPaCa-2 kontroline grupe

(30)

Iš visų tiriamųjų kontrolinių grupių, mitochondrijų endogeninio kvėpavimo greitis buvo mažiausias MIAPaCa-2 kontrolinėje ląstelių linijoje – jis siekė 28 pmolO/s/mln ląstelių. Kitose ląstelių linijose (Capan-1, Capan-2 ir SU.86.86) mitochondrijų endogeninio kvėpavimo greitis buvo statistiškai reikšmingai didesnis, lyginant su MIAPaCa-2 ląstelių linija. Capan-1 ląstelių linijos endogeninis kvėpavimo greitis buvo 60,6 pmolO/s/mln ląstelių, SU.86.86 ląstelių linijoje (49 pmolO/s/mln ląstelių) ir Capan-2 ląstelių linijos nustatytas endogeninio kvėpavimo greitis sudarė 51,1 pmolO/s/mln ląstelių. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp Capan-1, Capan-2 ir SU.86.86 lyginant endogeninio kvėpavimo greičius, nebuvo nustatyta.

Palyginus endogeninio kvėpavimo greičius, kasos vėžinėse ląstelėse, paveiktose gemcitabinu, nustatytas statistiškai reikšmingas kvėpavimo greičio padidėjimas 2,4 karto MIAPaCa-2 ląstelių linijoje, lyginant su kontrole. Tarp kitų ląstelių linijų (SU.86.86, Capan-1 ir Capan-2) statistiškai reikšmingo gemcitabino poveikio endogeninio kvėpavimo greičiui nebuvo, nors SU.86.86 vėžinėse ląstelėse buvo stebima tendencija didėti endogeniniam kvėpavimo greičiui (1,5 karto).

Taigi, rezultatai rodo, kad gemcitabinas neslopino endogeninio kvėpavimo greičio nei vienoje kasos vėžio ląstelių linijoje, o MIAPaCa-2 ir SU.86.86 ląstelių linijose endogeninis kvėpavimo greitis buvo netgi didesnis, lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Tai gali būti susiję su mitochondrijų kiekio padidėjimu kasos vėžinių ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu.

Tolimesniuose eksperimentuose įvertinome mitochondrijų kvėpavimo greitį kasos vėžinių ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu. Dėl šios priežasties ląstelės buvo veikiamos digitoninu (1 µg/ml) 7 minutes. Tokiu būdu ląstelės membrana tampa laidi ir prieinama mitochondrijų substratams.

5.3. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžio ląstelių mitochondrijų

kvėpavimo greičiui

Kasos vėžinių ląstelių, paveiktų gemcitabinu, tyrimai yra ypač svarbūs norint suprasti procesus, vykstančius kasos vėžio ląstelėse, paveiktose gemcitabinu, ir surasti, kuo daugiau informacijos apie kasos vėžio gydymą bei priežastis, kodėl kasos vėžinės ląstelės yra atsparios gemcitabino poveikiui. Kadangi mitochondrijos yra svarbios ląstelės organelės, tyrėme gemcitabino poveikį mitochondrijų kvėpavimo parametrams, joms oksiduojant I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substratus – glutamatą/malatą ir II mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substratą – sukcinatą.

Pirmiausia, parinkome eksperimentines sąlygas, ištyrėme mitochondrijų kvėpavimo greitį kontrolinėse ląstelių linijose (nepaveiktose chemoterapiniu vaistu gemcitabinu).

(31)

8 pav. Kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo greičiai. V0 – mitochondrijų

kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM

malato. V3 – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.

VADP(Succ)- mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir

15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+cyt C – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. * - statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su MIAPaCa-2 ląstelių linija, p<0,05.

Mitochondrijų kvėpavimo grečiai įvairiose metabolinėse būsenose (žr. 8 pav.), rodo, jog tirtomis sąlygomis visos ląstelių linijos geba naudoti ADP ir sintetinti ATP. Pridėjus ADP pradinis (V3) kvėpavimo greitis buvo stimuliuojamas ir vykstant oksidaciniam fosforilinimui, maksimalus kvėpavimo greitis MIAPaCa-2 ląstelių linijoje pasiekė 44,1 ± 4,6 pmolO/s/mln ląstelių, Capan-1 ląstelių linijoje – 59,9 ± 5,9 pmolO/s/mln ląstelių. Kitose ląstelių linijose ADP taip pat stimuliavo: Capan-2 ląstelių linijoje mitochondrijų kvėpavimo greitis nustatytas 51,2 ± 9,4 pmolO/s/mln ląstelių, SU.86.86 ląstelių linijoje – 68,3 ± 6,0 pmolO/s/mln ląstelių. Tai rodo oksidacinio fosforilinimo procesų apjungimą ir mitochondrijų gebėjimą sintezuoti ATP. Didžiausias sukcinato oksidacijos greitis buvo pasiektas SU.86.86 ląstelių linijoje (96,0 ± 9,8 pmolO/s/mln ląstelių), o, lyginant su kitomis ląstelių grupėmis, statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo, išskyrus su MIAPaCa-2 ląstelių linija: SU.86.86 ląstelių linijoje kvėpavimo greitis, oksiduojant sukcinatą, buvo 2 kartus didesnis už MIAPaCa-2 ląstelių linijos kvėpavimo greitį. Pridėjus citochromo c į ląstelių kvėpavimo terpę, pagreitėjimo nebuvo. Taigi, mitochondrijų išorinės membranos buvo nepažeistos – tai parodo kontrolinių ląstelių kokybę. Pridėjus atraktilozido, ADP/ATP inhibitoriaus, buvo slopinamas ADP patekimas į mitochondrijas ir ATP sintezė. Taigi, buvo stebimas kvėpavimo greičio sumažėjimas.

(32)

Statistiškai reikšmingo skirtumo mitochondrijų kvėpavimo greičio VATR tarp kasos vėžinių ląstelių linijų grupių nebuvo.

Kituose eksperimentuose tirtas gemcitabino poveikis kasos vėžinėms ląstelėms. Tam tikslui ląstelės paveikiamos gemcitabinu, o vėliau matuojami mitochondrijų kvėpavimo greičiai.

1 lentelė. MIAPaCa-2 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo greičiai Mitochondrijų kvėpavimo greičio parametrai MIAPaCa-2 MIAPaCa-2+Gem V0 (Glu/mal) 29,2 ± 8,1 72,2 ± 12,7* VADP(Glu/Mal) 44,1 ± 4,6 82,52 ± 10,1* VADP (Succ) 47,9 ± 4,4 82,5 ± 15,9* VADP (Succ)+Cyt c 47,7 ± 4,4 79,5 ± 17,8 VATR 27,1 ± 4,3 60,5 ± 8,1* VDNF max 45,3 ± 4,3 87,7 ± 15,4* Cyt C efektas 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1 KKK (succ) 1,9 ±0,3 1,3 ± 0,1

* – statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p<0,05. Mitochondrijų

kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato. VADP(Glu/Mal) –

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP. VADP(Succ) –

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir 15 mM

substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje,

pridėjus 32 mM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.

Rezultatai pateikti 1-oje lentelėje. MIAPaCa-2 ląstelių linijoje, po inkubacijos su gemcitabinu, stebimas statistiškai reikšmingas mitochondrijų kvėpavimo greičio padidėjimas 2,5 karto antroje metabolinėje būsenoje (V0), oksiduojant mitochondrijų I komplekso substratus

(33)

glutamatą/malatą, lyginant su kontroline grupe. Trečioje metabolinėje būsenoje, kuomet į inkubacijos terpę buvo pridedama ADP, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo taip pat statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnis 1,9 karto, lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis. Pridėjus sukcinato, mitochondrijų kvėpavimo greitis išliko toks pat (žr. 1 lentelė). Veikiant gemcitabinu, mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 1,7 karto. Citochromo c pridėjimas į inkubacijos terpę nepadidino kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje. Tai rodo, jog išorinė mitochondrijų membrana išliko intaktiška. Mitochondrijų kvėpavimo greitis, pridėjus atraktilozido (VATR), kuris yra ADP/ATP nešiklio inhibitorius, statistiškai reikšmingai padidėjo 1,3 karto (VATR=60,5 ± 8,1), lyginant su kontroline grupe. Todėl galima manyti, jog gemcitabinas padidino mitochondrijų vidinės membranos laidumą. Dinitrofenoliu atskirtas mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo panašaus dydžio kaip ir

VADP(succ). Taigi, gemcitabinas poveikio mitochondrijų kvėpavimo grandinei neturėjo. Mitochondrijų

kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK), rodantis mitochondrijų kokybę, nuo gemcitabino statistiškai reikšmingai sumažėjo 35 % (Glu/Mal) ir 32 % (Succ) – tai rodo mitochondrijų funkcijos slopinimą. Kadangi kvėpavimo greičiai, veikiant gemcitabinui, nebuvo slopinami, priešingai, jie netgi padidėję, lyginant su kontroline grupe, todėl tai gali būti siejama su mitochondrijų biogeneze.

Mitochondrijų kvėpavimo greičių pokyčiai vėžinių ląstelių linijoje – Capan-1 ląstelėse, oksiduojant substratą glutamatą/malatą, pateikti 2 lentelėje. Čia taip pat nustatytas mitochondrijų kvėpavimo greičių padidėjimas skirtingose metabolinėse būsenose.

Capan-1 kasos vėžio ląstelių linijos mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje padidėjo 38 %, t.y. nuo 49,4 iki 68 pmolO/s/mln ląstelių, lyginant su kontroline grupe (žr. 2 lentelė). Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (VADP(Glu/mal)) padidėjo nuo 59,9 iki 93,3 pmolO/s/mln ląstelių, t.y. net 56 %, lyginant su kontroline grupe. Oksiduojant II mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substratą – sukcinatą, Capan-1 tiriamosiose ląstelėse mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 43 %. Citochromo c pridėjimas stimuliavo mitochondrijų kvėpavimą nežymiai (6,4 %) ir statistiškai nereikšmingai. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė membrana nebuvo pažeista (žr. 2 lentelė). Kontrolinėje grupėje citochromo c pridėjimas taip pat nesukėlė reikšmingų pokyčių. Atraktilozidas slopino mitochondrijų kvėpavimo greitį, tačiau grupėje, paveiktoje gemcitabinu, buvo statistiškai reikšmingas padidėjimas (97 %), lyginant su kontroline grupe. Tai parodo, kad gemcitabinas padidina Capan-1 ląstelių linijos mitochondrijų vidinės membranos pralaidumą (~1,3 kartus). Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas KKK(Succ) oksiduojant sukcinatą sumažėja 32 %, o oksiduojant glutamatą/malatą 14%.

(34)

2 lentelė. Capan-1 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo greičiai Mitochondrijų kvėpavimo greičio parametrai Capan-1 Capan-1+Gem V0 (Glu/mal) 49,4 ± 12,9 68,0 ± 32,0 VADP(Glu/mal) 59,9 ± 5,9 93,3 ± 28,2 VADP (Succ) 72,0 ± 5,9 102,7 ± 29,7 VADP (Succ)+Cyt c 73,0 ± 6,5 109,3 ± 32,0 VATR 42,7 ± 6,0 84,0 ± 22,3 VDNF max 80,3 ± 6,5 102,7 ± 29,7 Citochromo C efektas 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1 KKK(succ) 1,9 ± 0,5 1,3 ± 0,1

Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0 – mitochondrijų kvėpavimo

greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato.

VADP(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP. VADP(Succ) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir

15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis

ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.

Capan-2 kasos vėžio ląstelių mitochondrijų kvėpavimo pokyčiai, veikiant gemcitabinui, pavaizduoti 3 lentelėje. Skirtingose metabolinėse būsenose, mitochondrijų kvėpavimo greitis vėžinėse ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu, statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolės. Priešingai, netgi turėjo tendenciją mažėti. Oksiduojant glutamatą/malatą mitochondrijų kvėpavimo greitis, veikiant gemcitabinui, buvo slopinamas 20 % (nuo 51,2 iki 41 pmolO/s/mln ląstelių), nors statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo. Lyginant kvėpavimo greičius, oksiduojant sukcinatą, matyti, kad grupės, paveiktos gemcitabinu, mitochondrijų kvėpavimo greitis 3 metabolinėje būsenoje buvo 23 % mažesnis, lyginant su kontroline grupe, tačiau pokytis nebuvo statistiškai reikšmingas. Papildomas citochromo c pridėjimas į inkubacinę terpę neturėjo poveikio mitochondrijų kvėpavimo greičiui

(35)

trečioje metabolinėje būsenoje. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė membrana nuo gemcitabino šiose ląstelėse buvo nepažeista. Mitochondrijų kvėpavimo greitis nei antroje metabolinėje būsenoje (V0), nei pridėjus atraktilozido (VATR) nesikeitė (p>0,05). Tai rodo, jog šių vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų vidinės membranos intaktiškumas nuo gemcitabino nesikeitė.

3 lentelė. Capan-2 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo greičiai Mitochondrijų kvėpavimo greičio parametrai Capan-2 Capan-2+Gem V0(Glu/mal) 39,2 +/-15,8 26,0 +/-6,0 VADP(Glu/mal) 51,2 +/-9,4 41,0 +/-9,0 VADP(Succ) 59,3 +/-16,5 45,0 +/-7,0 VADP(Succ)+Cyt c 59,0 +/-16,5 45,5 +/-6,5 VATR 38,3 +/-8,7 26,5 +/-7,5 VDNFmax 57,7 +/-14,2 45,0 +/-9,0 Citachromo C efektas 1,0 ± 3,3 1,0 ± 5,0 KKK(Succ) 1,5 ± 0,1 1,8 ± 0,2