1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA
Kristina Morkūnien÷
KIAULIŲ STRESINIO SINDROMO ĮTAKA MöSINöMS IR PENöJIMOSI
SAVYBöMS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadov÷:
Lektor÷ dr. Lina Baltr÷nait÷
2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas
Kiaulių stresinio sindromo įtaka m÷sin÷ms ir pen÷jimosi savyb÷ms 1. Yra atliktas mano pačios:
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje:
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2011 – 05 – 12 Kristina Morkūnien÷ (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ, UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ, ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2011 – 05 – 12 Kristina Morkūnien÷
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO 2011 – 05 – 12 Lektor÷ dr. Lina Baltr÷nait÷
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE 2011 – 05 – 12 prof. Dr. Ilona Miceikien÷
(parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s (-riaus) parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
Docentas dr. Artūras Stimbirys (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS 4 SANTRAUKA 5 ĮVADAS 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA 8 1.1. Genai, veikiantys kiaulių ūkines savybes 8 1.1.1.Rendement Nepole (RN) genas 81.1.2. Leptino (LEP) genas 8
1.1.3. Riebiąsias rūgštis jungiančio baltymo (H-FABP) genas 9
1.1.4. Miostatino (MYO) genas 9
1.1.5. Miogenino (MYOG) genas 9
1.1.6. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas 10
1.1.7. Pituitrino (PIT-1) genas 10
1.1.Augimo hormono (GH) genas 10
1.2. Kiaulių stresinis sindromas 11
1.2.1. Kiaulių stresinio sindromo genetinis pagrindimas 11 1.2.2. Kiaulių stresinio sindromo poveikis m÷sos kokybei 12 1.2.3. Kiaulių stresinio sindromo poveikis sveikatingumui ir reprodukcin÷ms savyb÷ms 13
1.2.4. Kiaulių stresinio sindromo paveld÷jimas 13
1.2.5. Kiaulių stresinio sindromo tyrimo metodai 15
2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS 16 2.1.Tyrimų medžiaga ir metodai 16 2.1.1. Tyrimų medžiaga 16
2.1.2. Kiaulių fenotipinių požymių duomenų baz÷ 17
2.2. Tyrimų metodai 18
2.2.1. DNR ekstrakcija Chelex dervų pagalba 18
2.2.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas 18
2.2.3. Kiaulių HAL geno tyrimo metodika 20
2.3. Statistin÷ duomenų analiz÷ 22
3. REZULTATAI 22 3.1. Kiaulių HAL geno polimorfizmo ištyrimas 22 3.2. Kiaulių HAL geno įtakos m÷sin÷ms savyb÷ms ištyrimas 26 3.3. Kiaulių HAL geno įtakos pen÷jimosi savyb÷ms ištyrimas 27 3.4. Aptarimas 4. REZULTATŲ APTARIMAS 29
IŠVADOS 32
REKOMENDACIJOS 32
4
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
Alw21I – restriktaz÷ bp – bazių pora
DFD – tamsios, kietos, sausos m÷sos sindromas (dark, firm, dry) DNR – dezoksiribonukleinin÷ rūgštis
DTT – dithiotreitolis
GH – augimo hormono genas HAL – halotano (streso) genas
H-FABP - riebiąsias rūgštis jungiančio baltymo genas LEP – leptino genas
MH – terminis šokas
MHS – stresinį sindromą sąlygojantis genas MC4R - melanokortino 4 receptoriaus genas MYOG – miogeno genas
MYO – miostatino genas
NN – homozigotin÷ dominantin÷ streso geno būsena Nn – heterozigotin÷ streso geno būsena
nn – homozigotin÷ recesyvin÷ streso geno būsena OD - optinis tankis
PGR – polimerazin÷ grandinin÷ reakcija PIT – pituitrino genas
PSE – blyškios, minkštos, vandeningos m÷sos sindromas (pale, soft, exudative) PSS – kiaulių streso sindromas
RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas RYR – rianodino geno receptorius
5
SUMMARY
Master Kristina Miceikait÷
Topic of Master thesis Influence of Porcine Stress Syndrome to pig meateness and fattening properties.
Tutor of M. Sc. thesis. dr. Lina Baltr÷nait÷
Lithuanian Health Science University, Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics.
Master‘s work accomplished in the year 2009 – 2011, volume of Master work 37 page original, 9 tables and 10 pictures.
Object and tasks of work
Object - to investigate gene, causing porcine stress syndrome, polymorphism and influence to meateness and fattening properties.
Tasks - analyse literature about genes influencing pig production traits and about stress (HAL) gene in pigs, investigate HAL gene polymorphism and distribution of different alleles and genotypes in pigs, create data base of phenotypic traits, investigate influence of HAL gene polymorhism to pig productive traits.
Application in practice – found pig stress syndrome gene polymorphisms and their influence to such productive traits as meateness and fattening give us possibillity to use them as genetic markers in selection process thus inhansing process by molecular technologies, increasing animal breeding value and improving productive traits and production quality.
Research methodology. DNA extraction from hair roots; PCR to amplify HAL gene; RFLP method to identify mutation; electrophoresis in agarose gel; staining with etidium bromide; genotyping; statistical analysis of data.
Results and conclusions. 144 unrelated pigs were investigated. Two halotan gene alleles -dominant N and recessive n (causing porcine stress syndrome) were identified in Lithuanian pig population. N allele in tested group was found with 0,903 frequency, n allele – 0,097 frequency, NN genotype with frequency 0,847, Nn – 0,111, nn – 0,042. The frequency of n allele between the breeds ranged from 0,000 in Lithunian native pig up to 0,250 in crossbreds. Undesirable nn genotype with highest frequency was found also in crossbreds. Animals with nn genotype had less warm carcass weight, body muscle area, ham weight, but longer carcass and bacon part. Stress sussceptible pigs were leaner and more muscular but had worse fattening properties – higher feed intake, less daily gain, less body weight at slaughtering age. Heterozygote pigs has intermediate results.
6
ĮVADAS
Žem÷s ūkio gyvulių selekcijos tikslas yra veisti ir auginti gyvulius, pasižyminčius aukštomis produktyvumo bei kitomis ūkiškai naudingomis savyb÷mis, mažinti gyvulininkyst÷s produkcijos gamybos savikainą bei gauti kokybiškus žem÷s ūkio produktus, tenkinančius vartotojų poreikius bei atitinkančius Vakarų Europos rinkos reikalavimus. Did÷jantys kokyb÷s reikalavimai bei aukšti standartai žem÷s ūkio produkcijai Europoje rodo, kad gyvulių selekcija Lietuvoje turi būti orientuota ne į produkcijos kiekio augimą, didinant gyvulių skaičių, bet į produkcijos kokyb÷s gerinimą, veisimui atrenkant ir parenkant aukštą genetinį potencialą turinčius gyvulius. Tod÷l dabartin÷s gyvulininkyst÷s tikslą galima būtų įvardinti kaip selekcijos proceso spartinimą veisiant aukšto produktyvumo, atsparius ligoms bei aplinkos veiksniams, genetinių defektų turinčius gyvulius, iš kurių gaunama produkcija būtų saugi žmonių mitybai, o jos perdirbimas produktų gamybai reikalautų kuo mažiau ekonominių, energetinių bei laiko sąnaudų.
Tradiciniai kiekybiniai būdai, naudojami gyvulių veisime, pasikliauja duomenų, tokių fenotipinių požymių, kaip augimo greičio, raumenin÷s akies ploto, nugaros lašinių storio ir kitų požymių registravimu. Statistinių metodų rinkinys, taikomas šiems duomenims tam, kad būtų galima identifikuoti ir atrinkti geriausius individus, kurių požymiai perduodami iš pra÷jusių kartų. Ši strategija veiksminga, kai tiriami požymiai, kurie yra vidutiniškai ar gerai paveldimi, tokie kaip augimo greitis, ir kurie plačiai yra naudojami, gerinant pageidaujamus požymius. Tuo pačiu metu, yra požymių, kur t÷vų fenotipas sunkiai nurodo, kokie bus palikuonių požymiai, tokie kaip reprodukciniai, ir su paveldimomis ligomis susiję požymiai. Be to, kiaulininkyst÷je dar yra ekonomiškai naudingų požymių, tokių kaip m÷sos kokyb÷ ir ilgaamžiškumas, kurių fenotipas yra pamatuojamas tik tuo metu, kai jau gyvulys neb÷ra tinkamas veisimui. Taigi, norint išspręsti šią problemą, reikia rasti kitus būdus žem÷s ūkio gyvulių selekcijai. Dabartiniai pasiekimai DNR technologijoje mokslininkams leidžia identifikuoti, genus kurie kontroliuoja kiaulininkystei naudingus ekonominius požymius. Galutinis šių genų ištyrimas pad÷s žem÷s ūkio gyvulių selekcijoje (Davoli, Braglia, 2008).
Kaip nuolat didinti ir gerinti kiaulienos kokybinius ir kiekybinius rodiklius padeda genetikos, fiziologijos ir gyvulių mitybos mokslų disciplinos. Kiekviena iš jų tiria ir sudaro planus, kurie pad÷tu dar plačiau pagerinti bei optimizuoti gamybą. Šiuo metu aktualiausi klausimai yra, kokie genetiniai faktoriai įtakoja kiaulių sveikatingumą, kokie ir kaip atskiri genai atsakingi už m÷sos kokybę, kokius sprendimus priimti ateičiai. Spręsti šią užduotį galima nagrin÷jant visus faktorius, susijusius su kiaulių auginimu. Genetika kiaulininkyst÷je atlieka vis
7 didesnį vaidmenį, kadangi tyrin÷jant galvijų ir kiaulių genomą išaiškinama vis daugiau atskirų genų turinčių įtakos kiaulių sveikatingumui ir kiaulienos kokybei.
Kiaulių ūkines savybes bei sveikatingumą veikia tiek fenotipiniai, tiek genetiniai faktoriai. Kiaulių autosomose atrasti genai arba genų grup÷s, lemiantys vislumą, pen÷jimosi spartą, raumeningumą, m÷sos kokybę, rezistentiškumą ligoms (Fiedler et al., 1999). Yra žinoma visa eil÷ genų įtakojančių m÷sos produkcijos kiekį bei kokybę. Tai miostatino, leptino, augimo hormono, augimo hormono receptoriaus, halotano genai (Alekxandra, 1997; Soumillion, 1997; Pas, 1999; Jiang, 1999; Barata, 2002; Switonski, 2002; Curi, 2005; Guimareaes, 2007; Davoli, Braglia, 2008). Kiaulių stresinį sindromą sąlygojantis genas (MHS) veikia kiaulių sveikatingumą, produktyvumą, reprodukcin÷ms savybes ir ypatingai kiaulienos kokybę, tod÷l šio geno polimorfizmo tyrimai labai aktualūs gyvulininkystei. Tačiau, kadangi aukštus kokybinius ir kiekybinius rodiklius įtakoja eil÷ genų bei genų grupių, kurių ekspresija ne visada būna vienoda, tod÷l, prieš įtraukiant į selekcijos programas, geno žymenio įtaką būtina įvertinti konkrečiose kiaulių veisl÷se ar populiacijose (Chikuni et al., 1997; Grochowska et al., 1999; Curi et al., 2005).
Darbo tikslas – ištirti kiaulių stresinį sindromą sukeliančio geno polimorfizmo įtaką m÷sin÷ms ir pen÷jimosi savyb÷ms.
Darbo uždaviniai
• Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie kiaulių genus, veikiančius ūkines savybes. • Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie kiaulių stresinį sindromą.
• Nustatyti streso geno alelių ir genotipų dažnius tiriamoje kiaulių grup÷je. • Nustatyti streso geno įtaką m÷sin÷ms savyb÷ms.
• Nustatyti streso geno įtaką pen÷jimosi savyb÷ms. Praktinis pritaikymas
Rasti kiaulių streso geno polimorfizmai bei jų įtaka tokioms ūkin÷ms savyb÷ms kaip m÷singumas bei pen÷jimosi rodikliai sudaro galimybę juos naudoti kaip biožymenis selekcijos procese taip jį paspartinant molekulinių technologijų pagalba, padidinant gyvulių veislinę vertę bei pagerinant jų ūkines savybes bei produkcijos kokybę.
8
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Genai, veikiantys kiaulių ūkines savybes
Kiaulių DNR yra išsid÷sčiusi 19 chromosomų porų ir sudaryta iš daugiau kaip 100 tūkstančių funkcionuojančių genų. Vykdoma visa eil÷ tyrimų siekiant identifikuoti šių genų funkcijas organizme. Kiaulių produktyviąsias savybes veikia tiek fenotipiniai, tiek genetiniai faktoriai. Kiaulių autosomose atrasti genai arba genų grup÷s, lemiantys vislumą, pen÷jimosi spartą, raumeningumą, m÷sos kokybę, rezistentiškumą ligoms (Fiedler et al., 1999).
1.1.1. Rendement Nepole (RN) genas
RN genas yra dominantinis genas, randamas 15 chromosomoje. Šis genas egzistuoja dviejų alelių formoje: rn+ (alel÷ normali) ir RN- alel÷ (alel÷ su neigiamu poveikiu) (Houde et al., 2001). RN geno neigiamų pasekmių priežastis yra glikogeno kiekio padid÷jimas raumenyje, tose kiaul÷se, kurios turi geną. Ligi šiol, šis genas buvo surastas Hempšyrų veisl÷je ir Hempšyrų mišrūnų linijose. RN alel÷ su nepageidaujamu poveikiu paplitusi pas Hempšyrų veisl÷s kiaules. RN genotipas labiausiai veikia m÷sos kokyb÷s parametrus. Nuo geno būkl÷s tiesiogiai priklauso glikolitin÷s reakcijos greitis. Esant genui dominantin÷je būkl÷je, pastarosios reakcijos greitis padid÷ja, d÷l ko greičiau skyla baltymai, pablog÷ja vandens rišlumas, padid÷ja virimo nuostoliai, m÷sa tampa rūgšti (Milan et al., 2000). Nepalankus alelinis genas (RN) paveikia technologinę m÷sos kokybę, radikaliai didindamas glikogeno kiekį. Po skerdimo, glikogenas raumenyse yra paverčiamas į pieno rūgštį, kuri sumažina raumens pH. Tod÷l kuo daugiau glikogeno yra raumenyje, tuo bus pagaminta daugiau pieno rūgšties ir tuo bus žemesnis galutinis raumens pH. Padidintas pieno rūgšties kiekis, gali būti priežastis to, kad raumens pH nukrenta žemiau 5,5 per 24 valandas po skerdimo. Rūgšti m÷sa labai panaši savo savyb÷mis į išblyškusią, minkštą ir vandeningą (PSE) m÷są, sukeltą PSS geno. RN-alelinio geno pasekm÷ yra vandeninga m÷sa (4% skirtumas) ir padid÷ję virimo nuostoliai (8 % skirtumas), sąlygojantis didelius finansinius nuostolius (Hamilton et al., 2001).
1.1.2. Leptino (LEP) genas
Leptino genas yra 18 chromosomos q13-q21 regione. Leptino genas atsakingas už 16 – kDA dydžio baltymo leptino gamybą. Šis baltymas išsiskiria riebaliniame audinyje ir veikia kaip kūno svorio ir energijos sąnaudų reguliatorius (Campfield et al., 1995). Nutukusių kiaulių leptino iRNR lygis yra žymiai didesnis nei liesų (McNeel et al., 2000). Rekombinantinio kiaulių leptino injekcijos sumažina pašarų normą ir padidina augimo hormono (GH) sekreciją (Barata,
9 2002). Yra aprašyti septyni leptino geno polimorfizmai, kurie vienaip ar kitaip įtakoja m÷sos kokybę ir riebalų kiekį atskiroms kiaulių veisl÷ms (Stratil et al., 1997, Jiang, Gibson, 1999, Kennes et al., 2001)
1.1.3. Riebiąsias rūgštis jungiančio baltymo (H-FABP) genas
H-FABP genas randamas 6 chromosomoje. Jis yra susijęs su tarpraumeninių riebalų kiekio kintamumu Diurokų kiaulių veisl÷je. Trys pageidaujami H-FABP geno aleliai (H, a ir d) gali sudaryti 27 galimas kombinacijas. Tarpraumeniniai riebalai arba marmuriškumas yra susiję su valgomosios m÷sos skonin÷mis savyb÷mis, kas suteikia m÷sai malonų aromatą, sultingumą ir švelnumą. Kiauliena, turinti didesnį kiekį tarpraumeninių riebalų, gali būti paklausesn÷, nei mažiau marmuringesn÷ m÷sa, kadangi perdirbant tokią m÷są, pagaminti produktai būna geresn÷s kokyb÷s ir yra lengviau išgauti norimą skonį bei aromatą. Tačiau yra pirk÷jų, kurie pageidauja, kad kiauliena tur÷tų mažiau, arba išvis netur÷tų tarpraumeninių riebalų. Kiaulių veisimas įvertinant H-FABP geno polimorfizmą, gal÷tų būti naudingas kiaulių veis÷jams ir perdirb÷jams norint pagerinti kiaulienos kokybę.
1.1.4. Miostatino (MYO) genas
Miostatino genas randamas 15 chromosomoje. Koduojanti kiaulių miostatino geno seka apima 1128 bp (McPherron, Lee, 1997). Kiaulių miostatino genas sudarytas iš trijų egzonų, kurių ilgiai 373, 374 ir 381 bp atitinkamai. Aktyvi baltymo forma apima 376 amino rūgštis. Miostatino genas veikia į raumeninių skaidulų formavimą. Kiaul÷s, turinčios daugiau raumeninių skaidulų, greičiau auga ir turi didesnę raumeninę masę. Mutacija miostatino gene nulemia dvigubo raumeningumo fenotipą. Miostatinas priklauso augimo faktoriaus β-šeimai ir yra ekspresuojamas skeleto raumenyse tiek embrioniniu, tiek poembrioniniais laikotarpiais. Miostatinas užkerta kelią besaikei mioblastų diferenciacijai. Esant funkcijos praradimo mutacijai miostatinas gali gaminti papildomas raumenų skaidulas, d÷l ko susiformuoja raumenų hiperplazija (Guimaraes et al., 2007). Buvo nustatyta, kad kiaulių miostatino genas veikia tiek m÷sines tiek pen÷jimosi savybes (Saumillion et al., 1997; Cieslak et al., 2003; Fausto et al., 2005).
1.1.5. Miogenino (MYOG) genas
Miogenino genas randamas 9 chromosomoje ir turi keturis skirtingus alelius. Genetinis kintamumas šiame lokuse yra susijęs su skirtingais mioblastų ir miofibrilių kiekiais. Miogenino genas priklausoMyoD geno šeimai sudarytai iš keturių struktūriškai artimų genų – tai MYOD1,
10 MYOG, MYF5 ir MYF6. Šie genai koduoja pagrindinius spiral÷-kilpa-spiral÷ (bHLH) baltymus ir susiję su raumeninių ląstelių diferenciacija tiek in vitro, tiek in vivo (Saumillion et al., 1997).
1.1.6. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas
Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas yra lokalizuotas kiaulių 1 chromosomoje MC4R genas vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant kiaulių medžiagų apykaitos energijos balansą, tai riebalų atsid÷jimą, augimo greitį ir maisto medžiagų pasisavinimą. Kiaulių energijos balansas remiasi energijos suvartojimu iš maisto medžiagų kūno energijai ir medžiagų apykaitai. Melanokortino 4 receptorius pasireiškia smegenyse tarpininkaujant leptinui įtakoja maisto medžiagų apykaitą. Melanokortino 4 receptoriaus lokusui nustatytas pleotropinis poveikis produktyvumo savyb÷ms: paros priesvoriui (g), nugaros lašinių storiui (mm), raumeningumui (%). Šis genetinis žymuo gali būti naudojamas veisimo tikslais atrenkant gyvulius pagal tokius požymius kaip riebalų atsid÷jimas, augimo greitis bei pašarų pasisavinimas. Nustatyta, melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) geno įtaka Lietuvos baltųjų kiaulių augimo greičiui ir skerdienos kokybei (Jokubka ir kt., 2003;Miceikien÷ ir kt., 2007).
1.1.7. Pituitrino (PIT-1) genas
PIT-1 genas, randamas 13 kiaulių chromosomoje, yra svarbus augimo hormono, prolaktino ir tirotropino β subvieneto transkripcijos reguliavimo faktorius. PIT-1 kontroliuoja trijų svarbių hormonų genų ekspresiją: augimo hormono (GH), prolaktino (PRL) ir skydliaukę stimuliuojantį hormoną beta (TSH-β). PIT-1 mutacijų rezultate, žinduoliams pasireiškia žemaūgiškumas d÷l hipopituitrizmo ir prieš tai išvardintų hormonų trūkumo. PIT-1 genas yra svabus kiaulių augimo reguliavimui. Yra ištirtos skirtingos PIT-1 alelio formos ir jų ryšys su ekonomiškai naudingais požymiais ir rasta, kad PIT-1 aleliai susiję su gimimo svoriu ir nugaros lašinių storiu (Yu et al., 1999).
1.1.8. Augimo hormono (GH) genas
Kiaulių augimo hormono genas yra sudarytas iš 190 amino rūgščių ir jį išskiria priešakin÷s hipofiz÷s somatotropin÷s ląstel÷s. GH genas yra randamas 12 chromosomoje. GH genas yra žinomas, kaip turintis didelę įtaką kiaulių skerdenos kokybei (Sun et al., 1997). Augimo hormono geno pasireiškimo kelias susideda iš skirtingų tarpusavyje susijusių genų, tokių kaip GH (augimo hormonas), IGF1 (insulino augimo faktorius), PIT1 (hipofiz÷s transkripcijos faktorius), GHRH (augimo hormoną atpalaiduojantis hormonas), somatostatinas, GHRHR (augimo hormoną atpalaiduojančio hormono receptorius), GHR (augimo hormono receptorius)
11 veiklos. Riebalų storis ir vidutinis dienos prieaugis yra labai svarbūs požymiai kiaulienos produkcijai, nes jie koreliuoja su augimu ir liesos m÷sos kiekiu skerdenoje. GH genas yra susijęs su šiais dviem požymiais. Tyrin÷damas ApaI ir HinpI polimorfizmą, Knorr ir kiti (1997) rado ryšį tarp GH geno variantų ir riebumo ir padar÷ išvadą, kad GH lokusas turi būti atidžiai ištirtas ir įtrauktas į selekcijos žymenų pagalba programas.
1.2. Kiaulių stresinis sindromas
1.2.1. Kiaulių stresinio sindromo genetinis pagrindimas
Stresą, kaip bendrą organizmo prisitaikymą arba fiziologinę nespecifinę jo reakciją į bet kokius veiksnius, sukeliančius fizinę ar psichinę traumą, pirmasis 1936 m. apibūdino Kanados mokslininkas H. Selje. 1968 m. Naminių kiaulių populiacijoje jautrumas stresui buvo pasteb÷tas daugeliui sveikų, normalaus svorio kiaulių prieš skerdimą ir aprašytas 1953-1957 m. Danijoje ir Prancūzijoje. Steb÷ti simptomai buvo aukšta temperatūra, padid÷jęs širdies ir kv÷pavimo dažnis, raumenų įtempimas. Šie simptomai buvo pavadinti kiaulių stresiniu sindromu (Porcine stress syndrome - PSS). Dažnais atvejais buvo stebimas stiprus kūno temperatūros padid÷jimas - terminis šokas (Malignant hyperthermia - MH), kurio pasekoje gyvulys nugaišta (Kerry et al., 2002; Morgan, 1995). 1970 metais atrastas Halotano testas jautrumui įvertinti. 1974 m. aprašytas reakcijos į Halotano testą paveldimumas (nustatyta HAL lokuso vieta, recesyvinis paveldimumo tipas). 1990 m. identifikuotas HAL genas ir priskirtas 6 chromosomai (Brenig, Brem, 1992). 1991 m. HAL genui tirti prad÷tas naudoti DNR testas. Jautrumą stresui lemia šio geno vieno nukleotido T(timino) pasikeitimas į C (citoziną) 1843-oje bazių poroje. To pasekoje yra sintetinama ne Arginino, o Cisteino amino rūgštis, d÷l to pakinta membraninio baltymo (ryanodino receptoriaus) struktūra ir sutrinka Ca2+ jonų pralaidumas per membraninius kanalus. Tai tiesiogiai paaiškina kelis fenomenus: hipertermiją (MH) ir PSE m÷sos sindromą. Šie genetiniai pakitimai, esant Halotano narkozei, iššaukia raumens kontrakturaciją, hipermetabolizmą ir aukštą temperatūrą Mutacija turi visą eilę pavadinimų: CRC - Ca2+ jonu pralaidumo kanalų genas; RYR 1- Ryanodino receptoriaus genas; HAL - jautrumo halotanui genas; MHS- terminio šoko genas (Gronek et al., 1999; Miceikiene, Jokubka, 2000).
HAL (CRC, RYR1, MHS) genas yra randamas ne tik kiaulių, bet ir kitų individų genome – galvijų 18 chromosomoje, arklių 10 chromosomoje, žmonių 19 chromosomoje, pelių 7 chromosomoje. Kiaulių šeštoje chromosomoje randasi ne tik HAL genas, bet ir genai svarbūs kiaulių endokrinologijoje ir reprodukcijoje.
12 1.2.2. Kiaulių stresinio sindromo poveikis m÷sos kokybei
Hal genas iššaukia raumens kontrakturaciją, hipermetabolizmą ir aukštą temperatūrą. D÷l padid÷jusio raumenų metabolizmo, stresui jautrių gyvulių skerdenose pakinta glikogeno skilimo greitis (Scholz et al., 1997).Glikogenas per valandą virsta pieno rūgštimi, tod÷l staigiai krenta pH (iki 5,5). Tuo tarpu stresui atsparių kiaulių raumenyse pH nuo 7,3 iki 5,5 nukrenta per 10 -24 val. Žemas pH, aukšta temperatūra, sukelia raumenų degeneraciją, pablogina baltymo makrostruktūrą, o tuo pačiu ir m÷sos kokybę. Ji tampa minkšta, pablog÷ja vandens rišlumas, padid÷ja virimo nuostoliai. Tai vadinamoji PSE m÷sa (Pale, Soft, Exudative – blyški, minkšta, vandeninga) arba DFD (dark, firm, dry – tamsi, kieta, sausa). Tokia m÷sa netinka kai kurioms kiaulienos perdirbimo technologijoms (rūkymui, ilgam laikymui) (Bowker et al., 2000).
Abu eksudacijos tipai yra apspręsti nenormalaus poskerdiminio glikogeno skilimo ir pieno rūgšties susidarymo raumenyse. Esant normaliai šio proceso trukmei (6-10 val.), m÷sa tinkamai subręsta, įgauna šviesiai rožinę spalvą, būna stangri ir sultinga. Normaliai subrendusi kiauliena yra atspari gedimui laikymo metu, ilgą laiką išlaiko aromatą ir skonį, o perdirbant tokią m÷są, patiriami nedideli nuostoliai. Nenormaliai subrendusi kiauliena, priklausomai nuo eksudacinio tipo, būna blyški ar pernelyg tamsi, vandeninga arsausa, labai kietos ar net žele konsistensijos. Ilgai laikanmt tokią m÷są, ji greitai genda, netenka specifinio skonio ir kvapo, praranda daug sulčių, perdirbimo metu duoda daug nuostolių (Bowker et al., 2000; Fisher et al., 2000; Fernandez et al., 2002). Tiriant eksudacinę kiaulieną, pasteb÷tas skirtumas tarp tamsių ir išorinių šviesių m÷sos sluoksnių. Tamsiuose sluoksniuose yra daugiau pigmentinių medžiagų, mažiau dr÷gm÷s ir aukštesnis pH. Pasteb÷ta, kad toje pat skerdenoje, m÷sos eksudacinis laipsnis yra nevienodas. Dažniausiai eksudacija pasireiškia ir didesniu laipsniu vertingiausiose skerdenos dalyse, tokiose, kaip m. longissimus. Toks raumuo tampa vandeningas, minkštas, kempin÷s konsistensijos, dreblus (PSE). Eksudacin÷ kiauliena pasižymi greitesniu poskerdiminiu sustingimu ir atsileidimu, m÷sos temperatūra būna aukštesn÷. Tokioje m÷soje sarkoplazmos elementai per 40 min. po paskerdimo suyra visiškai, kas sumažina dr÷gm÷s rišlumą (Fisher et al., 2000; Fernandez et al., 2002).
Eksudacijai nustatyti, pra÷jus 1-2 val. po skerdimų išmatuojamas m÷sos pH. Jai m÷sos pH 5-5,5 ji panaudojama rūkytų dešrų gamybai. Norint išvengti eksudacin÷s m÷sos pavandenijimo, ji ko greičiau perdirbama – sūdoma, nes sūdymas stabdo glikogenolizę. Eksudacin÷ m÷sa, naudojamą virtų dešrų gamyboje, padidina termoapdirbimo nuostolius, pablogina dešrų organoleptines savybes. Ilgai laikant eksudacinę m÷są, ji netenka 6-10% m÷sos sulčių bei didelio kiekio pilnaverčių baltymų. Dideli m÷sos sulčių nuostoliai būna ir
13 sūdant ilgai laikytą vandeningą kiaulieną. Mažiausius ekonominius nuostolius patiriama konservuojant eksudacinę m÷są (Fisher et al., 2000; Fernandez et al., 2002).
1.2.3. Kiaulių stresinio sindromo poveikis sveikatingumui ir reprodukcin÷ms savyb÷ms Paveiktas stresoriaus, organizmas mobilizuoja centrinę nervų, virškinimo sistemas ir endokrinines liaukas fiziologinei pusiausvyrai ir gyvybin÷ms funkcijoms palaikyti. To pasekoje pablog÷ja stresams jautrių kiaulių reprodukcin÷s savyb÷s. 20,3% stresams jautrių kiaulių blogiau apsivaisina, 9,5-10% sumaž÷ja paršelių vada, paršelių svoris apie 10% mažesnis. Stresams jautrūs paršeliai 1,9 karto daugiau serga virškinamojo trakto ligomis , tokių paršelių kritimai iki 2 m÷n. amžiaus 18 % didesni nei stresams atsparių paršelių.Transportuojant, pergrupuojant ar kitokių stresinių situacijų atveju galimi d÷l terminio šoko stresui jautrių kiaulių kritimai. Gyvulių nervin÷s disharmonijos reiškiniai d÷l streso veiksnių yra glaudžiai susiję su daugelio fiziologinių funkcijų pakitimais. Streso sindromo klinikai būdinga bendra depresija, raumenų įtampa, uodegos bei galūnių traukuliai, ausų cianoz÷, baltos arba raudonos d÷m÷s odoje, dažnas pulsas ir kv÷pavimas, dusulio atsiradimas, padid÷jusi kūno temperatūra (Gahne, Junea, 1985; Smet et al., 1997; Kriauziene ir kt., 2005).
1.2.4. Kiaulių stresinio sindromo paveld÷jimas
Genas yra paveldimas autosominiu recesyviniu būdu (Miceikien÷, Jokubka, 2000), t.y. jei genas yra homozigotin÷je recesyvin÷je būsenoje (nn) tokios kiaul÷s jautrios stresams, jei heterozigotineje (Nn), tokios kiaul÷s yra šio geno nešiotojos, jei homozigotin÷je dominantin÷je (NN), tokios kiaul÷s yra atsparios stresams (Gahne ir Juneja, 1985). Poruojant paršavedę ir kuilį, kai jie abu yra homozigotin÷je būsenoje (NN), bus tik stresui atsparūs palikuonys (1 pav). Tačiau poruojant stresui atsparią paršavedę (NN) su kuiliu - šio geno nešiotoju (Nn) arba stresui atsparų kuilį (NN) su paršavede šio geno nešiotoja (Nn) vadoje bus 25 % šio geno nešiotojų (Nn), o likę bus atsparūs (NN) (2 pav). Poruojant paršavedę su kuiliu, kurie abu bus šio geno nešiotojai (Nn), bus ketvirtadalis stresui atsparių (NN), 50 proc. genus nešiojančių (Nn) bei ketvirtadalis stresui jautrių (nn) paršelių (3 pav). Poruojant šio geno nešiotoją paršavedę (kuilį) ((Nn) su stresui jautriu kuiliu (paršavede) (nn), 50 % palikuonių bus streso geno nešiotojai (Nn), o kiti 50 %. jauniklių bus jautrūs stresui (nn) (4 pav). Kai kiaulių bandoje HAL geno atžvilgiu nevykdoma tinkama atranka ir paranka, streso genas greitai išplinta. Tirti tikslinga kuo ankstyvesnio amžiaus kiaules - laiku išbrokuosite jautrias stresui.
14 1 pav. Sveikų (NN) paršaved÷s (kuilio) ir kuilio (paršaved÷s) poravimas
2 pav. Sveikos (NN) paršaved÷s (kuilio) ir kuilio (paršaved÷s), geno nešiotojo (Nn), poravimas
3 pav. Paršaved÷s (kuilio), geno nešiotojos (Nn), ir kuilio (paršaved÷s), geno nešiotojo (Nn), poravimas
4 pav. Paršaved÷s (kuilio), sergančios (nn), ir kuilio (paršaved÷s), geno nešiotojo (Nn), poravimas 100 % ♀NN NN♂ NN NN NN NN X 50 % 50 % ♀NN Nn♂ NN NN Nn Nn X 25 % 50 % 25 % ♀Nn Nn♂ NN Nn Nn nn X 50 % 50 % ♀nn Nn♂ nn nn Nn Nn X
15 1.2.5. Kiaulių stresinio sindromo tyrimo metodai
Kiaulių stresinis sindromas yra paveldimas. Panaudojant specifinius kiaulių stresiniam sindromui DNR žymenis molekulinių genetinių (PGR-RFIP) metodų pagalba yra išaiškinami ne tik stresui jautrūs (homozigotiniai ) bet ir šio geno nešiotojai (heterozigotiniai ) gyvuliai. Heterozigotiniai gyvuliai turi nepilnai išreikštus kiaulių stresiniam sindromui būdingus neigiamus požymius.
Halotano testas - atradus, kad halotanas yra stresą sukeliantis faktorius, 1970 metais Olandijoje jis prad÷tas naudoti kaip metodas kiaulių jautrumui stresams įvertinti. Metodas plačiai paplito pasaulyje.Tačiau į šį testą reaguoja tik tos kiaul÷s, kurios yra stresui jautrios, t. y. pakitusį recesyvinį HAL geną turi homozigotinëje būsenoje (nn). Jei gyvulys yra heterozigotinis šio geno atžvilgiu (Nn), jis į halotano testą nereaguoja ir negalima jo atskirti nuo stresui nejautraus gyvulio (NN).
PGR - RFIP metodas - nustačius HAL geno nukleotidų seką, 1992 m. buvo atrastas metodas, panaudojant specifinius genui pradmenis polimerazin÷je grandinin÷je reakcijoje bei įvertinus restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmą atskirti tris genotipus - stresui jautrius (nn), nepageidaujamo geno nešiotojus (Nn) ir stresui nejautrius gyvulius (NN). DNR tyrimą galima atlikti nepriklausomai nuo gyvulio amžiaus bei lyties, net tik ką gimusiam paršeliui. Tyrimas atliekamas 1 kartą gyvenimo eigoje. DNR tyrimui gali būti išskirta iš audinio (ausies gabaliuko), šerių, spermos, kraujo. Šio tyrimo metu nustatomi stresui jautrūs gyvuliai (homozigotiniai), pakitusio streso geno platintojai (heterozigotiniai) ir neturintys šio geno gyvuliai (Brenig, Brem, 1992; Braun et al., 1999).
Kiaulių stresinio sindromo problema (PSS) šiandien yra aktuali visame pasaulyje. Tai lemia keletas pagrindinių faktorių. Pirma, kiaulių auginimo technologijos kasmet vis labiau mechanizuojamos ir automatizuojamos. Intensyv÷jant auginimo technologijoms pasitaiko daug stresą sukeliančių faktorių. Antra, šiuo metu ypač didelis d÷mesys yra kreipiamas į m÷sos kokybę, jos tinkamumą tolesniam technologiniam perdirbimui, tod÷l kiaulių stresinio sindromo tyrimai, atranka, paranka yra būtini kiaulių veisimo elementai, siekiant eliminuoti nepageiduajmą geną iš atskirų kiaulių populiacijų.
16
2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimų medžiaga ir metodai
Tyrimų etapai
Kiaulių m÷ginių surinkimas
HAL geno molekulinis genetinis tyrimas
HAL geno polimorfizmo veisl÷se analiz÷
Duomenų baz÷s ūkiniams rodikliams tirti suformavimas
HAL geno polimorfizmų įtaka ūkiniams rodikliams
Statistin÷ duomenų analiz÷ 5 pav. Tyrimų schema.
2.1.1. Tyrimų medžiaga
Tyrimui buvo atrinkta 112 negiminingų kiaulių, kurios priklaus÷ sekančioms veisl÷ms: Lietuvos baltųjų (26), Didžiujų baltųjų (21), Landrasų (25), Lietuvos vietinių (20), Jorkšyrų (20), ir mišrūnų grupei (32), augintų Valstybin÷je kiaulių veislininkyst÷s stotyje. DNR buvo išskirta iš plaukų svogūn÷lių, imant m÷ginius į vienkartinius plastikinius maišelius, juos markiruojant bei užpildant m÷ginių pa÷mimo lydraščius. Tiriamasis darbas atliktas LSMU VA Gyvūnų veisimo ir genetikos katedros K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje. Pen÷jimosi ir m÷sinių savybių duomenys gauti iš Valstybin÷s kiaulių kontrolinio pen÷jimo stoties Kauno skyriaus.
17 2.1.2 Kiaulių fenotipinių požymių duomenų baz÷
Buvo surinkti duomenys ir suformuota kiaulių sekančių požymių duomenų baz÷:
Pen÷jimosi savyb÷s – amžius esant 100 kg mas÷s, d.; priesvoris per parą, g.; suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį; pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio.
Brendimo greitis – amžius dienomis, kai gyvuliai pasiekia 100 kg masę. Šis rodiklis apibūdina augimo spartą nuo paršelio gimimo iki 100 kg mas÷s.
Vidutinis paros priaugimas – parodo gyvulio pen÷jimosi intensyvumą. Pen÷ti pradedama nuo 30 kg paršelio mas÷s iki pasiekiama 100 kg mas÷/ vidutinis paros priaugimas apskaičiuojamas :mas÷s priaugimą nuo 30 kg iki 100 kg dalijant iš pen÷jimo dienų skaičiaus (100kg – 30kg =70kg : 98d. = 714g).
Pašarų sąnaudos 1 kg priaugimui. Šiuo rodikliu vertinamas kiaulių pašarų pasisavinimas. Apskaičiuojamas sunaudotų pašarinių vienetų kiekį dalijant iš bendro mas÷s priaugimo pen÷jimo metu.
M÷sin÷s savyb÷s – šiltos skerdienos mas÷, kg; skerdienos pusel÷s ilgis, cm; bekono pusel÷s ilgis, cm; nugaros raumens plotas, cm²; kumpio mas÷, kg; lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm; lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm; lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm; lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu; lašinių storis taške Fat1, mm; lašinių storis
taške Fat2,mm; raumeninis storis taške Fat2, mm; raumeningumas, %.
Skerdenos pusel÷s ilgis centimetrais, matuojamas nuo pirmojo kaklo slankstelio priekinio krašto iki dubens kaulų suaugimo priekinio krašto (95 - 100 cm).
Bekono pusel÷s ilgis centimetrais, matuojamas nuo pirmojo krutin÷s slankstelio priekinio krašto iki dubens kau1ų suaugimo priekinio krašto (77 - 83 cm).
Nugaros raumens plotas, cm²- matuojamas pjūvyje ties pirmu ir antru juosmens slanksteliais.
Užpakalinio skerdenos pusel÷s trečdalio (kumpio) mas÷, vertinama perpjovus skerdenos puselę ties priešpaskutiniu ir paskutiniu juosmens slanksteliu.
Nugaros lašinių storis milimetrais, matuojamu slankmačiu: keteros srityje, ties 6-7 šonkauliu, juosmens srityje (už paskutinio šonkaulio) ir trijuose kryžiaus srities taškuose - prieš str÷nų paviršinį raumenį, virš raumens ir už raumens.
Raumeningumas % - raumeningumas apskaičiuojamas m÷sos plotą padauginus iš 100 ir padalijus iš lašinių ploto. Juo procentas didesnis, tuo skerdena m÷singesn÷.
18 2.2. Tyrimų metodai
2.2.1. DNR ekstrakcija Chelex dervų pagalba
Nukerpami 4-5 plaukų svogūn÷liai ir patalpinami į m÷gintuv÷lius. Paruošiamas lizavimo mišinys (DTT -7,5 µl, Chelex- 200µl, Proteinaze K (20mg/ml)- 10.7µl). M÷gintuv÷lio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 218,2µl paruošto mišinio). M÷gintuv÷liai 30 s. maišomi maišykl÷s „Vortex" pagalba. Centrifuguojami l0 s 13500 aps./min. greičiu. Pavyzdžiai 30 min. inkubuojami 56°C temperatūroje. Po inkubacijos m÷giniai (po 10µm) pakaitinami 94°C temperatūroje (inaktyvuojami - amplifikatoriuje) bei paliekami nakčiai (Paulauskas ir kt., 2002).
2.2.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genomin÷s DNR kiekis ir grynumas buvo nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba (DNA/RNA Reader, Pharmacia). Tam tikslui paruošiamas l00 µl skiestos DNR tirpalas: imama l0 µl koncentruotos DNR ir skiedžiama 90µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50ug dvigrand÷s DNR. DNR kokyb÷ įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų buvo daugiau, atlikome pakartotinį genomin÷s DNR valymą (Paulauskas ir kt., 2002).
2.2.3. Kiaulių HAL geno tyrimo metodika
Polimeraz÷s grandin÷s reakcija – PGR (Paulauskas ir kt., 2002). HAL geno pradmenys:
• HAL 1 5’-GTG-CTG-GAT-GTC-CTG-TGT-TCC-CT -3’(9,2 pmol/ml) • HAL 2 5’-CTG-GTG-ACA-TAG-TTG-ATG-AGG-TTTG-3’ (7,3 pmol/ml)
Į m÷gintuv÷lį pilama 10 µl DNR ir 15 µl PGR mišinio. PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje (AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700) tokiu režimu:
94 OC, 3 min (pirmin÷ denatūracija) 31 ciklas: 94 OC, 15 sek. (denatūracija),
69 OC 15 sek. (oligonukleotidų prisijungimas), 72°C 35 sek. (DNR grandin÷l÷s sintez÷).
19 1 lentel÷. PGR komponentai kiaulių streso geno tyrimui
E il. Nr.
PGR komponentai Vienai reakcijai atlikti (µl)
1 Dejonizuotas vanduo ddH2O 5,3
2 Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
3 MgCl2 (konc. 50mM) 1,5
4 dNTP miksas (2mM) 2,5
5 Pirminis pradmuo GL1 (darbin÷ konc. 20pmol)
1,1
6 Atvirkštinis pradmuo GL2 (darbin÷ konc. 20pmol)
1,35
7 BSA 0,25
8 Taq polymeraz÷ (1vnt./µl) aktyvumo 0,5
PGR produkto karpymas fermentais:
10 µl PGR produkto karpoma su 10 µl restrikcinio mišinio (7,5 µl ddH2O, 2 µl 10xMbuf., 0,5 µl. Alw21I. Paliekama termostate nakčiai (15 h) 37°C temperatūroje.
2 lentel÷. Pagrindiniai restriktaz÷s Alw21I parametrai
Eil. Nr.
Restrikcinių fermentų laikymo
ir veikimo sąlygos Alw21I
1 Koncentracija 10 a.v./µl
2 Šaltinis Acinetobacter lwoffi RFL21
3 Laikymo temperatūra - 20°C
4 Optimalus veikirnas + 37°C 16val.
5 Inaktyvacijos temperatūra + 65°C 20 min
6 Cheminis veikimas Kerta G(A/T)GC(A/T)m5C
7 Buferin÷ sistema 10mM MgCl2 , 66mM
20 Elektroforez÷ agaroz÷s gelyje:
Karpytas PGR produktas elektroforez÷s būdu frakcionuojamas 3% agaroz÷s gelyje, 100 V 35 min. Gelis dažomas etidžio bromidu 15−20 min. ir analizuojamas UV šviesoje (bangos ilgis 300 nm) „MiniBisPro“ videodokumentavimo prietaisu (Herolab).
Rezultatų vertinimas:
Jeigu gyvulys serga (nn), Alw21I DNR sekoje aptinka vieną kirpimo vietą bei padalina DNR į 48 bp ir 86 bp dydžio fragmentus.
Jei gyvulys yra geno nešiotojas, t.y. heterozigotas (Nn), Alw21I DNR seką perkerpa taip, kad gelyje matome 48 bp, 86 bp ir 134 bp dydžio DNR fragmentus.
Jei gyvulys yra stresui nejautrus (NN), Alw21I nekerpa niekur, tod÷l agaroz÷s gelyje matome vieną 134 bp dydžio DNR fragmentą.
3 lentel÷. Kiaulių streso geno alelių dydžiai (su Alw21I resriktaze)
Bp N (dominantinis) alelis n (recesyvinis) alelis NN genotipas Nn genotipas nn genotipas 134 — — — 86 — — — 48 — — —
2.3. Statistin÷ duomenų analiz÷
Kiaulių HALgeno alelių ir genotipų dažnumai tirtoje grup÷je bei atskirose veisl÷se, faktinis ir prognozuojamas heterozigotiškumas tirtame lokuse buvo apskaičiuoti R – statistiniu paketu (http://www.r-project.org/).
Genotipų dažnis p apskaičiuojamas pagal formulę:
p=N n
p – genotipų dažnis
n – atskiro genotipo individų skaičius N – tirtų individų skaičius
21 Alelių dažnis apskaičiuojamas pagal formulę
2) p= N n n 2 2 1 + 2 3) q= N n n 2 2 3+ 2
n1 ir n3 – homozigotinių individų skaičius n2 - heterozigotinių individų skaičius N - tirtų individų skaičius
Faktinis heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę:
ho= N n2
ho – faktinis heterozigotiškumas n2 - heterozigotinių individų skaičius
N - tirtų individų skaičius
Numatomas heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę:
he=1-(p2+q2) he – numatomas heterozigotiškumas
p ir q – alelių dažniai
ho< he reiškia heterozigotiškumo trūkumą .
22
3.
REZULTATAI
3.1. Kiaulių HAL geno polimorfizmo ištyrimas
Tyrimui buvo atrinktos 144 įvairių veislių kiaul÷s, augintos Valstybin÷je kiaulių veislininkyst÷s stotyje, Baisogaloje. Kiaul÷s priklaus÷ Lietuvos baltųjų, Lietuvos vietinių, Didžiųjų baltųjų, Landrasų, Jorkšyrų veisl÷ms ir mišrūnų grupei.
4 lentel÷. HAL geno genotipų ir alelių dažniai tirtoje kiaulių grup÷je
Eil Nr
HALgenas Kiekis Dažniai Aleliai Dažniai
1 NN 122 0,847 N 0,903
2 Nn 16 0,111 n 0,097
3 nn 6 0,042
144 X
Tirtoje kiaulių grup÷je rastas N ir n alelių dažnis buvo atitinkamai 0,903 ir 0,097; genotipų dažnis – NN genotipo - 0,847, Nn genotipo – 0,111, nn genotipo – 0,042 (4 lentel÷).
5 lentel÷. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas HAL geno lokuse
Heterozigotiškumas
Faktinis heterozigotiškumas 0,111
Teorinis heterozigotiškumas 0,182
χ2 – kriterijaus reikšm÷ (P – reikšm÷) 3,98 ( 0,046 )
Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą visoje tirtoje gyvulių grup÷je faktinis heterozigotiškumas buvo rastas mažesnis, nei teorinis, kas rodo nepakankamą genetin÷s įvairov÷s kiekį tirtame lokuse. Buvo aptiktas statistiškai patikimas nuokrypis nuo Hardžio – Weinbergo pusiausvyros d÷snio. Gauti rezultatai rodo, kad buvo vykdoma kryptinga selekcija homozigotinių individų atrankos ir tolimesnio veisimo kryptimi, t.y. buvo atrenkami individai turintys pageidaujamą streso geno genotipą NN (5 lentel÷).
23
6 lentel÷. HAL geno genotipų ir alelių dažniai tirtoje kiaulių grup÷je pagal atskiras veisles
Alelių dažniai Eil Nr Veisl÷ Kiekis N n 1 Lietuvos baltosios 26 0,92 0,08 2 Lietuvos vietin÷s 20 1,00 0,00 3 Didžiosios baltosios 21 0,93 0,07 4 Jorkšyrai 20 0,95 0,05 5 Landrasai 25 0,90 0,10 6 Mišrūnai 32 0,75 0,25 Viso: 144 0,90 0,10
Išanalizavus HAL geno polimorfizmą atskirose Lietuvoje auginamų kiaulių veisl÷se, didžiojoje dalyje veislių buvo rastas vyraujantis alelis N, kintantis ribose nuo 0,75 mišrūnų tarpe iki 1,000 Lietuvos vietin÷s veisl÷s kiaulių tarpe. n alelio dažnis kito nuo 0,00 Lietuvos vietin÷je iki 0,25 mišrūnų tarpe. Rasti genotipų skirtumai tarp atskirų kiaulių veislių. NN genotipas buvo rastas visose tirtose veisl÷se vyraujantis, kintantis ribose nuo 100 procentų Lietuvos vietin÷je veisl÷je iki 62,50 procentų mišrūnų tarpe.
Nepageidaujamas nn genotipas didžiausiu procentu, net 12,50, rastas mišrūnų tarpe, nes mišrinimui iš t÷vin÷s pus÷s buvo naudota Pjetr÷nų veisl÷, kurioje nepageidaujamas n alelis randamas pakankamai dideliu dažniu. Lietuvos baltųjų, Lietuvos vietinių ir Didžiųjų baltųjų kiaulių veislių tarpe nn genotipas nerastas.
Nepageidaujamo geno platintojų (heterozigotinių kiaulių) taip pat didžiausias procentas rastas tarp mišrūnų (6 lentel÷, 5 – 10 paveikslai).
24
HAL genotipų polimorfizmas tirtoje Lietuvos baltųjų veisl÷s grup÷je 92% 8% NN Nn nn
5 Pav. Hal geno genotipų polimorfizmas tirtoje Lietuvos baltojoje kiaulių veisl÷je
HAL genotipų polimorfizmas tirtoje Lietuvos vietinių veisl÷s grup÷je
100% NN
Nn nn
6 pav. Hal geno genotipų polimorfizmas tirtoje Lietuvos vietin÷je kiaulių veisl÷je
HAL genotipų polimorfizmas tirtoje Lietuvos didžiųjų baltųjų veisl÷s grup÷je
95% 5%
NN Nn nn
25
HAL genotipų polimorfizmas tirtoje Jorkšyrų veisl÷s grup÷je 85% 10% 5% NN Nn nn
8 pav. Hal geno genotipų polimorfizmas tirtoje Jorkšyrų kiaulių veisl÷je
HAL genotipų polimorfizmas tirtoje Landrasų veisl÷s grup÷je 84% 12% 4% NN Nn nn
9 pav. Hal geno genotipų polimorfizmas tirtoje Landrasų kiaulių veisl÷je
HAL genotipų polimorfizmas tirtoje mišrūnų grup÷je
62% 25% 13% NN Nn nn
26 3.2. Kiaulių HAL geno įtakos m÷sin÷ms savyb÷ms ištyrimas
Tiriant streso geno įtaką m÷sin÷ms savyb÷ms buvo suformuota sekančių fenotipinių požymių duomenų baz÷ - šiltos skerdenos mas÷, skerdenos pusel÷s ilgis, bekono pusel÷s ilgis, nugaros raumens plotas, kūno mas÷, lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, lašinių storis ties 10 šonkauliu, lašinių storis ties paskutiniu juosmens slanksteliu, lašinių storis taške Fat1, lašinių storis taške Fat2, raumens storis taške Fat2, raumeningumas. Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal streso geno homozigotinius ir heterozigotinius genotipus (7 lentel÷).
7 lentel÷. HAL geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms
Kumpio mas÷, kg Genotipas n Šiltos skerdenos mas÷, kg Skerdenos pusel÷s ilgis, cm Bekono pusel÷s ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm² NN 122 76,5± 0,047 97,4± 0,023 77,3± 0,043 41,7± 1,163 a 12,9± 0,159 a Nn 16 75,4± 0,015 97,6± 0,024 77,7± 0,028 39,8± 0,225 b 11,7± 0,009b nn 6 75,3± 0,013 99,6± 0,727 79,2± 0,457 39,6± 0,039 b 11,9± 0,004 b a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje (p<0,05)
Tiriant HAL geno įtaką m÷sin÷ms savyb÷ms buvo nustatyta, kad homozigotinio nn genotipo kiaul÷s tur÷jo mažesnę šiltos skerdenos masę 1,2 kg, tačiau ilgesnę skerdenos puselę 2,2 cm ir ilgesnę bekono puselę 1,9 cm. Nugaros raumens plotą 2,1 cm² ir kumpio masę 1kg didesnę tur÷jo NN genotipo kiaul÷s ir šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05). Heterozigotiniai Nn genotipo gyvuliai tur÷jo tarpines tiriamų požymių reikšmes lyginant su NN ir nn genotipo gyvuliais. Statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas rastas nugaros raumens plotui, kur NN genotipo kiaul÷s tur÷jo šį rodiklį 1,9 cm² didesnį nei Nn genotipo ir kumpio masei, kur NN genotipo kiaul÷s tur÷jo šį rodiklį 1,2 kg didesnį nei Nn genotipo (7 lentel÷).
27
8 lentel÷. HAL geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms
Raumens storis taške Fat2, mm Raumenin gumas, % Genotipas n Lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm Lašinių storis ties 10 šonkauliu, mm Lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm Lašinių storis taške Fat2, mm NN 122 19,2± 0,126 17,4± 0,125 17,2± 0,114 16,5± 0,112 44,3± 0,127 a 53,7± 0,106 a Nn 16 18,7± 0,317 17,2± 0,467 17,1± 0,154 15,3± 0,762 44,5± 1,393 a 53,5± 0,405 a nn 6 17,4± 0,034 16,5± 0,037 16,4± 0,041 14,7± 0,043 46,5± 0,079 b 55,3± 0,043 b a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje (p<0,05)
Mažiausiu lašinių storiu pasižym÷jo nn genotipo kiaul÷s. Jų lašinių storis ties 6-7 šonkauliu buvo mažesnis 1.8 mm, ties 10 šonkauliu 0,9 mm, už paskutinio šonkaulio 0,8 mm, taške Fat2 1,8 mm nei NN genotipą turinčių kiaulių. Didžiausiu raumens storiu taške Fat2 ir
raumeningumu pasižym÷jo nn genotipo kiaul÷s. nn genotipo kiaulių raumens storis taške Fat2
buvo didesnis 2,2 mm, o raumeningumas 2,4 procento nei NN genotipo kiaulių ir šis skirtumas buvo reikšmingas. Lyginant nn ir Nn genotipų kiaulių savybes nustatyta, kad nn genotipo kiaulių
raumens storis taške Fat2 buvo didesnis 2 mm, o raumeningumas 2,2 procento nei NN genotipo
kiaulių ir šis skirtumas buvo reikšmingas (8 lentel÷).
3.3. Kiaulių HAL geno įtakos pen÷jimosi savyb÷ms ištyrimas
Tiriant streso geno įtaką pen÷jimosi rodikliams buvo suformuota sekančių fenotipinių požymių duomenų baz÷ – amžius esant 100 kg mas÷s, priesvoris per parą, suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį, pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio. Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal streso geno homozigotinius ir heterozigotinius genotipus (9 lentel÷).
28
9 lentel÷. HAL geno įtaka kiaulių pen÷jimosi savyb÷ms
Pašarų sanaudos 1 kg priesvorio
Genotipas n
Amžius esant 100 kg mas÷s, d.
Priesvoris per parą, g Suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį, kg NN 122 176,3±0,181 785,3±1,361a 172,9±0,065a 2,7±0,004a Nn 16 181,9±0,413 726,6±2,672b 179,4±0,143b 3,1±0,003b nn 6 182,5±2,631 675,1±4,220 184,9±4,158 3,2 ±0,064
a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje (p<0,05)
Tiriant HAL geno įtaką pen÷jimosi savyb÷ms buvo rasta, kad mažiausias amžius esant 100 kg mas÷s buvo kiaulių, turinčių HAL geno NN genotipą (176,3 dienos), mažiausias suvartotas pašarų per pen÷jimosi laikotarpį kiekis buvo NN genotipo (172,9 kg), bei mažiausios pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio buvo kiaulių su genotipu NN (2,7 kg), kai kiaul÷ms, turinčioms nn genotipą 1 kg priesvoriui priaugti reik÷jo 3,2 kg pašarų. Didžiausią priesvorį per parą pasiek÷ kiaul÷s, turinčios NN genotipą (785,3 g), o mažiausią nn genotipą turinčios kiaul÷s (675,1 g) (9 lentel÷).
29
4.
REZULTATŲ APTARIMAS
Intensyvinant selekciją m÷singumo gerinimo kryptimi, padid÷jo stresams jautrių kiaulių skaičius. Jautrumą stresams veikia halotano genas (HAL) randamas šeštoje chromosomoje Kiaulių halotano genas yra polimorfiškas. Halotano geno polimorfizmas susijęs su pakitusiu glikogeno skilimo greičiu, ko pasekoje pH nukrenta iki 5,5. Žemas ph raumenyse sukelia baltymų denatūraciją, pablog÷ja baltymų mikrostruktūra ir tai pablogina m÷sos kokybę. Gaunama PSE – balzgana, minkšta, vandeninga m÷sa. D÷l nevienodo glikogeno skaidymo ir pieno rūgšties susidarymo greičio, skerdienos raumenyse atsiranda ir kitas nukrypimas – DFD
sindromas – tamsi, kieta, sausa m÷sa. Jautrios stresams kiaul÷s yra raumeningesn÷s, tačiau jų
m÷sa yra blogos kokyb÷s, netinka perdirbti, ypač rūkytiems gaminiams, prastesn÷ jos prekin÷ išvaizda. Halotano genas sukelia kiaulių stresinį sindromą ko pasekoje gyvuliai miršta nuo
terminio šoko, pablog÷ja reprodukcin÷s savyb÷s (Bowker et al., 2000; Band et al., 2005;
Kriauzien÷ ir kt., 2005).
Atlikus halotano geno tyrimus Lietuvoje veisiamų kiaulių tarpe buvo identifikuoti du halotano geno aleliai N ir n. Tirtoje kiaulių grup÷je vyravo N alelis, o stresinį sindromą sukeliantis n alelis kito nuo 0.080 iki 0,250. Mūsų gauti tyrimų rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų skelbtais duomenimis (Brenig et al., 1992; Houde, Roy, 1993; Knor et al., 1994; Jokubka ir kt., 2001).
Įvairių veislių kiaul÷s į stresus reaguoja skirtingai. Labai produktyvių veislių gyvuliai yra jautresni. Dažniausiai tai m÷sinių veislių kiaul÷s, ilgai selekcionuotos m÷singumo kryptimi. Tokių gyvulių organizme vykstantys intensyvūs metabolizmo procesai skatina mas÷s augimą, o adaptacin÷s savyb÷s prast÷ja. Jautriausi stresams yra Pjetr÷nai ir įvairios selekcijos Landrasai (Knorr et al., 1994; Klimas, Klimien÷, 2003; Miceikien÷, Jokubka, 2000; Jokubka,Miceikien÷, 2001). Mūsų tyrimų duomenimis jautriausi stresams buvo mišrūnai, nes mišrinimui iš t÷vin÷s pus÷s buvo naudota Pjetr÷nų veisl÷. Nepageidaujamo n geno nešiotojų taip pat radome daugiausia tarp mišrūnų. Halotano n alelį kaip ir kiti mokslininkai taip pat pakankami dideliu dažniu radome Landrasų veisl÷je. Yra nustatyta, kad Pjetrenų, Hempšyrų, Vokietijos ir Danijos landrasų, Švedijos jorkšyrų veislių kiaul÷s turi mažesnę krūtin÷s ląstą ir plaučių tūrį. Esant stresinei situacijai tokių kiaulių kv÷pavimo sistema negali aprūpinti kraujo pakankamu kiekiu deguonies, o kraujas neaprūpina raumenų ląstelių, o tai lemia eksudacinio proceso atsiradimą m÷soje. Tai būdinga specializuotų m÷sinių veislių kiaul÷ms. Mažinant ar norint visai išvengti eksudacin÷s kiaulienos atsiradimo d÷l genetinių veiksnių, reik÷tų gamybinio kryžminimo metu
30 kaip motininę veislę pasirinkti universalios krypties kiaules, o kaip t÷vinę – specializuotų m÷sinių veislių kuilius (Kriauzien÷, 2005).
Kadangi kiaulių halotano genas labiausiai paplitęs m÷sin÷se kiaulių veisl÷se bei įvairiuose mišrūnuose su šiomis veisl÷mis, kiaul÷s turinčios nepageidaujamą recesyvinį n alelį yra liesesn÷s, nors kaip buvo min÷ta turi daug blogesnę m÷sos kokybę. Mokslininkai nustat÷, kad stresui nejautrios kiaul÷s turi didesnį paros priesvorį bei mažesnes pašarų sąnaudas, bet yra riebesn÷s bei mažiau raumeningos nei stresui jautrios kiaul÷s (Monin et al., 1981; Aalhus et al., 1991; Carlson et., 2011). Šie duomenys puikiai koreliuoja su mūsų tyrimų rezultatais.
Atsparių stresams kiaulių atranka turi būti vykdoma veislynuose, nes jie aprūpina kompleksus ir prekines fermas veisliniais gyvuliais, o veislininkyst÷s įmones (spermos ÷mimo centrus) – kuiliais-reproduktoriais. Nustačius chromosomose recesyvinį halotano geną (Nn arba nn), kiaul÷s turi būti išbrokuojamos, veislei nepaliekamos. Išimtis gali būti daroma tik pjetr÷nams, nes dauguma jų chromosomose turi min÷tą HALgeną. Mišrinimo deriniuose siūloma naudoti heterozigotinius (Nn) pjetr÷nų veisl÷s kuilius, jeigu jie poruojami su recesyvinio geno neturinčiomis (NN) kiaul÷mis, o gauti pirmos kartos mišrūnai realizuojami m÷sai. Daugumos specialistų nuomone Hal genas per motininę veislę (Lietuvos baltąsias, Jorkšyrus, Landrasus) neturi būti platinamas. Gyvuliai, turintys šį geną, iš veislinio branduolio nedelsiant turi būti eliminuojami. T÷vin÷se veisl÷se (Pjetr÷nų, Hempšyrų, Diurokų) reikia atsisakyti Hal geno atžvilgiu homozigotinių gyvulių, t.y. stresui jautrių (nn). Šiuo metu, molekulinių genetinių metodų pagalba yra išaiškinami ne tik stresui jautrūs (homozigotiniai), bet ir šio geno nešiotojai (heterozigotiniai) gyvuliai. Tyrimą galima atlikti bet kokio amžiaus, lyties ar fiziologinio stovio gyvuliams ir atliekamas vieną kartą gyvulio gyvenime. Tyrimą tikslinga atlikti kuo ankstyvesniame amžiuje, kad būtų galima išbrokuoti stresui jautrias kiaules bei geno nešiotojas ir išvengti ekonominių nuostolių.
Molekulinių genetinių metodų panaudojimas kiaulių selekcijoje, gali labai paspartinti selekcijos procesą, pagerinti kiaulienos kokybę, sumažinti savikainą bei padaryti mūsų produkciją konkurencingą užsienio rinkose. Tai pat šiais metodais galima koreguoti gyvulio veislinę vertę, koreguojant pageidaujamus/nepageidaujamus genus. Žem÷s ūkio gyvulių selekcijos tikslas yra veisti ir auginti gyvulius, pasižyminčius aukštomis produktyvumo bei kitomis ūkiškai naudingomis savyb÷mis, mažinti gyvulininkyst÷s produkcijos gamybos savikainą bei gauti kokybiškus žem÷s ūkio produktus, tenkinančius vartotojų poreikius bei atitinkančius vakarų Europos rinkos kokyb÷s reikalavimus. Vienas iš būdų per trumpą
31 genetinių žymenų MAS (Marker Assisted Selection), kaip parankos kriterijų, panaudojimas selekcijoje. Genetinių žymeklių panaudojimas selekcijoje leidžia ne tik atrinkti tolesniam veisimui ankstyvame amžiuje gyvulius, turinčius pageidaujamą fenotipą, bet jų pagalba yra įmanoma nustatyti individualius genus ar netgi jų grupes, lemiančias pageidaujamą genotipą, o taip pat nustatyti genus, lemiančius genetiškai paveldimas ligas bei ydas, kurios atneša didelius ekonominius nuostolius (Davoli, Braglia, 2008).
32
IŠVADOS
1. Atlikus halotano geno tyrimus tarp Lietuvoje veisiamų kiaulių buvo identifikuoti du
halotano geno aleliai dominantinis - N ir recesyvinis ( sukeliantis stresinį sindromą) - n. 2. Tirtoje kiaulių grup÷je halotano geno alelių dažnis buvo N alelio – 0,903, n alelio -
0,097; genotipų dažnis – NN genotipo – 0,847, Nn genotipo – 0,111, nepageidaujamo nn genotipo – 0,042.
3. Ištyrus halotano geno polimorfizmą atskirose Lietuvoje auginamų kiaulių veisl÷se visose
veisl÷se buvo rastas vyraujantis dominantinis alelis N. Recesyvinio n alelio dažnis kito nuo 0,000 Lietuvos vietinių kiaulių veisl÷je iki 0,250 mišrūnų grup÷je. Nepageidaujams nn genotipas, sukeliantis kiaulių stresinį sindromą, didžiausiu procentu, rastas tarp mišrūnų. Tarp Lietuvos baltųjų, Lietuvos vietinių ir Didžiųjų baltųjų kiaulių nn genotipas nerastas.
4. Tiriant HAL geno įtaką m÷sin÷ms savyb÷ms buvo nustatyta, kad homozigotinio nn
genotipo kiaul÷s tur÷jo mažesnę šiltos skerdenos masę, nugaros raumens plotą, kumpio masę, bet ilgesnę skerdenos ir bekono puselę. Stresui jautrios kiaul÷s buvo liesesn÷s ir raumeningesn÷s nei stresui atsparios. Gyvuliai, streso geno nešiotojai tur÷jo tarpinius rodiklius.
5. Tiriant HAL geno įtaką pen÷jimosi savyb÷ms buvo nustatyta, kad stresui jautrios kiaul÷s
suvartoja daugiau pašarų 1 kg priesvorio priaugti, turi mažesnį paros priesvorį ir mažesnį svorį skerdimo metu. Gyvuliai, streso geno nešiotojai tur÷jo tarpinius rodiklius.
REKOMENDACIJOS
1. Kiaulininkyst÷je daugelį gyvuliui stresinių situacijų būtina pašalinti, tačiau jų visiškai
išgyvendinti neįmanoma. Tod÷l greta m÷singumo gerinimo turi būti vykdoma ir stresams atsparių kiaulių atranka ir paranka.
2. Suformavus stresams atsparių kiaulių bandas, būtų galima pagaminti geresn÷s
33
LITERATŪRA
1. Alexandra C., McPherron and Se-Jin Lee.Double muscling in cattle due to mutations
in the myostatin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 12457-12461.
2. Aalhus J. L., Jones S. D. M., Robertson W. M., Tonga1 A. K. W. and Sather A. P.
Growth characteristics and carcass composition of pigs with known genotypes for stress susceptibility over a weight range of 70 to 120 Kg. Animal Production. 1991. Vol. 52 . P. 347 -353.
3. Barata M., Saleri R., Mainardi G. L., Giustina A., Samanini C. Leptin Regulates GH
Gene Expression and Secretion and Nitric Oxside Production in pig Pituitary Cells. Endocrinology. 2002. V. 143 (2), P.551-557.
4. Band de Oliveira , Simone Eliza Facioni Guimaraes, Paulo Savio Lopes, Alex Sandro
Schierholt, Kleibe Moraes Silva, Aldrin Vieira Pires, Augusto Aloisio Benevenuto Junior and Lucio Alberto de Miranda Gomide. Relationship between the Porcine
Stress Syndrome gene and pork quality traits of F2 pigs resulting from divergent
crosses. Genetics and Molecular Biology. 2005. Vol. 28 (1). P. 88-91.
5. Braun, L. J. Chase, C.C.L. Swine Heatth and Production. Diagnostic porcine
polymerase chain reaction assay; 7(1). 1999. P. 37-40.
6. Brenig B., Brem G. Molecular cloning and analysis of the porcine „halothane“gene.
Arch. Thierz. 1992. Vol.35. P. 129-135.
7. Bowker, A. L. Grant, J. C. Forrest, and D. E. Gerrard. Muscle metabolism and PSE
pork. Proceedings of the American Society of Animal Science. Department of Animal Sciences. 2000. P. 37 – 42.
8. Campfield, L. A., Smith, F. J., Guisez, Y., Devos, R., Burn P. Recombinant mouse
OB protein: evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks. Science 269.1995. P. 546-549.
9. Carlson J. P., L. L. Christian, D. L. Kuhlers and B. A. Rasmusen. Influence of the Porcine Stress Syndrome on Production and Carcass Traits. Journal of Animal
Science. 1980.Vol. 50. P. 21-28.
10.Cieslak D., Blicharski T., Kapelanski W., Pierzchala M. Investigation of
polymorphisms in the porcine myostatin (GDF8; MSTN)gene. Czech J Anim Sci. 2003. 48: 69 – 75.
11.Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Fukumoto Y. and Ozawa S. A simple method for
34
12.Curi R.A., Oliveira H.N., Silveira A.C. and Lopes C.R. Effects of polymorphic
microsatellites in the regulatory region of IGF1 and GHR on growth and carcass traits in beef cattle. Animal Genetics. 2005. Vol. 36. P. 58-62.
13.Davoli R. and Braglia S. Molecular approaches in pig breeding to improve meat
quality. Briefings in functional genomics and proteomics. 2008. Vol 6. NO 4. P. 313-321.
14.Fausto Morena da Silva, Guimaraes Simone Eliza Facioni, Lopes Paulo Savio, Pires
Aldrin Vieira, Guimaraes Marta Fonseca Martins, Barbosa da Silva Marcos Vinicius Gualberto, Schierholt Alexs Sandro, Silva Kleibe de Moraes and Gomide Lucio Alberto de Miranda. Association of MYF5 gene allelic variants with production traists in pigs. Genetic and Molecular Biology. 2005. 28, 3, 363 – 369.
15.Fiedler I., Ender K., Wicke M., Maak S., Lengerken G. V., Meyer W. Structural and
functional characteristics of muscle fibers in pigs with different malignant hyperthermia susceptibility (MHS) and different meat quality. Meat Science. 1999. Vol. 53. P. 9–15.
16.Fernandez X, Neyraud E, Astruc T and Sante V. Effects of halothane genotype and
prc-slaughtcr treatment on pig meat quality. Post mortem metabolism, meat quality indicators and sensory traits of m. longissimus lumborum. Meat Science. 2002. Vol. 62. P. 429-437.
17.Fisher P, Mellett, FD and Hoffman LC (2000a) Halothane genotype and pork quality.
1. Carcass and meat quality traits from the three halothane genotypes. Meat Science. 2000. Vol. 54. P. 97-117.
18.Gahne B., Juneja R.K. Prediction of the halothane (HAL) genotypes of pigs by
deducing Hal, Phi, Po2, Pgd haplotypes of partens and offspring: Results from a large-scale practice in Swedish breeds. Anim Blood Groups Biochem Genetics . 16.1985. P. 265-283.
19.Gronek P. Ryanodine receptor locus: an interspecies comparison of the polymorphic
locus linked with the occurrence of Malignant Hyperthermia. Roczniki AR w Poznaniu. Rozprawy Naukowe, vol. 294. 1999.
20.Grochowska R., Zwierschowski L., Snochowski M. and Reklewski Z. Stimulated
growth hormone (GH) release in Friesian cattle with respect to GH genotypes. Reproduction Nutrition Development. 1999. Vol. 39. P. 171-180.
21.Guimaraes Simone, Stahl Chad, Lonergan Steven, Geiger Becky, Rothschild Max.
Myostatin promoter analysis and expresionpattern in pigs. Livestock Science. 2007. V. 122, P. 143-150.
35
22.Hamilton D.N., Ellis M., Miller K.D., McKeith F.K., Parrett D.F. The effect of the
halothane and rendement napole genes on carcass and meat quality characteristics of pigs. Journal of Animal Science. 2001. N. 78. P. 2862 – 2867.
23.Houde A., Godbout D., Gariepy C. Major genes and meat quality. Advances in pork
production. 2001. Vol. 12. P. 139 – 142.
24.Houde, A., Pommier, S.A. Roy, R. Detection of the ryanodine receptor mutation
associated with malignant hyperthermia in purebred swine populiations. J Anim Sci 71. 1993. P. 1414-1418.
25.Yu, T-P., Wang L., Tuggle C. K., Rothschild M. F. Mapping genes for fatness and
growth on pig chromosome 13: a search in the region close to the pig PIT1 gene. J. Anim. Brees. Gene. 1999 V. 116, P. 269-280.
26.Jiang Zhi-Hua, Gibson John P. Genetic polymorphisms in the leptin gene and their
association wth fatness in four pug breeds. 1999. Mammalian Genome. V. 10, P. 191-193.
27.Jokubka R., Miceikien÷ I. Streso geno paplitimas tarp Lietuvos veislininkyst÷s
įmon÷se veisiamų kuilių. Veterinarija ir zootechnika. Kaunas. 2001. Vol. 14(36). P. 67-72.
28.Jokubka R., Miceikien÷ I. A missence variation of melanocortin – 4 receptior gene
(MC4R) in Lithuanian White pig breed. Proceedings of the 9th Baltic Animal Breeding
Conference. Sigulda. 2003. P.65-67.
29.Kennes, Y. M., Murphy, B. D., Pothier, F., Palin, M. F. Characterization of swine
leptin (LEP) polymorphisms and their association with production traits. Animal Genetic 32. 2001. P. 215-218.
30.Kerry Joseph, Kerry John, Ledward David. Meat processing. Improving quality.
Woodhead Publishing Limited. 2002. P. 27- 57.
31.Klimas, R. Klimien÷, A. Kiaulių jautrumas stresams ir ryšys su m÷sos kokybe. VET
info. 2003. T 8-9. P. 75-76
32.Knorr , C. Schwille, M. Moser, G. Muller, E. Bartenschilager, H. And Geldermann, H.
Calcium-release-channel genotypes in several pig populiations – associations with halothane and CK reactions. J Anim. Breed. Genet. 1994. Vol. 111. P. 243-252
33.Knorr C., Moser G., Muller E. and Geldermann H. Association of GH gene variants
with performance traits in F-2 generations of European wild boar. Pietrain and Meishan pigs. Animal Genetics. 1997. Vol. 28. P. 124-128.
36
34.Kriauzien÷, J. Miceikien÷, I. Masiulien÷, A. Baltr÷nait÷, L. Hal geno įvairov÷s linijos
kiaulių bandoje. Geno įtaka kiaulių reprodukcin÷ms savyb÷ms. Veterinarija ir zootechnika. 2005. T. 30 (52). P. 50
35.McNeel, R. L., Ding, S. T., Smith, E. O., Mersmann, H. J. Effect of feed restriction on
adipose tissue transcript concentrations in generically lean and obese pigs. Journal of Animal. Science 78. 2000. P. 934-942.
36.McPherron A.C., Lee S. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin
gene. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, P. 12457-12461.
37.Miceikien÷ I., Jokubka R. Porcine Stress Syndrome (PSS)-identification, gene
frequencies and selection fot stress resistant pigs. The 6 Baltic Animal Breeding Conference, Jelgava. 2000. P.16-18.
38.Miceikien÷ I., Kriauzien÷ J., Pečiulaitien÷ N., Baltr÷nait÷ L. Kiaulių veisimas ir
genetika. 2007. P. 1 48
39.Morgan Jones S.D. Quality and Grading of Carcasses of Meat Animals. CRC Press,
1995. P. 233.
40.Monin G., Sellier P., Ollivier L., Goutepongea R. and Girard J. P. Carcass
characteristics and meat quality of halothane negative and halothane positive pietrain pigs. Meat Science. 1981. Vol.5. (6). P. 413-423.
41.Milan, D., Jeon, JT, Looft, C., Amarger, V., Robic, A., Thelander, M., Rogel- Gailard,
C., Paul, S., Iannuccelli, N., Rask, L., Ronne, H., Lundstrom, K., Reinsch, N. Gellin, J., Kalm, E., Le Roy, P., Chardon, P., Andersson, L.– A mulation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle. Science 288, 2000. P. 1248-1251.
42.Paulauskas A., Grigaliūnait÷ I., Miceikien÷ I., Malevičiūt÷ J., Tubelyt÷ - Kirdien÷ V.
Genetikos praktikumas - DNR polimorfizmo tyrimo metodai. Mokymo priemon÷. 2002. 72 p.
43.Pas M. F. W., Soumillion A., Harders F. L., Verburg F. J., Bosch, Galesloot P. The Meuwissen Influences of Myogenin Genotypes on Birth Weight, Growth Rate, Carcass Weight, Backfat Thickness, and Lean Weight of Pigs. 1999. J. Anim. Sci. V. 77.
44.Smet S.D., Bloemen H.G., Voorde G.V.D. Spincemaille G., Berkmens D. Meat and
Carcass Quality of Two Piges Lines and Their Crosses Differing in Stress Susceptibility. 48 Annual Meeting of the EAAP, Austria. 1997.
45.Stratil A, Peelman LJ, Vanpoucke M and Cepica S A HinfI PCR-RFLP at the porcine
37
46.Soumillion Ann, Erkens jo H.F., Lenstra Johannes A., Gunther Rettenberger, Pas
Marinus F. W. Genetic variation in porcine myogenin gene locus. 1997. Mammalian Genome. V. 8, N. 8, P. 564-568.
47.Sun H. S., Taylor C., Robic A., Wang L., Rothschild M. F., Tuggle C. K. Maping of
growth hormone receptor of swine chromosome 18. 1997. Animal Genetics. V. 28, P. 351-353.
48.Switonski M. Molecular genetics in beef cattle breding a review. Animal Sciense
