FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
KOTRYNA KOLPAKOVA
RUTULINIŲ EUKALIPTŲ (EUCALYPTUS GLOBULUS L.) IR
VYTELINIŲ EUKALIPTŲ (EUCALYPTUS VIMINALIS L.) LAPŲ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ETERINIO ALIEJAUS KOKYBINĖS,
KIEKYBINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai:
Dr. K. Zymonė 2016-2017 m.m. Prof. habil. dr. V. Janulis 2018 m.m.
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. Dr. Ramunė Morkūnienė
RUTULINIŲ EUKALIPTŲ (EUCALYPTUS GLOBULUS L.) IR
VYTELINIŲ EUKALIPTŲ (EUCALYPTUS VIMINALIS L.) LAPŲ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ETERINIO ALIEJAUS KOKYBINĖS,
KIEKYBINĖS SUDĖTIES TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai: Darbą atliko
Dr. K. Zymonė 2016-2017 m.m. Kotryna Kolpakova
Prof. habil. dr. V. Janulis 2018 m.m.
Recenzentas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
2.1. Eukaliptų (Eucalyptus L‘Her.) genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ... 12
2.2. Eukaliptų lapų fitocheminės sudėties tyrimai ... 13
2.3. Eukaliptų lapų preparatų panaudojimas medicinoje ir biologinio poveikio tyrimai ... 15
2.4. Antioksidantintinio aktyvumo nustatymo metodai ... 18
2.5. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 19
3. TYRIMO METODIKA ... 20
3.1. Tyrimų objektas ... 20
3.2. Naudotos medžiagos ir reagentai ... 20
3.3. Naudota aparatūra ... 20
3.4. Eukaliptų lapų ekstraktų paruošimas ... 21
3.5. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu metodu ... 21
3.6. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 22
3.7. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 22
3.8. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas FRAP metodu ... 23
3.9. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas ABTS metodu ... 23
3.10. Antioksidantinio aktyvumo tyriams DPPH metodu ... 24
3.11. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 24
3.12. Eukaliptų lapų eterinio aliejaus paruošimas ... 25
3.13. Eukaliptų lapų eterinio aliejaus komponentų kokybinis nustatymas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) metodu ... 25
3.14. Eukaliptų lapų eterinio aliejaus komponentų kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos metodu ... 26
3.15. Duomenų analizės metodai ... 26
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 27
4.2. Bendro fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekio nustatymas
eukaliptų lapų žaliavų ėminiuose ... 29
4.3. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas eukaliptų lapų ėminiuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 32
4.4. Eukaliptų lapų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas FRAP, ABTS, DPPH spektrofotometriniais metodais ... 36
4.5. Eukaliptų lapų eterinio aliejaus komponentų sudėties kokybinis ir kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos metodu ... 38 4.8. Rezultatų apibendrinimas ... 40 IŠVADOS ... 41 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44 PRIEDAI ... 50
SANTRAUKA
Kotrynos Kolpakovos magistro baigiamasis darbas/ moksliniai vadovai dr. K. Zymonė, prof. habil. dr. V. Janulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus Labill.) ir vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis Labill.) lapų fenolinių junginių ir eterinio aliejaus kokybinės, kiekybinės sudėties tyrimas.
Darbo tikslas: Ištirti skirtingų šalių rinkoms tiekiamų rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus Labill.), vytelinių eukaliptų lapų (Eucalyptus viminalis Labill.) vaistinės augalinės žaliavos fenolinių junginių ir eterinio aliejaus cheminę sudėtį ir jos įvairavimą.
Darbo uždaviniai: Nustatyti eukaliptų lapų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą; nustatyti eukaliptų lapų flavonoidų kiekybinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą; nustatyti eukaliptų lapų hidroksicinamono rūgšties darinių kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą; nustatyti eukaliptų lapų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą; nustatyti eukaliptų lapų fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, taikant ESC metodą; nustatyti eterinio aliejaus kokybinę ir kiekybinę sudėtį eukaliptų lapų ėminiuose.
Tyrimo metodai: Tyrimui atlikti buvo naudojama rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus Labill.) ir vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis Labill.) lapų vaistinė augalinė žaliava. Ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu su 30 proc. (v/v) etanoliu, ekstrakcijos laikas 20 min, stipris 75 W. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais. Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti taikyta reakcija su aliuminio chloridu, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais. Bendram hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymui atlikta reakcija su Arnow reagentu, rezultatai išreikšti chlorogeno rūgšties ekvivalentais. Antioksidacinis ekstraktų aktyvumas įvertintas taikant DPPH, ABTS ir FRAP metodus. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Dujų chromatografijos metodu įvertinta kokybinė ir kiekybinė eukaliptų lapų eterinio aliejaus sudėtis.
Tyrimo išvados: Vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis L.) mėginiuose nustatytas didžiausias kiekis fenolinių junginių (99,44 mg/g), flavonoidų (22,15 mg/g) bei hidroksicinamono rūgšties darinių (52,5 mg/g). Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinus eukaliptų lapų ekstraktus idenfikuota chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, avikularinas, astragalinas, kvercitrinas, kemferol-3-gliukuronidas ir kvercetinas. Kiekybiškai įvertinus ekstraktus nustatyta, kad
tirtuose rutulinių (Eucalyptus globulus L.) ir vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis L.) ekstraktuose dominuoja chlorogeno rūgštis (5341-14989 µg/g). Kokybinės eukaliptų lapų eterinio aliejaus analizės metu identifikuotas α-pinenas, eukaliptolis (1,8-cineolis), α-terpinilacetatas, aromadendrenas bei globulolis. Kiekybiškai ištyrus eukaliptų lapų eterinį aliejų, nustatyta, kad didžiausias 1,8-cineolio kiekis identifikuotas vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) mėginyje, kuris įsigytas Lenkijos rinkoje.
SUMMARY
The master thesis by Kotryna Kolpakova. The supervisors are dr. K. Zymonė, prof. habil. dr. V. Janulis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy, Kaunas.
The topic of the master thesis: Qualitative and quantitative analysis of eucalyptus (Eucalyptus globulus Labill., Eucalyptus viminalis Labill.) leaf phenolic compounds and essential oils.
The aim of the research: To investigate the chemical composition and variation of phenolic compounds and essential oils of eucalyptus (Eucalyptus globulus Labill., Eucalyptus viminalis Labill.) leaf raw materials from markets of different countries.
The goals: To determine the quantitative composition of phenolic compounds in eucalyptus leaf using spectrophotometric method; to investigate the amount of flavonoids in eucalyptus leaf using spectrophotometric method; to determine the amount of hydroxycinnamic acid derivatives in eucalyptus leaf samples using spectrophotometric method; to determine the antioxidant activity of eucalyptus leaf extracts; to investigate the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of eucalyptus leaf samples using the HPLC method; to determine the qualitative and quantitative composition of eucalyptus leaf essential oils.
The methods of the research: Eucalyptus leaf raw material was used in the research. Eucalyptus leaf samples were extracted with 30 % (v/v) ethanol 20 min in ultrasonic bath. Spectrophotometric method was applied for quantitative analysis of phenolic compounds, flavonoids, hydroxycinnamic acid derivatives and determination of antioxidant activity. The total content of phenolic compounds has been evaluated by Folin–Ciocalteu method. The total flavonoid content has been measured using the spectrophotometric method after the reaction with aluminium chloride. The total content of hydroxycinnamic acid derivatives has been determined using spectrophotometric method with Arnow reagent. High performance liquid chromatography (HPLC) was applied for qualitative and quantitative analysis of individual phenolic compounds composition. The antioxidant activity has been measured using the spectrophotometric method with DPPH, ABTS, FRAP reagents. Qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds has been evaluated using HPLC method. Gas chromatography method was applied to evaluate the qualitative and quantitative composition of eucalyptus leaf essential oils.
The conclusions: The highest content of phenolic compounds, flavonoids and hydroxycinnamic acid derivatives was detected in E. viminalis L. samples. Chlorogenic acid, hyperoside, isoquercitin, avicularin, astragalin, quercitin, kemferol-3-glucuronide and quercetin were
identified in eucalyptus leaf samples using HPLC method. Quantitative evaluation of the extracts showed that chlorogenic acid dominates in extracts of E. globulus L. and E. viminalis L. (5341-14989 μg/g). α-pinene, eucalyptol (1,8-cineole), α-terpinyl acetate, aromadendren and globulol were identified during the qualitative analysis of eucalyptus leaf essential oils. Quantitative analysis of eucalyptus leaf essential oils showed that the highest amount of 1,8-cineole was detected in E. viminalis L. sample, which was bought in Poland.
SANTRUMPOS
ABTS - 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas
DC-MS – dujų chromatografija-masių spektrometrija
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija (angl. HPLC)
FRAP - trivalentės geležies jonų redukcijos galia
GRE - galo rūgšties ekvivalentas
p – reikšmingumo lygmuo
R2 – regresijos koeficientas
TE - trolokso ekvivalentai (angl. Trolox equivalent)
TPTZ - 2,4,6-tripiridil-s-triazinas
ĮVADAS
Susidomėjimas vaistiniais augalais ir jų panaudojimu medicinos praktikoje sparčiai auga visame pasaulyje. Visuomenės ir mokslininkų susidomėjimas vaistinėmis žaliavomis yra susijęs su tiesioginiu gamtos ir sveikos gyvensenos ryšiu bei žaliavose kaupiamomis biologiškai aktyviomis medžiagomis. Iš vaistinių augalinių žaliavių yra gaminti preparatai, kurie iki šiol yra naudojami ligų profilaktikai, gydymui bei siekiant apsisaugoti nuo neigiamo aplinkos poveikio žmogaus sveikatai. Žaliavose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai, pavyzdžiui, riebiosios rūgštys, steroliai, flavonoidai, alkaloidai, saponinai, kurie sukelia tam tikro pobūdžio poveikį žmogaus organizmui. Dėl augaluose kaupiamų junginių įvairavimo, gaminant augalinius preparatus dažniausiai siekiama standartizuoti naudojamą žaliavą tam, kad kartojant preparato gamybos serijas būtų įmanoma kiekvieną kartą išgauti pastovų veikliųjų medžiagų kiekį [1,2].
Eukaliptų lapuose kaupiamas eterinis aliejus, fenoliniai junginiai, kurie pasižymi antioksidantiniu aktyvumu. Eukaliptų (Eucalyptus L‘Her.) genties augalų lapų ekstraktuose nustatyti fenoliniai junginiai, fenolinės rūgštys, kiekybiškai įvertinta flavonoidų sudėtis, tačiau duomenys apie galimą fenolinių junginių įvairavimą tarp skirtingų augalų rūšių nėra pakankami [3]. Įvairūs potencialūs šios žaliavos poveikiai yra tiriami dėl biologiškai aktyvių junginių įvairovės esančios eukaliptų vaistinėje augalinėje žaliavoje [4,5].
Gydymui naudojami augaliniai preparatai, kaip ir kiti vaistiniai preparatai, turi būti kokybiški, saugūs ir veiksmingi. Augalinėse žaliavose ir preparatuose esantys biologiškai aktyvūs junginiai lemia jų poveikį žmogaus organizmui. Vertinant vaistinės augalinės žaliavos kokybę, labai svarbi šių biologiškai aktyvių junginių kokybinė bei kiekybinė sudėtis, kuri gali kisti dėl įvairių aplinkos ir genetinių veiksnių. Augalinės žaliavos kokybė gali skirtis dėl tarprūšinių, žaliavos paruošimo laiko, naudojamos augalo dalies, augalinės žaliavos laikymo ir apdorojimo sąlygų skirtumų. Vaistinės augalinės žaliavos, kaupiančios eterinius aliejus, turi perspektyvą gydant įvairias ligas, tačiau skirtingose rinkose eteriniai aliejai yra išgaunami iš skirtingų rūšių bei kokybės žaliavų. Tokie augalinės žaliavos sudėties skirtumai kelia vis daugiau klausimų dėl jų saugumo, kokybės, prieinamumo ir kontrolės. Dėl šių priežasčių didėja eukaliptų lapų vaistinės augalinės žaliavos ir eterinio aliejaus fitocheminių tyrimų poreikis ir svarba [2].
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti skirtingų šalių rinkoms tiekiamų rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus Labill.,), vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis Labill.) lapų vaistinės augalinės žaliavos fenolinių junginių ir eterinio aliejaus cheminę sudėtį ir jos įvairavimą.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti eukaliptų lapų fenolinių junginių kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą.
2. Nustatyti eukaliptų lapų flavonoidų kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą.
3. Nustatyti eukaliptų lapų hidroksicinamono rūgšties darinių kiekinę sudėtį, taikant spektrofotometrinį metodą.
4. Nustatyti eukaliptų lapų fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, taikant ESC metodą.
5. Nustatyti eukaliptų lapų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Eukaliptų (Eucalyptus L‘Her.) genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai
1789 metais prancūzų botanikas L‘Heritier de Brutelle išskyrė eukaliptų (Eucalyptus L‘Her.) gentį, kurią tuo metu sudarė tik viena rūšis, E. Obliqua L‘Her. Per daugiau nei 200 metų buvo atrasta ir publikuota šimtai naujų eukaliptų rūšių [6]. Eukaliptų genčiai priklauso daugiau nei 740 rūšių, kurios yra suskirstytos į dešimt subgenčių, iš kurių šešios yra monotipinės, t. y. joms priklauso po vieną eukaliptų rūšį [7].Eucalyptus L‘Her. genties taksonominė struktūra: Skyrius – magnolijūnai (Magnoliophyta)
Klasė – magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis – erškėčiažiedžiai (Rosidae) Eilė – mirtiniečiai (Myrtales)
Šeima – mirtinių (Myrtaceae)
Gentis – eukaliptų (Eucalyptus L‘Her.)
Dauguma eukaliptų rūšių yra kilę iš Australijos žemyno, tačiau kai kurios rūšys kilusios ir iš Naujosios Gvinėjos, Indonezijos ir Filipinų [8]. Kai kurios eukaliptų rūšys yra kultivuojamos subtropinėje klimato juostoje esančiose valstybėse (Gruzijoje, Rusijoje ir Azerbaidžane) [9]. Eukaliptų medis gali išaugti iki 60-80 m aukščio, tačiau tai priklauso nuo augalo rūšies. Medžio kamienas storas, tiesus, 0,6-2 m skersmens, vainikas siauras, netaisyklingos formos, sudarytas iš didelių šakų ir lapų. Eukaliptų medžių žievė yra pilkos, rudos, žalsvos ar melsvos spalvos, šaknų sistema gili ir išplitusi. Eukaliptų lapų žaliavai būdingas stiprus, aromatingas kvapas ir aštrus, kartus skonis [10,11].
Rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus Labill.) lapai yra pilkai žalios spalvos, stori. Lapai pailgos, elipsinės ar pjautuvo formos, iki 25 cm ilgio ir 5 cm pločio. Koteliai sukti, stipriai raukšlėti, vidutiniškai 2-3 cm ilgio, tačiau gali siekti ir 5 cm. Standūs, odiški lapai yra lygūs, turi gelsvai žalios spalvos gyslas. Šoninės lapo gyslos išsidėsčiusios šalia lapo krašto tiesia linija. Lapo kraštas lygus, kartais šiek tiek raukšlėtas. Abiejose lapo pusėse būdingos netaisyklingai pasiskirsčiusios tamsiai rudos dėmės. Apšvietus lapą matomos mažos aliejinės liaukos [12].
Vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis Labill.) žievė yra pilkai rudos spalvos, šiurkšti, su giliomis vagomis, šakos šviesiai rudos spalvos su matomu juostelių pavidalo marginimu. Jauni lapai lancetiški, priešiniai, buki, mėlynai žalios spalvos, 4-8 cm ilgio, 0,6-1,2 cm pločio. Vidutinio amžiaus medžio lapai lancetiški, platesni už jaunus lapus, šviesiai žalios spalvos su trumpu koteliu. Subrendusio augalo lapai taip pat lancetiški, koteliu pritvirtinti prie šakelės, ploni (0,15-0,24 mm storio), tinkliški, buki, 8-15 cm ilgio, 1,2-2,3 cm pločio, kotelis 0,8-1,8 cm ilgio. Žiemą lapams
būdinga mėlynai žalia spalva, o vasarą – šviesiai žalia. Žiedynai paprasti, susiję su lapais, juos sudaro 3-7 žiedai. Žiedynas kotuotas, plonas, šiek tiek kampuotas, 7-11 mm ilgio. Pumpurai kiaušiniškos formos, turi trumpą kotelį, randuoti, 6-9 cm ilgio, 3-4 mm pločio, pumpurų koteliai 2-4 mm ilgio. Vaisiai kiaušiniškos ar sferiškos formos, turi trumpą kotelį. Vaisių ilgis 4-6 mm, plotis 4-6 mm. Subrendusios sėklos yra juodos spalvos, netaisyklingai kiaušiniškos formos, dantytos, smailėjančios į vieną sėklos galą [13].
Eukaliptai yra atsparūs sausroms, greitai auga, todėl kultivuojami atogrąžų regione [14]. Eukaliptų lapų morfologiniams požymiams įtakos turi klimatinės sąlygos. Eukaliptai, augantys sausesnėse vietovėse, pasižymi storesniais lapais ir didesniu eterinių aliejų liaukų tankiu [8].
2.2. Eukaliptų lapų fitocheminės sudėties tyrimai
Eukaliptai plačiai aprašyti dėl jų lapuose kaupiamų eterinių aliejų [9]. Eukaliptų lapuose nustatyti fenoliniai junginiai, steroliai, terpenoidai, saponinai, taninai, alkaloidai bei flavonoidai [15,16].
Įvairių rūšių eukaliptų eteriniai aliejai skiriasi chemine sudėtimi ir juose vyraujančiais komponentais. Eukaliptai, kurių eteriniame aliejuje vyrauja cineolis, priskiriami cineoliniams: rutulinis eukaliptas (E. globulus Labill.), gausiašakis eukaliptas (E. polybractea F.Muell. ex R.T.Baker), slėninis eukaliptas (E. Smithii F.Muell. ex R.T.Baker). Eukaliptai, kurių eterinio aliejaus sudėtyje vyrauja felandrenas, priskiriamis felandreniniams: spindulinis eukaliptas (E. australiana R.T.Baker & H.G.Sm). Kitų rūšių eukaliptų eteriniuose aliejuose vyrauja piperitonas, geranilacetatas, limonencitralis bei citralis [9].
Iš skirtingų rūšių eukaliptų lapų augalinės žaliavos gaunami eteriniai aliejai, kurių sudėtis tarpusavyje skiriasi. Eukaliptų eterinio aliejaus kokybę reglamentuoja Europos farmakopėja. Šiame normatyviniame dokumente nurodoma, kad eukaliptų lapų eterinis aliejus atitinka jam keliamus kokybės reikalavimus, jei 1,8-cineolio yra ne mažiau nei 70,0 proc., α-pineno 0,05-10,0 proc., sabineno ne daugiau nei 0,3 proc., α-felandreno 0,05-1,5 proc., limoneno 0,05-15,0 proc., o kamparo ne daugiau nei 0,1 proc. [12].
Buvo tirtas iš eukaliptų žiedų gautas eterinis aliejus. Lapų ir žiedų eterinių aliejų cheminė sudėtis skirtinga. Žiedų eteriniame aliejuje vyrauja monoterpenai (apie 60 proc.), seskviterpenai (apie 28 proc.), nustatyti poliketidai, riebiosios rūgštys, alkanai, amidai, aromatiniai junginiai. Tuo tarpu eukaliptų lapų eterinių aliejų sudėtyje vyrauja seskviterpenai (apie 48 proc.), monoterpenai (apie 47 proc.). Poliketidai, riebiosios rūgštys, diterpenai, alkanai ir aromatiniai junginiai nustatyti mažais kiekiais (≤5 proc.) [17].
Žiedų eteriniuose aliejuose vyrauja α-felandrenas, aromadendrenas, α-pinenas, globulolis, β-pinenas, O-cimenas ir 9-oktadecenamidas [17]. Lapų eteriniame aliejuje nustatomas 1,8-cineolis, trans-pinokarveolis, ledenas ir P-cimenas [4,18–20].
1,8-cineolis yra pagrindinis eukaliptų lapų eterinių aliejų komponentas, jo kiekis skirtingose rūšyse gali varijuoti tarp 70-85 proc., 48,6 proc., 54-61 proc. ir 54-95 proc. Tyrimais įrodyta, kad jaunų eukaliptų medžių lapai kaupia didesnį kiekį eterinio aliejaus, nei senų medžių lapai, tačiau senų medžių lapai kaupia daugiau 1,8-cineolio [21]. Eterinio aliejaus ir 1,8-cineolio kiekis yra svarbus vertinant eukaliptų eterinio aliejaus kokybę [9,12].
Euglobalis III Makrokarpalis am-1 Sideroksinalis C
1 pav. Terpenoidinių fenolaldehidų klasės junginiai [9].
1980 metais eukaliptų lapuose buvo identifikuota nauja gamtinių junginių klasė – terpenoidiniai fenolaldehidai. Šie junginiai yra būdingi eukaliptams, kadangi kituose augaluose jie nėra aptinkami. Šiai junginių klasei šiuo metu priklauso apie 50 junginių, kurie yra skirstomi į 3 pogrupius: euglobalius, makrokarpalius ir sideroksinalius. Euglobalių struktūrai yra būdingas chromano fragmentas. Sideroksinalių pogrupio junginiuose terpeno fragmentas yra pakeistas fenolaldehidiniu ciklu, o makrokarpaliai priskiriami seskviterpenams. (1 pav.) [9].
Fenoliniai junginiai - vieni iš labiausiai paplitusių augalų metabolitų. Pagrindinis fenolinių junginių struktūros bruožas yra aromatinis žiedas, turintis vieną ar keletą hidroksilo grupių [22]. Augalų fenoliniai junginiai yra įprastai skirstomi į monomerinius, dimerinius ir polimerinius [23]. Fenoliniai junginiai plačiai paplitę vaisiuose, daržovėse ir vaistinėse augalinėse žaliavose [22,24]. Fenoliniai junginiai yra svarbūs augalo vystymuisi bei dauginimuisi, apsaugo nuo žolėdžių, patogeninių organizmų ir kenkėjų, privilioja augalus apdulkinančius vabzdžius. Fenoliniai junginiai sugeria UV spindulius, mažina oksidacinį stresą ir slopina netoliese augančių konkurencinių augalų vystymąsi [25]. Šie junginiai dalyvauja organizmo fiziologiniuose procesuose. [22]. Fenoliniai junginiai pasižymi įvairiu farmakologiniu poveikiu ir yra naudojami vaistinių preparatų gamyboje [26].
2 pav. Eukaliptų lapų kaupiami fenoliniai junginiai [23].
Eukaliptų lapai dėl juose kaupiamų fenolinių junginių pasižymi antioksidantiniu, priešuždegiminiu, priešvėžiniu aktyvumu bei turi teigiamą poveikį esant nutukimui ar sergant diabetu [26–29]. Eukaliptų lapų fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas yra pagrįstas jų gebėjimu surišti laisvuosius radikalus ir perduoti elektronus [26]. Eukaliptų lapuose dažniausiai identifikuojama chlorogeno rūgštis, kvercetinas, hiperozidas bei rutinas (2 pav).
Apibendrinant, galima teigti, kad eukaliptai kaupia fenolinius junginius, sterolius, terpenoidus, saponinus, taninus, alkaloidus, flavonoidus, terpenoidinius fenolaldehidus ir kitas biologiškai aktyvias medžiagas. 1,8-cineolis vyrauja eukaliptų lapų eterinio aliejaus sudėtyje. Skirtingų rūšių eukaliptų žaliavoje biologiškai aktyvių junginių kiekiai skiriasi.
2.3. Eukaliptų lapų preparatų panaudojimas medicinoje ir biologinio poveikio
tyrimai
Europos vaistų agentūros (EMA) duomenimis eukaliptų lapų žaliava pasižymi antimikrobiniu, priešgrybeliniu, antivirusiniu, priešuždegiminiu, analgetiniu, antinociceptiniu, antioksidantiniu, antidiabetiniu, repelentiniu poveikiu, daro įtaka kvėpavimo takų sekreto išsiskyrimui ir pasižymi kitais žmogaus organizmui naudingais poveikiais [21].
Tyrimų metu nustatyta, kad eukaliptų lapų eterinis aliejus slopina gram-neigiamų, Enterococcus faecelis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella spp., bakterijų padermes ir gram-teigiamų bakterijų padermes, Staphylococcus aureus,
Chlorogeno rūgštis Kvercetinas
Streptococcus pyogenes [30–32]. Eukaliptų lapų ekstraktai slopina Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Saccharomyces cerevisiae, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Listeria monocytogenes bakterijų padermes [33–35].
Tyrimų metu patvirtintas ir priešgrybelinis eukaliptų lapų eterinio aliejaus poveikis. Nustatyta, jog šio augalo eteriniai aliejai slopina Candida albicans, Microsporum canis, Trichophyton ir Aspergillus rūšių grybelių dauginimąsi [18,30,32,36]. Eukaliptų eteriniai aliejai gali būti efektyvūs sergant virusų sukeltomis ligomis, kadangi pasižymi stipriu antivirusiniu poveikiu ir slopina 1 tipo Herpes simplex virusų dauginimąsi bei trumpina jų gyvavimo trukmę [37].
Eukaliptų lapų eterinis aliejus ne tik slopina uždegiminius procesus, bet ir mažina skausmą [3,38,39]. Ikiklinikinių tyrimų metu nustatyta, kad eukaliptų eteriniame aliejuje esantis 1,8-cineolis ir β-pinenas efektyviai mažina jautrumą skausmui [40].
Eukaliptų lapai pasižymi antioksidantiniu poveikiu. Mokslinių tyrimų duomenimis antioksidantiniu aktyvumu pasižymi ne tik eukaliptų lapų ekstraktai ir lapų eteriniai aliejai, bet ir žiedų eteriniai aliejai [3,4,34,41–43].
Atliktų mokslinių tyrimų duomenimis teigiama, kad eukaliptų lapų ekstraktai pasižymi antidiabetiniu, antihiperglikeminiu poveikiu. Tyrimai yra atlikti tik su ląstelių linijomis ir gyvūnais, tačiau dėl teigiamo aktyvumo manoma, jog eukaliptų lapų ekstraktai galėtų būti efektyvūs antihiperglikeminių maisto papildų sudėtyje bei galėtų būti potencialus veikliosios medžiagos šaltinis atrandant ir kuriant naujus per os vartojamus vaistus skirtus diabetui gydyti [5,44,45].
Eukaliptų eterinis aliejus taip pat pasižymi relepentiniu poveikiu prieš graužikus. Atlikus tyrimus su juodosiomis žiurkėmis (Rattus rattus) nustatyta, jog kasdien naudojamas 5 proc. ir 10 proc. eukaliptų eterinį aliejus atbaidė graužikus. Tyrimo rezultatais atskleistas repelentinis šio eterinio aliejaus potencialas gali lemti tolimesnius tyrimus kuriant natūralios kilmės prailginto atpalaidavimo repelentus su eukaliptų eteriniu aliejumi. Manoma, jog šis poveikis yra dėl eukaliptų eteriniame aliejuje kaupiamo 1,8-cineolio, kuris pasižymi pesticidinėmis savybėmis [46].
Eukaliptų eterinis aliejus dažniausiai įeina į įvairių farmacinių formų kompleksinių preparatų, tepalų, čiulpiamų tablečių, nosies lašų, skrandyje atsparių kapsulių, sudėtį. Tepalų sudėtyje eukaliptų eterinis aliejus naudojamas kartu su pipirmėčių, kadagių, pankolių aliejais, metilsalicilatu, mentoliu, levomentoliu ar kamparo aliejumi. Čiulpiamose tabletėse be eukaliptų eterinio aliejaus taip pat naudojamas benzalkonio chloridas, levomentolis, timolis ar pipirmėčių aliejus. Nosies lašuose eukaliptų eterinis aliejus derinamas su α-tokoferolio acetatu, timoliu, guaiazulenu, pušų ir pipirmėčių aliejais. Tuo tarpu gaminant skrandyje neirias kapsules be eukaliptų aliejaus naudojami tikrojo citrinmedžio ar apelsininio citrinmedžio eteriniai aliejai [21].
Skirtingų šalių rinkose produktų, kurių sudėtyje yra eukaliptų ekstraktai ar eterinis aliejus, kiekiai yra labai skirtingi, kadangi kai kurios šalys turi tik kombinuotus preparatus, o kitos šalys rinkoje neturi produktų su šiuo eteriniu aliejumi arba ekstraktais. Tačiau vienintelė išimtis yra Vokietija ir Rusija, kuriose preparatai pagaminti iš eukaliptų vaistinės žaliavos turi gerai žinomas terapines indikacijas. Vokietijoje naudojami tepalai, minkštos kapsulės su eukaliptų eteriniu aliejumi bei grynas eterinis aliejus. Šie produktai skirti lėtiniui viršutinių kvėpavimo takų uždegimui, peršalimo simptomams gydyti bei reumatinių skausmų mažinimui [21]. Tuo tarpu Rusijoje yra net 4 vaistiniai preparatai („Eucalimin“, „Chlorophyllipt“, „Galenofillipt“, „Chlorophylline-OZ“), kurių veikliosios medžiagos yra išgaunamos iš eukaliptų lapų vaistinės augalinės žaliavos. Preparatas „Eucalimin“ pasižymi antiseptinėmis ir dezinfekuojančiomis sąvybėmis. „Chlorophyllipt“ ir „Chlorophylline-OZ“ pasižymi priešmikrobiniu poveikiu, o vaistinis preparatas „Galenofillipt“ – priešuždegiminiu, baktericidiniu, antivirusiniu, fungicidiniu poveikiu [9].
Didėjant vaistinių augalų vartojimui daugėja ir pranešimų apie nepageidaujamas reakcijas. Vaistiniuose augaluose yra gausu farmakologiškai aktyvių medžiagų, kurių poveikis dažnai priklauso nuo vartojamos dozės, todėl negalima teigti, jog vaistinės augalinės žaliavos ar augaliniai vaistai yra visiškai saugūs [47].
Užsienio literatūroje teigiama, kad eukaliptų lapai, ekstraktai bei eteriniai aliejai yra gana saugūs vartoti, tačiau yra dokumentuota atvejų, kuomet vartojant šiuos preparatus pasireiškė nepageigaujamas poveikis. Teigiama, kad eukaliptų preparatus yra saugu vartoti iki 12 savaičių, tačiau ilgai išoriškai vartojant neskiestą eterinį aliejų jis gali sukelti neurotoksiškumą. Vartojant šio augalo eterinį aliejų per os gali ištikti mirtis (išgėrus 3,5 ml neskiesto eterinio aliejaus). Dėl per mažo tyrimų su nėščiosiomis ir žindančiomis kiekio negalima teigti, kad eukaliptų lapų eterinis aliejus yra saugus vartoti šiuo periodu [48].
Didžiausia tikimybė apsinuodyti eteriniu aliejumi yra vaikams, kadangi išgėrus nedidelį kiekį pasireiškia toksinis poveikis [47,49]. Dažniausiai vaistiniai augaliniai preparatai sukelia kepenų ar inkstų sutrikimus arba pažeidimus. Dažnai sunku nustatyti nepageidaujamos reakcijos sukelėją, kadangi tradicinių augalinių preparatų sudėtyje yra daugiau nei viena vaistinė augalinė žaliava [47].
Pastebėta, kad eukaliptų vaistinė augalinė žaliava ir iš jos pagaminti preparatai gali sąveikauti su vaistais. Preliminariais duomenimis eukaliptolis gali mažinti aminopirino ir amfetaminų kiekį kraujyje, taip sumažindamas šių medžiagų poveikį žmogaus organizmui. Kadangi eukaliptų lapai pasižymi hipoglikeminiu aktyvumu, jie gali sąveikauti su antidiabetiniais vaistais, sukeldami suminį poveikį. Teoriškai inhaliuojant eukaliptolį jis gali sumažinti pentobarbitalio patekimą į smegenis ir taip sumažinti vaisto efektyvumą. Pastebėta, jog eukaliptų eterinis aliejus gali inhibuoti citochromo P450 fermentą, tačiau toks poveikis žmonėms dar nebuvo dokumentuotas [48].
2.4. Antioksidantintinio aktyvumo nustatymo metodai
Didėjant skaičiui žmonių, kurie serga lėtinėmis ligomis siejamomis su oksidacinio streso daroma žala, domėjimasis antioksidantų poveikiu ženkliai auga [50]. Dėl šios priežasties poreikis tirti vaistinių augalinių žaliavų antioksidantinį aktyvumą nuolat didėja.
Antioksidantinio aktyvumo tyrimai atliekami in vitro bei in vivo sąlygomis. Šiems tyrimams atlikti taikomi įvairūs metodai, kurie yra pagrįsti skirtingais veikimo mechanizmais, pagal tai kokiu principu augaliniai antioksidantai inaktyvuoja oksidantą: vandenilio atomo perdavimo reakcijomis ar elektronų perdavimo reakcijomis [51]. Vieni iš dažniausiai naudojamų antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų yra FRAP, DPPH ir ABTS [52]. FRAP metodas yra pagrįstas geležies jonų redukcijos antioksidantine galia, DPPH – elektronų perdavimu, o ABTS – radikalų-katijonų surišimu [51].
DPPH – iš violetinės į geltoną spalvą keičiantis radikalas, spalva kinta dėl antioksidanto redukcinio gebėjimo kuomet susidaro stabilus DPPH radikalas [51]. Atliekant antioksidantinio aktyvumo nustatymą šiuo metodu, dėl antiradikalinio aktyvumo, violetinės spalvos DPPH radikalai yra redukuojami į šviesiai geltonos spalvos hidraziną. Antioksidantų redukcinė galia yra įvertinama pagal elektronų sukimo rezonansą arba matuojant absorbcijos sumažėjimą ties 515-528 nm iki pastovios absorbcijos. Šis metodas yra paprastas, greitas ir jam atlikti reikalingas tik UV-Vis spektrofotometras. Tačiau jis taip pat turi trūkumų, kadangi DPPH tirpsta tik organiniuose tirpikliuose, visiškai netirpsta vandenyje. Dėl šių sąvybių metodas yra nepalankus hidrofilinių antioksidantų antiradikalinio aktyvumo vertinimui [53].
FRAP metodas pagrįstas antioksidantų gebėjimu redukuoti geltoną geležies tripiridiltiazino kompleksą (Fe(III)-TPTZ) į mėlyną geležies kompleksą (Fe(II)-TPTZ). Šis spalvos pokytis vyksta dėl antioksidanto elektronų perdavimo. Antioksidanto redukcinis aktyvumas yra matuojamas spektrofotometriškai esant 593 nm bangos ilgiui. Šį metodą patogu naudoti, kadangi jis yra paprastas, greitas, nebrangus ir nereikalauja specializuotų aparatų. Tačiau FRAP metode gaunama dvivalentė geležis yra prooksidantė. Dėl šios priežasties antioksidantai gali redukuoti prooksidantą ir neredukuoti trivalentės geležies [53].
ABTS – tai peroksidazės substratas, kuris oksiduojant peroksilo radikalais ar kitais oksidantais virsta į ABTS radikalą-katijoną (ABTS.+). Šis radikalas-katijonas yra stabilus, intensyvios spalvos, įvertinamas spektrofotometriškai esant 600-750 nm bangos ilgiui. Antiradikalinis aktyvumas yra vertinamas pagal antioksidanto gebėjimą mažinti spalvos intensyvumą tiesiogiai reaguojant su ABTS.+ radikalu ir yra išreiškiamas trolokso ekvivalentais. Šiuo metodu galima tirti tiek hidrofilinės,
tiek lipofilinės kilmės medžiagas, kadangi ABTS.+
radikalas-katijonas yra tirpus organiniuose ir vandeniniuose tirpikliuose. Šis metodas yra paprastas, todėl naudojamas daugelyje laboratorijų. Vandeninių tirpalų maksimalią absorbciją galima įvertinti esant 414 nm, 752 nm, 842 nm bangos ilgiui, tuo tarpu etanolinių tirpalų – esant 414 nm, 730 nm, 873 nm bangos ilgiui. Tačiau šis metodas turi ir trūkumų. ABTS radikalas nėra aptinkamas biologinėse sistemose ir nėra panašus į šiose sistemose esančius radikalus, todėl šiuo metodu negalima vertinti biologinių molekulių [53].
2.5. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Eukaliptų (Eucalyptus L‘Her.) genties augalų vaistinių žaliavų preparatai pasižymi įvairiomis gydomosiomis savybėmis dėl juose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių. Iš eukaliptų lapų žaliavos pagaminti preparatai pasižymi antimikrobiniu, priešgrybeliniu, antivirusiniu, priešuždegiminiu, analgetiniu, antioksidantiniu, antidiabetiniu, repelentiniu poveikiu, daro įtaka kvėpavimo takų sekreto išsiskyrimui. Antioksidantinį poveikį lemia eukaliptų lapuose kaupiami fenoliniai junginiai. Šios žaliavos antioksidantinis poveikis nėra plačiai aprašytas, todėl eukaliptų augalinė žaliava vis dažniau tampa įvairių tyrimų objektu.
Apibendrinant, galima teigti, jog skirtingų vietovių ir rūšių eukaliptų vaistinės augalinės žaliavos skiriasi fitochemine sudėtimi, todėl gali būti nustatomi fenolinių junginių kiekybiniai skirtumai. Esant šiems skirtumams gali pasireikšti antioksidantinio žaliavos poveikio susilpnėjimas ar sustiprėjimas, dėl ko žaliava gali būti netinkama vartoti.
Skirtingų šalių rinkoms yra tiekiamos įvairios kilmės eukaliptų lapų vaistinės augalinės žaliavos. Nėra žinomos augimo sąlygos, augalo amžius, žaliavos surinkimo laikas bei paruošimo metodai, todėl svarbu tirti skirtingose šalyse parduodamos eukaliptų lapų augalinės žaliavos cheminės sudėties įvairavimą.
3. TYRIMO METODIKA
3.1. Tyrimų objektas
Tyrimų objektas yra rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus Labill.) ir vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis Labill.) lapų vaistinė augalinė žaliava. Žaliava tyrimui įsigyta 2016 metais 6 Europos šalyse (Norvegijoje, Lietuvoje, Rusijoje, Baltarusijoje, Ispanijoje, Lenkijoje).
3.2. Naudotos medžiagos ir reagentai
Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai. Išgrynintas vanduo (Ph. Eur. 01/2009:0008), Folin-Ciocalteu reagentas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), natrio karbonatas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96 proc. (AB „Vilniaus degtinė”, Lietuva), galo rūgštis („Sigma – Aldrich“, Vokietija), acto rūgštis („Lach-ner“, Čekija), aliuminio chloridas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), urotropinas („Lachema“, Čekija), rutino trihidratas („ROTH“, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis („Sigma – Aldrich“, Vokietija), natrio molibdatas („Alfa Aesar“, Vokietija), natrio nitritas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), natrio hidroksidas („POCh“, Lenkija), chlorogeno rūgštis („Sigma – Aldrich Chemie“, Šveicarija), natrio acetatas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), TPTZ („Sigma – Aldrich“, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas („Alfa Aesar“, Vokietija), troloksas („Sigma – Aldrich“, Vokietija), ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas) („Alfa Aesar“, Vokietija), kalio persulfatas („Alfa Aesar“, Vokietija), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas) („Sigma – Aldrich“, Vokietija).
3.3. Naudota aparatūra
Svarstyklės (Sartorius Lab Instruments GmbH &Co. KG, 37070 Goettingen, Germany). Elektrinė smulkintuvė – IKA (Vokietija). Ultragarso vonelė – Ekmasonic P 120 H (Vokietija). Sijoklis Retsch (Vokietija). Centrifūga – ThermoFisher scientific „Biofuge stratos“ (Vokietija). Spektrofotometras – Spectronic Compec M550 (Vokietija), efektyvioji skysčių chromatografija atlikta naudojant sistemą Waters e2695 Alliance („Waters“, Milfordas, MA, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998. Skirstymui atlikti naudota ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) kolonėlė (150 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 3 μm) su ACE C18 („ACT“, Didžioji Britanija) prieškolone (dalelių dydis 3 μm). Kokybinis eterinio aliejaus tyrimas atliktas naudojant Shimadzu GCMS-QP2010nc Ultra system (Shimadzu, Duisburgas,Vokietija) dujų chromatografą su masių spektrometrijos detektoriumi.
Kiekybinei eukaliptų lapų eterinio aliejaus analizei atlikti naudotas Shimadzu (SHIMADZU GC-2010 PLUS, Japonija) dujų chromatografas. Naudota Rxi – 5MS kolonėlė, kurios ilgis 30 m,
vidinis diametras 0,25 mm, nejudančios fazės storis 0,25 µm. Injekuojama 1 µl, injektoriaus temperatūra 290 o
C, liepsnos jonizacijos detektoriaus temperatūra (angl. FID) 330 oC. Analizei naudotos helio dujos.
3.4. Eukaliptų lapų ekstraktų paruošimas
Pasveriama 0,1 g (tiksli masė) smulkintos eukaliptų lapų augalinės žaliavos, užpilama 10 ml 30 proc. (v/v) etanolio ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 20 min. stikliniuose buteliukuose. Ultragarso stipris – 75 W. Gautas ekstraktas centrifūguojamas 4 min. Prieš atliekant ESC analizę ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų dydžio membraninius filtrus.
3.5. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu metodu
Bendras fenolinių junginių kiekis eukaliptų lapų ekstraktuose nustatytas Folin-Ciocalteu metodu.
400 μl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 2700 μl darbinio Folin-Ciocalteu reagento (motininis Folin-Ciocalteu tirpalas skiestas distiliuotu vandeniu 10 kartų) ir 2200 μl 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo. Gerai sumaišytas mėginys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Palyginamasis tirpalas ruošiamas 400 μl 30 proc. V/V etanolio sumaišant su 2700 μl darbinio Folin-Ciocalteu reagento ir 2200 μl 7,5 proc. Na2CO3. Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 765 nm bangos ilgiui.
Bendras fenolinių junginių kiekis eukaliptų augalinėje žaliavoje išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais gramui sausos žaliavos (mg/g), naudojantis galo rūgšties kalibracinės kreivės tiesine regresijos lygtimi (y = 0,1245x - 0,0034, R2=0,9992, p<0,05).
Apskaičiuojama pagal formulę:
𝐺𝐴𝐸 =𝑐 ∙ 𝑉 ∙ 𝑎
𝑚 ; mg/g
c - galo rūgšties koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V - pagaminto ekstrakto tūris (ml);
a - skiedimo faktorius;
3.6. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras flavonoidų kiekis eukaliptų ekstraktuose buvo nustatomas naudojant aliuminio chlorido reagentą.
Į 5 ml matavimo kolbutę pilama 200 μl augalinės žaliavos ekstrakto, 2000 μl 96 proc. V/V etanolio, 100 μl 30 proc. acto rūgšties tirpalo ir 300 μl 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Mišinys laikomas tamsoje 30 minučių. Pilama 400 μl 5 proc. urotropino tirpalo ir skiedžiama vandeniu iki 5 ml. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat kaip ir tiriamasis mėginys, tačiau nepilamas aliuminio chloridas ir urotropinas, vandeniu skiedžiama iki 5 ml. Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 407 nm bangos ilgiui.
Bendras flavonoidų kiekis eukaliptų augalinėje žaliavoje išreikštas rutino ekvivalentais gramui absoliučiai sausos žaliavos (mg/g), pagal rutino kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtį (y = 1,1797x - 0,008, R2=0,9992, p<0,05).
Apskaičiuojama pagal formulę:
𝐶 =𝑐 ∙ 𝑉 ∙ 𝑎
𝑚 ; mg/g
c - rutino koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V - pagaminto ektrakto tūris (ml);
a - skiedimo faktorius;
m - tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).
3.7. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis eukaliptų augalinėse žaliavose buvo nustatomas naudojant farmakopėjinį metodą su Arnow reagentu.
Kiekvieno tiriamojo ekstrakto analizei paruošiami 2 mėginiai – tiriamasis ir palyginamasis. Tiriamasis mėginys ruošiamas į 1 ml tiriamojo ekstrakto pridedant 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml Arnow reagento (mišinys sudarytas iš 10 proc. natrio molibdato tirpalo ir 10 proc. pr. natrio nitrito tirpalo santykiu 1:1), 2 ml praskiesto natrio hidroksido tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 1 ml tiriamojo ekstrakto pridedant 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml praskiesto natrio šarmo tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml.
Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 525 nm bangos ilgiui. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis išreikštas
chlorogeno rūgšties ekvivalentais gramui sausos medžiagos (mg/g), pagal chlorogeno rūgšties tiesinės regresijos lygtį (y=0,5636x+0,017, R2=0,9978, p<0,05).
Apskaičiuota pagal formulę:
𝐶 =𝑐 ∙ 𝑉 ∙ 𝑎
𝑚 ; mg/g
c – chlorogeno rūgšties koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V - pagaminto ekstrakto tūris (ml);
a - skiedimas;
m - tikslus atsvertos augalinės žaliavos kiekis (g).
3.8. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas FRAP metodu
Spektrofotometrinis FRAP metodas naudojamas nustatyti eukaliptų lapų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą. FRAP reagentas ruošiamas santykiu 10:1:1, iš 300 mM natrio acetato (CH3COONa) buferinio tirpalo, 10 mM TPTZ tirpalo 40 mM druskos rūgštyje ir 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo.
Atmatuojama 10 μl tiriamojo ekstrakto, pridedama 3 ml FRAP reagento, sumaišoma. Paruošiamas palyginamasis mėginys. Atmatuojama 3 ml FRAP reagento, pridedama 10 μl distiliuoto vandens, sumaišoma. Paruošti mėginiai 1 valandą laikomi kambario temperatūroje, tamsoje. Šviesos absorbcija matuojama prie 593 nm bangos ilgio.
Antioksidantinis aktyvumas eukaliptų lapuose nustatomas pagal trolokso kalibracinę regresijos lygtį (y=1,6694x-0,0137, R2
=09984, p<0,05), išreiškiant mg TE/g.
Antioksidantinis aktyvumas eukaliptų lapuose apskaičiuojamas pagal formulę: 𝑥 =𝑐 ∙ 𝑉
𝑚 c - antioksidantinis aktyvumas (mg TE/ml);
V - ekstrahento, naudoto ekstrakto gamybai, tūris (ml); m - tikslus atsvertas sausos žaliavos kiekis (g).
3.9. Antioksidantinio aktyvumo tyrimas ABTS metodu
Spektrofotometrinis ABTS metodas naudojamas nustatyti eukaliptų lapų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Motininio ABTS gamyba: 2 mM ABTS ištirpinama 50 ml distiliuoto vandens. Pridedama 0,7 mM kalio persulfato tirpalo, laikyti 16-17 valandų, kambario temperatūroje, tamsoje, kol ABTS
suoksiduojamas kalio persulfato. Motininis ABTS tirpalas, laikant kambario temperatūroje, apsaugojus nuo šviesos, gali išlikti stabilus ilgiau nei dvi paras.
Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas motininį tirpalą skiedžiant distiliuotu vandeniu, kol šviesos absorbcija, matuojant prie 734 nm bangos ilgio, tampa 0,8±0,005 absorbcijos vienetų.
Tiriamasis tirpalas gaminamas atmatuojant 10 μl tiriamojo ekstrakto, pridedant 3 ml darbinio ABTS tirpalo. Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo. Pagaminti tirpalai 1 valandą laikomi kambario temperatūroje, tamsoje. Šviesos absorbcija matuojama prie 734 nm bangos ilgio.
Antioksidantinis eukaliptų lapų aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracinę regresijos lygtį (y=-2,1345x+1,6172, R2
=0,9957, p<0,05), išreiškiamas mg TE/g.
Antioksidantinis aktyvumas eukaliptų lapuose apskaičiuojamas pagal formulę: 𝑥 =𝑐 ∙ 𝑉
𝑚 c - antioksidantinis aktyvumas (mg TE/ml);
V - ekstrahento, naudoto ekstrakto gamybai, tūris (ml); m - tikslus atsvertas sausos žaliavos kiekis (g).
3.10. Antioksidantinio aktyvumo tyriams DPPH metodu
Darbinis DPPH tirpalas gaminamas 60 μM DPPH tirpalo skiedžiant 96 proc. etanoliu (V/V), kol matuojant šviesos absorbciją prie 515 nm bangos ilgio, nustatomi 0,8±0,005 absorbcijos vienetai. Tiriamajam tirpalui pagaminti atmatuojama 10 μl tiriamojo ekstrakto, sumaišoma su 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Kaip palyginamasis mėginys naudojamas 96 proc. etanolis (V/V). Tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas matuojamas po 30 minučių, prie 515 nm bangos ilgio.
Antioksidantinis aktyvumas nustatomas pagal trolokso kalibracinę lygtį (y=-3,0925x+2,4431, R2=0,999, p<0,05) ir išreiškiamas mg TE/g.
Sausos tiriamosios žaliavos antioksidantinis aktyvumas apskaičiuojamas pagal formulę: 𝑥 =𝑐 ∙ 𝑉
𝑚 c - antioksidantinis aktyvumas (mg TE/ml);
V - ekstrahento, naudoto ekstrakto gamybai, tūris (ml); m - tikslus atsvertas sausos žaliavos kiekis (g).
3.11. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimas efektyviosios
skysčių chromatografijos metodu
Judriąją fazę sudarė du eliuntai (A ir B). Eliuentas A - 0,05 proc. trilfluoracto rūgštis, eliuentas B – acetonitrilas. Gradiento kitimas – 0 – 5 min. 12 proc. B, 5–50 min. – 12–30 proc. B, 50–
51 min. – 30–90 proc. B, 51–56 min. 90 proc. B, 57 min. 12 proc. B. Eliuentų tėkmės greitis – 0,5 ml/min., injekcijos tūris – 10 µl. Temperatūra palaikyta 25 °C. Chromatografinės smailės identifikuotos pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką bei lyginant analičių ir etaloninių junginių UV spektrus. Kiekinis analičių įvertinimas buvo atliktas remiantis analitės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos tiriamajame tirpale. Tirtų fenolinių junginių kiekiai skaičiuoti bangos ilgiui esant 350 nm, chlorogeno rūgšties kiekis apskaičiuotas esant 325 nm bangos ilgiui.
3.12. Eukaliptų lapų eterinio aliejaus paruošimas
Pasveriama 10,0 g eukaliptų lapų žaliavos (tiksli masė), tiksli masė susmulkinama, suberiama į apvaliadugnę kolbą ir užpilama 100 ml išgryninto vandens. Distiliuojama 45 minutes. Gauta vandeninė fazė nupilama, o aliejinė – skiedžiama 1 ml heksano. Eterinio aliejaus – heksano mišinys supilamas į chromatografinį buteliuką.
3.13. Eukaliptų lapų eterinio aliejaus komponentų kokybinis nustatymas dujų
chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) metodu
Eukaliptų lapų eterinio aliejaus tapatybė tirta dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu. Eterinio aliejaus išskirstymui naudota kapiliarinė kolonėlė („Restek“ Rxi-5ms, 30 m ilgio, 0,25 mm išorinio diametro ir 0,25 µm vidinio diametro) su skysta nejudančia faze (5 proc. difenilo ir 95 proc. polisiloksano). Dujos nešiklės – helis, į dujų chromatografą buvo injekuojama po 1 µl ekstrakto. Naudotas visą dujų tūrį įleidžiantis į kolonėlę (angl. splitless) būdas. Injektoriaus temperatūra - 280,0 °C. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas pateiktas 1 lentelėje.
1 lentelė. Gradientinis temperatūros kitimas.
Temperatūros kėlimo greitis
(°C/min) Temperatūra (°C) Užlaikymo laikas (min)
- 50,0 2,00
20,00 280,0 2,00
30,00 310,0 4,
Nustačius pasirinktus dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodikos parametrus, injekuotas eukaliptų lapų eterinis aliejus. Sudarytos eukaliptų lapų eterinių aliejų DC-MS chromatogramos, kuriose fiksuotas smailių sulaikymo laikas. Medžiagos identifikuotos pagal joms būdingą sulaikymo laiką.
3.14. Eukaliptų lapų eterinio aliejaus komponentų kiekybinis nustatymas dujų
chromatografijos metodu
Eukaliptų lapų eterinio aliejaus kiekybinis nustatymas atliktas taikant dujų chromatografijos metodą. Tyrimui atlikti naudoja chromatografinė kolonėlė („Restek“ Rxi-5ms), kolonėlės ilgis – 30 m ilgio, kolonėlės diametras 0,25 m, nejudančios fazės storis 0,25 µm, injekcijos temperatūra 290 o
C, kolonėlės temperatūra 80 oC. Injekcijos režimas Split 1:20, eliuentai: 1 – metanolis, 2 – chloroformas. Eliuentų santykis 1 – 90 proc., 2 – 10 proc., tėkmės greitis 1,2 ml/min, injekcijos tūris 1 µl. Pradinė kolonėlės temperatūra keliama palaipsniui: nuo 80o
C iki 250oC 10oC/min, nuo 250oC iki 310oC 30oC/min ir palaikoma 7 min. Bendras vieno bandinio analizės laikas 20 min.
3.15. Duomenų analizės metodai
Eukaliptų lapų mėginių analizės eksperimentai kartoti tris kartus, duomenys išreikšti vidurkiais ± standartiniais nuokrypiais. Duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, JAV).
4. REZULTATŲ APTARIMAS
4.1. Fenolinių junginių ekstrakcijos iš eukaliptų lapų žaliavos optimizavimas
Siekiant nustatyti optimalius ekstrakcijos sąlygų parametrus (ekstrakcijos laiką, stiprį ir etanolio koncentraciją), kurie daro įtaką fenolinių junginių išeigai, buvo naudojamas centrinis kompozicinis modelis. Naudojant „Design expert“ programą sudarytas centrinio kompozicinio modelio dizainas, apimantis 20 eksperimentų, kuris padėjo nustatyti optimaliausią ekstrakcijoje naudojamą etanolio koncentraciją, ekstrakcijos laiką bei stiprį. Eksperimentų metu buvo įvertinta trijų kintamųjų įtaka bendrai fenolinių junginių išeigai. Pagal modelio nurodytus derinius buvo gaminami eukaliptų lapų ekstraktai, kuriuose Folin-Ciocalteu metodu įvertintas bendras fenolinių junginių kiekis.
Kubinio atsako modelis laikomas tinkamu, kai R2 vertė yra didesnė nei 0,80 [48]. Atliktame tyrime R2 paviršiaus atsako reikšmė kintamiesiems buvo 0,8834, todėl galima teigti, kad modelis yra patikimas. Ekstrakcijos parametrų poveikis fenolinių junginių išeigai pavaizduotas sudarant kubinio modelio grafikus (3, 4, 5 pav.). Trimačiuose grafikuose pavaizduotas 3D paviršiaus plotas, kuris nurodo ekstrakcijos laiko, etanolio koncentracijos ir stiprio įtaką fenolinių junginių išeigai.
3 pav. Trimatis atsako paviršiaus grafikas, vaizduojantis ekstrakcijos metu naudoto stiprio ir etanolio koncentracijos įtaką fenolinių junginių išeigai.
Didėjant ekstrakcijos metu naudojamam stipriui didėja ir fenolinių junginių išeiga, tačiau esant didelei etanolio koncentracijai šių junginių išeiga mažėja. Remiantis šio trimačio grafiko duomenimis, siekiant pasirinkti optimaliausias ekstrakcijos sąlygas reikėtų rinktis didesnį stiprį ir mažesnę etanolio koncentraciją (3 pav).
4 pav. Trimatis atsako paviršiaus grafikas, vaizduojantis ekstrakcijos metu naudoto stiprio ir ekstrakcijos laiko įtaką fenolinių junginių išeigai.
Esant vidutiniui ekstrakcijos laikui (30 minučių) fenolinių junginių išeiga yra didesnė, nei ekstrahuojant trumpai (6 minutes) ar ilgai (70 minučių). Stipris šiuo atveju didelės įtakos fenolinių junginių išeigai neturi, tačiau grafiškai matoma, kad išeiga yra didesnė, kai parenkamas 75 W stipris. Remiantis šiuo trimačiu grafiku galima daryti išvadą, kad didžiausia fenolinių junginių išeiga yra ekstrahuojant 30 minučių ir taikant 75 W stiprį (4 pav.).
5 pav. Trimatis atsako paviršiaus grafikas, vaizduojantis laiko ir etanolio koncentracijos įtaką fenolinių junginių išeigai.
Vertinant laiko ir etanolio koncentracijos įtaką fenolinių junginių išeigai, galima daryti išvadą, kad optimaliausia ekstrahuoti žaliavą ilgą laiką, esant didelei etanolio koncentracijai arba trumpą laiką, esant mažai etanolio koncentracijai (5 pav.).
Bendro fenolinių junginių kiekio priklausomybę nuo ekstrakcijos laiko, stiprio ir etanolio koncentracijos parodo trečio laipsnio lygtis:
Z=91,08-2,12*X1+0,75*X2+0,8518*X3+1,90*X1*X2+1,25*X1*X3-1,27*X2*X3 -0,7117*X12+0,1005*X22-0,2149*X32
-0,8896*X1*X2*X3+0,7703*X12*X2+0,9602*X12*X3+2,96*X1*X22
Z - bendras fenolinių junginių kiekis; X1 - etanolio koncentracija;
X2 - laikas; X3 - stipris.
Įvertinus centrinio kompozicinio dizaino modelio rezultatus padaryta išvada, kad optimalios ekstrakcijos sąlygos eukaliptų lapų ekstraktams išgauti yra procesą vykdant 20 minučių, naudojant 30 proc. etanolį bei 75 W stiprį.
4.2. Bendro fenolinių junginių, hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų
kiekio nustatymas eukaliptų lapų žaliavų ėminiuose
Fenoliniai junginiai yra labiausiai paplitę visoje augalų karalystėje ir sudaro apytiksliai 45 proc. visų fitocheminių junginių. Šie junginiai sudaro didelę ir gana sudėtingą cheminių junginių grupę, kuri yra aptinkama augaluose. Jie yra gerai žinomi kaip antriniai metabolitai, kurių savybės yra naudingos žmogaus organizmui, kadangi pasižymi antioksidantinėmis savybėmis. Šios savybės lemia kaip efektyviai organizmas bus apsaugomas nuo laisvųjų radikalų sukeliamų ligų [24].
6 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingų šalių rinkose įsigytų eukaliptų lapų ėminiuose. 0 20 40 60 80 100 120 K ie ki s (m g/ g) Eucalyptus globulus L. 0 20 40 60 80 100 120 K ie ki s (m g/ g) Eucalyptus viminalis L.
Fenolinių junginių kiekis tirtuose eukaliptų lapų mėginiuose įvairuoja 72,48-99,44 mg/g ribose. Rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) mėginiuose bendras fenolinių junginių kiekis varijuoja nuo 74,62 mg/g iki 87,983 mg/g, tuo tarpu vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) mėginiuose – nuo 72,48 mg/g iki 99,44 mg/g. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas vytelinių eukaliptų mėginyje (99,44±0,88 mg/g), kuris buvo įsigytas Rusijos rinkoje, o mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Lenkijoje įsigytame vytelinių eukaliptų mėginyje (72,48±3,79 mg/g) (6 pav).
Kitų tyrimų duomenimis nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis eukaliptų ekstraktuose gali varijuoti nuo 12,8 mg/g iki 235,87 mg/g [34,43]. Tokie dideli skirtumai tarp rezultatų gali būti dėl ekstrakcijoje naudojamo etanolio koncentracijų skirtumo, skirtingų augaviečių, žaliavos rinkimo laiko bei skirtingo augalų amžiaus. Tokią išvadą galima daryti dėl to, kad tyrimo metu buvo analizuoti skirtingų etanolio koncentracijų ekstraktai (0 proc., 35 proc., 70 proc. vandens - etanolio koncentracija), kuriuose bendras fenolinių junginių kiekis įvairavo nuo 9,56 mg/g iki 14,12 mg/g [43].
Flavonoidai yra vieni labiausiai paplitusių junginių, kurie priskiriami fenoliniams. Šiuo metu jų yra išskirta daugiau nei 4000, dauguma jų yra paplitę daržovėse, vaisiuose. Pastaraisiais metais dėmesys flavonoidams išaugo dėl jų biologinio ir farmakologinio poveikio. Mokslininkų teigimu šie junginiai pasižymi ne tik antioksidantinio aktyvumu, bet ir antimikrobiniu, citotoksiniu, priešuždegiminiu, priešnavikiniu aktyvumu [24].
7 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas skirtingų šalių rinkose įsigytų eukaliptų lapų ėminiuose.
Flavonoidų kiekis tirtuose skirtingų šalių rinkose įsigytų eukaliptų lapų mėginiuose varijuoja nuo 7,93 mg/g iki 22,15 mg/g. Rutulinių eukaliptų mėginiuose bendras flavonoidų kiekis varijuoja nuo 7,93 mg/g iki 17,72 mg/g, o vytelinių eukaliptų – nuo 13,00 mg/g iki 22 mg/g. Didžiausias tirtų
0 5 10 15 20 25 K ie ki s (m g/ g) Eucalyptus globulus L. 0 5 10 15 20 25 K ie ki s (m g/ g) Eucalyptus viminalis L.
junginių kiekis nustatytas Lenkijoje įsigytame vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) lapų mėginyje (22,15±0,50 mg/g), tuo tarpu mažiausias – rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) lapų mėginyje, kuris įsigytas Ispanijoje (7,93±0,33 mg/g) (7 pav.).
Kitų šalių mokslininkų atliktuose tyrimuose nustatytas flavonoidų kiekis yra 34,76 mg/g [34]. Lyginant abiejų tyrimų metu gautus rezultatus, tokie bendro flavonoidų kiekio eukaliptų lapų ekstraktuose skirtumai galimai pasireiškė dėl skirtingų naudotų ekstrahentų, analizuotų eukaliptų rūšių, augalų kultivavimo bei klimato sąlygų.
Hidroksicinamono rūgštis yra priskiriama fenolinėms rūgštims. Šios rūgšties junginiai yra sudaryti iš paprastos struktūros esterio su gliukoze ar hidroksikarboksiline rūgštimi. Tokios struktūros junginiai daugiausiai yra tiriami dėl oksidacinį pažeidimą slopinančio poveikio sergant įvairiomis degeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip širdies ir kraujagyslių, uždegiminės ligos bei vėžys [24].
8 pav. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas skirtingų šalių rinkose įsigytų eukaliptų lapų ėminiuose.
Hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis tirtuose eukaliptų lapų augalinių žaliavų ėminiuose įvairuoja 29,2-52,5 mg/g. Rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus L.) mėginiuose šios rūgšties darinių kiekis varijuoja nuo 31,73 mg/g iki 44,4 mg/g, o vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis L.) 29,2-52,5 mg/g ribose. Baltarusijoje įsigytoje vytelinių eukaliptų lapų žaliavoje nustatytas didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis (52,5±3,00 mg/g), mažiausias - Lietuvoje įsigytoje vytelinių eukaliptų lapų žaliavoje (29,2±1,70 mg/g) (8 pav.).
0 10 20 30 40 50 60 K ie ki s (m g/ g) Eucalyptus globulus L. 0 10 20 30 40 50 60 K ie ki s (m g/ g) Eucalyptus viminalis L.
4.3. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas eukaliptų lapų
ėminiuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra plačiai naudojamas tiek fenolinių junginių identifikavimui, tiek kiekiui įvertinti. Tokį platų metodo panaudojimą fenolinių junginių analizėje lemia tai, jog tyrimus galima atlikti naudojant įvairias sąlygas bei metodikas. Dėl to yra lengviau analizuoti skirtingus junginius, pavyzdžiui, fenolines rūgštis, antocianus, flavonus ir kitas biologiškai aktyvias medžiagas [54].
9 pav. Eukaliptų lapų etanolinių ekstraktų chromatogramos (λ=350 nm). A - Eucalyptus
viminalis Labill. chromatograma; B - Eucalyptus globulus Labill. chromatograma; 1 –
chlorogeno rūgštis; 2 – hiperozidas; 3 – izokvercitrinas; 4 – avikularinas; 5 – astragalinas; 6 – kvercitrinas; 7 – kemferol-3-gliukuronidas; 8 – kvercetinas.
Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių analizė eukaliptų lapų mėginiuose atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Tirtuose eukaliptų lapų ekstraktuose identifikuota 8 skirtingi fenoliniai junginiai: chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, avikularinas, astragalinas, kvercitrinas, kemferol-3-gliukuronidas ir kvercetinas (9 pav.).
10 pav. Chlorogeno rūgšties, kvercitrino ir kemferol 3- gliukuronido kiekai skirtingų šalių rinkose įsigytų rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) lapų etanoliniuose ekstraktuose.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 K ie ki s µ g/ g Chlorogeno rūgštis Kemferol 3-gliukuronidas Kvercitrinas
11 pav. Chlorogeno rūgšties, kvercitrino ir kemferol 3- gliukuronido kiekai skirtingų šalių rinkose įsigytų vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) lapų etanoliniuose ekstraktuose.
Kiekybiškai įvertinus junginius, identifikuotus eukaliptų lapų ekstraktuose, nustatyta, jog didžiausias kiekis tirtuose rutulinių ir vytelinių eukaliptų lapų ėminiuose yra chlorogeno rūgšties. Tyrimo metu nustatyta, jog rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus L.) mėginiuose šios rūgšties kiekis įvairuoja nuo 5341 µg/g iki 10497 µg/g, o vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis L.) – 6850-14989 µg/g. Didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas Baltarusijos rinkoje įsigytame vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) lapų mėginyje (14989±12 µg/g), tuo tarpu mažiausias – Norvegijoje įsigytame rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) žaliavos mėginyje (5341±127 µg/g) (10, 11 pav.).
Kvercitrinas buvo identifikuotas 5 mėginiuose, trijuose rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus L.) ir dvejuose vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis L.). Rutulinių eukaliptų lapų mėginiuose šio junginio kiekis varijuoja nuo 364 µg/g iki 496 µg/g, o vytelinių eukaliptų – 23-10004 µg/g. Kemferol-3-gliukuronidas nustatytas visuose tirtuose rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) ir keturiuose vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) lapų mėginiuose. Rutulinių eukaliptų lapų mėginiuose šio junginio nustatyta nuo 519 µg/g iki 7521 µg/g, tuo tarpu vytelinių eukaliptų mėginiuose – 4285-9005 µg/g (10, 11 pav.). 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 K ie ki s µ g/ g Chlorogeno rūgštis Kemferol 3-gliukuronidas Kvercitrinas
12 pav. Hiperozido ir avikularino kiekiai skirtingų šalių rinkose įsigytų eukaliptų lapų etanoliniuose ekstraktuose.
Hiperozidas kokybiškai ir kiekybiškai įvertintas visuose tirtuose mėginiuose. Rutulinių eukaliptų ekstraktuose šio junginio kiekis varijuoja 55-92 µg/g ribose, o vytelinių eukaliptų – 24-54 µg/g. Didžiausias hiperozido kiekis nustatytas Lietuvos vaistinėje įsigytos rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) žaliavos mėginyje (92±8 µg/g), tuo tarpu mažiausias – Rusijoje įsigytos vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) lapų mėginyje (24±3 µg/g). Įvertinus eukaliptų lapų vaistinėje augalinėje žaliavoje kaupiamą avikularino kiekį, nustatyta, kad jis varijuoja nuo 9 µg/g iki 86 µg/g. Didžiausias šio biologiškai aktyvaus junginio kiekis nustatytas rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) lapų mėginyje (86±5 µg/g), kuris įsigytas Ispanijoje, o mažiausias vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) lapų mėginyje (9±4 µg/g), kuris įsigytas Lenkijos farmacinėje rinkoje (12 pav.).
13 pav. Izokvercitrino, astragalino ir kvercetino kiekiai skirtingų šalių rinkose įsigytų rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) lapų etanoliniuose ekstraktuose.
0 20 40 60 80 100 120 K ie ki s µ g/ g Eucalyptus globulus L. Hiperozidas Avikularinas 0 20 40 60 80 100 120 K ie ki s µ g/ g Eucalyptus viminalis L. Hiperozidas Avikularinas 0 100 200 300 400 500 600 K ie ki s µ g/ g Izokvercitrinas Astragalinas Kvercetinas
14 pav. Izokvercitrino, astragalino ir kvercetino kiekiai skirtingų šalių rinkose įsigytų vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) lapų etanoliniuose ekstraktuose.
Kiekybiškai įvertinus izokvercitrino kiekį, nustatyta, jog jis įvairuoja nuo 68 µg/g iki 229 µg/g. Tirtuose rutulinių eukaliptų (Eucalyptus globulus L.) lapų mėginiuose šio biologiškai aktyvaus junginio kiekis varijuoja 84-229 µg/g ribose, o vytelinių eukaliptų (Eucalyptus viminalis L.) lapų mėginiuose – 68-218 µg/g. Didžiausias izokvercitrino kiekis nustatytas rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) lapų mėginyje (229±4 µg/g), kuris įsigytas Rusijos rinkoje, o mažiausias kiekis (68±5 µg/g) nustatytas Lenkijoje įsigytame vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) žaliavos mėginyje (13, 14 pav.).
Astragalino kiekiai tirtuose ekstraktuose įvairavo nuo 36 µg/g iki 138 µg/g. Keturiuose mėginiuose šis junginys neaptiktas (trijuose E. globulus L. ir viename E. viminalis L.). Didžiausias astragalino kiekis nustatytas rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) lapų mėginyje, kuris įsigytas Rusijoje (138±1 µg/g), tuo tarpu mažiausias – Lietuvos farmacinėje rinkoje įsigytos vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) žaliavos mėginyje (36±2 µg/g) (13, 14 pav.).
Tirtuose mėginiuose kvercetino kiekis įvairuoja nuo 82 µg/g iki 543 µg/g. Rutulinių eukaliptų mėginiuose nustatytas šio junginio kiekis yra nuo 94 µg/g iki 543 µg/g, o vytelinių eukaliptų – nuo 82 µg/g iki 174 µg/g. Didžiausias kvercetino kiekis nustatytas Norvegijoje įsigytos rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) žaliavos mėginyje (543±19 µg/g), tuo tarpu mažiausias – vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) mėginyje, kuris įsigytas Baltarusijoje (82±1 µg/g) (13, 14 pav.).
Kitų mokslininkų atliktų tyrimų metu nustatyta, kad eukaliptų lapų ekstraktuose dominavo hiperozidas (666,42 µg/g). Šiuose ekstraktuose taip pat buvo kiekybiškai įvertinta chlorogeno rūgštis, izokvercitrinas, kvercetinas ir kvercitrinas. Nustatyta, jog eukaliptų lapų ekstraktuose chlorogeno rūgšties yra mažiau nei 0,02 µg/g, nedidelis kiekis kvercetino (2,01 µg/g), didžiausias kiekis nustatytas kvercitrino - 287,83 µg/g, tuo tarpu izokvercitrino tik 38,95 µg/g [34].
0 100 200 300 400 500 600 K ie ki s µ g/ g Izokvercitrinas Astragalinas Kvercetinas
Lyginant su mūsų atlikto tyrimo duomenimis eukaliptų lapų ekstraktuose dominuoja chrologeno rūgštis, kemferol-3-gliukuronidas bei kvercetinas. Tokius rezultatų skirtumus gali lemti skirtingos augimo sąlygos, tokios kaip oro temperatūra, drėgmė, dirvožemio savybės bei kiti veiksniai.
4.4. Eukaliptų lapų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas FRAP, ABTS,
DPPH spektrofotometriniais metodais
Išaugusį mokslininkų bei visuomenės susidomėjimą antioksidantais lemia oksidacinio streso sukeliamos įvairios lėtinės ligos. Antioksidantai pradėti plačiai naudoti ne tik maisto pramonėje, tačiau ir maisto papildų bei kosmetikos gamyboje. Toks platus šių medžiagų naudojimas padidino redukcinio ir antiradikalinio aktyvumo tyrimų poreikį [50].
15 pav. FRAP spektrofotometriniu metodu nustatytas skirtingų šalių rinkose įsigytų eukaliptų lapų ėminių antioksidacinis aktyvumas.
Atliktas eukaliptų lapų ėminių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimas, taikant FRAP metodą. Tirtuose rutulinių eukaliptų mėginiuose redukcinis aktyvumas įvairuoja nuo 88,67 mg TE/g iki 455,27 mg TE/g, o vytelinių eukaliptų – 66,63 – 416,21 mg TE/g ribose. Šio tyrimo metu stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo Norvegijoje įsigytas rutulinių eukaliptų (E. globulus L.) lapų mėginys (455,27±8,00 mg TE/g), o silpniausiu – vytelinių eukaliptų (E. viminalis L.) mėginys, kuris įsigytas Lenkijos farmacinėje rinkoje (66,63±1,89 mg TE/g) (15 pav.).
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 A n tiok si d ac in is akt yv u m as (m g TE /g ) Eucalyptus globulus L. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 A n tiok si d ac in is akt yv u m as (m g TE /g ) Eucalyptus viminalis L.
