LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Simas Rimgaila
HIPERKOAGULIACINIŲ BŪKLIŲ LABORATORINIS VERTINIMAS SPECIALIZUOTAIS KREŠĖJIMO SISTEMOS TYRIMAIS
Baigiamasis magistro darbas
Biomedicinos mokslų studijų kryptis
Laboratorinės medicinos biologijos studijų programa, valstybinis kodas 621B91002
Darbo vadovas (–ė): doc. Daiva Urbonienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
INTERESŲ KONFLIKTAS ... 7
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 7
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Hiperkoaguliacinių būklių samprata ... 13
1.1.1. Paplitimas ... 14
1.1.2. Etiologiniai veiksniai ... 14
1.1.3. Hiperkoaguliacinių būklių klinikinė išraiška ... 19
1.2. Kraujo krešėjimo sistema ir hiperkoaguliacinių būklių mechanizmai ... 21
1.2.1. Antrinė hemostazė ... 22
1.2.2. Prokoaguliaciniai mechanizmai, susiję su pagrindiniais krešėjimo sistemos faktoriais ... 24
1.2.3. Antikoaguliaciniai mechanizmai ... 25
1.3. Laboratorinė trombofilijų diagnostika ... 27
1.3.1. Antitrombinas ... 28
1.3.2. Baltymas C ... 28
1.3.3. Baltymas S ... 29
1.3.4. Rezistentiškumas aktyvintam baltymui C ... 29
1.3.5. Krešėjimo faktorius VIII ... 30
1.3.6. Lupus antikoaguliantas ir antikūnai prieš fosfolipiną ... 30
1.3.7. Laboratorinių tyrimų atlikimo pacientams su TE poreikis ir tikslingumas ... 31
2. TYRIMŲ METODIKA IR METODAI ... 32
2.1. Tyrimų metodika ... 32
2.2. Tyrimo metodai ... 32
2.2.1. Imunofermentinis autoantikūnų nustatymas ... 32
2.2.2. Krešėjimo faktorių VIII ir XII nustatymas ... 34
2.2.3. Kolorimetrinis antitrombino nustatymas ... 35
2.2.4. Kolorimetrinis baltymo C tyrimas... 36
3
2.2.6. Rezistentiškumo aktyvintam baltymui C nustatymas ... 38
2.3. Statistinė duomenų analizė ... 39
3. REZULTATAI ... 40
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 50
IŠVADOS ... 54
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 55
4
SANTRAUKA
Simas Rimgaila. „Hiperkoaguliacinių būklių laboratorinis vertinimas specializuotais krešėjimo sistemos tyrimais“. Tyrimo tikslas: Įvertinti laboratorinės diagnostikos reikšmę pacientams su hiperkoaguliaciniais sutrikimais. Uždaviniai: 1. Atlikti specializuotus krešėjimo sistemos (antikoaguliacinių baltymų (AT, PC, PS), prokoaguliacinių veiksnių (FVIII, FXII), APC-R bei autoantikūnų (anti–β2GP1 IgG, anti–β2GP1 IgM, anti–Kard IgG, anti–Kard IgM)) tyrimus ir nustatyti jų pokyčių ir hiperkoaguliacijos sutrikimų dažnį pacientams, tiriamiems dėl hiperkoaguliacinių būklių (HB). 2. Nustatyti ir įvertinti krešėjimo sistemos sutrikimų dažnį ir ypatumus pacientams atsižvelgiant į paciento lytį ir amžių. 3. Nustatyti ir įvertinti krešėjimo sistemos sutrikimų ypatumus pacientams atsižvelgiant į diagnozės pobūdį. 4. Įvertinti specializuotų krešėjimo sistemos laboratorinių tyrimų pasirinkimo ypatumus priklausomai nuo paciento diagnozės ir lyties. Objektas ir metodai: Retrospektyviai analizuoti 2016 metais LSMU ligoninėje Kauno klinikose dėl HB tirti pacientai. Autoantikūnams tirti naudoti AESKU.DIAGNOSTICS (Vokietija) reagentų rinkiniai, o krešėjimo sistemos tyrimams – Diagnostica Stago (Prancūzija) reagentų rinkiniai. Rezultatai: Ištirti 389 pacientai: 20 proc. vyrų ir 80 proc. moterų. VTE grupėje pacientų buvo 52 proc., akušerinės patologijos – 32 proc., arterijų TE – apie 17 proc. VTE sirgo 37,5 proc. moterų, 11,6 proc. vyrų, o arterijų TE – atitinkamai 8,4 proc. ir 8,4 proc. ≥1 patologinis rezultatas buvo nustatytas 93 pacientams (23,9 proc.) – 25/81 vyrų (30,9 proc.) ir 68/308 moterų (22,1 proc.). Daugiausiai patologijų nustatyta tiriant autoantikūnus (13,1 proc.), mažiau – AT, PC, PS (6,9 proc.) ir FVIII, FXII (2,8 proc.), o kombinuoti sutrikimai siekė vos 1,1 proc. VTE ir nėščiųjų grupėse dažniausiai aptikta autoantikūnų patologija, atitinkamai, 15,7 proc. ir 13,6 proc., arterijų TE grupėje – antikoaguliacinių baltymų 18,2 proc., o įtariamos TE grupėje – FVIII ir FXII (28,6 proc.). 11,6 proc. berniukų aptikti anti–β2GP1 IgG, 42,9 proc. berniukų – AT sumažėjimas, vyrams atitinkamai 2,3 proc. ir 0 proc. Moterims FVIII padidėjimas aptiktas dažniau nei mergaitėms (30,0 proc. ir 0 proc.). Išvados: 1. Beveik ketvirtadaliui pacientų, tiriamų dėl HB, buvo aptiktas bent vienas patologinis specializuotų krešėjimo sistemos laboratorinius tyrimų rezultatas. Patologijos dažnis tarp vyrų ir moterų grupių nesiskyrė. 2. Berniukams reikšmingai dažniau nei vyrams buvo aptikti anti–β2GP1 IgG ir AT sutrikimai, o suaugusioms moterims reikšmingai dažniau nei mergaitėms – FVIII patologija. 3. VTE grupėje dominavo autoimuninė patologija, o arterijų TE – antikoaguliacinių baltymų (AT, PC, PS) stoka. Beveik kas septintai pacientei su akušerine patologija aptikti autoantikūnų pokyčiai. 4. Pacientų su arterijų TE tyrimų spektras plačiausias – tiriami ir autoantikūnai, ir antikoaguliaciniai, ir prokoaguliaciniai veiksniai. Pacientams su VTE dažniausiai atlikti autoantikūnų tyrimai. Moterims su akušerine patologija apsiribojama tik autoantikūnų tyrimais. Raktiniai žodžiai: tromboembolija, hiperkoaguliacija, trombofilija, krešėjimo sistemos tyrimai.
5
SUMMARY
Simas Rimgaila. Laboratory evaluation of hypercoagulable disorders based on specialized coagulation tests. The aim: to determine the significance of laboratory evaluation in persons with hypercoagulable disorders. Objectives: 1. To perform specialized coagulation tests (natural anticoagulant proteins (AT, PC, PS), procoagulant factors (FVIII and FXII), APC-R, and autoantibodies (anti–β2GP1 IgG, anti– β2GP1 IgM, anti–Kard IgG, anti–Kard IgM), determine the frequency of pathological laboratory tests and hypercoagulable disorders in persons with suspected hypercoagulable states. 2. To determine and evaluate the frequency and features of coagulation disorders in relation to gender and age. 3. To determine and evaluate the features of coagulation disorders in relation to diagnosis. 4. To evaluate the features of specialized coagulation tests choice in relation to patient diagnosis and gender. Methods and study subjects: patients with suspected hypercoagulable disoreders during 2016 at the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences (LSMU) Kauno klinikos were included in study. AESKU.DIAGNOSTICS (Germany) reagent kits were used for autoantibodies testing and Diagnostica Stago (France) reagent kits were used for coagulation analyses. Results: 389 patients were investigated: 20% men, 80% women. Most of patients were in VTE group – 52%, 32% of them were in obstetrical pathology group and 17% – in arterial TE group. The prevalence of VTE was significantly higher in women than in men, however, prevalence of arterial TE was the same in men and women groups. At least one pathological result was detected in 93 patients (23.9%) – 25/81 men (30.9%) and 68/308 women (22.1%). The most common pathology was autoantibodies (13.1%), less common AT, PC, PS (6.9%) and FVIII, FXII (2.8%), combined disorders were rare (1.1%). The most common pathology in VTE and obstetrical pathology groups was increased autoantibodies (15.7% and 13.6%, respectively), whereas arterial TE group – natural anticoagulant proteins deficiency (18.2%), suspected TE group – increase of procoagulant factors (28.6%). Pathological values of anti-β2GP1 and AT were detected more often in boys compared to men (11.6% and 42.9% vs. 2.3% and 0%, respectively), increase of FVIII activity was observed more frequently in adult women than in girls (30.0% vs. 0%). Conclusions: 1. One or more pathological coagulation tests were observed in almost one quarter of patients. The overall frequency of pathology did not differ between men and women. 2. Pathologies of anti-β2GP1 and AT were detected significantly more often in boys compared to men, whereas increased FVIII activity was observed more frequently in adult women than in girls. 3. Autoimmune pathology was dominant in VTE group – one of five patients had increased autoantibodies, whereas in arterial TE group deficiency of anticoagulant proteins was observed more often than other pathologies. One of seven women had increased autoantibodies in obstetric patient group. 4. The most comprehensive testing of specialized coagulation tests consisting of
6 autoantibodies, anticoagulant proteins and procoagulant factors was performed for patients which were investigated for arterial TE. Autoantibodies assays in patients with VTE were tested mostly, whereas other assays were tested in less than a fifth of patients in this group. Women with obstetric pathology were tested for autoantibodies only. Keywords: thromboembolism, hypercoagulation, thrombophilia, coagulation tests.
7
INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Etikos komiteto leidimą (Nr.: BEC – LMB(M) – 153) 2015–12–21 išdavė Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centras (žr. 1 priedą).
8
SANTRUMPOS
ADTL – (angl. Activated partial thromboplastin time) Aktyvintas dalinis tromboplastino laikas
Anti–β2GP1 – Antikūnai prieš beta 2 glikoproteiną 1 Anti–FL – Antikūnai prieš fosfolipiną
Anti–Kard – Antikūnai prieš beta 2 glikoproteiną kardiolipiną APC–R – Rezistentiškumas aktyvintam baltymui C
AT – Antitrombinas
°C – Celsijaus laipsnis C4b–BP – C4b surišantis baltymas
DIK – Diseminuotos intravaskulinės koaguliacijos sindromas
ELISA – (angl. Enzyme-linked immunosorbent assay) Imunofermentinis tyrimo metodas EPCR – Endotelio baltymo C receptorius
FI–FXIII – Kraujo krešėjimo sistemos krešėjimo faktoriai I–XIII
FIa–FXIIIa – Aktyvinta kraujo krešėjimo sistemos krešėjimo faktoriaus I–XIII forma FVL – Krešėjimo faktoriaus V Leideno mutacija
fPS – (angl. Free protein S) Laisvas baltymas S
g – (angl. Relative centrifuge force expressed in units of gravity) Išcentrinė jėga
GPL – Standartiniai imunoglobulino G fosfolipidų vienetai GVT – Giliųjų venų trombozė
HB – Hiperkoaguliacinės būklės IgG – Imunoglobulinas G klasės IgM – Imunoglobulinas M klasės
IL – Interleukinas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos KT – Kambario temperatūra (18–21 °C) LA – Lupus antikoaguliantas
ll – Laisvės laispniai
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
MPL – Standartiniai imunoglobulino M fosfolipidų vienetai PAK – Protrombiną aktyvinantis kompleksas
9 PE – Plaučių arterijos trombinė embolija
PGR – (angl. Polymerase chain reaction) Polimerazės grandininė reakcija PS – (angl. Protein S) Baltymas S
PZI – Nuo baltymo Z priklausantis proteazių slopiklis r – Sperrman koreliacijos koeficientas
SD – (angl. Standard deviation) Standartinis nuokrypis
SPA – (angl. Stago prothrombin-complex assay) Stago gamintojo protrombino laiko tyrimo pavadinimas
TFPI – (angl. Tissue factor pathway inhibitor) Audinių faktoriaus kelio slopiklis
TM – Trombomodulinas
TNS – (angl. International normalized rattio) Tarptautinis normalizuotas santykis VTE – Venų trombinė embolija
vWF – Von Wilebrando faktorius
ŽIV – (angl. Human immunodeficiency virus) Žmogaus imunodeficito virusas
10
ĮVADAS
Kraujotakos sistemos ligos išlieka vienos iš pagrindinių žmonių mirtingumo priežasčių. Didelė svarba tenka įgimtoms arba įgytoms hiperkoaguliacinėms būklėms (HB), kurioms yra būdingas trombų susidarymas arterijų ir/arba venų sistemoje (1). Tromboze kasmet pasaulyje suserga 1–2 žmonės iš 1000 gyventojų, o dažniausia trombozės forma venų tromboembolija (VTE) kiekvienais metais vien JAV-e serga beveik vienas milijonas žmonių, iš kurių trečdalis miršta. Daugėja ne tik sergančiųjų, mirštančiųjų, bet ir dėl trombozės sukeliamų komplikacijų darbingumą prarandančių asmenų skaičius. VTE pasikartojimo rizika siekia apie 30 proc. (2–7).
HB-ių, dažnai įvardinamų trombofilijos terminu, sukėlusios priežastys gali būti įgimtos, įgytos, mišrios arba neaiškios klimės. HB priežastis, atsižvelgiant į jų funkciją TE mechanizmuose, galima skirti į kelias grupes: antikoaguliacinių baltymų stoka (antitrombino (AT), baltymo C (PC), baltymo S (PS), plazminogeno), perteklinis ar naujai atsiradusių veiksnių kiekis (V faktoriaus Leideno mutacija (FVL), protrombino geno mutacija (G20210)), prokoaguliacinių veiksnių aktyvumo ar kiekio padidėjimas (krešėjimo faktoriai FVIII, FIX, FXI, FXII, disfibrinogenemija, hiperhomocisteinemija) (8–10). Tačiau HB-ių išsivystymui yra reikšmingi ir klinikiniai rizikos veiksniai – antsvoris, tabako rūkymas, nėštumas, navikiniai ir uždegiminiai procesai, diseminuotos intravaskulinės koaguliacijos (DIK) sindromas, kontraceptinės priemonės, hormonų pakaitinė terapija, operacijos (11–14). Tokia rizikos veiksnių gausa HB diagnostiką daro itin painia ir sudėtinga.
Per gana trumpą laikotarpį, tobulėjant mokslo pasiekimams, išaugo trombofilijų laboratorinės diagnostikos galimybės ir poreikis. HB priežastinių veiksnių paieškai, trombozių gydymui tinkamam algoritmui parinkti nepakanka vien įprastų paciento anamnezės ir apžiūros duomenų. Dėl atrankinių trombofilijos laboratorinių tyrimų nebuvimo HB diagnostika tapo kompleksinė, susidedanti ne iš vieno, o grupės skirtingų pacientams atliekamų specializuotų tyrimų. Šie tyrimai apima AT, PC, PS, FVIII, resistentiškumo aktyvintam baltymui C (APC–R), antifosfolipidinio sindromo, kaip dažniausio įgytos TE rizikos veiksnio, žymenų (Lupus antikoaguliantas (LA), IgM ir IgG klasių antikūnai prieš kardiolipiną (anti–Kard IgM ir anti–Kard IgG) ir prieš beta 2 glikoproteiną 1 (anti–β2GP1 IgM ir anti–β2GP1 IgG) nustatymą ir kai kuriuos kitus tyrimus. Kliniškai yra svarbu nustatyti visus šiuos rizikos veiksnius ir nesustoti tirti, jei randamas kuris nors vienas patologinis radinys, nes kiekvienas nustatytas rizikos veiksnys didinina VTE riziką. Pacientams su didele VTE rizika yra taikomas profilaktinis gydymas siekiant išvengti galimų komplikacijų, o gydymo trukmė ir intensyvumas parenkami atsižvelgiant į laboratoriniais tyrimais nustatytus rizikos veiksnius (15,16). Tinkamą laboratorinį HB ištyrimą apsunkina
11 laboratorinių tyrimų ir jų metodų įvairovė, o taip pat ir netinkamas tiriamųjų pacientų, tyrimo laiko pasirinkimas, rekomendacijų tyrimams nesilaikymas.
Anksčiau minėtos priežastys rodo, kad HB ir jų klinikinės išraiškos – TE – diagnostika yra sudėtingas, daug medicinos personalo pastangų, laiko ir finansinių išteklių reikalaujantis procesas. Klaidingai nustatyta diagnozė arba, priešingai, nepilnas laboratorinis pacientų ištyrimas gali tapti pacientų baimės, nerimo, psichologinių emocijų ar kitų problemų (pavyzdžiui, gyvybės draudimo nesuteikimo) priežastimi (16–18). Šiuolaikinėje praktikoje susiduriama su problemomis sprendžiant, ar reikalingi šie tyrimai pacientams, jei taip, tai kokius tyrimus pasirinkti, o galbūt, priešingai, atsisakyti šių tyrimų.
12
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti specializuotų krešėjimo sistemos laboratorinių tyrimų reikšmę pacientams su hiperkoaguliaciniais sutrikimais.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti specializuotus krešėjimo sistemos (antikoaguliacinių baltymų (AT, PC, PS), prokoaguliacinių veiksnių (FVIII ir FXII), APC-R bei autoantikūnų (anti–β2GP1 IgG, anti–β2GP1 IgM, anti–Kard IgG, anti–Kard IgM)) tyrimus ir nustatyti jų pokyčių, o tuo pačiu ir hiperkoaguliacijos sutrikimų dažnį pacientams, tiriamiems dėl hiperkoaguliacinių būklių.
2. Nustatyti ir įvertinti krešėjimo sistemos sutrikimų dažnį ir ypatumus pacientams atsižvelgiant į paciento lytį ir amžių.
3. Nustatyti ir įvertinti krešėjimo sistemos sutrikimų ypatumus pacientams atsižvelgiant į diagnozės pobūdį.
4. Įvertinti specializuotų krešėjimo sistemos laboratorinių tyrimų pasirinkimo ypatumus priklausomai nuo paciento diagnozės ir lyties.
13
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Hiperkoaguliacinių būklių samprata
Trombozė kaip klinikinė būklė buvo paminėta dar prieš 5000 tūkstančius metų Kinų imperatoriaus Huang Ti, kuris šią būklę aprašė sekančiai: „kai kraujas sukreša kraujotakoje, jis nebecirkuliuoja naudingai; kai kraujas sukreša kojose – juntamas skausmas ir drebulys“. Graikų fizikas Klaudijus Galenas trombozės terminą vartojo patologiniam krešėjimui apibūdinti, tačiau pirmasis išsamesnę trombozės proceso analizę 1854 metais savo postulatuose pateikė vokiečių patologas Rudolfas Virchovas, kuriuose teigė, kad trombozę sukelia trys tarpusavyje susiję veiksniai: sulėtėjusi kraujo tekmė (veninė stazė), kraujagyslių ar šalia jų esančių audinių uždegiminis procesas (kraujagyslių endotelio pažaida) bei paties kraujo pokyčiai. Šie pakitimai sudaro vadinamąją Virchovo triadą, dėl kurios veiksnių pokyčių vyksta krešulio formavimasis, vedantis į trombozę (19,20).
Hiperkoaguliacinės būklės (HB) dažniausiai apibūdinamos kaip grupė įgimtų arba įgytų ligų, pasireiškiančių polinkiu išsivystyti veninei trombozei ir/arba arterinei trombozei (1). Tačiau kasdieniame gyvenime esama terminologinių skirtumų. Kitas gana dažnai sutinkamas terminas – trombofilija, kuris labiausiai tinkamas apibūdinti primines arba paveldimas HB. Tačiau praktikoje neretai yra naudojami abu terminai, tiek HB, tiek ir trombofilija, kalbant apie visas su hiperkoaguliacija susijusias būkles, neišskiriant jų pagal atsiradimo pobūdį (15).
Dažniausiai hiperkoaguliaciniai sutrikimai kliniškai pasireikšia venų tromboembolija (viršutinių ar apatinių galūnių giliųjų venų tromboze su ar be plaučių embolijos, smegenų venų tromboze, kitų venų tromboze). Dauguma pirminių (įgimtų) būklių padidina riziką VTE išsivystyti. Antrinės (įgytos) būklės susijusios tiek su VTE, tiek ir su arterine tromboze, kuriai priskiriamas miokardo infarktas, insultas, ūmi galūnių išemija. Antrinių būklių priežastims priklauso navikai, mieloproliferaciniai sindromai, antifosfolipidiniai antikūnai, hiperhomocisteinemija ir heparino indukuota trombocitopenija. Dauguma HB turi poveikį kraujo sudėčiai, tuo tarpu kitos – tiesiogiai pažeidžia kraujagysles (19).
Nors pacientai su HB turi didesnę riziką trombozių išsivystymui negu tie, kurie neturi hiperkoaguliacinių sutrikimų, vis dėlto, ne visiems asmenims išsivysto trombozė, o ir ne visiems asmenims, kuriems pasireiškusi trombozė, galima nustatyti HB.
14
1.1.1. Paplitimas
Įvairiose šalyse VTE sergamumas skiriasi. Jis priklauso nuo demografinių priežasčių ir diagnostikos galimybių.
Bendras sergamumas VTE, remiantis Švedijos ir Jungtinių Amerikos Valstijų (JAV) duomenimis, siekia apie 0,5/1000 gyventojų per metus (2). Rečiausiai, neišskiriant pirminių ir antrinių būklių, VTE serga Azijos gyventojai (0,138–0,159/1000 gyventojų per metus), dažniau – europiečiai (1,04–1,83/1000 gyventojų per metus) (3), o Amerikoje, priklausomai nuo etninių populiacijos skirtumų, sergamumo rodikliai svyruoja nuo 0,90 iki 2,39/1000 gyventojų per metus (4–7). Europos šalyse VTE paplitimo duomenys skiriasi, pavyzdžiui, Prancūzijoje užfiksuojamas VTE atvejų skaičius yra 1,69– 1,98/1000 gyventojų per metus (21), o Norvegijoje – 1,43–1,48/1000 gyventojų per metus (22,23). Lietuvos Higienos institutas sergamumo tromboembolijomis statistinių duomenų nepateikia. Prof. P. Grybausko teigimu, mūsų šalyje kasmet galėtų būti nuo 3000 iki 5000 naujų venų trombozės atvejų (24).
Pirminės, arba įgimtos, VTE atvejai yra gerokai retesni nei antrinių ir siekia apie 0,006– 0,007/1000 vaikų per metus (25). JAV šis rodiklis siekia 0,001–0,007/1000 gyventojų per metus (26,27). Europoje šis rodiklis dar šiek tiek didesnis. Nurodoma, kad Olandijoje jis siekia 0,014/1000 gyventojų per metus, o Vokietijoje – 0,051/1000 gyventojų per metus (28,29). Tuo tarpu įgytos VTE yra dažnesnės:JAV – 1,04–1,28/1000 gyventojų per metus (30), Danijoje – 1,15–2,69/1000 gyventojų per metus (31,32), o Didžiojoje Britanijoje – 0,745/1000 gyventojų per metus (33).
Vis dėlto, objektyviai nustatyti tikrąjį įgimtų ar įgytų hiperkoaguliacinių būklių bei VTE dažnį yra sudėtinga, nes neretai liga pasireiškia be specifinių simptomų, dalis ligos etiopatogenezinių mechanizmų, lemiančių VTE išsivystymą, lieka neišaiškinti, o kartais nustatyti tikslią diagnozę nepavyksta dėl laboratorinės diagnostikos galimybių neišnaudojimo ar, priešingai, diagnostikos metodų netobulumo.
1.1.2. Etiologiniai veiksniai
Hiperkoaguliacinė būklė gali būti paveldėta arba įgyta gyvenimo eigoje, tačiau kai kuriais atvejais būklę sukėlusi priežastis lieka nežinoma. Pacientai gali turėti nebūtinai vieną, o kelis rizikos veiksnius, kurie veikdami kartu lemia bendrą riziką pasireikšti VTE. Galėtų būti skiriamos trys trombofilijų priežasčių grupės, iš kurių dviems priklauso žinomos priežastys. 1 grupė – trombofilijos dėl sumažėjusio krešėjimo kaskados slopiklių kiekio, 2 grupė – trombofilijos dėl krešėjimo faktorių
15 padidėjusio kiekio ar šių faktorių suintensyvėjusios funkcijos (ar pakitusio aktyvumo), o į 3 grupę skiriamos mišrios arba nežinomos etiologijos trombofilijos (8).
Pirmosios grupės priežastims priskiriama AT, baltymų C ir S, plazminogeno stoka bei disfibrinolizė. Daugumai tokių pacientų VTE pasireiškia dar iki 60 metų amžiaus. Antrosios grupės dažniausiai minimos priežastys yra įgimtos, pvz. tokios, kaip protrombino ir FVL genų mutacijos. Pastarosios priežastys yra susijusios su mažesne trombozių rizika lyginant su pirmosios grupės priežastimis. Pacientams su įtariama trombofilija, 2 grupės sutrikimai nustatomi bent penkis kartus dažniau nei 1 grupės sutrikimai (8). Trombozės rizikos veiksnių paplitimas yra pateikiamas 1 lentelėje.
Analizuojant HB įgimtas ir įgytas priežastis dažnai susiduriama su problema jas diferencijuojant, nes tokie pokyčiai, kaip AT, PC, PS, plazminogeno stoka ar APC–R ir dalis kitų, gali būti tiek įgimti, tiek ir įgyti gyvenimo eigoje.
1 lentelė. Trombozės rizikos veiksnių paplitimas (pagal 17)
Trombozės rizikos veiksnys
Paplitimas bendroje populiacijoje, proc. Paplitimas trombofilija sergančių populiacijoje, proc. Trombozės rizikos padidėjimas kartais Sumažėjęs AT aktyvumas <0,01 <1 12–20 Sumažėjęs PC aktyvumas 0,3 4–8 8–10 Sumažėjęs PS aktyvumas 0,2 7–12 10–15 FVL (heterozigotai) 3–4* 10–40 1,8–2,6 FVL (homozigotai) <0,01 2–4 10–15 Protrombinas G20210A 2–3 10–15 1,5–2,2
Padidėjęs FVIII aktyvumas 10–15 20–35 2–4,5
Padidėjusi FI koncentracija 5–12 20–30 2–3
Disfibrinogenemija <0,01 0,3–0,8 1,5–3
Trombomodulino mutacija <0,01 0,2–0,8 2–4
Hiperhomocisteinemija 3–5 8–15 2–4,5
Lupus antikoaguliantas 1–5 10–30 2–10
Geriamieji kontraceptikai Nėra duomenų ND 2–3
Nėštumas Nėra duomenų ND 4–8
* FVL ir protrombino G20210A heterozigotų paplitimas baltaodžių populiacijoje, Afrikos ir Azijos populiacijose labai mažas (<0,01 proc.).
Įgimtos trombofiliją sukėlusios priežastys
Įgimta AT stoka. AT yra vienas pagrindinių kraujo krešėjimo slopiklių. Jis yra svarbus efektyviam antikoagulianto heparino veikimui. AT slopina krešėjimo proteazes FIIa, FXa, FIXa ir FXIa. AT trūkumas siejamas su didesne trombozių rizika. Baltaodžių tarpe AT stoka pasireiškia 1 iš 5000
16 asmenų (34). Sutrikimas paplitęs iki 3 proc. baltaodžių ir iki 6 proc. pietryčių Azijos gyventojų su VTE (35). Esant ženkliai AT stokai rizika VTE išauga iki 50 kartų, tačiau trūksta įrodymų, jog esant AT stokai didėja rizika pasireikšti ir arterinei trombozei (36,37). Dėl genetinių mutacijų AT gali sumažėti tiek kiekybiškai, tiek gali pakisti jo struktūra (38).
Baltymo C stoka. Baltymą C trombinas, dalyvaujant trombomodulinui, paverčia į aktyvintą baltymą C (PCa). Šis inaktyvina FVa ir FVIIIa formas (8). Rezistentiškumu PCa (APC–R) vadinama būklė, kai paciento plazma nesukelia pakankamo antikoaguliacinio poveikio PCa. Ją gali sukelti FV R506Q geno mutacija (FVL) , kai sintezuojamas pakitęs FV tampa atsparus PCa.
Įrodyta, kad PC stoka yra trombozių rizikos faktorius. PC trūksta 1 iš 500 baltaodžių, o paplitimas tarp azijiečių didesnis (9). Tarp pacientų su VTE PC stoka nustatoma iki 5 proc. baltaodžių ir iki 8 proc. azijiečių (35,39,40). Homozigotinė stoka naujagimiams gali pasireikšti gangrenuojančia purpura (neonatal purpura fulminans) (41). PC stoka skiriama į 2 tipus. I tipo metu nustatomas kiekybinis PC trūkumas: mažas kiekis baltymo, sumažėjęs jo aktyvumas. Šis tipas aptinkamas apie 75 proc. pacientų su PC stoka, o II tipas – kokybiniai PC defektai, nustatomi apie 25 proc. likusių pacientų (16).
Baltymo S stoka. Šio baltymo stoka aptinkama 1 iš 1000 baltosios rasės žmonių, o paplitimas tarp azijiečių didesnis (39,40,42). PS yra nuo vitamino K priklausomas kofaktorius, būtinas PC veikimui. Yra dvi PS formos: laisvas PS (40 proc.) ir PS susijungęs su C4b surišančiu baltymu (60 proc.). Kofaktoriumi gali būti tik laisvoji PS forma (fPS). Trūkstant PS didėja rizika išsivystyti VTE, ypač jauniems asmenims. PS stoka gali būti 3 tipų: I tipo metu sumažėja bendro PS kiekis, fPS kiekis ir aktyvumas, II tipo metu – tik baltymo funkcinis aktyvumas, o III tipo metu – fPS kiekis ir aktyvumas (43). Plazminogeno stoka. Literatūroje nurodoma, kad plazminogeno stoka labiau paplitusi tarp asmenų su VTE nei arterijų TE, tačiau, trūkstant duomenų, kai kurie autoriai neišskiria hipoplazminogenemijos į atskirą trombofiliją sukeliančių priežasčių grupę (8,44).
Disfibrinogenemija. Disfibrinogenemija yra retas įgimtas kraujavimo sutrikimas, kuris komplikuojasi tromboze penktadaliui (21 proc.) pacientų (45).
V Leideno faktorius (FVL). Tai genetinė FV R506Q geno mutacija, sąlygojanti hiperkoaguliaciją. Paplitimas baltaodžių rasėje iki 6 proc., o kitose etninėse grupėse – retas (46,47). Nustatoma penktadaliui pacientų su VTE (48). Apie 90 proc. pacientų su APC–R turi FVL (8). Rizika išsivystyti VTE heterozigotams padidėja 7 kartus, o homozigotams – net iki 80 kartų (47). Daugiau nei 75 proc. nešiotojų VTE neišsivysto. Vis dėlto daugiau nei pusei šio geno mutacijos nešiotojų, turinčių šeiminę VTE anamnezę, VTE pasireiškia iki 65 metų amžiaus (49).
Protrombino (FII) geno mutacija (G–20210–A). Protrombino mutacijos nešiotojai turi didelį protrombino kiekį, viršijantį normos ribas, dėl šios priežasties trombozių rizika didėja. Defektyvaus geno
17 paplitimas siekia 2 proc. baltaodžių grupėje, o kitose etninėse grupėse šis sutrikimas yra retas (50). VTE sergančių pacientų grupėje šios mutacijos dažnis siekia apie 6 proc., o pacientų, kurių artimieji sirgo VTE, grupėje protrombino mutacija nustatoma beveik 18 proc. pacientų (51). Heterozigotams rizika išsivystyti VTE padidėja 2–3 kartus, o heterozigotams, kartu turintiems FVL, rizika išauga iki 20 kartų (52).
3 grupė: mišri arba nežinoma etiologija
Pakitęs fibrinogeno kiekis. Esant hiperfibrinogenemijai, VTE rizika išauga dvigubai (53). Įdomu, jog trūkstant fibrinogeno pacientams gali pasireikšti ir kraujavimas, ir trombozė (54).
Padidėjęs FVIII kiekis. Patogenezė yra neaiški, tačiau manoma, kad defektas gali būti įgimtas (8). Didesnis nei 150 U/l aktyvumas 5 kartus padidina VTE riziką baltaodžiams, 10 kartų – juodaodžiams (55,56). Padidėjęs FVIII kiekis nustatomas ketvirtadaliui sergančių VTE (10). Kaskart FVIII padidėjus 10 U/l, VTE rizika padidėja po 10 proc. (10,57). Taip pat didėja rizika, kad ateityje VTE pasikartos (57).
Padidėjęs FIX arba FXI kiekis: padidina VTE riziką nuo 2 iki 3 kartų. FIX kiekis didėja su amžiumi ir vartojant geriamuosius kontraceptikus (58,59).
Hiperhomocisteinemija: įgimtas padidėjęs homocisteino kiekis atsiranda mutavus genui, todėl nebeprijungiama folio rūgštis ir sumažėja fermento metilentetrahidrafolatreduktazės aktyvumas. Hiperhomocisteinemijos sukeliamos trombozės mechanizmas išlieka nežinomas, nors yra manoma, kad ši patologija skatina lygiųjų raumenų proliferaciją, keičia endotelio azoto oksido ir lipidų metabolizmą (8). Literatūros duomenys dėl hiperhomocisteinemijos įtakos hiperkoaguliacijai prieštaringi (60,61).
Įgytos priežastys
Įgyta AT stoka: nustatytas mažas AT kiekis nereiškia, kad AT stoka įgimta. AT gali sumažėti ir dėl sumažėjusios AT sintezės (kepenų cirozė), padidėjusio AT praradimo (nefrozinis sindromas, baltymų suvartojimo koaguliopatija), padidėjusio AT suvartojimo ar inaktyvavimo (DIK, nudegimai, didelės hematomos, navikų metastazės), vaistų sukelto poveikio (gydymas L–asparaginaze, heparinu) (38).
Įgyta PC ir PS stoka gali išsivystyti kartu su vitamino K trūkumu, sergant kepenų ligomis, vartojant vitamino K antagonistus, esant ūmiam ir lėtiniam uždegimui, autoimuniniams susirgimams. Priešingai PC stokai, PS dažnai ima trūkti nuo pirmųjų nėštumo savaičių ar užsikrėtus ŽIV (62).
FVIII kiekis gali padidėti sergant cukriniu diabetu, padidėjus, fibrinogeno, trigliceridų kiekiui, nėštumo metu, po operacijos, sergant kepenų ar inkstų ligomis. FVIII kiekis taip pat didėja su amžiumi, o vartojant kontraceptines priemones FVIII kiekis nekinta (63).
Įgytas APC–R pasireiškia nėštumo metu, vartojant oralines kontraceptines priemones, esant pakaitinei hormonų terapijai ar padidėjusiam FVIII kiekiui (9).
Įgyta hiperhomocisteinemija pasireiškia esant nesubalansuotai mitybai ar trūkstant folatų, vitaminų B6, B12 (8).
18 Rizikos veiksniai, keičiantys krešėjimo sistemos komponentų kiekius ar jų aktyvumą
HB išsivystymą lemia ne tik krešėjimo sistemos veiksnių pokyčiai, bet nemažai kitų veiksnių, kurių reikšmė yra daugiau ar mažiau žinoma ir patvirtinta. Vieni iš svarbiausių įvardinamų veiksnių yra antsvoris ir tabako rūkymas (64–66). Antsvoris turi įtakos įvairių krešėjimo veiksnių pokyčiams – padidėja FII, FVII, FVIII, plazminogeno aktyvatoriaus slopiklio 1 kiekis, sutrinka fibrinolizė ir todėl gali išsivystyti protrombozinė būklė (64). Turintiems anstvorio žmonėms, proporcingai kūno masės indeksui didėja rizika tiek pirmam, tiek pakartotiniam VTE (65). Tabako rūkymas nors ir yra įvardinamas kaip silpnas VTE rizikos veiksnys, tačiau šis žalingas įprotis gali aktyvuoti krešėjimo procesą ir padidinti fibrinogeno, FVII, FIX ir FX kiekį (66).
VTE riziką didina navikiniai ir uždegiminiai žarnyno procesai, sisteminė raudonoji vilkligė, mieloproliferaciniai sutrikimai, nefrozinis sindromas, ŽIV infekcija, DIK sindromas ir daugelis kitų ligų (11–14,68–72). Sergant šiomis ligomis trombozė išsivysto dėl skirtingų mechanizmų, pavyzdžiui, sergant vėžiu protrombozinė būklė atsiranda, kai krešėjimo sistema aktyvuojasi dėl audinių faktoriaus ekspresijos, fibrinolizinio aktyvumo ir citokinų išsiskyrimo iš navikinių ląstelių bei jų sąveikos su endotelio ląstelėmis bei trombocitais (68). DIK sindromo metu padidėja trombino generacija dėl audinių faktoriaus ekspresijos, antikoaguliacinių baltymų sutrikusios funkcijos ir suintensyvėjusios fibrinolizės (71).
Nėštumas, vartojamos kontraceptinės priemonės, hormonų pakaitinė terapija, operacijos, navikų gydymas chemoterapija, – visi šie rizikos veiksniai taip pat gali sukelti HB (67,73). Nėščiųjų VTE rizika keturis kartus didesnė nei nesilaukiančių moterų. Be to, nėštumo metu fiziologiškai pasireiškia APC–R dėl sumažėjusio PS kiekio, padidėjusios fibrinogeno, FVIII ir von Wilebrando faktorių koncentracijos. Visi šie pokyčiai išlieka bent 2 mėnesius po gimdymo (67). Vartojant kontraceptikus gali sumažėti PS kiekis, padidėti FVII, FVIII kiekiai, suintensyvėti fibrinolizė ir atsirasti APC–R (73).
Amžius ir ilgalaikės (>4 val.) kelionės yra vieni dažniausių ir svarbiausių įgytas TE salygojančių veiksnių (64–66,74,75). Senstant didėja FVIIa, FIXa, FXa, FVIII, fibrinogeno ir D–dimerų (fibrinolizės žymens) kiekiai, kurie yra susiję su padidėjusia trombozės rizika (75), tuo tarpu po ilgos daugiau nei 4 valandas trunkančios kelionės sveikiems asmenims buvo nustatytas krešėjimo ir fibrinolizės suaktyvėjimas, todėl atsiradusi hiperkoaguliacija ir papildomi rizikos faktoriai didina VTE riziką (74).
19
1.1.3. Hiperkoaguliacinių būklių klinikinė išraiška
HB kliniškai pasireiškia TE, kurios gali būti įvairiose žmogaus organizmo vietose ir, žinoma, priklauso nuo etiologinių veiksnių. Trombozė nebūtinai pasireiškia tik vieną kartą gyvenime. Pacientams, nepaisant to, prieš kiek lauko jau buvo pasireiškusi trombozė, visada išlieka rizika, kad VTE pasikartos. Ji siekia 5–7 proc. per metus (76). TE yra vadinamos provokuotomis, kai trombozė pasireiškia dėl žinomo trumpalaikio įgyto rizikos faktoriaus, pavyzdžiui, nėštumo, neseniai atliktos operacijos, arba dėl ilgalaikio rizikos faktoriaus, pavyzdžiui, naviko, senyvo amžiaus. Kitais atvejais, kai trombozę sukėlęs rizikos faktorius nežinomas ir lieka nenustatytas, TE yra vadinamos neprovokuotomis arba idiopatinėmis (77).
Tam tikri klinikiniai požymiai leidžia įtarti ir skirti įgimtas TE nuo įgytų TE. Dėl paciento senyvo amžiaus, ilgalaikės nejudros, kitų gretutinių ligų dažniausiai išsivysto įgytos trombozės, o įgimtoms TE būdingi požymiai (o tuo pačiu ir indikacijos trombofilijų laboratoriniam ištyrimui) yra: idiopatinė trombozė ir/arba trombozė iki 50 metų amžiaus; pirmą kartą pasireiškusi VTE esant šeiminei anamnezei; VTE neįprastose vietose; vis pasikartojanti VTE; VTE nėštumo metu arba moterims, vartojančioms kontraceptines priemones, gydomoms pakaitine hormonų terapija; vaisiui letalios nėštumo komplikacijos dėl neaiškių priežasčių; žinomi tiriamojo paciento šeimos nariai ar artimi giminaičiai, kuriems yra nustatyta įgimta trombofilija (18).
HB klinikinę išraišką – TE – pagal pasireiškimo vietą yra priimta klasifikuoti į arterijų ir venų sistemos TE.
Venų sistemos TE: daugumą venų sistemos TE atvejų sudaro apatinių galūnių GVT ir jos
komplikacija – PE (žr. 1 pav.). Kitų lokalizacijų TE nors yra žymiai retesnės, tačiau jų sukeliamos komplikacijos taip pat sutrikdo organizmo gyvybinius procesus. Smegenų venų arba sinusų trombozė, priklausomai nuo trombo lokalizacijos ir infarkto apimtos srities, gali pasireikšti galvos skausmais, aklumu, traukuliais, afazija, hemipareze ar pažinimo sutrikimais. Pilvo ertmės organų venų trombozei priskiriamos pasaito, vartų ir kepenų (Budd–Chiari sindromas) venų trombozės, kurios išsivysto dėl kitų ligų: onkologinių, mieloproliferacinių, kepenų cirozės, pankreatito arba gali būti kaip komplikacija po operacijų (78). Inkstų venų trombozė – reta komplikacija sunkia inkstų funkcijos nepakankamumo forma sergantiems naujagimiams arba suaugusiems po inksto transplantacijos, kai dėl nefrozinio sindromo į šlapimą patenka AT ir fPS. Tinklainės venų okliuzija nuo kitų venų trombozės skiriasi tuo, jog pirmiausia tai kraujagyslių liga, susijusi su sisteminės aterosklerozės rizikos faktoriais, tokiais kaip hipertenzija, cukrinis diabetas ar hiperlipidemija. Ši trombozės forma pasireiškia 5 iš 1000 vyresnių nei 30 metų amžiaus asmenų. Viršutinių galūnių GVT gali būti pirminė (nežinomos kilmės) arba antrinė, kuria serga onkologiniai, kateterizuoti pacientai arba ligoniai, naudojantys širdies veiklą stimuliuojančius prietaisus.
20
Arterijų sistemos TE: lyginant su VTE, arterinėje sistemoje ir širdyje trombinės masės susidaro
dėl kitokios anatominės struktūros ir veikiant visai kitokiems patogeneziniams mechanizmams ir veiksniams. Sergant ateroskleroze, dėl aterosklerozinių plokštelių plyšimo susidarę trombai keliaudami pagal kraujo tėkmę įstringa arterijų spindyje, jį susiaurina ir sukelia miokardo infarktą, miego arterijos insultą, periferinių kraujagyslių ligą, lėtinę mezenterinę (pasaito arterijų) išemiją, tinklainės arterijos okliuziją. Aterosklerozės metu krešėjimo procesas suintensyvėja, pasigamina daugiau trombino, kuris savo ruožtu skatina uždegiminį procesą.
Širdies ertmėse trombai, dažniausiai dėl prieširdžių virpėjimo, susidaro kairiajame prieširdyje, kartais kairiajame skilvelyje ir retais atvejais ant mitralinio vožtuvo. Tačiau gali pasireikšti ir paradoksinė širdies embolija, kai trombai patenka iš veninės sistemos (79). Pagrindiniai veiksniai, jų ryšys su TE pasireiškimo vieta ir pobūdžiu pateikiami 2 lentelėje.
1 pav. VTE lokalizacija žmogaus organizme, skliaustuose pasireiškimas per metus 100 000 gyventojų (pagal 20)
21
2 lentelė. VTE ir arterijų TE veiksniai
VTE ARTERIJŲ TE ir VTE
Įgimti veiksniai FVL Protrombinas G20210A PC ir PS stoka AT stoka
Padidėjęs FVIII aktyvumas
Homocistinurija
Hiperhomocisteinemija Disfibrinogenemija
Įgyti veiksniai Amžius
Buvusios trombozės Imobilizacija
Operacijos
Nėštumas ir pogimdyvinis tarpsnis Hospitalizacija APC–R Navikai Antifosfolipidinis sindromas Hormonų terapija Hiperhomocisteinemija
Paroksizminė naktinė hemoglobinurija
1.2. Kraujo krešėjimo sistema ir hiperkoaguliacinių būklių mechanizmai
Kraujo krešėjimas – fiziologinis procesas, kurio metu pažeidimo srityje suformuojant kraujo krešulį yra stabdomas kraujavimas kartu išlaikant normalią organizmo kraujo apykaitą. Kraujagysles išklojantis endotelis palaiko antikoaguliantinį paviršių, todėl tekėdamas kraujas išlieka skystas. Vos tik pažeidus kraujagyslę į kraują išsiskiria subendotelinio matrikso komponentai, kurie aktyvina krešulio formavimąsi iš trombocitų ir fibrino. Šis procesas griežtai valdomas, kad po pažaidos prasidėtų iškart ir būtų lokalizuotas toje srityje.
Yra skiriami du pagrindiniai hemostazės komponentai. Pirminė hemostazė apima trombocitų adheziją, jų pačių agregaciją ir trombocitų kamščio susiformavimą, dalyvaujant ir kraujagysliniams veiksniams. Antrinės hemostazės metu vykstant proteolitinei krešėjimo kaskadai susiformuoja netirpus fibrino tinklas, kuris, apraizgydamas pirminės hemostazės metu susidariusį trombocitų kamštį, sustiprina ir stabilizuoja kraujo krešulį. Šie du procesai vyksta tuo pačiu metu ir yra mechaniškai persipynę. Fibrinolizė taip pat užima svarbią vietą hemostazės procese. Keletas antikoaguliacinių mechanizmų valdo šias sistemas, palaikant normalią kraujotaką ir susidarant pažaidai proporcingam kraujo krešuliui. Išlaikyta pusiausvyra tarp prokoaguliacinių ir antikoaguliacinių sistemų yra svarbi tinkamai hemostazei vykti ir padeda išvengti patologinio kraujavimo arba trombozės (80,81). Moksliniai–praktiniai tyrimai yra labiau nukreipti į HB antrinės hemostazės mechanizmus, kurie yra susiję su krešėjimo sistemos koaguliaciniais ir antikoaguliaciniais baltymais. Tuo tarpu pirminės hemostazės mechanizmai yra labai priklausomi nuo kraujagyslinių veiksnių, kuriems vertinti reikalingi ne laboratoriniai metodai, o eksperimentiniai laboratoriniai modeliai.
22
1.2.1. Antrinė hemostazė
Antrinės hemostazės krešėjimo kaskada apima tris pagrindinius žingsnius: A) Po kraujagyslių sienelės pažeidimo nuosekliai vyksta cheminės krešėjimo faktorių reakcijos, kurių metu susidaro aktyvių medžiagų kompleksas, aktyvinantis protrombiną. B) Protrombiną aktyvinantis kompleksas (PAK) katalizuoja protrombino virsmą trombinu. C) Trombinas atlieka fermentinę funkciją ir paverčia fibrinogeną į fibrino skaidulas, kuriose įstringa trombocitai, kraujo ląstelės ir plazma – susiformuoja krešulys.
A. PAK susiformavimas. PAK gali susidaryti dviem atskirais keliais, nors iš tikrųjų abu jie glaudžiai susiję: išorinis krešėjimo kaskados kelias prasideda po kraujagyslių ar aplinkinių audinių traumos; vidinis krešėjimo kaskados kelias prasideda dėl kraujo pokyčių arba atsiradus kontaktui su kolagenu. Tiek išoriniame, tiek vidiniame keliuose dalyvauja plazmos baltymai, dar vadinami kraujo krešėjimo faktoriais. Dauguma jų cirkuliuoja kaip neaktyvūs zimogenai, o virtę aktyviomis formomis katalizuoja krešėjimo reakcijų kaskadą.
Išorinis kelias apima šias reakcijas (žr. 2 pav.):
1. Audinių faktoriaus atpalaidavimas. Po traumos išsiskiria keletas faktorių, vadinamų audinių faktoriumi arba audinių tromboplastinu, sudarytų iš audinių membranų fosfolipidų lipoproteinų komplekso, kuris atlieka proteolizinę fermentinę funkciją.
2. FXa susidarymas: audinių faktoriaus lipoproteinų kompleksas prisijungia FVII ir, esant kalcio jonų, fermentiškai aktyvina FX į FXa.
3. PAK susidarymas. FXa nedelsiant susijungia su FV ir su audinių faktoriaus arba iš trombocitų išsiskiriančiais fosfolipidais, suformuodamas PAK. Per keletą sekundžių dalyvaujant kalcio jonams protrombinas skeliamas į trombiną. Iš pradžių FV, esantis PAK, yra neaktyvus, tačiau vos tik pradeda formuotis trombinas, jis preoteolitiškai aktyvina FV, tokiu būdu stiprindamas PAK veikimą.
23
2 pav. Išorinis (nuo 1 iki 3) ir vidinis (nuo 4 iki 8) kraujo krešėjimo kaskados keliai (pagal 82).
Vidinis kelias apima šias reakcijas (žr. 2 pav. ):
4. Pažeidus kraujo ląsteles ar kraujui kontaktuojant su kraujagyslių sienelių kolagenu yra aktyvinamas FXII ir iš trombocitų išsiskiria fosfolipidai, kuriuose yra lipoproteino, vadinamo trombocitų faktoriumi 3, kuris irgi prisideda prie sekančių krešėjimo kaskados reakcijų.
5. FXI aktyvina FXIIa. Šiai fermentinei reakcijai reikalingas didelio molekulio svorio kininogenas, o prekalikreinas šią reakciją pagreitina.
6. FXIa savo ruožtu aktyvina FIX.
7. FIXa kartu su FVIIIa, trombocitų fosfolipidais ir trombocitų faktoriumi 3, aktyvina FX.
8. Galiausiai FXa susijungia su FV ir fosfolipidais suformuodami PAK – šis vidinio kelio etapas sutampa su išorinio kelio paskutiniu etapu.
B. Protrombino virsmas trombinu. Susidaręs PAK esant pakankamam kalcio jonų kiekiui paverčia protrombiną trombinu. Per kitas 10–15 sekundžių trombinas polimerizuoja fibrinogeno molekules į fibrino gijas. Taigi, krešėjimo greitį labiau lemia laikas, per kurį susiformuoja PAK, negu po to vykstančios reakcijos. Trombocitai irgi svarbūs verčiant protrombiną trombinu, nes didžioji dalis protrombino pirmiausiai prisijungia prie protrombino receptorių, esančių ant pažaidos vietoje prisitvirtinusių trombocitų.
24 C. Fibrinogeno virsmas fibrinu – krešulio susiformavimas. Tik nedidelė fibrinogeno dalis patenka iš kraujagyslių į tarplastelinį skystį dėl didelio baltymo molekulinio svorio (molekulinė masė 340 000). Įprastai tarpląstelinis skystis nekreša, tačiau šis reiškinys gali vykti tais atvejais, kai padidėja kapiliarų laidumas ir fibrinogeno patenka į tarpląstelinį skystį (82).
1.2.2. Prokoaguliaciniai mechanizmai, susiję su pagrindiniais krešėjimo sistemos
faktoriais
Per pastarąsias dvi dekadas buvo atrasta nemažai naujų VTE išsivystymo mechanizmų ir vis daugėja įrodymų, jog svarbią reikšmę TE turi ne tik LA, APC–R, padidėjusi plazmos homocisteino koncentracija, bet ir padidėję krešėjimo faktorių kiekiai. Pagrindiniai krešėjimo faktoriai ir jų funkcijos yra nurodytos 3 lentelėje. FII, FVIII, FIX ir FXI kiekio padidėjimas siejamas su didesne VTE rizika (56– 59,83,84), o FV, FVII ir vWF kiekio padidėjimas – su arterijų TE (83). Dėl šių priežasčių vieni autoriai siūlo plėsti įprastą trombofilijų ištyrimo spektrą įtraukiant minėtus krešėjimo faktorius kaip trombozių rizikos veiksnius, tačiau kiti autoriai tokių rekomendacijų nepateikia (18,43,83,84,92,95).
3 lentelė. Krešėjimo sistemos faktorių nomenklatūra, jų funkcijos ir ryšys su VTE rizika (pagal 82,83). Krešėjimo faktorius Krešėjimo faktoriaus pavadinimas Funkcija Galimybių santykis (95 proc. pasikliautinumo intervalas)
FI Fibrinogenas Dalyvauja krešulio formavime 4,3 (1,7–10,5)
FII Protrombinas FI, FV, FVII, FVIII, FXI, FXIII, PC, trombocitų aktyvinimas 2,1 (1,1–3,2)
FIII Audinių faktorius FVIIIa kofaktorius Nėra duomenų
FIV Kalcio jonai Reikalingi krešėjimo faktorių sąveikai su
fosfolipidais
Nėra duomenų
FV Proakcelerinas FX–protrombinazės komplekso kofaktorius 1,3 (0,9–1,8)
FVII Prokonvertinas FIX, FX aktyvinimas 0,8 (0,4–1,5)
FVIII Antihemofilinis faktorius A FIX–tenazės komplekso kofaktorius 4,8 (2,3–10,0)
FIX Antihemofilinis faktorius B FX aktyvinimas: suformuoja tenazės komplesą kartu su FVIII 2,3 (1,6–3,5)
FX Stuarto-Proverio faktorius Protrombinazės komplekso su FV formavimas; FII aktyvinimas
1,6 (1,1–2,4)
FXI Plazmos tromboplastino
pagalbininkas FIX aktyvinimas
2,2 (1,5–3,2)
FXII Hagemano faktorius FXI, FVII ir prekalikreino aktyvinimas 1,2 (0,6–2,4)
FXIII Fibriną stabilizuojantis
faktorius
Skersinių jungčių tarp fibrino monomerų sudarymas
25 Vienas reikšmingiausių TE riziką didinančių veiksnių yra FVIII kiekio padidėjimas (83,85). FVIII kiekio padidėjimas gali būti laikinas, pvz. dėl tokių priežasčių, kaip ūmus uždegimas. Tačiau tyrimais nustatyta, kad FVIII kiekio padidėjimas gali būti paveldimas ir daliai pacientų patvirtintas ryšys su vWF ir su ne O kraujo grupe (pagal ABO sistemą). Tiek FVIII kiekio padidėjimas, tiek ir minėtas FVIII, kraujo grupės ir vWF derinys yra rizikos veiksniai pirmam GVT epizodui. Negana to, pacientai, kuriems nustatytas padidėjęs FVIII kiekis keleto mėnesių laikotarpiu tarp pirmo ir paskutinio VTE epizodų, pasižymi didesne rizika pakartotinei VTE lyginant su tais pacientais, kurių FVIII kiekis nepadidėjęs (83,85). Nors tikslus FVIII trombozės rizikos mechanizmas nėra žinomas, tikėtina, jog FVIII padidina FIXa kofaktoriaus aktyvumą, kuris savo ruožtu skatina FXa ir trombino formavimąsi. Dėl to ne tik susidaro daugiau fibrino, bet ir gali būti slopinama fibrinolizė, padidėti FVa rezistentiškumas PCa (84). Svarbu paminėti ir kitą svarbų VTE rizikos veiksnį – FI (fibrinogeną). Klauso metodu pacietams nustačius padidėjusią FI koncentraciją ir paneigus ūmios fazės reakcijų buvimą, nustatyta beveik 3 kartus didesnė GVT rizika nei pacientams, kurių FI koncentracija nepadidėjusi. Ši rizika vyrų ir moterų tarpe nesiskiria (83,84).
Didėjant FIX, FXI kiekiui dėl krešėjimo kaskados aktyvinimo ir fibrino susidarymo (FXI dar ir apsaugo fibriną nuo fibrinolizės) proporcingai didėja rizika įvykti pirmajam TE epizodui. Rizika pakartotinei TE didėja esant FIX, bet ne FIX, kiekio padidėjimui, tačiau literatūros duomenų tam patvirtinti yra per mažai ir dėl šių faktorių tyrimo tikslingumo didesnių diskusijų nekyla (83,84).
1.2.3. Antikoaguliaciniai mechanizmai
Yra skiriamos dvi pagrindinės antikoaguliacinių mechanizmų grupės: antikoaguliacinė sistema stabdo fibrino formavimąsi, o fibrinolizinė sistema „ištirpina“ jau susiformavusius krešulius. Prokoaguliacinių faktorių „išplovimas“ iš pažaidos vietos bei polimerizuoto fibrino serino proteazių adsorbcija priskiriami nespecifiniams antikoaguliaciniams mechanizmams.
Antitrombino–glikozaminoglikanų kelias. Kepenyse sintetinamas glikoproteinas AT yra pagrindinis fiziologinis trombino slopiklis. Kiti trombino slopikliai yra heparino kofaktorius II, α2 makroglobulinas ir α1 antitripsinas. AT labiausiai slopina trombiną ir FXa, mažiau FIXa ir FVIIa. Fermentinis AT aktyvumas išauga bent 1000 kartų esant heparino. Vis dėlto, in vivo endogeninio heparino koncentracija per maža, vietoje jo AT aktyvina kitas ant endotelio ląstelių paviršiaus randamas junginys glikozaminoglikanas heparansulfatas. AT pasižymi ir priešuždegiminiu poveikiu, kadangi slopina uždegiminių citokinų interleukino (IL) 6 ir IL–8 išsiskyrimą (86).
26 Baltymo C kelias. FVa ir FVIIIa yra stiprūs prokoaguliantai. FVIIIa kartu su FIXa formuoja tenazę, kuri aktyvina FX, o FVa susijungęs su FXa suformuoja protrombinazę, kuri protrombiną paverčia trombinu. Jų aktyvumą slopina PC kelias, kurį sudaro keturi pagrindiniai elementai:
PC yra kepenyse sintetinama nuo vitamino K priklausoma serino proteazė, kurią trombinas paverčia į aktyvintą baltymą C (PCa). Šis pasižymi stipriu antikoaguliaciniu poveikiu degraduodamas FVa ir FVIIIa (kartu su kofaktoriais PS ir fosfolipidais), jam taip pat būdingas priešuždegiminės ir anti– apoptozinės savybės. PCa yra slopinamas PC slopiklių, α2 makroglobulino ir α1 antitripsino.
Trombomodulinas (TM) yra transmembraninis receptorius, išsidėstęs ant endotelio ląstelių. TM susijungia su trombinu. Pats trombinas aktyvina PC labai lėtai, o susiformavus MT–trombino kompleksui PCa susidarymas labai pagreitėja, trombinas tampa efektyviu antikoaguliantu, neleisdamas formuotis trombams sveiko endotelio vietose.
Endotelio baltymo C receptorius (EPCR) yra dar vienas transmembraninis endotelio ląstelių receptorius, kuris padeda aktyvinti PC. EPCR susijungia su PC ir pateikia jį TM–trombino kompleksui optimaliam molekulės skėlimui, tai yra PCa susidarymui.
PS yra hepatocituose ir endotelio ląstelėse siintetinamas nuo vitamino K priklausomas glikoproteinas. Jis yra PCa kofaktorius inaktyvinant FVa ir FVIIIa. Plazmoje randamas keliose formose: laisvas (40 proc.), sudaręs kompleksus (60 proc.) su C4b surišančiu baltymu (C4b–BP). Tik laisva forma pasižymi antikoaguliaciniu poveikiu. Padaugėjus C4b–BP, PS aktyvumas mažėja. PS pasižymi ir nuo PCa nepriklausančia antikoaguliacine savybe tiesiogiai ir grįžtamai slopinti protrombinazės (FVa–FXa) kompleksą (87).
Audinių faktoriaus kelio slopiklis (TFPI) yra endotelio ląstelių gaminamas, ant jų ekspresuojamas ir į plazmą išskiriamas polipeptidas. TFPI yra pagrindinis audinių faktoriaus kelio slipikllis. Pirmiausiai TFPI prisijungia prie FXa suformuodamas TFPI–FXa kompleksą. Šis prisijungia prie FT–FVIIa ir suformuoja TFPI–FXa–TF–FVIIa kompleksą, kuriame slopinami FVIIa ir Xa. PS nepriklauomai nuo PCa stiprina sąveiką tarp TFPI ir FXa esant kalcio jonų ir fosfolipidų (88).
Nuo baltymo Z priklausantis proteazių slopiklis (PZI) yra kepenyse sintetinamas plazmos fermentas, kuris, esant kalcio jonų ir kofaktoriui baltymui Z (nuo vitamino K priklausomas glikoproteinas), slopina FXa. PZI slopina ir FIXa bei XIa, tačiau šiam mechanizmui baltymas Z nebūtinas (89).
Fibrinolizinė sistema
Plazminogenas ir plazminas. Plazminas yra pagrindinis fibrinolizinės sitemos fermentas, sintetinamas kepenyse ir išskiriamas į kraujotakaą kaip profermentas plazminogenas. Pastarasis negali
27 skelti fibrino, bet turi jam afiniškumą, todėl yra įterpiamas į krešulį. Dviejų tipų plazminogeno aktyvintojai – audinių (t–PA) ir urokinazės (u–PA) – paverčia plazminogeną į serino proteazę plazminą, kuris atlieka šias funkcijas: skelia fibriną į tirpius fibrino degradacijos produktus ir išskiria daugiau aktyvių t–PA ir u–PA formų, tokiu būdu skatindamas savo paties gamybą.
Fibrinolizės slopikliai. Plazminas geba per trumpą laiką visiškai suskaldyti visą fibriną organizme, todėl fibrinolitinis aktyvumas turi būti griežtai valdomas. Fibrinolizė stabdoma šiais būdais: plazminogeno aktyvintojo slipiklis (PAI) neleidžia plazminogenui virsti plazminu; cirkuliuojančios medžiagos tiesiogiai slopina plazminą; trombino aktyvintos fibrinolizės slopiklis (TAFI) apsaugo fibriną ir jo nebeskaldo plazminas (86).
1.3. Laboratorinė trombofilijų diagnostika
Polinkį į TE gali lemti tiek vietiniai individo veiksniai (kraujagyslių sienelės pažeidimai, aterosklerotinių plokštelių formavimasis, kraujo stazė), tiek sisteminiai viso kraujo pokyčiai. Funkciniais laboratoriniais krešėjimo sistemos tyrimais įprastai nustatomi tik sisteminiai kraujo sudėties komponentų pokyčiai. Yra keletas būdų hiperkoaguliacijos procesui įvertinti. Pirma, galima nustatyti priežastinius TE veiksnius – išmatuoti krešėjimo faktorių arba krešėjimo slopiklių koncentracijas. Nors šie tyrimai yra ypač svarbūs, tačiau susiduriama su tyrimo (sudėtinga išmatuoti labai mažas koncentracijas) ir informatyvumo (negalima įvertinti bendros trombų susidarymo tendencijos) problemomis. Antra, plačiai taikomo molekulinių trombozės žymenų – D–dimerų, fibrinopeptidų, tirpių fibrino monomerų, trombino–AT kompleksų ar protrombino fragmentų – ištyrimo pagrindinis trūkumas yra tas, kad nustatomi aktyvios arba jau buvusios trombozės pėdsakai (90). Galiausiai, hiperkoaguliacijai įvertinti galima atlikti tyrimus artimomis in vivo sąlygomis. Įprasti krešėjimo sistemos sutrikimų atrankai skirti tyrimai SPA/TNS ir ADTL visų pirma yra jautrūs krešėjimo faktorių stokai, dėl to šių tyrimų rezultatai (sekundėmis) padidėja. Krešėjimo laiko sutrumpėjimas yra retas reiškinys ir dažniausiai yra siejamas su procesais iki tyrimo, todėl netinka HB vertinti (91). Vienas iš galimų šios problemos sprendimų yra globalūs, arba kitaip integruoti, hemostazės tyrimai, kuriais tiksliau įvertinamas bendras hemostatinis potencialas. Šiai grupei priskiriami trombino generacijos, tromboelastografijos ir nauji trombodinamikos bei tėkmės perfuzijos kamerų (angl. flow perfusion chambers) tyrimai (90). Dar viena tyrimų grupė – genetiniai polimerazės grandininės reakcijos (PGR) principu atliekami FVL ir protrombino geno G20210 mutacijų tyrimai. Toliau bus apžvelgiamos pagrindinių specializuotų krešėjimo sistemos tyrimų laboratorinės charakteristikos.
28
1.3.1. Antitrombinas
Glikoproteino AT, kuris yra sintetinamas kepenų parenchimoje (bet sintezė nepriklauso nuo vitamino K), pagrindinė funkcija yra inaktyvinti FIIa ir FXa, taip pat FIXa, FXIa ir FXIIa. Laboratorijoje chromogeniniais metodais tiriamas AT funkcinis aktyvumas (rekomenduojami chromogeniniai metodai pagrįsti FXa slopinimu, nes jiems netrukdo kiti plazmoje esantys trombino slopikliai), o imunofermentiniais arba imunoturbidimetriniais metodais – antigeno kiekis (15,92). Tiriant HB svarbi AT stoka, kuri nustatoma esant funkciniam AT aktyvumo sumažėjimui. AT stokos tipas gali būti nustatomas derinant funkcinius ir antigeno tyrimus, tačiau žinoti tipą kliniškai nėra būtina, nes visų tipų gydymas antikoaguliantais nesiskiria. AT kiekis sumažėja gydant vaistais (heparinas, L–asparaginazė), sumažėjus sintezei (kepenų ligos), padidėjus AT netekimui (nefrozinis sindromas, DIK, sepsis, kraujagyslių ligos), moterims (nėštumo metu, geriant kontraceptines priemones) (92).
1.3.2. Baltymas C
Nustatant PC pirmiausia matuojamas baltymo aktyvumas funkciniais chromogeniniais arba krešulio susidarymu pagrįstais tyrimais. Esant PC aktyvumo sumažėjimui, imunologiniais tyrimais nustatomas antigeno kiekis ir įvertinama ar PC stoka kiekybinė (I tipas, sumažėjęs aktyvumas ir antigeno kiekis), ar kokybinė (II tipas, sumažėjęs aktyvumas, o antigeno kiekis normalus). Krešulio susidarymu pagrįsti PC tyrimai leidžia aptikti abu tipus, bet gali būti gaunamos tiek klaidingai padidėjusios reikšmės vartojant antikoaguliantus, esant LA ar FVL, tiek ir klaidingai sumažėjusios reikšmės, kai padidėja FVIII kiekis arba yra sumažėjęs PS kiekis. Chromogeniniai tyrimai, nors yra mažiau jautresni interferencinėms medžiagoms, gali aptikti tik IIa tipo baltymo defektus, o retesni IIb tipo sutrikimai gali likti neaptikti. PC sintezė kepenyse priklauso nuo vitamino K, todėl esant kepenų disfunkcijai, vitamino K stokai, vartojant varfariną PC sumažėja greičiau, palyginus su AT ir PS, dėl trumpo gyvavimo pusperiodžio. PC kiekiai taip pat yra nustatomi mažesni naujagimiams, DIK, nefrozinio sindromo atvejais, o didesni – nėštumo metu (15,92).
29
1.3.3. Baltymas S
Aktyvi laisva, nesurišta su C4bBP, kepenyse sintetinamo ir nuo vitamino K priklausomo glikoproteino PS forma yra kofaktorius PC veikimui ir dukart paspartina FVa, FVIIIa proteolizę. Laboratorijoje PS nustatomas krešulio susidarymu pagrįstais metodais (funkciniai tyrimai), imunologiniais ir imunoturbidimetriniais metodais panaudojant monokloninius antikūnus (fPS ir bendro PS antigeniniai tyrimai). Funkciniai tyrimai yra jautrūs visoms PS stokos tipams, tačiau jie nėra specifiški, ne visada standartizuoti, tyrimui trukdo APC–R, LA, padidėjęs FVIII kiekis, todėl atrankai rekomenduojama atlikti antigeninius PS tyrimus (išlieka tikimybė neaptikti II tipo PS stokos), pirmenybę teikiant fPS kiekio nustatymui. PS sumažėja dėl tų pačių priežasčių kaip ir PC, taip pat dėl padidėjusio FVIII kiekio, infekcinių ir autoimuninių ligų, nėštumo metu (15,62,92).
1.3.4. Rezistentiškumas aktyvintam baltymui C
Neaktyvaus kepenyse susintetinto PC aktyvinimui reikalinga sąveika su trombino, trombomodulino ir endotelio PC receptoriaus kompleksu. PCa esant kofaktoriui PS valdo trombino susidarymą suardydamas FVa ir FVIIIa. PCa šią funkciją atlieka silpniau esant APC–R. APC–R ir FVL laboratorinė diagnostika apima funkcinius tyrimus ir FVL genotipavimą. Įgimtą ir įgytą APC–R padeda nustatyti funkcinis tyrimas, pagrįstas ADTL pailgėjimu dėl pridėto PCa, kuris suardo FVa ir FVIIIa. Yra skaičiuojamas ADTL santykis paciento ir normalioje plazmoje prieš pridedant PCa ir pridėjus PCa. APC– R santykis gali klaidingai sumažėti dėl FVIII padidėjimo, sumažėjusio PS kiekio, ADTL ilginančių priežasčių (antikoaguliantų vartojimo, kepenų disfunkcijos). Taikant ADTL tyrimo modifikaciją – paciento plazmą skiedžiant plazma be FV – pasiekiamas didesnis tyrimo jautrumas ir specifiškumas, tokiu atveju tyrimui mažiau įtakos turi antikoaguliantų vartojimas, aktyvi trombozė, uždegiminės ligos. Pastarieji veiksniai neturi įtakos FVL nustatymui PGR metodais – jais patvirtinami funkciniais tyrimais gauti ribiniai ir teigiami rezultatai ir tik šiais metodais (ne funkciniais) nustatoma, ar FVL yra APC–R priežastis (15,92).
30
1.3.5. Krešėjimo faktorius VIII
Padidėjęs FVIII kiekis yra veiksnys, didinantis trombofilijos riziką. FVIII kiekis didėja nėštumo metu, daugėjant estrogenų, ūmių fazių reakcijų metu. HB diagnostikai tinkami tiek dažniausiai naudojami FVIII aktyvumo koagulometriniai tyrimai, tiek rečiau naudojami chromogeniniai metodai, tiek ir FVIII antigeno imunofermentiniai tyrimai (ELISA). FVIII turėtų būtų tiriamas ne anksčiau kaip po pusmečio nuo aktyvaus trombozės epizodo, praėjus bent 6 savaitėms po gimdymo ir pakartotinai tyrimas atliekamas 3–6 mėnesių laikotarpiu (15).
1.3.6. Lupus antikoaguliantas ir antikūnai prieš fosfolipiną
Pati dažniausia įgytos trombofilijos priežastis, didinanti riziką VTE ir arterijų TE, yra antifosfolipidinis sindromas, kuriuo sergant yra nustatomi autoantikūnai prieš fosfolipidinių baltymų kompleksus (antikūnai prieš fosfolipiną, anti–FL). Anti–FL, kurie kartais vadinami Lupus antikoguliantu (LA), yra labai heterogeniškų antikūnų grupė, nukreiptų prieš kardiolipiną, β2 glikoproteiną 1 (anti– β2GP1), ląstelių membranos fosfatidilseriną (93). Laboratoriniai antifosfolipidinio sindromo diagnostiniai kriterijai apima bent vieno iš tyrimų (LA arba IgM/IgG klasės antikūnų prieš kardiolipiną, arba IgM/IgG klasės anti–β2GP1) gautus teigiamus rezultatus bent 12 savaičių intervalu. LA laboratorinė diagnostika iki šių dienų išlieka didžiuliu iššūkiu tiek klinicistams, tiek ir laboratorijai. Klaidingai neigiamai LA gali būti nustatoma dėl FVIII padidėjimo, vartojantiems vitamino K antagonistus (tokius pacientus dėl LA galima tirti po 1–2 savaičių po paskutinės vaistų dozės ir kai TNS pasiekia <1,5 reikšmę). Prieš tiriant rekomenduojama atrinkti tuos pacientus, kuriems TE pasireiškia vyresniame amžiuje; nustatomas ADTL pailgėjimas besimptomiams pacientams, VTE pasireiškus jauname amžiuje ar esant pakartotiniams persileidimams; taip pat tirti dėl LA pacientus su VTE iki 50 metų amžiaus, esant trombozėms neįprastose vietose, nėštumo komplikacijoms (93).
Anti–β2GP1 tyrimu nustatomi antikūnai atpažįsta fosfolipido kardiolipino kompleksą, susijungusį su baltymu β2GP1. Komerciniais kietos fazės ELISA tyrimais yra nustatomi IgM ir IgG klasių antikūnai prieš kardiolipiną (metodas jautrus) ir anti–β2GP1 (metodas specifiškesnis, nes antikūnų prieš kardiolipiną antigeninis taikinys yra β2GP1 ir kardiolipino kompleksas). Anti–FL tyrimų maksimaliam jautrumui ir specifiškumui pasiekti rekomenduojama nustatyti tiek antikūnus prieš kardiolipiną, tiek anti– β2GP1. Antikūnų prieš kardiolipiną kiekis gali būti klaidingai padidėjęs dėl didelės reumatoidinio faktoriaus ar krioglobulinų koncentracijos (15,93).
31
1.3.7. Laboratorinių tyrimų atlikimo pacientams su TE poreikis ir tikslingumas
Įrodymais pagristos rekomendacijos nurodo laboratorinį trombofilijų ištyrimą skirti ne visiems pacientams, tai yra ne rutiniškai, o tik daliai, tikslingai atrinktų pacientų (94,95). Yra nurodoma, kad turi būti tiriami visi rizikos faktoriai, nes neretai tam pačiam pacientui yra nustatomas ne vienas, o keli rizikos veiksniai. Tačiau ištyrimas gali būti keičiamas atsižvelgiant į individualias sąlygas, pavyzdžiui, neradus didžiausią TE riziką lemiančių veiksnių, gali būti tiriami mažesnės rizikos veiksniai (disfibrinogenemija, FIX, FXI ir kiti) (95). Prieš pradedant paciento ištyrimą yra svarbu įvertinti tokius veiksnius kaip tyrimo paskyrimo laikas, paciento amžius, lytis, kepenų funkcijos, taikomas gydymas, esamas nėštumas, ūmios fazės reakcijos, – visi šie veiksniai gali iškreipti laboratorinių tyrimų rezultatus. Bene svarbiausi veiksniai, keičiantys rezultatų interpretaciją, yra tyrimo paskyrimo laikas (trombozės epizodas) ir taikomas gydymas (antikoaguliantais heparinu ar varfarinu), todėl laboratorinį HB ištyrimą reikia atidėti 3–6 mėnesiams po ūmios trombozės epizodo, o baigus gydymą varfarinu – bent 3–4 savaitėms (95).
Vis dėlto, tyrimai rodo, kad didelė dalis klinicistų nepaiso šių rekomendacijų ir tiria neatrinktus pacientus iškart po ūmaus provokuotos VTE epizodo (pavyzdžiui, po operacijos, traumos, ilgalaikės nejudros) arba taikomo gydymo antikoaguliantais metu, o šie veiksniai, kaip buvo minėta, gali iškreipti tyrimų rezultatus. Ir priešingai, daugeliu atvejų patvirtinamieji tyrimai nėra atliekami, todėl pacientams nepatikslinama diagnozė, o nemotyvuotas pernelyg ilgos trukmės gydymas antikoaguliantais didina kraujavimo riziką ir medicinines išlaidas (94–96).
32
2. TYRIMŲ METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimų metodika
Darbo objektas: LSMU ligoninės Kauno klinikose dėl hiperkoaguliacinių būklių tirti pacientai. Atranka ir tyrimo būdas: tyrimui buvo atrinkti pacientai, kurie LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje buvo tirti dėl hiperkoaguliacijos, atliekant specializuotus (antikoaguliacinių baltymų ir prokoaguliacinių veiksnių – krešėjimo faktorių) krešėjimo sistemos tyrimus bei autoantikūnų, susijusių su hiperkoaguliacinėmis būklėmis, tyrimai.
Tyrimo metu buvo vertinami pacientų klinikiniai, demografiniai bei hemostazės laboratorinių tyrimų duomenys.
2.2. Tyrimo metodai
Tiriamiesiems buvo atliekami autoantikūnų tyrimai: anti–β2GP1 IgG, anti–β2GP1 IgM, anti– Kard IgG, anti–Kard IgM ir specializuoti kraujo krešėjimo sistemos tyrimai: FVIII, FXII, APC–R, AT, PC, fPS. Autoantikūnų tyrimams atlikti buvo naudojamas automatinis imunofermentinis ELISA analizatorius Gemini (Stratec biomedical, Vokietija), o kraujo krešėjimo sistemos tyrimai buvo atliekami analizatoriumi STA COMPACT MAX (Diagnostica Stago, Prancūzija).
2.2.1. Imunofermentinis autoantikūnų nustatymas
Ėminiai ir tiriamųjų mėginių ruošimas
Veninis kraujas buvo imamas į vakuuminius mėgintuvėlius be priedų. Kraujo serumui atskirti nuo krešulio ėminiai buvo centrifuguojami 15 minučių esant 1500 g. Kraujo serumo mėginiai buvo laikomi 2–8 °C temperatūroje iki 3 dienų. Jei per 3 dienas tyrimai nebuvo atlikti, serumas buvo užšaldytas ir laikomas –20 °C iki tyrimo atlikimo.
Naudoti reagentai
— Reagentų rinkinys AESKULISA Cardiolipin–GM (AESKU.DIAGNOSTICS, Vokietija); — Reagentų rinkinys AESKULISA ß2–Glyco–GM (AESKU.DIAGNOSTICS, Vokietija). Kiekvieno reagentų rinkinio sudėtyje yra:
