'Black Veil'

(1)

DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „STAMBIAUOGIŲ SPANGUOLIŲ (VACCINIUM MACROCARPON AIT.) UOGŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR

ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAI“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir

ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Ieva Preibytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Ieva Preibytė

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(2)

Palma Nenortienė

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

2020–05–12 Liudas Ivanauskas

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

IEVA PREIBYTĖ

STAMBIAUOGIŲ SPANGUOLIŲ (VACCINIUM

MACROCARPON AIT.) UOGŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Lekt. P. Nenortienė

KAUNAS, 2020

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė

Data

STAMBIAUOGIŲ SPANGUOLIŲ (VACCINIUM MACROCARPON AIT.) UOGŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO

TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Lekt. P. Nenortienė Data

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Data Ieva Preibytė Data

KAUNAS, 2020

(5)

TURINYS

SANTRAUKA ... 7

SUMMARY ... 8

SANTRUMPOS ... 10

ĮVADAS ... 11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1 Stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) apibūdinimas ... 13

1.2 Stambiauogių spanguolių paplitimas Lietuvoje ir pasaulyje... 14

1.3 Stambiauogių spanguolių uogų cheminė sudėtis ... 15

1.4 Stambiauogių spanguolių biologinės savybės ir panaudojimas ... 17

1.5 Fenolinių junginių apžvalga ... 19

1.6 Fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės analizės metodai ... 21

1.7 Antioksidacinis poveikis ir jo nustatymo metodai ... 23

2. TYRIMO METODIKA ... 25

2.1. Tyrimo objektas... 25

2.2. Naudoti reagentai ... 26

2.3. Naudota aparatūra ir priemonės ... 26

2.4 Ekstraktų gamyba ... 27

2.5 Tyrimo metodai ... 27

2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27

2.5.2 Bendro antocianinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 28

2.5.3 Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 28

2.5.4 Antocianinų kokybinis ir kiekinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 29

2.5.5 Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų‒katijonų surišimo metodu ... 30

2.6 Statistinis duomenų įvertinimas ... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas spanguolių uogose ... 32

3.1.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingose spanguolių veislėse ... 32

3.1.2. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse surinktose 'Pilgrim' veislės spanguolių uogose ... 33

(6)

3.2. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas spanguolių uogose ... 34

3.2.1. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas skirtingose spanguolių veislėse ... 34

3.2.2. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse surinktose 'Pilgrim' veislės spanguolių uogose ... 36

3.3. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas spanguolių uogose ... 37

3.3.1. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas skirtingose spanguolių veislėse ... 37

3.3.2. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse surinktose 'Pilgrim' veislės spanguolių uogose ... 38

3.4. Antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties nustatymas spanguolių uogose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 39

3.5. Spanguolių uogų antioksidacinio aktyvumo vertinimas ... 41

3.5.1. Skirtingų spanguolių uogų veislių antioksidacinio aktyvumo vertinimas ... 41

3.5.2. 'Pilgrim' veislės spanguolių uogų, surinktų skirtingose augavietėse, antioksidacinio aktyvumo vertinimas ... 43

4. IŠVADOS ... 44

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 46

7. PRIEDAI ... 51

(7)

SANTRAUKA

I. Preibytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė lekt. Palma Nenortienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Pavadinimas – Stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) uogų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimai.

Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) uogų fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, jos įvairavimą bei įvertinti ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Uždaviniai: Spektrofotometriniu metodu nustatyti Lietuvoje auginamų skirtingų stambiauogių spanguolių veislių uogų fenolinių junginių kiekinę sudėtį bei jos įvairavimą.

Spektrofotometriniu metodu nustatyti ir palyginti skirtingose Lietuvos vietose auginamų 'Pilgrim' veislės stambiauogių spanguolių uogų fenolinių junginių kiekinę sudėtį ir jos įvairavimą. ESC metodu nustatyti skirtingų stambiauogių spanguolių veislių uogų antocianinų kokybinę ir kiekinę sudėtį bei jos įvairavimą. Nustatyti Lietuvoje auginamų skirtingų stambiauogių spanguolių veislių uogų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu. Nustatyti ir palyginti skirtingose Lietuvos vietose auginamų 'Pilgrim' veislės stambiauogių spanguolių uogų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu.

Tyrimo objektas ir metodai: tirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) veislių 'Bergman', 'Black Veil', 'Pilgrim', 'Holliston', 'Searles', 'Franklin', 'Stevens', 'Ben Lear' uogų ėminiai. Bendras fenolinių junginių, antocianinų, proantocianidinų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas in vitro vertintas spektrofotometriniu analizės metodu. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta kokybinė ir kiekinė antocianinų sudėtis.

Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias bendras fenolinių junginių ir antocianinų kiekis nustatytas 'Holliston', o proantocianidinų – 'Bergman' veislės uogose. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas 'Pilgrim' veislės uogose, surinktose Vilniaus mieste, antocianinų – Salantų m. (Kretingos raj.), o proantocianidinų – VDU Kauno botanikos sode.

ESC metodu uogose kokybiškai nustatyti 4 antocianinai: cianidin-3-O-galaktozidas, cianidin- 3-O-arabinozidas, peonidin-3-O-galaktozidas, peonidin-3-O-arabinozidas. Daugiausiai nustatyta junginio peonidin-3-O-galaktozido. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas 'Bergman' veislės uogose ir Vilniaus mieste surinktose 'Pilgrim' veislės uogose.

(8)

SUMMARY

I. Preibytė master‘s thesis. Supervisor lect. Palma Nenortienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas.

The title of the master thesis. Studies on phenolic compounds and antioxidant activity of berries of American cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.).

The aim of the research. To investigate the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of Vaccinium macrocarpon Ait. berries grown in Lithuania and to evaluate the antioxidant activity of the extracts.

The objectives of the research. To determine the quantitative composition of phenolic compounds of different American cranberry cultivars grown in Lithuania by spectrophotometric method. To determine and compare the phenolic compounds of 'Pilgrim' cranberry cultivars grown in different parts of Lithuania by spectrophotometric method. To determine the qualitative and quantitative composition of anthocyanins of different American cranberry cultivars by high performance liquid chromatography method. To determine the antioxidant activity of different American cranberry cultivars berry extracts by ABTS spectrophotometric method. To determine and compare the antioxidant activity of 'Pilgrim' cranberry cultivars by ABTS spectrophotometric method.

The object and methods of the research. Samples of 'Bergman', 'Black Veil', 'Pilgrim', 'Holliston', 'Searles', 'Franklin', 'Stevens', 'Ben Lear' berries of Vaccinium macrocarpon Ait.

grown in Lithuanian climatic conditions were studied. The total amount of phenolic compounds, anthocyanins, proanthocyanidins and antioxidant activity in vitro were evaluated by spectrophotometric analysis. The qualitative and quantitative composition of anthocyanins was determined by high performance liquid chromatography.

The results and conclusions of the research. The highest total content of phenolic compounds and anthocyanins was found in 'Holliston', and proanthocyanidins in 'Bergman' cultivars. The highest total amount of phenolic compounds was found in 'Pilgrim' berries harvested in Vilnius, anthocyanins – in Salantai and proanthocyanidins – in VDU Kaunas Botanical Garden. Four anthocyanins were qualitatively determined in berries by high performance liquid chromatography: cyanidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-arabinoside, peonidine-3-O- galactoside, peonidine-3-O-arabinoside. The compound peonidin-3-O-galactoside was mainly detected. The highest antioxidant activity was found in 'Bergman' variety berries and 'Pilgrim' variety berries harvested in Vilnius.

(9)

PADĖKA

Už stambiauogių spanguolių uogas dėkoju VDU Kauno botanikos sodo Pomologijos skyriaus darbuotojams.

(10)

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonrūgštis);

DMCA – 4-(dimetilamino)cinamono aldehidas;

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

GRE – galo rūgšties ekvivalentas;

H2O2 – vandenilio peroksidas;

K2S2O8 ‒ kalio persulfatas;

TE – trolokso ekvivalentas;

Troloksas – 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksirūgštis;

VDU – Vytauto Didžiojo universitetas.

(11)

ĮVADAS

Uogos – gana plačiai ištirtos augalinės kilmės žaliavos dėl jose sukauptų didelių kiekių biologiškai aktyvių junginių, kurių ypač gausu spalvotose uogose. Daugiausia šių junginių randama Rosaceae ir Ericaceae šeimoms priklausančių augalų vaisiuose – braškėse, avietėse, gervuogėse, mėlynėse, spanguolėse. Didžiąją dalį sukauptų medžiagų sudaro fenoliniai junginiai, kurie pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu, dėl kurio uogos turi teigiamą poveikį žmogaus organizmui ir yra vartojamos lėtinių ir infekcinių ligų profilaktikai bei gydymui [40,45].

Stambiauogės spanguolės (Vaccinium macrocarpon Ait.) – Kanadoje, Amerikoje paplitusi ir Europoje populiarėjanti spanguolių rūšis. Atlikti biocheminiai stambiauogių spanguolių uogų tyrimai patvirtino, kad jose kaupiami dideli kiekiai įvairių biologiškai aktyvių medžiagų. Dėl didelio sukauptų fenolinių junginių – antocianinų, proantocianidinų – kiekio stambiauogės spanguolės pasižymi stipriu antioksidaciniu poveikiu, o maisto papildai su stambiauogėmis spanguolėmis plačiai vartojami šlapimo takų infekcijų profilaktikai [45,3].

Moksliniais tyrimais taip pat nustatytas teigiamas šių uogų poveikis širdies ir kraujagyslių, virškinimo organų sistemoms, priešvirusinis, priešvėžinis poveikiai [20, 37, 32, 34, 22].

Stambiauogės spanguolės – reta, tačiau sparčiai populiarėjanti tarp augintojų uogų rūšis Lietuvoje. Dėl natūralių augaviečių Lietuvoje nebuvimo, stambiauogės spanguolės tirtos nedaug. Nustatyta, kad priklausomai nuo veislės ir augavietės, kinta sukauptų biologiškai aktyvių junginių kiekiai. Šių tyrimų stoka paskatino ištirti ir įvertinti skirtingų veislių spanguolių uogų fitochemines sudėtis. Šiame magistro darbe nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, antocianinų bei proantocianidinų kiekiai ir antioksidacinis aktyvumas skirtingose stambiauogių spanguolių veislėse, taip pat šie junginiai nustatyti ir įvertinti 'Pilgrim' veislės uogose, auginamose penkiose skirtingose Lietuvos vietose. Gauti duomenys galės būti pritaikyti, renkantis auginimui ir kuriant naujas stambiauogių spanguolių veisles, bei uogų panaudojimui kuriant maisto produktus ir maisto papildus.

Šio mokslinio darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) uogų fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, jos įvairavimą bei įvertinti ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

(12)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) uogų fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį, jos įvairavimą bei įvertinti ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Spektrofotometriniu metodu nustatyti Lietuvoje auginamų skirtingų stambiauogių spanguolių veislių uogų fenolinių junginių kiekinę sudėtį bei jos įvairavimą.

2. Spektrofotometriniu metodu nustatyti ir palyginti skirtingose Lietuvos vietose auginamų 'Pilgrim' veislės stambiauogių spanguolių uogų fenolinių junginių kiekinę sudėtį ir jos įvairavimą.

3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti skirtingų stambiauogių spanguolių veislių uogų antocianinų kokybinę ir kiekinę sudėtį bei jos įvairavimą.

4. Nustatyti Lietuvoje auginamų skirtingų stambiauogių spanguolių veislių uogų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu.

5. Nustatyti ir palyginti skirtingose Lietuvos vietose auginamų 'Pilgrim' veislės stambiauogių spanguolių uogų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu.

(13)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) apibūdinimas

Stambiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpon Ait.) priskiriama magnolijūnų skyriui (Magnoliophyta), magnolijainių klasei (Magnoliopsida), erikinių šeimai (Ericaceae), šilauogių genčiai (Vaccinium) [52].

Stambiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpon Ait.) yra mažas, žiemą žaliuojantis krūmas (1 pav.). Lapai yra 10‒20 mm dydžio, ovalo formos, standūs, blizgūs, uogos ‒ raudonos, stambios, rūgščios, apvalios formos, 2 cm diametro, turi obuolį primenantį skonį, skinamos rugsėjo, spalio mėnesiais [50]. Ūglių viršūnėse antroje vasaros pusėje susiformuoja žiediniai pumpurai, iš kurių kitų metų gegužės mėnesį išauga jauni ūgliai su 2–15 žiedų, sukrautų į kekes. Stambiauogės spanguolės žydi birželio‒liepos mėnesiais [5]. Šios uogos mėgsta rūgštų ir nederlingą dirvožemį, saulėtą vietą, ilgi vegetatyviniai ūgliai suformuoja ištisą kilimą [1].

1 pav. Stambiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpon Ait.) [53]

Stambiauogės spanguolės naudojamos įvairiomis formomis – vartojamos šviežios, džiovintos uogos, spanguolių sultys, gaminami padažai, uogienės, vartojami maisto papildai su spanguolėmis, jos esti kaip sudėtinė įvairių dribsnių, mėsos bei pieno produktų dalis [40].

(14)

1.2 Stambiauogių spanguolių paplitimas Lietuvoje ir pasaulyje

Pasaulyje randama daugiau nei 450 rūšių Vaccinium genties augalų. Jų augimvietės aptinkamos Europoje, šiaurinėje ir centrinėje Amerikoje, šiaurės ir pietryčių Afrikoje, Madagaskare, Japonijoje, Azijoje [13]. Stambiauogės spanguolės – Vaccinium macrocarpon Ait. natūraliai auga tik rytinėje Šiaurės Amerikos dalyje (2 pav.), auginamos ir kultivuojamos Amerikoje, Kanadoje ir Europoje. Tai gana jauna agrokultūrinė rūšis, pradėta kultivuoti tik maždaug prieš 160 metų [11].

2 pav. Stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) paplitimas Šiaurės Amerikoje (augavietės pažymėtos taškeliais) [44]

Šiuo metu daugiausia stambiauogių spanguolių plantacijų aptinkama Amerikoje, Kanadoje, Jungtinėje Karalystėje ir Olandijoje, apie 90 proc. šių uogų surenkama Amerikoje ir Kanadoje. Dėl nedidelio šių spanguolių natūralių augimviečių pasiskirstymo bei jų nykimo, kuriamos naujos veislės ir plėtojamas kultivavimas įvairiose pasaulio šalyse [33].

Pastaraisiais metais stambiauoges spanguoles vis daugiau imama auginti ir Lietuvoje [7]. Drėgnose ir pelkėtose vietose, natūraliai augančios Lietuvoje aptinkamos tik paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccus L.). Paprastosios spanguolės, plačiai vartotos liaudies medicinoje, tapo ilgalaike tradicija, tačiau dėl suintensyvėjusios žemdirbystės ir pelkių nykimo,

(15)

jų laukai ėmė mažėti. Stambiauogės spanguolės nuo paprastosios skiriasi stambesnėmis (10–

27 mm skersmens) uogomis (3 pav.), tvirtesniais, ilgesniais (iki 1,5–1,8 m) stiebais, stačiais, 5–15 cm aukštumo generatyviniais (ant kurių užsimezga uogos) ūgliais, stambesniais (10–20 mm ilgio), abipus žaliais bukaviršūniais lapais [8].

3 pav. Stambiauogių ir paprastųjų spanguolių uogų dydžio skirtumai (viršuje – stambiauogės, apačioje – paprastosios spanguolės) [8]

Per 200 metų iš natūralioje gamtoje augančių stambiauogių spanguolių, jas kryžminant, išvesta daug naujų veislių. Šiuo metu žinoma virš 250 stambiauogių spanguolių veislių, kurios tarpusavyje skiriasi derėjimo laiku, uogų dydžiu, forma, spalva, kitais morfologiniais požymiais [4, 8]. Lietuvoje šias uogas tiria 3 įstaigos – Vytauto Didžiojo universiteto (VDU) Kauno botanikos sodas, Gamtos tyrimų centro botanikos institutas ir Vilniaus universiteto botanikos sodas. Didžiausios stambiauogių spanguolių kolekcijos šiuo metu auginamos VDU Kauno botanikos sode [8]. Visos veislės yra skirstomos į ankstyvąsias (prinoksta rugsėjo pirmoje pusėje), vidutinio vėlyvumo (prinoksta rugsėjo antroje pusėje) ir vėlyvas (prinoksta spalio mėnesį) [4, 8]. 1999 m. Lietuvos valstybinis augalų veislių tyrimo centras patvirtino, kad Lietuvoje labiausiai tinkamos auginti yra ‘Ben Lear’, ‘Pilgrim’, ‘Black Veil’,

‘Washington’ ir ‘Stevens’ stambiauogių spanguolių veislės [4].

1.3 Stambiauogių spanguolių uogų cheminė sudėtis

Pagrindinės fenolinių junginių, randamų stambiauogėse spanguolėse, grupės ‒ flavonoliai, antocianinai, proantocianidinai, fenolinės rūgštys ir resveratrolis [33]. Šių junginių kiekis ir koncentracija uogose kinta priklausomai nuo rūšies, veislės, geografinės vietos, kultivavimo ir laikymo sąlygų, uogų sunokimo, klimato [33, 25]. Atliktų tyrimų duomenimis, didžiausias fenolinių junginių kiekis aptinkamas šviežiose spanguolių uogose, lyginant jas su

(16)

spanguolių sultimis, padažais ir saldintomis, džiovintomis spanguolėmis. Bendras fenolinių junginių, randamų šviežiose stambiauogėse spanguolėse, kiekis svyruoja 163,4‒357,6 mg/100 g [33].

Antocianinų kiekis uogose didėja joms sirpstant ir taip pat priklauso nuo veislės ir uogų dydžio. Stambiauogėse spanguolėse randami šešių antocianidinų šeimos aglikonų glikozidai:

cianidinas, peonidinas, malvidinas, pelargonidinas, delfinidinas ir petunidinas [33].

Prinokusiose šviežiose stambiauogių spanguolių uogose randama nuo 13.6 mg/100g iki 171 mg/100g antocianinų. Daugiausia sukaupiama cianidin-3-galaktozido, cianidin-3- gliukozido, cianidin-3-arabinozido, peonidin-3-galaktozido, peonidin-3-arabinozido ir petunidin-3-gliukozido [33, 20, 3, 25].

Flavonolių kiekis 100 gramų prinokusių uogų svyruoja tarp 20‒40 mg. Gausiausiai randama flavonolių, kurių aglikonai kvercetinas, miricetinas ir kemferolis. Pagrindinis ‒ kvercetino glikozidas 3-O-galaktozidas [33, 20].

Stambiauogių spanguolių proantocianidinai daugiausia randami kaip katechino ir epikatechino aglikonai [18]. Didžiausi proantocianidinų kiekiai randami flavan-3-olių oligomerų ir polimerų pavidalu [48, 32]. 100 gramų stambiauogių spanguolių uogų sukaupia apie 180 mg proantocianidinų oligomerų [20].

Stambiauogės spanguolės kaupia fenolines ir organines rūgštis – benzenkarboksirūgštį ir 4-hidroksicinamono rūgštį. Taip pat nustatyti ir nepoliniai junginiai – izoprenoidai bei riebalų rūgštys. Pagrindinis triterpenoidas – ursolio rūgštis, kurios, priklausomai nuo veislės, uogos sukaupia nuo 65 iki 120 mg/ 100 g [20].

Stambiauogių spanguolių uogose taip pat randama askorbo rūgšties (13,7–

28,5 mg/100 g), organinių rūgščių (2,2 proc.‒2,3 proc.) ir cukrų (3,66 proc.‒4,9 proc.), nedideli kiekiai kitų vitaminų bei mikroelementų [7].

Remiantis moksline literatūra, stambiauogėse spanguolėse randami dideli kiekiai fenolinių junginių, iš kurių daugiausia aptinkama ir plačiausiai tyrinėjami antocianinai ir proantocianidinai. Daugiausia tyrimų atlikta tose šalyse, kuriose aptinkamos natūralios stambiauogių spanguolių augavietės, tačiau Lietuvoje auginamos stambiauogės spanguolės mokslininkų tyrinėtos nedaug.

(17)

1.4 Stambiauogių spanguolių biologinės savybės ir panaudojimas

Jau nuo 1600 metų stambiauogės spanguolės vietinių amerikiečių buvo vartojamos konservuojant džiovintą mėsą, gydant žaizdas bei šlapimo takų infekcijas [20, 51].

Nuo XX amžiaus mokslininkai tyrinėjo stambiauoges spanguoles dėl jų poveikio šlapimo organų sistemai. XXI amžiaus pradžioje daugelio tyrėjų dėmesį patraukė spanguolių kaupiamų junginių kraujagysles veikiantis ir priešvėžinis poveikis (4 pav.) [51].

4 pav. Stambiauogių spanguolių biologinio poveikio tyrimų eiga [51]

Stambiauogės spanguolės uogose randami dideli biologiškai aktyvių junginių kiekiai turi teigiamą poveikį žmogaus sveikatai, moksliniais tyrimais nustatytas šių uogų poveikis širdies ir kraujagyslių, virškinimo, šlapimo takų sistemoms, taip pat priešvirusinis, antioksidacinis, priešvėžinis poveikiai [37, 32, 34, 22, 43].

Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Dėl didelio sukauptų flavonoidų kiekio, pastebėta, kad stambiauogės spanguolės pasižymi teigiamu poveikiu širdies ir kraujagyslių sistemai, stabdo aterosklerozės vystymąsi. Atliktų tyrimų duomenimis, flavonoidai didina mažo tankio lipoproteinų atsparumą oksidacijai, mažina uždegiminius procesus organizme, sukelia vazodilataciją, mažina kraujospūdį, gerina kraujo tėkmę, apsaugo nuo trombocitų agregacijos ir trombozės. Atlikti in vitro tyrimai parodė, kad spanguolėse esantys antocianinai ir hidroksicinamono rūgštis stabdo viduląsteninio vandenilio peroksido (H2O2)sukeliamą žalą ir mažina ląstelių membranų rūgščių oksidaciją. Pastebėta, kad antocianinai slopina uždegiminių ląstelių gamybą [37, 32].

Poveikis virškinimo sistemai. Spanguolių ekstraktai apsaugo nuo skrandžio opų susidarymo, kadangi inhibuoja specifines Helicobacter pylori vietas, kuriomis bakterijos jungiasi žmogaus skrandžio gleivinėje [34]. Taip pat nustatyta, kad spanguolėse randami proantocianidinai inhibuoja kasos lipazę, alfa-amilazę ir gliukoamilazę, mažina uždegimus žarnyne, gerina žarnyno homeostazę, gleivių sluoksnio morfologiją [22].

(18)

Priešvėžinis poveikis. Atlikus in vitro tyrimus, nustatyta, kad proantocianidinai pasižymi priešvėžiniu poveikiu stemplės, žarnyno, prostatos, kiaušidžių, plaučių ląstelėse, slopindami piktybinių ląstelių apoptozę ir proliferaciją [22]. Spanguolių vaisiuose randami ursolio rūgšties cis ir trans hidroksicinamono rūgšties esteriai inhibuoja žarnyno, krūties ir prostatos piktybinių ląstelių augimą. Nustatyta, kad kvercetinas ir proantocianidinai taip pat stabdo auglių ląstelių dauginimąsi [20].

Poveikis šlapimo takų sistemai. Stambiauogių spanguolių poveikis šlapimo takų infekcijų prevencijai paremtas daugeliu atliktų tyrimų, kuriuose aprašomas fenolinių junginių bei oligosacharidų biologinis poveikis. Daugiau nei 80 proc. šlapimo takų infekcijų sukėlėjas – E. coli bakterija, kuri lengvai patenka iš žarnyno į šlaplę [43]. Spanguolių sultys jau daugelį dešimtmečių vartojamos siekiant išvengti šlapimo takų infekcijų pasikartojimo, jų prevencijai.

Nustatyta, kad A tipo proantocianidinai, kuriuos kaupia spanguolės, veikia sutrikdydami E.

Coli bakterijų prisitvirtinimą prie uroepitelinių ląstelių. Jie prisijungia prie bakterijų tvirtinimosi vietų ‒ fimbrijų – ir sustabdo pirmąjį infekcijos proceso etapą. Spanguolėse randami junginiai padeda apsisaugoti nuo 70 proc. įvairiems vaistams atsparių E. Coli padermių. Atliktų klinikinių tyrimų meta-analizės duomenimis, spanguolių sultys ir maisto papildai sumažina simptominių pasikartojančių šlapimo takų infekcijų skaičių [22]. Taip pat atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad spanguolių oligosacharidų frakcijos, esant 1,25 mg/ml koncentracijai, 50 proc. sumažino patogeninių E. Coli bakterijų prisitvirtinimą šlapimo takuose [43].

Antimikrobinis poveikis. 2011 metais Kanados mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu nustatė spanguolių ekstraktų ir spanguolių sulčių antimikrobinį poveikį. Gauti rezultatai parodė, kad spanguolių ekstrakto sudėtyje randami vandenyje tirpūs fenoliniai junginiai slopina P. aeruginosa, S. aureus, E. coli ir atsparaus vankomicinui Enterococcus faecium mikrobinį aktyvumą. Taip pat P. Aeruginosa ir E. coli aktyvumą mažina ekstraktuose aptinkami antocianinai. Spanguolių sultyse esantys junginiai visiškai inaktyvino L. Monocytogenes ir vankomicinui atsparias Enterococcus faecium [17]. Taip pat nustatyta, kad spanguolių ekstraktai inhibuoja A ir B influenza virusų adheziją ir užkrečiamumą [34].

Antioksidacinis poveikis. Ištirta, kad stambiauogės spanguolės pasižymi labai stipriomis antioksidacinėmis savybėmis. Antioksidacinį veikimą nulemia sukaupti dideli kiekiai antocianinų, flavonolių, benzenkarboksirūgšties ir cinamono rūgšties darinių, kurie pasižymi laisvuosius radikalus šalinančiu poveikiu [16]. Šie junginiai pasižymi antiradikaliniu poveikiu prieš superoksido (O2-), vandenilio peroksido (H2O2), hidroksilo (•OH) radikalus, taip pat inhibuoja baltymų ir lipidų oksidaciją liposomose ir lipidų peroksidaciją [47].

(19)

Apžvelgus mokslinę literatūrą, galima teigti, kad įvairiapusį biologinį poveikį ir stambiauogių spanguolių panaudojimą įvairių ligų gydymui lemia sukaupti fenoliniai junginiai.

Kadangi stambiauogių spanguolių poveikis šlapimo organų sistemai žinomas pakankamai seniai, šiuo metu daug dėmesio skiriama ir naujiems moksliniams tyrimams, kurių metu siekiama atrasti naujų šių uogų panaudojimo sričių, ypač širdies ir kraujagyslių sistemos bei virškinimo sistemos negalavimams.

1.5 Fenolinių junginių apžvalga

Augaluose randami fenoliniai junginiai skirstomi į tris pagrindines grupes: fenolines rūgštis, flavonoidus ir taninus. Fenolinės rūgštys skirstomos į benzenkarboksirūgšties ir cinamono rūgšties darinius. Flavonoidai yra plačiausia fenolinių junginių grupė, kurios pagrindą sudaro flavano branduolys, sudarytas iš 15 anglies atomų. Flavonoidai skirstomi į šias grupes: flavonai, flavonoliai, flavononai, izoflavonai ir antocianinai. Taninai skirstomi į dvi grupes – hidrolizuotus taninus ir kondensuotus taninus, pastariesiems priskiriami ir proantocianidinai [19].

Antocianinai. Antocianinai yra junginių grupė, atsakinga už pigmentaciją ir uogų spalvą, pigmentai išsidėstę išoriniuose uogų odelės sluoksniuose [3]. Bendrą antocianinų struktūrą sudaro antocianidinai – aglikonai, kurie sudaryti iš trijų žiedų – aromatinių A ir B, bei heterociklinio C (5 pav.). Antocianidinų aglikonai, prisijungę cukrinę dalį, yra vadinami antocianinais [15].

5 pav. Bendra antocianidinų struktūra [15]

Antocianinai yra labai nestabilūs junginiai ir greitai skyla. Nestabilumą lemia įvairūs faktoriai – pH, laikymo temperatūra, cheminė struktūra, koncentracija, šviesa, deguonies poveikis, įvairūs tirpikliai [38]. Uogose randami šešių antocianidinų šeimos aglikonų

(20)

glikozidai: cianidinas, peonidinas, malvidinas, pelargonidinas, delfinidinas ir petunidinas (6 pav.) [9].

6 pav. Svarbiausi uogose randami antocianinų aglikonai [38]

Proantocianidinai. Proantocianidinai, kitaip vadinami poliflavan-3-oliais ‒ tai kondensuoti taninai, flavonoidų polimerai, antra pagal gausumą augaluose kaupiamų polifenolių grupė.

Stambiauogių spanguolių uogose randami dimerų, trimerų ir didesnių polimerų, epikatechino oligomerų pavidalu (1 lentelė) [41, 27].

1 lentelė. Proantocianidinų pasiskirstymas spanguolėse [32]

Proantocianidinai Polimerizacijos laipsnis ( mg/100 g)

Monomerai 7,3

Dimerai 25,9

Trimerai 18,9

4-6 merai 70,3

7-10 merai 62,9

Polimerai (> 10 monomerų) 233,5

Epikatechino monomerai jungiasi dviejų tipų jungtimis :

• 4β→8 (B tipo) jungtimi;

• 4β→8 ir 2β→O→7 (A tipo) jungtimi (7 pav.).

(21)

7 pav. Procianidinai B2 ir A2 [24]

Labiausiai paplitęs ryšys tarp proantocianidinų monomerų yra B tipo jungtis. B tipo jungtimi proantocianidinų monomerai jungiasi mėlynėse, vynuogėse, kakavoje. Spanguolėse ir keliose kitose augalų rūšyse monomerai jungiasi C-O-C jungtimi ir su C-C jungtimi sudaro dvigubą (A tipo) jungtį, kuri pasitaiko gana retai [48]. A tipo jungtis lemia teigiamą spanguolių poveikį mažinant bakterijų prisitvirtinimą šlapimo takuose [20, 43, 41].

1.6 Fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės analizės metodai

Bendro fenolinių junginių kiekinis nustatymas. Fenolinių junginių nustatymui dažniausiai naudojami du metodai – ESC ir dujų chromatografijos metodai, jų kombinacijos su masių spektrometrija. Taip pat labai dažnai taikomi ir spektrofotometriniai metodai [26].

Spektrofotometrija yra vienas paprasčiausių metodų, siekiant nustatyti fenolinių junginių kiekį augalinėse žaliavose. Bendram šių junginių kiekiui nustatyti naudojami du pagrindiniai metodai: Folin-Denis ir Folin-Ciocalteu. Abu metodai yra pagrįsti chemine redukcija, naudojant reagentus, turinčius volframo ir molibdeno. Redukcijos produktai, reaguodami su fenoliniais junginiais, sudaro mėlyną spalvą, kuri absorbuojama esant 760 nm bangos ilgiui [26].

Antocianinų kokybinis ir kiekinis nustatymas. Antocianinų kokybiniam ir kiekiniam įvertinimui dažniausiai naudojami spektrofotometrinis ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodai.

(22)

Spektrofometrinis metodas – tai greitas ir paprastas antocianinų nustatymo metodas, nereikalaujantis didelių išlaidų. Nustatant antocianinus naudojamas dažnai pH-indiferentinis metodas, kurio esmė antocianinų struktūriniai pokyčiai skirtingose tirpalų pH, kurie lemia absorbcijos dydžių pasikeitimus. Antocianinų kiekis dažniausiai išreiškiamas cianidin-3-O- galaktozido ekvivalentu, kadangi šis antocianinas yra dominuojantis augaluose [30].

ESC metodika, naudojama antocianinų nustatymui, skirtinguose mokslininkų tyrimuose skiriasi (2 lentelė). Apžvelgus literatūrą, galima teigti, kad dažniausiai naudojamas detektorius – diodų matricos, kolonėlė – C18 atvirkštinių fazių. Naudojant atvirkštinių fazių kolonėlę, antocianinų sulaikymo laikas priklauso nuo molekulės poliškumo, kurį lemia aglikono pobūdis, prisijungusių glikozidų skaičius ir tipas, bei prisijungusios acilo grupės [42].

Gradientiniam eliuavimui naudojamos įvairios skirtingos tirpiklių sistemos, tėkmės greitis – 0,9–1,5 ml/min. Antocianinų kiekis taip pat dažniausiai išreiškiamas cianidin-3-O-galaktozido ekvivalentu [30, 42, 12].

2 lentelė. Antocianinų nustatymo ESC metodikos Naudojamas

detektorius

Naudota kolonėlė Tėkmės greitis

Tirpiklių sistemos Šaltinis

Diodų matricos

Cosmosil 5C18-PAQ waters type, 150 mm ×

4.6 mm, 5 μm

0.9 ml/min

A: vanduo–fosforo rūgštis ( 99,5 + 0,5,v/v)

B: vanduo–acetonitrilas–ledinė acto rūgštis–fosforo rūgštis (50,0

+ 48,5 + 1,0 + 0,5, v/v/v/v)

P.

Brown, P.

Shipley [12]

Diodų matricos

C18 reverse-phase symmetry analytical column, 250 mm × 4.6

mm, 5 µm

1 ml/min A: 5% fosforo rūgštis vandenyje B: metanolis

S. Lee ir kt.[30]

Diodų matricos

C-18 Acclaim1 120 Silica-Based reversed-

phase column, 150 mm × 4.6 mm, 5

µm

1,5 ml/min

A: 20% vandeninis metanolio tirpalas, kuriame 0,5%

trifluoracetilo B: metanolis

M.

Ştefănuţ

ir kt.

[42]

(23)

Proantocianidinų kiekinis nustatymas. Proantocianidinų nustatymas, išanalizavus mokslinę literatūrą, dažniausiai atliekamas spektrofotometriniu metodu, naudojant 4- (dimetilamino)cinamono aldehidą (DMCA). Šis metodas chemiškai labai panašus į kolorimetrinius (vanilino, rūgštinį butanolio) metodus, tačiau yra iki 5 kartų jautresnis, tikslesnis, pigesnis bei lengviau atliekamas [46, 36]. DMCA yra aromatinis aldehidas, kuris reaguoja su flavan-3-oliais ir spanguolių proantocianidinais, suformuodamas žalią chromoforą (8 pav). DMCA nereaguoja su kitais junginiais – hidroksicinamono rūgštimi, hidroksibenzenkarboksirūgštimi, flavonais ir flavonoliais, todėl galima tiksliau nustatyti proantocianidinų kiekį.

8 pav. Reakcija su DMCA [46]

Proantocianidinų spektrofotometrinė analizė, naudojant DMCA reagentą, atliekama esant 640 nm bangos ilgiui. Norint nustatyti proantocianidinų kiekį, naudojamas procianidino A2 dimero arba (-)-epikatechino standartas [28, 49].

1.7 Antioksidacinis poveikis ir jo nustatymo metodai

Antioksidantai yra junginiai, kurie gali atitolinti, slopinti ar užkirsti kelią oksiduojančių medžiagų oksidacijai, šalindami laisvuosius radikalus ir mažindami oksidacinį stresą.

Oksidacinis stresas yra būklė, kai organizme atsiranda per didelis reaktyviųjų deguonies ir azoto dalelių kiekis (superoksido anijonų, vandenilio peroksido, hidroksilo radikalų, peroksinitrito), kurių organizmas nespėja neutralizuoti, o tai sukelia įvairių biomakromolekulių, tokių kaip fermentai, baltymai, DNR ir lipidai, oksidaciją. Oksidacinis stresas greitina senėjimą bei įvairių lėtinių ligų atsiradimą – širdies ligų, vėžio [19].

(24)

Antioksidacinio aktyvumo nustatymui augalinių vaistinių žaliavų ekstraktuose dažniausiai naudojami fotometriniai CuPRAC (vario (II) jonų redukcijos antioksidantinės galios), ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonrūgšties), DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazilo laisvojo radikalo), TEPH (trifluorperazinodihidrochlorido radikalo-katijono), FRAP (geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinės galios) metodai. Pagal veikimo mechanizmą ir vykstančias reakcijas, metodai skirstomi į dvi grupes: vyksta vandenilio atomo perdavimo reakcijos ir elektronų perdavimo reakcijos [19]. Plačiausiai naudojami elektronų perdavimu paremti antioksidacinio nustatymo metodai yra DPPH radikalų surišimo metodas ir ABTS radikalų–katijonų surišimo metodas [6]. ABTS metodas taikomas, norint nustatyti lipofilinius ir hidrofilinius antioksidantus, kadangi jis tirpsta vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, DPPH – tirpus tik organiniuose tirpikliuose, todėl antioksidacinis aktyvumas nustatomas tik lipofiliniuose junginiuose [39].

(25)

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimams naudotos skirtingų Vaccinium macrocarpon Ait. (Stambiauogių spanguolių) veislių ‒ 'Bergman', 'Black Veil', 'Pilgrim', 'Holliston', 'Searles', 'Franklin', 'Stevens', 'Ben Lear' ‒ uogos, surinktos 2019 m. rugsėjo–spalio mėnesiais VDU Kauno botanikos sode, bei 'Pilgrim' veislės uogos, surinktos skirtingose Lietuvos vietose: 1 – Nugarių km. (Plungės raj.), 2 – Salantų m. (Kretingos raj.), 3 – Linkaičių km. (Joniškio raj.), 4 – Vilniaus m. ir 5 – VDU Kauno botanikos sode (9 pav.).

9 pav. Stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait.) 'Pilgrim' veislės uogų rinkimo vietos (pažymėtos skaičiais)

Šiame darbe tiriamos šios stambiauogių spanguolių veislės: veislė 'Ben Lear' išvesta šio amžiaus pradžioje, veislė ankstyva, uogos ovalios, tamsiai raudonos, stambios, tačiau nelabai tinkamos sandėliuoti, derlingumas didelis. 'Black Veil' veislės uogos atrinktos 1890 m.

Masačiusetso valstijoje iš natūralių augaviečių, veislė labai ankstyva, uogos juosvai raudonos, kiaušinio formos, vidutinio dydžio, neblogai laikosi sandėliuojamos, derlingumas labai didelis.

'Franklin' veislė – 'Early Black' ir 'Howes' hibridas, gautas 1930 m., veislė vidutinio ankstyvumo, uogos juosvai raudonos, kiaušinio formos, vidutinio dydžio arba stambios, tinka sandėliuoti, derlingumas didelis. 'Bergman' veislė sukurta JAV, kryžminant 'Early Black' ir 'Searles', įregistruota 1961 m., ši veislė vidutinio ankstyvumo, uogos tamsiai raudonos, cilindrinės arba kiaušinio formos, stambios, tinka sandėliuoti, derlingumas didelis. 'Stevens' veislė sukurta JAV, sukryžminus 'McFarlin' ir 'Potter', įregistruota 1950 m., veislė vidutinio

(26)

vėlyvumo, uogos tamsiai raudonos, ovalios, stambios arba labai stambios, gerai laikosi sandėliuojamos, derlingumas didelis. 'Searles' veislė atrinkta 1893 m. JAV iš natūralių augaviečių, veislė vidutinio vėlyvumo, uogos juosvai raudonos, cilindrinės, nevienodai nusispalvinusios, stambios, sandėliuoti netinkamos, derlingumas vidutinis. 'Holliston' veislė vidutinio vėlyvumo, uogos tamsiai raudonos, netolygiai nusispalvinusios, kiaušinio formos, stambios, sandėliuojamos laikosi pakankamai gerai, derlingumas vidutinis. 'Pilgrim' veislė sukurta JAV, sukryžminus 'Prolific' ir 'McFarlin', įregistruota 1961 m., veislė vidutinio vėlyvumo–vėlyva, uogos purpurinės, cilindrinės, su nedidele melsva vaškine apnaša, stambios arba labai stambios, tinka sandėliuoti, derlingumas labai didelis [35, 8, 4].

Uogos rinktos prinokusios, vizualiai įvertinus uogų spalvą ir sėklų rudumą. Surinkti švieži spanguolių vaisiai užšaldyti ir laikyti ‒19±1 °C.

2.2. Naudoti reagentai

Etanolis (96 proc. „Stumbras“, Lietuva), vandenilio chlorido rūgštis (37 proc.,

„Lachema“, Neratovice, Čekija), išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV), natrio karbonatas (≥99,5 proc., Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98 proc., “ACROS ORGANICS”), metanolis (99,8 proc.), bevandenė skruzdžių rūgštis (≥98 proc.), ABTS (≥98 proc.), DMCA, acetonitrilas, cianidin-3-gliukozido standartas, (-)-epikatechinas, („Sigma-Aldrich“, Buck, Šveicarija), K2S2O8 (≥99 proc., Alfa Aesar, Karlsruhe, Vokietija), troloksas (98 proc., „FlukaChemika“, Buchs, Šveicarija).

2.3. Naudota aparatūra ir priemonės

Bendras fenolinių junginių, bendras antocianinų, bendras proantocianidinų kiekis bei antioksidacinis aktyvumas spanguolių uogose nustatytas spektrofotometru Halo DH–20 UV–

Vis Dinamika GmbH (Šveicarija). Spanguolių uogos trintos grūstuvėje. Ekstraktų gamybai naudota ultragarso vonelė (WiseClean), purtyklė (Laboratory shaker type 358S, Lenkija), reagentai ir medžiagos svertos laboratorinėmis svarstyklėmis (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija). Darbo metu naudotos automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV). Efektyvioji skysčių chromatografija atlikta naudojant ,,Waters 2695“

(27)

chromatografą (Waters Corporation, Milfordas, CT, JAV) su ,,Waters 996 PDA“ detektoriumi (Waters Corporation, Milfordas, CT, JAV).

2.4 Ekstraktų gamyba

Užšaldytų stambiauogių spanguolių uogos sutrinamos grūstuvėje. Tyrimas atliktas tiriant visas uogos dalis sutrynus į vieną masę. Atsveriama 3 g sutrintų uogų. Ekstrakcijos tirpiklis – parūgštintas etanolis (0,1 M HCl). Ektrakcija vykdyta tol, kol tirpalas tampa bespalvis. Žaliava ekstrahuojama tirpiklį pilant po 20 ml, kiekvieną kartą purtant po 15 minučių mechaninėje purtyklėje. Gauto ekstrakto dalys pro popierinį filtrą filtruojamos į 100 ml matavimo kolbą, popierinis filtras praplaunamas parūgštintu etanoliu ir ekstraktas praskiedžiamas parūgštintu etanoliu iki žymės. Gauto ekstrakto pH 1,2.

2.5 Tyrimo metodai

2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Prieš analizę paruošiamas tyrimui reikalingas 7 proc. natrio karbonato tirpalas – atsisveriama 17,5 g natrio karbonato, kuris ištirpinamas 250 ml distiliuoto vandens. Mėginio paruošimas: analizei imamas 1 ml spanguolių etanolinio ekstrakto, sumaišoma su 1 ml Folin-Ciocalteu reagento, pilami 9 ml distiliuoto vandens ir po 5 minučių įpilama 10 ml pasigaminto 7 proc. natrio karbonato tirpalo. Gautas tirpalas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 25 ml, gerai sumaišomas. Lyginamojo tirpalo paruošimas: viskas vykdoma ta pačia seka, tačiau vietoje stambiauogių spanguolių ekstrakto dedama 1 ml distiliuoto vandens. Pagamintas tirpalas iki analizės laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 90 minučių. Spektrofotometru matuojama tirpalų absorbcija, esant 750 nm šviesos bangos ilgiui. Matavimai kartojami 3 kartus. Etaloninių tirpalų paruošimas: viskas vykdoma ta pačia seka, tačiau vietoje 1 ml spanguolių ekstrakto, dedama 1 ml skirtingų koncentracijų galo rūgšties tirpalo. Kalibracinė kreivė ( y = 0,9068x + 0,0617, R²= 0,996, kur y – absorbcijos dydis, x – bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentu

(28)

mg/ml) sudaroma iš 5 skirtingų koncentracijų – 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 mg/ml galo rūgšties 70 proc. metanolinių tirpalų.

Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) apskaičiuojamas pagal formulę :

C = ^{𝑥 ×𝑉}

𝑚 ;

x – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibracijos kreivę, mg/ml V – pagaminto ekstrakto tūris, ml

m – ekstrakcijai naudotos žaliavos masė, g

2.5.2 Bendro antocianinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras antocianinų kiekis stambiauogėse spanguolėse nustatytas spektrofotometru HALO-DH 20. Naudota P. Viskelio ir kt. mokslininkų straipsnyje aprašyta bendro antocianinų kiekio nustatymo metodika, nežymiai ją modifikavus [7]. Absorbcija matuojama esant 528 nm bangos ilgiui. Lyginamasis tirpalas ‒ parūgštintas etanolis (0,1 M HCl). Matavimai kartoti 3 kartus. Antocianinų koncentracija (mg/ml) apskaičiuota pagal cianidin-3-O-gliukozido kalibracinę kreivę, sudarytą iš 0,0625–10,0000 mg/ml koncentracijos tirpalų: y = 1,6236x + 0,0465, R²=0,9999.

Bendras antocianinų kiekis (mg/g) apskaičiuotas pagal formulę :

C = ^{𝑐 𝑥 𝑉 𝑥 𝐷}

𝑚 ;

c – antocianinų koncentracija, mg/ml;

V ‒ pagaminto ekstrakto tūris, ml;

D ‒ pagaminto ekstrakto skiedimas;

m ‒ ekstrakcijai naudotos žaliavos masė, g.

2.5.3 Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras proantocianidinų kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, panaudojant DMCA reagentą. DMCA reagentas ištirpinamas vandenilio chlorido rūgštimi parūgštintame etanolyje (9:1 v/v). 10 μl etanolinio stambiauogių spanguolių ekstrakto sumaišoma su 3 ml paruošto 0,1 proc. DMCA tirpalu. Lyginamasis tirpalas: 3 ml 0,1 proc.

(29)

DMCA tirpalo sumaišoma su 10 μl išgryninto vandens. Paruoštas tirpalas laikomas 5 min. ir spektrofotometru matuojama gauto tirpalo šviesos absorbcija, esant 640 nm bangos ilgiui [23].

Bendras proantocianidinų kiekis etanoliniame stambiauogių spanguolių ekstrakte išreiškiamas (-)-epikatechino ekvivalentu (mg/ml) pagal (-)-epikatechino kalibracinę kreivę (y=4,6598x +

0,042, R² = 0,9997), sudarytą iš 0–0,5 mg/ml koncentracijos (-)-epikatechino tirpalų. Bendras

proantocianidinų (mg/g) kiekis uogose apskaičiuotas pagal formulę:

C = ^{𝑐 𝑥 𝑉}

𝑚 ;

c – bendras proantocianidinų kiekis mg/ml;

V – pagaminto ekstrakto tūris, ml;

m – ekstrakcijai naudotos žaliavos masė, g.

2.5.4 Antocianinų kokybinis ir kiekinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Efektyvioji skysčių chromatografija vykdyta pagal Europos farmakopėją, šviežių mėlynių uogų sauso standartizuoto ekstrakto straipsnį. Analizė atlikta naudojant ,,Waters 2695“ chromatografą su detektoriumi ,,Waters 996 PDA“. Naudota kolonėlė – ACE (C18) 250 x 4,6 mm, su prieškolonėle, sorbento dalelių dydis – 5 µm. Detekcija atlikta esant 535 nm bangos ilgiui. Antocianinų nustatymui naudota 2 ml paruošto spanguolių uogų ekstrakto.

Ekstraktai filtruoti per membraninius 0,22 µm porų dydžio filtrus. Injekuota 10 µl tiriamojo ekstrakto. Tėkmės greitis – 1 ml/min. Kolonėlė termostatuojama esant 30 °C temperatūrai [21].

Mobili fazė A sudaryta iš bevandenės skruzdžių rūgšties ir vandens (8,5:91,5 v/v), o mobili fazė B iš bevandenės skruzdžių rūgšties, acetonitrilo, metanolio, vandens (8,5:22,5:22,5:41,5 v/v/v/v). Eliuavimas – gradientinis (3 lentelė).

3 lentelė. Gradiento kitimas

Laikas (min) Mobili fazė A (%) Mobili fazė B (%)

0 – 35 93 → 75 7 → 25

35 – 45 75 → 35 25 → 65

45 – 46 35 → 0 65 → 100

46 - 50 0 100

(30)

Analizė atliekama 30 °C temperatūroje. Antocianinų tapatybė nustatoma lyginant analičių sulaikymo trukmes su standartų sulaikymo trukmėmis ir spektrais, gautais atlikus efektyviąją skysčių chromatografiją su PDA detektoriumi.

2.5.5 Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų‒

katijonų surišimo metodu

Motininio 2 mmol/l ABTS tirpalo paruošimas: į tamsaus stiklo buteliuką atsisveriama 0,0548 g ABTS miltelių ir ištirpinama 50 ml išgrynintojo vandens. Į gautą tirpalą įdedama 0,0095 g K2S2O8. Pagamintas tirpalas laikomas tamsoje 16 val., kol įvyksta oksidacijos−redukcijos reakcija ir susidaro ABTS^•+ katijonas. Susidaręs ABTS^•+tirpalas išlieka stabilus 2 paras, laikant kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Darbinio ABTS^•+

tirpalo paruošimas: motininis tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu tol, kol, esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8±0,03. Mėginio paruošimas: 3 µl stambiauogių spanguolių ekstrakto sumaišyta su 3 ml darbinio ABTS^•+ tirpalo. Mėginys laikytas tamsoje 30 min., po to, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis. Lyginamasis tirpalas – išgrynintasis vanduo. Kalibravimo grafikas (y = 0,00003x–0,00360; R²=0,9714) sudarytas, naudojant 8000–24000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.

Antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas pagal formulę:

C = ^{𝑐 ×𝑉}

𝑚 ; µmol TE/g

c– antioksidacinis aktyvumas µmol TE/l;

V – pagaminto ekstrakto tūris (litrais);

m – ekstrakcijai naudotos žaliavos masė, g.

2.6 Statistinis duomenų įvertinimas

Duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Office Excel 2010“ (Microsoft, JAV) ir „SPSS Statistics 21“ („IBM“, JAV). Tyrimo metu apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Siekiant įvertinti, ar

(31)

skirtumai tarp tiriamųjų yra statistiškai reikšmingi (p<0,05), taikyta vienfaktorinė dispersinė analizė (ANOVA).

(32)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas spanguolių uogose

3.1.1. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingose spanguolių veislėse

Vertinant spanguolių kokybę, svarbu ištirti jų cheminę sudėtį, atlikti fenolinių junginių kiekinį tyrimą ir jų įvairavimą uogose. Spanguolių uogų kokybė svarbi vertinant uogas kaip maisto produktą bei kaip žaliavą įvairių kitų produktų ir maisto papildų gamybai.

Atlikti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų stambiauogių spanguolių veislių 'Bergman', 'Black Veil', 'Pilgrim', 'Holliston', 'Searles', 'Franklin', 'Stevens', 'Ben Lear' bendro fenolinių junginių kiekinės sudėties tyrimai. Šiam tyrimui pasirinktas sudėtingos aparatūros nereikalaujantis, populiarus spektrofotometrinis metodas, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą.

Bendras fenolinių junginių kiekis tarp aštuonių skirtingų stambiauogių spanguolių uogų veislių pavaizduotas 10 paveiksle. Apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 12,00±0,45 mg/g ('Pilgrim') iki 16,53±0,51 mg/g ('Holliston'). Nustatytas vidutinis fenolinių junginių kiekis skirtingų spanguolių veislių uogose siekia 14,10±0,41 mg/g.

Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas 'Holliston' (16,53±0,51 mg/g) ir stambiauogių spanguolių veislės uogų ekstraktuose. Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas 'Pilgrim' (12,00±0,45 mg/g) ir 'Searles' (12,59±0,19 mg/g) veislės uogų ekstraktuose. Palyginus gautus rezultatus, nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirtingų stambiauogių spanguolių veislių uogose sukaupto bendro fenolinių junginių kiekio, p<0,05.

(33)

10 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) skirtingose stambiauogių spanguolių veislėse (n=3)

Gautus rezultatus palyginus su kitų mokslininkų atliktais tyrimais, mūsų tyrimo metu VDU Kauno botanikos sode rinktose spanguolėse nustatyti didesni fenolinių junginių kiekiai. Lietuvoje P. Viskelis ir kt. mokslininkų atliktų tyrimų metu didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti 'Black Veil' (221,1 mg/100g) ir 'Ben Lear' (196,0 mg/100g) veislės uogose.

Mažesni kiekiai nustatyti 'Stevens' (184,4 mg/100g) ir 'Pilgrim' (167,7 mg/100g) veislių uogose [7]. Borowska ir kt. mokslininkų tyrimų metu nustatyta, kad tirtose stambiauogių spanguolių uogų veislėse, didžiausias fenolinių junginių kiekis sukauptas 'Ben Lear' (374,7±0,1 mg/100 g) veislės uogose, o mažiausias 'Pilgrim' (192,1±0,1 mg/100g) veislės uogose [10]. Latvijoje Tikuma ir kt. mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis, 'Pilgrim' veislės uogose nustatyta 351,02±0,26 mg/100 g, 'Stevens' veislės uogose – 218,11±0,33 mg/100g, 'Bergman' veislės uogose – 256,19±0,33 mg/100g fenolinių junginių [35]. Skirtingų mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis fenolinių junginių kiekis skirtingose veislėse varijuoja įvairiai, vis dėl to daugumoje tyrimų mažiausi kiekiai šių junginių sukaupiami 'Pilgrim' veislės uogose. Šiuos skirtumus galėjo nulemti skirtingos auginimo ir klimato sąlygos, tyrimų metodikos variacijos.

3.1.2. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse surinktose 'Pilgrim' veislės spanguolių uogose

Lyginant stambiauogių spanguolių uogų bendrą fenolinių junginių kiekį skirtingose augavietėse, tirtos 'Pilgrim' veislės uogos. Palyginus penkias skirtingas augavietes, nustatyti panašūs fenolinių junginių kiekiai. Fenolinių junginių kiekio kitimas pavaizduotas 11

14.48 14.82

12

16.53

12.59

13.93 14.69

13.75

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

'Bergman' 'Black Veil' 'Pilgrim' 'Holliston' 'Searles' 'Franklin' 'Stevens' 'Ben Lear'

Fenolinių junginių kiekis, mg/g

Stambiauogių spanguolių veislė