LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

SAULĖ PABRICAITĖ

RAUKŠLĖTALAPIŲ ERŠKĖČIŲ (ROSA RUGOSA THUNB.) ŽIEDŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. dr. Raimondas Raudonis 2017–2018 m. Dr. Mindaugas Liaudanskas 2019 m.

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

RAUKŠLĖTALAPIŲ ERŠKĖČIŲ (ROSA RUGOSA THUNB.) ŽIEDŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Doc. dr. Raimondas Raudonis 2017–2018 m. Dr. Mindaugas Liaudanskas 2019 m.

Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Data Saulė Pabricaitė

Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1 Erškėčio genties (Rosa L.) augalų apibūdinimas, morfologiniai požymiai ir paplitimas... 10

1.2 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų cheminės sudėties tyrimai ... 12

1.3 Raukšlėtalapių erškėčių preparatų poveikis ir vartojimas ... 15

1.4 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų fenolinių junginių kiekio ir eterinio aliejaus komponentų kiekybinės sudėties įvairavimas žydėjimo metu ... 18

1.5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 21

2. METODIKA ... 22

2.1 Tyrimo objektas ... 22

2.2 Naudoti reagentai ... 23

2.3 Naudota aparatūra ... 23

2.4 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų paruošimas ... 24

2.5 Tyrimo metodai ... 24

2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 24

2.5.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 25

2.5.3 Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS metodu... 26

2.5.4 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas FRAP metodu ... 27

2.5.5 Ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos metodika ... 28

2.6 Tyrimo duomenų analizė ... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30 3.1 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas 30

3.2 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 31

3.3 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas.33 3.4 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas ... 34

3.5 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas UESC–MS/MS metodu ... 35 3.6 Rezultatų apibendrinimas ... 39 4. IŠVADOS ... 41 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43 7. PRIEDAI ... 48

SANTRAUKA

S. Pabricaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Raudonis 2017–2018 m., dr. Mindaugas Liaudanskas 2019 m.; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Pavadinimas: Raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) žiedų fenolinių junginių sudėties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas.

Tyrimo tikslas – ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių (Rosa

rugosa Thunb.) žiedų ėminių fenolinių junginių sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidantinį

aktyvumą in vitro.

Tyrimo uždaviniai: ištirti Lietuvoje augančių raukšlėtapių erškėčių (Rosa rugos Thunb.) žiedų ėminių fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą; ištirti raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių flavonoidų kiekybinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą; ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos–tandeminės masių spektrometrijos metodu atlikti raukšlėtalapių žiedų ištraukų kiekybinę ir kokybinę sudėties analizę; UV– regimosios šviesos spektrofotometriniais ABTS ir FRAP metodais įvertinti antioksidantinį aktyvumą in

vitro; įvertinti koreliacinius ryšius tarp raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių fenolinių junginių kiekio ir

antioksidantinio aktyvumo in vitro.

Tyrimo objektas ir metodai: Natūraliai augantys raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) žiedų ėminiai, surinkti žydėjimo metu skirtingose Lietuvos vietovėse. Ištraukų sudėties analizė atlikta pritaikius UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos ir ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos–tandeminės masių spektrometrijos metodus (UESC–MS/MS). Antioksidantinis aktyvumas in vitro įvertintas UV–VIS spektrofotometrijos ABTS ir FRAP metodais.

Rezultatai ir išvados: Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Palangoje surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose (153,93±4,51 mg GRE/g.), o mažiausias – Kaune (76,83±2,84 mg GRE/g ). Flavonoidų kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose varijuoja nuo 12,26±1,23 mg RE/g (Palangoje) iki 19,67±1,40 mg RE/g Plikiškėse (Joniškio raj.). Stipriausias antiradikalinis aktyvumas (2,99±0,15 mmol TE/g) nustatytas ištyrus raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių, surinktų Vilkaviškyje, ištraukas, o stipriausias redukcinis aktyvumas (2,12±0,10 mmol TE/g) – ištyrus Birštone surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukas. Atlikus UESC–MS/MS tyrimą, raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose buvo nustatyta chino rūgštis, dvi fenolinės rūgštys (kavos r. ir chlorogeno r.) ir 6 flavonoidai ((+)–katechinas, kvercetinas, rutinas, kemferolis, kemferol–3–O– gliukozidas, tilirozidas). Nustatytas stiprus koreliacinis ryšys tarp fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo (R=0,764; p<0,05).

SUMMARY

S. Pabricaitė master‘s thesis. Supervisor Doc. Dr. Raimondas Raudonis 2017–2018 yrs., Dr. Mindaugas Liaudanskas 2019 yr.; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas, 2019

The title: The research of phenolic compounds composition and antioxidant activity of the wrinkled rose (Rosa rugosa Thunb.) flowers.

The aim: to determine composition variability of phenolic compounds and to evaluate the antioxidant activity in vitro of wrinkled rose flowers, collected in different parts of Lithuania.

The objectives of the research: to determine the quantitative composition of total phenolic compounds in the samples of wrinkled roses‘ flowers growing naturally in Lithuania; to determine the quantitative composition of total flavonoids in the samples of wrinkled roses‘ flowers; to evaluate the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in samples of Rosa rugosa Thunb. flowers by HPLC analysis method; to determine the free radical scavenging activity using ABTS method

as well as reducing activity was determined by spectrophotometric FRAP method; to evaluate the correlation between quantities of total phenolic compounds and the antioxidant activity.

The object and methods: the object is Rosa rugosa Thunb. flowers growing naturally, collected during vegetation period in different parts of Lithuania. The total content of phenolic compounds, the total content of flavonoids and the antioxidant activity was determined by spectrophotometric methods; qualitative and quantitative evaluation of phenolic compounds was determined by ultra–high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry (UHPLC– MS/MS) analysis. The antioxidant activity was assesed by ABTS and FRAP spectrophotometric methods.

Results and conclusions: The highest amount of phenolic compounds were determined in Rosa

rugosa Thunb. flowers, collected in Palanga (153,93±4,51 mg GAE/g), the lowest amount – in Kaunas

(76,83±2,84 mg GAE/g ). Quantitative composition of the total flavonoids in Rosa rugosa Thunb. flowers varies from 12,26±1,23 mg RE/g (Palanga) to 19,67±1,40 mg RE/g (Plikiškės, Joniškis region). The highest antiradical activity (2,99±0,15 mmol TE/g) was found in Rosa rugosa Thunb. flowers samples, collected in Vilkaviškis, the strongest reducing power (2,12±0,10 mmol TE/g) was found in

Rosa rugosa Thunb. flowers samples, collected in Birštonas. Quinic acid, 2 phenolic acids (caffeic acid

and chlorogenic acid) and 6 flavonoids ((+)–catechin, quercetin, rutin, kaempherol, kaempherol–3–O– glucoside and tiliroside) were identified by UHPLC–MS/MS method. The strongest correlation was estimated between the amount of total phenolic compounds content and antiradical activity (r=0,764, p<0,05).

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2‘azino–bis– (3–etilbenztiazolin–6–sulfono rūgštis); COX–2 – ciklooksigenazė–2;

DPPH – 2,2–difenil–pikrilhidrazilo radikalas;

FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia; GRE – galo rūgšties ekvivalentas;

NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo; PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

TPTZ – 2,4,6–tri–(2–piridil)–1,3,5–triazinas

ĮVADAS

Vaistiniai augaliniai preparatai apsaugo, palaiko ir padeda atkurti žmonių sveikatą. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, 65–80 proc. pasaulio gyventojų naudoja augalinius vaistinius preparatus gydymo tikslais [1]. Daugybė klinikinių ir medicininių tyrimų įrodė augalinių preparatų svarbą žmonių sveikatai. Apskaičiuota, kad iš 300 000 pasaulyje esančių augalų rūšių tik 15 proc. yra ištirtos [1]. Dėl šios priežasties yra itin svarbu tirti augalines žaliavas, siekiant nustatyti jų fitocheminę sudėtį ir su ja susijusį vaistinių augalinių preparatų farmakologinį poveikį.

Raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) yra erškėtinių šeimos augalas, paplitęs vidurinėje Azijos dalyje – Kinijoje, Japonijoje ir Korėjoje, vėliau išplito į Europą ir Šiaurės Ameriką [2]. Raukšlėtalapių erškėčių vaisiai, žiedai ir lapai yra nuo seno vartojami įvairių šalių liaudies medicinoje. Žiedai įeina į polivitamininių arbatų sudėtį, iš jų yra verdamos uogienės, gaminami vynai, spaudžiamos sultys. Raukšlėtalapiai erškėčiai ypač populiarūs Azijos šalyse, kur žiedlapiai ir šaknys tradicinėje medicinoje naudojami viduriavimo, gastroenterito, dismenorėjos gydymui. Moksliniais tyrimais įrodyti raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų antioksidacinis, uždegimą slopinantis, antivirusinis, priešvėžinis, antimikrobinis poveikiai. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų preparatai gali būti vartojami cukrinio diabeto, vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų prevencijai, lėtinti senėjimo procesus. Preparatų farmakologinį poveikį lemia žieduose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai – flavonoidai, taninai ir kiti fenoliniai junginiai. Raukšlėtalapių erškėčių žiedai labiausiai vertinami dėl antioksidacinio aktyvumo. Žaliavos sudėtyje esantys fenoliniai junginiai yra natūralūs antioksidantai, kurie suriša laisvuosius radikalus [2, 3].

Darbo naujumas. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų fenolinių junginių sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų raukšlėtalapių erškėčių žiedų kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. Atlikto tyrimo metu, pirmą kartą nustatytas fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose, surinktuose skirtingose Lietuvos augavietėse. Įvertintas raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių, surinktų skirtingose Lietuvos augavietėse, antioksidacinis aktyvumas.

Darbo tikslas. Ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių (Rosa

rugosa Thunb.) žiedų ėminių fenolinių junginių sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidantinį

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – ištirti skirtingose Lietuvos vietovėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) žiedų ėminių fenolinių junginių sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidantinį aktyvumą in vitro.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti Lietuvoje augančių raukšlėtapių erškėčių (Rosa rugosa Thunb.) žiedų ėminių fenolinių junginių kiekybinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą.

2. Ištirti raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių flavonoidų kiekybinę sudėtį, taikant UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą.

3. UV–regimosios šviesos spektrofotometriniais ABTS ir FRAP metodais įvertinti raukšlėtapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų antioksidantinį aktyvumą in vitro.

4. Ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos–tandeminės masių spektrometrijos metodu atlikti raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukų kiekybinės ir kokybinės sudėties analizę.

5. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo in vitro.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1

Erškėčio genties (Rosa L.) augalų apibūdinimas, morfologiniai požymiai ir

paplitimas

Raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) yra erškėčių (Rosa L.) genties augalas, priklausantis erškėtrožinių (Rosoideae) pošeimiui, erškėtinių šeimai (Rosaceae) [4].

• Karalystė: Augalai (Plantae

• Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) • Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) • Poklasis: Erškėčiažiedžiai (Rosidae) • Eilė: Erškėtiečiai (Rosales)

• Šeima: Erškėtiniai (Rosaceae Juss.)

• Pošeimis: Eršketrožiniai (Rosoideae Juss. ex Arn.) • Gentis: Erškėtis (Rosa L.)

• Rūšis: Raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) [4]

Erškėtinių (Rosaceae) šeimos augalai yra gausiausia erškėtiečių (Rosales) šeima, kurią sudaro 120 genčių [5] ir turinti apie 3100 [6] įvairių augalų rūšių. Erškėčio (Rosa L.) genties augalai yra vasarą žaliuojantys ir ilgai išsilaikančiais lapais vijokliniai augalai ir krūmai. Jų šakos ir stiebai dažniausiai turi dyglius. Erškėčio gentį sudaro apie 150 rūšių, kurios yra paplitę po Aziją, Europą ir Šiaurės Ameriką.

10 rūšių Lietuvoje auga savaime ir apie 18 yra auginamos, iš jų kelios yra sulaukėjusios [5]. Kultūrinės erškėčių atmainos yra vadinamos rožėmis [7].

Raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) – iki 2 m aukščio galintis užaugti pusrutuliškas, tankus, 1–3 m pločio krūmas. Raukšlėtalapių erškėčių stiebai yra tvirti, statūs [7, 8], sumedėję [9]. Ūgliai stori, gausiai apaugę tankiais plaukeliais ir nevienodo tvirtumo bei ilgio pūkuotais dygliais [7]. Lapai 10–20 cm ilgio, sudaryti iš 5–9 apskritų ar ovalios formos, 2–5 cm ilgio storų, neaštriai dantytų, smailių, su gyslomis, raukšlėtų lapelių. Viršutinė lapų pusė yra ryškiai žalia, lygi, kiek žvilganti, o apatinė – šviesesnė, padengta plaukeliais. Lapkočiai dygliuoti, su plačiais prielapiais [7].

Žiedai dideli, kvapnūs, nuo baltos iki tamsiai rožinės spalvos, pavieniai arba po 3–6 susitelkę į 8–10cm pločio žiedynus. Žydėti pradeda birželį ir negausiai žydi visą vasarą [7]. Žydėjimo maksimumas yra birželio trečia dekada – liepos vidurys. Augalai dekoratyvūs išlieka ne tik žydėjimo metu, bet ir

vėliau, nes užmezga daug spalvingų vaisių [10]. Vaisiai ovalūs ar šiek tiek pailgi, plokščiai rutuliški, tamsiai raudonos spalvos, lygiu paviršiumi, blizgūs [7], 2–3 cm skersmens [11]. Vaisiai renkami subrendę, dažniausiai rugpjūčio–rugsėjo mėnesiais [7].

1 pav. Raukšlėtalapio erškėčio (Rosa rugosa Thunb.) žiedas ir vaisiai (nuotrauka: Jouko Lehmuskallio) [12]

Raukšlėtalapių erškėčių gimtinė yra šiaurės rytų Azija, apimanti šiaurės Kiniją, Korėją, Japoniją, pietryčių Sibirą bei Kamčiatkos ir Ochotsko žemyninę dalį [8, 13]. Dabar savo gimtinėje raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa Thunb.) yra retesnis augalas, tačiau įveistas kituose kraštuose ir tampa invaziniu augalu. Raukšlėtalapiai erškėčiai yra paplitę ne tik šiaurės rytų Azijoje, bet ir Šiaurės Amerikos vakaruose, Australijoje, Europoje. Lietuvoje dažnas, išskyrus šiaurinę jos dalį. Augalai subrandina labai daug vaisių, kurie ilgai išlieka nenukritę. Subrendusios sėklos yra labai maistingos, jas lesa ir išnešioja paukščiai, taip pat platina smulkūs žinduoliai ar vanduo. Augalas geba daugintis ir šaknų atžalomis. Dėl atsparumo šalčiui, raukšlėtalapiai erškėčiai gali plisti į dar šiauresnius regionus [13]. Raukšlėtalapiai erškėčiai yra ilgaamžiai, nereiklūs dirvožemiui augalai. Auga pakrančių zonose, smėlio arba žvyro paplūdimiuose, ypač kopose, nes rūšis yra tolerantiška druskai. Taip pat atvirose buveinėse, pvz., pakelėse, statybvietėse, geležinkelių šlaituose, lauko ar miško kraštuose, sausose pievose [15].

Dažniausios Lietuvoje augančių erškėčių rūšys:

• Paprastasis erškėtis (Rosa canina L.) – daugiametis lapuotis krūmas, galintis užaugti iki 2–3 m aukščio. Žiedų spalva varijuoja nuo šviesiai rožinės iki tamsiai rožinės ir baltos spalvos. Žiedai yra 4–6 cm skersmens, su 3–5 žiedlapiais, kurie vėliau subręsta į oranžiniai raudonus pseudovaisius [15, 16]. Dažnesnis pietinėje Lietuvos dalyje, ypač Kauno ir Vilniaus apylinkėse. Einant į šiaurę retėja [17].

• Miškinis erškėtis (Rosa majalis Herrm. arba Rosa cinnamomea L.) – iki 2 m aukščio užaugantis krūmas. Lapai sudaryti iš 5–7 1,5–4,5 cm ilgio lapelių. Lapeliai elipsės formos, dantytais kraštais, mažai plaukuotu viršutiniu paviršiumi ir tankiai plaukuota apačia. Žiedai dažniausiai pavieniai,

vainiklapių spalva yra nuo šviesiai iki tamsiai raudonos. Vaisiai ovalūs, rutuliški, sultingi, oranžinės arba raudonos spalvos [17, 18]. Auga visoje Lietuvos teritorijoje, šiaurinėje dalyje dažnas, o einant į pietus – retėja [17].

• Rūdėtasis erškėtis (Rosa rubiginosa L.) – vidutinio dydžio, šakotas krūmas, galintis užaugti iki 2 m aukščio. Lapai ovalo formos, dantytais kraštais, stipraus obuolių kvapo. Žiedai susitelkę į žiedynus po 3–25, rečiau pavieniai. Vainiklapiai rožiniai arba raudoni, rečiau būna balti. Vaisiai pailgi, 1–2 cm skersmens. Pietinėje Lietuvos dalyje dažnas, einant į šiaurę- retėja [17].

• Švelnialapis erškėtis (Rosa mollis Smith.) – mažai šakotas, iki 1,5 m aukščio užaugantis krūmas. Dygliai tiesūs. Lapai švelniai plaukuoti, sudaryti iš 5–7 1,2–3,5 cm ilgio lapelių. Žiedai pavieniai arba susitelkę po 2–3, žiedlapių spalva varijuoja nuo rožinės iki šviesiai violetinės. Vaisiai nedideli, kiaušiniški arba rutuliški, tamsiai oranžiniai–raudoni, gali būti padengti liaukiniais plaukeliais [17, 19]. Lietuvoje aptinkamas visuose regionuose, dažniau vakarinėje ir pietinėje dalyje [17].

• Kitos Lietuvoje augančios erškėčių rūšys yra tankiadyglis erškėtis (Rosa spinosissima L.), raudonlapis erškėtis (Rosa rubrifolia Vill.), geltonasis erškėtis (Rosa foetida Herrm.) prancūzinis erškėtis (Rosa gallica L.).

Raukšlėtalapis erškėtis yra auginamas kaip dekoratyvinis, maistinis ar vaistinis augalas, tačiau jis tampa ir grėsme gamtai – plisdamas šaknų atžalomis, suformuoja tankius, sunkiai praeinamus sąžalynus, kurie užima vietinių augalų augavietes, taip sunaikindami ne tik vietinių augalų, bet ir gyvūnų rūšis, todėl šio augalo kultivavimas turėtų būti itin atsakingas [20].

1.2 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų cheminės sudėties tyrimai

Atlikus raukšlėtalapių erškėčių organuose kaupiamų antrinių metabolitų sudėties tyrimus, nustatyti skirtingų grupių biologiškai aktyvūs junginiai: fenoliniai junginiai, alkaloidai, saponinai, terpenai, lipidai ir angliavandeniai [3, 21, 22]. Antriniai metabolitai atlieka svarbų vaidmenį augalų sąveikoje su aplinka [21]. Jie apsaugo augalus nuo pažeidimų, kuriuos sukelia bakterijos, grybai ir virusai [23]. Biologiškai aktyvūs junginiai veikia kaip natūralūs antioksidantai, apsaugo augalą nuo žalingo UV spinduliuotės poveikio. Antriniai metabolitai (pvz., eterinio aliejaus komponentai, flavonoidai) padeda privilioti vabzdžius apdulkintojus ir sėklas platinančius gyvūnus [23, 24, 25].

2 pav. Pagrindiniai raukšlėtalapių erškėčių organuose nustatyti biologiškai aktyvūs junginiai [26]

Raukšlėtalapių erškėčių vegetatyviniuose ir generatyviniuose organuose nustatyti antriniai metabolitai (2 pav.). Mokslinės literatūros duomenimis, raukšlėtalapių erškėčių šaknų ėminiuose identifikuoti katechino dariniai, triterpeniniai junginiai. Lapuose nustayti flavonoidai, hidrolizuojami taninai, monoterpenininiai ir seskviterpeniniai junginiai [8]. Raukšlėtalapių erškėčių žieduose nustatyti biologiškai aktyvūs junginiai – antocianinai (cianidinas, pelargonidinas, peonidinas), flavonoliai (kemferolis, kvercetinas), flavan–3–oliai ir jų dariniai, procianidinai, fenolinės rūgštys (galo rūgštis, elago rūgštys), įvairūs eterinio aliejaus komponentai [27].

• Eterinis aliejus – erškėčių žiedų eterinio aliejaus sudėtis skiriasi priklausomai nuo rūšies ir vegetacijos fazės. Mokslinių tyrimų duomenimis, raukšlėtalapių erškėčių žiedų eteriniame aliejuje identifikuota beveik 30 komponentų, kurių didžiąją dalį sudaro citronelolio acetatas (12,1 proc.), citronelolis (7,7 proc.) ir geraniolio acetatas (5,5 proc.) [28]. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų eterinio aliejaus sudėtyje vyrauja terpenoidai (daugiausiai nustatyta monoterpeninių ir seskviterpeninių junginių) [29]. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų eterinio aliejaus komponentas linalolis suteikia silpną rožių kvapą, o geraniolis, citronelolis yra pagrindiniai rožių aromatą lemiantys junginiai. Eugenolis, β-kariofilenas ir kiti stipraus kvapo ingredientai yra pagrindiniai komponentai, lemiantys malonų raukšlėtalapių erškėčių eterinio aliejaus kvapą [3].

Eterinio aliejaus kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose – 0,03–0,04 proc. [30]. Raukšlėtalapių erškėčių žiedai yra naudojami rožių eterinio aliejaus ir rožių vandens gamybai. Rožių vanduo yra antrinis eterinio aliejaus gamybos produktas. Atlikus tyrimus nustatyta, kad eterinio aliejaus ir rožių vandens, gautų iš raukšlėtalapių erškėčių žiedlapių, kvapas ir fitocheminė sudėtis beveik nesiskyrė nuo komponentų, gautų iš damaskinių rožių (Rosa

damascena Mill.) žiedlapių. Tai įrodo, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedų distiliavimo produktai

gali būti kvapnių damaskinių rožių eterinio aliejausalternatyva [31].

• Fenoliniai junginiai – raukšlėtalapių erškėčių žieduose nustatyti skirtingų grupių fenoliniai junginiai [27]. Žiedlapiuose identifikuotos fenolinės rūgštys, flavonoliai, flavan–3–oliai, hidrolizuojami taninai (elagitaninai ir galotaninai). Fenoliniai junginiai nustatyti ir antžeminėse, ir požeminėse raukšlėtalapių erškėčių dalyse. Fenolinių junginių kiekis žiedų, lapų ir šaknų etanoliniuose ekstraktuose varijuoja nuo 12,75 iki 13,9 mg GRE/ml. Mokslininkai nustatė, kad fenolinių junginių kiekis raukšlėtalapių erškėčių vaisių tinktūroje buvo 11,88 mg/ml, mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas sėklų etanoliniame ekstrakte – 2,88 mg/ml. Erškėčių sėklų ir žiedų arbatose nustatyti mažesni fenolinių junginių kiekiai – 0,14 mg/ml sėklų arbatoje ir 1,52 mg/ml žiedų arbatoje. [3]. Kito tyrimo duomenimis raukšlėtalapių erškėčių žiedlapiuose nustatyta apie 107,4 mg/g fenolinių junginių [32].

• Flavonoidai – raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose nustatyti vyraujantys flavonoidai: rutinas (kvercetin–3–O–rutinozidas), izokvercitrinas (kvercetin–3–O–gliukozidas) ir avikularinas (kvercetin–3–L–arabinofuranozidas). Nustatyti mažesni kiekiai tilirozido (kemferol–3–O–(6“–O–(E)–kumaroil)–gliukozido), astragalino (kemferol–3–O–gliukozido), kvercitino (kvercetin–3–O–ramnozido), hiperozido (kvercetin–3–O–galaktozido), kemferol–3– O–rutinozido, apigenin–7–O–gliukozido [2, 8, 32]. Bendras flavonoidų kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose varijuoja nuo 3,56 iki 8,88 mg RE/g [32].

• Fenolinės rūgštys – raukšletalapių erškėčių žiedlapiuose nustatytos fenolinės rūgštys. Pagrindinės yra galo, elago rūgštys, nustatyti mažesni kiekiai kavos, gentisinės, protokatecho, sinapo, p–kumaro, vanilino rūgščių [2, 8, 32]. Žiedlapių metanoliniame ekstrakte nustatytas bendras fenolinių rūgščių kiekis 10,24±0,51 µg/mg, o vandeniniame ekstrakte bendras fenolinių rūgščių kieks sudarė tik 0,29±0,02 µg/mg [27].

• Hidrolizuojami taninai – mokslinės literatūros šaltiniuose nurodoma, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose nustatyti rugozinai A (<10 mg/g), B, C, D (8,2–48,1 mg/g), E, F, G, telimagrandinas I (10,4–41,6 mg/g) ir telimagrandinas II (1,5–35,3 mg/g) [8, 22].

Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose nustatyti pigmentai, lemiantys tamsiai rožinę žiedų spalvą. Pigmentai, išgaunami iš raukšlėtalapių erškėčių žiedų, yra antocianinų dariniai. Žiedų ėminiuose nustatytos aminorūgštys, karotinoidai (fitoenas ir fitofluenas), nesočiosios riebalų rūgštys, vitaminai

(askorbo rūgštis, riboflavinas, tokoferolis, filochinonas) mikroelementai ir makroelementai (kalcis, cinkas, geležis, fosforas) [3, 27].

1.3 Raukšlėtalapių erškėčių preparatų poveikis ir vartojimas

Augalinių preparatų poveikį lemia augalo fitocheminė sudėtis [33]. Raukšlėtalapiai erškėčiai kaupia daug biologiškai aktyvių junginių. Raukšlėtalapių erškėčių organų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai yra natūralūs antioksidantai. Antocianinai veikia kapiliarus, lėtina edemų formavimąsi, slopina uždegimą, suriša laisvuosius radikalus, apsaugo ląstelių plazminės membranos lipidus nuo oksidacijos, yra svarbūs vėžio prevencijai, slopina vėžio vystymąsi. Flavonoidai svarbūs širdies ir kraujagyslių ligų, pvz., aterosklerozės, prevencijai. Kvercetinas ir kiti flavonai, flavanonai slopina Helicobacter pylori padermių dauginimąsi ir apsaugo nuo skrandžio opų susidarymo. Flavonai veikia mikroorganizmus, slopina Herpes simplex ir poliomielito virusų padermių dauginimąsi. Fenolinės rūgštys pasižymi priešvėžiniu, antioksidaciniu, antimutageniniu, antibakteriniu ir antivirusiniu poveikiais [27].

• Antioksidacinis aktyvumas. Fenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas įrodytas in vitro tyrimais. Atlikti tyrimai rodo, kad oksidacinis stresas sukelia lėtines ligas, įskaitant širdies ir kraujagyslių sistemos ligas, vėžį, diabetą, neurodegeneracines ligas ir senėjimo sutrikimus. Šių lėtinių ligų prevencijai gali būti vartojami natūraliai augaluose randami antioksidantai [34]. Erškėčių žiedų ištraukose nustatyti fenoliniai junginiai veikia kaip natūralūs antioksidantai, kurie suriša laisvuosius radikalus. Raukšlėtalapių erškėčių antioksidacinis poveikis buvo tiriamas ne

tik in vitro, bet ir in vivo. Užsienio šalių mokslininkai tyrė skirtingų erškėčių organų arbatas ir

tinktūras bei nustatė stiprų antiradikalinį aktyvumą (0,26–4,25 mmol TE/g) ir redukcinį aktyvumą (1092,04–9258,70 mmol Fe2+_{/g). Ištirta DPPH, hidroksilo ir superoksido laisvųjų} radikalų surišimo geba skiringose raukšlėtalapių erškėčių žiedų žydėjimo fazėse. Nustatyta, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų DPPH laisvųjų radikalų surišimo geba svyravo nuo 40,2 proc. iki 73,5 proc., hidrokisilo radikalų − nuo 14,3 proc. iki 32,2 proc., superoksido − nuo 78,0 proc. iki 84,6 proc. [3]. Kim S ir kt. (2012) vertindami erškėčių žiedų ėminių ištraukų antioksidacinį aktyvumą, atliko tyrimą su pelėmis. Jie išskyrė du antioksidantinius komponentus, polisacharido–peptido kompleksą (P(1–a)) ir kondensuoto tanino rūšį (P(1–b)), bei inkubavo juos su pelių eritrocitais, siekdami ištirti jų įtaką eritrocitų katalazės (CAT) ir superoksido dismutazės (SOD) aktyvumui. Rezultatai parodė, jog CAT ir Zn–SOD aktyvumas žymiai padidėjo praėjus 3 valandoms po inkubacijos [34].

• Uždegimą slopinantis poveikis.Raukšlėtalapių erškėčių šaknų preparatai Rytų Azijoje plačiai naudojamos lėtinių uždegiminių ligų gydyme. Šaknyse esantys triterpeniniai junginiai (euskafo

rūgštis (EA) ir tormento rūgštis (TA)), yra atsakingi už raukšlėtalapių erškėčių šaknų preparatų uždegimą slopinantį poveikį [3, 8]. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų preparatai gali būti vartojami gydant uždegimines ligas. Atliktas tyrimas parodė, kad erškėčių žieduose esantys fenoliniai junginiai pasižymėjo uždegimą slopinamuoju poveikiu lipopolisacharido (LPS) sukeltam uždegimui RAW 264.7 makrofaguose. Jie žymiai slopino azoto oksido (NO), prostaglandino E2 (PGE2), naviko nekrozės faktoriaus (TNF)–α, interleukino (IL)–6 ir inerleukino 1β (IL–1β) gamybą, jų sintezės fermentų, indukuojamos azoto oksido sintazės (iNOS) ir ciklooksigenazės– 2 (COX–2), ekspresiją. Fenoliniai junginiai slopino mitogeno aktyvuotų baltymų kinazių (MAPK) ir branduolio faktoriaus – kappa B (NF–κB) signalizacijos kelią [35]. Atliktų tyrimų rezultatai paaiškina erškėčių žiedų ėminiuose kaupiamų fenolinių junginių poveikio mechanizmą ir įrodo, kad jų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai turi gydomąjį potencialą ir gali būti vartojami uždegiminių sutrikimų prevencijai.

• Priešvėžinis poveikis. Raukšlėtalapių erškėčių žiedlapiuose nustatyti biologiškai aktyvūs junginiai, pasižymintys antiproliferaciniu aktyvumu: flavonoidai, galo ir protokatecho rūgštys, taninai. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad raukšlėtalapių erškėčių šaknų, lapų, sėklų, vaisių ir žiedų tinktūros ir nuovirai pasižymi priešvėžiniu poveikiu. Tyrimų metu buvo vertinamos kiaušidžių (TOV–112D), gimdos kaklelio (HeLa), krūties vėžio (T47D) ir plaučių vėžio (A549) ląstelių linijos, naudojant BrdU testą. Tinktūros ir nuovirai, paruošti iš žiedų ir lapų, pasižymėjo stipriausiu priešvėžiniu poveikiu A549 ir TOV–112 ląstelių linijoms (85–95 proc. negyvų ląstelių), tačiau buvo pastebėtas ir žalingas poveikis normalioms fibroblastinių ląstelių linijoms (80-90 proc. negyvų ląstelių). Reikšmingas citotoksinis žiedų nuoviro poveikis buvo stebimas ir HeLa ląstelių linijai (50 proc. negyvų ląstelių) bei sėklų nuoviro – T47D ląstelių linijai. Arbatos, paruoštos iš lapų ir vaisių, neturėjo jokios reikšmingos įtakos priešvėžiniam poveikiui [32, 36]. • Antivirusinis poveikis. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų sudėtyje esantys taninai turi įtakos augalų

ekstraktų antivirusinėms savybėms, tačiau manoma, kad antivirusinį poveikį apsprendžia fenolinių junginių komponentų derinys, o ne atskiri komponentai. Mokslininkai nustatė, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedų ekstraktai apsprendė poveikį hepatito C virusui [37]. Kito tyrimo metu mokslininkai įrodė, kad raukšlėtalapių erškėčių 100 μg/ml koncentracijos šaknų ekstraktas turėjo stiprų aktyvumą prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) [38].

• Antimikrobinis poveikis. Moksliniais tyrimais nustatytas raukšlėtalapių erškėčių žiedlapių antimikrobinis poveikis. Tyrimai parodė, kad žiedlapių preparatai pasižymėjo selektyviu antibakteriniu poveikiu prieš žarnyno ir patogenines bakterijas. Jų selektyvumas buvo panašus į prebiotikų. Nustatyta, kad labiausiai antimikrobinį poveikį lemia sudėtyje esantys hidrolizuojami taninai – rugozinas D ir telimagrandinas II [39]. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų preparatai pasižymėjo teigiamu poveikiu prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijų padermes [3].

Nustatytas teigiamas antimikrobinis poveikis 8 bakterijų padermėms: Staphylococcus

epidermidis, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, ir dviems mielių

padermėms: Candida albicans ir Candida parapsilosis [31]. Geriausiomis antimikrobinėmis savybėmis pasižymėjo lapų, žiedų ir šaknų ėminių ekstraktai ir tinktūros, o sėklų ir vaisių ėminių ekstraktų ir tinktūrų antimikrobinės savybės buvo silpnesnės [8]. Telimagrandinas I ir kartu vartoti antimikrobiniai vaistai (pvz. tetraciklinas, oksacilinas) pasižymėjo sinergistiniu aktyvumu ir padidino šių antibiotikų veiksmingumą [37].

• Antidiabetinis poveikis. PSO duomenimis, cukrinis diabetas yra plačiai paplitusi lėtinė liga, sukelianti daugybę komplikacijų ir yra viena iš didžiausių žmonių populiacijos sergamumo priežasčių [40]. Kinijoje, Japonijoje raukšlėtalapių erškėčių žaliavų preparatai plačiai naudojami cukrinio diabeto ir su juo susijusių komplikacijų gydyme [36]. Oksidacinis stresas yra vienas iš svarbiausių diabetinių komplikacijų patogeninių veiksnių. Keletas tyrimų įrodė, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedų ir šaknų ėminiai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis [41]. Raukšlėtalapių erškėčių preparatų poveikis pasireiškia dėl sudėtyje esančių fenolinių junginių, kurie geba surišti laisvuosius radikalus ir apsaugo ląstelių plazminės membranos lipidus nuo oksidacijos. Su žiurkėmis atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad raukšlėtalapių erškėčių šaknų ekstraktai padeda sumažinti gliukozės kiekį kraujyje cukriniu diabetu sergančioms žiurkėms, padidindami jautrumą insulinui, įrodant, kad poveikis yra susijęs su oksidacinio streso ir α-gliukozidazės slopinimu [42].

• Antihipertenzinis poveikis. In vivo atliktas tyrimas su žiurkėmis įrodė, kad raukšlėtalapių erškėčiųžiedų ekstraktai pasižymi antihipertenziniu poveikiu. Žiurkėms buvo sugirdoma 20 g/kg erškėčių žiedų ekstrakto, AKS sumažėjimas buvo lyginamas su kaptoprilio (80 mg/kg) kontroline doze. Nustatyta, kad po 6 dienų, pavartojus 20 g/kg dozę, AKS sumažėjo 17,5 mmHg ir toks sumažėjimas išliko 8 dienas. Tyrimais įrodyta, kad antihipertenzinis poveikis pasireiškia dėl galimybės inhibuoti angiotenziną I konvertuojantį fermentą [43].

Raukšlėtalapių erškėčių vaisiai, žiedai ir lapai yra nuo seno vartojami įvairių šalių liaudies medicinoje. Iš žiedų yra gaminamos polivitamininės arbatos, verdamos uogienės, gaminami vynai, spaudžiamos sultys. Žiedai, sumaišyti su cukrumi, naudojami konditerijos gaminiuose. Raukšlėtalapiai erškėčiai yra populiarūs Azijos šalyse, kur jų žiedlapiai ir šaknys tradicinėje medicinoje vartojami viduriavimo, gastroenterito, dismenorėjos gydymui [8]. Šiaurės Kinijoje, Turkijoje augančių Rosa genties augalų žiedai yra plačiai naudojami eterinio aliejaus [32] ir rožių vandens [30] gamybai.

Atlikti moksliniai tyrimai įrodo raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukų poveikį gyvūnų ir žmogaus organizmui, todėl ši augalinė žaliava yra perspektyvi ir galėtų būti plačiau naudojama įvairių ligų profilaktikai ir papildomam gydymui, maisto papildų bei funkcinio maisto kūrimui ir gamybai.

1.4 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų fenolinių junginių kiekio ir eterinio aliejaus

komponentų kiekybinės sudėties įvairavimas žydėjimo metu

Antioksidantai priklauso labiausiai pageidaujamiems augalų komponentams ir jų panaudojimas maisto pramonėje, kosmetikoje ar medicinos tikslais tampa vis populiaresnis. Oksidacinis stresas sukelia daugelį ligų, pvz., neurodegeneracines, širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimus, vėžį ar artritą, todėl tikimasi, kad augali gali suteikti antioksidantų, pasižyminčių vertingomis gydomosiomis savybėmis. Raukšlėtalapiai erškėčiai daugiausiai auginami dėl vaisių ir žiedų. Užsienio mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis, raukšlėtalapių erškėčių žiedai pasižymi stipriu antiradikaliniu aktyvumu [44]. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose nustatyti fenoliniai junginiai ir askorbo rūgštis yra natūralūs antioksidantai. Šių junginių kiekis ir antioksidacinės savybės priklauso nuo raukšlėtalapių erškėčių geografinės padėties, žydėjimo fazės, oro sąlygų, žiedų nuėmimo laiko, ekstrakcijos metodų ir laikymo sąlygų [15].

Mokslininkai raukšlėtalapių erškėčių. žiedų vystymąsi skirsto į 6 etapus (2 pav.): pirmoje fazėje žiedų pumpurai yra neišsiskleidę, nesubrendę žiedlapiai dar žali; antrosios fazės metu prasideda žiedlapių spalvos keitimasis į rožinę; trečios fazės metu žiedlapiai pradeda laisvėti ir atsiskirti; ketvirtoje – žiedlapiai ilgėja ir žiedas skleidžiasi; penktos fazės metu žiedlapiai išsiskleidžia; šeštos fazės metu žiedai pilnai išsiskleidžia, prasideda masinis žydėjimas [45, 46].

Svarbu įvertinti laisvųjų radikalų surišimo gebą ir fenolinių junginių kiekį skirtingais žiedų vystymosi etapais. Tai yra naudinga nustatant optimalų žiedų nuėmimo laiką [45]. Raukšlėtalapių erškėčių žiedlapių laisvųjų radikalų surišimo gebos palyginimas yra pateiktas 3 paveiksle.

3 pav. Raukšlėtalapių erškėčių žiedlapių vandeninių ekstraktų laisvųjų radikalų surišimo geba skirtingomis žydėjimo fazėmis (skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus) [45]

Laisvųjų DPPH•

radikalų surišimo geba kinta nuo 73,5 proc. iki 40,2 proc. (balti stulpeliai), hidroksilo laisvųjų radikalų – nuo 32,2 proc. iki 14,3 proc. (pilki stulpeliai diagramoje), o superoksido- nuo 84,6 proc. iki 78,0 proc. (juodi stulpeliai diagramoje), priklausomai nuo žiedų vegetacijos fazės. Žiedų vystymosi metu pastebimas reikšmingas DPPH• _ir •_{OH laisvųjų radikalų surišimo gebos}

sumažėjimas. Superoksido laisvųjų radikalų surišimo gebos sumažėjimas žiedų vystymosi metu reikšmingai nesiskyrė, o 6 fazės metu greitai sumažėjo. Nustatyta, kad didžiausia laisvųjų radikalų surišimo geba buvo 1 fazės metu, o mažiausia – 6 žiedų vystymosi fazės metu.

Ta pati tendencija pastebima analizuojant erškėčių žiedų vandeninių ekstraktų fenolinių junginių koncentracijos pokyčius skirtingomis žydėjimo fazėmis. Nuolatinis, reikšmingas fenolinių junginių kiekio sumažėjimas stebimas visu žiedų vystymosi metu (4 pav.).

4 pav. Raukšlėtalapių erškėčių žiedlapių vandeninių ekstraktų fenolinių junginių kiekiai skirtingomis žydėjimo fazėmis (skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus) [45]

Fenolinių junginių kiekis vegetacijos metu mažėjo nuo 19,8 iki 6,9 mg KE/g, didžiausias kiekis nustatytas pirmoje žydėjimo fazėje. Tai leidžia daryti išvadą, kad laisvųjų radikalų surišimo geba, fenolinių junginių kiekis ir su juo susijęs antioksidacinis aktyvumas bus didžiausi tuose raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose, kurie bus surinkti pirmos žydėjimo fazės metu. Raukšlėtalapių erškėčių žiedus geriausia yra rinkti žydėjimo pradžioje, kai žiedų pumpurai dar neprasiskleidę [45].

Yangzhou universiteto mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu tyrė raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių eterinio aliejaus ir jo komponentų sudėties pokyčius žiedų vystymosi metu. Junginiai buvo analizuojami taikant kietafazės mikroekstrakcijos bei dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodus. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų pumpuruose mokslininkai nustatė 53 junginius (γ–muuroleną, α–himachaleną, α–pineną ir kt.). Terpenai yra pagrindinė raukšlėtalapių erškėčių pumpurų sudedamoji dalis. Žiedų skleidimosi pradžioje raukšlėtalapių erškėčių žieduose buvo identifikuoti 65 junginiai: β-citronelolis, citronelolio acetatas, β–feniletilalkoholis, geraniolis, n–heksilacetatas, nerolis, fenetilacetatas, cis–3–heksenilacetatas ir kt. Nustatyta, kad β–feniletilalkoholis yra pagrindinis kvapą suteikiantis raukšlėtalapių erškėčių žiedų komponentas [22]. Pusinio žiedų išsiskleidimo etapo metu nustatyti 62 komponentai (β–citronelolis, geraniolis, β–feniletilalkoholis, citronelolio acetatas, nerolis, n-heksilacetatas, fenetilacetas ir kt.). Pilnai išsiskleidusių raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose identifikuoti 65 junginiai (β–citronelolis, citronelolio acetatas, β–feniletilalkoholis, geranilacetatas, geraniolis, fenetilacetatas, nerolis, α-mircenas ir kt.). Masinio žydėjimo metu raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose nustatyti 58 junginiai (β–citronelolis, β–feniletilalkoholis, fenetilacetatas, citronelolio acetatas, α–pinenas, limonenas, geranilacetatas ir kt.). Mokslininkai padarė išvadas, kad alkoholių kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų vystymosi metu sparčiai didėjo, o maksimumas buvo pasiektas pusiniame

žiedų išsiskleidimo etape. Esterių kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose iš pradžių padidėjo, paskui pradėjo mažėti, o didžiausia koncentracija buvo nustatyta žiedams pilnai išsiskleidus. Maksimali terpenų koncentracija nustatyta raukšlėtalapių erškėčių žiedų pumpuruose, žymiai sumažėjo žiedų skleidimosi pradžioje ir vėl padidėjo žiedams pilnai išsiskleidus. Aldehidų kiekis didėjo laipsniškai, didžiausia koncentracija nustatyta pilnai išsiskleidusių raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose [47].

Apibendrinus galima teigti, kad eterinio aliejaus komponentų kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose priklauso nuo vegetacijos fazės. Mokslininkai padarė išvadą, kad norint išgauti didžiausią rožių eterinio aliejaus kiekį, šviežius raukšlėtalapių erškėčių žiedus reikėtų skinti žiedams pusiau arba pilnai prasiskleidus [3, 47, 48].

1.5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Mokslininkų atlikti klinikiniai ir mediciniai tyrimai patvirtino raukšlėtalapių erškėčių žiedų preparatų svarbą žmonių sveikatai. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedų preparatai yra ne tik maistinių medžiagų šaltinis, bet gali būti vartojami cukrinio diabeto, vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų prevencijai, lėtinti senėjimo procesus, sustiprinti imuninį atsaką ir antibakterines organizmo funkcijas. Šie poveikiai siejami su raukšlėtalapių erškėčių organuose kaupiamais biologiškai aktyviais junginiais, įskaitant flavonoidus, fenolines rūgštis, taninus ir terpenus.

Prieinamoje mokslinėje literatūroje yra pateikiama mažai duomenų apie raukšlėtalapių erškėčių žiedų kiekybinę ir kokybinę sudėtį, todėl vis dar trūksta išsamios informacijos apie kaupiamus biologiškai aktyvius metabolitus. Raukšlėtalapių erškėčių žiedai gali būti vertinga žaliava maisto, medicininėje ir kosmetikos pramonėje, kuriant biologiškai aktyvius maisto papildus ar funkcinio maisto produktus. Dėl šios priežasties išsamesni raukšlėtalapių erškėčių žiedų fitocheminės sudėties ir jų ištraukų biologinio aktyvumo tyrimai yra itin svarbūs ir aktualūs.

2. METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiai, surinkti žydėjimo metu 15 skirtingų Lietuvos vietovių. Rinkimo laikas – 2017 m. birželio – liepos mėn. Duomenys pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Raukšlėtalapių erškėčių. žiedų ėminių rinkimo datos ir vietos

Nr. Žiedų rinkimo data Žiedų rinkimo vieta

1. 2017-06-29 Vilkaviškio raj., Žirgėnų k. (pamiškė)

2. 2017-06-20 Ukmergės raj., Veprių miestelis (prie sodybos) 3. 2017-07-17 Trakų raj., Totoriškių k. (paežerė)

4. 2017-07-18 Kazlų Rūdos sav., Jūrės k. (miškas, prie geležinkelio bėgių) 5. 2017-06-20 Kaunas, Kleboniškis (Kleboniškio miškas)

6. 2017-06-30 Akmenės raj., Ventos miestelis (paupys) 7. 2017-07-05 Raseinių raj., Vaičaičių k. (pamiškė) 8. 2017-06-22 Tauragės raj., Skaudvilės miestelis (pakelė) 9. 2017-06-18 Kalvarijos sav., Orijos k. (pamiškė, prie sodybos)

10. 2017-06-24 Palanga (kopos)

11. 2017-06-10 Vilkaviškis (sodų bendrija) 12. 2017-07-01 Joniškio raj., Plikiškių k. (laukai) 13. 2017-06-13 Prienų raj., Vazgaikiemio k. (pakelė) 14. 2017-06-16 Varėnos raj., Mergežerio k. (pamiškė) 15. 2016-06-21 Birštonas (miško pakraštys)

Surinkti raukšlėtalapių erškėčių žiedai buvo džiovinti kambario temperatūroje, sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje. Susmulkinti raukšlėtalapių erškėčių žiedai laikyti popieriniuose maišeliuose.

2.2 Naudoti reagentai

Tyrimams naudoti reagentai, kurie atitinka kokybės reikalavimus ir yra analitinio švarumo: etilo alkoholis 96 proc. (v/v) (AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva), galo rūgšties monohidratas (,,Sigma–Aldrich“, Sent Luisas, JAV), Folin–Ciocalteu reagentas (,,Sigma–Aldrich“, Sent Luisas, JAV), natrio karbonatas („Carl Roth GmbH & Co. KG“, Karlsrūjė, Vokietija), acto rūgštis (,,Lachner“, Neratovicas, Čekijos Respublika), aliuminio chlorido heksahidratas („Sigma–Aldrich Chemie GmbH“, Šteinheimas, Vokietija), rutinas („Carl Roth GmbH & Co“, Karlsrūjė, Vokietija), heksimetilentetraminas („Sigma–Aldrich Chemie GmbH“, Šteinheimas,Steinheim Vokietija), ABTS (2,2'–azino–bis–(3–etilbenztiazolin–6–sulfono rūgšties) reagentas („Alfa Aesar“, Karlsrūjė, Vokietija), kalio persulfatas (,,Alfa Aesar“, Karlsrūjė, Vokietija), troloksas ((±)–6–hidroksi–2,5,7,8– tetrametilchromano–2–karboksilinė rūgštis) (,,Sigma–Aldrich“, Sent Luisas, JAV), natrio acetatas (,,Sigma–Aldrich Chemie GmbH“, Šteinheimas, Vokietija), 37 proc. (v/v) vandenilio chlorido rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, Sent Luisas, JAV), TPTZ (2,4,6-tripiridil–s–triazinas) („Alfa Aesar“ GmbH & Co“, Karlsrūjė, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas („Vaseline–Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija). Chromatografinei analizei naudotas išgrynintas dejonizuotas vanduo, paruoštas naudojant Milli–Q® („Millipore“, Bedfordas, JAV) vandens valymo sistemą.

2.3 Naudota aparatūra

Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiai smulkinti elektriniu malūnėliu „Retsch GM 200“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija). Susmulkintos žaliavos svėrimai atlikti analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius CP64-0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Spektrofotometrinės analizės tyrimai atlikti naudojant UV–regimosios šviesos spektrofotometrą „M550“ („Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė). Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties analizė atlikta skysčių chromatografu „Waters ACQUITY UPLC® H– Class“ („Waters“, Milfordas, Masačusetsas, JAV) su kvadrupolio tandeminiu masių spektrometriniu „Xevo TQD“ („Waters“, Milfordas, Masačusetsas, JAV) detektoriumi. Analičių skirstymui naudota „YMC Triart C18” (100 Å, 100 × 2,0 mm; dalelių dydis 1,9 μm) kolonėlė („YMC“, Kiotas, Japonija) su prieškolonėle.

2.4 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų paruošimas

Žaliavos paruošimas. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiai surinkti 15 skirtingų Lietuvos vietų

2017 m. birželio – liepos mėn. Augalinė žaliava džiovinta kambario temperatūroje, sausoje, gerai vėdinamoje vietoje. Išdžiovinti raukšlėtalapių erškėčių žiedai buvo susmulkinti elektriniu malūnėliu. Susmulkintos žaliavos svėrimai atlikti elektroninėmis analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius CP64– 0CE“. Susmulkinti raukšlėtalapių erškėčių žiedai laikyti popieriniuose maišeliuose, tamsioje, sausoje vietoje.

Nuodžiūvio nustatymas. Tiriamųjų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių nuodžiūvis buvo

nustatytas remiantis Europos farmakopėjos straipsnyje nurodytu metodu (Ph. Eur. 2.2.32). Tiksliai atsveriama 1,0 g tiriamosios raukšlėtalapių erškėčių žaliavos. Džiovinama 105°C džiovinimo spintoje 2 valandas, džiovinimo nuostoliai turi būti ne daugiau kaip 10 proc. [49] Tyrimo rezultatai perskaičiuoti absoliučiai sausos žaliavos masei.

Etanolinių ištraukų paruošimas. Išdžiovinti raukšlėtalapių erškėčių žiedai buvo susmulkinti

elektriniu malūnėliu. Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama po 0,25 g kiekvienos smulkintos erškėčių žiedų žaliavos, jos suberiamos į tamsaus stiklo buteliukus, užpilama po 25 ml 70 proc. (v/v) etanolio. Fenolinių junginių išskyrimas vykdytas taikant maceracijos metodą [50]. Augalinė žaliava ekstrahuota 7 dienas kambario temperatūroje. Po 7 dienų, ištraukos filtruojamos pro filtrinį popierių į 25 ml matavimo kolbutes. Gautos ištraukos perpilamos į tamsaus stiklo buteliukus, kurie sandariai užsukami, paženklinami ir laikomi kambario temperatūros patalpoje. Prieš atliekant UESC–MS/MS analizę etanolinės ištraukos nufiltruotos per 0,22 μm porų membraninius filtrus.

2.5 Tyrimo metodai

2.5.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas naudojant Folin–Ciocalteu metodą ir atlikus keletą modifikacijų [51]

Paruošiamas darbinis reagentas, motininį Folin–Ciocalteu reagentą 10 kartų praskiedžiant vandeniu. 5 ml motininio Folin – Ciocalteu reagento praskiedžiami 45 ml distiliuoto vandens.

Paruošiamas 7,5 proc. Na2CO3 tirpalas. 7,5 g Na2CO3 miltelių tirpinama 100 ml kolboje ir

Tiriamojo tirpalo paruošimas: sausame mėgintuvėlyje sumaišoma 0,8 ml tiriamosios ištraukos, 4 ml Folin – Ciocalteu darbinio reagento ir 3,2 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo.

Palyginamojo tirpalo paruošimas: palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, kaip ir tiriamasis, tik vietoje 0,8 ml tiriamosios ištraukos yra pilama 0,8 ml 70 proc. (v/v) etanolio.

Abu gauti mišiniai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje, 1 val. Spektrofotometru išmatuojama 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui.

Kalibracinis grafikas sudaromas naudojant galo rūgšties standartą. Galo rūgšties tirpalų koncentracijų ribos: [0,00625–0,1 mg/ml]. Gauti rezultatai įvertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:

y = 9,0723x - 0,033; R² = 0,9992

Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) gramui sausos augalinės žaliavos ir apskaičiuojamas taikant formulę:

X

=

𝑚

(mg GRE/g)

X – bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g)

c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės V – ištraukos tūris (ml)

a – skiedimas

m – sausos žaliavos masė (g)

2.5.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Bendras flavonoidų kiekis (atitinkantis rutino kiekį) nustatomas raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukas veikiant aliuminio chlorido tirpalu acto rūgštimi parūgštintoje aplinkoje [52].

Tiriamojo tirpalo paruošimas. Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukos, 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Gautas mišinys laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Po 30 min į kolbutę įpilama 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo. Kolbutės turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir išmaišomas.

Palyginamojo tirpalo paruošimas. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml kolbutę įpilant 0,2 ml raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukos, 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio ir 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties. Kolbutės turinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir išmaišomas.

Spektrofotometru išmatuojamas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis, lyginant jį su palyginamuoju tirpalu esant 407 nm bangos ilgiui.

Kalibracinis grafikas sudaromas naudojant rutino standartą. Rutino tirpalų koncentracijų ribos: [0,03125–0,5 mg/ml]. Gauti rezultatai įvertinami pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:

y = 1,393x - 0,0103; R

= 0,9992

Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) gramui sausos augalinės žaliavos ir apskaičiuojamas taikant formulę:

X =

𝑚

(mg RE/g)

c – rutino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės V – ištraukos tūris (ml)

a – skiedimas

m – sausos žaliavos masė (g)

2.5.3 Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS metodu

UV–regimosios šviesos metodu antiradikalinis aktyvumas nustatomas naudojant ABTS reagentą [53].

Motininio ABTS tirpalo paruošimas. Tamsaus stiklo buteliuke ruošiamas 2 mM koncentracijos ABTS tirpalas. Analitinėmis svartyklėmis atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių, jie ištirpinami 50 ml distiliuoto vandens, į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato. Mišinys sumaišomas ir paliekamas tamsoje 16 val. Po 16 val. yra gaminamas darbinis ABTS tirpalas.

Darbinio ABTS tirpalo paruošimas. Darbinis ABTS tirpalas yra ruošiamas motininį ABTS tirpalą praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki 0,8±0,03 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo.

Tiriamojo tirpalo paruošimas. Tiriamasis tirpalas gaminamas sumaišant 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir pridėjus 20 µl raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukos. Gautas mišinys 1 valandą laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Po 1 valandos spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos dydis esant 734 nm bangos ilgiui. Absorbcijos pokytis apskaičiuojamas iš darbinio ABTS tirpalo absorbcijos dydžio atėmus tiriamojo tirpalo absorbcijos dydį.

Kalibracinis grafikas sudaromas naudojant trolokso standartą. Trolokso tirpalų koncentracijų ribos: [50–800 µmol/l]. Kalibracinė kreivė braižoma apskaičiavus absorbcijos pokyčius (0,800 - A). Gauti rezultatai įvertinami pagal trolokso kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:

y = 0,0002x + 0,0226; R

_{= 0,9991}

Antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEABTS) gramui sausos augalinės žaliavos ir apskaičiuojamas taikant formulę:

X =

𝑚

(µmol TE/g)

c – trolokso koncentracija (µmo/l), nustatyta iš kalibracinės kreivės V – ištraukos tūris (l)

a – skiedimas

m – sausos žaliavos masė (g)

2.5.4 Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas FRAP metodu

Raukšlėtalapių erškėčių ėminių redukcinis aktyvumas įvertintas spektrofotometriniu metodu pagal Benzie ir Strain (1996) metodiką [54]. Pirmiausia yra paruošiami reagentai, kurie bus naudojami darbinio FRAP reagento gamyboje:

1. 300 mM acetatinis buferis. Atsveriama 3,1 g natrio acetato, suberiama į 1000 ml matavimo kolbą, pilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymos.

2. 10 mM TPTZ tirpalas. Į 50 ml distiliuoto vandens įpilama 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties. Gaunamas 40 mM druskos rūgšties tirpalas. Jame ištirpinama 0,1562 g TPTZ miltelių. Gaunamas 10 mM TPTZ tirpalas.

3. 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas. 50 ml distiliuoto vandens yra ištirpinama 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato.

Darbinio FRAP reagento paruošimas. Darbinis FRAP reagentas yra gaunamas sumaišius 300 mM acetatinį buferį, 10 mM TPTZ tirpalą ir 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalą santykiu 10:1:1.

Tiriamojo tirpalo paruošimas. Į 3 ml darbinio FRAP reagento yra įpilama 20 µl tiriamosios raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukos. Gautas mišinys 1 valandą laikomas tamsoje, kambario temperatūroje.

Palyginamojo tirpalo paruošimas. Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, kaip tiriamasis tirpalas, tačiau vietoje 20 µl tiriamosios raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukos yra pilama 20 µl tirpiklio (70 proc. (v/v) etanolio). Gautas mišinys 1 valandą laikomas tamsoje, kambario temperatūroje.

Po 1 valandos spektrofotometru yra išmatuojamas tiriamojo mišinio absorbcijos dydis esant 593 nm bangos ilgiui.

Kalibracinis grafikas sudaromas naudojant trolokso standartą. Trolokso tirpalų koncentracijų ribos: [500–8000 µmol/l]. Gauti rezultatai įvertinami pagal trolokso kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:

y= 0,0003x - 0,0713; R

_{= 0,9993}

Redukcinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEFRAP)

gramui sausos augalinės žaliavos ir apskaičiuojamas taikant formulę:

X =

𝑚

(µmol TE/g)

c – trolokso koncentracija (µmo/l), nustatyta iš kalibracinės kreivės V – ištraukos tūris (l)

a – skiedimas

m – sausos žaliavos masė (g)

2.5.5 Ultra–efektyviosios

skysčių

chromatografijos

– tandeminės masių

spektrometrijos metodika

Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų fenolinių junginių ir chino rūgšties kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui pritaikyta mokslinėje literatūroje aprašyta ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos–tandeminės masių spektrometrijos (UESC–MS/MS) metodika [55].

2.6 Tyrimo duomenų analizė

Tyrimo duomenų statistinė analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Excel 2016“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 17.0“ („IBM“, JAV). Visi tyrimų matavimai atlikti po 3 kartus, rezultatai išreikšti įvertinus gautų tyrimo rezultatų aritmetinius vidurkius ir standartinius nuokrypius. Koreliacijos įvertintos naudojant Pirsono koreliacijos koeficientą. Vienfaktorinė dispersinė analizė ANOVA taikyta lyginamųjų duomenų statistinio reikšmingumo įvertinimui. Statistiškai reikšmingi vidurkių skirtumai įvertinti naudojant daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų bendro fenolinių junginių

kiekio nustatymas

UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodas yra vienas dažniausiai augalinių ištraukų kiekybinės sudėties analizei naudojamų instrumentinių metodų. Folin–Ciocalteu metodas plačiai naudojamas nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį augalinėse ištraukose. Metodas pagrįstas junginių redukcijos principu. Tiriant augalines ištraukas šiuo metodu, susidariusių fenolinių junginių redukcijos produktų šviesos absorbcija išmatuojama spektrofotometriškai [56].

Bendras fenolinių junginių kiekis Lietuvoje augančių raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukose nustatytas Folin – Ciocalteu metodu [51]. Rezultatai pateikti 5 paveiksle.

5 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose, surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose. Skirtingos raidės žymi statistiškai

reikšmingus skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)

Skirtinguose Lietuvos regionuose surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose fenolinių junginių kiekis varijuoja nuo 76,83±2,84 mg GRE/g iki 153,93±4,51 mg GRE/g. Analizuojant tyrimo rezultatus, apskaičiuota, kad vidutinis bendras fenolinių junginių kiekis Lietuvos klimato sąlygomis augančių raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose – 108,82±4,76 mg GRE/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis (153,93±4,51 mg GRE/g) nustatytas Palangos kopose surinktų

d, c a a,b a,b,c a c,d a,b b,c c,d f e f e e f 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 B endra s feno lin ių jun gini ų k iek is , m g G RE /g

raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose. Mažesni fenolinių junginių kiekiai nustatyti Birštone, miško pakraštyje (140,92±5,59 mg GRE/g) ir Plikiškių kaimo (Joniškio raj.) laukuose (139,08±2,58 mg GRE/g) surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose. Šiose trijose augavietėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose fenolinių junginių kiekis statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Mažiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių, surinktų Kauno miesto Kleboniškio miško pakraštyje, Veprių miestelyje (Ukmergės raj.), Totoriškių kaime (Trakų raj.), Jūrės kaime (Kazlų rūdos sav.), Vaičaičių kaime (Raseinių raj.), ištraukose. Šiose penkiose vietovėse surinktų natūraliai augančių raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose nustatyti fenolinių junginių kiekiai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p<0,05). Kleboniškio miško pakraštyje surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose fenolinių junginių kiekis buvo beveik du kartus mažesnis už Palangos kopose nustatytą raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų fenolinių junginių kiekį. Nustatyta, kad skirtinguose Lietuvos regionuose rinktų erškėčių žiedų ėminių ištraukose fenolinių junginių kiekis įvairuoja. Įvairavimui įtakos galėjo turėti raukšlėtalapių erškėčių augavietės geografinė padėtis, žydėjimo stadija, oro sąlygos, žiedų nuėmimo laikas ir kiti veiksniai.

Gautus rezultatus svarbu palyginti su kitų mokslininkų skelbiamais duomenimis. Mokslininkai nurodo, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedlapių ėminiuose bendras fenolinių junginių kiekis yra 107,4 mg GRE/g [32]. Kiti mokslininkai nustatė, kad Kinijoje augančių raukšlėtalapių erškėčių žiedai kaupia 312,21±4,22 mg GRE/g fenolinių junginių [57]. Šis kiekis yra 3 kartus didesnis už mūsų tirtuose raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose nustatytą bendrą fenolinių junginių kiekį. Skirtumams įtakos galėjo turėti įvairūs veiksniai: augalo vegetacijos tarpsnis, geografinė padėtis, klimato sąlygos, dirvožemio cheminė sudėtis, skirtingos ėminių ekstrakcijos metodikos.

3.2 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų bendro flavonoidų kiekio

nustatymas

Lietuvoje augančių raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukų flavonoidų kiekio nustatymui buvo taikomas UV−regimosios šviesos spektrofotometrijos metodas, pritaikant reakciją su aliuminio chloridu [52]. Gauti tyrimų rezultatai pateikti 6 paveiksle.

6 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminiuose, surinktuose skirtinguose Lietuvos regionuose. Skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus

skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)

Atlikus tyrimą nustatyta, kad skirtinguose Lietuvos regionuose surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose flavonoidų kiekis varijuoja nuo 12,26±1,23 mg RE/g (Plikiškių kaime, Joniškio raj.) iki 19,67±1,40 mg RE/g (Palangos kopose). Nustatytas vidutinis flavonoidų kiekis raukšlėtalapių erškėčių žiedų ištraukose – 15,94±1,19 mg RE/g. Didžiausi flavonoidų kiekiai nustatyti raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių, surinktų Palangos kopose, Mergežerio kaime (Varėnos raj.), pamiškėje, Vazgaikiemio kaime (Prienų raj.) pakelėje, Orijos kaime (Kalvarijos sav.) pamiškėje prie sodybos, Skaudvilės miestelyje (Tauragės raj.) pakelėje, Ventos miestelyje (Akmenės raj.) paupyje, Totoriškių kaime (Trakų raj.) paupyje ir Žirgėnų kaime (Vilkaviškio raj.) pakelėje, ištraukose. surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose nustatyti flavonoidų kiekiai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Mažiausi flavonoidų kiekiai nustatyti Plikiškių kaimo (Joniškio raj.) laukuose, Veprių miestelyje (Ukmergės raj.) prie sodybos, Jūrės kaime (Kazlų rūdos sav.) miške, prie geležinkelio bėgių, Kaune, Kleboniškio miško pakraštyje, Vaičaičių kaime (Raseinių raj.) pamiškėje, Vilkaviškyje, sodų bendrijoje ir Birštone, miško pakraštyje, surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose. Šiose augavietėse surinktuose raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose nustatyti flavonoidų kiekiai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05).

Palyginus mūsų tyrimų rezultatus su kitų mokslininkų tyrimų rezultatais pastebėta, jog Lietuvos klimato sąlygomis auginamų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose nustatytas ženkliai didesnis bendras flavonoidų kiekis. Užsienio mokslininkų tyrimo duomenimis, bendras flavonoidų kiekis raukšlėtalapių erškėčių žieduose varijuoja nuo 3,56 iki 8,88 mg RE/g [32].

a,b,c c,d,e a,b,c,d,e d,e b,c,d,e a,b,c,d b,c,d,e a,b a,b,c,d a b,c,d,e e a,b,c a,b d,e 0 5 10 15 20 25

Raukšlėtalapių erškėčių augavietė

B endra s fla vo no idų k iek is , m g RE /g

3.3 Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų antiradikalinio aktyvumo in

vitro nustatymas

Tyrimo metu nustatytas raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių antiradikalinis aktyvumas UV– regimosios šviesos spektrofotometriniu ABTS metodu [53]. Šis metodas yra nesudėtingas, greitai atliekamas ir pasižymi geru atkartojamumu.

Analizuojant atlikto tyrimo rezultatus, nustatyta, kad raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų antiradikalinis aktyvumas varijuoja nuo 1,45±0,16 mmol TE/g iki 2,99±0,15 mmol TE/g. Tyrimo rezultatai pateikiami 7 paveiksle.

7 pav. Raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių, surinktų skirtinguose Lietuvos regionuose, ištraukų antiradikalinio aktyvumo in vitro įvairavimas. Skirtingos raidės žymi statistiškai patikimus

skirtumus tarp tiriamųjų bandinių (n=3, p<0,05)

Vidutinis nustatytas raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukų antiradikalinis aktyvumas – 2,10±0,15 mmol TE/g. Stipriausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas ištyrus raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių, surinktų Vilkaviškyje, sodų bendrijoje ir Vazgaikiemio kaime (Prienų raj.), pakelėje, ištraukas (atitinkamai 2,99±0,15 mmol TE/g ir 2,35±0,16 mmol TE/g). Šiose dviejose augavietėse surinktų raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių ištraukose nustatytas antiradikalinis aktyvumas statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Silpniausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas ištyrus raukšlėtalapių erškėčių žiedų ėminių, surinktų Kaune, Kleboniškio miško pakraštyje, Totoriškių kaime (Trakų raj.), paežerėje, Jūrės miestelyje (Kazlų rūdos sav.), pamiškėje, prie geležinkelio bėgių, Vaičaičių kaime

d,e,f,g b,c,d,e a,b a,b _a c,d,e,f a,b,c a,b a,b,c,d e,f,g h d,e,f,g g,h a,b,c f,g 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

Raukšlėtalapių erškėčių augavietė

An tira d ik a li n is a k ty v u m a s, m m o l TE/g