LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
LUKAS BŪDA
LIOFILIZUOTŲ AUGALINIŲ ŽALIAVŲ ANTOCIANINŲ
SUDĖTIES PROFILIO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Valdas Jakštas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Prof.dr. Ramunė Morkūnienė
Data
LUKAS BŪDA
LIOFILIZUOTŲ AUGALINIŲ ŽALIAVŲ ANTOCIANINŲ
SUDĖTIES PROFILIO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. dr. Valdas Jakštas
Recenzentas Darbą atliko
Data Magistrantas
Lukas Būda
TURINYS
TURINYS... 3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Antocianinų apžvalga ... 12
1.1.1 Antocianinų apibūdinimas ... 12
1.1.2 Antocianinų cheminės ir fizikinės savybės ... 12
1.1.3 Antocianinų poveikis žmogaus organizmui ... 14
1.2 Antocianinus kaupiantys augalai ... 14
1.2.1 Mėlynė (Vaccinium myrtillus) ... 14
1.2.2 Juodauogis šeivamedis (Sambucus nigra) ... 15
1.2.3 Paprastoji vyšnia (Prunus cerasus) ... 15
1.2.4 Juodasis serbentas (Ribes nigrum) ... 16
1.2.5 Sodinė šilauogė (Vaccinium corymbosum) ... 16
1.2.6 Juodavaisė aronija (Aronia melanocarpa) ... 17
1.2.7 Paprastasis šermukšnis (Sorbus aucuparia) ... 17
1.2.8 Dygliuotasis šaltalankis (Hippophae rhamnoides) ... 18
1.2.9 Paprastoji avietė (Rubus ideus) ... 18
1.2.10 Braškė (Fragaria x ananassa); Žemuogė (Fragaria vesca) ... 18
1.3 Antocianinų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1 Tyrimo objektas ... 20
2.2 Naudoti reagentai ... 20
2.3 Naudota aparatūra... 20
2.4 Ekstraktų paruošimas ... 21
2.5 ESC taikymas vertinant antocianų profilius kiekybiškai ir kiekybiškai ... 21
2.6 UESC-MS taikymas antocianinų identifikavimui ... 22
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 23
3.1 Kokybinis antocianinų įvertinimas ... 23
3.1.1 Paprastųjų aviečių (Rubus ideus) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas ... 23
3.1.2 Žemuogių (Fragaria vesca) ir braškių (Fragaria x ananassa) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas ... 24
3.1.3 Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas... 26
3.1.4 Juodauogių šeivamedžių (Sambucus nigra) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas... 27
3.1.5 Juodųjų serbentų (Ribes nigrum) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas ... 28
3.1.6 Mėlynių (Vaccinium myrtillus) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas ... 29
3.1.7 Paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas .. 30
3.1.8 Sodinių šilauogių (Vaccinium corymbosum) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas... 31
3.1.9 Paprastųjų šermukšnių (Sorbus aucuparia) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas... 32
3.1.10 Dygliuotųjų šaltalankių (Hippophae rhamnoides) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas... 32
3.2 Kiekybinis antocianinų įvertinimas... 34
3.2.1 Paprastųjų aviečių (Rubus ideus) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 36
3.2.2 Žemuogių (Fragaria vesca) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 36
3.3.3 Braškių (Fragaria x ananassa) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 37
3.2.4 . Juodauogių šeivamedžių (Sambucus nigra) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 38
3.2.5 Juodųjų serbentų (Ribes nigrum) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 38
3.2.6 Mėlynių (Vaccinium myrtillus) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 39
3.2.7 Paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 40
3.2.8 Sodinių šilauogių (Vaccinium corymbosum) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 41
3.2.9 Paprastųjų šermukšnių (Sorbus aucuparia) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 42
3.2.10 Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas ... 43
3.3 Produktų su tirtų augalų žaliavomis antocianinų profilių tyrimo sistemos vystymas ... 44
IŠVADOS ... 47
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48
SANTRAUKA
L. Būdos magistro baigiamasis darbas “Liofilizuotų augalinių žaliavų antocianinų sudėties tyrimas“ / mokslinio darbo vadovas Prof. dr. Valdas Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: įvertinti antocianinus kaupiančių augalų liofilizuotų žaliavų antocianinų sudėties profilius.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti antocianinų kokybinę sudėtį liofilizuotų augalinių žaliavų mėginiuose ESC ir UESC-MS metodais.
2. Įvertinti antocianinų kiekybinę sudėtį liofilizuotų augalinių žaliavų mėginiuose. 3. Palyginti skirtingų liofilizuotų augalinių žaliavų antocianinų kiekybinius rodiklius.
Tyrimo objektas ir metodai: Tyrimo metu tirta liofilizuoti vaisių ruošiniai, kurie gaminti naudojant šių augalų žaliavas: paprastųjų aviečių (Rubus ideus); žemuogių (Fragaria vesca); braškių (Fragaria x
ananassa); juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa); juodauogių šeivamedžių (Sambucus nigra);
juodųjų serbentų (Ribes nigrum); mėlynių (Vaccinium myrtillus); paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus); sodinių šilauogių (Vaccinium corymbosum); paprastųjų šermukšnių (Sorbus aucuparia); dygliuotųjų šaltalankių (Hippophae rhamnoides). Kiekybinis ir kokybinis įvertinimas atliktas MS ir ESC pagalba. Rezultatai ir išvados: Gauti rezultatai buvo palyginti su skelbtų tyrimų rezultatais, ir nustatyta, kad kokybiniai antocianinų profiliai atitinka skelbtų tyrimų duomenis, išskyrus juodavaisių aronijų ir dygliuotųjų šaltalankių liofilizuotus ruošinius. Aronijų profilyje dominavo malvidino-3-arabinozidas, kuris nėra būdingas aronijos profiliui, o šaltalankių mėginyje nebuvo aptikta antocianinų. Didžiausi antocianinų kiekiai nustatyti mėlynių (Vaccinium myrtillus) liofilizuotų vaisių ruošinyje (2878 mg/100 g), o mažiausi - paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus) - 53,84 mg/100 g ir paprastųjų šermukšnių (Sorbus
aucuparia) - 1,27 mg/100 g bandiniuose. Mėlynėse ir sodinėse šilauogėse dominuojančių antocianinų
nebuvo galima išskirti dėl nereikšmingai besiskiriančio antocianinų pasiskirstymo profilyje. Pritaikius augalinių žaliavų antocianinų kiekybinių lygmenų vertinimo sistemą palyginti liofilizuotų augalinių žaliavų antocianinų kiekybiniai rodikliai. Visų tirtų mėginių kiekybiniai rodikliai skyrėsi.
SUMMARY
Master Thesis by L.Būda “Anthocyanins composition of liophilized material research“ / research super-visor professor V.Jakštas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Phar-macy, Analytical Chemistry and Toxicology Cathedral. – Kaunas.
The aim: to evaluate the anthocyanin composition profiles of lyophilized raw materials of anthocyanin-accumulating plants.
Objectives : 1. Investigation of the qualitative composition of anthocyanins in samples of lyophilized plant raw materials by ESC and UPLC-MS methods.
2. Investigation of the quantitative composition of anthocyanins in samples of lyophilized materials. 3. Comparison of anthocyanin profile of different lyophilized materials and characterization of analytical markers.
Research object and methodology: During the study, 11 different varieties of lyophilizates with an-thocyanin-accumulating properties were studied: Raspberry (Rubus ideus); Garden strawberry
(Fragaria vesca); Strawberry (Fragaria x ananassa); Black aronia (Aronia melanocarpa); Sea
buck-thorn (Hippophae rhamnoides); Elderberry (Sambucus nigra); Black currant (Ribes nigrum); Blueberry
(Vaccinium myrtillus); Cherry (Prunus cerasus); Blueberry (Vaccinium corymbosum); Rowan (Sorbus aucuparia). Quantitative and qualitative evaluation was performed by MS and HPLC
Results and conclusions: All qualitative anthocyanin profiles obtained correspond to the test data, ex-cept for the Black Chokeberry (Aronia melanocarpa) and the Common Rowan (Sorbus aucuparia). Chokeberry profile was dominated by Mvd-3-ara, which is not characteristic of the chokeberry profile, and Sea Buckthorn role as a control sample in the study, its anthocyanins were not detected in its profile. Maximum levels of anthocyanins was found in the freeze-dried fruit of Vaccinium myrtillus - 2878 mg / 100 g, and the lowest - in Cherry (Prunus cerasus) - 53,84 mg / 100 g, and in Rowan (Sorbus aucuparia) - 1,27 mg / 100 g. The dominant anthocyanins in blueberry and billberry were not evaluated due to the specific position of anthocyanins in the profile. Based on the results obtained, we can include all samples tested except for chokeberry in food supplements and products with a potential for detection of antho-cyanin evaluation database due to the non-characteristic profile.
PADĖKA
Esu nuoširdžiai dėkingas Pranui Viškeliui už geranoriškumą, suteikiant galimybę pamatyti
LAMMC Sodininkystės ir daržininkystės instituto kolekcijas ir sodus, taip pat už pagalbą surenkant tinkamą tiriamąją grupę - vaisių liofilizatus.
Lieku dėkingas Mindaugui Marksai, Mindaugui Liaudanskui, Vaidotui Žvikui už geranoriškumą padedant naudojantis visais reikalingais įtaisais ir interpretuojant gautus rezultatus.
SANTRUMPOS
ACN - acetonitrilas Cyd-3-rut - Cianidino-3-rutinozidas Cyd-3-sop - Cianidino-3-sofrozidas Cyd-3-glu-rut - Cianidino-3-gliukozid-rutinozidas Cyd-3-sam - Cianidino-3-sambubiozidas Cyd-3,5-diglu - Cianidino-3,5-digliukozidas Cyd-3-mal-glu - Cianidino-3-malanoil-gliukozidas Cyd-3-gal - Cianidino-3-galaktozidas Cyd-3-glu - Cianidino-3-gliukozidas Cyd-3-ara - Cianidino-3-arabinozidas ESC - efektyvioji skysčių chromatografija Dpd-3-gal - Delfinidino-3-galaktozidas Dpd-3-glu - Delfinidino-3-gliukozidas Dpd-3-ara - Delfinidino-3-arabinozidas Dpd-3-rut - Delfinidino-3-rutinozidas Mvd-3-gal - Malvidino-3-galaktozidas Mvd-3-glu - Malvidino-3-gliukozidas Mvd-3-ara - Malvidino-3-arabinozidas MS - masių spektrometrija Pgd-3-rut - Pelarginidino-3-rutinozidas Pgd-3-glu - Pelarginidino-3-gliukozidas Pgd-3-mal-glu - Pelarginidino-3-malanoil-gliukozidas Pgd-3-acetil-glu - Pelarginidino-3-acetil-gliukozidas Ptd-3-glu - Petunidino-3-gliukozidas Ptd-3-gal - Petunidino-3-galaktozidas Ptd-3-ara - Petunidino-3-arabinozidas Pnd-3-gal - Peonidino-3-galaktozidas Pnd-3-ara - Peonidino-3-arabinozidas Pnd-3-rut - Peonidino-3-rutinozidas Pnd-3-glu - Peonidino-3-gliukozidas PDA - Fotodiodų matricos dedektoriusĮVADAS
Antocianinai - tai augalų antriniai metabolitai, pasižymintys išskirtine chemine struktūra, fizikocheminėmis ir biologinėmis savybėmis. Antocianinai nustatyti vaisiuose, daugiausiai uogose, bei kituose augalų organuose, kuriems suteikia būdingą raudoną, mėlyną arba violetinę spalvas [18]. Šios grupės junginių struktūra labai panaši į flavonoidų, tačiau pasižymi tautomerinių formų įvairove, kurių viena – flavilio katijonas – išsiskiria teigiamo krūvio susiformavimu chromeno žiede, kitos formos (kaip chinoidinė bazė) pasižymi ypatingai mažu stabilumu.
Antocianinų grupės junginius kaupiančių augalų, jų žaliavų ir produktų tyrimai sparčiai plečiasi dėl aktyviai atliekamų bioaktyvumo tyrimų, kurių metu nustatyta jog antocianinai pasižymi ypač dideliu antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antidiabetiniu aktyvumu bei kitais poveikiais [19,20]. Šios grupės junginių suvartojimas maždaug 9 kartus didesnis nei flavonoidų, dėl šios priežasties yra svarbu ištirti perspektyvių produktų ir jų pagrindinių ingredientų sudėties profilius, kurie būtų taikomi analitinių žymenų charakterizavimui kontroliuojant produktų kokybę bei plėtojant aktyvumo žmogaus organizmui tyrimus [18].
Vienas svarbiausių etapų tiriant antocianinais turtingas žaliavas ir jų produktus yra tinkamas metodikos, tirpiklių ir ekstraktų pasirinkimas. Esminės problemos su kuriomis susiduriama tiriant antocianinus yra antocianinų irimas (dėl: a) temperatūros, b) pH poveikio) ir didelė antocianinų įvairovė [21]. Todėl yra svarbu pasirinkti tinkamą tyrimo objektą ir metodiką. Antocianinų stabilumui padidinti augalinės kilmės produktai gali būti laikomi žemoje temperatūroje, liofilizuojami ar kitaip technologiškai apdirbami. Atsižvelgus į technologinius ir analitinius ypatumus, tikslinga tirti antocianinais turtingus augalinių žaliavų ir ruošinių liofilizatus. Liofilizacijos metodas yra naudingas dėl to, kad išvengiama antocianinų degradacijos dėl laikymo metu patiriamų temperatūrų pokyčio, ilgo laikotarpio iki analizės, taip pat išvengiama antocianinų skilimo dėl uogose esančių rūgščių, kurios keičia terpės pH [21,22].
Lietuvoje, dėl maisto papildų kokybės kontrolės reikalavimų neapibrėžtumo, gali būti susiduriama su produktų turinio klastojimu. Nepakankamai kontroliuojant produktų kokybines charakteristikas galimas vartotojų klaidinimas, kai augalinė medžiagos, kuri yra nurodyta ženklinime, sudėtis yra nebūdinga ar sudėties profilis atitinka kitą augalinę medžiagą, galimai sietiną su klastojimu ar skiedimu siekiant pasipelnyti. Tokios sudėties variacijos gali būti aptinkamos tik atlikus išsamius kokybinius ir kiekybinius cheminės kompozicijos tyrimus. Dėl šios priežasties tikslinga tinkamu periodiškumu vertinti vaistinių augalinių žaliavų ingredientus, maisto papildus ir artimus produktus, kuriuose pagal ženklinime ar kitokiu būdu pateiktą informaciją gali būti specifikuojamas antocianinų profilis. Kadangi kiekvieno maisto papildo vertinimas skirtingomis metodologijomis reikalauja daug
išteklių ir negarantuoja galimybės rezultatų kryžminiam pritaikomumui taikant skirtingas metodikas, tikslinga sukurti šalyje plačiai vartojamų ingredientų sudėties profilių duomenų bazę, tyrimus vykdant tomis pačiomis metodologinėmis sąlygomis. Ingredientų sudėties referentiniai profiliai (,,pirštų atspaudai“) galėtų būti lyginami su vertinimui atrinkto produkto sudėties profiliu, tokiu būdu būtų galima įvertinti ne tik maisto papildo kokybinę ir kiekybinę sudėtį bet ir galimą fiziologinį ar farmakologinį poveikį žmogaus organizmui.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: įvertinti antocianinus kaupiančių augalų liofilizuotų žaliavų antocianinų sudėties profilius.
Uždaviniai:
1. Ištirti antocianinų kokybinę sudėtį liofilizuotų augalinių žaliavų mėginiuose ESC ir UPLC-MS metodais.
2. Įvertinti antocianinų kiekybinę sudėtį liofilizuotų augalinių žaliavų mėginiuose. 3. Palyginti skirtingų liofilizuotų augalinių žaliavų antocianinų kiekybinius rodiklius.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Antocianinų apžvalga1.1.1 Antocianinų apibūdinimas
Antocianinai - tai junginiai priklausantys flavonoidų grupei, daugiausiai aptinkami uogose, daržovėse, kartais grūdinėse kultūrose. Kaip ir dauguma fenolinių junginių, antocianiai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Lyginant šią savybę su vienu dažniausiai sutinkamų ir vartojamų antioksidantu - vitaminu C, nustatyta, kad cianidino grupės antocianinai aktyvesni 4,4 karto [4].
1.1.2 Antocianinų cheminės ir fizikinės savybės
Antocianinų struktūros pagrindas yra sudarytas iš 3 aromatinių žiedų: žiedas A sujungtas su heterocikliniu žiedu C, turinčiu O pirmoje padėtyje, o antrojoje padėtyje prisijungęs žiedą B. Trečioje ir penktoje padėtyse esančios hidroksilo grupės sudaro tinkamas sąlygas jungtis angliavandenių pakaitams. Esminis struktūrinis skirtumas tarp antocianidinų ir antocianinų yra cukrinė dalis kuri lemia antocianinų įvairovę. Kitaip tariant antocianidinai kartu su angliavandenio pakaitu yra vadinami antocianinais [23].
1 pav. Bendrinė antocianidinų struktūra
Antocianinų įvairovė skirtinguose augaluose ir jų žaliavose skiriasi. Tačiau nepaisant jų įvairovės, didžiausi kiekiai randami: cianidino 50%, delfinidino 12%, pelargonidino 12%, peonidino 12%, petunidino 7% ir malvidino 7% grupės derivatų. Dėl šios junginių grupės įvairovės ir potencialių antioksidacinių savybių atliekama vis daugiau naujų mokslinių tyrimų, norint rasti ir išgauti kaip įmanoma daugiau aktyvių derivatų su didžiausiu antioksidaciniu poveikiu [5].
1 lentelė. Dažniausiai aptinkami antocianidinai
Daug tyrimų atliekama norint išanalizuoti fizikines antocianinų ypatybes. Viena priežasčių yra plati maisto dažiklių paieška. Naujausių mokslinių darbų duomenimis, šiuo metu rinkoje esantys dažikliai galimai sukelia CNS, širdies sistemos pažeidimus bei astmą, todėl vykdant šių sutrikimų prevenciją ieškomi nekenksmingi pakaitai [6]. Kitas svarbus aspektas, kodėl svarbu tinkamai ištirti antocianinų fizikines savybės, tai analitinių procesų optimizavimas, tik žinant visus ypatumus bus galima tinkamai ekstrahuoti ir identifikuoti tiriamąją medžiagą. Antocianinai augaluose suteikia jiems būdingą spalvą. Šios grupės junginiai yra gerai tirpūs vandenyje, netoksiški organizmui tačiau labai nestabilūs. Dėl mažo stabilumo komplikuojasi antocianinų pritaikymas rinkoje, bei analitiniai tiriamųjų žaliavų procesai. Vieni pagrindinių veiksnių kurie daro įtaką antocianinų nestabilumui taip pat ir aktyvumui: temperatūros pokyčiai, UV, pH, deguonies poveikis, cukrinės dalies ypatumai [5]. Antocianidinų glikozilinimas stabilizuoja antocianinų struktūrą, dėl susidarančių vandenilinių jungčių molekulėje, taip pat cukrinės dalies įjungimas į aglikono struktūrą padidina tirpumą vandenyje. Norint optimizuoti analitinius procesus būtina atsižvelgti į pH reikšmes. Antocianinai yra ypač jautrūs pH pokyčiams, esant didesniam nei neutrali pH antocianinai suyra negrįžtamai. Šie junginiai savo struktūra palaiko tik esant neutraliai arba labai silpnai rūgštinei terpei, o jai rūgštėjant susidaro keturios nuo pH priklausomos transformacijos, visos reakcijos yra grįžtamos todėl ir antocianinų degradacinis procesas yra grįžtamas, kuomet pH reikšmės grįžta į normos ribas. Transformacijos metu susidarę junginiai skiriasi tiek chemine struktūra, tiek fizikinėmis savybėmis, dėl šios priežasties, atliekant analitinius
procesus gali būti gauti netikslūs rezultatai, o naudojant antocianus maisto pramonėje, gali kisti tiek estetinės, tiek skoninės maisto savybės [7].
1.1.3 Antocianinų poveikis žmogaus organizmui
Tiriant šią junginių grupę, išsiaiškinta, kad vartojant produktus, kuriuose randami didesni kiekiai antocianinų, turi įtakos įvairių lėtinių ligų profilaktikoje ir prevencijoje. Naujausių tyrimų duomenimis didžiausią poveikį turi cukrinio diabeto, vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų profilaktikoje, taip pat pasižymi antimikrobiniu, antioksidaciniu bei antiuždegiminiu efektais [8,18,24].
Atliekant mokslinius tyrimus, esant širdies ir kraujagyslių ligoms, pastebėta, jog vartojami mėlynės preparatai pasižymi vazodilataciniu bei antitrombocitiniu poveikiu. O juodojo šeivamedžio preparatai turi įtakos lipidų profilio kitimui [18].
Ne ką mažesniu poveikiu šios grupės junginiai pasižymi ir vėžio gydymo profilaktikoje bei prevencijoje. Vienas svarbiausių etapų besivystant vėžiui – procesas vadinamas angiogenezė, jo metu gerybinio auglio vietoje pradeda aktyviai vystytis naujos kraujagyslės, dėl kurių auglys geriau aprūpinamas krauju ir virsta piktybiniu, to pasekoje ląstelės gali sparčiai daugintis ir metastazuoti visame organizme. Todėl šio proceso kontrolė tampa vienu svarbiausių tikslų vėžio prevencijoje. Nustatyta, jog mėlynės preparatai turi ryškų poveikį krūties vėžio ląstelių proliferacijoje, taip pat pastebėta, jog šie preparatai pasižymi ir COX-2 geno raiškos slopinimu [25]. Įvairios kilmės antocianinai turi platų priešvėžinį spektrą: krūties, storosios žarnos, kepenų, prostatos vėžio profilaktikoje, kurios metu šie junginiai stabdo vėžinių ląstelių plitimą, jų vystymąsi, skatiną genų raišką, kurie pasižymi supresinėmis savybėmis ir slopina genų raišką, kurie skatina jo vystymąsi [24].
Ženklus efektas pastebėtas ir cukrinio diabeto gydyme, vartojant preparatus kurių sudėtyje yra cianidino, pelargonidino ir delfinidino gliukozidų. Visos šios medžiagos skatina insulino sekreciją, sumažina ląstelių rezistentiškumą insulinui, gerina inkstų ir kepenų veiklą. Esant diabetinei nefropatijai mažina oksidacinį stresą bei lipidų kiekį organizme [8].
1.2 Antocianinus kaupiantys augalai 1.2.1 Mėlynė (Vaccinium myrtillus)
Viena farmakologiškai aktyviausių medžiagų aptinkama mėlynėse yra antocianinai. Dėl šios priežasties buvo pradėta ypač aktyviai analizuoti kiekybinė ir kokybinė mėlynių sudėtis. 2008 metais
visoje Suomijoje buvo ištirta 20 mėlynių populiacijų skirtinguose šalies regionuose. Bendras antocianinų kiekis žaliavoje vidutiniškai - 2878 mg / 100 g sausos žaliavos. Šio augalo vaisiuose aptinkama iki 15 skirtingų antocianinų: delfinidino galaktozidas, delfinidino gliukozidas, delfinidino arabinozidas, cianidino galaktozidas, cianidino gliukozidas, petunidino galaktozidas, cianidino arabinozidas, petunidino gliukozidas, peonidino galaktozidas, petunidino arabinozidas, peonidino gliukozidas, malvidino galkatozidas, peonidino arabinozidas, malvidino gliukozidas, malvidino arabinozidas. Priklausomai nuo augimo sąlygų: (aukščio kuriame auga, klimato, regionio), delfinidino kiekis 100 g sausos žaliavos svyruoja nuo 481 mg iki 1385 mg; cianidino nuo 652 mg iki 1214 mg; petunidino nuo 243 mg iki 581 mg; peonidino nuo 94 mg iki 279 mg; malvidino nuo 200 mg iki 253 mg [1].
1.2.2 Juodauogis šeivamedis (Sambucus nigra)
Šis augalas priklauso Ūksmininių (Adoxacea) šeimai ir yra viena svarbiausių rūšių, kurioje aptinkami dideli antocianinų kiekiai. 2014 metais atlikto tyrimo metu buvo tiriama skirtingų šeimos rūšių, antocianinų profiliai, bei dirbtinai išveistų veislių cheminė sudėtis, iš viso 12 veislių (5 natūraliai randamos, bei 7 išvestos). Tyrimo metu iš viso nustatyta 19 antocianinų. Iš jų 7 randami juodauogio šeivamedžių uogose: cianidino sambubiosid-gliukozido, cianidino digliukozido, cianidino glikozido (pentoksido heksidozės), cianidino gliukozido, cianidino galaktozido, cianidino sambubiozido, cianidino rutinozidas. Cianidino grupės antocianinų šioje šeimoje varijuoja daugiausiai, bendras jų kiekis – 560.48 mg/100 g šviežios žaliavos masės [3].
1.2.3 Paprastoji vyšnia (Prunus cerasus)
Viena iš daugiausia, paprastąsias vyšnias, užauginančių ir eksportuojančių šalių Europoje – Vengrija. Vynuogės sudaro apie 16 % šalyje užauginamos vaisių produkcijos. Atsižvelgiant į didelius eksporto ir produkcijos kiekius, 2015 metais atlikto tyrimo metu buvo tiriamos penkios dažniausiai sutinkamos paprastųjų vyšnių rūšys. Bendras antocianinų kiekis rūšyse svyravo tarp 100 ir 220 mg/g žaliavos. Vyšniose identifikuoti antocianinai: delfinidino gliukozidas, cianidino gliukozil-rutinozidas, malvidino digliukozidas, cianidino gliukozidas, cianidino rutinozidas, petunidino gliukozidas, malvidino gliukozidas, peonidino rutinozidas, malvidino rutinozidas. Tačiau visose penkiose rūšyse
variavo trys antocianinai: cianidino rutinozidas 4 -14 mg /100 g; cianidino gliukozidas 2 – 7,9 mg/100 g; malvidino digliukozidas 0,1 – 3 mg/100 g [9].
1.2.4 Juodasis serbentas (Ribes nigrum)
Juodojo serbento vaisiuose antocianinai užima didžiausiąją dalį fenolinių junginių grupėje. 2009-2011 metais trukusio tyrimo metu, Lenkijoje, buvo tiriama keturiolika juodųjų serbentų veislių iš: Škotijos, Ukrainos bei Lenkijos. Iš viso buvo aptikti 8 antocianinai: delfinidino gliukozidas, delfinidino rutinozidas, kaumaroil gliukozidas, cianidino gliukozidas,cianidino rutinozidas, cianidino gliukozido kumarilas, peonidino rutinozidas, malvidino rutinozidas. Tačiau didžiausiąją dalį užėmė delfinidino grupės antocianiai: delfinidino gliukozidas 37,8 – 179,7 mg/100 g; delfinidino rutinozido 97,1 – 347,9 mg/100 g, ir cianidino grupės antocianinai: cianidino gliukozido 6,7 – 45,4 mg/100 g; cianidino rutinozidas 45,6 – 172,3 mg/100 g žaliavos [10].
1.2.5 Sodinė šilauogė (Vaccinium corymbosum)
Didžiausi antocianinų kiekiai randami: serbentų, gervuogių bei šilauogių gentyse. Didžiausią antocianinų kiekį kaupia šilauogių genčiai priskiriama mėlynės, antroje vietoje šilauogės. Be jokios abejonės, skirtingose rūšyse aptinkami skirtingi kiekiai medžiagų, tačiau remiantis jau atliktų tyrimų duomenimis, galima teigti, jog įvairios šilauogių rūšys kaupia ypač daug antocianinų. 2008 metais, Naujoje Zelandijoje atlikto tyrimo metu buvo tiriamos 5 šilauogių rūšys, visos buvo gautos iš Sodininkystės ir maisto tyrimų instituto Naujojoje Zelandijoje. Šilauogių uogose buvo rasta 10 skirtingų antocianinų, daugiausia jų malvidino ir delfinidino grupių: malvidino galaktozido 7 – 79,8 mg; malvidino gliukozido 0,5 – 56,6 mg; malvidino arabinozido 7,1 – 38,4 mg; delfinidino galaktozido 3 – 69,5 mg; delfinidino gliukozido 0,2 – 33,2 mg; cianidino gliukozido 0,1 – 15,2 mg; cianidino galaktozido 2,8 – 49,4 mg; petunidino arabinozido 3,6 – 28 mg; petunidino galaktozido 3,3 – 41,7 mg; petunidino gliukozido 0,3 – 33 mg 100 g žaliavos [26].
1.2.6 Juodavaisė aronija (Aronia melanocarpa)
Juodavaisių aronijų vaisiai nepasižymi tokia didele antocianinų gama kaip mėlynės, tačiau dėl didėjančios paklausos pramonės ir mokslo srityse, tyrimai parodė jog šio augalo vaisiuose yra gausu antocianinų. 2013 – 2014 metais atlikto tyrimo metu, Norvegijoje, buvo tiriamos dvi aronijų rūšys: A. melanocarpa ir A. prunifolia. Tyrimui buvo pasirinkta 3 veislės A. melanocarpa augalų, kurių vaisiai buvo renkami Norvegijoje ir Vokietijoje, o A. prunifolia augalo vaisiai buvo renkami Vokietijoje, visų augalų vaisiai surinkti 2010-2011 metų laikotarpyje. Aronijų vaisiuose daugiausiai aptinkami cianidino grupės antocianinai: cianidino galaktozido 168 – 497 mg/100 g; cianidino gliukozido vos aptinkami kiekiai; cianidino arabinozido 52 – 236 mg/100 g cianidino ksilozido 2,7 – 12 mg/100 g žaliavos [11]. Tačiau, yra duomenų, jog aronijų vaisiuose galima rasti ir daugiau antocianinu, tai priklauso nuo rūšies bei augimo sąlygų. Galimai aptinkami pelargonidino grupės antocianinai: arabinozidas, galaktozidas ir kt [12].
1.2.7 Paprastasis šermukšnis (Sorbus aucuparia)
Antocianinai pasižymi dideliu antioksidaciniu aktyvumu, taip pat šios grupės medžiagos yra atsakingos už augalo spalvą. Didelių antocianinų kiekiu pasižymi augalai kurių vaisiai yra tamsesnės spalvos: mėlynos, juodos, tačiau ne ką mažiau jų randama ir raudonos spalvos vaisiuose. Paprastųjų šermukšnių vaisiai yra oranžinės spalvos, dėl šios priežasties jo vaisiai yra neįtraukiami į profilio variacijos tyrimus padarius prielaidą, kad oranžinės spalvos vaisiuose antocianinų neaptinkama. Tačiau nepaisant jo spalvos, paprastųjų šermukšnių vaisiuose, nors ir maži antocianinų kiekiai, bet yra aptinkami. Dėl šios priežasties antocianinų profilio variacijos tyrimuose šis augalas įtraukiamas retai. Vienas pirmų tyrimų kuriame buvo tiriamos šermukšnių uogos buvo atliktas 2006 metais. Vėliau jis buvo atnaujintas 2010 metais [13]. Abu tyrimai vyko Suomijoje, jų metu buvo tiriama laukinė bei 4 paprastųjų šermukšnių veislės. Taigi po ESC ir masių spektroskopijos tyrimų laukinių šermukšnių uogose buvo užfiksuoti cianidino grupės antocianinai: galaktozidas bei arabinozidas [14]. Taip pat šio augalo vaisiai buvo įtraukti į šiek tiek platesnį, 2015 metais, Slovėnijoje vykusį tyrimą, kurio metu buvo tiriamos 24 rūšys uogų. Jo metu, šermukšnių uogose, be dviejų jau minėtu antocianinų buvo užfiksuota ir cianidino gliukozidas. Taigi šio augalo vaisiai kaupia cianidino grupės antocianinus: galaktozidą 181 ± 11,6 mg; gliukozidą 8,2 ± 0,3 mg; arabinozidą 9,4 ± 0,4 mg 100 gramų žaliavos [4].
1.2.8 Dygliuotasis šaltalankis (Hippophae rhamnoides)
Paprastuosiuose šermukšniuose antocianinų aptinkama mažai, tačiau dygliuotųjų šaltalankių vaisiuose jų aptinkama dar mažiau, todėl panašaus pobūdžio tyrimų su šiuo augalu beveik neatliekama. 2009 metais, Kanadoje, tiriant braškių, aviečių, miškauogių, aronijų bei šaltalankių vaisių fenolinių junginių antioksidacinį aktyvumą, antocianinų šaltalankių uogose aptikta nebuvo [15]. Tokie patys rezultatai gauti ir 2011 metais, Kinijoje, atlikto tyrimo metu. Jo metu buvo tiriama 12 skirtingų augalų rūšių iš šiaurės Kinijos. Laukinio šaltalankių uogų ekstrakte antocianinų neaptikta [16]. Tačiau 2014 metais, Indijoje, atlikto tyrimo metu, kuriame buvo analizuojami dygliuotųjų šaltalankių vaisių sulčių milteliai, buvo aptikta antocianinų pėdsakų. Produkto gamybos pabaigoje 100 gramų buvo nustatyta 1,15 mg antocianinų, tad tolimesni identifikavimo tyrimai nebuvo vykdomi. Taigi nors randami labai maži antocininų kiekiai, tačiau jų yra, tereikia juos identifikuoti [17].
1.2.9 Paprastoji avietė (Rubus ideus)
2012 metais Kanadoje atlikto tyrimo metu buvo analizuojamas askorbo rūgšties kiekis bei antocianinų profilis 10 aviečių veislių bei 2 eksperimentiniuose genotipuose. Eksperimento metu, 3 metų laikotarpyje, buvo vertinami faktoriai (klimato temperatūra, augimvietės), kurie galimai daro įtaką šių medžiagų kiekiui. Tyrimo rezultatai parodė jog antocianinų kiekis kinta priklausomai nuo temperatūros, tačiau profilis išlieka pastovus visoje tiriamojoje grupėje. Avietėse daugiausiai paplitę cianidino grupės antocianinų: Cyd-3-sop, Cyd-3-glu, Cyd-3-glu-rut, Cyd-3-rut [27]. Taip pat yra informacijos, kad šiose uogose galima rasti ir pelargonidino grupės antocianinų: Pgd-3-sop, Pgd-3-glu, Pgd-3-rut. Tačiau tai tik pėdsakai, dominuojantys antocianinai - cianidinai, kurie aviečių bendrame antocianinų kiekyje sudaro 90% ir daugiau [27, 28].
1.2.10 Braškė (Fragaria x ananassa); Žemuogė (Fragaria vesca)
Abu augalai priklauso tai pačiai šeimai - Erškėtinių, bei tai pačiai genčiai- žemuogių. Dėl šios klasifikacinės padėties, abiejų augalų antocianinų profiliai praktiškai identiški. Identifikuojami tie patys antocianinai, tik jų kiekis santykinai skiriasi. Šios genties augalai susilaukia didelio mokslininkų dėmesio dėl plataus fenolinių junginių kiekio. Skirtinguose tyrimuose dažniausiai aptinkama nuo 6 iki 10 skirtingų antocianinų. 2011 metais tiriant braškių fenolinių junginių variaciją buvo aptikti 6 skirtingi
antocianinai. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad dominuojantys antocianinai yra cianidino ir pelargonidino grupės. Daugiausia užfiksuota: Pgd-3-glu ir 3-glu. Mažesni kiekiai užfiksuoti: Cyd-3-rut, Pgd-Cyd-3-rut, Pgd-3-mal-glu, Pgd-3-acetyl-glu [29]. Tų pačių grupių antocianiai dominuoja ir žemuogės vaisiuose. 2012 metai atlikto tyrimo metu buvo lyginama 4 žemuogės veislių polifenolinių junginių variacija. Nustatyti 7 skirtingi antocianinai. Dominuojantys antocianinai: Cyd-3-glu ir Pgd-3-glu. Mažiau užfiksuota: Cyd-3-gal, Pnd-3-glu, Cyd-3-mal-glu, Pgd-3-mal-glu, Pnd-3-mal-glu [31].
1.3 Antocianinų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai
Vienas plačiausiai naudojamų analizės metodų yra chromatografija, taip yra dėl to, kad šis metodas yra naudojamas ne tik analičių atskyrimui bet ir kiekybiniam jų įvertinimui. Be to, šio metodo pagalba galima nustatyti platų junginių spektrą. Taip pat šis metodas naudojamas kartu su masių spektrometrija tapo vienu tiksliausių ir greičiausių analizės metodų. Šis metodikų naudojimas kartu yra labai naudingas, nes naudojant chromatografiją sunkiai atskiriamų medžiagų analizėje, masių spektrometrija išskirsto medžiagas žymiai tiksliau, todėl atlikus tyrimus galima pilnai identifikuoti visus junginius ir įvertinti jų kiekybinę sudėtį [44].
Atsižvelgus į plačiai naudojamų metodikų privalumus, buvo nuspręsta, kad jie yra tinkami naudoti šiame tyrime. Šie metodai neabejotinai vieni dažniausiai pasirenkamų atliekant antocianinų profilio variacijos tyrimus, tai buvo viena priežasčių pasirenkant šiuos metodus dėl objektyvaus rezultatų palyginimo.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektasTyrimo metu tirta 11 skirtingų augalų rūšių liofilizuotų vaisių ruošinių mėginiai. Liofilizuoti rušiniai buvo gaminami naudojant šių augalų žaliavas: paprastųjų aviečių (Rubus ideus); žemuogių
(Fragaria vesca); braškių (Fragaria x ananassa); juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa);
juodauogių šeivamedžių (Sambucus nigra); juodųjų serbentų (Ribes nigrum); mėlynių (Vaccinium
myrtillus); paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus); sodinių šilauogių (Vaccinium corymbosum); paprastųjų
šermukšnių (Sorbus aucuparia); dygliuotųjų šaltalankių (Hippophae rhamnoides). Tiriamoji žaliava liofilizuota forma buvo gauta iš Lietuvos Agrarinių ir Miškų Mokslo Centro sodininkystės ir daržininkystės instituto kolekcijų ir sodų. Laikymo sąlygos tyrimo metu -5°C.
2.2 Naudoti reagentai
Visi naudoti reagentai buvo analitinio grynumo. Naudoti tirpikliai: Metanolis ; ACN; koncentruota fosforo rūgštis; koncentruota HCl rūgštis; bevandenė skruzdžių rūgštis - visi reagentai pirkti iš „Sigma-Aldrich“ (Vokietija). Mėlynių sausasis ekstraktas CRS (Europos direktoratas vaistų kokybei ir sveikatos rūpybai). Taip pat analizėje buvo naudotas išgrynintas vanduo gamintas laboratorijoje.
2.3 Naudota aparatūra
Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV);
Waters Xevo trijų kvadrupolių masių spektrometras (Waters Corporation, Milford, JAV)
Waters 2998 PDA detektorius (Waters, Milford, JAV) ;
4,6x250 mm, 1,7 μm atvirkštinių fazių ESC kolonėlė (ACE 5 C18);
2x100 mm ,1,9 μm ESC kolonėlė (YMC-Triart C18)
Mikropipetės „Eppendorf Research‖ (JAV);
Matavimo kolbos;
Membraninis, 0,22 μm porų dydžio filtras Carl Roth GmbH, Karlsruhe (Vokietija);
2.4 Ekstraktų paruošimas
Kiekvieno ėminio svoris tyrimo metu 1,000g. Ėminiai buvo ekstrahuojami druskos rūgšties ir metanolio mišiniu (2:98 V/V), vėliau šie ekstraktai buvo praskiesti tuo pačiu mišiniu iki 25 ml. Iš kiekvieno gauto ekstrakto buvo atmatuota po 5 ml, kurie buvo filtruojami popieriaus filtru ir skiedžiami praskiesta fosforo rūgštimi ( 11,5:88,5 V/V) iki 10 ml.
2.5 ESC taikymas vertinant antocianų profilius kiekybiškai ir kiekybiškai
Antocianinų kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatoma efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Pamatuojama 2 ml gauto ekstrakto, ir dar kartą filtruojama pro membraninį, 0,22 μm porų dydžio filtrą (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija). 10 μl skysto ekstrakto yra injekuojama į atvirkštinių fazių ESC kolonėlę ACE 5 C18, kolonėlės diametras 4,6x250 mm. Eliuentų tėkmės greitis 1ml/min. Taikytas gradientinis eliuavimas. Eliuentas A – praskiesta bevandenė fosforo rūgštis (8,5:91,5 V/V), eliuentas B – ACN.
2 lentelė. Eliucijos gradiento kitimas
Laikas Judančioji fazė A (%) Judančioji fazė B (%)
0-35 9375 725
35-45 7535 2565
45-46 350 65100
46-50 0 100
Analizė atliekama kambario temperatū roje. Bendras analizės laikas – 60 min. Matavimams at-likti naudojamas Waters 2695 skysčių chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV), sujungtas su 2998 PDA detektoriumi. Detekcija atliekama esant 525 nm bangos ilgiui. Antocianinų tapatybė buvo
nustatyta lyginant analičių sulaikymo trukmes su standartų sulaikymo trukmėmis ir spektrais, gautais su PDA detektoriumi. Antocianinų kiekis apskaičiuotas lyginant analičių smailių plotus su antocianinų standartų smailių plotais.
2.6 UESC-MS taikymas antocianinų identifikavimui
Masių spektrometrijos pagalba buvo įvertintas pilnas tiriamųjų, antocianinų profilis. Ultra efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija veiksmingas metodas, skirtas kiekybinei antocianų analizei ir jų identifikavimui atlikti.
MS detektavimo sąlygos: kapiliarinė temperatūra – 550 °C, purškimo įtampa – 3,5 kV. Jonizacijos laipsnis - teigiamas.
UESC detektavimo sąlygos:10 μl skiesto ekstrakto yra injektuojama į YMC-Triart C18 kolonėlę, dalelių dydis 1,9 μm, kolonėlės diametras 2x100 mm. Eliuentų tėkmės greitis 0,5 ml/min. Taikytas gradientinis eliuavimas. Eliuentas A – praskiesta 0,1% skruzdžių rugštis, eliuentas B – ACN. Kolonėlės temperatūra - 40°C
3 lentelė. Eliucijos gradiento kitimas
Laikas Judančioji fazė A (%) Judančioji bazė B (%)
1 95% 5% 5 70% 30% 7 50% 50% 7,5 0% 100% 8 0% 100% 8,1 95% 5% 10 95% 5%
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Kokybinis antocianinų įvertinimasGauti ESC it MS rezultatai buvo lyginami tarpusavyje. Dalis junginių buvo identifikuota ESC pagalba, lyginant gautus rezultatus su turimu mėlynių ekstrakto standartu. MS pagalba buvo identifikuota likusi dalis antocianinų interpretuojant gautus duomenis ir lyginant juos su straipsniuose pateikta informacija.
Identifikuojant antocianinus taip pat buvo vertinimas sulaikymo faktorius (Rf). Tai daryti buvo
nuspręsta dėl keleto priežasčių. Viena jų - antocianinų identifikavimas, atsižvelgiant į sulaikymo faktorių galima palengvinti sunkiai atskiriamų antocianinų identifikavimą. Kita priežastis - metodologinių savybių (eliucinės gebos) stebėjimui, atliekant tyrimus su didele tiriamųjų grupe kaip ši, atsiranda faktorių dėl kurių didėja daromų klaidų rizika, todėl stebint sulaikymo faktorius tyrimo metu galima sumažinti klaidų atsiradimo riziką ir gauti tikslesnius rezultatus. Paskutinioji priežastis yra svarbi anto-cianinus kaupiančių žaliavų ir maisto papildų vertinimo sistemai, skaičiuojamas sulaikymo faktorius leistų daryti prielaidas ir išvadas lyginant dviejų ar daugiau tyrimų metodikas.Taigi atsižvelgus į sulaikymo faktoriaus teikiamą naudą buvo nuspręsta šį analitinį žymenį įtraukti į tyrimą.
3.1.1 Paprastųjų aviečių (Rubus ideus) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
2 pav. Paprastųjų aviečių vaisių chromatograma: 1. Cyd-3,5-diglu; 2. Cyd-3-sop; 3. Cyd-3-glu-rut; 4. Cyd-3-glu
Analizuojant paprastųjų aviečių vaisius buvo aptikti 4 antocianinai: Cyd-3,5-diglu; Cyd-3-sop; Cyd-3-glu-rut. Šie antocianinai buvo identifikuoti masių spektrometrijos pagalba, nustačius, jog aktyvių junginių m/z reikšmės yra: 611; 757. 3-glu identifikuotas remiantis ESC gautais rezultatais. Cyd-3-glu sulaikymo faktorius 0,291 lyginant su dominuojančiu piku. Kitų junginių sulaikymo faktoriai: Cyd-3-glu-rut - 0,196; Cyd-3,5-diglu - 0,210; Cyd-3-glu- 0,291.
Atsižvelgiant į ankščiau darytus tyrimų rezultatus galima teigti jog visi nustatyti antocianinai gali būti randami paprastosiose avietėse bei kitose jos veislėse. G.Borges ir kitų atlikto ikiklinikinio tyrimo su pelėmis metu, buvo tirtas antocianinų biopreinamumas pelėms. Rezultatai parodė jog kraujo plazmoje buvo rasta, 9 skirtingų antocianinų pėdsakai: cianidino ir pelargonidino grupės [30]. Lyginant abu tyrimus galima teigti jog, dominuojanti grupė yra cianidino grupė, o pelarginidino antocianinų gali būti randama labai mažai arba nerandama. Būtent tokie rezultatai buvo gauti A.Cata ir kitų atlikto tyrimo metu, kada buvo tirtos 8 skirtingų rūšių uogos, analizuojant aviečių bandinius rezultatai parodė vienintelį dažniausiai aptinkamą pelargonidino grupės antocianiną - Pgd-3-glu, kuris sudarė tik 0,8% bendro antocianinų kiekio [28].
3.1.2 Žemuogių (Fragaria vesca) ir braškių (Fragaria x ananassa) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
3 pav. Žemuogių vaisių chromatograma: 1. Cyd-3-glu; 2. Pgd-3-Glu; 3. Pnd-3-glu; 4. Cyd-3-mal-glu; 5. Pgd-3-mal-glu; 6. X
Tiriant abiejų rūšių uogas buvo nustatyti 9 skirtingi antocianinai: cianidino, pelarginidino ir peonidino grupės. Abiejų tiriamųjų kokybiniai chromatografiniai profiliai yra panašūs, taip yra dėl to jog abu augalai priklauso tai pačiai šeimai ir genčiai. Žemuogėse rasti 5 antocianinai: Cyd-3-glu; Pnd-3-glu kurie identifikuoti ESC pagalba. Peonidino-3-gliukozido sulaikymo faktorius buvo 0,451. Cyd-3-mal-glu; Pgd-3-Cyd-3-mal-glu; Pgd-3-Glu antocianinai identifikuoti pasitelkiant MS metodiką, kurioje aktyvumą parodė junginiai su 535; 519 ir 433 m/z reikšmėmis, jų sulaikymo faktoriai buvo: 0,612; 0,691; 0,241 atitinkamai, o X - 0,794 lyginant su dominuojančiu piku (Cyd-3-glu).
4 pav. Braškių vaisių chromatogramos 1. Cyd-3,5-diglu; 2. Cyd-3-glu; 3. Pgd-3-Glu; 4.Pgd-3-rut; 5. Cyd-3-mal-glu; 6. Pgd-3-mal-glu; 7. Pgd-3-acetil-glu; 8. X
Braškėse rasti 7 antocianinai: Cyd-3-glu identifikuotas ESC pagalba, o likę: Pgd-3-Glu (433 m/z); Pgd-3-rut (579 m/z); Cyd-3-mal-glu (535 m/z); Pgd-3-mal-glu (519 m/z); Pgd-3-acetil-glu (475 m/z); diglu (611 m/z) MS pagalba. Braškių profilio antocianinų sulaikymo faktoriai: Cyd-3,5-diglu - 0,314; Cyd-3-glu - 0,192; 3-rut - 0,140; Cyd-3-mal-glu - 0,314; 3-mal-glu - 0,363; Pgd-3-acetil-glu - 0,425; 8. X - 0,446 lyginant su dominuojančiu piku (Pgd-3-glu).
Tarpusavyje abiejų augalų antocianinų profiliai skiriasi tik tuo jog braškėse buvo rasta Cyd-3-sop, Pgd-3-acetil-glu ir Pgd-3-rut pėdsakų kurių nebuvo galima matyti žemuogių profilyje. Tikėtina kad žemuogėse nenustatytas 6 antocianinas yra tas pats kaip ir braškių chromatogramoje neatpažintas 8 antocianinas. Lyginant abiejų mėginių profilius su kitų tyrimų metu gautais profiliais galima teigti jog aukščiau pateikti profiliai yra būdingi šiems augalams. M.D.Bubba ir kitų atlikto tyrimo metu buvo analizuojami 4 skirtingų veislių žemuogės, tyrimo pabaigoje gautas kokybinis antocianinų profilis buvo identiškas aukščiau pateiktam profiliui [31]. Šiek tiek didesniais skirtumais nei būdinga pasižymėjo braškių profilis. Nors didžioji dalis rastų antocianinų yra būdingi braškėms, tačiau Cyd-3,5-diglu
aptinkama retai. H.Kelebek ir S.Selli atlikto ikiklinikinio tyrimo metu buvo tiriama kaip braškių polifenoliniai junginiai veikia pažeistą skrandžio gleivinę. Tyrimo metu buvo tirta kraujo plazma, joje buvo nustatyta daugiausiai pelargonidino grupės antocianinų, taip pat buvo rasta cianidino darinių [29]. Panašus braškių profilis buvo gautas tais pačiais metais daryto tyrimo metu. Šiame eksperimente buvo tirta fenolinių junginių variacijos braškėse. Šio tyrimo rezultatai taip pat parodė jog daugiausiai šiame augale paplitę cianidino ir pelargonidino grupės antocianinai [32].
3.1.3 Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
Atlikus straipsnių analizę, galima teigti jog dominuojanti grupė aronijų vaisiuose yra cianidino. J.Oszmianski ir S.Lachowicz, Lenkijoje, atliekant aronijų cheminės kompozicijos ir antiksidacinio aktyvumo tyrimus, gauti rezultatai parodė jog tiek sultyse tiek vaisiuose gauti cianidino grupės antocianinai. Nustatyti šie antocianinai: Cyd-3-gal; Cyd-3-glu; Cyd-3-ara, mažesnis kiekis cianidino ksilozido, taip pat kitų rečiau ir labai mažais kiekiais sutinkamų antocianinų [38]. Panašūs duomenys užfiksuoti K.Appel ir kitų, Vokietijoje, analizuojant aronijų ekstraktų poveikį malšinant uždegiminius procesus. Atlikus sausos žaliavos cheminę analizę rezultatai parodė, jog profilį sudaro cianidino grupės antocianinai [39]. Taigi, remiantis straipsnių duomenimis galime teigti jog aronijų ruošiniuose dominuojantys antocianinai yra cianidino grupės.
5 pav. Juodavaisių aronijų vaisių chromatograma: 1. 3-glu-rut; 2. 3-gal; 3. Cyd-3-glu; 4. Ptd-3-gal; 5. Cyd-3-ara; 6. Mvd-3- ara
Tačiau atlikus tyrimus buvo gauti rezultatai kitokie nei tikėtasi, ESC pagalba nustatyti šie antocianinai: Cyd-3-gal; Cyd-3-glu; Ptd-3-gal; Cyd-3-ara; Mvd-3-ara, o MS pagalba Cyd-3-glu-rut kurio m/z reikšmė - 757. Lyginant gautus rezultatus, galime teigti, jog gautas profilis nėra standartinis aronijų vaisiams. Galime daryti prielaida, kad tai yra kitos veislės aronijų vaisiai.
Dėl aronijų profilio netinkamumo tolimesniems tyrimams, sulaikymo faktorius skaičiuotas nebuvo.
3.1.4 Juodauogių šeivamedžių (Sambucus nigra) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
Tiriant juodauogių šeivamedžių vaisius buvo aptikti 2 antocianinai: MS pagalba - Cyd-3-sam (581 m/z), o Cyd-3-glu identifikuotas naudojant ESC. Cyd-3-sam sulaikymo faktorius - 0,270 lyginant su Cyd-3-glu.
Paprastai kitose šeivamedžių veislėse randama daugiau cianidino grupės antocianinų, tačiau juodauogiuose šeivamedžiuose būdingiausi sambubiozido bei gliukozido angliavandenių radikalus turintys cianidinai. Tipinis šeivamedžių profilis buvo gautas Liublianos universitete dirbančių mokslininkų atlikto tyrimo metu, kuriame buvo tirtos keturios šeivamedžių veislės. Nustatyta 15 skirtingų antocianinų, tačiau juodauogiuose šeivamedžiuose nustatyti tik ankščiau minimi du [3]. R.Veberic ir kitų atlikto tyrime metu, kuriame buvo tiriamos 24 uogų rūšys, nustatyta šiek tiek platesnis šeivamedžių antocianinų profilis. Nors dominuojanti grupė išlieka cianidinai, tačiau buvo aptikta ne tik pastarieji du, bet ir Cyd-3,5-diglu; Cyd-3-rut [4]. Taigi, galima teigti jog gautas antocianinų profilis yra būdingas šeivamedžiams.
3.1.5 Juodųjų serbentų (Ribes nigrum) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
Analizuojant kompleksinius straipsnius, kuriuose analizuojama didelės tiriamosios grupės, galime teigti jog juodieji serbentai turi siauriausią profilį lyginant su baltaisiais ir raudonaisiais serbentais, tačiau juodųjų serbentų profilis yra dominuojantis visose serbentų rūšyse [33]. Gautas kokybinis serbentų profilis nustatytas ESC pagalba: Dpd-3-glu; Cyd-3-glu, o atlikus masių spektrometriją identifikuoti šie antocianinai: Dpd-3-rut (611 m/z); Cyd-3-rut (595 m/z); Pgd-3-glu (433 m/z); Pgd-3-rut (579 m/z); Pnd-3-rut (609 m/z); Cyd-3-sop (611 m/z). Šių junginių sulaikymo faktoriai: Dpd-3-glu - 0,143; Cyd-3-sop - 0,055; Cyd-3-glu - 0,110; Cyd-3-rut - 0,282; glu; - 0,413 Pgd-3-rut - 0,482; Pnd-3-Pgd-3-rut - 0,815 lyginant su Dpd-3-Pgd-3-rut.
7 pav. Juodųjų serbentų vaisių chromatograma: 1. Dpd-3-glu; 2. sop; 3. Dpd-3-rut 4. Cyd-3-glu; 5. Cyd-3-rut; 6. Pgd-3-Cyd-3-glu; 7. Pgd-3-rut; 8. Pnd-3-rut
D.Thornton ir kitų atlikto tyrimo metu, kuriame buvo analizuojamas chromatografijos proceso optimizavimas norint izoliuoti antocianinus iš serbentų, dėl jų nestabilumo, buvo aptikti 4 dažniausiai sutinkami antocianinai: Dpd-3-glu; Dpd-3-rut; Cyd-3-glu; Cyd-3-rut. Lyginant abiejų tyrimų rezultatus galima teigti jog gautas serbentų profilis yra būdingas šiai rūšiai [34]. H.Antolak ir kitų analizuojant mėlynių ir serbentų cheminę kompoziciją, buvo nustatyti šiek tiek platesnis profilis, kurį papildė Ptd-3-glu ir Ptd-3-rut [35]. Atlikus platesnę straipsnių analizę galima teigti, kad nepaisant aukščiau matomų identifikuotų antocianinų galima sutikti ir kitus rutinozido ir gliukozido dalį turinčius antocianinus [4,33].
Taigi galima teigti, kad gautas serbentų profilis yra būdingas. Dominuojantys antocianinai yra cianidino ir delfinidino grupės, tačiau galima sutikti ir pelargonidino, peonidino, petunidino ir malvidino
grupes. Serbentų antocianinų profilis pasižymi specifine savybe - dažniausiai sutinkamos dvi cukrinės dalys: rutinozidas ir gliukozidas.
3.1.6 Mėlynių (Vaccinium myrtillus) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
Teigiama, kad mėlynės yra augalai turintys plačiausią antocianinų profilį. Tyrimo eigoje buvo gautas mėlynėms būdingas profilis kurį sudaro 5 iš 6 pagrindinių antocianinų grupių: cianidino, delfinidino, petunidino, peonidino, malvidino. Visi antociainai buvo nustatyti ESC pagalba. ESC rezultatai parodė jog, gautas mėlynių profilis yra visiškai identiškas mėlynių ekstrakto standartui. Lyginant gautą profilį su kitų tyrimų duomenimis taip pat galima teigti, kad nustatyti antocianinai yra būdingi mėlynėms [4,16].
Mėlynių profilio antocianinų sulaikymo faktoriai: 3-glu - 0,105; 3-ara - 0,029; Dpd-3-gal - 0,231; Cyd-3-glu - 0,160; Ptd-Dpd-3-gal - 0,245; Cyd-3-ara - 0,277; Ptd-3-glu - 0,396; Pnd-Dpd-3-gal - 0,503; Ptd-3-ara - 0,538; Pnd-3-glu - 0,682; Mvd-3-gal - 0,716; Pnd-3-ara - 0,799; Mvd-3-glu - 0,839; Mvd-3-ara - 0,901 lyginant su Cyd-3-gal.
8 pav. Mėlynių vaisių chromatograma: 1. Dpd-3-gal; 2. Dpd-3-glu; 3. Cyd-3-gal; 4. Dpd-3-ara; 5. Cyd-3-glu; 6. Ptd-3-gal; 7. Cyd-3-ara; 8. Ptd-3-glu; 9. Pnd-3-gal; 10. Ptd-3-ara; 11. Pnd-3-glu; 12.
3.1.7 Paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
Skirtingose vyšnių rūšyse aptinkami skirtingi antocianinų profiliai. Varšuvos universitete, Lenkijoje, tiriant paprastųjų vyšnių likerio stabilumą ir antioksidacinį aktyvumą, buvo aptikta: Cyd-3-sop; Cyd-3-glu-rut; Cyd-3-glu; Cyd-3-sam; Cyd-3-rut [36]. Tuo tarpu J.Lee tyręs antocianinų kompoziciją ir kokybę 30-yje įvairių vyšnių maisto papildų, aptikto: sop; glu-rut; Cyd-3-glu; Pgd-3-sop; Cyd-3-rut [37]. Tačiau visai kitoks profilis buvo gautas, J.R.Hamoki ir kitų, Vengrijoje daryto tyrimo metu. Nustatyti šie antocianinai: Dpd-3-glu; Cyd-3-glu-rut; Mvd-3-diglu; Cyd-3-glu; Cyd-3-rut; Ptd-3-glu; Mvd-3-glu; Pnd-3-rut; Mvd-3-rut [9]. Taigi lyginant visus tris tyrimus galima teigti jog dominuojanti antocianinų grupė yra cianidinai. Dažniausiai sutinkamos cukrinės dalys: rutinozidas sofrozidas, gliukozil-rutinozidas, gliukozidas. 9 paveiksle pateiktos chromatogramos pagalba buvo nustatytas - Cyd-3-glu, kurio sulaikymo faktorius buvo 0,021. Likę antocianinai identifikuoti masių spektrometrijos pagalba, kurios metu aktyvumas pastebėtas ties 611 (Cyd-3-sop); 757 (Cyd-3-glu-rut); 595 (Cyd-3-rut); 609 (Pnd-3-rut) m/z reikšmėmis. Identifikuotų antocianinų sulaikymo faktoriai: Cyd-3-sop - 0,133; Cyd-3-glu - 0,021; Cyd-3-rut - 0,178; Pnd-3-rut - 0,602. Lyginant su Cyd-3-glu-rut. Taigi galima teigti, kad 4 iš 5 antocianinų yra būdingi vyšnioms, o Pnd-3-rut sutinkamas rečiau.
9 pav. Paprastųjų vyšnių vaisių chromatograma: 1. Cyd-3-sop; 2. Cyd-3-glu-rut; 3. Cyd-3-glu; 4. Cyd-3-rut; 5. Pnd-3-rut
3.1.8 Sodinių šilauogių (Vaccinium corymbosum) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
1 - 15 antocianinai aptikti ESC pagalba, o 16-20 acetilinti antocianinai matomi MS rezultatuose, tačiau neturint kiekvieno iš acetilintų antocianinų standartų identifikacija nėra galima. Taip yra dėl kiekvieno iš antocianų migracijos profilyje todėl tik iš MS rezultatų ir literatūros duomenų identifikacija nėra tiksli. Sodinės šilauogės yra platų antocianinų profilį turintys augalai, savo kokybiniu profiliu labai panašus į mėlynes. Šilauogių profilis yra specifinis, jam skirtingai nei mėlynei randami būdingi acetilinti antocianinai. Būtent tokį profilį galime pastebėti, A.Brito, Čilėje atliktame tyrime, analizuojant 8 rūšių uogų fenolinių junginių kiekybinę ir kokybinę sudėtį [46]. Panašius rezultatus gavo G.Giovanelli ir S.Buratti atlikto tyrimo metu lyginant mėlynių ir šilauogių cheminę sudėtį [45]. Analizuojant skirtingus straipsnius skiriasi tik aptinkamų acetilintų antocianinų kiekis. Taigi lyginant gautus rezultatus galima teigti, kad gautas profilis yra būdingas šilauogėms, o norint identifikuoti acetilintus antocianinus reiktų kiekvienam jų turėti lyginamąjį standartą.
10 pav. Sodinių šilauogių vaisių chromatograma: 1. 3-gal; 2. 3-glu; 3. Cyd-3-gal; 4. Dpd-3-ara; 5. Cyd-3-glu; 6. Ptd-3-gal; 7. Cyd-Dpd-3-ara; 8. Ptd-3-glu; 9. gal; 10. Ptd-Dpd-3-ara; 11. Pnd-3-glu; 12. Mvd-3-gal; 13. Pnd-3-ara; 14. Mvd-3-Pnd-3-glu; 15. Mvd-3-ara; 16-20 acetilinti antocianinai
Sodinių šilauogių profilio antocianinų sulaikymo faktoriai: Dpd-3-glu - 0,507; Dpd-3-ara - 0,439; Dpd-3-gal - 0,575; Cyd-3-glu - 0,371; Cyd-3-gal - 0,455; Ptd-3-gal - 0,328; Cyd-3-ara - 0,312; Ptd-3-glu - 0,250; Pnd-3-gal - 0,198; Ptd-3-ara - 0,178; Pnd-3-glu - 0,104; Mvd-3-gal - 0,087; Pnd-3-ara - 0,048; Mvd-3-glu - 0,030. Lyginant su Mvd-3-ara.
3.1.9 Paprastųjų šermukšnių (Sorbus aucuparia) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
Paprastieji šermukšniai kaip ir dygliuotieji šaltalankiai yra retai sutinkami antocianinų profilio variacijos tyrimuose, tačiau atlikus nuodugnią straipsnių analizę buvo nuspręsta juos įtraukti į tyrimus. Tyrimo rezultatai parodė, jog ESC pagalba aptikti du antocianinai: Cyd-3-gal; Mvd-3-ara jo sulaikymo faktorius - 0.896 lyginant su Cyd-3-glu. Lyginant gautus rezultatus su P.Kylli ir kitų, Švedijoje, atlikto tyrimo rezultatais galime teigti jog gautas profilis yra būdingas šermukšniams [14]. Analizuojant daugiau straipsnių galime teigti kad, dominuojantys antocianinai šermukšnių vaisiuose yra cianidino grupės: Cyd-3-gal; Cyd-3-glu; Cyd-3-rut; Cyd-3-ara [4,33].
11 pav. Paprastųjų šermukšnių vaisių chromatograma: 1. Cyd-3-gal; 2. Mvd-3-ara
3.1.10 Dygliuotųjų šaltalankių (Hippophae rhamnoides) liofilizuotų vaisių antocianinų sudėties tyrimas
Atliekant antocianinų profilio variacijos tyrimus, šaltalankių vaisiai pasirenkami ypač retai, nes šis augalas nepasižymi antocianinus kaupiančiomis savybėmis. Tačiau į tyrimą įtrauktas buvo dėl tyrimo tikslumo optimizavimo, šio augalo ekstraktai tyrimo eigoje atliko kontrolinio bandinio vaidmenį, kurio dėka buvo užtikrinama bandinių svėrimo, ekstrahavimo ir skiedimo tikslumas. Tyrimo rezultatai kaip ir tikėtasi antocianinų pėdsakų neparodė.
3.2 Kiekybinis antocianinų įvertinimas
Visų liofilizuotų ruošinių kiekybinė sudėtis buvo nustatyta ESC pagalba, pagal kiekvieno junginio smailės plotą esantį chromatogramoje. Dėl visuotinio susitarimo ir objektyvaus vertinimo kiekvieno junginio kiekis išreikštas miligramais, 100 gramų tiriamojo liofilizuoto ruošinio. Visi kiekiai išreikšti pagal cianidino-3-gliukozidą.
4 lentelė. Antocianinų kiekybinė sudėtis visuose tiriamuosiuose bandiniuose
C yd -3 -glu C yd -3 -ga l C yd -3 -a ra C yd -3 -r ut C yd -3 -s op C yd -3 -glu -r ut C yd -3 -s am C yd -3, 5 - dig lu C yd -3 -mal -glu Dpd -3 -glu Dpd -3 -ga l Dpd -3 -a ra Dpd -3 -r ut 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1. Paprastųjų aviečių (Rubus ideus) 3,73 328,4 64,52 3,32
2. Žemuogių (Fragaria vesca) 45,58 *
3. Braškių (Fragaria x ananassa) 5,05 0,03 *
4. Juodavaisių aronijų (Aronia melanocarpa) 1,05 30 4,78 11,29
5. Juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra) 1356 87,49
6. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum) 38,64 234,2 4,01 96,98 372,6 7. Mėlynių (Vaccinium myrtillus) 331,9 347,8 233,3 264,2 285,7 243 8. Paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus) * 26,09 0,16 27,57
9. Sodinių šilauogių (Vaccinium corymbosum) 8 13,35 12,99 42,62 81,55 97,7
M vd -3 -glu M vd -3 -ga l M vd -3 -a ra P gd -3 -glu P gd -3 -r ut P gd -3 -mal -glu P gd -3 -a ce ti l-glu P nd -3 -glu P nd -3 -ga l P nd -3 -a ra P nd -3 -r ut P td -3 -glu P td -3 -ga l P td -3 -a ra 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
1. Paprastųjų aviečių (Rubus ideus)
2. Žemuogių (Fragaria vesca) 35 0,32 7,88
3. Braškių (Fragaria x ananassa) 155,1 2,33 37,47 0,97
4. Juodavaisių aronijų (Aronia
melano-carpa) 22,25 1,09
5. Juoduogių šeivamedžių (Sambucus
nigra)
6. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum) 0,55 2,1 0,38
7. Mėlynių (Vaccinium myrtillus) 247,8 109,5 71,73 179,7 52,52 21,86 190,3 109,5 67,49
8. Paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus) *
9. Sodinių šilauogių (Vaccinium
corymbo-sum) 66,51 104,2 119,5 3,17 5,71 1,94 29,86 38,83 37,94
10. Paprastųjų šermukšnių (Sorbus
aucu-paria)
*
* Kiekybinis įvertinimas negalimas dėl per mažo kiekio
3.2.1 Paprastųjų aviečių (Rubus ideus) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas
Atlikus paprastųjų aviečių bandinių analizę nustatyta, kad dominuojantys antocianinai yra cianidino grupės. Daugiau kaip 80% viso antocianinų kiekio sudaro vienas antocianinas - Cyd-3-sop, taip pat nemažą dalį - 16,13%, sudaro Cyd-3-glu-rut. Bendras antocianinų kiekis 100 gramų - 362,24 mg. Panašūs duomenys buvo gauti, Norvegijoje, atliekant cheminės kompozicijos tyrimus dešimtyje aviečių genotipų. Rezultatai atskleidė, kad daugiau kaip pusę (61%) viso antocianinų kiekio sudaro Cyd-3-sop, likę: Cyd-3-glu-rut - 15%; Cyd-3-glu - 14%; Cyd-3-rut - 5% [40]. Pažvelgus į ankstesnę tyrimų analizę galime matyti, kad avietėje galima aptikti ir pelargonidino grupės antocianinų, tačiau palyginus kiekybinę sudėtį yra aišku, kad pagrindiniai dominuojantys antocianininai avietėje yra Cyd-3-sop ir Cyd-3-glu-rut [28,30].
3.2.2 Žemuogių (Fragaria vesca) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas
Identifikuotais antocianinais žemuogės yra panašios į braškes, tačiau atlikus kiekybinį įvertinimą buvo gauti skirtingi profiliai. Žemuogių bandiniuose iš viso aptikti 6 antocianinai, vieno jų nepavyko identifikuoti ir net trys iš jų sudarė 99% bendro antocianinų kiekio, dominavo šie antocianinai: Cyd-3-glu - 51,33%; Pgd-3-glu - 39,42%; Pnd-3-glu - 8,89%. Dėl 82.11% 16.13% 0.83% 0.93% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00%
Cyd-3-sop Cyd-3-glu-rut Cyd-3,5- diglu Cyd-3-glu 13 pav. Paprastųjų aviečių liofilizuoto ruošinio antocianinų
procentinis pasiskirstymas 51.33% 39.42% 8.89% 0.37% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00%
Cyd-3-glu Pgd-3-glu Pnd-3-glu Pgd-3-mal-glu 14 pav. Žemuogių liofilizuoto ruošinio antocianinų
plataus šių antocianinų pasiskirstymo galima teigti, kad 3 iš 6 aptiktų antocianinų nulemia profilio ypatumus. Bendras antocianinų kiekis 100 gramų - 88,8 mg. Panašus antocianinų pasiskirstymas nustatytas R.Rugieniaus ir kitų, analizuojant kaip temperatūros padidėjimas ir vandens trūkumas veikia žemuogių antocianinų profilį. Tyrimų rezultatai atskleidė, kad dominuoja ankščiau minėti antocianinai: Pgd-3-glu 50-62%; Cyd-3-glu 18-30%; Pnd-3-glu iki 10%. Keičiant tyrimo sąlygas (temperatūrą bei vandens kiekį) buvo pastebėta, kad žemuogių vaisiams bręstant ne visų antocianinų kiekis mažėja kaip tikėtasi. Nustatyta, kad didėjant aplinkos temperatūrai, didėja ir Pgd-3-glu kiekis [42]. Įvertinus abu tyrimus galima teigti, kad gautas žemuogių profilis yra būdingas šiam augalui, tačiau reikia turėti galvoje, kad dėl augimo ypatumų jis gali kisti, t.y. dominuojančių antocianinų kiekis dėl didelės temperatūros - Cyd-3-glu mažėti, o Pgd-3-glu didėti.
3.3.3 Braškių (Fragaria x ananassa) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas
Atliekant tyrimų analizę buvo pastebėta, kad braškių antocianinų profilis yra ypač nepastovus ir gali priklausyti nuo įvairių faktorių: tiriamos veislės, regioninių ypatumų, ar net pačio tyrimo metodikos. Būtent antocianinų profilių variacijų priklausomybę nuo veislės ir laikymo laikotarpio 2012 metais tyrė C.H. Fredricks ir kiti. Analizei pasirinkta 10 skirtingų braškių veislių, rezultatai parodė, kad visose veislėse dominuojantis antocianinas yra Pgd-3-glu, kuris sudarė 78 % - 92% viso antocianinų kiekio, šiek tiek mažiau rasta Cyd-3-rut - 6% ir Cyd-3-glu - 4%. Tačiau net 7 iš 10 veislių nebuvo aptikta Pgd-3-mal-glu, o trijose kuriose vis dėl to buvo nustatytas šis antocianinas buvo vienas iš dominuojančių ir sudarė 12 - 13 % bendro antocianinų kiekio [41]. Atlikus tyrimus su liofilizuotais barškių bandiniais dominuojantys antocianinai buvo šie: Pgd-3-glu - 82,43% ir Pgd-3-mal-glu 9,32%. Taigi lyginant rezultatus galime daryti išvadą, kad gautas dominuojantis antocianinas visai atvejais išlieka vienas - Pgd-3-glu, o Pgd-3-mal-glu aptinkama tik specifinėse braškių veislėse, todėl atliekant tolimesnius profilio variacijos tyrimus šio antocianino
82.43% 9.32% 3.73% 2.69% 1.24% 0.52% 0.07% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00%
15 pav. Braškių liofilizuoto ruošinio antocianinų procentinis pasiskirstymas
galima neaptikti, tačiau jei jis aptinkamas, jis sudaro nemažą dalį bendro antocianinų kiekio. Bendras antocianinų kiekis 100 gramų - 188,13 mg.
3.2.4 . Juodauogių šeivamedžių (Sambucus nigra) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas
Juodauogių šeivamedžių bandiniuose buvo rasti didžiausi Cyd-3-glu kiekiai - 1356 mg/ 100 g. Taip pat tai vienintelis bandinys kuriame buvo nustatytas Cyd-3-sam, 100 g aptikta 87,49 mg. Bendras antocianinų kiekis 100 gramų - 1443,7 mg. Cyd-3-sam ir Cyd-3-glu atitinkamai sudarė 6,06% ir 93,94%. Tačiau M. Mikulic-Petkovsek ir kiti tirdami 4 šeivamedžių rūšis nustatė, kad tėra du dominuojantys antocianinai yra: Cyd-3-sam ir Cyd-3-glu, atitinkamai 61% ir 34% [3]. Taigi vertinant abu tyrimų rezultatus galima teigti, kad gautas profilis neatitinka šeivamedžių profilio. Tačiau priešingi rezultatai buvo gauti R.Veberic ir kitų, tiriant laukinių ir kultyvuotų uogų antocianinų profilius. Nors tyrimo rezultatai parodė, jog dominuoja tie patys antocianinai tačiau abiejų kiekis vienas kito atžvilgiu skyrėsi: Cyd-3-glu - 64%, o Cyd-3-sam - 28%, toks antocianinų pasiskirstymas išlieka nepriklausomai ar bandinys buvo augęs natūralioje aplinkoje ar ne [4]. Taigi vertinant gautą profilį pagal šį tyrimą, aptikti antocianinai yra būdingi šeivamedžiams. Lyginant visus aptartus rezultatus reiktų atkreipti dėmesį, kad šeivamedžių profilio dominuojančių antocianinų kiekiai gali varijuoti ir net keisti pačio profilio išvaizdą, kuriame vienu atveju matome, kad dominuoja Cyd-3-glu, o kitu Cyd-3-sam.
3.2.5 Juodųjų serbentų (Ribes nigrum) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas
Juodųjų serbentų profilis gan platus, atlikus tyrimus buvo nustatyti 8 skirtingi antocianinai. Dominuojantys buvo delfinidino bei cianidino grupės antocianinai: Dpd-3-rut - 49,71%; Cyd-3-rut - 31,25%; Dpd-3-glu - 12,94%; Cyd-3-glu - 5,16%. Bendras antocianinų kiekis 100 gramų - 749,49 mg.
93.94% 6.06% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00% 100.00% Cyd-3-glu Cyd-3-sam
16 pav. Juodauogių šeivamedžių liofilizuoto ruošinio antocianinų procentinis pasiskirstymas
Mažiau nei po 1 % identifikuota: Cyd-3-sop; Pgd-3-rut; Pgd-3-glu; Pnd-3-rut. Taigi galime teigti, jog serbentų profilį sudaro 4 dominuojantys junginiai: Dpd-3-rut; Dpd-3-glu; Dpd-3-rut; Cyd-3-glu. Panašų profilį galime matyti I.Ochamian ir kitų atlikto tyrimo metu, tiriant 14 serbentų veislių. Didžiausias antocianinų kiekis buvo nustatytas "Ben alder" veislėje. Dominuojantys antocianinai išsidėstė tokia pačia tvarka, Dpd-3-rut sudarė didžiausią antocianinų kiekį - 46%, šiek tiek mažesnę dalį sudarė: Cyd-3-rut, Dpd-3-glu ir Cyd-3-glu, atitinkamai: 24%, 23% ir 5% [10]. Panašų profilį gavo H.Antolak ir kiti, tiriant sultis gautas iš serbentų ir mėlynių. Tyrimo metu nustatyti šie dominuojantys antocianinai: Dpd-3-rut - 41%; Cyd-3-rut - 40%; Dpd-3-glu - 10%; Cyd-3-glu -7% [35]. Taigi lyginant abiejų tyrimų rezultatus su gautu serbentų profiliu galime teigti, jog dominuojantys antocianinai visai atvejais išlieka tokie patys, ir išsidėsto tokia pačia tvarka.
3.2.6 Mėlynių (Vaccinium myrtillus) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas
Mėlynių antocianinų profilis iš visų 11 bandinių pasižymėjo vienu plačiausių antocianinų įvairavimu. Atlikus analizę buvo nustatyta 15 skirtingų antocianų, kurie sudarė 2756,32 mg/ 100 g liofilizuotos žaliavos. Mėlynių profilis pasižymi specifinėmis savybėmis, t.y. jame kitaip nei kitų tiriamųjų profiliuose nėra konkretaus dominuojančio antocianino, net 6 iš jų patenka į intervalą nuo 5% iki 10% bendro kiekio, o didžiausias Cyd-3-gal kiekis - 347 mg/100 g, sudaro tik 12,62 % bendro antocianinų kiekio. Nors dominuojančio antocianino išskirti negalima, tačiau 18 paveiksle matyti, kad didžiąją dalį antocianinų sudaro cianidino ir delfinidino grupės, atitinkamai 33% ir 29%. Panašius rezultatus gavo A.K.Latti ir kiti, tiriant 179 mėlynių rūšių bandinius iš 20 skirtingų populiacijų. Rezultatai parodė, kad vidutiniškai 100 g sauso bandinio aptikta 2878 mg. Taigi bendras antocianinų kiekis yra labai panašus. Tyrimo metu dominuojančios antocianinų grupės buvo cianidino ir delfinidino atitinkamai 33 ± 6% ir 33 ± 7%. Taigi abiem atvejais dominuojančių antocianininų grupės išlieka tokios pačios, procentinis jų pasiskirstymas taip pat labai panašus. Mokslininkės A.K.Latti atliktame tyrime
49.71% 31.25% 12.94% 5.16% 0.54% 0.28% 0.07% 0.05% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00%
17 pav. Juodųjų serbentų liofilizuoto ruošinio antocianinų procentinis pasiskirstymas
mažiau paplitusių antocianinų grupių buvo nustatyta: Ptd 14 ± 2%; Pnd 7 ± 3%; Mvd 13 ± 3%, o štai gautame profilyje matyti, kad petunidino grupė sudaro 13%; peonidino 9%; malvidino 16%. Taigi apibendrinus atliktų tyrimų rezultatus, galime teigti, jog gautas mėlynių profilis yra tipinis, o antocianinų kiekis ir jų grupių pasiskirstymas sutampa su literatūros duomenimis [1].
3.2.7 Paprastųjų vyšnių (Prunus cerasus) liofilizuotų vaisių kiekybinis tyrimas
Paprastosios vyšnios nepasižymi ypač plačiu profiliu. Atlikus vyšnių profilio analizę matyti, kad dominuojantys antocianinai yra cianidino grupės, šiuo atveju jie sudaro 100% bendro antocianinų kiekio. Bendras antocianinų kiekis 100 g liofilizuoto bandinio taip pat nėra didelis - 53,84 mg. Štai J.R.Hamoki ir kitų atliktame tyrime, vertinant 5 vyšnių veislių antocianų profilį buvo nustatyta, kad liofilizuotuose bandiniuose antocianinų kiekis svyravo nuo 135 ± 25 iki 1459 ± 127 mg /100 g [9]. Taigi bendras kiekis mažiausiai du kartus mažesnis nei pateikta literatūroje. 19 paveiksle
12.62% 12.04% 10.36% 9.59% 8.99% 8.82% 8.47% 6.90% 6.52% 3.97% 3.97% 2.60% 2.45% 1.91% 0.79% 0.00% 2.00% 4.00% 6.00% 8.00% 10.00% 12.00% 14.00%
18 pav. Mėlynių antocianinų liofilizuoto ruošinio procentinis pasiskirstymas
51.22% 48.47% 0.31% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00%
Cyd-3-glu-rut Cyd-3-rut Cyd-3-sop 19 pav. Paprastųjų vyšnių liofilizuoto ruošinio antocianinų
