LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA
K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija
Vilma Kliševičiūt÷
Kiaulių leptino geno polimorfizmo įvairov÷ ir įtaka m÷sin÷ms savyb÷ms
Magistro darbas
Darbo vadovas:
Lektor÷: Lina Baltr÷nait÷
Magistro darbas atliktas 2008 – 2010 metais Lietuvos veterinarijos akademijoje, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Magistro darbą paruoš÷: Vilma Kliševičiūt÷
(parašas)
Magistro darbo vadovas:
Dr. Lina Baltr÷nait÷
(parašas)
TURINYS
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
ĮVADAS... 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA... 8
1.1 Kiaulių pen÷jimosi savyb÷s...8
1.2 Kiaulių m÷sin÷s savyb÷s...8
1.3 Genai veikiantys kiaulių pen÷jimosi ir m÷sines savybes bei m÷sos kokybinius rodiklius...10
1.3.1. Miostatino genas...11
1.3.2. Halotano (HAL) genas...11
1.3.3. Augimo hormono (GH) genas... 12
1.3.4. Rapole (RN) genas...12
1.3.5. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas...13
1.4 Leptino (LEP) genas...13
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA...18
2.1TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI...18
2.2KIAULIŲ FENOTIPINIŲ POŽYMIŲ DUOMENŲ BAZöS...18
2.3DNR SKYRIMAS IŠ PLAUKO SVOGŪNöLIO LĄSTELIŲ...19
2.4DNR ŠVARUMO IR KONCENTRACIJOS NUSTATYMAS...19
2.5POLIMERAZINö GRANDININö REAKCIJA (PGR)...19
2.5.1 Kiaulių Leptino geno (LEP 1) (PGR-RFIP) tyrimo metodika ... .20
2.5.2 Kiaulių Leptino geno LEP 2) (PGR-RFIP) tyrimo metodika...21
2.6STATISTINö DUOMENŲ ANALIZö...21
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS...22
3.1KIAULIŲ LEP1 IR LEP2 GENŲ POLIMORFIZMO IŠTYRIMAS...ERROR!BOOKMARK NOT DEFINED. 3.2KIAULIŲ LEP1 IR LEP2 GENŲ POLIMORFIZMO RYŠIO SU FENOTIPINIAIS POŽYMIAIS IŠTYRIMAS...ERR OR!BOOKMARK NOT DEFINED. 4. IŠVADOS ... 31
5. REKOMENDACIJOS ... 31
6. SUMMARY... 32
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
bp – bazių pora
HAL – halotono genas
DFD – tamsios, kietos, sausos m÷sos sindromas (dark, firm, dry) DNR – dezoksiribonukleinin÷ rūgštis
DTT - dithiotreitolis
GH – augimo hormono genas
GHR – augimo hormono receptorius
GHRH – augimo hormoną atpalaiduojančio receptoriaus genas GHRHR – augimo hormoną atpalaiduojančio hormono receptorius IGFBP3- insulino panašaus augimo faktoriaus rišamojo proteino 3 LEP – leptino genas
MC4R – melanokortino 4 receptorius
MHS – stresinį sindromą sąlygojantis genas MYOG – miogeno genas
NP – heterozigotin÷ būsena ob – nutukimo genas OD - optinis tankis
PGR – polimerazin÷ grandinin÷ reakcija PP – homozigotin÷ būsena
PSE – blyškios, minkštos, vandeningos m÷sos sindromas (pale, soft, exudative) PSS – kiaulių streso sindromas
RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas RYR – rianodino geno receptorius
RN – Rapole genas
Darbo tikslas
Ištirti leptino geno įvairovę kiaulių tarpe ir nustatyti polimorfizmo įtaką kiaulių produktyvumo savyb÷ms.
Darbo uždaviniai
• Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie kiaulių leptiną bei jo genetinį pagrindimą.
• Ištirti leptino geno (LEP1 ir LEP2) įvairovę kiaulių tarpe PGR metodu. • Suformuoti fenotipinių požymių duomenų bazę.
• Ištirti leptino geno įvairov÷s įtaką kiaulių pen÷jimosi savyb÷ms. • Ištirti leptino geno įvairov÷s įtaką kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms.
Darbo naujumas
•
Pirmą kartą leptino geno polimorfizmas bei jo variantų įtaka kiaulių produktyvumo savyb÷ms ištirtas Lietuvoje veisiamose kiaul÷se.Praktinis pritaikymas
Įdiegta metodika leidžia ištirti kiaulių genome leptino geną, nustatyti alelių polimorfizmą ir įvertinti jo poveikį kiaulių fenotipin÷ms savyb÷ms.
Siūloma atsižvelgti į kiaulių genome esančio leptino geno polimorfizmą, atrenkant ir parenkant gyvulius, turinčius ekonomiškai naudingus alelius, kad būtų galima pagerinti produktyviąsias savybes.
ĮVADAS
Pastaraisiais metais telkiami kiaulių pasauliniai genetiniai ištekliai ir intensyviai pertvarkomas selekcijos darbas, pagrįstas naujausiomis technologijomis, didinamas kiaulių genetinis potencialas, vis labiau specializuojama ir koncentruojama galvijienos bei kiaulienos gamyba. Pagrindin÷mis priemon÷mis kiaulienai intensyvinti tapo veisimo programos, pagrįstos kiekybin÷s genetikos principais.
Tradiciniai kiekybiniai būdai, naudojami gyvulių veisime, pasikliauja duomenų, tokiems fenotipiniams požymiams, kaip augimo greičiui, raumenin÷s akies plotui, nugaros lašinių storiui ir kitų požymių registravimu. Statistinių metodų rinkinys, taikomas šiems duomenims tam, kad būtų galima identifikuoti ir atrinkti geriausius individus, kurių požymiai pareina iš pra÷jusių kartų. Ši strategija veiksminga, kai tiriami požymiai, kurie yra vidutiniškai ar gerai paveldimi, tokie kaip augimo greitis, ir kurie plačiai yra naudojami, gerinant pageidaujamus požymius. Tuo pačiu metu, yra požymių, kur t÷vų fenotipas sunkiai nurodo, kokie bus palikuonių požymiai, tokie kaip reprodukciniai, ir su paveldimomis ligomis susiję požymiai. Be to, kiaulininkyst÷je dar yra ekonomiškai naudingų požymių, tokių kaip m÷sos kokyb÷ ir ilgaamžiškumas, kurių fenotipas yra pamatuojamas tik tuo metu, kai jau gyvulys neb÷ra tinkamas veisimui. Taigi, norint išspręsti šią problemą, reikia rasti kitus būdus žem÷s ūkio gyvulių selekcijai. Dabartiniai pasiekimai DNR technologijoje mokslininkams duoda galimybę identifikuoti, genus kurie kontroliuoja kiaulininkystei naudingus ekonominius požymius. Galutinis šių genų ištyrimas pad÷s žem÷s ūkio gyvulių selekcijoje.
Genetinių žymenų panaudojimas žem÷s ūkio gyvulių selekcijoje atveria galimybes įvertinti gyvulį iš vidaus ir pilnai panaudoti jame slypinčias naudingas ūkines savybes. Genetiniai markeriai gali būti naudojami tiek vieno geno, tiek genų grup÷s lemiamo požymio ar požymių grup÷s identifikavimui. Taigi, žem÷s ūkio gyvulių selekcijos tikslas palaipsniui pereina nuo tik ekonominių požymių prie kokybinių ir sveikatingumo požymių vertinimo, o veislin÷s gyvulių vert÷s nustatymas grindžiamas tiek fenotipine, tiek ir genotipine informacija apie gyvulį. Dar vienas genetinių žymeklių panaudojimo selekcijoje privalumas yra tas, kad šis gyvulių vertinimo būdas yra patikimas, nereikalaujantis didelių ekonominių bei, svarbiausia, laiko sąnaudų, leidžia jauname amžiuje išaiškinti genus, kontroliuojančius selekcinę ir technologinę auginamų gyvulių vertę, įvertinti žem÷s ūkio gyvulių genetinį kintamumą ir genetinių defektų paplitimą bei suteikia galimybę laiku išvengti nepageidaujamų požymių pasireiškimo. Genetinių žymeklių panaudojimas selekcijoje gali labai paspartinti selekcijos procesą, pagerinti žem÷s ūkio produkcijos kokybę, sumažinti jos
gamybos savikainą bei padaryti produkciją konkurentabilią užsienio rinkose (Malevičiūt÷ et al., 2002).
Lietuvos veterinarijos akademijoje veikianti K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija vykdo naminių gyvūnų ir paukščių paveldimų ligų ir ydų tyrimus, užsiima selekcijos efektyvumo, gyvulių produktyvumo bei pieno ir m÷sos kokyb÷s gerinimu molekulinių genetinių metodų pagalba, vykdo žem÷s ūkio gyvūnų genetinių išteklių monitoringą. LVA gyvūnų genetikos laboratorijoje buvo atlikti tyrimai ir nustatyta melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) geno įtaka Lietuvos baltųjų kiaulių augimo greičiui ir skerdienos kokybei, o taip pat buvo analizuota kiaulių stresinį sindromą sąlygojančio geno (MHS) įtaka kiaulių sveikatingumui, produktyvumui ir reprodukcin÷ms savyb÷ms (Jokubka R. and Miceikien÷ I., 2001; Malevičiūt÷ et al., 2002; Jokubka R. and Miceikien÷ I., 2003).
Yra žinoma visa eil÷ genų įtakojančių m÷sos produkcijos kiekį bei kokybę. Tai miostatino, leptino, augimo hormono, augimo hormono receptoriaus, halotano ir kiti genai (Switonski, 2002). Lietuvoje leptino geno polimorfizmas, įtaka kiaulių pen÷jimosi bei m÷sin÷ms savyb÷ms nebuvo tyrin÷ta.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Kiaulių pen÷jimosi savyb÷s
Pen÷jimosi savybių paveld÷jimo koeficientas yra h² = 0,27 – 0,35. Pen÷jimosi savybių vertinimo rodikliai yra šie:
1. Brendimo greitis – amžius dienomis, kai gyvuliai pasiekia 100 kg masę. Šis rodiklis apibūdina augimo spartą nuo paršelio gimimo iki 100 kg mas÷s.
2. Vidutinis paros priaugimas – parodo gyvulio pen÷jimosi intensyvumą. Pen÷ti pradedama nuo 30 kg paršelio mas÷s iki pasiekiama 100 kg mas÷/ vidutinis paros priaugimas apskaičiuojamas mas÷s priaugimą nuo 30 kg iki 100 kg dalijant iš pen÷jimo dienų skaičiaus (100kg – 30kg =70kg : 98d. = 714g).
3. Pašarų sąnaudos 1 kg priaugimui. Šiuo rodikliu vertinamas kiaulių pašarų pasisavinimas. Apskaičiuojamas sunaudotų pašarinių vienetų kiekį dalijant iš bendro mas÷s priaugimo pen÷jimo metu. Kuo pašarų sąnaudos mažesn÷s, tuo rodiklis geresnis.
1.2 Kiaulių m÷sin÷s savyb÷s
M÷sinių savybių paveldimumo koeficientas yra h² = 0,35 – 0,75. M÷sin÷s savyb÷s apibūdinamos šiais rodikliais:
1. Skerdenos išeiga procentais – tai skerdenos mas÷s santykis su priešskerdimine mase (72 – 80proc.). Skerdenos mas÷ – skerdena su galva, kojomis, vidaus riebalais be vidaus organų ir žarnyno. Priešskerdimin÷ mas÷ – gyvos kiaul÷s mas÷ po 12val.alkinimo.
2. Skerdenos ilgiu centimetrais, matuojamu nuo pirmojo kaklo slankstelio priekinio krašto iki dubens kaulų suaugimo priekinio krašto (95 - 100 cm). Ilga skerdena pasižymi gerais m÷singumo rodikliais ir atitinka bekoninį produktyvumo tipą.
3. Bekono pusel÷s ilgiu centimetrais, matuojamu nuo pirmojo krutin÷s slankstelio priekinio krašto iki dubens kau1ų suaugimo priekinio krašto (77 - 83 cm).
4. Nugaros lašinių storiu milimetrais, matuojamu slankmačiu: keteros srityje, ties 6-7 šonkauliu, juosmens srityje (už paskutinio šonkaulio) ir trijuose kryžiaus srities taškuose - prieš str÷nų paviršinį raumenį, virš raumens ir už raumens.
5. Vidutiniu nugaros lašinių storiu, kuris apskaičiuojamas taip: pirmiausia iš trijų matmenų apskaičiuojamas vidutinis lašinių storis kryžiaus srityje, po to iš keturių matmenų apskaičiuojamas vidutinis lašinių storis nugaroje, t.y.lašinių storis ties 6 – 7 šonkauliu,
keteros, juosmens ir kryžiaus srities matmenų vidurkio. Lašinių storis nugaroje teigiamai koreliuoja su lašinių išeiga skerdenoje.
6. Nugaros lašinių pasiskirstymo vienodumu. Jį parodo lašinių storio skirtumas keteros ir juosmens srityse. Pageidaujamas kuo mažesnis skirtumas (10 – 13mm.).
7. Papilv÷s storiu, matuojamu spenių linijoje, praduriant papilvę šiose vietose (35 – 38 mm):
a) 5 cm atstumu nuo paskutinio spenio,
b) pilvo viduryje (lygiagrečiai paskutinio šonkaulio prisegimui), c) 3 cm nuo krūtinkaulio pilvo link.
Selekcionuojama, kad papilv÷ būtų storesn÷ už nugaros lašinius, peraugusi keliais raumeninio audinio sluoksniais.
8. „Raumenine akimi“ vertinama ilgiausiojo nugaros raumens skerspjūvio plotu cm² (35,8cm²). Matuojama pjūvyje ties pirmu ir antru juosmens slanksteliais. Ilgiausiojo nugaros raumens skerspjūvio plotas teigiamai koreliuoja su m÷sos išeiga skerdenoje.
9. M÷sos, lašinių ir „raumenin÷s akies“ plotu, kurie matuojami iš kalkiniame popieriuje apibr÷žtų skerdenos skerspjūvio kontūrų planimetru pagal atitinkamas metodikas.
10. M÷sos ir lašinių santykiu procentais, apskaičiuojamas m÷sos plotą padauginus iš 100 ir padalijus iš lašinių ploto. Juo procentas didesnis, tuo skerdena m÷singesn÷.
11. Užpakalinio skerdenos pusel÷s trečdalio (kumpio)mase, vertinama perpjovus skerdenos puselę ties priešpaskutiniu ir paskutiniu juosmens slanksteliu. Kumpis sveriamas. Ši skerdenos dalis yra vertingiausia ir daro įtaką m÷sos išeigai.
12. M÷sos, lašinių ir kaulų santykiu, vertinamu iškaulinus skerdeną ir išreiškiamą procentais nuo skerdenos mas÷s.(Jančien÷ I., Kvietkut÷ N., 2004).
Kiauliena, priklausomai nuo jos m÷singumo, skirstoma į 6 raumeningumo klases: S,E,U,R,O,P.(Skimundris V., 2000)
1 lentel÷. Kiaulienos skirstymas į raumeningumo klases.
Raumeningumo klas÷ Raumeningumas, %
S > 60 E 55 - 60 U 50 - 55 R 45 - 50 O 40 - 45 P < 40
1pav. Kiaulienos skirstymas į raumeningumo klases.
(http://www.manoukis.lt/print_forms/print_st_z.php?s=139&z=10)
1.3. Genai veikiantys kiaulių pen÷jimos, m÷sines savybes bei m÷sos
kokybinius rodiklius
Daugiau kaip prieš dešimtmetį didžiul÷ pažanga buvo padaryta genotipuojant ir apibūdinant kiaulių genomą. Šiuo metu yra ištirti ir paskelbti daugiau kaip 5 tūkstančiai kiaulių genomo lokusų. Dideliu mastu tiriamos tam tikros sekos, kurių identifikavimas, lygiagrečiai su genomo sekvenavimu, sudaro galimybę nustatyti vieno nukleotido polimorfizmą (VNP), kas gali būti panaudota galutinai nustatant ekonominius požymius, tokius kaip m÷sos kokyb÷, augimo greitis ir pašaro pasisavinamumas. Taigi, priemon÷s ir informacija vystoma ta linkme, kad genomika sudarytų galimybę kiaulininkystei vystytis kiaulių sveikatingumo ir naudingų požymių gerinimo linkme. Dabartiniai ir ateityje naudojami metodai ekonomiškai naudingų požymių gerinimui remsis genolapiais ir mūsų supratimas apie individualių genų funkcijas ir struktūrą did÷s.
Kiaulių DNR yra išsid÷sčiusi 19 chromosomų porų ir sudaryta iš daugiau kaip 100 tūkstančių funkcionuojančių genų. Kiaulių produktyviąsias savybes veikia tiek fenotipiniai, tiek genetiniai faktoriai. Kiaulių autosomose atrasti genai arba genų grup÷s, lemiantys vislumą, pen÷jimosi spartą, raumeningumą, m÷sos kokybę, rezistentiškumą ligoms (Fiedler et al., 1999).
1.3.1. Miostatino genas
Miostatiną ir su juo susijusius genus 1997 metais atrado genetikai McPherron ir Se-Jin Lee, kurie taip pat sukūr÷ atmainą mutantinių pelių, kurios neturi geno ir yra maždaug du kartus stipresn÷s negu normalios pel÷s. Geno sekos buvo nustatytos žmon÷ms, pel÷ms, galvijams, kiaul÷ms. Sekos parod÷ rūšinius skirtumus. (McPherron et.al., 1998)
Koduojanti kiaulių miostatino geno seka apima 1128 bp (McPherron and Lee, 1997). Dvi šio geno iššifruotos 800 ir 1500 ilgio bp sekos buvo rastos kiaulių raumenyse bei pieno liaukose. (Sonstegard et al., 1998) Kiaulių miostatino genas sudarytas iš trijų egzonų, kurių ilgiai 373, 374 ir 381 bp atitinkamai. Aktyvi baltymo forma apima 376 amino rūgštis. Buvo aptikti kai kurie geno pakitimai kiaulių tarpe, tačiau jų paplitimas labai nedidelis. Tai reiškia, kad kiaulių tarpe miostatino genas daug stabilesnis nei galvijų tarpe. Geno stabilumą dar kartą patvirtina ir tai, kad didelio raumeningumo kiaul÷ms retai pasireiškia raumenų hiperplazija. Tačiau joms būdinga raumenų hipertrofija, ypač Pjetr÷nų ir Belgijos landrasų veisl÷ms. Remiantis atliktais tyrimais teigiama, jog Jorkšyrų veisl÷s kiaul÷s geba geriau sintetinti baltymus raumenyse (Ezekwe and Martin, 1975), tod÷l jos raumeningesn÷s nei to paties amžiaus ir svorio kitų veislių kiaul÷s.
Buvo nustatyta, kad kiaulių miostatino genas veikia tiek m÷sines tiek pen÷jimosi savybes. (Saumillion et al., 1997; Cieslak et al., 2003; Fausto et al., 2005)
1.3.2. Halotano (HAL) genas
Šeštoje kiaulių chromosomose atrastas recesyvinis halotano genas (Brenig, Brem, 1992). Jis paveldimas autosominiu būdu, t.y., jei genas homozigotin÷s būsenos (PP), kiaul÷s jautrios stresams, jei heterozigotin÷s (NP) tokios kiaul÷s yra šio geno nešiotojos (Gahne, Juneja, 1985). Streso (HAL) genas charakterizuojamas kaip kiaulių streso sindromo (PSS) genas arba piktybin÷s hipertermijos genas (Kerry et al., 2002, Morgan Jones, 1995).
Stresams jautrios kiaul÷s mažiau rezistentiškos, prastesn÷s jų reprodukcin÷s, pen÷jimosi savyb÷s, prastesn÷ m÷sos kokyb÷. Tokių kiaulių skerdenose daugiau yra m÷sos su PSE (blyški, minkšta, vandeninga) bei DFD (tamsi, kieta, sausa) sindromais. Tokią m÷są perdirbant did÷ja gamybos kaštai, maž÷ja produkcijos išeiga, o galiausiai – blog÷ja ekonominiai kiaulienos gamybos rodikliai (Gahne, Juneja, 1985; Smet et al., 1997).
Įvairių veislių kiaul÷s į stresus reaguoja skirtingai. Labai produktyvių veislių gyvuliai yra jautresni. Dažniausiai tai m÷sinių veislių kiaul÷s, ilgai selekcionuotos m÷singumo kryptimi. Tokių gyvulių organizme vykstantys intensyvūs metabolizmo procesai skatina
mas÷s augimą, o adaptacin÷s savyb÷s prast÷ja. Jautriausi stresams yra Pjetr÷nai ir įvairios selekcijos Landrasai (Knorr et al., 1994; Klimas, 2002; Miceikien÷ I., Jokubka R., 2000; Jokubka R., Miceikien÷ I., 2001).
1.3.3 Augimo hormono (GH) genas
Augimo hormono genas yra (GH) genas kandidatas, kontroliuojantis kiaulių augimą ir riebalų atsid÷jimą organizme. Kiaulių GH genas yra sudarytas iš 190 amino rūgščių ir jį išskiria priešakin÷s hipofiz÷s somatotropin÷s ląstel÷s. Augimo hormono genas buvo žinomas, kaip turintis didelę įtaką kiaulių skerdenos kokybei. Suleidus kiaul÷ms augimo hormono, padidinamas kasdieninis gyvo svorio priaugimas, pašaro įsisavinimas ir liesos m÷sos kiekis skerdenoje (Pierzchala M., 2004).
1.3.4. Rapole (RN) genas
RN genas lokalizuotas 15 kiaulių chromosomos trumpojo petuko (q21-22) regione. Šis genas dar yra žinomas kaip Hempšyrų genas, nes hempšyrų veisl÷s kiaul÷s yra geno nešiotojos. RN genas įtakoja kiaulių m÷singumą ir m÷sos kokybę. Jis paveldimas dominantiniu būdu. Nuo geno būkl÷s tiesiogiai priklauso glikolitin÷s reakcijos greitis. Esant genui dominantin÷je būkl÷je pastarosios reakcijos greitis padid÷ja, tod÷l greičiau skyla baltymai, pablog÷ja vandens rišlumas, padid÷ja (5 - 6%) virimo nuostoliai.
RN geno neigiamų pasekmių priežastis yra glikogeno kiekio padid÷jimas raumenyje, tose kiaul÷se, kurios turi geną. Šis genas egzistuoja 2 alelinių genų formoje: rn + alelinis genas (normalus alelinis genas) ir RN-alelinis-genas (alelinis genas su neigiamu efektu N). Ligi šiol, šis genas buvo surastas Hempšyrų veisl÷je ir Hempšyrų mišrūnų linijose. Nepalankus alelinis genas (RN) paveikia technologinę m÷sos kokybę, radikaliai didindamas glikogeno kiekį. Glikogenas yra susikaupusio cukraus kiekis, kurio atsargos yra kaupiamos kepenyse ir raumenyse. Po skerdimo, glikogenas raumenyse yra paverčiamas į pieno rūgštį, kuri sumažina raumens pH. Tod÷l, kuo daugiau glikogeno yra raumenyje, tuo pieno rūgšties bus daugiau pagaminta ir tuo bus žemesnis galutinis raumens pH. Padidintas pieno rūgšties kiekis, gali būti priežastis to, kad raumens pH nukrenta žemiau 5,5 per 24 valandas po skerdimo. "Rūgšti m÷sa" labai panaši savo savyb÷mis į išblyškusią, minkštą ir vandeningą (PSE) m÷są, sukeltą PSS geno. Iš tikrųjų, kai PSS genas dalyvauja, jis stiprina padarinį RN geno m÷sos kokybei. Skirtingai nuo HAL geno, RN genas turi poveikį turiniui, bet ne normai, pH nukritimo (pH 24 val. <5.5), kuris priveda prie “ rūgščios m÷sos”, geriau žinomos kaip Hampšyro padarinys. RN-alelinio geno pasekm÷ yra vandeninga m÷sa (4% skirtumas) ir
padid÷ję virimo nuostoliai (8 % skirtumas), sąlygojantis didelius finansinius nuostolius. Neseni atradimai molekulin÷je genetikoje, leido nustatyti RN geną 15 chromosomoje ir kitimą PRKAG3 gene, susijusiame su glikogeno kiekiu. Jie gali būti identifikuoti nauju molekuliniu metodu, geresnei šio geno kontrolei (Hamilton et al., 2001).
1.3.5. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas
Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas yra lokalizuotas kiaulių 1 chromosomoje (SSC1) q22-27 regione ir artimas kitiems žymenims esantiems (SSC1). MC4R genas vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant kiaulių medžiagų apykaitos energijos balansą, tai riebalų atsid÷jimą, augimo greitį ir maisto medžiagų pasisavinimą. Kiaulių energijos balansas remiasi energijos suvartojimu iš maisto medžiagų kūno energijai ir medžiagų apykaitai. Melanokortino 4 receptorius pasireiškia smegenyse tarpininkaujant leptinui įtakoja maisto medžiagų apykaitą. Melanokortino 4 receptoriaus lokuso nustatytas pleotropinis poveikis produktyvumo savyb÷ms: paros priesvoriui (g), nugaros lašinių storiui (mm), raumeningumui (%). Šis genetinis žymuo gali būti naudojamas veisimo tikslais atrenkant gyvulius pagal tokius požymius kaip riebalų atsid÷jimas, augimo greitis bei pašarų pasisavinimas. Nustatyta, melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) geno įtaka Lietuvos baltųjų kiaulių augimo greičiui ir skerdienos kokybei.
1.4. Leptino genas
Pastaraisiais metais daug tyrimų atliekama norint išsiaiškinti leptino įtaką svorio reguliavime, paaiškinant nutukimo fiziologiją (Barata et.al., 2002).
Leptinas yra 16 – kDa baltymo hormonas, kurį koduoja nutukimo (ob) genas ir kuris veikia hipotaliamo receptorius bei reguliuoja maisto suvartojimo ir energijos balansą (http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=19181784) .
Šis proteinas priklauso citokinų šeimai, taip pat kaip ir augimo hormonas ir prolaktino receptorius (Houseknecht ir kt., 1998). Leptiną daugiausiai gamina adipocitai, kurie formuoja riebalinį audinį (Harigaya ir kt., 1997), taip pat jį gamina smegenys, širdis, placenta, skrandžio sienel÷s ir kai kurios neoplazmos (Barb C.R., 1999).
Leptinas yra polipeptidas, vaidinantis svarbiausią vaidmenį reguliuojant energiją homeostaz÷je ir taip pat, šalia kitų, yra susijęs su mechanizmais, kontroliuojančiais reprodukcijos procesą. Duomenys apie leptino dalyvavimą, kontroliuojant reprodukcines
funkcijas kiaul÷se hipotaliamo ir hipofiziniu lygiu, yra riboti (http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=17790857).
Kiaul÷se leptinas sudarytas iš 167 amino rūgščių, iš 18,661 kDa molekulin÷s mas÷s (Bidwell ir kt., 1997). Leptinas gaminasi kiaulių riebaliniame audinyje
(http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.htm?seq_no_115=173159 ). Leptiną sudaro keturios alfa – spiral÷s (žr. 2pav.apačioje). Kaip apraš÷ mokslininkas Zhang ir kiti (Zhang et.al,1997) leptino alfa – spiral÷s yra labai panašios. Keturios spiral÷s gali būti išsid÷stę viena ant kitos pagal aukšto lygio seką ir struktūrinį panašumą. Taip pat svarbu pasteb÷ti, kad amino rūgščių seka yra labai išsaugota tarp rūšių. Šis sekos panašumas reiškia, kad leptinas yra svarbus baltymas, reikalingas riebalų reguliavimui.
2 pav. Leptino piešinys. Iš šio paveiksl÷lio galima matyti, kad leptinas yra sudarytas iš keturių alfa spiralių. Piešinys gautas iš PDB.
(http://www.rcsb.org/pdb/index.html)
Kaip matome kitame paveiksl÷lyje, leptinas sudarytas iš dviejų peptidų. Nors tiktai vienas genas koduoja šį baltymą (ob), suformuojami du peptidai. Taip yra d÷l potransformacin÷s modifikacijos, kurios metu nepilnas baltymas suskaidomas į du funkcinius peptidus. Būtent ši baltymų forma yra išskiriama į kraujotaką.
(http://www.rcsb.org/pdb/index.html)
Leptinas yra išskiriamas į kraujotaką ir padeda reguliuoti riebalų kiekį, sukauptą organizme. Jis veikia kaip savotiškas lipostatas; kai yra daugiau leptino kraujotakoje, padid÷ja energijos sąnaudos ir sumaž÷ja maisto suvartojimas, o kai leptino yra mažiau, sumaž÷ja energijos sąnaudos ir suvartojama daugiau maisto. Žemiau esantis paveiksl÷lis puikiai pademonstruoja, kaip veikia leptinas kūne, reguliuodamas riebalų atsargas.
Svorio sumaž÷jimas Svorio padid÷jimas
Padid÷jęs maisto suvartojimas Sumaž÷jęs maisto suvartojimas Sumaž÷jusios energijos sąnaudos Padid÷jusios energijos sąnaudos
4 pav. Santykis tarp riebalų kiekio kūne ir leptino išskyrimo. Geltoni apskritimai yra adipocitai.
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/bodyweight/leptin.html. Tyrimai su pel÷mis parod÷, kad leptino injekcijos į genetiškai nutukusių pelių kraujotaką sukelia žymų maisto suvartojimo sumaž÷jimą ir labai padidina energijos sąnaudas. Šios pel÷s praranda didelę dalį savo kūno svorio ir sugeba išlaikyti šį svorį, jei ir toliau leidžiamos leptino injekcijos. Manoma, kad nutukę asmenys tapo atsparūs leptinui. Leptinas gaminasi šiuose asmenyse, bet baltymai negali būti tinkamai panaudoti, reguliuojant riebalų kiekį kūne (Leptin, 1997). Tai reiškia, kad šių asmenų problema gali būti susijusi su leptino baltymo nesusijungimu su savo receptoriumi. Atrodo, kad jei asmuo apkūnus, leptino lipostatas atmetamas ir nors svorio did÷jimo metu išskiriama daugiau leptino, atrodo, kad kūnas nejaučia, kad gaminasi baltymai. Leptino baltymo ar leptino receptorių mutacijos gal÷tų
būti kūno nesugeb÷jimo atpažinti leptino gaminimąsi priežastis. Kita galimyb÷ yra tokia, kad tas leptinas, kuris gaminasi kūne, negali išskirti į kraujotaką. Tai gali būti d÷l struktūrin÷s mutacijos baltymuose, kuri neleidžia jam praeiti per adipocito membraną, kur jis yra gaminamas ir į kraujotaką, kur jis gali jungtis prie savo receptoriaus (http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2005/Amore/leptin.html).
Kiaulių leptinas yra 16 – kDA dydžio baltymas, gaminamas riebalin÷se ląstel÷se, kuris reguliuoja pašaro pasisavinimą, energijos atidavimą bei viso organizmo energijos balansą. Leptino genas yra 18 chromosomos q13-q21 regione. Leptinas reguliuoja GH sekreciją, reguliuodamas pagumburio somastatino geno ekspresiją. Kadangi leptino receptoriai buvo rasti hipofizio ląstel÷se, tai iškelta prielaida, kad yra ryšys tarp leptino ir augimo hormono (Baratta, 2002). Hardge ir kiti rado ryšį tarp LEP geno polimorfizmo ir raumens bei riebalų santykio. CHEN Chi-Chen ir kiti rado 1 introne ir 3 Lep geno egzone esančius polimorfizmus Diurokų, Jorkšyrų ir Landrasų veislių kiaul÷se. 3 egzone rastas polimorfizmas paveikia reprodukcines savybes, tokias kaip vados dydis pirmame paršingume, bei atitinkamai 1-4 paršingumuose (P<0,05) Landrasų veisl÷je ir 12-4 paršingumuose Diurokų veisl÷je. Polimorfizmas rastas 1 introne paveikia tik pirmo paršingumo vados dydį Diurokų veisl÷je (P<0,05). 3 egzone rastas polimorfizmas turi įtakos produktyviosioms savyb÷ms, tokioms kaip vidutinis paros prieaugis bei pašaro įsisavinimas (P<0,05) Landrasų ir Jorkšyrų veisl÷je. 1 introne esantis polimorfizmas paveikia tik nugaros lašinių storį (P<0,05) Diurokų veisl÷je. Tyrimų rezultatai rodo aukštesnes reprodukcines savybes, bei mažesnį genotipo dažnį. Duomenys rodo, kad ilgalaik÷ selekcija pageidaujamų požymių kryptimi gali būti priklausoma nuo leptino geno polimorfizmo (CHEN Chi-Chen, 2004). Peixoto ir kiti ištyr÷ LEP geno C798T, T2411C, T3266G ir T3469C polimorfizmus įvairių mišrūnų F2 kartos. C798T polimorfizmas susijęs su bendru spenių skaičiaus kitimu (P<0,02), bei kair÷s pus÷s spenių skaičiumi (P,0,03), o T3469C polimorfizmas paveikia svorį 21 dienoje (P<0,03), 41 dienos amžiuje (P<0,05), 63 dienos amžiuje (P<0,03), 77 dienų (P<0,04) amžiuje, taip pat ir pašaro įsisavinimą (P<0,01), vidutinį dienos priesvorį (P<0,01), kumpio atsid÷jimą (P<0,03), paršavedžių svorį (P<0,03). T3469C ir C798T genotipų kitimai paveikia fenotipinius požymius. C798T genotipo ir lyties saveikoje nustatyti keletas požymių (Peixoto, 2006). Urban nustat÷ LEP-HinfI polimorfizmą Didžiųjų Baltųjų, Landrasų ir Diurokų veisl÷se. Alelių dažnis šiose populiacijos buvo C = 0.139 T = 0.861. Didžiausias dažnis buvo T alelio (0,861), o CC genotipą tur÷jo tik 1,8 % gyvulių. T alelio dažnis Didžiųjų Baltųjų, Landrasų ir Diurokų veisl÷se atitinkamai buvo 0,846; 0,927; 0,786. Stratil ir kiti (1997) nustat÷ analogiškus alelių dažnius Didžiųjų Baltųjų, Landrasų ir Hempšyrų veisl÷se. O meishan
veisl÷s gyvuliai buvo monoaleliniai. Krenkova (1999) nustat÷ didesnį T alelio dažnį (0,91), o CC genotipo nebuvo mišrūnių kiaulių populiacijoje (Didžioji Baltoji, Landrasai, Pjetr÷nai) (Urban, 2006). Kuryl nustat÷, kad TT genotipo kiaul÷s yra pranašesn÷s, kadangi turi mažesnį lašinių storį nei CT genotipo kiaul÷s. Ernst tyrin÷jo 2 laukinių šernų porūšius, ir nustat÷, kad T alelis pasireiškia 0,87 dažniu (Ernst, 2003). Ramsay ir kiti (1998) nustat÷, kad riebų fenotipą turinčių kiaulių kraujo serume leptino koncentracija buvo 306 % didesn÷, nei tokio paties amžiaus neriebaus fenotipo mišrūnių kiaulių kraujyje. Jie nustat÷ keturis naujus leptino geno polimorfizmus ir jų ryšį su riebumu.
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimų medžiaga ir metodai
M÷giniai tyrimams imti iš Valstybin÷je kiaulių veislininkyst÷s stotyje Baisogaloje laikomų 40 kiaulių .
Tyrimų metodai
DNR skyrimas iš plaukų
Kiaulių leptino geno (LEP) padauginimas polimeraz÷s grandin÷s reakcijos metodu (PGR);
Kiaulių leptino geno (LEP) variantų identifikavimas restrikcinių fragmentų ilgio polimorfiškumo tyrimo metodu (RFIP).
Leptino geno (LEP) variantų frakcionavimas horizontalios elektroforez÷s metodu agaroz÷s gelyje bei gelio dažymas etidžio bromidu; analiz÷ Herolab video dokumentavimo sistema.
Kiaulių produktyvumo ir produkcijos kokyb÷s požymių duomenų baz÷s suformavimas.
Leptino geno įtakos kiaulių produktyvumo ir produkcijos kokyb÷s savyb÷ms įvertinimas.
2.2 Kiaulių fenotipinių požymių duomenų baz÷s
Buvo surinkti duomenys ir suformuota kiaulių sekančių požymių duomenų baz÷: Pen÷jimosi savyb÷s –
amžius skerdimo metu, d.; amžius esant 100 kg mas÷s, d.; priesvoris per parą, g.; suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį; pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio.
M÷sin÷s savyb÷s –
šiltos skerdienos mas÷, kg; skerdienos pusel÷s ilgis, cm; bekono pusel÷s ilgis, cm; nugaros raumens plotas, cm²; kumpio mas÷, kg; lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm; lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm; lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm; lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu; lašinių storis taške Fat1, mm; lašinių storis taške Fat2,mm; raumeninis storis taške Fat2, mm; raumeningumas, %.
2.3 DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio ląstelių
Nukerpami 4-5 plaukų svogūn÷liai ir patalpinami į m÷gintuv÷lius. Paruošiamas lizavimo mišinys (DTT -7,5 µl, Chelex- 200µl, Protenaze K (20mg/ml)- 10.7µl). M÷gintuv÷lio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 218,2µl paruošto mišinio). M÷gintuv÷liai 30s maišomi maišykl÷s „Vortex" pagalba. Centrifuguojami l0 s 13500 aps./min greičiu. Pavyzdžiai 30 min inkubuojami 56°C temperatūroje. Po inkubacijos m÷giniai (po 10µm) pakaitinami 94°C temperatūroje (inaktyvuojami - amplifikatoriuje) bei paliekami nakčiai.
2.4 DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genomin÷s DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba. Tam tikslui paruošiamas l00 µl skiestos DNR tirpalas: imama l0 µl koncentruotos DNR ir skiedžiama 90µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50ug dvigrand÷s DNR.
DNR kokyb÷ įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti pakartotinį genomin÷s DNR valymą.
Šiuo metu laboratorijose naudojami spektrofotometrai iš karto nustato ir apskaičiuoja tiek DNR, tiek baltymų koncentraciją tirpale.
2.5 Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija (PGR)
Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija yra metodas, pavadintas pagal DNR polimerazę, fermentą, vykdantį DNR replikaciją ląstel÷je. Tai yra nukleino rūgščių sintez÷s in vitro
metodas, kuriuo laboratoriniame m÷gintuv÷lyje gali būti specifiškai padauginti (amplifikuoti) atskiri DNR fragmentai. PGR metodas yra labai jautrus, tod÷l padauginti pasirinkta DNR atkarpa gali sudaryti netgi vieną milijoninę bendro DNR pavyzdžio dalį. Tai reiškia, kad, naudojant PGR galima amplifikuoti net ir vienintelį pasirinktą geną.
2.5.1 Kiaulių Leptino geno (LEP1) (PGR-RFIP) tyrimo metodika
LEP1 geno pradmenys: Pirminis (5‘ –CAACTCACCGTCGCTTTCTTGAT-3‘) Atvirkštinis (5‘ –AGGGAAGCGGAGGAGCAAAG-3‘)
PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (µl)
Geros kokyb÷s dejonizuotas vanduo ddH2O 2,95
Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
MgCl2 (konc. 50mM) 1,5
dNTP miksas (2mM) 2,5
Pirminis pradmuo (darbin÷ konc. 20pmol) 2,5
Atvirkštinis pradmuo (darbin÷ konc. 20pmol) 2,5
BSA 0,25
Taq polymeraz÷ (1vnt./µl) aktyvumo 0,3
PGR atliekama automatiniame amplifikatoriuje GeneAmp ® PGR sitema 2700, PGR režimas:
94 OC,3 min (pirmin÷ denatūracija) 94 OC, 45 s (denatūracija),
61 OC 45 s (oligonukleotidų prisijungimas), 72 OC 45 s (DNR grandin÷l÷s sintez÷).
72 OC, Sintez÷s užbaigimui 5 min. Laikyti: 4 OC Reakcija atliekama 35 ciklus LEP1 geno variantų ištyrimas
PGR produktas – 569 bp
DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentu TaqI: A (alelis) -569 bp
2.5.2 Kiaulių Leptino geno (LEP2) (PGR-RFIP) tyrimo metodika
LEP2 geno pradmenys: Pirminis (5‘ –GAGCCAACATCTCTCTGGCTGAG-3‘) Atvirkštinis (5‘ –GACTCCTGGAAGCTCAGGTTTCTT-3‘)
PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (µl)
Geros kokyb÷s dejonizuotas vanduo ddH2O 2,95
Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
MgCl2 (konc. 50mM) 1,5
dNTP miksas (2mM) 2,5
Pirminis pradmuo (darbin÷ konc. 20pmol) 2,5
Atvirkštinis pradmuo (darbin÷ konc. 20pmol) 2,5
BSA 0,25
Taq polymeraz÷ (1vnt./µl) aktyvumo 0,3
PGR atliekama automatiniame amplifikatoriuje GeneAmp ® PGR sitema 2700, PGR režimas:
94 OC,3 min (pirmin÷ denatūracija) 94 OC, 45 s (denatūracija),
61 OC 45 s (oligonukleotidų prisijungimas), 72 OC 45 s (DNR grandin÷l÷s sintez÷).
72 OC, Sintez÷s užbaigimui 5 min. Laikyti: 4 OC Reakcija atliekama 35 ciklus LEP2 geno variantų ištyrimas
PGR produktas – 469 bp
DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentu HinfI: C (alelis) -347 bp, 118 bp, 4 bp
T (alelis) - 465 bp, 4 bp
2.6 Statistin÷ duomenų analiz÷
Kiaulių LEP1 ir LEP2 alelių ir genotipų dažnumai tirtoje grup÷je, faktinis ir prognozuojamas heterozigotiškumas tirtuose lokusuose buvo apskaičiuoti R – statistiniu paketu (http://www.r-project.org/).
Vertinant LEP1 ir LEP2 genų įtaką kiaulienos kiekybiniams ir kokybiniams rodikliams buvo atlikta vienfaktorin÷ dispersin÷ analiz÷ Vienfaktorin÷s analiz÷s būdu buvo įvertinta atskirų genų ir agreguotų genotipų įtaka fenotipiniams požymiams.
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS
3.1. Kiaulių LEP 1 ir LEP 2 genų polimorfizmo ištyrimas
Viso buvo paimta 40 kiaulių m÷ginių, iš kurių buvo išskirta DNR, nustatyta jos koncentracija bei švarumas. Buvo tiriami du leptino geno lokusai - LEP1 ir LEP2. Tiriami genai buvo padauginti polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos metodu, o jų aleliai identifikuoti skaldant gautus PGR produktus karpymo fermentais. Visuose tirtuose genuose rasta po 2 skirtingus alelius (2 lentel÷, 5, 6 ir 7 paveikslai).
2 lentel÷. Rastas LEP1, LEP2 genų alelių skaičius tirtoje kiaulių grup÷je
Lokusas Alelių skaičius
LEP1 2
LEP2 2
Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą visoje tirtoje gyvulių grup÷je faktinis heterozigotiškumas buvo rastas didesnis, nei teorinis, kas rodo pakankamą genetin÷s įvairov÷s kiekį tirtuose lokusuose, nors skirtumas n÷ra statistiškai reikšmingas (3 lentel÷).
Atskiruose lokusuose taip pat stebimas didesnis faktinis heterozigotiškumas nei prognozuojamas, kas sudaro prielaidas vykdyti gyvulių selekciją pagal šiuos genus (4 lentel÷).
3 lentel÷. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas tirtoje kiaulių grup÷je
Heterozigotiškumas Tirta kiaulių grup÷
Faktinis heterozigotiškumas 0,463
Teorinis heterozigotiškumas 0,372
χ2 – kriterijaus reikšm÷
4 lentel÷. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas tirtose genų lokusuose
Lokusas H faktinis H teorinis χ
2 – kriterijaus reikšm÷ (P – reikšm÷) LEP1 0,375 0,305 2,13 (p=0,345) LEP2 0,421 0,375 2,97 (p=0,201)
Kiaulių LEP1 geno A alelis rastas 0,188 dažniu, o G alelis 0,813 dažniu; gyvuliai su AA genotipu nerasti, AG genotipą tur÷jo 37,5 proc. tirtų kiaulių, GG genotipą 62,5 proc. (5 lentel÷). Kiaulių LEP2 geno C alelis rastas 0,81 dažniu, T alelis 0,19 dažniu: TT genotipą tur÷jo 12,7 proc. tirtų kiaulių, CT genotipą 8,5 proc., CC genotipą 78,8 proc.(6 lentel÷).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5 paveikslas. Leptinas1 (LEP1): 1 – markeris, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16 – PGR produktas; 3, 5, 7, 9, 17 – GG genotipas;13, 15 – AG genotipas.
5 lentel÷. LEP1 genotipų ir alelių dažniai
LEP1 N Dažniai Aleliai Dažniai
AA 0 0,000 A 0,188
GA 15 0,375 G 0,813
GG 25 0,625
40 1 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
6 paveikslas. Leptinas 2: 1 - markeris; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 – PGR produktas; 3, 5, 7, 11, 17 – TT genotipas; 9, 13,15, 19 – CT genotipas.
7 paveikslas. Leptinas2: 1 – markeris; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 – PGR produktas; 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 – CC genotipas.
6 lentel÷. LEP2 genotipų ir alelių dažniai
LEP2 N Dažniai Aleliai Dažniai
TT 6 0,13 C 0,81
CT 4 0,08 T 0,19
CC 37 0,79
Viso 47 1 1
3.2. Kiaulių LEP 1 ir LEP 2 genų polimorfizmo ryšio su fenotipiniais
požymiais ištyrimas
Siekiant įvertinti LEP1 ir LEP2 genų įtaką m÷sin÷ms savyb÷ms buvo suformuota sekančių fenotipinių požymių duomenų baz÷ - šiltos skerdenos mas÷, skerdenos pusel÷s ilgis, bekono pusel÷s ilgis, nugaros raumens plotas, kūno mas÷, lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, lašinių storis ties 10 šonkauliu, lašinių storis ties paskutiniu juosmens slaksteliu, lašinių storis taške Fat1, lašinių storis taške Fat2, raumens storis taške Fat2, raumeningumas. Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal LEP1 ir LEP2 genų homozigotinius ir heterozigotinius genotipus atskirai kiekvienam genui (7, 8 lentel÷s).
Tiriant LEP 1 geną šiltos skerdenos mas÷ gyvulių su genotipu GA buvo didesn÷ 0,05 kg, skerdenos pusel÷s ilgis gyvulių su genotipu GA buvo didesnis 0,22 cm. Bekono pusel÷s ilgis 0,01 cm didesnis gyvulių su genotipu GG, to paties genotipo GG didesnis ir nugaros raumens plotas 2,68 cm², bei kumpio mas÷ 0,23 kg didesn÷ nei GA gyvulių genotipo. Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu gyvulių su genotipu GA buvo didesnis 2,45 mm, to paties genotipo didesnis ir lašinių storis ties 10 šonkauliu 3,04 mm. Gyvulių su genotipu GA buvo didesnis ir lašinių storis už paskutinio šonkaulio 2,79 mm, lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu 3,0 mm, lašinių storis taške Fat1 2,44 mm, lašinių storis taške Fat2 1,95 mm. O raumens storis taške Fat2 didesnis gyvulių su genotipu GG 2,41 mm, kaip ir didesnis raumeningumas 2,3 %.
7 lentel÷. LEP1 geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms Genotipa s n Šiltos skerdenos mas÷, kg Skerdenos pusel÷s ilgis, cm Bekono pusel÷s ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm² Kumpio mas÷, kg Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm Lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm GA 15 75,33± 0,13 99,36± 0,392 78,27± 0,419 36,85± 1,416 A 11,57± 0,077 a 21,13± 1,367 A 20,2± 1,488 A GG 25 75,28± 0,139 99,14± 0,371 78,28± 0,339 39,53± 0,831 B 11,8± 0,053 b 18,68± 0,78 B 17,16± 0,895 B
A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05) 7 lentel÷s tęsinys Genotipa s n Lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm
Lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu Lašinių storis taške Fat1, mm Lašinių storis taške Fat2, mm Raumens storis taške Fat2, mm Raumeningum as, % GA 15 20,47± 1,328 A 18,6± 1,33 A 19,8± 1,342 A 18,07± 1,296 42,27± 2,029 51,86± 1,335 A GG 25 17,68± 0,736 B 15,6± 0,849 B 17,36± 0,732 B 16,12± 0,788 44,68± 1,159 54,16± 0,717 B
A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05)
Tiriant LEP 2 geną šiltos skerdenos mas÷ gyvulių su genotipu TT (75,50 kg) buvo didesnis, nei CC (75,33 kg) ir CT (74,90 kg) genotipų. Skerdenos pusel÷s ilgis buvo didesnis gyvulių su genotipu CC 1,6 cm, lyginant su genotipais CT ir TT. Bekono pusel÷s ilgis buvo didesnis genotipo CC ~1,9 cm, nei genotipų CT ir TT. Nugaros raumens plotas gyvulių su genotipu TT (42,70 cm) buvo didesnis nei genotipo CC (40,30 cm) ir genotipo CT (39,70 cm). Gyvulių su genotipu TT buvo didesn÷ ir kumpio mas÷, kuri siek÷ 12,10 kg, kai tuo tarpu kitų gyvulių genotipų CT (11,70 kg), CC (11,08 kg). Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu buvo didesnis gyvulių su genotipu CC (18,20 mm), šiek tiek mažesnis lašinių storis buvo genotipo TT (18,00 mm), o mažiausias storis genotipo CT (15,90 mm). Lašinių storis ties 10 šonkauliu buvo didžiausias gyvulių su genotipu TT (17,40 mm), o mažiausias genotipo CT (15,90 mm). Lašinių storis už paskutinio šonkaulio gyvulių su genotipu TT (18,00 mm) buvo didesnis, nei
genotipų CC (17,3 mm) ir CT (15,70 mm). Lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu buvo didžiausias gyvulių su genotipu CC (15,2 mm), o mažiausias genotipo CT (12,9 mm). Lašinių storis taške Fat1 buvo didžiausiasgenotipo CC (17,1 mm), o genotipų TT (16,83 mm) ir CT (14,8 mm). Lašinių storis taške Fat2 buvo didesnis genotipo CC (15,5 mm), genotipo Ttduomenys mažai kuo skir÷si nuo genotipo CC, nes storis siek÷ 15,6 mm, o gyvulių su genotipu CT lašinių storis buvo mažiausias (12,3 mm). Raumens storis taške Fat2 buvo didžiausias genotipo TT (50,5 mm), o mažiausias gyvulių su genotipu CC (45,54 mm). Raumeningumas visų trijų genotipų buvo apytiksliai vienodas, didžiausias buvo gyvulių su genotipu CT (56,9 %), šiek tiek mažesnis genotipo TT (55,5 %), mažiausias CC (54,5%).
8 lentel÷. LEP2 geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms
Genotipa s n Šiltos skerdenos mas÷, kg Skerdenos pusel÷s ilgis, cm Bekono pusel÷s ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm² Kumpio mas÷, kg Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm Lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm CC 37 75,33± 0,120 99,20± 0,292 78,30± 0,319 40,30± 0,426 11,08± 0,067 18,20± 1,367 A 16,70± 0,488 A CT 4 74,90± 0,141 97,60± 0,351 76,50± 0,329 39,70± 0,721 11,70± 0,053 15,90± 0,780 B 15,90± 0,755 B TT 6 75,50± 0,319 97,60± 0,120 76,60± 0,325 42,70± 0,292 12,10± 0,329 18,00± 0,632 17,40± 0,734
A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05) 8 lentel÷s tęsinys Genotipa s n Lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm
Lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu Lašinių storis taške Fat1, mm Lašinių storis taške Fat2, mm Raumens storis taške Fat2, mm Raumeningum as, % CC 37 17,3± 1,328 A 15,2± 1,33 A 17,1± 1,342 A 15,5± 1,296 45,54± 2,029 54,5± 1,335 A CT 4 15,70± 0,736 B 12,9± 0,849 B 14,8± 0,732 B 12,3± 0,788 45,8± 1,159 56,9± 0,717 B TT 6 18,00± 14,7± 16,83± 15,16± 50,5± 55,5±
0.356 0,852 0,831 0,956 1,125 0,875
A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05)
Kiaulių leptino genas LEP1 ir LEP2 ženkliai įtakoja lašinių kiekį – LEP1 GG genotipo kiaul÷s ir LEP2 CT genotipo kiaul÷s buvo liesiausios, o jų raumeningumas didžiausias (7 lentel÷ ir 8 lentel÷).
Siekiant įvertinti LEP1 ir LEP2 genų įtaką pen÷jimosi rodikliams buvo suformuota sekančių fenotipinių požymių duomenų baz÷ – amžius skerdimo metu, amžius esant 100 kg mas÷s, priesvoris per parą, suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį, pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio.
Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal LEP1 ir LEP2 genų homozigotinius ir heterozigotinius genotipus atskirai kiekvienam genui (9 ir 10 lentel÷s).
Tiriant LEP 1 geną amžius skerdimo metu buvo didesnis 12,87 dienomis gyvulių su genotipu GA, amžius esant 100 kg mas÷s taip pat buvo didesnis genotipo GA 13,54 dienomis. Priesvoris per parą buvo didesnis gyvulių su genotipu GG 45,43g. Gyvulių su genotipu GA buvo daugiau suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį 4,88, pašarų sąnaudos 1 kg priesvoriui buvo didesn÷s GA genotipo 0,05.
9 lentel÷. LEP1 geno įtaka kiaulių pen÷jimosi savyb÷ms
Genotipas n Amžius skerdimo metu,d. Amžius esant 100 kg mas÷s, d. Priesvoris per parą, g Suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį Pašarų sanaudos 1 kg priesvorio GA 15 185,67±2,809 a 192,19±2,808 a 684,16±17,201 183,95±0,919 a 2,77±0,025 GG 25 172,8±2,769 b 178,65±2,933 b 729,59±19,221 179,07±1,865 b 2,72±0,031 AA - - - -
a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje (p<0,05)
Tiriant LEP 2 geną amžius skerdimo metu buvo didžiausias gyvulių su genotipu CC (168,82 d), o mažiausias genotipo CT (161 d), amžius esant 100 kg mas÷s taip pat buvo didesnis genotipo CC, nuo genotipo CT skir÷si 8 dienomis,o nuo genotipo TT 2 dienomis. Priesvoris per parą buvo didesnis gyvulių su genotipu TT, lyginant su genotipu CC jis buvo didesnis 32,2 g, o su genotipu CT 6,7 g. Gyvulių su genotipu CC buvo daugiau suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį 2,16 lyginant su genotipu CT, ir 2,8 lyginant su TT genotipu.
Pašarų sąnaudos 1 kg priesvoriui buvo didesn÷s CT genotipo 0,09, nei genotipo CC, ir 0,11 nei TT genotipo.
10 lentel÷. LEP2 geno įtaka kiaulių pen÷jimosi savyb÷ms
Genotipas n Amžius skerdimo metu,d. Amžius esant 100 kg mas÷s, d. Priesvoris per parą, g Suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį Pašarų sanaudos 1 kg priesvorio CC 37 168,82±2,709 a 175,50±2,809 a 756,40±13,203 178,20±0,731 a 2,71±0,037 CT 4 161,00±2,127 b 167,90±2,133 b 781,9±16,233 176,04±2,761b 2,80±0,025 TT 6 166,83±2,235 173,00±2,675 788,60±19,352 175,40±1,952 2,69±0,067
a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje (p<0,05)
Įvertinus leptino geno įtaką pen÷jimosi fenotipiniams rodikliams nustatyta, kad mažiausios pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio buvo kiaulių, kurios tur÷jo LEP1 GG genotipą ir
LEP2 TT genotipą (9 ir 10 lentel÷). Per pastaruosius keletą metų leptinas buvo plačiai tyrin÷jamas naminiuose gyvuliuose ir
kadangi leptinas yra svarbus energijos metabolizme, yra keletas pranešimų apie asociaciją tarp vieno nukleotido polimorfizmų (VNP) leptino gene ir produkcijos savybių kiaul÷se bei kituose naminiuose gyvuliuose. Pagal Van der Lende T. ir kt. (2005), šeši skirtingi VNP buvo panaudoti asociacijos analiz÷je kiaul÷se. Mūsų tyrimų rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų gautais tyrimų duomenimis. Jiang Z.H ir Gibson J.P (1999) ištyr÷ T 3469 C VNP skirtingose kiaulių veisl÷se ir pasteb÷jo asociaciją tarp nugaros riebalų kiekio ir Didžiosios Baltosios veisl÷s kiaulių turinčių mutuotą C alelį, asocijuojamą su didesniu riebumu. Kennes Y.M. ir kt. (2001) pasteb÷jo asociaciją tarp T3469C VNP ir Landrasų kiaulių pašarų suvartojimo, taip pat A 2845 T VNP ir amžiaus, esant 100 kg svoriui.
D÷l fiziologinių funkcijų, Barb C.R ir kt. (2001) teig÷, kad leptino geną reik÷tų laikyti genu kandidatu, įtakojančiu kiaulių skerdienos savybes. Buvo tiriama asociacija tarp leptino geno VNP (introninių nukleotidų pasikeitimų pozicijose 2411 (T‘!C) ir 3266 (T‘!G) ir skerdienos savybių F2 kiaulių populiacijoje, gautoje sukryžminus vietinę Brazilijos Piau kiaulę su komercin÷mis kiaul÷mis. Buvo pasteb÷ta statistiškai reikšminga koreliacija tarp abiejų VNP F2 kiaulių populiacijoje ir daugelio savybių, rodančių, kad leptinas atlieka fiziologinę funkciją skerdienos struktūros savyb÷se.
Lenkijoje buvo atlikti tyrimai, ieškant koreliacijų tarp leptino geno polimorfizmo ir pen÷jimosi ir skerdimo savybių. Tyrin÷toje kiaulaičių populiacijoje, 990 linijoje buvo
identifikuoti du LEP aleliniai genai C ir T. Buvo pasteb÷tas dviejų iš trijų galimų genotipų atsiradimas: TC ir TT. Alelinio geno T dažnis buvo 0.94, o alelinio geno C dažnis buvo 0.06. Didžioji dalis kiaulaičių tur÷jo TT genotipą (0.88), o heterozigotų dažnis buvo 0.12. Kiaulait÷s su CC genotipu nebuvo identifikuotos. Sukryžminus Landraso ir Didžiąją Baltąją veisles ir Pjetr÷nų su Didžiąją Baltąja, TT genotipo dažnumas buvo 0.85. Tačiau CC homozigotai nebuvo identifikuoti. Homozigotų su C aleliniu genu dažnumas buvo mažas, iki 0.15 lygio (Kulig ir kt., 2001), kur TT genotipas pakilo iki 0.76 lygio, o tai reišk÷, kad jis yra dominuojantis genotipas. Gavus tyrimų, atliktų su Diurokų, Jorkšyrų ir Landrasų veisl÷mis, rezultatus, nustatyta, kad C alelinio geno dažnumas taip pat buvo žemas (Kennes ir kt., 2001). Tačiau Stratil ir kt. (1997) gavo kitokius rezultatus. Tie autoriai atliko LEP geno tam tikrų alelinių genų atsiradimo dažnumo analizę, tirdami Meishan veislę, kuri yra paprastai žinoma kaip vaisingiausia kiaulių veisl÷. T alelinis genas nebuvo aptiktas, o visi individai buvo CC homozigotai. Skirtingose veisl÷se (Didžiosiose Baltosiose, Juodosiose Pied Prestice, Pjetr÷nų) pastebimas ryškus T alelinio geno dominavimas, kintantis iki 0.83 lygio (Stratil ir kt. 1997). Kuryl ir kt.(2003) savo tyrime naudojo Pjetr÷nų, Zlotnicka Spotted, Landrasų ir Torhyb, Stamboek bei PIC linijos veisles ir atrado, kad C alelinis genas rastas mažu dažniu visuose tiriamųjų veislių bei linijų atstovuose. CC genotipas buvo pasteb÷tas tiktai Landrasų veisl÷je, o jo dažnumas buvo 0.07. TT genotipas dominavo vienoje iš visų tiriamųjų veislių ir linijų. Szydlowski ir kt. (2004) ir Blicharski ir kt.(2004) savo naujesniuose tyrimuose teigia, kad C alelinio geno dažnumas kiaul÷se buvo žemas, dominuojant TT genotipui tiriamosiose šių veislių kiaulių populiacijose: Lenkiškoje Didžiojoje Baltojoje, Lenkiškoke Landrasų, ir 990 linijoje. Viename iš naujausių tyrimų, susijusių su kiaulait÷mis, gimusiomis, sukryžminus Lenkišką Didžiąją Baltąją su Lenkiška Landrasų, buvo nustatyta CC, TC ir TT genotipų dažniai, atitinkamai 0.02, 0.18 ir 0.80 (Terman 2005). Taigi tyrimų rezultatai d÷l tam tikrų genotipų atsiradimo dažnumo atitinka bendras selekcijos tendencijas, vykstančias skirtingose kiaulių veisl÷se ir linijose.
Kulig ir kt. (2001) savo tyrimuose analizavo skirtumus tarp tam tikrų LEP genotipų, susijusių su pen÷jimo ir skerdenų verte ir tie tyrimai buvo atlikti su Lenkiškomis Landrasų kiaul÷mis. Jie nustat÷ individų su CC genotipu aukštesnį kasdieninį svorio prieauglį, lyginant su TT homozigotais (p ≤ 0.05). Blicharski ir kt. (2004) atliko tyrimus su Lenkiškomis Baltosiomis kiaul÷mis ir didžiausias kasdieninis prieauglis buvo aptiktas CC genotipo kiaulait÷se. Kasdieninis prieauglis buvo susietas su riebumu; tod÷l CC genotipo individai tur÷jo didžiausią kasdieninį prieauglį ir didžiausią riebumą. Kennes ir kt. (2001) gavo kitokius rezultatus, kur TT genotipo individai augo greičiau (p ≤0.05).
Kitas tyrimas buvo atliktas iš 112 kiaulių (http://www.funpecrp.com.br/gmr/year2008/vol7-4//pdf/gmr511.pdf). Šio tyrimo tikslas buvo identifikuoti ir palyginti nutukimo (leptino) geno polimorfizmo dažnį motinin÷se ir t÷vin÷se linijose tarp Pjetr÷nų ir Didžiųjų Baltųjų veislių, kurioms buvo atlikta atranka daugiau kaip per 30 metų. Veisl÷s, panaudotos tyrimui, yra trijų tipų: Europos ar amerikiečių komercin÷s veisl÷s (Didžiosios Baltosios, Landrasų ir/ar Pjetr÷nų), kinų veisl÷s (daugiausia Meishan) ir laukin÷s Europos kiaul÷s (Ellegren, 1995). Didžiųjų Baltųjų veisl÷, siejama su didžiausiu paros priesvoriu jaunesniame amžiuje, palyginti su Pjetr÷nų (Tibau et al., 1997).Atlikus tyrimus buvo nustatyta, kad pasirinkus Pjetr÷nų veislę tiek motinin÷se tiek t÷vin÷se linijose, tai nekeit÷ leptino geno genotipo ir alelinio geno dažnio. Tačiau, lyginant Didžiųjų Baltųjų ir Pjetr÷nų veisl÷s t÷vin÷s linijos gyvulius, Didžiųjų Baltųjų veisl÷je C alelinis genas yra susijęs su pen÷jimusi ir priesvoriu per parą, labiau nei Pjetr÷nų veisl÷je.
Pasaulin÷je praktikoje yra plačiai taikoma gyvulių selekcija pagal genus ir genotipus (MAS). Įdiegus selekciją genetinių žymenų pagalba kiaulininkyst÷je Lietuvoje galima padidinti kiaulienos kiekį ir pagerinti jos kokybę. Gauta informacija bei suformuota strategija genetiniams ryšiams nustatyti pritaikyta kiaulių veislių tolesnei genetinei charakteristikai. Gauti tyrimų rezultatai yra kaip oficialus selekcijos kriterijus genetiškai gerinant kiaulių m÷sines savybes. Siūloma atsižvelgti į kiaulių genome esančių atskirų genų pasireiškimą, atrenkant gyvulius, turinčius ekonomiškai naudingus alelius ir suformuoti specifines galvijų ir kiaulių bandas, iš kurių būtų galima gauti aukštos išeigos ir kokyb÷s kiaulieną. Taip pat remiantis tyrimų rezultatais galima įvertinti genetinius ryšius tarp veislių bei įvertinti viduveislinę bei tarpveislinę genetinę įvairovę.
4. IŠVADOS
• Ištyrus kiaulių LEP1, LEP2 genus jie rasti polimorfiški, t.y kiekvienas genas turi po du variantus.
• Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą tirtuose genuose faktinis heterozigotiškumas buvo rastas didesnis, nei teorinis, kas rodo pakankamą genetin÷s įvairov÷s kiekį tirtuose lokusuose ir sudaro prielaidas vykdyti gyvulių selekciją pagal šiuos genus.
• Kiaulių leptino genas LEP1 ir LEP2 ženkliai įtakoja lašinių kiekį – LEP1 GG genotipo kiaul÷s ir LEP2 CT genotipo kiaul÷s buvo liesiausios, o jų raumeningumas didžiausias.
• Įvertinus leptino geno įtaką pen÷jimosi fenotipiniams rodikliams nustatyta, kad mažiausios pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio buvo kiaulių, kurios tur÷jo LEP1 GG genotipą ir LEP2 TT genotipą.
5. REKOMENDACIJOS
• Kadangi kiaulių leptino genas abiejose polimorfin÷se vietose (LEP1 ir LEP2) ženkliai veikia kiaulienos fenotipinius riebumo rodiklius rekomenduojama jį naudoti kaip genetinį žymenį selekcijoje norint gauti liesesnę kiaulieną.
• Rekomenduojama šį genetinį žymenį įtraukti į selekcines programas prieš tai atlikus platesnius šio geno raiškos tyrimus didesn÷je imtyje ir įvertinus ar jis neblogina kitus fenotipinius rodiklius.
6. SUMMARY
Master Vilma Kliševičiūt÷
Topic of Master thesis Pig leptin gene polymorphism and it's influence to meat production traits.
Tutor of M. Sc. thesis Lina Baltr÷nait÷
Lithuanian Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics, K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.
Master‘s work accomplished in the year 2008 – 2010, volume of Master work 37 page original, 10 tables and 7 pictures.
Object and tasks of work. 1. Analyse and summarize literature about leptin gene. 2. Investigate leptin gene polymorphism and distribution of different alleles at Lithuanian pig population by PCR-RFLP method. 3. Create datebase of pig phenothypical traits. 4. Analyse correlation between leptin gene polymorphism and production traits.
Research methodology. 1. DNA extraction from hair roots. 2. PCR to amplify leptin gene. 3. RFLP method. 3. Electrophoresis in agarose gel. 4. Staining with Etidium bromide. 5. Genotyping. 6. Stasitical analysis of data.
Results and conclutions.
After examing porcine genes LEP1 and LEP2, they were found polymorphous, i.e. each gene had two variants. After evaluating factual and theorical heterozygosity in the examined genes, their factual heterozygosity was found bigger than theorical one and that indicates a sufficient amount of variety in the loci and the assumption can be made that according to these genes, animal selection can be carried out. Porcine leptin gene LEP1 and LEP2 significantly influences the amount of fat –the pigs of LEP1 GG genotype and the pigs of LEP2 CT genotype had the leanest meat and the biggest muscularity. After evaluating the influence of the leptin gene to the phenotypic indicators of feeding, it was ascertained that the least feed conversion to 1 kg of weight gain was in the pigs that had LEP1 GG genotype and LEP2 TT genotype. Since porcine leptin gene significantly influences porcine phenotypic fat indicators in both polymorphic loci (LEP1 and LEP2), it is recommended to use it as a genetical marker in the selection in order to gain leaner pork. It is reccomended to include this genetic marker into selection programmes after making wider research of this gene indications in bigger extent and after evaluating, if it does not worsen other phenotypical indicators.
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Barata M., Saleri R., Mainardi G.L., Valle D., Giustina A., Samanini C. Leptin Regulates GH Gene Expression and Secretion and Nitric Oxside Production in Pig Pitmitary Cells. Endocrinology. 2002. Vol. 143 (2), P. 551-557.
2. Barb C. The brain - pituitary - adipocyte axis: Role of leptin in modulating neuroendocrine function. J AnimSci. 1999. Vol. 77. P. 1249-1257.
3. Barb C.R., Hausman G.J., Houseknecht K.L. Biology of leptin in the pig. Domestic Animal Endocrinology. 2001. Vol.21, N.4. P.297-317.
4. Bidwell C, Ji S, Frnk G, Cornelius S, Willis G, Spurlock M. Cloning and expression of the porcine obese gene. Anim Biotechnol. 1997. Vol. 8. P. 136-142.
5. Blicharski T., Kuryl J., Pierzchala M. Relationship between polymorphism at loci colipase and leptin and most important fattening and slaughtert traits in pigs with special reference to intramuscular fat – a review. Pr Mat Zoot- Zesz Spec. 2004. Vol.15. P.41-46 (in Polish).
6. Brenig B., Brem G. Molecular cloning and analysis of the porcine „halothane“gene. Arch. Thierz. 1992. Vol.35. P. 129-135.
7. Cieslak D., Blicharski T., Kapelanski W., Pierzchala M. Investigation of polymorphisms in the porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene. Czech J Anim Sci. 2003. 48: 69 – 75.
8. Ellegren H.Mutation rates at porcine microsatellite loci. Mamm. Genome. 1995. Vol.6. P. 376-377.
9. Ernst C.W., Vaske D.A., Larson R.G., Rothschild M.F. Rapid communication: MspI restriction fragment length polymorphism at the swine MYOG locus. Czech J Anim Sci.1993. 71, 3479.
10. Ezekwe, M.O. and R.J. Martin. Cellular characteristics of skeletal muscle in selected strains of pigs and mice and the unselected controls. 1975. Growth. 39:95.
11. Fausto Morena da Silva, Guimaraes Simone Eliza Facioni, Lopes Paulo Savio, Pires Aldrin Vieira, Guimaraes Marta Fonseca Martins, Barbosa da Silva Marcos Vinicius Gualberto, Schierholt Alexs Sandro, Silva Kleibe de Moraes and Gomide Lucio Alberto de Miranda. Association of MYF5 gene allelic variants with production traists in pigs. Genetic and Molecular Biology. 2005. 28, 3, 363 – 369.
12. Fiedler I., Ender K., Wicke M., Maak S., Lengenken G., Meyer W. Structular and functional characteristic of muscle fibers in pigs with different malignant hypertermia susceptibility (MHS) and different meat quality. Meat Sci. 1999. Vol.53. P. 9-15.
13. Gahne B., Juneja R.K. Animal Blood Groups and Biochemical Genetics. Department of Animal Breeding and Genetics. Swedish University of Agricultural Sciense. 1985. Vol. 1b. P. 265-83.
14. Hamilton D.N., Ellis M., Miller K.D., McKeith F.K., Parrett D.F. The effect of the halothane and rendement napole genes on carcass and meat quality characteristics of pigs. Journal of Animal Science. 2001. N. 78. P. 2862 – 2867.
15.Harigaya A, Nagashima K, Nako Y, Morikawa A. Relationship between concentration of serum leptin and fetal growth. J Clin Endocrinol Metab. 1997. Vol.82. P.3281-3284.
16. Houseknecht K.L., Baile C.A., Matteri R.L. et al. The biology of leptin: a review. Journal of Animal Science. 1998. Vol.76. N.5. P.1405-1420.
17. Jančien÷ I., Kvietkut÷ N. Kiaulininkyst÷s laboratorinių ir praktinių darbų metodiniai nurodymai. Kaunas, 2004.
18. Jiang Z.H., Gibson J.P. Genetic polymorphism in the leptin gene and their association with fatness in four pig breeds. Mammalian Genome. 1999. Vol.10. N.2. P.191-193.
19. Jokubka R., Miceikien÷ I. A missence variation of melanocortin – 4 receptior gene (MC4R) in Lithuanian White pig breed. Proceedings of the 9th Baltic Animal Breeding Conference. Sigulda. 2003. P.65-67.
20. Jokubka R., Miceikien÷ I. Streso geno paplitimas tarp Lietuvos veislininkyst÷s įmon÷se veisiamų kuilių. Veterinarija ir zootechnika. Kaunas. 2001. Vol. 14(36). P. 67-72.
21. Kennes Y.M., Murphy, B.D., Pothier, F. et al. Characterization of swine leptin (LEP) polymorphisms and their association with production traits. Animal Genetics. 2001.Vol.32. N.4. P.215-218.
22. Kerry Joseph, Kerry John, Ledward David. Meat processing. Improving quality. Woodhead Publishing Limited. 2002. P. 27- 57.
23. Kiaulių supirkimo tvarka ir skerdenų skirstymas. 2003.
http://www.manoukis.lt/print_forms/print_st_z.php?s=139&z=10 (prieiga per internetą, žiūr÷ta 2009-11-05).
24. Klimas R. Metodai ir priemon÷s Lietuvoje veisiamų kiaulių ūkin÷ms – biologin÷ms savyb÷ms gerinti. Habilitacinio darbo santrauka. Kaunas. 2002. P. 23 – 25.
25. Knorr C., Schwille M., Moser G. Et al. Calsium–release–chanell genotypes in several pig populations – associations with halothane and CK reactions. J. Anim. Breed. 1994. Vol. 111. P. 243-252.
26. Krenkova L., Kuciel J., Urban T. Association of the RYR1, GH, LEP and TF genes with carcass and meat quality traits in pigs. Czech J Anim Sci. 1999. 44. P. 481-486.
27. Kulig H., Grzesiak W., Szatkowska I.Effect of leptin gene polymorphism on growth and carcass traits in pigs. Arch Tierz-Arch Anim Breed. 2001. Vol.44. P. 291-296.
28. Kuryl J., Kapelanski W., Pierzchala M., Bocian M., Grajewska S. A relationship between genotypes at the GH and LEP loci and carcass meat and fat deposition in pigs. Anim Sci Pap Rep. 2003. Vol.21. P. 15-26.
29. Leptin. 1997.
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/bodyweight/leptin.html (prieiga per internetą, žiūr÷ta 2010-01-21).
30. Leptin. 2005.
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2005/Amore/leptin.html
(prieiga per internetą, žiūr÷ta 2010-01-18).
31. Leptin and Leptin Receptor Expression in Skeletal Muscle and Adipose Tissue in Response to in Vivo Porcine Somatotropin Treatment. 2005.
http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.htm?seq_no_115=173159 (prieiga per internetą, žiūr÷ta 2010-01-16).
32. Leptin and long form of leptin receptor genes expression in the hypothalamus and pituitary during the luteal phase and early pregnancy in pigs. 2006.
http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=17790857 (prieiga per internetą, žiūr÷ta 2009-12-15).
33. Leptin gene and protein expression in the trophoblast and uterine tissues during early pregnancy and the oestrous cycle of pigs. 2007.
http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=19181784 (prieiga per internetą, žiūr÷ta 2009-09-27).
34. Malevičiut÷ J., Baltr÷nait÷ L., Pečiulaitien÷ N., Miceikien÷ I. Genetinių žymeklių panaudojimas gyvulių selekcijoje. Ūkininko patar÷jas. 2002. Nr.131 (1425).
35. McPherron A.C., Lee S. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12457-12461.
36. McPherron, AC, Lawler, AM, Lee, S-J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member. Nature. 1997. Vol. 387. P. 83-90.
37. Miceikien÷ I., Jokubka R. Porcine Stress Syndrome (PSS) - identification, gene frequencies and selection fot stress resistant pigs. The 6 Baltic Animal Breeding Conference, Jelgava. 2000. P.16-18.
38. Morgan Jones S.D. Quality and Grading of Carcasses of Meat Animals. CRC Press, 1995. P. 233.
39. Obese gene polymorphism in Poetrain and Large White pigs after a divergent selection. 2008. http://www.funpecrp.com.br/gmr/year2008/vol7-4//pdf/gmr511.pdf (prieiga per internetą, žiūr÷ta 2010-02-16).
40. PDB. 2005. http://www.rcsb.org/pdb/index.html (prieiga per internetą, žiūr÷ta 2010-02-04).
41. Peixoto J.O., Guimaraes S.E.F., Lopes P.S. et al. Associations of leptin gene polymorphisms with production traits in pigs. Journal of Animal Breeding and Genetics. 2006. Vol.123. N.6. P.378-383.
42. Pierzchala Mariusz, Blicharski Tadeusz, Kuryl Jolanta. Growth rate and carcass quality in relation to GH/Mspl and GH/HaeII PCR-RF LP polymorhism in pigs. Poland. Animal Sciense Papers and Reports. 2004. Vol. 22. N. 1. P. 57-64.
43. Ramsay TG, Yan X, Morrison C. The obesity gene in swine: sequense and expression of porcine leptin. J Anim Sci. 1998. 76. P. 484-490.
44. Skimundris V. Skerdimo produktų technologija. 2000. P. 39.
45. Smet S.D., Bloemen H.G., Voorde G.V.D. Spincemaille G., Berkmens D. Meat and Carcass Quality of Two Piges Lines and Their Crosses Differing in Stress Susceptibility. 48 Annual Meeting of the EAAP, Austria. 1997.
46. Sommillion Ann, Erkens Jo H.F., Lenstra Jahannes A., Gȕnther Retterberger, Pas Marinus F.W. Genetic variation in porcine myogenin gene locus. Mammalian Genome . 1997. Vol. 8. N.8. P. 564-568.
47. Sonstegard T.S., Rohrer G.A., Smith T.P.L. Myostatin maps to porcine chromosome 15 by linkage and physical analyses. 1998. Anim. Genet., 29, 19-22.
48. Stratil A., Peelman L., Van Poucke M., Čepica S. A HinfI PCR-RFLP at the porcine leptin (LEP) gene. Anim Genet. 1997. Vol. 28. P. 371-372.
49. Switonski M. Molecular genetics in beef cattle breding a review. Animal Sciense Papers and Reports. 2002. Vol.20. Supplement 1, P.7-18.
50. Szydlowski M., Stachowiak M., Mackowski M., Kamyczek M., Eckert R., Rozycki M., Switonski M. No major effect of the leptin gene polymorphism on porcine production traits. J Anim Breed Genet. 2004. Vol.121. P. 149-155.
51. Terman A. Effect of the polymorphism of prolactin receptor (PRLR) and leptin (LEP) genes on the litter size in Polish pigs. J Anim Breed Genet. 2005. Vol.122. P. 400-404.
52. Tibau J., Puigvert X., Soler J., Trilla N., et al. Incidencia de factores geneticos y de comportamiento en la eficiencia del crecimiento, la composicion y la calidad de la canal y de la carne en distintas razas porcinas. Anaporc. 1997. Vol. 171. P. 74-91.
53. Van der Lende T., Te Pas M.F., Veerkamp R.F. et al. Leptin gene polymorphisms and their phenotypic associations. Vitamins and Hormones. 2005. Vol.71. P. 373-404.
54. Zhang, F., et al. Crystal Structure of the obese protein leptin-E100. Nature. 1997. P. 206-209, 387.
