LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS
FAKULTETAS
GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA
K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija
Gintar÷ Navakauskait÷
Galvijų leptino geno įvairov÷ ir įtaka produktyvumui
Magistro darbas
Darbo vadovas:
Asist. Natalija Krasnopiorova
Magistro darbas atliktas 2008 – 2010 metais Lietuvos veterinarijos akademijoje, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Magistro darbą paruoš÷: Gintar÷ Navakauskait÷
(v., pavard÷) (parašas)
Magistro darbo vadovas: Asist. Natalija Krasnopiorova (LVA, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedra)
(parašas)
Recenzentas:
TURINYS
SĄNTRUPŲ SĄRAŠAS ... 4
ĮVADAS ... 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 7
1.1. MOLEKULINö GENETIKA MöSINIŲ GALVIJŲ VEISIME ... 7
1.2. MIOSTATINO GENO MUTACIJOS IR JŲ FENOTIPINIAI POVEIKIAI ... 7
1.3. AUGIMO HORMONO GENO (GH) POLIMORFIZMAS (L/V) ĮTAKA AUGIMUI IR KARKASO SUDöČIAI ... 8
1.4. KITI KOKYBINIŲ POŽYMIŲ LOKUSŲ GENAI KANDIDATAI ... 9
1.5. CHROMOSOMŲ REGIONŲ, TURINČIŲ KOKYBINIŲ POŽYMIŲ LOKUSUS, PAIEŠKA ... 10
1.6. LEPTINO GENAS, JO POVEIKIS ORGANIZMUI ... 11
1.6.1. LEPTINO GENO ĮTAKA ENERGIJOS BALANSUI, PIENO IŠEIGAI, GYVAM SVORIUI ... 12
1.6.2. LEPTINO GENO ĮTAKA RIEBALŲ KIEKIUI (NUTUKIMUI) ... 13
1.6.3. LEPTINO POVEIKIS APSIVERŠIAVUSIOMS MELŽIAMOMS KARVöMS ... 15
1.6.4. LEPTINO POVEIKIS PAŠARO SUVARTOJIMUI, ENERGIJOS BALANSUI IR VAISINGUMUI ... 16
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA ... 18
2.1. TYRIMŲ MEDŽIAGA ... 18
2.2. DNR SKYRIMAS IŠ PLAUKO SVOGŪNöLIO LĄSTELIŲ ... 18
2.3. DNR ŠVARUMO IR KONCENTRACIJOS NUSTATYMAS ...18
2.4. GALVIJŲ LEPTINO TYRIMO METODIKA ... 19
2.5. STATISTINö ANALIZö ... 20
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APIBENDRINIMAS ... 21
4. IŠVADOS ... 26
5. SUMMARY ... 27
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
bp – bazių pora
BTA 2; BTA 5; BTA 6; BTA 27; BTA 29 - chromosomos CANP 3 – raumenų specifinis genas
cM – rekombinantinio dažnio matavimo vienetas (centimorgan) DFD – tamsios, kietos, sausos m÷sos sindromas (dark, firm, dry) DNR – dezoksiribonukleinin÷ rūgštis
GH – augimo hormono genas
GHR – augimo hormono receptorius Hint – endonukleaz÷
HPH I – restrikcinis fermentas IGF-I – insulino augimo faktorius
iRNR – informacin÷ ribonukleino rūgštis JXR – galvijų veisl÷ Jiaxianred
Lep – leptinas
LX – galvijų veisl÷ Luxi Mh – raumens hipertonija
MYF 6 – lygiųjų raumenų kaldesmono miogeno faktorius 6 MYOD 1 – miogeno determinacijos faktorius 1
MYOG – miogenas
mRNR – mitochondrin÷ ribonukleino rūgštis NY – galvijų veisl÷ Nanyang
PGR – polimeraz÷s grandinin÷ reakcija
PIT-1 arba POU1F1 – hipofiz÷s transkripcijos faktorius PREF – 1 predipocitų faktorius
QC – galvijų veisl÷ Qinchuan QTL – kokybinių požymių lokusai
RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas Sau 3AI – restrikcinis fermentas
SNP – vieno nukleotido polimorfizmas TaqI – restriktaz÷
TAE – TAE buferis
Darbo tikslas
Ištirti leptino geno įvairovę galvijų tarpe ir išanalizuoti jo poveikį ūkin÷ms savyb÷ms.
Darbo uždaviniai
Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie leptiną bei jo genetinį pagrindimą.
Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie leptino geno įvairov÷s įtaką galvijų ūkin÷ms savyb÷ms
Ištirti leptino geno įvairovę galvijų tarpe, naudojant sumodeliuotus pradmenis pagal geno seką.
Nustatyti leptino geno alelių ir genotipų dažnius skirtingose galvijų veisl÷se
.
Darbo naujumas
ĮVADAS
Šiuo metu virš 3,800 lokusų, daugiau nei 3,600 genetinių žymenų yra sud÷ta į galvijų genomo žem÷lapį (http://locus.jouy.inra.fr.). Genomo žem÷lapis pirmiausia buvo pl÷tojamas su mikrosatelitų išskyrimo analize nurodytoje šeimoje (genetinis žem÷lapis ar glaudus jungiamasis žem÷lapis), in situ hibridizacija chromosomų preparatuose ir somatinių hibridinių ląstelių linijų perrašymu (citogenetinis žem÷lapis ar fizinis žem÷lapis). Galvijų genetinio žem÷lapio tankumas yra pakankamai didelis ir išmatuotas vidutinis atstumas tarp dviejų kaimyninių lokusų yra 2.5 cM (Kappes et al., 1997). Citogenetiniame žem÷lapyje yra lokalizuoti 575 lokusai (Switonski 2002). Kai plataus žem÷lapio sudarymo ÷m÷si kelios mokslininkų grup÷s, tai buvo labai svarbu formuoti vienodus ir išsamius žem÷lapius būdingus galvijų chromosomoms. Pirmieji žem÷lapiai buvo sudaryti lytinių chromosomų (Sonstegard et al., 2001) ir kai kurių autosomų, pavadintų skaičiais: 1, (Taylor et al., 1998); 4, (Casas et al., 1999); 11, (Casas et al., 2001); 17, (Sonstegard et al., 2001); 23, (Beeverj et al., 1996); ir 27 (Casas et al., 2001). Buvo padaryta prielaida, kad skirtingose veisl÷se rekombinacijos dažniai yra panašūs. Tačiau reikia pamin÷ti, kad ši prielaida gali būti neteisinga. Kaip buvo parodyta Thomsen ir kitų mokslininkų, kurie lygino rekombinacijos santykius trijose veisl÷se rado, kad mažiausiai keturiuose segmentuose, tai yra 19, 24 ir 27 chromosomose yra svarbi veisl÷s įtaka rekombinacijos dažniui. Šie atradimai parodo, kad genetin÷s distancijos tarp lokusų gali įvairuoti priklausomai nuo parinktų individų šeimose informacijos naudojamo jų apskaičiavimuose.
Neseniai, buvo išvystytas naujas žem÷lapių sudarymo būdas, pavadintas spindulin÷s hibridizacijos žem÷lapių sudarymu. Metodas paremtas somatinių ląstelių hibridizacija, bet donoro (galvijo) ląstel÷s prieš hibridizaciją yra apšvitinamos, suskaldant donoro chromosomas į fragmentus. Fragmentų dydis priklauso nuo radiacijos doz÷s. Hibridinių ląstelių molekulin÷ analiz÷ palengvina sintetinių grupių lokusų, esančių arti vienas kito, identifikaciją. Galvijų genome yra rastos dvi radiacinių ląstelių plokšt÷s. Pirma naudojama yra 5000 radų (Womack et al., 1997) gama spinduliai ir kita - 12000 radų (Rexroad et al., 2000).
Genominio žem÷lapio vystymasis buvo taip pat sustiprintas lyginamojo genomo žem÷lapio studijomis, naudojant chromosomoms specifinius zondus, kilusius iš vienos rūšies (pavyzdžiui žmogaus) in situ hibridizacija galvijų chromosomų pasklidimui. Tokie tyrimai atskleid÷ evoliucinį chromosomų segmentų koncervatyvumą, apimantį tarp tirtų rūšių mažiausiai 4 milijonus bazių porų (bp). Žmogaus specifinių chromosomų zondų pritaikymas
galvijų chromosomų preparatams parod÷ 50 tokių segmentų (Solfnas-Toldo et al., 1995). Kiti tyrimai, atlikti naudojant avių nuspalvinimo zondus, patvirtino avių ir galvijų chromosomų išsilaikymą, bet nurodyti dideli genomo pasikeitimo dažniai tarp kiaulių ir galvijų (Fronicke and Wienberg 2001).
Genomo žem÷lapių sudarymo progresas tarp aukščiau pamin÷tų aiškiai parodo, kad mūsų žinios apie galvijų genomą yra pakankamos ieškant genų, kurie yra svarbūs veisimui. Tarp jų svarbiausi yra: kiekybinių požymių lokusai, genai, atsakingi už paveldimas ligas ir atsparumą specifiniams patogenams. Pamin÷ti pavyzdžiai genų, svarbių m÷sinių galvijų veisimui yra pamin÷ti žemiau.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Molekulin÷ genetika m÷sinių galvijų veisime
Platus galvijų genomo molekulinis tyrin÷jimas prasid÷jo ankstyvajame dešimtmetyje. 1992 metais buvo įkurtas Europos galvijų genomo projektas. Nuo to laiko buvo pasiektas didelis progresas galvijų genomo struktūros supratime ir žymenų (markerių) genomo žem÷lapis tapo svarbiu įrankiu gyvulių veisime. Žem÷lapis palengvino genų, kurie vaidina lemiamą vaidmenį kiekybinių požymių vystymuisi, identifikavimą. Taigi, veisimo vert÷s nustatymas gali būti sustiprintas pasinaudojant molekuliniu genotipavimu, žinomu kaip kiekybinių požymių lokusas ar genetinių žymenų lokusas glaudžiai susijęs su juo. (Switonski 2002)
1.2. Miostatino geno mutacijos ir jų fenotipiniai poveikiai
1997 metais Grobet ir kiti mokslininkai įrod÷, kad Belgijos m÷lynųjų galvijų dvigubą raumeningumą nulemia miostatino geno mutacija. Miostatino geno identifikavimas buvo atliktas ryšių tarp žymens lokuso, priklausančio galvijų 2 chromosomai ir taip vadinamo raumens hipertrofijos (mh) lokuso smulkios analiz÷s. Be to, palyginamasis žem÷lapių sudarymas pasirod÷ labai naudingas nuo tada kai buvo žinoma kad galvijų 2 chromosomos fragmentas, turintis mh lokusą yra homologiškas žmogaus 2 chromosomos fragmentui, kuriame taip pat yra miostatino geno lokusas. Be to, tuo pačiu metu buvo žinoma, kad taip vadinami pelių miostatino geno ekspresijos genai nulemia nenormalų raumenų augimą. Sud÷jus šiuos rezultatus kartu miostatino genui buvo padaryta išvada, kad jis yra genas kandidatas, atsakingas už raumenų hipertrofiją (dvigubą raumeningumą). Sekvenuojant dvigubą raumeningumą turinčių Belgijos m÷lynųjų galvijų geną buvo rasta 11 nukleotidų
delecija, kuri nulemia pirmalaikį STOP kodono pasireiškimą ir taip sintetinamas baltymas praranda savo biologinę funkciją. Iki dabar skirtingose galvijų veisl÷se buvo identifikuotos šešios skirtingos funkcijos praradimo mutacijos.(Grobet et al., 1998).
Miostatino geno, kaip vieno iš kiekybinių požymių lokusų, atpažinimas m÷siniuose galvijuose tur÷jo didelį pasiekimą pritaikant žymenų genomo žem÷lapį veisimo tikslams. Žinoma, genas n÷ra vienintelis kontroliuojantis augimą ir m÷sines savybes. Greitai po miostatino geno mutacijų radimo, buvo prad÷ti neaktyvių alelių tyrimai su tikslu identifikuoti kitus kokybinių požymių lokusus, turinčius įtaką m÷sinių galvijų raumeningumui. Buvo parodyta, kad karkaso sud÷tis ir m÷sos kokybin÷s savyb÷s yra taip pat veikiamos nežinomų lokusų, priklausančių keletai galvijų chromosomų. Šis radimas akivaizdžiai patvirtino, kad molekulinis miostatino lokuso genotipavimas gali tik pad÷ti klasikiniam m÷sinių galvijų veisimo vert÷s įvertinimui, bet ne jį pakeisti (Grobet et al., 1998).
Gerai žinoma, kad galvijai turintys homozigotinį genotipą (-/-) d÷l miostatino alelių funkcijos praradimo mutacijos parodo nepalankų distocijos poveikį, d÷l ko padid÷ja gimimo svoris. Antravertus heterozigotiniams gyvuliams (+/-) pasireiškia teigiamas poveikis, d÷l ko gyvuliai auga liesi, bet yra mažas distocijos efektas lyginant su +/+ gyvuliais (Casas et al., 1999). Šių pasteb÷jimų pagrindu gali būti pasiūlytos kergimo sistemos, duodančios +/- palikuonis (Keele and Fahrenkrug 2001).
1.3. Augimo hormono geno (GH) polimorfizmas (L/V) įtaka augimui ir karkaso sud÷čiai
Galvijų augimo hormono gene buvo identifikuota keletas mutacijų (Lagziel and Sollerm 1999). Tačiau, viena jų, aprašyta Lucy ir kitų mokslininkų, V egzone (C→G transversija 2141 nukleotido pozicijoje, nulemia amino rūgšties leucino pasikeitimą į valiną, 127 pozicijoje), buvo plačiausiai ištyrin÷ta atsižvelgiant kad ji lemia produkcines savybes. Daugelyje tyrimų, gyvuliai, turintys VV genotipą (dvi GH geno kopijas su valinu pozicijoje 127 ) parod÷ žemesnį augimo greitį, nei gyvuliai turintys du kitus genotipus – LL ir /arba LV. VV genotipą turintys gyvuliai pasižym÷jo mažesniu kūno svoriu ir prieaugiu per parą (Chrenek et al., 1998; Sirotkin et al., 2000), mažesniu m÷sos sukaupimu (Oprzadek et al., 1999) ir mažesniu m÷sos svoriu eksterjere (Grochowska et al., 2001). Taip pat yra pranešimų, kad LV genotipo gyvuliai yra pranašesni už LL ir VV d÷l karkaso augimo (Schlee et al., 1994). Neseniai, Zwierzchowski ir kiti mokslininkai parod÷, kad VV genotipo m÷siniai buliai tur÷jo didesnį priesvorį per parą ir d÷l to buvo didesni nei kitų genotipų buliai. Kita vertus Di Stasio ir kiti mokslininkai įrod÷ ryšių stygių tarp GH geno
polimorfizmo ir m÷sos produkcijos savybių Pjedmont÷s galvijuose. Pranešama, kad GH geno polimorfizmo fenotipinis poveikis augimo ir karkaso savyb÷ms n÷ra atitinkantis. Tariant, kad L/V polimorfizmas yra tik genetinio žymens sistema, susijusi su nežinomu kokybinių požymių lokusu, tik galima teigti, kad rezultatų kitimas gali būti priežastis to, kad tyrimai buvo atlikti su skirtingomis populiacijomis, atstovaujančiomis pieninių ir m÷sinių galvijų veisl÷ms. Neveinareikšmiški ryšiai buvo taip pat nustatyti, tuo tarpu L/V polimorfizmo poveikis laktacijai ir reprodukcin÷ms savyb÷ms buvo išeliminuoti (Lechniak et al., 1999; Lechniak et al., 2002). Taigi, įtraukti GH lokuso L/V variantų molekulinį genotipavimą į veisimo tikslus atrodo dar yra per anksti.
1.4. Kiti kokybinių požymių lokusų genai kandidatai
Galvijų genomo žem÷lapio vystymasis ir išpl÷stos gyvulių augimo reguliacijos analiz÷s, galinčios identifikuoti genus, kurie vaidina pagrindinį vaidmenį nustatant produkcijos savybes. Daugelyje iš jų, polimorfiniai variantai darantys įtaką augimo ir/ar eksterjero savyb÷ms buvo identifikuoti. Labai svarbu atskirti tylias taškines mutacijas ir mutacijas, nulemiančias fenotipinius pasireiškimus. Pastarosios yra laikomos darančios didelę įtaką požymių pasireiškimui. (Switonski et al., 2002)
Insulino – augimo faktoriaus – I genas (IGF – I) dvi polimorfin÷s sistemos buvo išanalizuotos atsižvelgiant į m÷sinių galvijų produkcijos savybes. Mikrosatelitų (CA)n
polimorfizmas promotoriaus regione buvo susijęs su gimimo svoriu ir svorio priaugimu nuo gimimo iki metų laiko Herefordų galvijų populiacijoje (Moody et al., 1996). Pasak Ge ir kitų mokslininkų šis polimorfizmo tipas nerastas Angusų galvijuose, tačiau promotoriuje rasta kita mutacija: T→C per÷jimas ir parodyta, kad BB genotipas (abiejuose aleliuose C nukleotidas dalyvauja) yra susijęs su didesniu svorio priaugimu per pirmas dvidešimt dienų po nujunkymo.
Augimo hormono receptoriaus genas (GHR) vaidina lemiamą vaidmenį veikiant GH. Yra žinomas mikrosatelitų (TG trumpi tandeminiai pakartojimai) polimorfizmas GHR promotoriaus regione, aprašytas Angusų veisl÷je (Hale et al., 2000). Buvo rasta, kad taip vadinami trumpi aleliai (vienuolika iš eil÷s einančių TG sekų) yra bendri Bos indicus, tuo tarpu ilgesni (nuo šešiolikos iki dvidešimt pasikartojimų) yra bendri Bos taurus galvijams. Palyginus Angus veisl÷s galvijus, turinčius homozigotinį (ilgas/ilgas) genotipą, buvo atskleistas svarbus poveikis svoriui nujunkymo metu ir karkaso svoriui.
Pituitrino specifinis transkripcijos faktorius (PIT 1 ar POU1F1) kontroliuoja GH geno ekspresiją. Moody ir kiti mokslininkai priskyr÷ šį geną galvijų 1 chromosomai ir apraš÷
RFIP variantus, skaldant HinfI restrikcijos fermentu į fragmentus susidedančius iš dalies 5 ir 6 egzonų. Šio polimorfizmo tipo poveikio įvertinimas Italų Holšteinų – Fryzų bulių tarpe parod÷ teigiamą A alelio poveikį kūno depui, liesumui ir užpakalin÷s kojų dalies formai (Renaville 1997). Kita vertus, Zwierzchowski bei Di Stasio ir kiti mokslininkai nerado tarpusavio ryšių tarp PIT 1 geno variantų ir m÷sos produkcijos savybių m÷siniuose buliuose.
Sp÷jama, kad genai ekspresuojami išskirtinai skeleto ar lygiuosiuose raumenyse gali būti kiekybinių požymių lokusai, veikiantys augimą bei karkaso savybes. Šeši iš šių genų, pavadintų miogeniniu determinacijos faktoriu I (MYOD 1), miogeninu (MYOG), lygiųjų raumenų kaldesmono miogeno faktoriu 6 (MYF6) buvo priskirti galvijų chromosomoms (Ryen et al., 1997). Taip pat raumenų specifinis genas 3 (CANP 3), priskirtas 3 galvijų chromosomai yra laikomas galimu kokybinių požymių lokusu (Nonneman and Koohmaraie 1999). Deja, duomenys apie šių genų polimorfizmą yra kol kas labai riboti. Tai kol kas yra trumpi pranešimai apibūdinantys MYOG geno RFIP variantus (Beever et al., 1997).
Tarpraumeniniai riebalai (marmuringumas) yra svarbus galvijienos kokyb÷s požymis. Preadipocitų faktorius 1 (PREF – 1) vaidina svarbų vaidmenį slopinant riebalų metabolizmą ir tai gali paveikti tarpraumeninio riebalinio audinio vystymąsi. PREF – 1 buvo neseniai priskirtas galvijų 21 chromosomai ir pilvo raumenų audinyje buvo rastos dvi izoformos (Minoshima et al., 2001). Gali būti sp÷jama, kad netolimoje ateityje pasirodys duomenys apie šio geno polimorfizmą ir jo veikimą.
1.5. Chromosomų regionų, turinčių kokybinių požymių lokusus, paieška Mažo dažnio galvijų žymenų genomo žem÷lapio pl÷tojimas palengvino chromosominių regionų, turinčių kiekybinių požymių lokusus, radimą. Tokių tyrimų planas yra genetinių markerių radimas, kurie yra susiję su pasteb÷tų produktyviųjų požymių nurodytoje šeimoje kitimu dvejose ar trejose kartose. Tokių chromosominių fragmentų požymiai yra pirmas žingsnis link genų, turinčių norimą poveikį, radimas. Tokių tyrimų rezultatai yra pateikti. Yra keletas chromosominių fragmentų, pripažintų kaip kiekybinių požymių lokusai skirtingoms produkcijos savyb÷ms. Kai kurios chromosomos buvo aprašytos skirtingų autorių – BTA15 ir BTA19, tuo tarpu kitos pasirod÷ tik po atskirų tyrimų – BTA2, BTA5, BTA6, BTA27 ir BTA29. Įdomu, kad kai kuriais atvejais rasti regionai yra žinomi kad turi svarbius gyvulių augimo lokusus. Kiekybinių požymių lokusai, atsakingi už ilgiausiojo nugaros raumens poodinius ir kitus riebalus buvo rasti 19 chromosomos regione, turinčioje GH fokusą (Taylor et al., 1998). Kitas pavyzdys liečia 15 chromosomą, kurioje kiekybinių
požymių lokusas, liečiantis ilgiausiojo nugaros raumens minkštumą (Keele et al., 1999), buvo rastas MYOG lokuse (Beever et al., 1997). Šie rezultatai rodo, kad žinomi kiekybinių požymių lokuso kandidatai gali būti susiję su kitais nežinomais kiekybinių požymių lokusais. Kita vertus galima sp÷ti, kad ateityje molekuliniai tyrimai bus reikalingi žinomų genų molekulin÷s struktūros atžvilgiu, įskaitant reguliacinių regionų analizę.
1.6. Leptino genas, jo poveikis organizmui
Leptinas (Lep) yra 16 kD proteinas, kuris sintetinamas baltojo riebalinio audinio ir dalyvauja pašarų suvartojimo, energijos balanso, vaisingumo ir imunin÷s funkcijos reguliavime. Leptinas yra baltymas, kuris dalyvauja sud÷tinguose gyvulių augimo ir medžiagų apykaitos procesuose, ir kuris daro didžiulę įtaką pašarų suvartojimo reguliavime, energijos apykaitoje, augime bei galvijų dauginimesi (Ramsay ir Cranwell, 1999) ir tuo būdu leptino genas yra potencialus vyraujantis genas kiekybinių lokusų savybių tyrimuose. (Fruhbeck et al., 1998; Magni et al., 2000). Galvijuose, leptino genas yra ketvirtoje chromosomoje. Jis susideda iš 24 egzonų ir 2 intronų, iš kurių tik du egzonai yra paverčiami proteinais. (Javanmard et al., 2005). Leptino receptoriaus DNR analiz÷ rodo, kad šis baltymas, atrodo, priklauso citokinų receptorių šeimai.
Genetiniai skirtumai leptino gene pirmiausiai buvo pasteb÷ti pel÷se; ob / ob pel÷se trūkumas funkcinio leptino ir yra hiperfagiškumo, nutukimo ir nevaisingumo priežastis (Hamann and Matthaei, 1996). Kai leptinas yra valdomas, vaisingumas yra atstatomas, o taip pat kūno riebalų mas÷ sumaž÷ja (Halaas et al., 1995). ob/ob pelių sterilizacija yra iššaukta hormonų nepakankamumo hipokalemin÷s hipofiz÷s lygyje gerokai dažniau nei fizin÷s kliūtys, susiję su riebalinio audinio pertekliumi (Chehab et al., 1996). Tyrimuose, kuriuos atliko Fitzimmons su kolegom, atskleidžiami ryšiai tarp BM 1500 mikrosatelito, leptino geno ir riebalų kiekio galvijuose (Stone et al., 1996; Fitzsimmons et al., 1998).
Polimorfizmai žmogaus leptino gene buvo susiję su mažai cirkuliuojančio leptino lygmeniu (Hager et al., 1998), gimimo svoriu (Orbak et al., 2001), ir nutukimu (Ohshiro et al., 2000). Keturi poliformizmai kiaulių leptino gene buvo susiję su riebumu ( Jiang and Gibson, 1999). Nors poliforfizmai galvijų leptino gene buvo apibūdinti (Pomp et al., 1997; Fitzsimmons et al., 1998; Heageman et al., 2000), tačiau vis dar nebuvo jokių pranešimų apie su tuo susijusius tyrimus su pienin÷mis karv÷mis. Linderssonas ir kiti (1998) pateik÷ duomenų apie kiekybines lokusų savybes (QTL) pieno gamyboje, artimas leptino genui (82,8 cM). Jie nustat÷ kiekybines lokusų savybes (QTL) pienui, riebalams ir baltymų išeigai, esančiai prie 65 ir 85 cM, ir riebalų ir baltymų procentiniam santykiui prie 75 ir 95 cM,
atitinkamai. Ryšys tarp galvijų leptino poliformizmų ir pieno kiekio, gyvojo svorio, pašarų suvartojimo ir vaisingumo egzistuoja, o rezultatai gali būti panaudojami ateityje veisimo programose (Pryce et al., 2000; Veerkamp et al., 2000)
1.6.1. Leptino geno įtaka energijos balansui, pieno išeigai, gyvam svoriui.
Kadangi įrodymais patvirtinta genetin÷ koreliacija tarp liuteinin÷s faz÷s pradžios ir energijos balanso, pieno išeigos ir gyvojo svorio. Liefers ir kiti mokslininkai ištyr÷ genetinius skirtumus galvijų leptino gene ir šių savybių asociacijas (Liefers et al., 2004). Gyvuliai buvo tiriami nuo gimimo iki 105-tos laktacijos dienos. Per pirmąsias 15 laktacijos savaičių įvertintas 565 karvių gyvasis svoris, pašaro suvartojimas ir primilžis. Liuteinin÷s veiklos pradžia nustatyta pirmąją dieną su didesne nei 3 ng/ml progesterono koncentracija. Kartu su intervalu tarp apsiveršiavimo ir liuteinin÷s veiklos pradžios atlikti ir kiti tyrimai, siekiant išmatuoti vidutinį primilžį, procentinį riebumą, baltymų kiekį ir laktozę piene, sauso pašaro suvartojimą, pašaro suvartojimą, energijos balansą ir gyvąjį svorį per pirmąsias 15 laktacijos savaičių. Visos 613 karvių buvo genotipuotos dviem restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmams ir BM1500 mikrosatelitui; visi jie išd÷styti leptino geno vietoje. Genotipo poveikio reikšm÷s apskaičiuotos naudojant apytikslę F-statistiką, kurią teikia ASREML. Nekintantys poveikiai buvo metų laikas, genetin÷ grup÷ ir apsiveršiavimo amžius. Gyvuliui priskirtas atsitiktinis poveikis, įskaitant prid÷tinį santykį tarp gyvulių, paaiškinantį pamatinius genus. Pirmiausia, kiekvieno genotipo poveikis tirtas paeiliui; antra, kiti restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmai buvo pritaikyti kaip kofaktorius, norint pažvelgti į neatsitiktin÷s genų sankibos efektus. Trečia, ištirta reproduktoriaus x genotipo sąveika.
Telyčios, turinčios RFLP1-AB genotipą, duoda 1,32 kg/d daugiau pieno ir suvartoja 0,73 kg/d daugiau pašaro lyginant su RFLP1-AA genotipu. Joks poveikis nepasteb÷tas liuteinin÷s veiklos pradžiai. Kai atsižvelgta į neatsitiktinę genų sankibą su kitais rodikliais, o DMI į modelį įtrauktas kaip fiksuotas poveikis, vis tiek gautas 0,96 kg/d didesnis primilžis. Darant prielaidą, kad n÷ra jokio pleiotropinio poveikio tokioms savyb÷ms kaip imunitetas ir pieno produkcija v÷lesn÷s laktacijos metu, būsimos veisimo programos, rodančios palankumą RFLP1 B-aleliui gali užtikrinti daugiau primilžio be jokio neigiamo poveikio energijos balansui ir vaisingumui. Perspektyvos išties yra geros, nes šiame tyrime RFLP1 AB- ir BB-genotipų dažnumas buvo tik, atitinkamai, 18,5 ir 0,2%. (Liefers et al., 2004)
1.6.2. Leptino geno įtaka riebalų kiekiui (nutukimui)
Leptinas yra hormonas dalyvaujantis riebalų metabolizmo kelyje ir įtakoja riebalų kiekį jautienoje. Jis yra nutukimo geno produktas, gaminamas riebalinse ląstel÷se, iš kurių patenka į kraujotaką (Ren et al., 1999). Leptino koncentracija kraujo plazmoje atitinka organizmo riebalų atsargas. Did÷jant riebalų atsargoms, leptino pagaminama daugiau, ir atvirkščiai, riebalų atsargoms maž÷jant, leptino pagaminama mažiau. Kai kraujyje leptino daug÷ja, maž÷ja apetitas ir kūno riebalų atsargos. Taigi kuo mažiau leptino, tuo daugiau vartojame maisto. Badaujant leptino kiekis žymiai sumaž÷ja, d÷l to baigus badauti kyla noras prisikimšti iki valios. (http://edieta.mama.lt/badavimas/s436).
Leptino receptoriai buvo rasti smegenyse, tai rodo, kad jis reguliuoja apetitą ir kontroliuoja svorį. Leptino receptoriai aptikti keturiose pagumburio vietose. Nustatyta, kad jis įtakoja maitinimąsi ir metabolizmą, taip pat buvo nustatyta, kad leptinas susijęs su riebalų atsid÷jimu (http://ohioline.osu.edu/sc170/sc170_6.html). Taigi, jis gali tur÷ti didelį vaidmenį riebalų pasiskirstymui. Didesni leptino mRNR kiekiai galvijuose yra rasti apie inkstus ir taukinę ir mažesni poodiniame riebaliniame audinyje (Ren et al., 1999).
Sočiame organizme riebląst÷s įjungia leptino geną ir gamina leptiną. Leptino kiekis yra proporcingas trigliceridų atsargoms ir nutukimo laipsniui. Matyt, egzistuoja viduląstelinis metabolitinis ar kitoks signalas, kuris yra tuo stipresnis, kuo daugiau ląstel÷je riebalų. Šis signalas įjungia leptino geną. Be to, leptino gamybą reguliuoja ir užląsteliniai veiksniai. Jie gali per kelias valandas pakeisti leptino sintezę, mažai susietai su riebalų atsargomis. Tai insulinas, gliukokortikoidai, β-adrenerginiai ligandai ir citokinai. Manoma, kad leptinas duoda integruotą laike signalą apie energijos atsargas, tačiau, atrodo, kad staigūs jo gamybos pokyčiai gali būti reikšmingi.
Manoma, kad egzistuoja sistema, permetanti leptiną per kraujo-smegenų barjerą į smegenų pusę. Ši sistema yra įsotinama, tod÷l leptino lygis neviršija tam tikro, net tada, kai leptino lygis kraujo plazmoje - tai nutukimą rodantis lygis. Galbūt tai viena iš priežasčių, kod÷l periferinis leptinas neefektyviai informuoja smegenis apie nutukimą. (http://ohioline.osu.edu/sc170/sc170_6.html). Alternatyvus leptino taikinys yra neuropeptidinis melaniną koncentruojantis hormonas. Jis gaminamas daugiausiai pagumburyje. Šio neuropeptido injekcija į smegenis sukelia apsirijimą. Dar vienas leptino taikinys gali būti neuropeptidai, slopiną maitinimąsi. Leptino fiziologin÷ funkcija gali būti apsauga nuo nutukimo esant maisto pertekliui (neigiamas grįžtamas ryšys; adipostatin÷ funkcija). Daugelis nutukimo atvejų (tiek žmonių, tiek pelių) susiję su didel÷mis leptino
koncentracijomis. Tai nejautrumo leptinui atvejai. Labai retai nutukimas yra viengenio sutrikimo pasekm÷ (Bardet Biedl, Prader Willi. Ahlstrom, Cohen sindromai). Bet šie sindromai atpažįstami pagal kitus požymius. Leptinas jungiasi prie leptino receptoriaus (genas db) smegenų "sotumo centre" ir lemia sotumo jausmą pavalgius. Adipocitų leptino genas vadinamas ob genu. Pelių ob/ob mutantai visai negamina leptino, jie yra nepasotinami, turi didžiulį viršsvorį ir valgo daug daugiau už normalias peles. Apribojus jų suvartojamo maisto kiekį iki kiekio, kuri su÷da normalios pel÷s, ob/ob mutantai vis tiek priauga gerokai daugiau svorio. Taigi jų medžiagų apykaita irgi yra pakitusi. Tačiau virsvorį turinčių žmonių problema dažniau būna ne mažesnis leptino kiekis, o leptino receptorių nebuvimas. Tod÷l leptinas jiems nesukelia sotumo jausmo. (http://ohioline.osu.edu/sc170/sc170_6.html)
Iki šiol, leptino santykis su galvijų kūno riebaliniu audiniu yra mažiau aiškus, ypač santykis su tarpraumeniniais riebalais, d÷l kurių m÷sa vadinama marmurine. Mokslininkai ištyr÷ ryšį tarp plazmos leptino lygių, nutukimo geno išraiškos ir riebalų kiekio Šarol÷, Vokietijos holšteinų ir Wagyu (75 % hibridų) veisl÷s galvijuose. Galvijuose, aukštesni leptino mDNR lygiai randami apie inkstus ir taukin÷s riebaliniame audinyje, kartu su žemesnio lygio, esančiais poodiniame riebaliniame audinyje. „Wagyu“ hibridas turi aukščiausius lygius visose riebalų kaupimosi vietose. Žymūs skirtumai buvo rasti plazmos leptino lygiuose tarp galvijų veislių, kurie dav÷ mintį, kad tarp leptino lygio ir riebalų sankaupos yra sąryšis (Ren et al., 1999)
Mokslininkai nustat÷ augimo geno geb÷jimą reguliuoti leptino mRNR išsiskyrimą galvijų riebaliniame audinyje, esant apvaisinimui in vitro ir dirbtiniam apvaisinimui in vivo. Poodinio riebalinio audinio inkubacinio periodo eksplantavimas 24 valandoms vien tik su augimo hormonu neturi jokio poveikio galvijų leptino geno išraiškai, tuo tarpu didel÷ insulino arba deksametazono (DEX) koncentracija stipriai stimuliavo galvijų leptino mRNR perteklių. Augimo hormonas (AH) kartu su didele insulino koncentracija, deksametazonu, ar abiem kartu, susilpnina insulino ar deksametazono geb÷jimą stimuliuoti leptino išraišką in vitro. Šie duomenys rodo, kad augimo hormonas gali netiesiogiai reguliuoti leptino išsiskyrimą in vitro, keičiant riebalinio audinio reakciją į insuliną ar deksametazoną. Mokslininkai Houseknecht ir kiti išpl÷t÷ šiuos tyrimus, kad gal÷tų išnagrin÷ti augimo hormono geb÷jimą reguliuoti leptino išraišką in vivo, naudojant jaunus kastruotus jaučius, laikomus be hormonų (kontrol÷s) ar augimo geno (200 mikrogramų/kg kūno svoriui per dieną) trejetą dienų. Augimo hormonas padidino augimo hormono plazmą ir insulino koncentraciją, bet ne tuos kortizolio ar neesterintų riebalų rūgščių koncentracijas. AH režimas padidino riebalinio audinio leptiną ir IGF-1 mRNR koncentracijas (n=9, P>0.001). Papildant,
leptino gausa buvo labai susijusi su riebalinio audinio IGF-1 mRNR augimo hormonais veisiamuose gyvūnuose (P>0.001). Laikas suk÷l÷ augimo hormono pasikeitimus leptino geno išraiškoje, kurie suk÷l÷ gan žymų AH poveikį nutukimui. (Houseknecht et al., 2000)
1.6.3. Leptino poveikis apsiveršiavusioms melžiamoms karv÷ms
Tiriant melžiamas karves paaišk÷jo, kad išaugus primilžiui, sumaž÷jo vaisingumas, o energijos balansas buvo labiau neigiamas. Kadangi hormonas leptinas padeda reguliuoti mitybą ir reprodukcinę funkciją, šį proteiną itin įdomu tirti melžiamų karvių veršiavimosi laikotarpiu, kai daug pokyčių vyksta tiek energijos metabolizme, tiek ir reprodukcin÷je fiziologijoje. Šio tyrimo tikslai buvo išsamiai išnagrin÷ti leptino funkciją veršiavimosi laikotarpiu ir atlikti asociacijų tyrimą tarp polimorfizmų galvijų leptino ir leptino receptoriaus gene ir vaisingumo bei produktyvumo požymių. Leptino genas, įskaitant jo promotorinę dalį, ir leptino receptoriaus genas buvo išd÷styti sekoje, siekiant rasti polimorfizmus, ir susieti su vaisingumo ir produktyvumo požymių skirtumais. Tyrimo metu apibr÷žti leptino lygiai melžiamoms karv÷ms veršiavimosi laikotarpiu. Taip pat apskaičiuotos asociacijos su genotipų polimorfizmais ir vaisingumo bei produktyvumo požymiais. Pateikta literatūros, susijusios su leptinu ir jo receptoriumi, apžvalga bei reikšm÷ medžiagų apykaitos procesams ir vaisingumui. (Liefers 2004)
Aptarti leptino lygiai melžiamoms karv÷ms veršiavimosi laikotarpiu. Šie lygiai susieti su produkcijos ir reprodukcijos požymių skirtumais. Leptino koncentracijos veršingoje karv÷je ženkliai kinta. Didel÷ leptino koncentracija pasteb÷ta v÷lyvuoju n÷štumo periodu. Tuo tarpu iki mažiausio lygio koncentracija sumaž÷jo karvei apsiveršiavus. Padid÷jusi plazmos leptino koncentracija atrajotojų n÷štumo laikotarpiu pasireiškia d÷l padid÷jusio riebalinio audinio leptino mRNA, d÷l trūkstamo neigiamo atsako (atsparumas leptinui) ir d÷l padid÷jusio nutukimo. Liefers tyr÷ gyvojo svorio leptino koncentracijas laktacijos periodu ir prieš pat veršiavimąsi, tačiau neanalizavo asociacijų tarp gyvojo svorio prieš pat apsiveršiavimą ir leptino koncentracijų. Leptino lygis art÷jant apsiveršiavimui ir laktacijos metu sumaž÷ja d÷l riebalinio audinio mobilizacijos. Atrodo, kad leptino koncentracijos atspindi energijos balanso būklę laktacijos metu; plazmos leptino koncentracijos buvo mažesn÷s karv÷ms su vidutiniškai neigiamu energijos balansu laktacijos metu. Tolesn÷ analiz÷ parod÷, kad visų trijų polimorfizmų promotorin÷je dalyje kombinacija paaiškina 14,3% nuokrypį leptino koncentracijose prieš pat apsiveršiavimą. Dvi kritin÷s kombinacijos su didžiausia ir mažiausia leptino koncentracijomis prieš pat apsiveršiavimą gali būti naudojamos norint ištirti leptino koncentracijų funkciją veršingose karv÷se. (Liefers 2004)
1.6.4. Leptino poveikis pašaro suvartojimui, energijos balansui ir vaisingumui. Leptino genas ir leptino receptoriaus genas yra galimi genai-kandidatai, siekiant ištirti poveikį energijos balansui ir vaisingumui žindančiose karv÷se. Leptino genas, įskaitant jo promotorinę dalį, ir leptino receptoriaus genas buvo išd÷styti sekoje, siekiant ne tik rasti polimorfizmus, bet ir aptikti numanomas transkripcijos faktorių prijungimo vietas leptino promotorin÷je dalyje. Su rastais polimorfizmais atliktas asociacijų tyrimas. Ištirtos visų genotipuotų polimorfizmų asociacijos su melžiamose karv÷se vedimo laikotarpiu vertintais vaisingumo ir produkcijos požymiais; taip išanalizuoti leptino lygio skirtumai tarp visų genotipuotų polimorfizmų genotipų. (Liefers 2004)
Introninis polimorfizmas (RFLP1), esantis leptino geno 2 introne, pad÷jo išsiaiškinti skirtingo primilžio, su 0,5 standartiniu genetiniu nuokrypiu tarp dviejų kritinių genotipų, priežastis. Tačiau kadangi šis polimorfizmas yra intronin÷je dalyje, o leptino geno egzonuose randami polimorfizmai nebuvo susieti su primilžiu, negalime išskirti, kad priežastinis genas yra neatsitiktin÷je genų sankiboje su šiuo polimorfizmu. Promotorin÷je leptino geno dalyje SNP -1457 susieta su pirmąja liuteinine veikla po apsiveršiavimo (p=0.017) ir su svorio netekimu tarp pirmosios savait÷s ir minimalaus svorio (p=0.027), kur daugiau svorio prarasta, kai pirmoji liuteinin÷ faz÷ po apsiveršiavimo prasideda v÷liau. Vaisingumo požymius reikia atidžiai pasirinkti. Tod÷l šis SNP gal÷jo būti potencialus kandidatas-rodiklis, vertinant melžiamų karvių vaisingumą. SNP -963 susietas su energijos balansu (p=0.015) ir sauso pašaro suvartojimu (p = 0.030), kur didesnis sauso pašaro suvartojamas rod÷ ir geresnį energijos balansą. Siekiant rasti optimalią genotipo kombinaciją su dideliu primilžiu, geru energijos balansu ir vaisingumu, buvo atliktas naujas tyrimas. Šiame tyrime apibr÷žtos dvi trijų SNP genotipo kombinacijos; o tolesnis eksperimentas ir ekonominiai šių požymių verčių skaičiavimai turi parodyti (t.y. pagrįsti), ar viena iš šių genotipo kombinacijų gali būti naudojama selekcijoje. R4C polimorfizmas, esantis leptino geno 2 egzone, sulauk÷ daug d÷mesio iš keleto tyr÷jų grupių d÷l savo tariamo poveikio leptino struktūrai. Vis tik kai kurie tyrimai, įskaitant ir mūsų tyrimą, nepateik÷ pagrįstų įrodymų, kad R4C polimorfizmas daro įtaką leptino struktūrai ir funkcijai. Kiti tyrimai atskleid÷ poveikį melžiamų karvių primilžiui ir m÷sin÷s jautienos riebalų turiniui. Remiantis šiais rezultatais, sukurtas R4C-testas. Remiantis šiuo testu, galima pagerinti veisimo rodiklius tiek melžiamoms karv÷ms, tiek ir m÷siniams galvijams. Leptino ir leptino receptoriaus geno polimorfizmai siejami su leptino koncentracijos skirtumais v÷lyvuoju n÷štumo laikotarpiu, tačiau ne laktacijos laikotarpiu. Kadangi leptino aktyvatorius reguliuoja leptino išsiskyrimą, polimorfizmai šioje dalyje gali būti svarbi priežastis d÷l skirtingų plazmos leptino lygių v÷lyvuoju n÷štumo laikotarpiu. Tod÷l
Liefers pateik÷ leptino aktyvatorių ir ištyr÷ transkripcijos faktorių prijungimo vietos ir polimorfizmų seką. Visi genotipuoti polimorfizmai susieti su leptino koncentracijomis prieš pat apsiveršiavimą, tačiau trys polimorfizmai, esantys 135 bp regione (282 - 147 bp prieš transkripcijos pradžios vietą), yra svarbūs leptino koncentracijos skirtumams v÷lyvuoju n÷štumo laikotarpiu. Taip pat ženklūs skirtumai laktacijos periodu pasteb÷ti tarp dviejų genotipo kombinacijų su didžiausiomis ir mažiausiomis leptino koncentracijomis. Pasiūl÷ sp÷jamą nuo n÷štumo priklausančią stiprinimo seką pad÷ti šioje leptino aktyvatoriaus vietoje. Galiausiai, leptino geno polimorfizmai ir jo aktyvatoriaus regionas siejami su melžiamų karvių primilžiu (RFLP1), energijos balansu (SNP -963) ir vaisingumu (SNP -1457). Reikia tolimesnių eksperimentų ir skaičiavimų, norint ištirti, ar šių trijų polimorfizmų kombinacija būtų naudinga selekcijai ateityje. Promotorin÷je dalyje galima išd÷styti nuo n÷štumo priklausančią stiprinimo seką. Šioje dalyje išd÷stytų polimorfizmų kombinacija gali būti naudinga tiriant didel÷s leptino koncentracijos n÷štumo metu funkciją. (Liefers 2004)
Apibendrinimas
Yra tikimasi, kad netolimoje ateityje pranešimų apie genų polimorfizmo poveikį produkcijos savyb÷ms skaičius gerokai padid÷s. Tačiau, šių žinių įgivendinimas veisimo programose turi vykti atsargiai ir nepriekaištingai pritaikant geno poveikį, numatytą skirtingų autorių skirtingose populiacijose. Mažai tik÷tina, kad v÷l pasirodys toks stiprus veikimas, kaip nustatyta miostatino geno funkcijos praradimo mutacija. Kita vertus, galima tik÷tis, kad geno reguliacijos fragmentų polimorfizmo analiz÷ pateiks svarbius duomenis apie genų ekspresijos reguliaciją (Klauzinska et al., 2000). Šio proceso genetiškai nulemtas kitimas gali paveikti fenotipinį požymių pasireiškimą. Galiausiai, tolimesnis gyvulių gerinimo progresas reikalaus didelio kiekybin÷s ir molekulin÷s genetikos specialistų bendradarbiavimo.
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimų medžiaga
M÷giniai buvo paimti iš 61 galvijo: Lietuvos juodmargių (12), Lietuvos žalųjų (14), Limuzinų (8), Simentalų (7), Šarol÷ (8), Holšteinai (12).
DNR buvo išskirta iš plaukų svogūn÷lių, imant m÷ginius į vienkartinius plastikinius maišelius, juos markiruojant bei užpildant m÷ginių pa÷mimo lydraščius. M÷giniai buvo surinkti iš UAB „Šilut÷s veislininkyst÷“ .
Tiriamasis darbas atliktas Lietuvos veterinarijos akademijos Gyvūnų veisimo ir genetikos katedros K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
2.2. DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio ląstelių
Nukerpami 4-5 plaukų svogūn÷liai ir patalpinami į m÷gintuv÷lius. Paruošiamas lizavimo mišinys (DTT -7,5 µl, Chelex- 200µl, Proteinaze K (20mg/ml)- 10.7µl). M÷gintuv÷lio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 218,2µl paruošto mišinio). M÷gintuv÷liai 30 s. maišomi maišykl÷s „Vortex" pagalba. Centrifuguojami l0 s 13500 aps./min. greičiu. Pavyzdžiai 30 min. inkubuojami 56°C temperatūroje. Po inkubacijos m÷giniai (po 10µm) pakaitinami 94°C temperatūroje (inaktyvuojami - amplifikatoriuje) bei paliekami nakčiai.
2.3. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genomin÷s DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba. Tam tikslui paruošiamas l00 µl skiestos DNR tirpalas: imama l0 µl koncentruotos DNR ir skiedžiama 90µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50ug dvigrand÷s DNR. DNR kokyb÷ įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti pakartotinį genomin÷s DNR valymą. Šiuo metu laboratorijose naudojami spektrofotometrai iš karto nustato ir apskaičiuoja tiek DNR, tiek baltymų koncentraciją tirpale.
2.4. Galvijų leptino tyrimo metodika
LEP geno pradmenys:Pirminis LEP 1 (5‘ –GTCTGGAGGCAAAGGGCAGAGT-3‘) Atvirkštinis LEP 2 (5‘ –CCACCACCTCTGTGGAGTAG-3‘)
PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (µl)
Geros kokyb÷s dejonizuotas vanduo ddH2O 4,75
Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
MgCl2 (konc. 50mM) 1,5
dNTP miksas (2mM) 2,5
Pirminis pradmuo GL1 (darbin÷ konc. 20pmol) 1,5 Atvirkštinis pradmuo GL2 (darbin÷ konc. 20pmol) 1,5
BSA 0,25
Taq polymeraz÷ (1vnt./µl) aktyvumo 0,5
PGR atliekama automatiniame amplifikatoriuje GeneAmp ® PGR sitema 2700 PGR režimas:
94 OC,5 min (pirmin÷ denatūracija) 94 OC, 15s (denatūracija),
64 OC 30s (oligonukleotidų prisijungimas), 72 OC 1 min (DNR grandin÷l÷s sintez÷).
72 OC, Sintez÷s užbaigimui 5 min. Laikyti: 4 OC Reakcija atliekama 35 ciklų GL 1 GL 2 geno variantų ištyrimas
PGR produktas – 522 bp
DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentu BsaAI: A (alelis) – 522 bp G (alelis) - 441 bp ir 81 bp A G 552 — 441 — 81 — AA genotipas - 522 bp AG genotipas - 522 bp, 441 bp, 81 bp GG genotipas - 441 bp ir 81 bp
2.5. Statistin÷ analiz÷
Alelių, genotipų, homozigotų ir heterozigotų analiz÷ atlikta su statistiniu R – paketu (Gentlemen R. et al., 1997).
Genotipų dažnis p apskaičiuojamas pagal formulę: p=
N n
p – genotipų dažnis
n – atskiro genotipo individų skaičius
N – tirtų individų skaičius
Alelių dažnis apskaičiuojamas pagal formulę 2) p= N n n 2 2 1+ 2 3) q= N n n 2 2 3 + 2
n1 ir n3 – homozigotinių individų skaičius
n2 - heterozigotinių individų skaičius
N - tirtų individų skaičius
Faktinis heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę:
ho=
N n2
ho – faktinis heterozigotiškumas
n2 - heterozigotinių individų skaičius
N - tirtų individų skaičius
Numatomas heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę: he=1-(p2+q2) he – numatomas heterozigotiškumas
p ir q – alelių dažniai
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS
Galvijų leptino geno RFIP- BsaAI polimorfizmas buvo tirtas šešiose Lietuvoje auginamų galvijų veisl÷se (61 galvijas) - Lietuvos juodmargių, Lietuvos žalųjų, Limuzinų , Simentalų , Šarol÷ , Holšteinų. Procentaliai m÷ginių imtys atskirose veisl÷se buvo panašios (1 paveikslas).
T irtų g alvijų p as is kirs tymas p ag al
veis les
20% 23% 20% 13% 13% 11% L J L Ž H Š L i S i1 pav. Tirtų galvijų pasiskirstymas pagal veisles.
Leptinas yra baltymas, kuris dalyvauja sud÷tinguose gyvulių augimo ir medžiagų apykaitos procesuose, ir kuris daro didžiulę įtaką pašarų suvartojimo reguliavime, energijos apykaitoje, augime bei galvijų dauginimesi (Ramsay ir Cranwell, 1999) ir tuo būdu leptino genas yra potencialus vyraujantis genas kiekybinių lokusų savybių tyrimuose. (Fruhbeck et al., 1998; Magni et al., 2000). Galvijuose, leptino genas yra ketvirtoje chromosomoje. Jis susideda iš 24 egzonų ir 2 intronų, iš kurių tik du egzonai yra paverčiami proteinais. (Javanmard et al., 2006). Leptino receptoriaus DNR analiz÷ rodo, kad šis baltymas, atrodo, priklauso citokinų receptorių šeimai.
1 lentel÷. Rastas LEP geno alelių skaičius tirtoje galvijų grup÷je.
Lokusas Alelių skaičius
LEP nukleotido G į A pasikeitimas 2 introne galvijų 4 chromosomoje
Mes tyr÷me nukleotidų sekos polimorfizmą (G – guanino pasikeitimą į A- adeniną) galvijų leptino geno 2 introne. Kadangi, ši mutacija sukuria naują fermento BsaAI kirpimo vietą, mutaciją galima lengvai rasti naudojant PGR-RFIP analizę. Tirtoje galvijų grup÷je rasti du LEP geno aleliai A ir G (1 lentel÷).
2 lentel÷. Faktinis ir teorinis Leptino geno heterozigotiškumas tirtoje galvijų grup÷je.
Heterozigotiškumas Tirta galvijų grup÷
Faktinis heterozigotiškumas ho 0,34
Teorinis heterozigotiškumas he 0,47
χ2 – kriterijaus reikšm÷
(P – reikšm÷) 0,002
ho< he reiškia heterozigotiškumo trūkumą
Rastas statistiškai reikšmingai mažesnis faktinis heterozigotiškumas nei prognozuotas, kuris gal÷jo susidaryti d÷l gyvulių kryptigos selekcijos ir genetin÷s įvairov÷s sumaž÷jimo. (2 lentel÷).
Tirtoje galvijų grup÷je rastas A ir G alelių dažnis buvo atitinkamai 0,61 ir 0,39, genotipų dažnis – GG genotipo - 0,45, GA genotipo – 0,34 AA genotipo – 0,21. (3 lentel÷, 2 ir 3 paveikslai).
2 pav. Leptino geno alelių pasiskirstymas tirtoje grup÷je.
Leptipo geno alelių pasiskirtymas
tirtoje galvijų grupėje
39%
61%
L ep tin o g en o g en o tip ų
p as is kirs tymas tirto je g alvijų
g ru p ėje
45%
34% 21%
G G G A A A
3 pav. Leptino geno genotipų pasiskirstymas tirtoje galvijų grup÷je.
Ištyrus Leptino geno polimorfizmą atskirose Lietuvoje auginamų galvijų veisl÷se visose veisl÷se buvo rastas vyraujantis alelis G, kintantis ribose nuo 0,44 Šarole veisl÷je iki 0,71 Holšteinų veisl÷je. A alelio dažnis kito nuo 0,25 Limuzinų veisl÷je iki 0,56 Šarole veisl÷je(3 lentel÷, 4 paveikslas).
Visose veisl÷se rastas vyraujantis leptino geno GG genotipas ribose nuo 0,33 iki 0,58. GA heterozigotinis genotipas didžiausiu dažniu (0,5) rastas pas Lietuvos juodmargius ir Limuzinų galvijus, o mažiausiu pas Šarole veisl÷s galvijus - 0,13. AA genotipas dažniausiai rastas pas Šarole veisl÷s galvijus – 0,5, o Limuzinu veisl÷s galvijų tarpe šis genotipas išviso nerastas(3 lentel÷, 5 paveikslas).
3 lentel÷. Leptino genogenotipų ir alelių dažniai Lietuvoje veisiamų galvijų veisl÷se Genotipas ir alelis Lietuvos juod-margiai Lietuvos žalieji
Holšteinai Šarole Limuzi-nai Simental ai Viso Gyvulių skaičius GG 4 5 7 3 4 4 27 GA 6 6 3 1 — 1 17 AA 2 3 2 4 4 2 17 Alelių dažnis G 0,58 0,57 0,71 0,44 0,75 0,64 0,61 A 0,42 0,43 0,29 0,56 0,25 0,36 0,39 Genotipų dažnis GG 0,33 0,36 0,58 0,37 0,5 0,57 0,45 GA 0,5 0,43 0,25 0,13 0,5 0,14 0,34 AA 0,17 0,21 0,17 0,5 — 0,29 0,21
0 0,2 0,4 0,6 0,8 L J L Ž H Š L i S i
A lelių d až n iai
A B
4 pav. Leptino geno alelių pasiskirstymas atskirose galvijų veisl÷se.
0 0,2 0,4 0,6
L J L Ž H Š L i S i
G enotipų daž niai
G G G A A A
5 pav. Leptino geno genotipų pasiskirstymas atskirose galvijų veisl÷se.
Palyginus mūsų gautus duomenis su literatūros duomenmis, gauti panašūs tyrimų rezultatai. Kitų mokslininkų tyrimų duomenimis mišrūnų tarpe G alelis rastas dažniu 0,76, A alelis – 0,24, Holšteinų veisl÷je G alelis - 0,82, A alelis – 0,18, Džersių veisl÷je G alelis 0,66 dažniu, A alelis – 0,34 dažniu (Choudhary et al., 2005). Kiti mokslininkai, kaip ir mes, ištyrę LEP geno polimorfizmą rado A alelį žemesniu dažniu (0,18 iki 0,34) nei G alelį visose tirtose veisl÷se. Pagal tokius tyrimų rezultatus galima teigti, kad gal÷jo veikti atrankos j÷gos prieš A alelį arba palankesn÷ atranka G aleliui.
Pirmas apie leptino geno polimorfizmą galvijų tarpe paskelb÷ Pomp ir kiti mokslininkai, kurie 1,820 bp PGR produktą suskald÷ su Sau3AI restrikciniu fermentu. Šio polimorfizmo poveikį m÷sinių galvijų produkcijos savyb÷ms tyrin÷jo Zwierchowski ir kiti mokslininkai, kurie parod÷ ryšį tarp polimorfizmo ir maisto įsisavinimo. Taip pat buvo paliestos kai kurios
karkaso savyb÷s. Genotipų poveikis buvo kintantis ir AA (A alelis rodo tris restrikcijos fragmentus) genotipo buliai geriau pasisavino pašarą, o tuo tarpu AB (B alelis turi keturis fragmentus) genotipo buliai tur÷jo didesnį kiekį liesos m÷sos. Kiti RFIP variantai, aprašyti Haegeman ir kitų mokslininkų, kurie amplifikavo 2 egzono fragmentą ir atliko skaldymą su Hph I restrikciniu fermentu. Platus galvijų leptino geno DNR sekvenavimo tyrimas buvo atliktas Konfortov ir kitų mokslininkų (perdengiant 2 egzoną, dalį 2 introno ir 3 egzono), kurie ištyr÷ dvidešimt du įvairių veislių gyvulius, bei atskleid÷ dvidešimt polimorfinių vietų, kurios vadinamos VNP (vieno nukleotido polimorfizmas). Iš jų šešios pasitaik÷ egzonuose ir dvi pakeit÷ amino rūgščių seką. Šiuo metu dar yra sunku padaryti išvadą, kuri aprašyta taškin÷ mutacija vaidina svarbiausią vaidmenį.(Haegeman et al., 2000).Kiniečių mokslininkai(Yang at al., 2007) PGR-SSCP metodu ištyr÷ leptino geno polimorfizmą šešiose galvijų veislese - Nanyang (NY), Qinchuan (QC), Jiaxianred (JXR), Xizhen (XZ), Luxi (LX) ir Holsteinų (HOL). Gauti rezultatai parod÷, kad A/B alelių dažniai NY, QC, JXR, XZ, LX, ir HOL veisl÷se buvo, atitinkamai, 0,558/0,442, 0,492/0,508, 0,571/0,429, 0,658/0,342, 0,591/0,409 ir 0,615/0,385. Ištirta leptino geno variacijų ir augimo požymių asociacija NY, QC, JXR veisl÷se. Kalbant apie NY veislę, reikia pasteb÷ti, kad kai kurie rodikliai individams, pasižymintiems BB genotipu, buvo aukštesni nei individams su AA ar AB genotipu. Tarp tokių rodiklių reikia pamin÷ti kūno ilgį, širdies ilgį, kūno svorį, klubikaulio plotį, kūno aukštį ir vidutinį priaugimą per dieną. Aukštis ties klubu QC veisl÷s individams su BB genotipu buvo didesnis nei tiems, kurie pasižymi genotipu AA ir AB (P < 0,05). Taigi leptino genas gali būti vienas iš genų-kandidatų augimo požymiams (su aukščiu ties klubu), tačiau ne kūno svoriui, širdies ilgiui ir kūno ilgio požymiams. Tačiau tiriant JXR veislę, paaišk÷jo, kad aukštis ties klubu ir klubikaulio plotis šios veisl÷s atstovams su genotipu AB ir BB buvo didesni nei šios veisl÷s atstovams su AA genotipu (P < 0.05). Tačiau skirtumas nebuvo statistiškai ryškus vertinant kūno svorį ir kūno dydį (kūno aukštį, kūno ilgį ir širdies ilgį). Polimorfizmus leptino gene suk÷l÷ G —> T transversija 66-oje bp pozicijoje, A —> C transversija 67-ojoje bp pozicijoje ir G —> T transversija 299-ojoje bp pozicijoje. (Yang et al., 2007).
Galvijų leptino geno ir kitų genų, susijusių su riebalų atsid÷jimu bei augimu, genetinių žymenų radimas ir naudojimas yra labai svarbus ekonominiu požiūriu. Visuomen÷ reikalauja liesos, aukštesn÷s kokyb÷s m÷sos. Jei bus įrodyta, kad polimorfiniai genetiniai leptino geno žymenys koreliuoja su riebalų atsid÷jimu, tokiu būdu bus galima genetinių žymenų pagalba veisti liesesnius galvijus, turinčius mažesnį ar didesnį marmuringumo lygį. (Tessanne et al., 1999).
4. IŠVADOS
1. Leptinas yra baltymas, kuris dalyvauja sud÷tinguose gyvulių augimo ir medžiagų apykaitos procesuose, ir kuris daro didžiulę įtaką pašarų suvartojimo reguliavime, energijos apykaitoje, augime bei galvijų dauginimesi. Tod÷l leptino genas yra potencialus genas kiekybinių lokusų tyrimuose bei jo panaudojimu selekcijoje genetinių žymenų pagalba.
2. Galvijuose leptino genas yra randamas ketvirtoje chromosomoje ir sudarytas iš 24 egzonų ir 2 intronų. Galvijų leptino genas yra polimorfiškas. Viso rasti devyni vieno nukleotido polimorfizmai antrame introne ir vienas polmorfiškas mikrosatelitas. Atskiri leptino geno polimorfizmai susiję su mažesniu riebalų kiekiu, pašarų sąnaudomis, didesniu liesos m÷sos svoriu.
3. Atlikus leptino geno tyrimus PGR-RFIP metodu buvo identifikuoti du leptino geno aleliai G ir A.
4. Rastas statistiškai reikšmingai mažesnis faktinis heterozigotiškumas nei prognozuotas, kuris gal÷jo susidaryti d÷l gyvulių kryptingos selekcijos ir genetin÷s įvairov÷s sumaž÷jimo.
5. Tirtoje galvijų grup÷je leptino geno alelių dažnis buvo G alelio - 0,61, A alelio - 0,39; genotipų dažnis – GG genotipo - 0,45, GA genotipo – 0,34. AA genotipo – 0,21.
6. Ištyrus leptino geno polimorfizmą atskirose Lietuvoje auginamų galvijų veisl÷se visose veisl÷se buvo rastas vyraujantis alelis G , kintantis ribose nuo 44 proc. Šarole veisl÷je iki 75 proc. Limuzinų veisl÷je. Taip pat yra vyraujantis ir GG genotipas, kintantis nuo 33 proc Lietuvos juodmargių veisl÷je iki 58 proc Holšteinų veisl÷je. GA heterozigotinis genotipas didžiausiu dažniu rastas 0,5 pas Lietuvos juodmargius ir Limuzinų galvijus, o mažiausiu pas Šarole 0,13.
5. SUMMARY
Master. Gintar÷ Navakauskait÷Topic of Master thesis. Leptin gene polymorphism in cattle and it‘s influence to production traits
Tutor of M. Sc. Thesis. Natalija Krasnopiorova
Master‘s work accomplished in the year 2008 – 2010, in Lithuanian Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics, K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics. Volume of Master work 35 page original, 3 tables and 5 pictures.
Object and tasks of work. Analyse and summarize literature about leptin and it genetic background. Analyse and summarize literature about leptin gene polymorphism influence to cattle production traits. Investigate LEP gene polymorphism and distribution of different alleles and genotypes in Lithuanian cattle population.
Research methodology. 1. DNA extraction from hair roots. 2. PCR to amplify LEP gene. 3. RFLP method. 3. Electrophoresis in agarose gel. 4. Staining with Etidium bromide. 5. Genotyping. 6. Stasitical analysis of data.
Results and conclutions. Leptin is a protein involved intricately in the growth and metabolism of animals and which plays an important role in the regulation of feed intake, energy metabolism, growth and reproction of cattle. Therefore Leptin gene is a potential gene in the research of quantitative loci, also it's useful in genetic markers aid breeding. In cattle, the leptin gene is located on chromosome 4. It consists of 24 exons and 2 introns that only two exons is translated in to protein. In cattle leptin gene is polymorphous. Leptinus individual gene polymorphisms are related to a lower fat content, feed costs, higher weight of the lean meat. After leptin gene studies were made by PGR - RFIP method, there were identified two alleles G and A of leptin gene. It was found statistically significantly lower heterozygousism than it was estimated. It could be a result of a decrease of the targeted selection of animals and genetic diversity. In the group of investigated cattle the frequency of alleles was G allele - 0,61, A allele - 0,39, frequency of genotype - GG genotype - 0,45, GA genotype - 0,34, AA genotype - 0,21. After the studies of leptin gene's polymorphysm in separate cattle breeds in Lithuania, the dominant allele G was found in all breeds, which was variable ranging from 44 % in Sharole , till 75 % in Limousines. Also there was a dominant GG genotype, which has the variable range from 35 % in Lithuanian black and white cattle, till 58 % in Holstein cattle. GA heterozygous genotype in it's maximum frequency 0,5 was found in Lithuanian black and white cattle and Limousine breeds. The lowest frequency 0,13 was found in Sharole.
6. Literatūra
1. Beever J.E., Fisher S.R., Levin H.A.,m- Polymorphism identification in the ACADM, AT3, ILIO MYOC and TSHB genes of cattle. Animal Genetics. 1997. Vol. 28. P. 373-374.
2. Casas E., Barendese W., Beever J.E., Burns B.M., Davis S.K., Erhard G., Forster M., Gomez-Raya L., Kalm E.. Kappes S.M.. Klungland H., Lewin H.A., Lien S., Olsaker L., Refnsch N., Schwerin M., Song Y, Taylor J.F., Thosen H., Vage D.I., Wu X., Xu N., Yeh C.C., - Bovine chromosome 4 workshop: consensus and comprehensive linkage maps. Animal Genetics. 1999. Vol. 30. P. 375-377.
3. Casas E., Keele J.W., Fahrenkrug S.C., Smith T.P.L., Cundiff L.V. Stone R.T., - Quantitative analysis of birth, weaning and yearling weights and calving difficulty in Piedmontese crossbreds segregating an inactive myostatin allele. Journal of Animal Science. 1999. Vol. 77. P. 1686-1692.
4. Casas E., Bennett G.L., Bottema C.D.K.. Crawford A., Kalm E., Kappes S.M., Ki- Ster A., Lewin H.A., Morris C.A., Olsaker L., Pitchford W.S., Schmutz S.M., Thom Sen H., Xu N., - Comprehensive linkage map of bovine chromosome 11. Animal Genetics 2001. Vol. 32. P. 92-94.
5. Chehab F.F., Lim M.E. and Lu R., – Correction of the sterility defect in homozygous obese female mice by treatment with the human recombinant leptin. Natl. Genet 1996. Vol. 12 P. 318-320
6. Choudhary V., Kumar P., Bhattacharya T.K., Bhushan B. and Shanna A. — DNA polymorphism of leptin gene in Bos indicus and Bos taurus cattle. Genetics and Molecular Biology. 2005. Vol. 28. N. 4. P. 740-742
7. Chrenek P., Kmet J., Sakowski T., Vasicek T., Huba J., Chrenek J., - Relationships of growth hormone genotype wjth meat production traits of Slovak Pied bulls. Czech Journal of Animal Science 1998. Vol. 43. P. 541-544.
8. Di Stasio L., Saratore S., Alberta A., - Lack of association of GH1 and Poulfl gene variants with meat production traits in Piemontese cattle. Animal Genetics. 2002. Vol.33. P. 61-64.
9. Fitzsimmons C.J., Schmutz S.M., Bergen R.D., McKinnon J.J. - A potential association between the BM 1500 microsatellite and fat deposition in beef cattle. Mamm. Genome. 1998. Vol. 9 P. 432-434
rate of karyotype changes between pigs and bovids. Mammalian Genome. 2001. Vol. 12. P. 442-449.
11. Feuhbeck G., Jebb S.A. and Prentice A.M., – Leptin: Physiology and pathophysiology. Clin. Physiol. 1998.Vol. 18. P. 399-419
12. Ge W., Davis M.E., Hines H.C., Irvin K.M., Simmen R.C.M. -Association of a genetic marker with blood serum insulin-like growth factor concentration and growth traits in Angus cattle. Journal of Animal Science. 2001. Vol. 79. P. 1757-1762.
13. Gelderman H., - Investigations on inheritance of quantitative characters in animals by gene markers 1. Methods Theor Appl Gen 1997. Vol. 46. P. 319-330
14. Grobet L., Poncelet D., Royo L.J., Brouwers B., Pirottin D., Michaux C., Menissier F., Zanotti M., Dunner S., Georges M., - Molecular definition of an allelic series of mutations disrupting the myostatin function and causing double-muscling in cattle. Mammalian Genome 1998. Vol. 9. P. 210-213.
15. Grochowska R., Lunden A., Zwierzchowski L., Snochowski M., Oprazadek J. - Association between gene polymorphism of growth hormone and carcass traits in dairy bulls. Animal Science 2001. Vol. 72. P. 441-447.
16. Haegeman A., Van Ze Veren A., Peelman L.J., – Naw mutation in exon 2 of the bovine leptin gene. Animal Genetics 2000. Vol. 31. P. 79
17. Hager J., Clement J.K., Francke S., Dina C., Raison J., Lahlou N., Rich N., Pelloux V., Basdevant A., Guy-Grand B., North M. and Froguel P. – A polymorphism in the 5‘ untranslated region of the human ob gene is associated with low leptin levels. Int J. Obes. Ralat. Metab. Disord 1998. Vol. 22 P. 200-205
18. Halaas J.L., Gajiwala K.S., Maffei M., Cohel S.L., Chait B.T., Rabinowitz D., Lallone R.L., Burley S.K. and Friedman J.M., – Weight – reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science 1995. Vol. 269, P. 543-546 19. Hale C.S., Herring W.O., Shibuya H., Lucy M.C., Lubahn D.B., Keisler D.H.,
Johnson G.S., - Decreased growth in Angus steers with short TG-microsatellite allele in the PI promoter of the growth hormone receptor gene. Journal of Animal Science 2000. Vol. 78. P. 2099-2104.
20. Hamann A. and Matthaei S., – Regulation of energy balance by leptin. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 1996. Vol. 104. P. 293-300
21. Houseknecht K.L., Baile C.A., Matteri R.L., Spurlock M.C., - The Biology of leptin: A review, J.Anim. Sci. 1998 Vol. 76. P. 1405-1420
22. Houseknecht K.L., Portocarrero C.P., Ji S., Lemenager R. and Spurlock M.E. – Growth hormone regulates leptin gene expression in bovine adipose tissue: correlation with adipose IGF-1 expression. Journal of Endocrinology 2000. Vol. 164.P. 51-57
23. Yang D., Chen H., Wang X., Tian Z., Tang L., Zhang Z., Lei C., Zhang L., Wang Y. – Association of polymorphisms of leptin gene with body weight and body sizes indexes in Chinese indigenous cattle. College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling 712100, China 2007
24. Javanmard A., Elyasi-Zarringabayi G., Gharadaghi A.K., Asadzadeh N. and Banabazi M.H., Nassiry M.R. and Javadmanash A., – Molecular analysis of the bovine leptin gene in Iranian Sarabi cattle (Iranian Bos taurus). Pajouhesh & Sazandegi 2005. Vol 70. P. 2-8
25. Jiang Z.H. and Gibson J.P. – Genetic polymorphisms in the leptin gene and their association with fatness in four pig breeds. Mamm. Genome 1999. Vol. 10. P. 191-193
26. Kappes S.M., Keele J.W., Stone R.T., Mcgraw R.A., Sonstegard T.S., Smith T.P.L., Lopez-Corrales N.L., Beattie C.W. - A second-generation linkage map of the bovine genome. Genome Research 1997. Vol. 1. P. 235-249.
27. Keele I.W., Shackelford S.D., Kappes S.M., Koohmaraie M., Stone R.T. - Aregion on bovine chromosome 15 influences beef longissimus dorci tenderness in steers. Journal of Animal Science 1999. Vol. 77. P. 1364-1371.
28. Keele I.W. and Fahrenkrug S.C. - Optimum mating system for the myostatin locus in cattle. Journal of Animal Science 2001. Vol. 79. P. 2016-2022.
29. Klauzinska M., Szymanowska M., Zwierzchowski L. – Polimorfizm 5‘-flanku- ja_cych rejonow genow zwierza_t gospodarskich – nowe zrodto markerovv genetycznych (Polymorphism in 5‘-flanking genes‘ regions resulting in a new type of genetic markers in farm animals – a review). In Polish, summary in English. Prace i Material Zootechniczne 2000. Vol. 57. P. 47-76
30. Konfortov B.A., Licence V.E., Miller J.R. – Re-sequencing of DNA from a diverse panel of cattle reveals a high level of polymorphism in both intron and exon. Mammalian Genome 1999. Vol. 10. P. 1142-1145
31. Lagziel A. and Soller M. - DNA sequence of SSCPhaplotypes at the bovine growth hormone (bGH) gene. Animal Genetics 1999. Vol. 30. P. 362-365.
32. Lechniak D., Machnik G., Szydlowski M., Switonski M. - Growth hormone gene polymorphism and reproductive performance of AI bulls. Theriogenology 1999. Vol. 52. P. 1145-1152.
33. Lechniak D., Strabel T., Przybyla D., Machnik G., Switonski M. - GH and CASN3 gene polymorphism and their impact on milk traits in cattle. Journal of Animal and Feed Sciences 2002. Vol. 11 (1), in press.
34. Liefers S.C. – Physiology and Genetics of Leptin in Peripparturient Dairy Cows, Waginenggen University dissertation 2004. Vol. 3570
35. Lindersson M., Andersson-Eklund L., de Koning D.J., Lunden A., Maki-Tanila A. and Andersson L, – Mapping of serum amylase-1 and quantitative trait loci for milk production traits to cattle chromosome 4 J. Dairy Sci 1998. Vol. 81. P. 1454-1461 36. Lucy M.C., Hauser S.D., Eppard P.I., Krivi G.G., Clark J.H., Bauman D.E., Collier
R.J., - Variants of somatotropin in cattle: gene frequencies in major dairy breeds and associated milk production. Domestic Animal Endocrinology 1993. Vol. 10. P. 325-333.
37. Magni P., Motta M. and Martini L. - Leptin: A possible link between food intake, energy expenditure, and reproductive function. Regul. Pept. 2000. Vol. 92. P. 51-56 38. Minoshima Y., Taniguchi Y., Tanaka K., Yamada T., Sasaki Y. - Molecular cloning, expression analysis, promoter characterization, and chromosomal localization of the bovine PREF1 gene. Animal Genetics 2001. Vol. 32. P. 333-339. 39. Moody D.E., Pomp D., Newman S., Macneil M.D., - Characterization of DNA polymorphism in three populations of Hereford cattle and their associations with growth and maternal EPD in line 1 Herefords. Journal of Animal Science 1996. Vol. 74. P. 1784-1793.
40. Moody D.E., Pomp D., Barendse W., - Restriction fragment length polymorphism in amplification products of the bovine PITl gene and assignment of PITl to bovine chromosome 1. Animal Genetics 1995. Vol. 26. P. 45-47.
41. Nonneman D., Koohmaraie M., - Molecular cloning and mapping of the bovine and ovine skeletal muscle-specific calpains. Animal Genetics 1999. Vol. 30. P. 456-458.
42. Oprzadek J., Dymnicki E., Zwierzchowski L., Lukaszewicz M., -The effect of growth hormone (GH), k-casein (CASK) and b-lactoglobulin (BLG) genotype on carcass traits in Friesian bulls. Animal Science Papers and Reports 1999. Vol. 17. P. 85-92.
43. Ohshiro Y., Ueda K., Nishi M., Ishigame M., Wakassaki H., Kawashima H., Furuta H., Sasaki H., Sanke T., Takasu N. and Nanjo K., – A polymorphic marker in the leptin gene associated with Japanese morbid obesity. J. Mol. Med 2000. Vol. 78. P. 516-520
44. Orbak, Z., Coker M., Darcan S., and Goksen D., - Association between serum leptin and anthropometric parameters at birth and at 15th day of life in infants born asymmetrically small for gestational age. J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 2001. Vol. 14. P. 185-192
45. Pomp D., Zou T., Clutter A.C. and Barendse W., – Rapid communication: mapping of leptin to bovine chromosome 4 by linkage analysis of a PCR-based polymorphism. J. Anim. Sci. 1997. Vol. 75. P. 1427
46. Pryce J.E., Coffey M.P. and Brotherstone S. – The genetic relationship between calving interval, body condition score and linear type and management traits in registered Holsteins J. Dairy. Sci. 2000. Vol. 83 P. 2664-2671
47. Ramsay T.G. and Cranwell P.D., – A review – Leptin: A regulator of feed intake and physiology in swine. Procceding of the Seventh Biennial Conference of the Australasian Pig Science Association (APSA), 1999 28 November – 1 December, Adelaide, Australia, P. 157-170
48. Ren M. Q. , Xie C. P., Schneider F., Mir P.S., Weselake R.J., Wegner J. and Ender K., – Leptin plazma levels and obese gene expression in differtent adipose tissue of cattle. International Symposium „Candidate Genes for Animal Heaith“ Rostock/Germany, 1999 25th- 27th August
49. Renaville R., Genegler N., Vrech E., Prandi A., Massart S., Corradini C., Bertozzi C., Mortiaux F., Burny A., Portetelle D., - Pit-1 gene polymorphism, milk yield, and conformation traits for Italian Holstein-Friesian Bulls. Journal of Dairy Science 1997. Vol. 80. P. 3431- 3438.
50. Rexroad C.E., Owens E.K., Johnson J.S., Womack J.E., - A 12000 rad whole genome radiation hybrid panel for high resolution mapping in cattle: characterization of the centromeric end of chromosome 1. Animal Genetics 2000. Vol. 31. P. 262-265.
51. Ryen A.M., Schelling C.P., Womack J.E., Gallagher D.S., - Chromosomal assignment of six muscle-specific genes in cattle. Animal Genetics 1997. Vol. 28. P. 84-87.
genotypes on breeding values of Simmental bulls. Journal of Animal Breeding and Genetics 1994. Vol.111. P. 253-256.
53. Sirotkin A.V., Chrenek P., Makarevich A.V., Huba J., Bulla J., - Interrelationships between breed, growth hormone genotype, plasma IGF-I level and meat performance in bulls of different ages. Archives of Animal Breeding 2000. Vol. 43 P. 591-596.
54. Solfnas-Toldo S., Lengauer C., Fries R. - Comparative genome map of human and cattle. Genomics 1995. Vol. 27. P. 489-496.
55. Sonstegard T.S., Barendse W., Bennett G.L., Brockmann G.A., Davis S., Dro - Egemtjller C., Kalm E., Kappes S.M., Kuhn C., Li Y., Schwerin M., Taylor J., Thomsen H., Van Tasell C.P., Yeh C.C., - Consensus and comprehensive maps of the bovine sex chromosomes. Animal Genetics2001. Vol. 32. P. 115-117.
56. Sonstegard T.S., Bendixen C., Bennett G.L., Kalm E., Kappes S.M., Lewin H.A., Lien S., Nielsen V.H., Olsaker L, Schmutz S., Thomsen H., Van Tassel C.P., Xu N., -Consensus and comprehensive linkage maps of bovine chromosome 17. Animal Genetics 2001. Vol. 32. P. 112-113.
57. Stone R.T., Kappes S.M., Beattie C.W. - The bovine homologue of the obese gene maps to chromosome 4. Mammal. Genome 1996. Vol. 7. P. 399-400
58. Switonski M., - Cytogenetyka i mapy genomow zwierzat domowych - zarys osignic i perspektywy rozwoju (Cytogenetics and domestic animal genome maps - achievements and perspectives). In Polish, summary in English. Zeszyty Naukowe Przeglqdu Hodowlanego 2002 (in press).
59. Taylor J.F., Eggen A., Aleyasin A., Mrmitage S.M., Barendse W., Beever J.E., Bishop M.D., Brenneman R.A., Burns B.M., Davis S.K., Elo K., Harlizius B., Kap - Pes S.M., Keele J.W., Kemp S.J., Kirkpatrick B.W., Lewin H.A., Ma R.Z., Mcgraw R.A., Pomp D., Stone R.T., Sugimoto Y, Teale A.J., Vaiman D., Vilkki J., Williams J.L., Yeh C.C., Zanotti M.C., - Report of the first workshop on the genetic map of bovine chromosome 1. Animal Genetics 1998. Vol. 29. P. 228-235. 60. Tessanne K., Hines H.C. and Davis M.E., – Relationships of Polymorphisms in the
Bovine Leptin Gene with Differences in Beef Carcass Traits. The Ohio State University Departament of Animal Sciences. Special Cilcular 1999. P. 168-199 61. Thomsen H., Reinsch N., Xu N., Bennewitz J., Looft C., Grupe S., Kuhn C.,
Brockmann G.A., Schwerin M., Leyhe-Horn B., Hiendleder S., Erhard G., Medjugo - Rac I., Russ I., Forster M., Brening B., Reinhardt F., Reents R., Blumel
