LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
AKUŠERIJOS IR GINEKOLOGIJOS KLINIKA
Laura Tvarijonavičiūtė
MUC16 raiška OVCAR-3 ląstelėse normotermijos, hipertermijos sąlygomis ir
veikiant cisplatina
Medicinos vientisųjų studijų programos Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas: Prof. med. dr. Saulius Paškauskas Konsultantas: Doktorantas Artūras Sukovas
Kaunas 2020
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 4
2. SUMMARY ... 5
3. PADĖKA ... 6
4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 6
5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6
6. SANTRUMPOS ... 7
7. SĄVOKOS ... 8
8. ĮVADAS ... 9
9. TYRIMO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
10.1. Kiaušidžių vėžio epidemiologija ... 11
10.2. Kiaušidžių vėžio gydymas ... 11
10.2.1. Intraperitoninė hiperterminė chemoterapija (HIPEC) ... 12
10.3. MUC16 (CA125) baltymas ... 13
10.3.1. MUC16 baltymo imunoprotekcinis poveikis vėžinėms ląstelėms ... 14
10.3.2. MUC 16 ir naviko metastazavimas ... 15
11. TYRIMO METODIKA ... 16
11.1. Ląstelių kultivavimas ... 16
11.2. Eksperimento atlikimas ... 17
11.3. Genų raiškos pokyčių nustatymas tikro laiko PGR metodu ... 17
11.4. Baltymų raiškos nustatymas Western Blot metodu ... 18
11.5. Statistinė analizė ... 19
12. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 20
12.1. Rezultatai ... 20
12.1.1. MUC16 RNR raiškos pokyčiai ... 20
12.1.2. Kokybiniai MUC16 baltymo raiškos pokyčiai ... 21
12.2. Rezultatų aptarimas ... 22 13. IŠVADOS ... 24 14. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 25
1. SANTRAUKA
Autorė: Laura TvarijonavičiūtėDarbo pavadinimas: MUC16 raiška OVCAR-3 ląstelėse normotermijos, hipertermijos sąlygomis ir veikiant cisplatina.
Tyrimo tikslas: Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse normotermijos, hipertermijos sąlygomis ir veikiant cisplatina.
Tyrimo uždaviniai: 1. Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse normotermijos sąlygomis. 2. Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse hipertermijos sąlygomis. 3. Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse veikiant cisplatina normotermijos ir hipertermijos sąlygomis.
Tyrimo metodika: Tyrimui pasirinkta epitelinės kilmės kiaušidžių vėžio ląstelių linija – OVCAR-3. Ląstelės buvo kultivuojamos pagal ATCC (angl. American Type Culture Collection) rekomeduojamas kultivavimo sąlygas „LSMU MA virškinimo sistemos tyrimų instituto Chirurginės gastroenterologijos laboratorijoje“. Ląstelės buvo veikiamos hipertermija (43 C). Chemoterapijos poveikiui tirti naudotas platinos chemopreparatas (cisplatina). MUC16 ekspresijos pokyčiai ląstelėse tirti tikro laiko polimerazės grandinine reakcija (TL-PGR) jas veikiant hipertermija ir cisplatina. Kokybiškai įvertinta MUC16 baltymo koncentracija Western blot tyrimo metodu.
Tyrimo rezultatai: Visi rezultatai lyginti su kontroline grupe (normotermija (37 C), be cisplatinos). OVCAR-3 ląsteles veikiant hipertermija (43 C, be cisplatinos) MUC16 RNR raiška padidėjo 1,30 kartų (p>0,05). Veikiant OVCAR-3 ląsteles cisplatina, esant 37 C temperatūrai, MUC16 RNR raiška pakito 0,88 karto (p>0,05). Veikiant OVCAR-3 ląsteles cisplatina, esant aukštai temperatūrai (43 C), MUC16
RNR raiška padidėjo ~ 4 kartus (3,78) (p<0,05). MUC16 baltymo raiška buvo mažesnė, veikiant
OVCAR-3 ląsteles hipertermija ir cisplatina, nei normotermijos sąlygomis.
Tyrimo išvados: 1. Nustatyta MUC16 RNR raiška OVCAR-3 ląstelėse normotermijos sąlygomis ir naudota kaip kontrolė. 2. MUC16 RNR raiška OVCAR-3 ląstelėse hipertermijos sąlygomis reikšmingai nepakito. 3. MUC16 RNR raiška OVCAR-3 ląstelėse veikiant cisplatina ir normotermija reikšmingai nepakito, tačiau, veikiant cisplatina ir hipertermija, padidėjo 3,78 kartų (p<0,05). MUC16 baltymo raiška, veikiant OVCAR-3 ląsteles hipertermija ir cisplatina, buvo mažesnė nei veikiant normotermijos sąlygomis.
2. SUMMARY
Author: Laura TvarijonavičiūtėTitle: Expression of MUC16 in OVCAR-3 cells under normothermic, hyperthermic conditions and cisplatin.
Aim: To assess the expression of MUC16 in OVCAR-3 cells under normothermic, hyperthermic conditions and cisplatin.
Objectives: 1. To evaluate the expression of MUC16 in OVCAR-3 cells under normothermic conditions. 2. To evaluate the expression of MUC16 in OVCAR-3 cells under hyperthermic conditions. 3. To evaluate the expression of MUC16 in OVCAR-3 cells using cisplatin under normothermic and hyperthermic conditions.
Methods: Ovarian adenocarcinoma (OVCAR-3) cells were purchased from the American Type Tissue Culture Collection (ATTC, Manassas, VA, USA). Cells were harvested in the Institute for Digestive Research, Lithuanian University of Health Sciences. Cells were treated normothermia (37 C) or 43 C and IC50 dose of cisplatin. MUC16 levels were measured by Real-Time Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR). MUC16 protein concentration changes were qualitatively evaluated by Western blot test. Results: All results were compared with the control group (normothermia (37 C), without cisplatin). The temperature rise from 37 C to 43 C boosted MUC16 RNA expression by 1,30 – fold (p>0,05). Cisplatin forced the increase of MUC16 RNA expression by 0,88 – fold (p>0,05). Concomitant cisplatin and hyperthermia (43 C) treatment increased MUC16 RNA expression by 3,78 – fold (p<0,05). MUC16 protein expression was lower under concomitant cisplatin and hyperthermia treatment.
Conclusions: 1. MUC16 RNA expression under normothermic conditions was measured and used as a control. 2. The temperature rise from 37 C to 43 C had no significant change in MUC16 RNA expression. 3. Cisplatin had no significant change in MUC16 RNA expression but concomitant cisplatin and hyperthermia (43 C) treatment increased MUC16 RNA expression by 3,78 – fold (p<0,05). MUC16 protein expression was lower under concomitant cisplatin and hyperthermia treatment.
3. PADĖKA
Dėkoju šio darbo moksliniam vadovui prof. med. dr. Sauliui Paškauskui ir doktorantui Artūrui Sukovui už visas pastabas, patarimus bei skirtą laiką šio darbo tobulinimui. Esu dėkinga biologams Mantui Šilkūnui ir Aldonai Jasukaitienei už suteiktas žinias ir pagalbą „LSMU MA virškinimo sistemos tyrimų instituto Chirurginės gastroenterologijos laboratorijoje“ viso tyrimo metu.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Interesų konflikto nebuvo.5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Etikos komiteto leidimas nebuvo reikalingas, kadangi vykdytas validizuotas ląstelių linijos pirkimas.Tyrimas finansuotas Lietuvos mokslo tarybos (SEN-01/2015).
6. SANTRUMPOS
ATCC – angl. American Type Culture CollectionCa-125 – pagrindinis epitelinio kiaušidžių vėžio laboratorinis žymuo (angl. Cancer antigen 125) CT – ribinis ciklas (angl. Cycle treshold)
DFS – išgyvenamumas iki ligos pasireiškimo (angl. Disease – Free Survival) DNR – deoksiribonukleorūgštis
FIGO – Tarptautinė akušerių ir ginekologų federacija (angl. International Federation of Gynecology
and Obstetrics)
GAPDH – gliceralaldehido-3-fosfato dehidrogenazė HIPEC – hiperterminė intraperitoninė chemoterapija HO-1 – (angl. Heme oxygenase-1)
IC50 – koncentracija, inhibuojanti biologinį procesą 50 proc. (angl. Half maximal inhibitory
concentration)
MUC16 – mucinas 16
NK – natūralieji žudikai arba kileriai (angl. Natural killers) OS – bendras išgyvenamumas (angl. Overall survival)
OVCAR-3 – kiaušidžių vėžio ląstelių linija (angl. Ovarian carcinoma cells) PFS – išgyvenamumas be ligos progresavimo (angl. Progression – free survival) RNR – ribonukleino rūgštis
TL-PGR – tikro laiko polimerazių grandininė reakcija (angl. Real Time Polymerase Chain Reaction
7. SĄVOKOS
HIPEC (angl. hyperthermic intraperitoneal chemotherapy) – hiperterminė intraperitoninė chemoterapija, kai tiesiai į pilvaplėvės ertmę supilamas pakaitintas chemopreparatas
Citoredukcinė operacija – tai naviko apimties mažinimas atliekant operaciją (esant kiaušidžių vėžiui atliekama histerektomija, abipusė salpingooforektomija, omentektomija ir metastazių, esančių pilvaplėvės ertmėje, patologinių limfmazgių pašalinimas)
Išgyvenamumas be ligos progresavimo (angl. Progression – free survival) – laikotarpis po taikyto gydymo iki vėžio atkryčio
8. ĮVADAS
Kiaušidžių vėžys – tai onkologinė liga, kurios metu kiaušidėje susiformuoja piktybinis navikas. Kiekvienais metais 240 000 moterų diagnozuojamas kiaušidžių vėžys, o dėl jo miršta 150 000 [1].
Ankstyvose stadijose kiaušidžių vėžys būna besimptomis, todėl pacientės į gydytojus kreipiasi jau esant pažengusiai ligai, kai išryškėja vėžio sąlygotos komplikacijos: žarnyno nepraeinamumas, ascitas, dusulys ir kitos [1].
Pagrindiniai kiaušidžių vėžio gydymo būdai yra operacinis (chirurginio stadijavimo ar citoredukcinė operacija) ir adjuvantinė chemoterapija. Kai yra kontraindikacijų operacijai, arba manoma, kad radikalus navikinių pakitimų pašalinimas operaciniu būdu negalimas dėl jų išplitimo, gydymas pradedamas skiriant neoadjuvantinę chemoterapiją. Tokiais atvejais, po 2 – 4 neoadjuvantinės chemoterapijos kursų, atliekama citoredukcinė operacija ir skiriami likę chemoterapijos kursai. Tačiau, nepaisant gero atsako į taikytą gydymą, net ~75 proc. atvejų kiaušidžių vėžys recidyvuoja per pirmuosius 2 metus [2,3]. Dažniausiai kiaušidžių vėžys linkęs metastazuoti į pilvaplėvę, taukinę, pleurą, limfmazgius, rečiau – parenchiminius organus.
Pastaruoju metu vis daugiau diskutuojama apie pakankamai naują išplitusio kiaušidžių vėžio gydymo būdą – hiperterminę intraperitoninę chemoterapiją (HIPEC). HIPEC apibūdinama kaip intraperitoninė chemoterapija, kuri leidžiama tiesiai į pilvo ertmę esant 40 – 43 C temperatūrai [4].
Kai kurie tyrimai rodo, kad HIPEC gali pagerinti ligonių bendrą išgyvenamumą ir prailginti laikotarpį iki atkryčio, lyginant su standartine intraveniškai skiriama chemoterapija [5,6].
Žinoma, kad su kiaušidžių vėžiu labiausiai siejamas kraujo žymuo Ca-125 (arba MUC16). MUC16 yra didelės molekulinės masės glikoproteinas, kurį koduoja MUC16 genas. Šio baltymo pokyčiai gali būti naudingi diagnozuojant kiaušidžių vėžį, vertinant taikyto gydymo efektyvumą, arba pacientų stebėjimui dėl galimo atkryčio.
Nustatyta, kad epitelinės kilmės kiaušidžių vėžio ląstelėse MUC16 ekspresija yra padidėjusi, kai tuo tarpu nepakitusiame kiaušidžių epitelyje šio glikoproteino raiškos pokyčių nenustatoma. Pakitusi MUC16 raiška siejama su vėžinių ląstelių invazija, metastazavimu, augimu [7-9].
Lietuvoje iki šiol nebuvo atlikta tyrimų, kurie tirtų MUC16 molekulių raiškos pokyčius hipertermijos ir chemoterapijos sąlygomis. Todėl šio baigiamojo darbo tikslas yra įvertinti MUC16 ekspresijos pakitimus veikiant OVCAR-3 ląsteles atskirai aukšta temperatūra ir cisplatina bei veikiant minėtų sąlygų kombinacija, t.y. hipertermija + cisplatina.
9. TYRIMO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas: Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse normotermijos, hipertermijos sąlygomis ir veikiant cisplatina.
Tyrimo uždaviniai:
1. Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse normotermijos sąlygomis. 2. Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse hipertermijos sąlygomis.
3. Įvertinti MUC16 raišką OVCAR-3 ląstelėse veikiant cisplatina normotermijos ir hipertermijos sąlygomis.
10.
LITERATŪROS APŽVALGA
10.1. Kiaušidžių vėžio epidemiologija
Kiekvienais metais 240 000 moterų diagnozuojamas kiaušidžių vėžys, o dėl jo miršta 150 000. Dėl vėlyvos diagnozės 5 metų išgyvenamumas yra mažesnis nei 45 proc. Kiaušidžių vėžys yra septintas pagal dažnumą moterų piktybinis susirgimas [1]. Ši patologija užima aštuntą vietą tarp moterų mirties dėl vėžio priežasčių [10]. Tuo tarpu Europoje kiaušidžių vėžys užima šeštą vietą tarp moterų susirgimų (2012 m. – 66 tūkst. atvejų) ir penktą vietą tarp moterų mirčių nuo vėžio (2012 m. – 43 tūkst. mirčių). Remiantis 2012 metų duomenimis, didžiausias susirgimų dažnis nustatytas Europoje ir Šiaurės Amerikoje, mažiausias – Azijoje ir Afrikoje. Europoje didžiausi sergamumo rodikliai yra Latvijoje, Lenkijoje, Bulgarijoje (daugiau nei 17 atvejų/100 000), o didžiausias mirtingumas – Latvijoje ir Lietuvoje (12 – 13 atvejų/100 000) [42]. Dažniausiai serga moterys, kurioms yra 60 ir daugiau metų [11]. Lietuvoje didžiausi sergamumo rodikliai yra tarp moterų, kurios sulaukė 75 ir daugiau metų [42]. Pastebėta, kad sergamumas kiaušidžių vėžiu šiek tiek sumažėjo per paskutinius 10 metų [11]. Lietuvoje sergamumas kiaušidžių vėžiu taip pat yra mažėjantis. Remiantis Lietuvos vėžio registro duomenimis, 2012 m. diagnozuota 377 naujų kiaušidžių vėžio atvejų, kai 2011 m. nustatyta 418, o 2009 m. – 459 [43].
Jaunesnio amžiaus (< 40 m.) moterys kiaušidžių vėžiu serga retai. Tokio amžiaus pacientėms dažniausiai diagnozuojami germinacinių ląstelių navikai (angl. germ cell tumors). Moterims, kurios yra vyresnės nei 40 metų, dažniausiai nustatomas epitelinės kilmės kiaušidžių vėžys (> 90 proc. atvejų) [10]. Pastebėta, kad daugiau nei pusei visų pacienčių kiaušidžių vėžys diagnozuojamas pažengusioje stadijoje. 2012 metais Lietuvoje I stadijos kiaušidžių vėžys diagnozuotas 18,8 proc., II stadijos – 4,8 proc., III stadijos – 28,4 proc., IV stadijos – 35 proc., o susirgimo stadija nebuvo nurodyta 13 proc. atvejų [43].
10.2. Kiaušidžių vėžio gydymas
Pagrindiniai kiaušidžių vėžio gydymo būdai yra operacinis (chirurginio stadijavimo ar citoredukcinė operacija) ir adjuvantinė chemoterapija (6 – 8 kursai) su ar be biologinės terapijos [2].
Dažniausia citoredukcinės operacijos apimtis: totalinė histerektomija, abipusė salpingooforektomija, omentektomija ir metastazavusių židinių, pilvo ar dubens ertmėse bei limfmazgiuose, pašalinimas. Citoredukcinės operacijos tikslas yra pašalinti visas matomas navikines
mases [12]. Svarbu paminėti, kad operacijos radikalumas susijęs su ilgesniu pacienčių penkerių metų išgyvenamumu, todėl jis yra vienas svarbiausių prognostinių rodiklių. Operacijos radikalumo nauda įrodyta dar 1975 metais, kada Griffiths ir kiti pastebėjo, kad pacientėms, kurioms po citoredukcinės operacijos nelikdavo makroskopiškai matomų navikinių židinių – jų išgyvenamumo vidurkis siekė 39 mėnesius. Kai naviko židinių likdavo iki 0,5 cm – 29 mėn.; likus 0,6 – 1,5 cm – 18 mėn.; likus >1,6 cm – 11 mėn. [13]. Tačiau, remiantis paskutinėmis atliktomis klinikinėmis studijomis, ligonių išgyvenamumui įtakos turėjo operacijos radikalumas, o ne likusių navikinių židinių dydis [40,41]. Po pirminės citoredukcinės operacijos pacientėms skiriama chemoterapija kas 21 dieną, iš viso 6 – 8 ciklai (dažniausiai pasirenkamas vienas iš platinos preparatų ir paklitakselis) [2].
Kai yra kontraindikacijų operacijai, arba manoma, kad vėžio pašalinimas operaciniu būdu negalimas dėl jo išplitimo, gydymas pradedamas skiriant neoadjuvantinę chemoterapiją. Tokiais atvejais, po 2 – 4 neoadjuvantinės chemoterapijos kursų, atliekama citoredukcinė operacija ir skiriami likę chemoterapijos kursai [14].
10.2.1. Intraperitoninė hiperterminė chemoterapija (HIPEC)
Nepaisant gero atsako į taikytą gydymą, net ~75 proc. atvejų kiaušidžių vėžys recidyvuoja per pirmuosius 2 metus [2,3]. Jeigu atkrytis pasireiškė per pirmuosius šešis mėnesius po taikyto gydymo – toks vėžys vadinamas „platinai atsparus“, jei vėliau nei po šešių mėnesių – „platinai jautrus“ [3]. Blogesnė prognozė pacienčių, kurioms yra „platinai atsparus“ kiaušidžių vėžys [12,15].
Dažniausiai pirminis kiaušidžių vėžys išplinta į pilvaplėvę, taukinę, pleurą, limfmazgius, rečiau – parenchiminius organus. Atkryčio atvejais vėžys dažniausiai plinta į pilvaplėvę. Viena iš galimų priežasčių, kodėl recidyvavęs kiaušidžių vėžys metastazuoja į pilvaplėvę, yra ta, kad, skiriant intraveninę chemoterapiją, vaistas šią ertmę pasiekia sunkiau dėl pilvaplėvės ertmės – kraujo plazmos barjero [16]. Dėl to kiaušidžių vėžio, išplitusio pilvaplėvės ertmėje, gydymas yra problematiškas.
Pastarąjį dešimtmetį, gydant kiaušidžių vėžį, atliekama vis daugiau klinikinių tyrimų naudojant intraperitoninę hiperterminę chemoterapiją (angl. hyperthermic intraperitoneal chemotherapy
(HIPEC)). HIPEC apibūdinama kaip intraperitoninė chemoterapija, kuri leidžiama tiesiai į pilvo ertmę
esant 40 – 43 C temperatūrai [4]. HIPEC metu naudojama chemoterapijos ir aukštos temperatūros kombinacija. HIPEC taikomas pilvaplėvės pseudomiksomos, mezoteliomos ir pilvaplėvės karcinomatozės gydymui, sergant storosios žarnos vėžiu [2,4]. Nors apie HIPEC taikymą kaip apie pirmos eilės gydymą šiuo metu duomenų nėra daug, vis dėlto kai kurios studijos rodo, kad išgyvenamumas yra geresnis nei skiriant vien standartinę intraveninę chemoterapiją [17-19]. Į pilvaplėvės ertmę skiriama chemoterapija veikia geriau pilvaplėvės ertmėje nei sisteminė intraveninė,
nes sunaikina: 1) laisvas navikines ląsteles, esančias pilvaplėvės ertmėje, ascite, navikui peraugus organo paviršių, 2) laisvas navikines ląsteles, kurios atsiranda pilvaplėvės ertmėje operacijos metu: traumuojant naviką, plyšus navikui, rezekuojant organus per naviką ar labai arti jo, atvėrus kraujagysles ar limfagysles, kuriose yra išplitęs navikas, 3) navikines ląsteles, kurios gali likti po operacijos kraujo krešuliuose, iškritusio fibrino siūluose, o vėliau sąlygoti naviko atkrytį ir progresavimą, 4) laisvus trombocitus, neutrofilus, monocitus pilvaplėvės ertmėje, kurie vėliau, gyjant operacinėms žaizdoms, išskiria tumoro augimo faktorius, skatina ne tik normalių, bet ir navikinių ląstelių augimą.
Pastebėta, kad intraperitoninės chemoterapijos skyrimas pagerina bendrą išgyvenamumą pažengusio kiaušidžių vėžio atvejais. Dėl pilvaplėvės ertmės – kraujo plazmos barjero didelė vaisto koncentracija nepasiekia kraujo plazmos, todėl sumažėja sisteminio toksiškumo rizika [12]. Vis dėlto, šis gydymas nėra plačiai taikomas dėl jo galimo šalutinio poveikio, intraperitoninio kateterio naudojimo ypatumų, pilvo skausmų, blogesnės gyvenimo kokybės [4]. Taip pat trūksta bazinių žinių apie karščio ir chemoterapijos kombinacijos poveikį vėžinėms ląstelėms, paciento imuninei sistemai. Iki šiol nėra nustatyta optimalių HIPEC sąlygų (optimalios temperatūros, chemopreparato dozės, procedūros trukmės, pacientų atrankos kriterijų ir t.t.).
Yra 2 pagrindinės HIPEC atlikimo metodikos: atvira ir uždara. Iki dabar jokie moksliniai tyrimai neįrodė, kuri technika yra geresnė ir priimtinesnė, kadangi abi metodikos turi savų privalumų ir trūkumų [12]. Manoma, kad HIPEC procedūra gali būti taikoma pacientams, kuriems po citoredukcinės operacijos neliko matomų navikinių masių, kadangi HIPEC nėra efektyvus, jeigu yra likę didesni nei 2 – 3 mm. dydžio naviko židiniai [12]. Taip yra todėl, kad chemopreparatai hipertermijos sąlygomis gali prasiskverbti į audinį tik 2 – 3 mm. [20]. Dažniausiai naudojami vaistai HIPEC procedūros metu yra cisplatina, oksaliplatina, doksorubicinas, karboplatina, paklitakselis. Vaisto pasirinkimas priklauso nuo jo farmakokinetinių ypatumų: vaistas turėtų būti didelės molekulinės masės tam, kad nepraeitų pilvaplėvės – kraujo plazmos barjero, taip pat jo poveikis turėtų sustiprėti esant aukštai temperatūrai. Cisplatina yra preparatas, kuris gerai penetruoja į navikinius audinius, o jo poveikis yra sustiprinamas hipertermijos pagalba tiek platinai jautrių, tiek platinai atsparių vėžinių ląstelių atveju [12,20].
10.3. MUC16 (CA125) baltymas
MUC16 yra didelės molekulinės masės glikoproteinas, kurį koduoja MUC16 genas. Nustatyta, kad MUC16 genas yra 19p13.2 chromosomoje. MUC16 yra 3 – 5 milijonus daltonų sveriantis baltymas, sudarytas iš pasikartojančių sekų, esančių tarp N – ir C – galinių domenų. C – galinis domenas sudarytas iš 284 aminorūgščių ir yra mažiausia molekulės dalis, tuo tarpu N – galinis domenas sudarytas iš 12,068
aminorūgščių. Tarp šių domenų, manoma, kad yra apie 60 pasikartojančių sričių, iš kurių kiekviena sritis turi po 156 aminorūgštis [24]. Manoma, kad Ca-125 antigeno vieta yra pasikartojančių sričių vietoje. Šis antigenas – epitopas jungiasi su atitinkama antikūno dalimi.
Šio baltymo ekspresija dažniausiai būna padidėjusi moterims, sergančioms kiaušidžių vėžiu, kai tuo tarpu raiška išlieka nepakitusi sveikose kiaušidėse. MUC16 raiška taip pat stebima sveikose bronchų, endometriumo ir ragenos epitelio ląstelėse, pilvaplėvės mezotelio ląstelėse, pleuroje, perikarde. Šis baltymas klinikinėje praktikoje gali būti naudojamas: 1) siekiant diagnozuoti ankstyvos stadijos kiaušidžių vėžį, 2) kai reikia diferencijuoti gerybinį ir piktybinį susirgimus, 3) kai reikia įvertinti atsaką į taikomą gydymą [7].
MUC16 raiška skiriasi priklausomai nuo histologinio kiaušidžių vėžio tipo. Hogdall ir kiti nustatė, kad MUC16 ekspresija serozinio kiaušidžių vėžio atveju siekė 85 proc., 65 proc. – endometrioidinio, 40 proc. – šviesių ląstelių, 36 proc. – nediferencijuotų adenokarcinomų ir vos 12 proc. – mucininių navikų atvejais. Šiame tyrime taip pat nustatyta reikšminga koreliacija tarp FIGO (angl.
International Federation of Gynecology and Obstetrics) stadijos ir MUC16 raiškos [25]. Padidėjusi
MUC16 raiška vėžinėse ląstelėse yra siejama su blogesne pacienčių, sergančių epitelinės kilmės kiaušidžių vėžiu, prognoze [26].
Pacienčių, kurių atsakas į standartinį gydymą buvo geras, žemos MUC16 koncentracijos buvo susijusios su ilgesniu išgyvenamumu be ligos progresavimo ir bendruoju išgyvenamumu [27,28].
10.3.1. MUC16 baltymo imunoprotekcinis poveikis vėžinėms ląstelėms
Nustatyta, kad natūralieji žudikai arba kileriai (NK) ir monocitai negali sunaikinti vėžinių ląstelių, kuriose MUC16 raiška yra padidėjusi. Kai baltymo raiška slopinama, įvyksta kiaušidžių vėžinių ląstelių lizė, sąlygota citolitinio NK poveikio. Nors mechanizmas, kaip MUC16 slopina NK poveikį vėžinėms ląstelėms, nėra iki galo išaiškintas, tačiau vyrauja nuomonė, kad šis glikoproteinas veikia kaip barjeras, neleidžiantis prisijungti NK prie ląstelių – taikinių, šiuo atveju – vėžinių ląstelių, o lizei yra būtina NK ir ląstelių – taikinių sąveika [29]. Kai NK yra susijungę su ląstelėmis – taikiniais, jie išskiria citolizines granules ir sukelia ląstelių apoptozę. Todėl manoma, kad padidėjusi MUC16 raiška apsaugo vėžines ląsteles nuo žūties [7].
Dar viena teorija, kaip pasireiškia MUC16 imunoprotekcinis poveikis, yra šio baltymo sąveika su NK slopinamuoju receptoriumi – Siglec-9. Žinoma, kad NK ląstelių paviršiuje ekspresuojami ir aktyvinantys, ir slopinantys receptoriai. Todėl priklausomai nuo to, su kuriais receptoriais sąveikauja ląstelių – taikinių paviršiuje esantys ligandai, priklausys ir NK citolitinis poveikis: jis bus aktyvinamas arba slopinamas [30]. Siglec yra slopinamųjų receptorių klasė, kuri jungiasi prie neigiamą krūvį ir sialo
rūgštį turinčių ligandų [31]. MUC16 oligosacharidai turi sialo rūgštį alfa 2 – 3 jungtyje. Minėtieji oligosacharidai yra atpažįstami kaip ligandai slopinamojo receptoriaus Siglec-9. Tokia MUC16 ir Siglec-9 sąveika apsaugo vėžines ląsteles nuo NK lizės. Pažymėtina, kad monocitų ląstelių paviršiuje taip pat yra ekspresuojamas Siglec-9. Manoma, kad vėžinės ląstelės nuo lizės gali būti apsaugotos labai panašiu būdu dėl slopinamojo Siglec-9 receptoriaus kaip minėta anksčiau.
Pastebėta, kad NK sunaikina tas kiaušidžių vėžines ląsteles, kurių MUC16 ekspresija ląstelių paviršiuje yra maža. Tuo tarpu išgyvena tos vėžinės ląstelės, kuriose šio baltymo raiška yra didesnė, kadangi jos yra atsparesnės imuniniam poveikiui [7].
10.3.2. MUC 16 ir naviko metastazavimas
Vėžinės ląstelės, kurių paviršiuje MUC16 raiška yra didesnė, linkusios metastazuoti į pilvaplėvę. [8]. Taip atsitinka dėl MUC16 ir mezotelino susijungimo. Mezotelinas – glikoproteinas, randamas mezotelio ląstelių paviršiuje (šios ląstelės dengia pilvaplėvę), tačiau jo raiška taip pat būna padidėjusi ir kiaušidžių vėžinėse ląstelėse. MUC16 – mezotelino sąveika sudaro sąlygas vėžinėms ląstelėms jungtis vienai su kita. Tokiu būdu susiformuoja didesnės navikinės masės metastazavimo vietose [32].
2011 metais Theriault ir kiti atliko tyrimą, kurio tikslas buvo įvertinti MUC16 baltymo vaidmenį naviko augime ir metastazavime. Tyrimo metu MUC16 buvo slopinamas (angl. knockdown) OVCAR-3 ląstelėse, kuriose jo ekspresija buvo padidėjusi. Tyrimas parodė, kad MUC16 slopinimas OVCAR-3 ląstelėse sumažino naviko augimą in vivo ir in vitro [9].
Vadinasi, MUC16 yra svarbus kiaušidžių vėžio ląstelių augimui ir metastazavimui. Manoma, kad šis glikoproteinas turi imunoprotekcinį mechanizmą, kuris neleidžia NK sunaikinti vėžinių ląstelių. HIPEC sąlygomis šio baltymo raiška nebuvo tyrinėta. Todėl šio baigiamojo darbo tikslas buvo įvertinti MUC16 ekspresijos pakitimus veikiant OVCAR-3 ląsteles atskirai ar kartu aukšta temperatūra ir cisplatina. Manome, kad MUC16 slopinimas galėtų pagerinti HIPEC rezultatus.
11.
TYRIMO METODIKA
Tyrime naudojama tikro laiko PGR (TL-PGR) analizė – tai molekulinės biologijos metodas, naudojamas vienu metu pagausinti norimą DNR fragmentą ir kiekybiškai įvertinti produkto kiekį. Metodo esmė – vykdoma DNR ar kopijinės DNR (kDNR) fragmento amplifikacija, kurios metu naudojamos fluorescencuojančios žymės ir po kiekvieno PGR ciklo pagal fluorescencijos intensyvumą nustatomas susidariusio produkto kiekis [45].
TL-PGR dažniausiai atliekama kartu su kDNR sinteze, nes pati RNR molekulė yra nestabili, linkusi degraduoti dėl RNR nukleazių, esančių aplinkoje. Norint išvengti šių pokyčių, informacinėje RNR (iRNR) užkoduota biologinė informacija yra „perrašoma“ atvirkštinės transkriptazės pagalba į stabilesnę nukleorūgšties formą – DNR, gaunant kDNR. Nustatytas gausinamos kDNR kiekis atitinka iRNR kiekį [45].
TL-PGR analizės metu nustatomas fluorescencijos signalo intensyvumas. Fluorescencijai viršijus foninį lygį, pasiekiama slenkstinė vertė (angl. threshold) ir fiksuojamas pagrindinis kriterijus, analizuojant TL-PGR rezultatus – ciklų skaičius (CT). Kuo mažiau ciklų reikia, norint pasiekti slenkstinę
vertę, tuo didesnis pradinės DNR kiekis yra mėginyje. Taigi, kada yra fiksuojama fluorescencijos slenkstinė vertė, galima įvertinti pradinę tiriamojo geno iRNR kiekybinę išraišką. Vėliau apskaičiuojama santykinė iRNR raiška mėginyje pagal Livako metodą.
11.1. Ląstelių kultivavimas
Tyrimui pasirinkta epitelinės kilmės kiaušidžių vėžio ląstelių linija – OVCAR-3. Ląstelės auginamos remiantis ATCC (angl. American Type Culture Collection) rekomendacijomis „LSMU MA virškinimo sistemos tyrimų instituto Chirurginės gastroenterologijos laboratorijoje“.
OVCAR-3 ląstelės buvo kultivuotos RPMI-1640 mitybinėje terpėje (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kuri praturtinta 20 proc. jaučio serumu (Gibco/Invitrogen), 1 proc. penicilino/streptomicino (Gibco/Invitrogen) ir 0,01 mg/ml jaučio insulinu. Ląstelės auginamos klasikinėmis in vitro sąlygomis: 37 C temperatūra, 5 proc. CO2 atmosfera, drėgmė.
11.2. Eksperimento atlikimas
Ląstelės minėtomis sąlygomis buvo kultivuojamos 24 valandas. Vėliau jos buvo veikiamos 37 C (normotermija), 43 C (hipertermija) su cisplatina arba be jos 1 valandą (laikas pradėtas skaičiuoti nuo tada, kai buvo pasiekta reikiama temperatūra). Šiame tyrime OVCAR-3 ląstelės buvo veikiamos cisplatinos IC-50 doze (184 uM). Cisplatinos IC-50 dozė nustatyta titruojant. Vėliau terpė buvo keičiama į įprastinę mitybinę terpę ir ląstelės kultivuojamos dar 48 valandas pagal ATCC rekomendacijas (1 pav.).
1 pav. Tyrimo atlikimo eiga
11.3. Genų raiškos pokyčių nustatymas tikro laiko PGR metodu
RNR išskyrimui, kolonėlių metodu, iš efektoriumi (cisplatina ir/ar hipertermija) paveiktų OVCAR-3 ląstelių, naudotas komercinis „PureLink RNA micro kit“ (Invitrogen, JAV) gryninimo rinkinys ir vadovautasi gamintojo protokolu. RNR koncentracija ir švarumas nustatytas naudojant spektrofotometrą NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, JAV), tinkami mėginiai, kurių optinių tankių 260/280 nm santykis yra apie 2.
RNR konvertavimui į kopijinę DNR (kDNR) naudotas komercinis „Super Script Vilo Master Mix“ (Invitrogen) rinkinys, vadovaujantis gamintojo protokolu. kDNR buvo paruošta naudojant 2 g RNR ir minėto komercinio rinkinio komponentus. Pastaruosius komponentus patalpinus į termociklerį ThermoCycler nexus GSX1 (Eppendorf, Vokietija), buvo paleidžiama reakcija, kurios metu gauta kDNR.
Kiekybiniu tikro laiko PGR (TL-PGR) metodu, MUC16 raiškos pokyčių vertinimui, buvo naudojami komerciniai rinkiniai ir reagentai. Santykinei MUC16 RNR raiškai nustatyti buvo naudojamas referentinis (kontrolinis) genas GAPDH (gliceralaldehido-3-fosfato dehidrogenazė). Tinkamas
kontrolinis genas apibrėžiamas toks genas, kuris geba kompensuoti nebiologinius svyravimus, atsiradusius mėginio paruošimo metu. TL-PGR naudoti MUC16 ir GAPDH pradmenys (Invitrogen, JAV). MUC-16 pradmenų sekos: pirmaujančioji TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ ir reversinė 5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’. Reakcijų mišiniai išpilstyti į 96-ių šulinėlių plokštelę. Paruošta plokštelė įdėta į PGR termociklerį 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied biosystems, JAV).
MUC-16 raiškos analizei buvo taikytas ΔΔCT metodas:
ΔΔCTMUC16 K43o= (CT(MUC16 K43oC) – CT(GAPDH K43o)) – (CT(MUC16 K37oC) – CT(GAPDH K37oC))
ΔΔCTMUC16 Cis37o= (CT(MUC16 Cis37oC) – CT(GAPDH Cis37oC)) – (CT(MUC16 K37oC) – CT(GAPDH K37oC))
ΔΔCTMUC16 Cis43o= (CT(MUC16 Cis43oC) – CT(GAPDH Cis43oC)) – (CT(MUC16 K37oC) – CT(GAPDH K37oC))
Santykinė iRNR raiška mėginyje apskaičiuojama pagal Livako metodą: 2-(ΔΔCT)
11.4. Baltymų raiškos nustatymas Western Blot metodu
MUC-16 koncentracijai OVCAR-3 ląstelėse patikrinti ir įvertinti buvo naudota Western blot analizė. Po 48 val. nuo efektoriaus poveikio paruošti ląstelių lizatai. Paruošus ląstelių lizatus radioimunoprecipitacijos buferiu (Abcam, JK), su proteazių inhibitoriais (Roche Diagnostics, Šveicarija) bei naudojant baltymų kiekio nustatymo rinkinį (Thermo Fischer Scientific JAV), nustatyta baltymų koncentracija, vadovaujantis gamintojo pateiktu protokolu. Vienam mėginiui naudotas 50 μg bendro baltymo kiekis. 5 min. pašildytų 97 C mėginių buvo perkelta į 4 – 12 proc. SDS-PAGE gelį. Veikiant šį gelį 30 V 50 min., mėginiai perkelti ant polivinilideno fluorido membranos. Paskui membranos veiktos blokavimo buferiu (Thermo Fisher Scientific, JAV) 1 val. kambario temperatūroje. Vėliau, 4 C temperatūroje parą laiko veikti pirminiais antikūniais. MUC16 antikūnis – antiMUC16, išgautas iš triušio (Abcam, JK), taip pat naudotas ir kontrolinis antikūnis – GAPDH, išgautas iš pelės (Ambion, JAV). Vėliau mėginiai veikti antriniais antikūniais 1 val. kambario temperatūroje: prieš triušio antikūnius (Invitrogen, JAV) bei prieš pelės (Invitrogen, JAV). Rezultatų vizualizacijai naudotas chemiliuminescuojantis substratas (Invitrogen, JAV) su ChemiDoc sistema (Bio-Rad Laboratories, JAV). ImageJ (versija 1.48; National Institutes of Health, JAV) programinė įranga naudota siekiant vaizdinį rezultatą paversti skaitiniu.
11.5. Statistinė analizė
Grafiniam tyrimų vaizdavimui naudota GraphPad programa. Statistinis skirtumas apskaičiuotas pagal Mann-Whitney testą. Vidurkis ir standartinė paklaida gauti iš 3 eksperimentų. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.
12.
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
12.1. Rezultatai
12.1.1. MUC16 RNR raiškos pokyčiai
Atlikta tikro laiko PGR analizė, kurios tikslas – kiekybinis MUC16 RNR įvertinimas. Tyrimas atliktas praėjus 48 valandoms po to, kai OVCAR-3 ląstelės paveiktos hipertermija, cisplatina ar aukštos temperatūros ir cisplatinos kombinacija. MUC16 RNR raiška kontrolinėmis sąlygomis (37 C, be cisplatinos – K37) prilyginama 1.
Atlikus tyrimą, nustatėme, kad MUC16 RNR raiška, veikiant OVCAR-3 ląsteles hipertermija (43C, be cisplatinos – K43), padidėjo 30 proc., t.y. 1,30 karto (p>0,05).
Tiriant vien cisplatinos (37C, su cisplatina – Cis37) poveikį OVCAR-3 ląstelėms, nustatyta, kad MUC16 RNR raiška, sumažėjo 12 proc., t.y. pakito 0,88 karto (p>0,05).
Kai OVCAR-3 ląstelės buvo veikiamos HIPEC sąlygomis (43C + cisplatina – Cis43), MUC16
RNR raiška padidėjo 278 proc., t.y. padidėjo 3,78 karto (p<0,05).
Atsižvelgiant į gautus rezultatus, MUC16 RNR raiška didžiausia buvo tada, kai OVCAR-3 ląstelės buvo veikiamos HIPEC sąlygomis, t.y. 43 C + cisplatina (2 pav.), p<0,05.
2 pav. MUC16 RNR raiškos pokyčiai po 48 valandų, paveikus OVCAR-3 hipertermija, cisplatina arba aukšta temperatūra ir cisplatina, išreikšti kartais
1 0.88 1.3 3.78 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 K37 Cis37 K43 Cis43 M UC1 6 RNR ra iš ka , iš re ik št a ka rt ais
12.1.2. Kokybiniai MUC16 baltymo raiškos pokyčiai
Taikant kokybinį Western Blot metodą, MUC16 baltymo padidėjusi ekspresija nustatyta OVCAR-3 ląstelėse normotermijos sąlygomis (37 C, be cisplatinos – K37) (3 pav., Nr.1).
OVCAR-3 ląsteles paveikus HIPEC sąlygomis (43C + cisplatina – Cis43), po 48 valandų MUC16 ekspresija ir baltymo kiekis sumažėjo (3 pav., Nr.2).
3 pav. MUC16 molekulių raiška baltymo lygmenyje kontrolinėmis ir HIPEC sąlygomis
12.1.3. MUC16 baltymo raiškos kiekybinis įvertinimas
Kiekybiškai (naudojant programinę įrangą, paverčiančią vaizdinį rezultatą skaitiniu) įvertinus MUC16 raiškos kitimus baltymo lygmenyje (48 valandos po poveikio efektoriumi), nustatyta, kad kontrolinėmis sąlygomis (37 C, be cisplatinos – K37) MUC16 baltymo ekspresija OVCAR-3 ląstelėse buvo 14,06 kartų didesnė nei ląsteles paveikus hipertermijos ir cisplatinos kombinacija.
OVCAR-3 ląstelėse HIPEC (43 C + cisplatina – Cis43) sąlygos sumažino MUC16 raišką baltymo lygmenyje (4 pav.).
MUC16 GAPDH K37 Cis43 1.
A.
AGS
1. 2. 3.
OVCAR-3
1. 2. 3.
T3M4
1. 2. 3.
1. siMUC16 37°C, 48h
2. K 37°C, 48h
3. +cis 43°C, 48h
MUC16
GAPDH
2.4 pav. MUC16 baltymo raiškos kiekybinis įvertinimas, išreikštas kartais
12.2. Rezultatų aptarimas
Mūsų atliktame tyrime MUC16 raiška RNR lygmenyje nepakito, kai OVCAR-3 ląstelės buvo veikiamos tik aukšta temperatūra (43 oC) arba tik cisplatina IC-50. Tačiau MUC16 RNR raiška padidėjo
~4 kartus, kai OVCAR-3 ląstelės buvo veikiamos kombinuojant hipertermiją su cisplatina – tai yra sąlygos, kurios imituoja klinikinėje praktikoje naudojamas HIPEC sąlygas. Dėl to, taikant HIPEC, gali būti stimuliuojama MUC16 raiška vėžinėse ląstelėse bei aktyvuojami citoprotekciniai baltymai, ypatingai karščio indukuojami baltymai, dėl ko gaunamas priešingas efektas nei tikėtasi – po gydymo vėžys greitai progresuoja ir metastazuoja. Žinoma, kad MUC16 raiškos padidėjimas yra apsauginis navikinių ląstelių mechanizmas, kuris neleidžia NK prisijungti prie kiaušidžių vėžio ląstelių. Dėl NK negalėjimo prisijungti prie šių ląstelių – neįvyksta lizė ir navikinių ląstelių apoptozė. Tokiu atveju vėžinės ląstelės išgyvena ir gali metastazuoti [29]. Gubbels JA ir kiti atliktame tyrime pastebėjo, kad sumažėjusi MUC16 raiška koreliavo su padidėjusiu sinapsių kiekiu tarp NK ir kiaušidžių vėžio ląstelių [29]. Pažymėtina, kad MUC16 apsaugo kiaušidžių vėžines ląsteles nuo imuninių ląstelių poveikio, sąveikaudamas su Siglec-9 arba slopindamas CD16, esantį NK paviršiuje [33]. Padidėjusi MUC16 raiška siejama su blogesne kiaušidžių, intrahepatinės cholangiokarcinomos, kasos, stemplės, skrandžio vėžio prognoze ir išgyvenamumu [34-36]. Padidėjusi MUC16 ekspresija gali apsaugoti ląsteles ir nuo citotoksinių vaistų poveikio [37].
K37 Cis43 15 10 5 0 M UC 16/G AP DH k ieki s, iš re ik štas k ar tais 2.18 14.06
Manome, kad slopinant MUC16 raišką kiaušidžių vėžio ląstelėse prieš HIPEC taikymą, būtų galima pagerinti gydymo rezultatus.
Anksčiau minėtame Theriault ir kiti tyrime buvo tirta MUC16 raiška OVCAR-3 ląstelėse. Šiame tyrime minėto glikoproteino ekspresija buvo slopinama monokloninio antikūno pagalba. Ląstelės, kurių MUC16 raiška buvo nuslopinta, nustojo augti 4 dieną, t.y. pasiekė plato fazę. Palyginimui, OVCAR-3 ląstelės, kurių MUC16 raiška nenuslopinta, augo ir toliau, nepasiekdamos plato fazės. Tyrime įrodyta, kad MUC16 ekspresijos slopinimas sumažina ir tumorogeninį poveikį [9].
Nors iki dabar mažai žinoma apie MUC16 raiškos reguliavimą, naujausi šaltiniai teigia, kad uždegiminiai citokinai gali stimuliuoti šio mucino ekspresiją. Taip yra dėl to, kad ascitas, atsirandantis kiaušidžių vėžio progresavimo fone, sukuria uždegiminę aplinką. Šiame skystyje yra gausu citokinų, chemokinų ir augimo faktorių, kurie galėtų didinti MUC16 raišką žmogaus peritoninėse mezotelio ląstelėse [38].
Kad karščio indukuojamo baltymo raiškos reguliavimas gali pagerinti vėžinių ląstelių atsaką į gydymą, nagrinėjo Čėsna ir kiti [39]. Mokslininkai įrodė, kad, nuslopinus HO-1 geno raišką, OVCAR-3 ląstelių atsakas į hipertermiją (4OVCAR-3 oC) ir cisplatiną pagerėjo: cisplatinos sąlygota apoptozė šių ląstelių linijoje padidėjo 2,07 karto, o hipertermijos sąlygota apoptozė – 3,09 karto. Verta paminėti, kad šiame tyrime OVCAR-3 paveikus HIPEC sąlygomis, HO-1 baltymo raiška padidėjo net 11 kartų, lyginant su kontrole.
Šio tyrimo trūkumai: 1) ištirta tik viena ląstelių linija, 2) in vitro neįmanoma atkartoti visų sąlygų, kurios susidaro in vivo.
Verta paminėti, kad mūsų atliktame tyrime MUC16 baltymo ekspresija sumažėjo, veikiant OVCAR-3 ląsteles HIPEC sąlygomis. Nėra aišku, kodėl šiuo atveju RNR nėra transliuojama į galutinį produktą – baltymą. Tačiau reiškinys, kai informacinės RNR (iRNR) kiekis dažnai nebūna lygus ekspresuojamo baltymo kiekiui, yra dažnas. Tokį reiškinį būtų galima paaiškinti keliais būdais: 1) ląstelėje vyksta labai daug sudėtingų potranskripcinių procesų, kurių dėka RNR verčiamas į baltymą. Vis dėlto, šie mechanizmai nėra iki galo išaiškinti, todėl apskaičiuoti baltymo kiekį iš iRNR yra sunku, 2) skiriasi įvairių baltymų gyvavimo pusperiodžiai in vivo, 3) atliekamų tyrimų netikslumą gali lemti aplinkos ar kitos sąlygos, kurios gali turėti įtakos eksperimento rezultatams, dėl ko yra sunku susidaryti aiškų vaizdą apie RNR transliavimą į baltymą [44]. Kitas galimas paaiškinimas – mikroRNR molekulės, kurios, prisijungusios prie iRNR, gali keisti potranskripcinę geno raišką. Vyrauja nuomonė, kad mikroRNR geba blokuoti transliacijos iniciacijos faktorių, dėl ko nevyksta iRNR transliacija [46].
Taigi, atlikto pilotinio tyrimo rezultatai skatina imtis tolimesnių tyrimų atliekant eksperimentus su daugiau ląstelių linijų, su ląstelėmis ex vivo (pacientų ascito ar naviko), ar tyrimus in vivo (su pelėmis), siekiant pagerinti ligonių, sergančių kiaušidžių vėžiu, gydymo rezultatus.
13.
IŠVADOS
1. Nustatyta MUC16 RNR raiška OVCAR-3 ląstelėse normotermijos sąlygomis ir naudota kaip kontrolė.
2. MUC16 RNR raiška OVCAR-3 ląstelėse hipertermijos sąlygomis reikšmingai nepakito.
3. MUC16 RNR raiška OVCAR-3 ląstelėse veikiant cisplatina ir normotermija reikšmingai nepakito, tačiau, veikiant cisplatina ir hipertermija, padidėjo 3,78 kartų (p<0,05). MUC16 baltymo raiška, OVCAR-3 ląsteles veikiant cisplatina ir hipertermija, buvo mažesnė nei veikiant normotermijos sąlygomis.
14. LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Lheureux S, Gourley C, Vergote I, Oza AM. Epithelial ovarian cancer. Lancet 2019 Mar 23;393(10177):1240-1253.
2. Cortez AJ, Tudrej P, Kujawa KA, Lisowska KM. Advances in ovarian cancer therapy. Cancer Chemother Pharmacol 2018 Jan;81(1):17-38.
3. Le Saux O, Decullier E, Freyer G, Glehen O, Bakrin N. Long-term survival in patients with epithelial ovarian cancer following cytoreductive surgery and hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC). Int J Hyperthermia 2018;35(1):652-657.
4. Wu Q, Wu Q, Xu J, Cheng X, Wang X, Lu W, et al. Efficacy of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy in patients with epithelial ovarian cancer: a meta-analysis. Int J Hyperthermia 2019;36(1):562-572.
5. Huo YR, Richards A, Liauw W, Morris DL. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) and cytoreductive surgery (CRS) in ovarian cancer: A systematic review and meta-analysis. Eur J Surg Oncol 2015 Dec;41(12):1578-1589.
6. Arjona-Sanchez A, Rufian-Pena S. Progress in the management of primary and recurrent ovarian carcinomatosis with peritonectomy procedure and HIPEC in a high volume centre. Int J Hyperthermia 2017 Aug;33(5):554-561.
7. Felder M, Kapur A, Gonzalez-Bosquet J, Horibata S, Heintz J, Albrecht R, et al. MUC16 (CA125): tumor biomarker to cancer therapy, a work in progress. Mol Cancer 2014 May 29;13:129-4598-13-129.
8. Tang Z, Qian M, Ho M. The role of mesothelin in tumor progression and targeted therapy. Anticancer Agents Med Chem 2013 Feb;13(2):276-280.
9. Theriault C, Pinard M, Comamala M, Migneault M, Beaudin J, Matte I, et al. MUC16 (CA125) regulates epithelial ovarian cancer cell growth, tumorigenesis and metastasis. Gynecol Oncol 2011 Jun 1;121(3):434-443.
10. Webb PM, Jordan SJ. Epidemiology of epithelial ovarian cancer. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2017 May;41:3-14.
11. Orr B, Edwards RP. Diagnosis and Treatment of Ovarian Cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2018 Dec;32(6):943-964.
12. Bhatt A, Glehen O. The role of Cytoreductive Surgery and Hyperthermic Intraperitoneal Chemotherapy (HIPEC) in Ovarian Cancer: A Review. Indian J Surg Oncol 2016 Jun;7(2):188-197.
13. Griffiths CT. Surgical resection of tumor bulk in the primary treatment of ovarian carcinoma. Natl Cancer Inst Monogr 1975 Oct;42:101-104.
14. Cowan RA, O'Cearbhaill RE, Zivanovic O, Chi DS. Current status and future prospects of hyperthermic intraoperative intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) clinical trials in ovarian cancer. Int J Hyperthermia 2017 Aug;33(5):548-553.
15. Pujade-Lauraine E, Hilpert F, Weber B, Reuss A, Poveda A, Kristensen G, et al. Bevacizumab combined with chemotherapy for platinum-resistant recurrent ovarian cancer: The AURELIA open-label randomized phase III trial. J Clin Oncol 2014 May 1;32(13):1302-1308.
16. Wang Y, Ren F, Chen P, Liu S, Song Z, Ma X. Effects of CytoReductive surgery plus hyperthermic IntraPEritoneal chemotherapy (HIPEC) versus CytoReductive surgery for ovarian cancer patients: A systematic review and meta-analysis. Eur J Surg Oncol 2019 Mar;45(3):301-309.
17. Pomel C, Ferron G, Lorimier G, Rey A, Lhomme C, Classe JM, et al. Hyperthermic intra-peritoneal chemotherapy using oxaliplatin as consolidation therapy for advanced epithelial ovarian carcinoma. Results of a phase II prospective multicentre trial. CHIPOVAC study. Eur J Surg Oncol 2010 Jun;36(6):589-593.
18. Bakrin N, Bereder JM, Decullier E, Classe JM, Msika S, Lorimier G, et al. Peritoneal carcinomatosis treated with cytoreductive surgery and Hyperthermic Intraperitoneal Chemotherapy (HIPEC) for advanced ovarian carcinoma: a French multicentre retrospective cohort study of 566 patients. Eur J Surg Oncol 2013 Dec;39(12):1435-1443.
19. Helm CW, Richard SD, Pan J, Bartlett D, Goodman MD, Hoefer R, et al. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy in ovarian cancer: first report of the HYPER-O registry. Int J Gynecol Cancer 2010 Jan;20(1):61-69.
20. Samartzis K, Thomakos N, Liontos M, Kollia D, Malakasis A, Haidopoulos D, et al. Is it the right moment to include hyperthermic intraperitoneal chemotherapy as standard in ovarian cancer management? A reappraisal. J BUON 2018 Dec;23(7):19-23.
21. van Driel WJ, Koole SN, Sikorska K, Schagen van Leeuwen JH, Schreuder HWR, Hermans RHM, et al. Hyperthermic Intraperitoneal Chemotherapy in Ovarian Cancer. N Engl J Med 2018 Jan 18;378(3):230-240.
22. Warschkow R, Tarantino I, Lange J, Muller SA, Schmied BM, Zund M, et al. Does hyperthermic intraoperative chemotherapy lead to improved outcomes in patients with ovarian cancer? A single center cohort study in 111 consecutive patients. Patient Saf Surg 2012 Jun 15;6(1):12-9493-6-12.
23. Fahim MI, Nassar OA, Mansour OM, Ali AM, Mahmoud AM, Hafez NH, et al. Hyperthermic Intraperitoneal Chemotherapy as a Treatment for Epithelial Ovarian Cancer. Indian J Surg Oncol 2019 Sep;10(3):417-421.
24. O'Brien TJ, Beard JB, Underwood LJ, Dennis RA, Santin AD, York L. The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumour Biol 2001 Nov-Dec;22(6):348-366.
25. Hogdall EV, Christensen L, Kjaer SK, Blaakaer J, Kjaerbye-Thygesen A, Gayther S, et al. CA125 expression pattern, prognosis and correlation with serum CA125 in ovarian tumor patients. From The Danish "MALOVA" Ovarian Cancer Study. Gynecol Oncol 2007 Mar;104(3):508-515.
26. Chen X, Li X, Wang X, Zhu Q, Wu X, Wang X. MUC16 impacts tumor proliferation and migration through cytoplasmic translocation of P120-catenin in epithelial ovarian cancer cells: an original research. BMC Cancer 2019 Feb 22;19(1):171-019-5371-4.
27. Krivak TC, Tian C, Rose GS, Armstrong DK, Maxwell GL. A Gynecologic Oncology Group Study of serum CA-125 levels in patients with stage III optimally debulked ovarian cancer treated with intraperitoneal compared to intravenous chemotherapy: an analysis of patients enrolled in GOG 172. Gynecol Oncol 2009 Oct;115(1):81-85.
28. van Altena AM, Kolwijck E, Spanjer MJ, Hendriks JC, Massuger LF, de Hullu JA. CA125 nadir concentration is an independent predictor of tumor recurrence in patients with ovarian cancer: a population-based study. Gynecol Oncol 2010 Nov;119(2):265-269.
29. Gubbels JA, Felder M, Horibata S, Belisle JA, Kapur A, Holden H, et al. MUC16 provides immune protection by inhibiting synapse formation between NK and ovarian tumor cells. Mol Cancer 2010 Jan 20;9:11-4598-9-11.
30. Lanier LL. Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. Nat Immunol 2008 May;9(5):495-502.
31. Crocker PR, Paulson JC, Varki A. Siglecs and their roles in the immune system. Nat Rev Immunol 2007 Apr;7(4):255-266.
32. Gubbels JA, Belisle J, Onda M, Rancourt C, Migneault M, Ho M, et al. Mesothelin-MUC16 binding is a high affinity, N-glycan dependent interaction that facilitates peritoneal metastasis of ovarian tumors. Mol Cancer 2006 Oct 26;5(1):50-4598-5-50.
33. Aithal A, Rauth S, Kshirsagar P, Shah A, Lakshmanan I, Junker WM, et al. MUC16 as a novel target for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 2018 Aug;22(8):675-686.
34. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature 2011 Jun 29;474(7353):609-615.
35. Higashi M, Yamada N, Yokoyama S, Kitamoto S, Tabata K, Koriyama C, et al. Pathobiological implications of MUC16/CA125 expression in intrahepatic cholangiocarcinoma-mass forming type. Pathobiology 2012;79(2):101-106.
36. Streppel MM, Vincent A, Mukherjee R, Campbell NR, Chen SH, Konstantopoulos K, et al. Mucin 16 (cancer antigen 125) expression in human tissues and cell lines and correlation with clinical
outcome in adenocarcinomas of the pancreas, esophagus, stomach, and colon. Hum Pathol 2012 Oct;43(10):1755-1763.
37. Boivin M, Lane D, Piche A, Rancourt C. CA125 (MUC16) tumor antigen selectively modulates the sensitivity of ovarian cancer cells to genotoxic drug-induced apoptosis. Gynecol Oncol 2009 Dec;115(3):407-413.
38. Matte I, Garde-Granger P, Bessette P, Piche A. Ascites from ovarian cancer patients stimulates MUC16 mucin expression and secretion in human peritoneal mesothelial cells through an Akt-dependent pathway. BMC Cancer 2019 Apr 30;19(1):406-019-5611-7.
39. Cesna V, Sukovas A, Jasukaitiene A, Silkuniene G, Paskauskas S, Dambrauskas Z, et al. Stimulated upregulation of HO-1 is associated with inadequate response of gastric and ovarian cancer cell lines to hyperthermia and cisplatin treatment. Oncol Lett 2019 Aug;18(2):1961-1968.
40. Liberale G, Pop CF, Polastro L, Kerger J, Moreau M, Chintinne M, et al. A radical approach to achieve complete cytoreductive surgery improve survival of patients with advanced ovarian cancer. J Visc Surg 2019 Dec 11.
41. Sorensen SM, Schnack TH, Hogdall C. Impact of residual disease on overall survival in women with Federation of Gynecology and Obstetrics stage IIIB-IIIC vs stage IV epithelial ovarian cancer after primary surgery. Acta Obstet Gynecol Scand 2019 Jan;98(1):34-43.
42. Samalavičius, N., Aleknavičius, E., Žilinskas, K., Daukantienė, L. and Čiurlienė, R. (2015). Epitelinio kiaušidžių vėžio (ligos kodas pagal TLK-10-AM C56), diagnostikos ir gydymo metodika.
[online] Sam.lrv.lt. Available at:
https://sam.lrv.lt/uploads/sam/documents/files/Veiklos_sritys/Asmens_sveikatos_prieziura/Diagnostik os_metodikos_ir_rekomendacijos/Metodikos/Kiausidziu_vezio_diagnostikos_ir_gydymo_metodika.pd f [Accessed 19 Sep. 2019].
43. Vėžio registras. Vėžys Lietuvoje 2012 m. Nacionalinis vėžio institutas 2019.
44. Greenbaum D, Colangelo C, Williams K, Gerstein M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biol 2003;4(9):117-2003-4-9-117. Epub 2003 Aug 29.
45. Kasnauskienė J. Viso žmogaus genomo analizės metodai . Vilnius: Vilniaus universitetas; 2014.
46. Sethi A, Kulkarni N, Sonar S, Lal G. Role of miRNAs in CD4 T cell plasticity during inflammation and tolerance. Front Genet. 2013;4(JAN).
