FARMACIJOS FAKULTETAS
MEDICINOS FAKULTETAS
FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS
EGLĖ SVITOJŪTĖ
EKSPERIMENTINIO NEFROTOKSIŠKUMO MODELIO IN VIVO
SUKŪRIMAS IR JO TAIKYMAS KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ
TYRIMUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. Romaldas Mačiulaitis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS
FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
EKSPERIMENTINIO NEFROTOKSIŠKUMO MODELIO IN VIVO SUKŪRIMAS IR JO TAIKYMAS KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ TYRIMUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Romaldas Mačiulaitis 2012 05 21
Recenzentas
Prof. Edgaras Stankevičius 2012 05 21
Darbą atliko
Magistrantė Eglė Svitojūtė 2012 05 21
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Ūminis inkstų pažeidimas ... 11
1.1.1. Ūminio inkstų pažeidimo epidemiologija ir baigtys ... 11
1.1.2. Ūminio inkstų pažeidimo etiologija ... 12
1.2. Ūminis inkstų funkcijos nepakankamumas ... 13
1.2.1. Ūminio inkstų funkcijos nepakankamumo epidemiologija ir baigtys ... 13
1.2.2. Ūminio inkstų funkcijos nepakankamumo etiologija ... 14
1.3. Ūminio inkstų pažeidimo modeliavimas ... 15
1.4. Bendrieji eksperimentinių modelių su gyvūnais kūrimo principai ... 15
1.5. Eksperimentinių nefrotoksiškumo modelių su gyvūnais kūrimo principai ... 16
1.6. Eksperimentinių nefrotoksiškumo modelių klasifikacija ... 16
1.7. Nefrotoksiškumo modeliai in vitro ... 17
1.8. Nefrotoksiškumo modeliai in vivo ... 18
1.8.1. Toksinio ūminio inkstų pažeidimo modeliai in vivo ... 18
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1. Laboratoriniai gyvūnai ir jų laikymo sąlygos ... 22
2.2. Pasirengimas eksperimentui ... 23
2.3. Inkstų pažeidimo modelis ... 23
2.3.1. Kontrolinės ir tiriamųjų grupių sudarymas ... 24
2.3.2. Fiziologinių rodiklių vertinimas ... 26
2.3.3. Elgesio rodiklių vertinimas ... 27
2.3.4. Biocheminių rodiklių vertinimas ... 27
2.3.5. Frakcinės ekskrecijos rodiklių vertinimas ... 28
2.3.6. Glomerulų filtracijos greičio vertinimas ... 29
2.4. Nefrotoksiškumo modelio pritaikomumo kamieninių ląstelių tyrimuose įvertinimas ... 31
2.4.1. Bandomasis tyrimas ... 31
2.4.2. Raumeninės kilmės kamieninių ląstelių išskyrimas ... 31
2.5. Statistinė duomenų analizė ... 32
3. REZULTATAI ... 33
3.1. Laboratorinių gyvūnų imtis ir charakteristika ... 33
3.2. Fiziologiniai rodikliai ... 33 3.2.1. Svoris ... 33 3.2.2. Vandens kiekis ... 35 3.2.3. Pašaro kiekis ... 36 3.2.4. Diurezė ... 37 3.3. Elgesio rodikliai ... 38 3.4. Biocheminiai rodikliai ... 39
3.4.1. Biocheminiai šlapimo rodikliai ... 39
3.4.2. Biocheminiai kraujo serumo rodikliai ... 41
3.5. Frakcinės ekskrecijos rodikliai ... 42
3.6. Glomerulų filtracijos greičio rodikliai ... 43
3.7. Biocheminių, frakcinės ekskrecijos ir glomerulų filtracijos greičio rodiklių prognostinė vertė ... 44
3.8. Histologiniai inkstų rodikliai ... 47
3.9. Sukurto nefrotoksiškumo modelio pritaikomumo kamieninių ląstelių tyrimuose įvertinimas ... 50
4. IŠVADOS ... 51
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 52
E. Svitojūtės magistro baigiamasis darbas. Eksperimentinio nefrotoksiškumo modelio in vivo sukūrimas ir jo taikymas kamieninių ląstelių tyrimuose. Mokslinis vadovas prof. R. Mačiulaitis. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, Fiziologijos ir farmakologijos institutas, Kaunas 2012.
Pagrindinis tyrimo tikslas buvo sukurti eksperimentinį nefrotoksiškumo modelį in vivo ir įvertinti jo pritaikomumą ikiklinikiniuose kamieninių ląstelių tyrimuose. Nefrotoksiškumo modeliui parinkti 9–12 sav. amžiaus Wistar linijos žiurkių patinai. Eksperimento metu gyvūnai buvo laikomi individualiuose metaboliniuose narvuose esant pastovioms aplinkos sąlygoms. Inkstų pažeidimui sukelti parinktas gentamicino sulfato injekcinis tirpalas 40mg/1ml, kai jo dozė 80 mg/kg/d i. p. 7 dienas.
Sudarytos trys laboratorinių gyvūnų grupės: I – kontrolinė grupė (1.5 ml 0.9 proc. NaCl tirpalo injekcijos i. p. 14 dienų), II – terapinė grupė (gentamicino injekcijos i. p. 14 dienų, dozė 5 mg/kg/d), III – pažeidimo grupė (gentamicino injekcijos i. p. 7 dienas, dozė 80 mg/kg/d). Vertinti žiurkių fiziologiniai, elgesio, biocheminiai šlapimo ir kraujo, frakcinės ekskrecijos, glomerulų filtracijos greičio ir histologiniai inkstų rodikliai. Visi rodikliai lyginti tarp trijų grupių.
Laboratoriniams gyvūnams paskirta toksinė gentamicino dozė i. p. 80 mg/kg/d 7 dienas iš eilės sukėlė funkcinius ir morfologinius inkstų pokyčius, t. y. ūminį inkstų funkcijos pažeidimą, kurio pasireiškimą statistiškai patikimai (p<0.05) atspindėjo fiziologiniai, elgesio, biocheminiai kraujo ir šlapimo, frakcinės ekskrecijos, glomerulų filtracijos greičio ir histologiniai inkstų rodikliai lyginant su tais pačiais kontrolinės ir terapinės grupių žiurkių rodikliais.
Sukurtas nefrotoksiškumo modelis pritaikytas bandomojo (pilotinio) tyrimo metu. III grupės žiurkėms praėjus parai po paskutinės gentamicino injekcijos paskirta išskirtų ir kultivuotų raumeninės kilmės kamieninių ląstelių injekcija i. p. (dozė – 150–200 tūkst. ląstelių injekcijoje). Nustatyta geresnė inkstų regeneracija žiurkėms, kurioms buvo skirta kamieninių ląstelių injekcija. Remiantis atlikto bandomojo tyrimo, kurio metu buvo taikyta sukurto nefrotoksiškumo modelio metodika, rezultatais, galima vertinti šį modelį kaip pritaikomą ikiklinikiniuose kamieninių ląstelių tyrimuose.
SUMMARY
Master thesis of E. Svitojute. Development of Experimental Nephrotoxicity Model in vivo and Its’ Application to Stem Cells Research. Scientific supervisor prof. R Maciulaitis. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Medicine, Institute of Physiology and Pharmacology. Kaunas 2012.
The main objective of this study was to develop experimental nephrotoxicity model in vivo and to assess its’ applicability for stem cell research. 9–12 weeks old male Wistar rats were chosen for the establishment of this model. During the experiment rats were housed in individual metabolic cages and maintained under standard conditions. Gentamicin sulphate solution for injection (40mg/1ml) was chosen as a toxicant. Toxic dose – genamicin 80 mg/kg/d i. p. for 7 consecutive days.
3 groups were constituted for the study: I group – control group (i. p. injection of saline 1.5 ml for 14 consecutive days), II group – therapeutic group (i. p. injection of genamicin 5mg/kg/d for 14 consecutive days), III group – acute kidney injury group (i. p. injection of genamicin 80mg/kg/d for 7 consecutive days). We evaluated physiological parameters, behavioural parameters, biochemical urine and blood parameters, fractional excretion parameters, glomerular filtration rate and histological kidney parameters. All parameters were compared between groups.
Gentamicin administration in a very high dose (80 mg/kg/d i. p. for 7 consecutive days) caused functional and morphological renal changes and induced acute kidney injury, which was marked by statistically significant changes of physiological, behavioural, biochemical, fractional excretion, glomerular filtration rate and histological parameters, comparing with the same parameters of control and therapeutic groups.
Nephrotoxicity model was applied for the pilot experiment with stem cells. Isolated and cultured muscle derived stem cell i. p. injection (dose – 150.000–200.000 cell/injection) was administrated to III group rats 24 hours after last gentamicin injection. In the end of the pilot experiment stem cell injection demonstrated the influence on better kidney regeneration. Data collected during the pilot experiment demonstrates the applicability of the established nephrotoxicity model for preclinical stem cell research.
Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems ir prisidėjusiems atliekant mokslinius tyrimus ir rengiant magistro darbą. Dėkoju savo darbo vadovui prof. Romaldui Mačiulaičiui, už visokeriopą pagalbą, patarimus ir stiprią motyvaciją. Dėkoju gydytojui–rezidentui Justinui Mačiulaičiui už nuolatinį bendradarbiavimą bei indėlį atliekant kamieninių ląstelių išskyrimą ir kultivavimą. Taip pat dėkoju LSMU VA Anatomijos ir fiziologijos katedros vedėjai prof. Juditai Žymantienei bei katedros kolektyvui, LSMU VA Neužkrečiamųjų ligų katedros doc. Gintarui Daunorui, už pagalbą atliekant eksperimentinius tyrimus. Dėkoju LSMU MA Fiziologijos ir farmakologijos instituto vadovui prof. Edgarui Stankevičiui už suteiktą galimybę atlikti magistro darbą šiame Universiteto padalinyje.
SANTRUMPOS
A – gentamicino injekcinio tirpalo dozė mg, kurią reikia sušvirkšti
ATC – anatominė terapinė cheminė vaistų klasifikacija (angl. Anatomical Therapeutic Chemical Classification System)
AUC – plotas po kreive (angl. area under the curve) CCr – kreatinino klirensas (ml/min.)
D – GM injekcinio tirpalo dozė mg/kg/d
DMEM – Dulbecco modifikuota DME terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle Medium – DMEM) FBS – fetalinis veršelio serumas (angl. FBS – fetal bovine serum)
FEK – frakcinė kalio jonų ekskrecija proc. (angl. fractional excretion of potassium)
FENa – frakcinė natrio jonų ekskrecija proc. (angl. fractional excretion of sodium)
FEP – frakcinė fosforo jonų ekskrecija proc. (angl. fractional excretion of phosphate)
g/granul. – gramai granulėje g/kg – gramai kilograme
GFG – glomerulų filtracijos greitis ml/min (angl. glomerular filtration rate – GFR) GM – gentamicinas
granul./24val. – suvartotas granulių kiekis per parą i. m. – į raumenis (angl. intramuscular)
i. p. – į pilvo ertmę (angl. intraperitoneal) KL – kamieninės ląstelės (angl. stem cells) KMUK – Kauno medicinos universiteto klinikos L–NAME – L – nitroarginino metilo esteris m – žiurkės masė kilogramais
mg/kg – miligramai kilogramui kūno masės
mg/kg/d – dozė miligramais kilogramui kūno masės per dieną (24 val.) mg/ml – miligramai mililitre
ml/24val. – mililitrai per parą
ml/kg – mililitrai kilogramui kūno masės
ml/kg/val. – mililitrai kilogramui kūno masės per valandą ml/min. – mililitrai per minutę
PBS – fosfatinis buferinis tirpalas (angl. Phosphate buffered saline) Ph. Eur. – Europos farmakopėja
RKKL – raumens kilmės kamieninės ląstelės (angl. Muscle derived stem cells – MDSC) ROC – gavėjo veiklos charakteristika (angl. Receiver Operating Characteristics) s. c. – į poodį (angl. subcutaneous)
SCr – kreatinino koncentracija kraujo serume (μmol/l)
SD – standartinis nuokrypis (angl. Standard deviation) SK – kalio jonų koncentracija kraujo serume (mmol/l)
SNa – natrio jonų koncentracija kraujo serume (mmol/l)
SP – fosforo jonų koncentracija kraujo serume (mmol/l)
UCr – kreatinino koncentracija šlapime (μmol/l)
ŪIFN – ūminis inkstų funkcijos nepakankamumas ŪIP – ūminis inkstų pažeidimas
UK – kalio jonų koncentracija šlapime (mmol/l)
UNa – natrio jonų koncentracija šlapime (mmol/l)
UP – fosforo jonų koncentracija šlapime (mmol/l)
VGM5 – gentamicino injekcinio tirpalo (40mg/1ml) tūris ml, kurį reikia sušvirkšti, kai gentamicino
dozė 5 mg/kg/d
VGM80 – gentamicino injekcinio tirpalo (40mg/1ml) tūris ml, kurį reikia sušvirkšti, kai
gentamicino dozė 80 mg/kg/d
VGMD – gentamicino injekcinio tirpalo (40mg/1ml) tūris ml, kurį reikia sušvirkšti, kai gentamicino
dozė D mg/kg/d
VU/24val. – šlapimo kiekis (ml/24val.)
ĮVADAS
Ūminis inkstų pažeidimas (ŪIP) – dažna ir grėsminga sveikatos būklė, kurios etiologija gali būti įvairi. Inkstų pažeidimas yra viena dažniausiai pasireiškiančių ir viena dažniausiai mirtį sukeliančių nepageidaujamų reakcijų į vaistus (NRV). Taip pat ŪIP dažnai yra lydimas sunkių širdies ir kraujagyslių, kvėpavimo, virškinimo, nervų sistemos komplikacijų, infekcijų. 30–60 proc. pacientų, išgyvenusių ŪIP inkstų funkcija tampa normali, 25–50 proc. pacientų ji atsistato iš dalies, o apie 10–15 proc. pacientų vystosi lėtinis inkstų funkcijos nepakankamumas.
Pacientų išgyvenusių ŪIP prognozės yra gana neblogos, tačiau mirtingumo rodikliai dėl šio sveikatos sutrikimo yra blogi ir gali siekti net 60 proc. [14, 32, 71]. Pacientams, kuriems ŪIP pereina į lėtinį inkstų funkcijos nepakankamumą, pagrindiniai taikomi gydymo metodai yra pakaitinė inkstų terapija (hemodializė, hemofiltracija, hemodiafiltracija) ir inkstų transplantacija. Tiek pakaitinės inkstų terapijos, tiek inkstų transplantacijos
Šiuo metu visame pasaulyje plačiai atliekami kamieninių ląstelių (KL) tyrimai žada gerų rezultatų regeneracinėje medicinoje. KL preparatai ateityje turėtų atlikti svarbų vaidmenį gydant struktūrinius bei funkcinius organų pažeidimus. KL terapija – vienas perspektyviausių ŪIP gydymo bei lėtinio inkstų nepakankamumo prevencijos būdų. Norint plėtoti tyrimus šioje srityje būtina sukurti ir pritaikyti tinkamą inkstų pažaidos modelį in vivo, kurio rezultatai ateityje galėtų būti pagrindu klinikiniams tyrimams atlikti.
Pagrindinis šio darbo tikslas – sukurti eksperimentinį nefrotoksiškumo modelį in vivo ir įvertinti jo pritaikomumą ikiklinikiniuose kamieninių ląstelių tyrimuose.
DARBO TIKSLAS
Sukurti eksperimentinį nefrotoksiškumo modelį in vivo ir įvertinti jo pritaikomumą ikiklinikiniuose kamieninių ląstelių tyrimuose.
1. Atlikus literatūros analizę parinkti tinkamiausius laboratorinius gyvūnus, optimalias sąlygas jų laikymui bei stebėjimui, parinkti tinkamą toksikantą ir optimalią jo dozę, kuri sukeltų maksimalų neletalų inkstų funkcijos pažeidimą, pasireiškiantį funkciniais ir morfologiniais žiurkių inkstų pokyčiais;
2. Nustatyti ir įvertinti laboratorinių gyvūnų fiziologinius, elgesio, biocheminius kraujo ir šlapimo, frakcinės ekskrecijos, glomerulų filtracijos greičio ir histologinius inkstų rodiklius bei jų pakitimus skirtinguose sukurto nefrotoksiškumo modelio etapuose;
3. Įvertinti sukurto nefrotoksiškumo modelio pritaikomumą ikiklinikiniuose kamieninių ląstelių tyrimuose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Ūminis inkstų pažeidimas
Ūminis inkstų pažeidimas (ŪIP) – tai polietiologinis klinikinis sindromas, kuris pasireiškia staigiu svarbiausių inkstų funkcijų sutrikimu ir gali komplikuotis į ūminį inkstų funkcijos nepakankamumą (ŪIFN). Dėl ŪIP sutrinka normali organizmo homeostazė: paros diurezė tampa mažesnė nei 1 ml/kg/val., organizme susilaiko azotinės medžiagos, sutrinka vandens, elektrolitų, rūgščių ir šarmų pusiausvyra, pasireiškia ūmi ureminė intoksikacija [8, 52].
1.1.1. Ūminio inkstų pažeidimo epidemiologija ir baigtys
ŪIP yra dažna ir grėsminga sveikatos būklė, kuri literatūros duomenimis pasireiškia 3–23 proc. hospitalizuotų pacientų [4, 40, 44, 75], 23–45 proc. pacientų, gydomų intensyvios terapijos skyriuose [24, 31, 39]. ŪIP pasireiškimo dažnis sparčiai auga dėl didėjančio diabeto, širdies ir kraujagyslių ligų atvejų skaičiaus, didėjančio kontrastinių medžiagų naudojimo medicinoje, ilgėjančios vidutinės gyvenimo trukmės [30]. Remiantis JAV inkstų duomenų bazės (angl. US Renal Data System – USRDS) pateikiamais
duomenimis, metinis ŪIP pasireiškimo dažnis bendroje populiacijoje tenkantis 100,000 gyventojų 2009 m. buvo 522 žmonės [73].
Mirštamumo rodikliai nuo ŪIP yra gana aukšti ir įvairių autorių duomenimis gali svyruoti nuo 20 iki 60 proc. [9, 14, 24, 32, 39, 44, 65, 71,]. ŪIP išgyvenusiems pacientams galimos baigtys yra visiškas inkstų funkcijos atsistatymas, dalinis inkstų funkcijos atsistatymas ar lėtinis inkstų funkcijos nepakankamumas, reikalaujantis pakaitinės inkstų terapijos ir inkstų transplantacijos.
1.1.2. Ūminio inkstų pažeidimo etiologija
ŪIP nėra vienalypis sutrikimas. Jis apima daugybę klinikinių reiškinių, apibūdinančių ūmiai prasidedančią inkstų disfunkciją, kurią sukelia gausybė išeminių, toksinių ir uždegiminių faktorių. Šie faktoriai gali sukelti ŪIP veikdami kartu arba atskirai. Taip pat skiriasi individų polinkis ŪIP pasireikšti veikiant sąlyginai panašiems etiologiniams veiksniams. Tai parodo predisponuojančių faktorių svarbą ŪIP pasireiškimui, įskaitant genetinį polinkį ir įgytas gretutines ligas [54]. ŪIP etiologiniai veiksniai yra skirstomi į prerenalinius, renalinius ir postrenalinius [37, 53, 66].
Prerenaliniai ŪIP etiologiniai veiksniai – tai tokie veiksniai, kurie lemia inkstų kraujotakos sumažėjimą (hipoperfuziją). Prerenaliniais ŪIP etiologiniai veiksniais gali būti cirkuliuojančio kraujo tūrio sumažėjimas (nukraujavimas, vėmimas, viduriavimas, gastroenteritas, diabetas, sepsis, nefrozinis sindromas, nudegimas), širdies funkcijos sutrikimas (kongestinė kardiomiopatija, perikarditas, širdies tamponada, įgimtų širdies ydų operacinė korekcija, kt.). Dėl užsitęsusios inkstų hipoperfuzijos ir išemijos gali būti pažeisti inkstų kanalėliai. Tuomet prerenalinis ŪIP gali pereiti į renalinį [37, 53, 66].
Renaliniai ŪIP etiologiniai veiksniai – tai tokie veiksniai, kurie tiesiogiai veikia ir pažeidžia inkstų funkcinį vienetą – nefroną. Renaliniais ŪIP etiologiniai veiksniais gali būti ūminė kanalėlių nekrozė, kuri pasireiškia dėl užsitęsusios šokinės būklės, vaistų poveikio (aminoglikozidų, cisplatinos, acetaminofeno, nesteroidinių vaistų nuo uždegimo), toksinų poveikio (etilenglikolio, metanolio, grybų nuodų, sunkiųjų metalų), pigmenturijos atsiradusios dėl hemolizės ar rabdomiolizės (raumeninių skaidulų irimo). Taip pat renaliniais ŪIP etiologiniais veiksniais gali būti medikamentinis ar idiopatinis intersticinis nefritas, šlapimo rūgšties sukelta nefropatija, glomerulonefritai, inkstų kraujagyslių pakenkimas, infekciniai faktoriai (pielonefritas, sepsis) [37, 53, 66].
stenozė), augliai, inkstų akmenligė [37, 53, 66].
1.2. Ūminis inkstų funkcijos nepakankamumas
ŪIFN – ypač grėsmingas klinikinis sindromas, kurio pirmieji inkstų pažeidimo požymiai pasireiškia tik kai inkstų funkcija sumažėja daugiau kaip 80 proc. Esant pradinei inkstų pažeidimo stadijai, pasireiškus ŪIP, atsiranda trijų skirtingų formų ląstelių pažaida: subletalus pažeidimas, lemiantis ląstelių depoliarizaciją (kartu ir atitinkamą ląstelių funkcijų praradimą), ląstelių mirtis dėl apoptozės ir ląstelių mirtis dėl nekrozės [36, 62, 70]. Ląstelių pažaida ir užsitęsęs nefrotoksiškumą sukeliančio veiksnio poveikis lemia ŪIFN vystymąsi. ŪIFN pagal pasireiškiančius klinikinius simptomus yra skirstomas į keturias stadijas: pradinę, oligurijos, poliurijos ir sveikimo.
Pradinėje stadijoje (dar vadinama preoligurijos stadija) inkstų pažeidimą sąlygoja žalojančio veiksnio poveikis. Stadija tęsiasi 1–2 paras, dominuoja pagrindinės ligos simptomai, inkstuose vykstantys pokyčiai nėra pastebimi ar išreikšti klinikiniais požymiais. Oligurijos stadija išsivysto po 3–5 dienų ir tęsiasi apie 10–14 dienų. Šios stadijos metu pacientų diurezė būna mažesnė kaip 400 ml/24val. (arba mažesnė nei 1 ml/kg/val.). Oligurijos stadijos metu pasireiškia šie klinikiniai simptomai: uremija, astenija, apatija, pakitusi psichika, sutrikęs miegas (CNS pažeidimo simptomai), metabolinė acidozė, hiperhidratacija, hiperkalemija, kitų elektrolitų disbalansas, kraujavimai iš virškinamojo trakto, mažakraujystė. Poliurijos stadija tęsiasi apie 7–10 dienų. Jos metu didėja diurezė, mažėja šlapimo santykinis tankis, dėl žymiai padidėjusios diurezės gali išsivystyti dehidratacija, hipokalemija. Sveikimo stadija trunka ilgiausiai ir gali užsitęsti nuo 6 iki 12 mėn. Jos metu išnyksta uremija, pamažu atsistato inkstų funkcija (dažniausiai iki 80 proc. pradinio lygio), nemaža šlapimo organų sistemos infekcijų pasireiškimo galimybė [8, 52].
1.2.1. Ūminio inkstų funkcijos nepakankamumo epidemiologija ir baigtys
Lietuvoje nėra vieningo registro, rodančio nefrologinių ligų paplitimą. 2007 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje VšĮ. Kauno klinikose atliktas retrospektyvinis tyrimas, kurio metu vertintas
ŪIFN dažnis, priežastys ir baigtys per 1995–2006 metų laikotarpį. ŪIFN pasireiškimo dažnis per 12 metų išaugo daugiau nei 9 kartus, kaip pavaizduota 1 paveiksle. Tyrimo duomenimis iš 1653 pacientų, kuriems pasireiškė ŪIFN ir kurie buvo gydyti pakaitine inkstų terapija, dėl pagerėjusios inkstų funkcijos pakaitinė inkstų terapija nutraukta 46.9 proc. pacientų, 6.7 proc. pacientų išliko negrįžtamas inkstų nepakankamumas, 45.1 proc. pacientų mirė [65].
1 pav. Pacientų, sergančių ūminiu inkstų nepakankamumu (n=1653), skaičiaus kitimas (1995–2006 m.) [65]
Apytiksliai skaičiuojama, kad Lietuvoje 100,000 gyventojų tenka 30–35 dėl lėtinio inkstų nepakankamumo dializuojami pacientai. Kasmet atsiranda apie 150 naujų ligonių, kuriems yra būtina hemodializė [74].
1.2.2. Ūminio inkstų funkcijos nepakankamumo etiologija
Norint kuo efektyviau gydyti pacientus, kuriems pasireiškė ŪIFN, svarbu tiksliai nustatyti nefrotoksiškumą sąlygojančius veiksnius ir juos kuo greičiau pašalinti. Dažniausiai ŪIFN etiologija būna renalinės kilmės. 2007 m. atliktas retrospektyvinis tyrimas parodė, kad daugiau nei trečdaliui pacientų ŪIFN buvo sąlygojamas renalinių etiologinių veiksnių (2 pav.), iš kurių pagrindinis buvo ūminė kanalėlių nekrozė dėl inkstų išemijos, egzogeninių ir endogeninių toksinų poveikio (n=545, 84.4 proc.) [65].
2 pav. Ūminio inkstų nepakankamumo (n=1653) priežastys (1995–2006 m.)[65]
1.3. Ūminio inkstų pažeidimo modeliavimas
Norint diegti naujoves ir ieškoti naujų perspektyvių ŪIP gydymo bei ŪIFN prevencijos metodų, svarbu sukurti eksperimentinius modelius, kurie atkartotų ar sukurtų kuo panašesnės klinikines situacijas, kurių metu pasireiškia ŪIP. Tyrinėjant skirtingos etiologijos inkstų pažaidą, kuriami skirtingi nefrotoksiškumo modeliai, kurie leidžia prognozuoti galimą ŪIP eigą, baigtis bei tiriamų naujų gydymo metodų efektyvumą, pritaikomumą. Toliau apžvelgiami eksperimentinių modelių kūrimo principai bei sukurti nefrotoksiškumo modeliai, jų privalumai ir trūkumai.
1.4. Bendrieji eksperimentinių modelių su gyvūnais kūrimo principai
Planuojant, atliekant ir vertinant eksperimentinių tyrimų su gyvūnais modelius, būtina laikytis tam tikrų bendrųjų principų. Pradedant eksperimentą svarbi tinkama laboratorinių gyvūnų randomizacija į kontrolinę ir tiriamąją (intervencinę) grupes. Gyvūnų lytis, amžius ir laikymo sąlygos turėtų būti vienodos abiejose grupėse. Tyrimai su tiriamąja ir kontroline grupėmis turėtų būti atliekami vienu metu, siekiant išvengti rezultatų iškraipymo dėl gyvūnų charakteristikos ar aplinkos sąlygų skirtumų. Taip pat svarbu parinkti tinkamą gyvūnų skaičių į kiekvieną grupę, kuris leistų lengvai atkartoti konkretų modelį po tam tikro laiko. Turėtų būti apsvarstyti ir fiksuojami gyvūnų mirties atvejai.
Jei rezultatų vertinime galimas subjektyvumas (pavyzdžiui nėra tikslios reikšmės apibūdinančios tam tikrą rodiklį), tokius rezultatus reikėtų vertinti aklu principu, siekiant išvengti vertintojo subjektyvumo iš anksto žinant tiriamojo objekto grupę. Tokius rezultatus patartina vertinti keletą kartų tam pačiam tyrėjui, arba įtraukti antrą tyrėją objektyviam rezultatų įvertinimui. Eksperimentai su laboratoriniais gyvūnais turi būti atliekami gavus šalies atsakingos institucijos leidimą laikyti, prižiūrėti ir naudoti laboratorinius gyvūnus eksperimentams. Taip pat turi būti išduotas atsakingos šalies institucijos etikos komisijos leidimas vykdyti eksperimentus su gyvūnais. Modelio atkuriamumas kitose laboratorijose yra taip pat labai svarbus norint galutinai patvirtinti gautus tyrimo rezultatus. [50]
1.5. Eksperimentinių nefrotoksiškumo modelių su gyvūnais kūrimo principai
Inkstų struktūra ir funkcijos statistiškai patikimai skiriasi ne tik tarp gyvūnų rūšių, bet ir tarp veislių. Dėl to skiriasi ir žmonių bei gyvūnų jautrumas skirtingoms nefrotoksinėms medžiagoms. Šie skirtumai gali lemti skirtingą toksikantų metabolizmą, eliminacijos būdą bei greitį, dėl skirtingo imuninio atsako, skirtingo medžiagų transporto inkstų kanalėliuose. Taigi kuriant nefrotoksiškumo modelius in vivo turi būti įvertinti morfologiniai ir funkciniai šlapimo išskyrimo sistemų skirtumai tarp rūšių. Didelę įtaką daro ir tai, kad eksperimentiniams modeliams dažniausiai yra naudojami jauni ir sveiki gyvūnai, o ūminis inkstų pažeidimas dažniausiai pasireiškia vyresnio amžiaus ir ne viena gretutine liga sergantiems pacientams, todėl būtina atsižvelgti į galimas paklaidas ar nefrotoksiškumo modelių neatitikimą realioms klinikinėms situacijoms. [54]
1.6. Eksperimentinių nefrotoksiškumo modelių klasifikacija
Eksperimentiniai nefrotoksiškumo modeliai yra klasifikuojami atsižvelgiant į tyrimo objektą bei veiksnį, sukeliantį inkstų pažeidimą [54]. Eksperimentinių nefrotoksiškumo modelių klasifikacija pavaizduota 3 paveiksle.
3 pav. Eksperimentinių nefrotoksiškumo modelių klasifikacija
1.7. Nefrotoksiškumo modeliai in vitro
Inkstai yra kompleksinis organas, sudarytas iš įvairių skirtingų tipų ląstelių. Daugelio nefrotoksiškų medžiagų taikiniai yra vienas konkretus ląstelių tipas, todėl šios medžiagos neveikia kitų inkstų ląstelių. Toks toksikantų selektyvumas apsunkina nefrotoksiškumo vertinimą atliekant tyrimus in vivo. Dėl šios priežasties buvo sukurta įvairių nefrotoksiškumo modelių in vitro, kurie leidžia vertinti nefrotoksiškai veikiančių medžiagų ir jų ląstelių taikinių sąveiką bei patofiziologinius mechanizmus. Nefrotoksiškumo modelių in vitro tyrimų objektu gali būti izoliuotas perfuzuotas inkstas, inksto dalis, izoliuoti inkstų kanalėlių fragmentai, izoliuoti glomerulai ir inkstų ląstelių kultūros [54].
Nefrotoksiškumo modelių in vitro svarba atliekant įvairius tyrimus yra neabejotina. Nors yra nemažai atvejų, kai in vitro modeliai yra nepakeičiami, tačiau pagrindinis jų trūkumas yra tas, kad tyrimai in vitro negali imituoti ir atspindėti klinikinių būklių, pasireiškiančių žmonėms tam tikrų ligų eigos metu. Dėl šios priežasties nefrotoksiškumo modeliai in vitro toliau nebus plačiau aptariami.
1.8. Nefrotoksiškumo modeliai in vivo
Nefrotoksiškumo modeliai in vivo yra klasifikuojami atsižvelgiant į žmonių ŪIP pasireiškimo priežastis. Šiuos modelius galima skirstyti į tris dideles grupes:
Toksinio ŪIP modeliai (vienkartinės toksinės dozės, kartotinės toksinės dozės, kombinuoti modeliai);
Hipoksinio ŪIP modeliai (šilta išemija – reperfuzija, šalta išemija – šilta reperfuzija, prailginta inkstų hipoperfuzija, kardiopleginė viso kūno išemija);
Sepsinio ŪIP modeliai (lipopolisacharidų injekcija, mikroorganizmų infuzija/injekcija, aklosios žarnos ligatūravimas ir perforacija, bakterijų sėjimas į pilvo ertmę).
Ši klasifikacija nėra labai tiksli, nes tiek žmonėms, tiek gyvūnams nefrotoksiškumo modeliuose, dažniausiai pasireiškia mišrios etiologijos ŪIP, apimantis ne vieną patofiziologinį mechanizmą [54]. Dažnai ikiklinikiniuose tyrimuose in vivo yra taikomi toksinio ŪIP modeliai dėl patogumo tyrėjams, lengvos inkstų funkcijos pažeidimo atlikimo technikos, sąlyginai pigių tyrimų kaštų bei lengvo eksperimento atkuriamumo.
1.8.1. Toksinio ūminio inkstų pažeidimo modeliai in vivo
Inkstai pasižymi unikaliomis struktūrinėmis, fiziologinėmis ir biocheminėmis savybėmis, kurios lemia inkstų jautrumą įvairių toksikantų, tame tarpe ir vaistų, sukeliamiems nepageidaujamiems poveikiams. Inkstai yra aprūpinami neproporcingai dideliu kiekiu kraujo, lyginant su kitais organais, todėl žymiai išauga nefrotoksiškumo galimybė veikiant kraujyje cirkuliuojančioms toksinėms medžiagoms. Nefrotoksiškumą laboratoriniams gyvūnams galima sukelti įvairiais toksikantais taikant skirtingus inkstų pažeidimo modelius. Pagal toksikanto tipą ir injekcijų skaičių, reikalingą sukelti inkstų pažeidimui, nefrotoksiškumo modelius galima skirstyti į tris grupes [54]:
Vienkartinės toksinės dozės nefrotoksiškumo modeliai Kartotinės toksinės dozės nefrotoksiškumo modeliai Kombinuoti nefrotoksiškumo modeliai
Vienkartinės toksinės dozės nefrotoksiškumo modelių taikymas yra paplitęs dėl patogumo tyrėjams ir greitai sukeliamo inkstų pažeidimo. Tačiau norint gauti reikiamą efektą, ne visuomet pakanka vienintelės toksikanto dozės. Taip pat šie toksikantai dažniausiai nėra specifiški, pažeidžia ne vieną organų sistemą, yra pakankamai toksiški, todėl jų naudojimas reikalauja ypatingų atsargos priemonių eksperimentą atliekantiems tyrėjams. Toliau pateikiami vienkartinės toksinės dozės nefrotoksiškumo modelių pavyzdžiai.
1.8.1.1.1. Cisplatinos sukeltas ūminis inkstų pažeidimas
Cisplatina (Cisplatinum, Ph. Eur. 01/2008:0599; ATC: L01XA01) – stipriai veikiantis priešvėžinis vaistinis preparatas, platinos darinys, skirtas šlapimo pūslės, sėklidžių, kiaušidžių vėžiui ir kitiems susirgimams gydyti [16]. Tiesioginis toksiškumas inkstų kanalėliams yra vyraujantis patofiziologinis procesas, pasireiškiantis dėl cisplatinos poveikio, kai šis vaistinis preparatas yra absorbuojamas ir akumuliuojasi proksimaliniuose inkstų kanalėliuose [6]. Cisplatinos tirpalo injekcija laboratoriniams gyvūnams (dažniausiai pelėms ir žiurkėms) leidžiama į pilvo ertmę (i. p.), vienkartinė cisplatinos dozė, reikalinga inkstų pažeidimui sukelti, skirtingų tyrėjų duomenimis gali būti 4–16 mg/kg [3, 23, 38, 41, 46, 49, 57, 59, 72].
1.8.1.1.2. Gyvsidabrio sukeltas ūminis inkstų pažeidimas
Gyvsidabrio (II) chloridas (HgCl2) (Hydrargyri dichloridum, Ph. Eur. 01/2008:0120; ATC:
D08AK03) – vietinis antiseptikas ir dezinfektantas, skirtas paviršių dezinfekcijai [17]. Nors visos gyvsidabrio darinių formos gali sukelti inkstų pažeidimą, tačiau neorganiniai gyvsidabrio dariniai yra labiau nefrotoksiški nei organiniai. Neorganiniai gyvsidabrio junginiai laboratoriniams gyvūnams sukelia ŪIP ir greitą inkstų funkcijos sutrikimo pasireiškimą, dažniausiai per pirmąsias 24 valandas po vienkartinės injekcijos [79, 80]. Vienkartinė HgCl2 tirpalo injekcija laboratoriniams gyvūnams
reikalinga inkstų pažeidimui sukelti, skirtingų tyrėjų duomenimis gali varijuoti 2.5–6 mg/kg [7, 20, 21, 56, 60].
1.8.1.1.3. Glicerolio sukeltas ūminis inkstų pažeidimas
Glicerolis (Gycerolum, Ph. Eur. 01/2005:0496; ATC: A06AG04, A06AX01) – laisvinamųjų vaistų atstovas, skirtas vidurių užkietėjimui gydyti, taip pat gali būti naudojamas kosuliui gydyti [18]. Nors peroraliniu būdu vartojamas glicerolis nėra toksiškas nei žmonėms, nei laboratoriniams gyvūnams, glicerolio i. m. vienkartinė injekcija sukelia inkstų pažeidimą, kuris yra tapatus ūminiai kanalėlių nekrozei, pasireiškiančiai žmonėms dėl rabdomiolizės ar intravaskulinės hemolizės [42, 77, 78]. Skirtingi tyrėjai nurodo tą pačią glicerolio injekcijos dozę, reikalingą ŪIP sukelti – 8 ml/kg [2, 12, 34, 61, 64].
1.8.1.2. Kartotinių toksinių dozių nefrotoksiškumo modeliai
Vienkartinės toksikantų dozės ne visada geba sukurti norimą inkstų pažeidimą laboratoriniams gyvūnams, todėl yra taikomi modeliai, kuriuose laboratoriniams gyvūnams injekuojamos kartotinės parinkto toksikanto dozės, taip siekiant imituoti tapačius ūmius inkstų kanalėlių nekrozės procesus, pasireiškiančius žmogaus organizme. Dažnai kartotinių toksinių dozių nefrotoksiškumo modeliuose yra naudojami aminoglikozidai dėl jų sukeliamos NRV – ŪIP [15].
1.8.1.2.1. Aminoglikozidų sukeltas ūminis inkstų pažeidimas
Gentamicino sulfatas (Gentamicini Sulfas, Ph. Eur. 01/2005:0331; ATC: J01GB03) – aminoglikozidų grupės antibiotikas, pasižymintis baktericidiniu poveikiu, veikia slopindamas jam jautrių mikroorganizmų baltymų sintezės procesus [41]. ŪIP sukelia tik labai didelės (dažniausiai 10 kartų didesnės nei terapinės), kartotinės gentamicino (GM) dozės. GM dozės ir eksperimentinio modelio dienų skaičius skirtingų tyrėjų duomenimis labai skiriasi. GM dozė gali svyruoti nuo 50 mg/kg/d [15] iki 240 mg/kg/d [51], tačiau dažniausiai inkstų funkcijos pažeidimui sukelti parenkamos 80 mg/kg/d [1, 5, 10, 45, 47, 58, 63] ar 100 mg/kg/d [33, 48, 67, 68, 69] GM dozės, injekuojamos i. p. 6–8 dienas iš eilės. Nors
gyvsidabrio dariniai, toksiškai veikiantys ir kitas organų sistemas).
1.8.1.3. Kombinuoti nefrotoksiškumo modeliai
Žmonėms nefrotoksiškos medžiagos ne visuomet taip pat veikia ir laboratorinius gyvūnus. Tam tikrais atvejais yra reikalingi keli veiksniai, kurių poveikyje išsivystytų ŪIP, imituojantis tapačius ūmius inkstų kanalėlių nekrozės procesus, pasireiškiančius žmogaus organizme. Tokiais atvejais eksperimentams parenkami kombinuoti nefrotoksiškumo modeliai. Toliau pateikiamas tokio modelio pavyzdys.
1.8.1.3.1. Radiokontrastinių medžiagų sukeltas ūminis inkstų pažeidimas
Nefropatija, pasireiškianti dėl jodo turinčių radiokontrastinių medžiagų skyrimo, yra viena dažniausių ŪIP atsiradimo priežasčių ligoninėse [22]. Radiokontrastinės medžiagos yra naudojamos diagnostiniais ir terapiniais tikslais, tokiais kaip kompiuterinė tomografija, angiografija ar širdies kateterizacija. Radiokontrastinės medžiagos gyvūnams nesukelia ŪIP. Tačiau atlikti tyrimai pademonstravo, kad radiokontrastinių medžiagų skyrimas laboratorinėms žiurkėms ir pelėms, kartu taikant ir kitas renalinio „streso“ formas, tokias kaip kraujo nuleidimas (sumažėja cirkuliuojančio kraujo tūris), vieno inksto pašalinimas ar prostaglandinų sintezės slopinimas, gali sukelti ŪIP [13, 26, 27, 28, 29]. Kombinuoto nefrotoksiškumo modelio, kai ŪIP laboratoriniams gyvūnams yra sukeliamas veikiant radiokontrastinėmis medžiagomis, patofiziologiniai mechanizmai yra glaudžiai susiję su procesais vykstančiais žmogaus organizme. Pacientams, kuriems yra skiriamos radiokontrastinės medžiagos, ūmi inkstų kanalėlių nekrozė dažniausiai nepasireiškia, jei nėra kitų ją lemiančių faktorių, tokių kaip jau esantis lėtinis inkstų funkcijos nepakankamumas ar inkstų aprūpinimo krauju sumažėjimas [13, 26, 27, 28, 29].
Nefrotoksiškumo modeliuose in vivo inkstų pažeidimui sukelti dažniausiai naudojama radiokontrastinė medžiaga yra diatrizoato (520 mg/ml meglumino diatrizoatas ir 80 mg/ml natrio diatrizoato) injekcinis tirpalas, prieš kurio injekciją i. v. leidžiama indometacinio ir L-nitroarginino metilo esterio (L-NAME) standartinės dozės skirtos prostaglandinų sintezei slopinti [35, 76].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Laboratoriniai gyvūnai ir jų laikymo sąlygos
Tyrimas su laboratoriniais gyvūnais atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Veterinarijos akademijos vivariume. Tyrimui atlikti pasirinkti 9–12 sav. Wistar linijos žiurkių patinai. Eksperimentai su laboratoriniais gyvūnais atlikti vadovaujantis laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos reikalavimais, laikantis „Gyvūnų, skirtų eksperimentams ir kitiems mokslo tikslams, laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų“, patvirtintų 2008 12 18 Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymu Nr. B1–639 (Žin., 2009, Nr. 287). Leidimas Nr. 0191 eksperimentiniams tyrimams atlikti gautas pagal Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2009 10 02 posėdžio protokolą Nr. 4.
Laboratoriniai gyvūnai viso eksperimento metu buvo laikomi specialiuose individualiuose metaboliniuose narvuose (4 pav.) (Techniplast, Italija), esant pastoviai patalpos temperatūrai (21.0±2.5°C) ir pastoviai santykinei oro drėgmei (50–55 proc.). Paros apšvietimo ciklas (šviesa/tamsa) buvo keičiamas kas 12 val. Šviesa buvo įjungiama kiekvieną dieną 8 val. ryte. Gyvūnų adaptacijos periodas metaboliniuose narvuose prieš eksperimentą truko dvi paras.
4 pav. Metabolinis narvas skirti eksperimentiniams tyrimams su žiurkėmis atlikti. [11] Metabolinio narvo dalys:
proc., 45.0 g/kg, ~0.18 g/granul.; kalcis – 0.85–1.2 proc., 8.5–12.0 g/kg, ~0.034–0.048 g/granul.; fosforas – 0.85–1.2 proc., 8.5–12.0 g/kg, ~0.034–0.048 g/granul.; natrio chloridas – 0.45–0.7 proc., 4.5–7.0 g/kg, ~0.018–0.028 g/granul.; natris – ne daugiau 0.2 proc., 2.0 g/kg, 0.008 g/granul.; kalis – 0.45–0.8 proc., 4.5–8.0 g/kg, ~0.018–0.032 g/granul.; magnis – 0.12–0.2 proc., 1.2–2.0 g/kg, ~0.0048–0,008 g/granul.
2.2. Pasirengimas eksperimentui
Prieš eksperimentą metaboliniai narvai buvo sužymimi užklijuojant etiketes. Etiketėse buvo užrašomas žiurkės identifikacijos numeris, svoris (kg), grupė, į kurią priskirtas gyvūnas (I, II arba III), GM injekcinio tirpalo dozė (ml; jei jis buvo leidžiamas). Kiekvienos žiurkės kasdieniniam rutininiam stebėjimui buvo sukurtas specialus protokolas (1 priedas). Pirmąją eksperimento dieną kiekvieno laboratorinio gyvūno protokole buvo žymimas gyvūno identifikacijos numeris, lytis, amžius (sav.), svoris (g), grupė, į kurią priskirtas gyvūnas (I, II arba III), eksperimento pradžios data, GM injekcinio tirpalo dozė (ml; jei jis buvo leidžiamas). Nustatytuose eksperimento taškuose buvo stebimas ir protokoluose fiksuojamas žiurkių suvartoto vandens (ml/24val.) ir pašaro (granul./24val.) kiekis, paros diurezė (ml/24val.), svoris (g).
Parą prieš eksperimentą laboratoriniai gyvūnai buvo pasveriami laboratorinėmis svarstyklėmis (Mettler P1200, Šveicarija). Tikslus gyvūno svoris reikalingas tiksliai GM injekcinio tirpalo dozei apskaičiuoti (jei jis leidžiamas), taip pat svorio pokyčiams stebėti tolimesniuose eksperimento etapuose.
2.3. Inkstų pažeidimo modelis
Inkstų pažeidimo modelį sudaro šie etapai: 1. Laboratorinių gyvūnų adaptacijos fazė
2. Laboratorinių gyvūnų intoksikacijos (inkstų pažeidimo) fazė 3. Laboratorinių gyvūnų inkstų funkcijos atsistatymo fazė
2.3.1. Kontrolinės ir tiriamųjų grupių sudarymas
Laboratoriniai gyvūnai buvo suskirstyti į tris grupes (I, II ir III): I grupė – kontrolinė grupė;
II grupė – terapinė grupė; III grupė – pažeidimo grupė.
I grupės žiurkėms i. p. 14 dienų kasdien buvo švirkščiama 1.5 ml 0.9 proc. natrio chlorido (NaСl) fiziologinio tirpalo. II grupės žiurkėms kasdien buvo švirkščiama terapinė GM dozė – 5 mg/kg/d i. p. 14 dienų. III grupės žiurkėms kasdien buvo švirkščiama didelė toksinė GM dozė – 80 mg/kg/d i. p. 7 dienas. Tiek 0.9 proc. NaCl fiziologinio tirpalo, tiek GM injekcinio tirpalo švirkštimas buvo atliekamas kiekvieną dieną tuo pačiu metu 8 val. ryte.
5 pav. Nefrotoksiškumo modelio in vivo sukūrimo schema
Toksinė GM dozė buvo parinkta atsižvelgiant į kitų tyrėjų atliktus tyrimus, kuriuose kaip toksikantas inkstų funkcijos pažeidimui sukelti buvo naudotas GM injekcinis tirpalas (80mg/kg/d) [1, 5, 10, 45, 47, 58, 63].Naudotas KRKA gentamicino sulfatotirpalas injekcijoms 40mg/1ml. GM švirkštimui naudoti insulino švirkštai (29G×1/2"; 0.33×12 mm). Nefrotoksiškumo modelio in vivo sukūrimas schematiškai pavaizduotas 5 paveiksle.
GM injekcinio tirpalo dozė buvo apskaičiuojama individualiai kiekvienam laboratoriniam gyvūnui pagal svorį (kg) nustatytą prieš eksperimentą. GM injekcinio tirpalo dozė ml, kurią reikia sušvirkšti, buvo apskaičiuojama pagal formulę:
Formulės išvedimas:
Naudotas GM injekcinis tirpalas 40mg/1ml Jei 1ml GM injekcinio tirpalo yra 40mg GM Tai VGMD ml GM injekcinio tirpalo bus A mg GM
A – GM injekcinio tirpalo dozė mg, kurią reikia sušvirkšti D – GM injekcinio tirpalo dozė mg/kg/d
m – žiurkės masė kg
VGMD – GM injekcinio tirpalo (40mg/1ml) tūris ml, kurį reikia sušvirkšti, kai GM dozė D mg/kg/d
Formulė, kai GM dozė 5 mg/kg/d (D=5):
Formulė, kai GM dozė 80 mg/kg/d (D=80):
VGM80 – GM injekcinio tirpalo (40mg/1ml) tūris ml, kurį reikia sušvirkšti, kai GM dozė
80 mg/kg/d
Pavyzdys. Tarkime, kad žiurkės masė m=0.300 (kg). Žiurkė priklauso III grupei (GM injekcinio
tirpalo dozė – 80mg/kg/d). Tai GM injekcinio tirpalo dozė ml, kurią reikia sušvirkšti, bus: VGM80=2×m=2×0.3=0.6 (ml)
2.3.2. Fiziologinių rodiklių vertinimas
Vertinti laboratorinių gyvūnų svorio, suvartoto vandens ir pašaro kiekio bei paros diurezės pokyčiai.
Svoris. Žiurkės buvo sveriamos elektroninėmis laboratorinėmis svarstyklėmis (Mettler P1200,
Šveicarija) prieš eksperimentą, vėliau po 7, 21 ir 35 dienų. Vertinti žiurkių svorio pokyčiai kiekviename eksperimento etape.
Vandens ir pašaro kiekis. Žiurkių suvartoto vandens ir pašaro kiekis vertintas nuo 1 iki 14
eksperimento dienos kasdien, vėliau – 21, 28 ir 35 eksperimento dienomis. Matuotas suvartoto vandens kiekis (ml/24val.) ir suvartoto maisto kiekis granulėmis per parą (granul./24val). Suvartotas vandens ir pašaro kiekis visada buvo vertinamas tuo pačiu metu, 8 val. ryte, pamatuojant išgerto vandens tūrį matuojamuoju cilindru ir suskaičiuojant suvartotų pašaro granulių skaičių.
Diurezė. Žiurkių paros diurezė (šlapimo kiekis ml/24val.) vertinta nuo 1 iki 14 eksperimento
dienos kasdien, vėliau – 21, 28 ir 35 eksperimento dienomis. Paros diurezė visada buvo vertinama tuo pačiu metu, 8 val. ryte, surenkant paros šlapimo mėginius ir pamatuojant šlapimo tūrį matuojamuoju cilindru.
Žiurkių elgesys buvo vertintas 8 eksperimento dieną, praėjus parai po paskutinės toksinės GM dozės sušvirkštimo III grupės žiurkėms ir 15 eksperimento dieną, praėjus parai po paskutinės 0.9 proc. NaCl fiziologinio tirpalo švirkštimo I grupės ir po paskutinės terapinės GM dozės sušvirkštimo II grupės žiurkėms. Vertinta šių žiurkių elgesio pozicijų trukmė (min.):
1. Domėjimasis aplinka 2. Galvos padėtis
3. Tupėjimo (sėdėjimo) poza, uodegos laikymas 4. Nugaros išlenkimas, rietimasis, gūžimasis 5. Netipiška galvos padėtis (nuleista žemyn) 6. Kailio valymasis
7. Kitos (triukšmo, garso skleidimas, porfirino išsiskyrimas akių srityje, judėjimas, ėdimas, gėrimas, pašaro kaupimas)
Laboratorinių gyvūnų elgesio pozicijos buvo vertinamos pagal J. B. I. Rousseau ir kitų tyrėjų pasiūlytą metodiką [55].
2.3.4. Biocheminių rodiklių vertinimas
Vertinti šlapimo ir kraujo biocheminiai rodikliai. Žiurkių šlapime ir kraujo serume tirti šie biocheminiai rodikliai:
Natrio jonų koncentracija (mmol/l) Kalio jonų koncentracija (mmol/l) Fosforo jonų koncentracija (mmol/l) Kreatinino koncentracija (μmol/l)
Šlapimo ir kraujo mėginių biocheminiai tyrimai atlikti visų trijų grupių laboratoriniams gyvūnams tuose pačiuose eksperimento taškuose, siekiant nustatyti šių rodiklių reikšmes ir jų ribas laboratorinių gyvūnų normalios fiziologinės būklės metu ir jų pokyčius inkstų funkcijos pažeidimo metu (III grupės žiurkėms).
Šlapimo mėginiai imti 1 eksperimento dieną, siekiant nustatyti normalias fiziologines tirtų rodiklių reikšmes, vėliau po 7 ir 14 dienų – inkstų funkcijos pažeidimo piko metu, ir po 21 ir 35 dienų – inkstų funkcijos atsistatymo procesų metu. Šlapimo mėginiai rinkti į sterilius vienkartinius plastikinius mėgintuvėlius, ant kurių buvo klijuojamos etiketės pažymint žiurkės identifikacijos numerį ir mėginio paėmimo datą. Mėgintuvėliai su šlapimo mėginiais laikyti šaltai (2–8°C temperatūroje), specialiame termose iki pristatymo į laboratoriją ištyrimui.
Kraujo mėginiai imti į vienkartinius sterilius plastikinius centrifuginius mėgintuvėlius be antikoaguliantų iš v. jugularis. Kraujo mėginiai imti 1 eksperimento dieną, siekiant nustatyti kraujo serumo biocheminių rodiklių normas esant normaliai žiurkių fiziologinei būklei, po 7 dienų (III grupės žiurkėms) ŪIP metu, po 14 dienų (II grupės žiurkėms po paskutinės terapinės GM injekcijos), ir 35 dieną (I, II ir III grupės žiurkėms) inkstų funkcijos atsistatymo procesų metu. Surinkus kraują buvo išskiriamas kraujo serumas. Kraujo mėginiai buvo centrifuguojami 10 min. 1000 apsisukimų per min. greičiu, norint išvengti hemolizės. Išskirtas serumas iki pristatymo į laboratoriją buvo laikytas -20°C temperatūros šaldiklyje.
Natrio, kalio ir fosforo jonų koncentracijų nustatymas šlapime ir kraujo serume atlikti naudojant automatinį biocheminį analizatorių „COBAS INTEGRA 400 plus“ (Tegimenta Ltd Roche, Šveicarija) taikant atrankiąją jonų potenciometriją. Kreatinino koncentracijos nustatymas šlapime ir kraujo serume atliktas taikant spektrofotometriją.
2.3.5. Frakcinės ekskrecijos rodiklių vertinimas
Frakcinės ekskrecijos rodikliai atspindi kalio, natrio ir fosforo jonų pašalinimą iš organizmo, o kartu ir inkstų funkciją. Apskaičiuotos šių jonų frakcinės ekskrecijos reikšmės. Frakcinės ekskrecijos reikšmės apskaičiuotos pagal kalio, natrio, fosforo jonų ir kreatinino koncentracijas šlapime ir kraujo serume, naudojantis šiomis formulėmis:
FEK – frakcinė kalio jonų ekskrecija (proc.)
FENa – frakcinė natrio jonų ekskrecija (proc.)
FEP – frakcinė fosforo jonų ekskrecija (proc.)
UCr – kreatinino koncentracija šlapime (μmol/l)
UK – kalio jonų koncentracija šlapime (mmol/l)
UNa – natrio jonų koncentracija šlapime (mmol/l)
UP – fosforo jonų koncentracija šlapime (mmol/l)
SCr – kreatinino koncentracija kraujo serume (μmol/l)
SK – kalio jonų koncentracija kraujo serume (mmol/l)
SNa – natrio jonų koncentracija kraujo serume (mmol/l)
SP – fosforo jonų koncentracija kraujo serume (mmol/l)
Frakcinės ekskrecijos rodikliai vertinti eksperimento pradžioje, 8 dieną (III grupės žiurkėms ŪIP metu po paskutinės toksinės GM dozės), 15 eksperimento dieną (praėjus parai po paskutinės 0.9 proc. NaCl fiziologinio tirpalo injekcijos I grupės žiurkėms ir paskutinės GM terapinės dozės injekcijos II grupės žiurkėms), ir 35 dieną (I, II ir III grupių žiurkėms).
2.3.6. Glomerulų filtracijos greičio vertinimas
Pagal tarptautinių ekspertų grupių KDOQI (angl. Kidney Disease Outcome Quality Initiative) ir KDIGO (angl. Kidney Disease: Improving Global Outcomes) rekomendacijas inkstų funkcijai įvertinti būtina išmatuoti vieną svarbiausių inkstų funkcinių rodiklių – glomerulų filtracijos greitį (GFG). Vertinant žiurkių GFG, apskaičiuotas 24 val. endogeninio kreatinino klirensas renkant žiurkių paros šlapimą. Endogeninio kreatinino klirensas apskaičiuotas pagal formulę [43]:
CCr=GFG (ml/min.)
CCr – kreatinino klirensas (ml/min.)
VU/24val. – šlapimo kiekis (ml/24val.)
GFG vertintas eksperimento pradžioje, 8 dieną (III grupės žiurkėms ŪIP metu po paskutinės toksinės GM dozės), 15 eksperimento dieną (praėjus parai po paskutinės 0.9 proc. NaCl fiziologinio tirpalo injekcijos I grupės žiurkėms ir paskutinės GM terapinės dozės injekcijos II grupės žiurkėms), ir 35 dieną (I, II ir III grupės žiurkėms).
2.3.7. Histologinių rodiklių vertinimas
Prieš histologinių mėginių paėmimą, laboratoriniams gyvūnams atlikta eutanazija Ketamino hidrochlorido 10 proc. injekciniu tirpalu (dozė – 80 mg/kg, i. p.) ir Ksilazino 20mg/1ml injekciniu tirpalu (dozė – 5 mg/kg, i. .p.). Po eutanazijos žiurkėms atlikta laparotomija. Atliekant laparotomiją buvo apžiūrima injekcijų vieta pilvaplėvėje (6 pav.).
6 pav. Injekcijų vietos pilvaplėvėje apžiūra 7 pav. Inkstų skersinis pjūvis atliekamas prieš atliekant laparotomiją inksto fiksavimą
Histologiniams pokyčiams įvertinti paimti inkstų mėginiai. Prieš inkstų fiksavimą, skalpeliu padaryti inkstų išilginiai pjūviai, kaip parodyta nuotraukoje (7 pav.). Inkstai fiksuoti 10 proc. formalino tirpalu (santykiu 1:20), 24 valandų laikotarpyje pristatyti į laboratoriją tolimesniems tyrimams. Inkstų histologijos tyrimai atlikti Valstybiniame patologijos centre. Inkstų mėginių dažymas atliktas hematoksilinu ir eozinu, PAS (jodo perrūgšties ir Šifo reagentu) metodu. Rezultatuose pateikiamas 200 kartų padidintas inkstų histologinis vaizdas.
įvertinimas
2.4.1. Bandomasis tyrimas
Nefrotoksiškumo modelio pritaikomumo įvertinimui atliktas bandomasis (pilotinis) tyrimas. Bandomojo (pilotinio) tyrimo metu 6 žiurkėms sukeltas ŪIP naudojant sukurto nefrotoksiškumo modelio metodiką (GM i. p. 80 mg/kg/d 7 dienas iš eilės). Žiurkės suskirstytos į dvi grupes po 3 gyvūnus:
GM80 grupė – kontrolinė grupė; KL grupė – bandomoji grupė.
GM80 grupės žiurkės buvo paliktos inkstų funkcijos atsistatymui ir rutininiam stebėjimui pagal sukurtą metodiką. KL grupės žiurkėms praėjus parai po paskutinės toksinės GM dozės buvo i. p. injektuojamos išskirtos ir kultivuotos raumeninės kilmės kamieninės ląstelės (RKKL), dozė – 150–200 tūkst. ląstelių injekcija. KL grupės žiurkės (kaip ir GM80 grupės žiurkės) paliktos inkstų funkcijos atsistatymui ir rutininiam stebėjimui pagal sukurtą metodiką. Lyginti GM80 ir KL grupių žiurkių rodikliai po 35 dienų.
2.4.2. Raumeninės kilmės kamieninių ląstelių išskyrimas
Kamieninių ląstelių išskyrimas ir kultivavimas atliktas LSMU MA Kardiologijos instituto Ląstelių kultūrų laboratorijoje. KL išskyrimas atliktas naudojant Gharaibeh B. ir kitų mokslininkų metodiką [25], taikant tam tikras modifikacijas. RKKL išskyrimas schematiškai pavaizduotas 8 paveiksle. RKKL išskyrimui buvo naudotas Wistar linijos žiurkės naujagimis (2–3 sav. amžiaus). Paimti 2 dvilypio (lot. musculus gastrocnemius) ir plekšninio (lot. musculus soleus) raumenų audinių gabalėliai, audinys mechaniškai susmulkintas steriliais įrankiais. Susmulkinta raumenų masė tris kartus buvo plaunama PBS (angl. Phosphate buffered saline) tirpalu, po to perkeliama į kolagenu dengtą flakoną. Ląstelės atskirtos fermentų mišiniu (0.2 porc. XI tipo kolagenazė, 0.2 proc. dispazė, ir 0.1 proc. tripsino), inkubuotos 37°C temperatūroje (aplinkos dujų sudėtis – 5 proc. CO2 ir 95 proc. oro). Raumenų ląstelių suspensija persėta į flakoną (PP1), kaip aprašyta Gharaibeh B. ir kitų mokslininkų metodikoje [25]. PP1 ląstelių kultūra inkubuota ir laikyta flakone 2 val. Greitai (per 2 val. inkubacinį periodą) prie flakono
dugno prikibusios ląstelės buvo daugiausiai į fibroblastus panašios ląstelės. Neprikibusios ląstelės buvo persėjamos į kitą flakoną (PP2) ir inkubuojamos 24 val. Pastaroji procedūra kartota kas 24 val. iki PP6 ląstelių kultūros. Lėtai prikimbančios ląstelės dažniausiai prikimba prie PP6 flakono. Jos būna pavienės, mažos, apvalios.
Ląstelių proliferacijai naudota Dulbecco modifikuota DME terpė (angl. DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium), praturtinta 10 proc. fetalinio veršelio serumo (angl. FBS – fetal bovine serum), 10 proc. arklio serumo, antibiotikų tirpalu (100 U/ml penicilino, 100 µg/ml streptomicino) ir 0.5 proc. viščiuko embriono audinių kultūra. Terpė buvo keičiama kas 2–3 dienas. PP6 ląstelių fenotipas – Sca-1, CD34+ [25].
8 pav. Raumeninės kilmės kamieninių ląstelių išskyrimo schema
2.5. Statistinė duomenų analizė
Aprašomoji ir lyginamoji statistinė duomenų analizė atlikta statistiniu paketu SPSS Statistics 17.0. Apskaičiuotos iš anksto parinktų kintamųjų dažnių ir kryžminės lentelės, atliktas χ2
testas su priklausomu kintamuoju – GM injekcinio tirpalo doze (0 mg/kg/d; 5 mg/kg/d; 80 mg/kg/d). Vertinant fiziologinius, biocheminius, frakcinės ekskrecijos ir glomerulų filtracijos greičio rodiklius apskaičiuotas kiekvieno parametro vidurkis, standartinis nuokrypis (SD), mediana. Biocheminių, frakcinės ekskrecijos ir glomerulų filtracijos greičio rodiklių jautrumui ir specifiškumui nustatyti ir palyginti naudotos ROC (angl. Receiver Operating Characteristics) kreivės, apskaičiuojant plotą po kreive – AUC (angl. Area Under the
prognozavimui. Rezultatai laikyti statistiškai patikimais kai patikimumo koeficientas p<0.05.
3. REZULTATAI
3.1. Laboratorinių gyvūnų imtis ir charakteristika
Tirti Wistar linijos žiurkių patinai, kurių amžius eksperimento pradžioje buvo 9–12 sav., svorio vidurkis 316.63 g (SD=61.65, mediana 324.15, ribos 206.9–396.7). Vienu metu eksperimentai atlikti su 12 laboratorinių gyvūnų. Eksperimentas kartotas 3 kartus. Statistiškai patikimų skirtumų tarp trijų eksperimentų metu surinktų duomenų nenustatyta (p>0.05).
3.2. Fiziologiniai rodikliai
Vertinant žiurkių fiziologinius rodiklius (svorį, suvartoto vandens ir maisto kiekį, paros diurezę), nustatyti statistiškai patikimi šių rodiklių skirtumai (p<0.05) lyginant I ir III grupes bei II ir III grupes. Statistiškai patikimų skirtumų tarp I ir II grupių žiurkių fiziologinių rodiklių nenustatyta (p>0.05).
3.2.1. Svoris
I grupės žiurkių svoris eksperimento pradžioje buvo vidutiniškai 301.5 g (SD=67.57, mediana 289.8, ribos 234.8 – 391.8), II grupės žiurkių – vidutiniškai 287.3 g (SD=67.44, mediana 288.6, ribos 206.9 – 365.2), III grupės žiurkių – vidutiniškai 361.1 g (SD=27.14, mediana 355.7, ribos 336.2 – 396.7). Po 7 eksperimento dienų I grupės žiurkių svoris buvo vidutiniškai 310.5 g (SD=63.15, mediana 300.4, ribos 247.4 – 393.7), II grupės žiurkių – vidutiniškai 269.7 g (SD=49.46, mediana 270.8, ribos 208.4 – 328.7), III grupės žiurkių – vidutiniškai 323.3 g (SD=42.43, mediana 304.4, ribos 298.1 – 386.5). Po 35 eksperimento dienų I grupės žiurkių svoris buvo vidutiniškai 324.7 g (SD=58.55, mediana 311.5, ribos
269.5 – 406.1), II grupės žiurkių – vidutiniškai 307.7 g (SD=51.61, mediana 307.6, ribos 246.0 – 369.5), III grupės žiurkių – vidutiniškai 335.9 g (SD=42.56, mediana 320.6, ribos 304.0 – 398.6).
Laboratorinių gyvūnų svorio pokyčiai per 35 dienas statistiškai patikimai priklausė nuo GM injekcinio tirpalo dozės lyginant I ir III grupes (p<0.05), II ir III grupes (p<0.05). Statistiškai patikimų skirtumų tarp I ir II grupių žiurkių nenustatyta (p>0.05).
Nors per pirmąsias 7 dienas II grupės žiurkių svoris sumažėjo (vidutiniškai sumažėjo 6.13 proc.), o nuo 7 iki 21 dienos augo nežymiai (vidutiniškai padidėjo 1.82 proc.), tačiau bendras priaugto svorio vidurkis nežymiai skyrėsi nuo I grupės žiurkių, statistiškai patikimų skirtumų nerasta (p>0.05). I grupės žiurkių svorio prieaugis per 35 dienas vidutiniškai sudarė 7.67 proc. pradinio žiurkių kūno svorio, II grupės žiurkių svorio prieaugis – 7.08 proc. pradinio žiurkių kūno svorio.
III grupės žiurkių svoris per pirmąsias 21 dieną žymiai mažėjo (per pirmąsias 7 dienas svoris vidutiniškai sumažėjo 10.46 proc., nuo 7 iki 21 dienos – dar 13.66 proc.). Nors nuo 21 iki 35 eksperimento dienos III grupės laboratorinių gyvūnų svoris ženkliai augo (vidutiniškai padidėjo 20.33 proc.), tačiau šios grupės žiurkių svoris per 35 dienas vidutiniškai sumažėjo 6.96 proc. lyginant su pradiniu svoriu. Žiurkių svorio pokyčio priklausomybė nuo GM dozės pavaizduota grafiškai (9 pav.).
Eksperimento pradžioje I grupės žiurkių suvartoto vandens kiekis buvo vidutiniškai 30.0 ml/24val. (SD=8.16, mediana 30.0, ribos 20.0 – 40.0), II grupės žiurkių – vidutiniškai 22.5 ml/24val. (SD=6.45, mediana 22.5, ribos 15.0 – 30.0), III grupės žiurkių – vidutiniškai 33.8 ml/24val. (SD=10.31, mediana 35.0, ribos 20.0 – 45.0). Po 14 eksperimento dienų I grupės žiurkių suvartoto vandens kiekis buvo vidutiniškai 26.3 ml/24val. (SD=7.50, mediana 25.0, ribos 20.0 – 35.0), II grupės žiurkių – vidutiniškai 25.0 ml/24val. (SD=5.77, mediana 25.0, ribos 20.0 – 30.0), III grupės žiurkių – vidutiniškai 75.0 ml/24val. (SD=52.75, mediana 72.5, ribos 25.0 – 130.0).
I ir II grupių žiurkių suvartoto vandens kiekis per 14 dienų žymiai nekito, statistiškai patikimų skirtumų nenustatyta (p>0.05). Laboratorinių gyvūnų suvartoto vandens kiekis statistiškai patikimai priklausė nuo GM dozės lyginant I ir III grupes (p<0.05) bei II ir III grupes (p<0.05).
I grupės žiurkių suvartoto vandens kiekio vidurkis per pirmąsias 14 eksperimento dienų buvo 25.3 ml/24val. (SD=7.11, mediana 25, ribos 10–45), II grupės – 27.8 ml/24val. (SD=6.53, mediana 30, ribos 15–50), III grupės – 55.18 ml/24val. (SD=41.78, mediana 35, ribos 20–110).
10 pav. Suvartoto vandens kiekio (ml/24val.) vidurkio kitimas per 14 dienų priklausomai nuo GM dozės (mg/kg/d)
Per pirmąsias 4 eksperimento dienas III grupės žiurkių suvartoto vandens kiekis (ml/24val.) ženkliai nekito. Suvartojamo vandens kiekio (ml/24val.) ženklus didėjimas stebimas nuo 4 iki 8 eksperimento dienos (suvartoto vandens kiekio vidurkis išaugo 176.19 proc.). Nuo 8 iki 14 eksperimento dienos suvartojamo vandens kiekis beveik nekito ir vidutiniškai buvo 72.9 ml/24val. Žiurkių vidutinio suvartoto vandens kiekio (ml/24val.) kitimas per 14 dienų grafiškai pavaizduotas 10 paveiksle.
3.2.3. Pašaro kiekis
Eksperimento pradžioje I grupės žiurkių suvartoto pašaro kiekis buvo vidutiniškai 6.0 granul./24val. (SD=0.82, mediana 6, ribos 5 – 7), II grupės žiurkių – vidutiniškai 6.0 granul./24val. (SD=1.15, mediana 6, ribos 5 – 7), III grupės žiurkių – vidutiniškai 6.5 granul./24val. (SD=1.91, mediana 7, ribos 4 – 8). Po 14 eksperimento dienų I grupės žiurkių suvartoto pašaro kiekis buvo vidutiniškai 6.0 granul./24val. (SD=0.82, mediana 6, ribos 5 – 7), II grupės žiurkių – vidutiniškai 5.5 granul./24val. (SD=0.58, mediana 5.5, ribos 5 – 6), III grupės žiurkių – vidutiniškai 4.0 granul./24val. (SD=0.82, mediana 4, ribos 3 – 5).
11 pav. Suvartoto pašaro kiekio (granul./24val.) vidurkio kitimas per 14 dienų priklausomai nuo GM dozės (mg/kg/d)
priklausė nuo GM dozės lyginant I ir III grupes (p<0.05) bei II ir III grupes (p<0.05).
I grupės žiurkių suvartoto pašaro kiekio vidurkis per pirmąsias 14 eksperimento dienų buvo 5.7 granul./24val. (SD=0.90, mediana 6, ribos 4–8), II grupės – 5.4 granul./24val. (SD=0.74, mediana 6, ribos 4–6), III grupės – 3.27 garnul./24val. (SD=2.02, mediana 3, ribos 0–8).
Per 3 pirmąsias eksperimento dienas III grupės žiurkių suvartoto pašaro kiekio mažėjimas buvo nežymus. Nuo 3 iki 8 eksperimento dienos III grupės žiurkių suvartojamo pašaro kiekis sumažėjo nuo vidutiniškai 5.3 granul./24val. iki vidutiniškai 1.5 granul./24val. Nuo 8 iki 13 dienos suvartoto pašaro kiekis nežymiai didėjo, nuo 13 dienos ėmė žymiai didėti. Žiurkių vidutinio suvartoto pašaro kiekio (granul./24val.) kitimas per 14 dienų grafiškai pavaizduotas 11 paveiksle.
3.2.4. Diurezė
Eksperimento pradžioje I grupės žiurkių diurezė buvo vidutiniškai 13.9 ml/24val. (SD=2.66, mediana 14.8, ribos 10.0 – 16.0), II grupės žiurkių – vidutiniškai 12.9 ml/24val. (SD=3.86, mediana 13.8, ribos 7.5 – 16.5), III grupės žiurkių – vidutiniškai 12.3 ml/24val. (SD=3.62, mediana 12.3, ribos 8.0 – 16.5). Po 14 eksperimento dienų I grupės žiurkių diurezė buvo vidutiniškai 12.3 ml/24val. (SD=2.90, mediana 12.5, ribos 8.5 – 15.5), II grupės žiurkių – vidutiniškai 10.1 ml/24val. (SD=0.48, mediana 10.3, ribos 9.5 – 10.5), III grupės žiurkių – vidutiniškai 45.0 ml/24val. (SD=14.43, mediana 45.0, ribos 32.5 – 57.5).
I ir II grupių žiurkių paros diurezė per 14 dienų žymiai nekito, statistiškai patikimų skirtumų nenustatyta (p>0.05). Laboratorinių gyvūnų paros diurezė statistiškai patikimai priklausė nuo GM dozės lyginant I ir III grupes (p<0.05) bei II ir III grupes (p<0.05).
I grupės šlapimo kiekio vidurkis per pirmąsias 14 eksperimento dienų buvo 12.25 ml/24val (SD=2.45, mediana 12, ribos 7.5–19.5), II grupės – 12.59 ml/24val. (SD=3.52, mediana 11.5, ribos 7– 23.5), III grupės – 32.13 ml/24val. (SD=20.78, mediana 28, ribos 6–68.5).
12 pav. Šlapimo kiekio (ml/24val.) vidurkio kitimas per 14 dienų priklausomai nuo GM dozės (mg/kg/d)
Per pirmąsias 4 eksperimento dienas III grupės žiurkių šlapimo kiekis (ml/24val.) ženkliai nekito. Ženklus diurezės (ml/24val.) didėjimas stebimas nuo 4 iki 9 eksperimento dienos (šlapimo kiekio (ml/24val.) vidurkis išaugo iki 318.18 proc.). Nuo 9 iki 14 eksperimento dienos žiurkių diurezė beveik nekito ir buvo vidutiniškai 45.3 ml/24val.. Žiurkių diurezės (ml/24val.) kitimas per 14 dienų grafiškai pavaizduotas 12 paveiksle.
3.3. Elgesio rodikliai
III grupės žiurkių elgesys ženkliai pasikeitė lyginant su I ir II grupėmis (p>0.05). Pakito judesiai, pozos refleksai, galvos padėtis, laboratoriniai gyvūnai gūžėsi ir rietėsi 53.40 proc. dažniau. Remiantis vienfaktorine dispersine analize galime teigti, kad GM III grupės žiurkių visoms elgesio pozicijoms turėjo neigiamos įtakos: domėjimuisi aplinka – 99,50 proc. (p<0,001), galvos padėčiai – 96,50 proc. (p<0,001), tupėjimo pozai ir uodegos laikymui – 98,90 proc. p<0,001), nugaros išlenkimui, rietimuisi, gūžimui – 88,90 proc. (p<0,05), netipiniam galvos laikymui – 100,0 proc. (p<0,001), kailio valymuisi – 98,60 proc. (p<0,001), kitoms elgesio pozicijoms – ėdimui, gėrimui – 55,10 proc. (p<0,05). I ir II grupės gyvūnų
1 lentelė. Žiurkių elgesio pozicijų trukmė min. priklausomai nuo GM dozės (mg/kg/d) [81]
GM dozė (mg/kg/d)
Žiurkių elgesio rodikliai
1 2 3 4 5 6 7 15 diena 0 9.7±0.41 11.7±0.41 15.0±0.00 12,7±1,47 0 8,3±0,41 2,6±0,02 5 10.0±0.00 15.5±6.34 15.0±0.00 11,5±4,71 0 4,5±1,87 3,5±0,01 8 diena 80 0 10.0±0.00 20,5±0,71 19,5±0,71 10,0±0,00 0 0
Pateikiamas rodiklių vidurkis ± standartinis nuokrypis
Žiurkių elgesio rodikliai: 1 – domėjimasis aplinka, 2 – galvos padėtis (pakelta), 3 – tupėjimo (sėdėjimo) poza, uodegos laikymas, 4 – nugaros išlenkimas, rietimasis, gūžimasis, 5 – netipiška galvos padėtis (nuleista žemyn), 6 – kailio valymasis, 7 – kitos (triukšmo, garso skleidimas, porfirino išsiskyrimas akių srityje, judėjimas, ėdimas, gėrimas, pašaro kaupimas)
3.4. Biocheminiai rodikliai
3.4.1. Biocheminiai šlapimo rodikliai
Statistiškai patikimų skirtumų tarp I ir II grupių biocheminių šlapimo rodiklių nenustatyta (p>0.05). Nustatyti statistiškai patikimi skirtumai tarp I ir III grupių biocheminių šlapimo rodiklių (p<0.05), bei tarp II ir III grupių biocheminių šlapimo rodiklių (p<0.05). Biocheminių šlapimo rodiklių duomenys pateikti 2 lentelėje.
Kalio koncentracija šlapime III grupės žiurkėms ŪIP metu sumažėjo vidutiniškai 62.4 proc. po 7 dienų, ir 80.9 proc. po 14 dienų, lyginant su UK koncentracija eksperimento pradžioje. Po 21 ir 35 dienų
UK padidėjo, tačiau nepasiekė pradinės kalio koncentracijos šlapime. Natrio koncentracija šlapime III
grupės žiurkėms ŪIP metu sumažėjo vidutiniškai 52.3 proc. po 7 dienų, ir 89.1 proc. po 14 dienų, lyginant su UNa koncentracija eksperimento pradžioje. Po 21 dienos UNa koncentracija buvo 68.9 proc. mažesnė nei
pradinė, po 35 dienų – 64.2 proc. mažesnė nei pradinė. Taigi po 35 dienų natrio koncentracija šlapime buvo sumažėjusi daugiau nei perpus.
2 lentelė. Biocheminiai šlapimo rodikliai priklausomai nuo GM dozės mg/kg/d GM dozė (mg/kg/d) Šlapimas UK (mmol/l) UNa (mmol/l) UP (mmol/l) UCr (μmol/l) 0 diena 0 192.3±36.0 161.6±40.7 29.8±15.9 5725.0±1064.8 5 171.5±2.1 154.1±46.3 39.7±18.8 6765.0±1427.6 80 163.5±75.1 216.0±49.2 51.9±5.14 9190.0±856.5 7 diena 0 163.6±1.8 180.4±23.5 43.5±3.1 7010.0±792.0 5 120.2±73.1 216.2±43.2 57.5±8.6 8107.5±501.4 80 61.4±14.7 103.0±46.7 21.5±9.0 2900±1280.4 14 diena 0 153.9±78.4 202.1±60.7 37.8±33.8 6815.0±2708.2 5 179.0±9.5 209.5±9.4 51.4±2.6 8042.5±733.4 80 31.3±7.5 23.45±4.9 7.6±0.14 2330.0±127.3 21 diena 0 168.2±21.4 148.7±93.7 40.2±21.6 7625.0±190.9 5 174.2±32.7 195.5±19.1 51.6±12.0 7570.0±1810.2 80 113.1±1.13 67.2±4.0 10.1±2.6 4610.0±497.9 35 diena 0 153.1±59.3 95.3±21.3 28.4±3.7 7697.5±341.3 5 192.9±11.6 182.0±74.7 40.0±18.9 7990.0±465.1 80 114.4±0.6 77.3±5.3 14.1±2.8 4637.5±487.3
Pateikiamas rodiklių vidurkis ± standartinis nuokrypis
Fosforo koncentracija šlapime III grupės žiurkėms ŪIP metu sumažėjo vidutiniškai 58.6 proc. po 7 dienų, ir 85.4 proc. po 14 dienų, lyginant su UP koncentracija eksperimento pradžioje. Po 21 dienos UP
koncentracija buvo 80.5 proc. mažesnė nei pradinė, po 35 dienų – 72.8 proc. mažesnė nei pradinė. Po 35 dienų fosforo koncentracija šlapime vis dar buvo sumažėjusi beveik dviem trečdaliais. Kreatinino koncentracija šlapime III grupės žiurkėms ŪIP metu sumažėjo vidutiniškai 68.4 proc. po 7 dienų, ir 74.6 proc. po 14 dienų, lyginant su UCr koncentracija eksperimento pradžioje. Po 21 dienos UCr koncentracija
buvo 49.8 proc. mažesnė nei pradinė, po 35 dienų – 49.5 proc. mažesnė nei pradinė. Po 35 dienų fosforo koncentracija šlapime vis dar buvo sumažėjusi beveik perpus.
