FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
LAURA KISIELIŪTĖ
LIETUVOJE AUGANČIŲ SMULKIAŽIEDŽIŲ GALINSOGŲ (GALINSOGA PARVIFLORA L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ CHEMINĖS SUDĖTIES ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Lekt. dr. Daiva Kazlauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data
LIETUVOJE AUGANČIŲ SMULKIAŽIEDŽIŲ GALINSOGŲ (GALINSOGA PARVIFLORA L.) ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ CHEMINĖS SUDĖTIES ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Lekt. dr. Daiva Kazlauskienė Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Data Laura Kisieliūtė Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Smulkiažiedė galinsoga (Galinsoga parviflora L.), paplitimas ir morfologiniai požymiai ... 10
1.2. Biologiškai aktyvios medžiagos ... 11
1.3. Farmakologinės savybės ir panaudojimas ... 11
1.4. Fenolinių junginių apžvalga ... 12
1.5. Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 14
1.6. Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai ... 15
1.7. Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas ... 16
1.8. Antioksidantai, antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 18
1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Naudoti reagentai ir aparatūra ... 21
2.3. Galinsogos ekstraktų paruošimas ... 22
2.4. Tyrimo metodikos... 22
2.5. Duomenų statistinis įvertinimas ... 26
2.6. Tyrimo metodikos apibendrinimas ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 28
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstraktuose spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu ... 30
3.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 31
3.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstraktuose ... 32
3.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygų parinkimas ... 33
3.6. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 33
3.6.2. Pakartojamumas ... 34
3.6.3. Tarpinis preciziškumas ... 35
3.6.4. Tiesiškumas ... 36
3.6.5. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 37
3.7. Fenolinių junginių nustatymas smulkiažiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje ESC metodu... 38
3.7.1. Fenolinių rūgščių kiekybinis įvertinimas smulkiažiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje ESC metodu ... 39
3.7.2. Flavonoidų nustatymas smulkiažiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje ESC metodu ... 41
3.8. Tyrimo rezultatų apibendrinimas ... 43
4. IŠVADOS ... 45
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 47
SANTRAUKA
L. Kisieliūtės magistro baigiamasis darbas „Lietuvoje augančių smulkiažiedžių galinsogų (Galinsoga parviflora L.) žolės fenolinių junginių cheminės sudėties analizė“ / mokslinis vadovas lekt. dr. Daiva Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Analizinės ir toksikologijos chemijos katedra. – Kaunas, 2017.
Raktiniai žodžiai: Galinsoga parviflora L., smulkiažiedė galinsoga, flavonoidai, fenolinės rūgštys, efektyvioji skysčių chromatografija, antioksidantai, CUPRAC, Folin – Ciocalteu.
Tyrimo tikslas: įvertinti Lietuvoje augančių smulkiažiedžių galinsogų (Galinsoga parviflora L.) žolėje esančių fenolinių junginių cheminės sudėties ir kiekio įvairavimą skirtingose mėginių rinki-mo vietose.
Tyrimo objektas ir metodai: smulkiažiedės galinsogos (Galinsoga parviflora L) fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Suminis fenolinių jun-ginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu, suminis flavonoidų kiekis - spektrofotometriniu metodu su AlCl3. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu CUPRAC metodu. ESC metodu kiekybiškai ir kokybiškai nustatyti fenoliniai junginiai ekstraktuose.
Tyrimo uždaviniai: ekstrakcijos sąlygų parinkimas fenolinių junginių nustatymui smulkia-žiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje. Suminis fenolinių junginių ir flavonoidų įvertinimas spektro-fometriniais metodais, antioksidacinio aktyvumo įvertinimas CUPRAC metodu. ESC metodikos pa-rinkimas ir validacija, fenolinių junginių kokybinis ir kiekybinis įvertinimas smulkiažiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje ESC metodu.
Rezultatai: tinkamiausios sąlygos smulkiažiedžių galinsogų augalinei žaliavai ekstrahuoti yra su 70% (v/v) etanoliu kaitinant glicerolio vonioje 90° temperatūroje su prijungtu grįžtamuoju šaldytu-vu 1,5 val. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekisnustatytas Vilkaviškyje 40,216 ± 1,37 mg/g. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas Kėdainiuose 29,5 ± 0,11 mg/g. Didžiausiu antioksi-daciniu aktyvumu pasižymėjo Anykščiuose 3,9 ± 0,14 µmol/g augusios smulkiažiedžių galinsogų au-galinės žaliavos. ESC analizės metu iš ekstraktų identifikuoti 6 fenoliniai junginiai: chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, dihidroksibenzoinė rūgštis, rutinas, hiperozidas ir izokvercitrinas. Didžiausias chloroge-no r. (526,266 ± 0,94 µg/g), hiperozido (506,161 ± 0,69 µg/g) ir izokvercitrichloroge-no (99,328 ± 0,29 µg/g) kiekis nustatytas Vilkaviškyje, didžiausias kavos r. (881,801 ± 18,76 µg/g) ir rutino (133,87 ± 0,76 µg/g) kiekis nustatytas Ignalinoje ir didžiausias dihidroksibenzoinės r. (215,76 ± 28,14 µg/g) kiekis nustatytas Kaune. Bendras didžiausias fenolinių rūgščių kiekis, nustatytas ESC metodu, buvo Ignalino-je (1266,417 ± 9,38 µg/g), o bendras didžiausias flavonoidų kiekis VilkaviškyIgnalino-je (641,39 ± 0,88 µg/g) augusiose smulkiažiedės galinsogos žaliavose.
SUMMARY
Master Thesis by L.Kisieliūtė, title „Analysis of phenolic compounds in Galinsoga parviflora L. growing in Lithuania“, Scientific Supervisor D.Kazlauskienė, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2017. Keywords. Galinsoga parviflora L, phenolic compounds, flavonoids, phenolic acids, antioxi-dant activity, high performance liquid chromatography, CUPRAC, Folin – Ciocalteu.
Aim of the study. To evaluate phenolic compounds chemical content and amount in Galinso-ga parviflora L herb from different locations in Lithuania.
Object and methods of the study. Spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used for the determination of total content of phenolic compounds in herb material. Total amount of flavonoids was determined by specific reactions with AlCl3. Spectrophotometric CUPRAC method was used to determine total antioxidant activity. Phenolic compounds were identified and quantified by HPLC method.
Goals of the study. To select proper extraction conditions for determination of phenolic compounds in galinsoga parviflora herb. To measure total phenolic compounds and flavonoids in Ga-linsoga parviflora L extracts using spectrophotometric methods. To measure reductive qualities using CUPRAC spectrophotometric method. To select proper conditions and validate HPLC assay for iden-tifying and measuring quantity of phenolic compounds in galinsoga parviflora herb extracts.
Results. The best results of galinsoga extracts were achieved using 70% ethanol and heating extracts in 90° C glycerol bath for 90 minutes with reversible refrigerator. The highest amount of phe-nolic compounds was determined in Vilkaviškis (40,216 ± 1,37 mg/g). The highest amount of flavo-noids was determined in Kėdainiai (29,5 ± 0,11 mg/g). The most significant antioxidant activity of Galinsoga parviflora extracts was determined in Anykščiai (3,9 ± 0,14 µmol/g). Six phenolic com-pounds were identified using HPLC assay – chlorogenic acid, caffeic acid, dihydroxy benzoic acid, rutin, hyperoside and isoquercitrin. The highest amount of chlorogenic acid (526,266 ± 0,94 µg/g), hyperoside (506,161 ± 0,69 µg/g) and isoquercitrin (99,328 ± 0,29 µg/g) was determined in Vilkaviš-kis. The highest amount of caffeic acid (881,801 ± 18,76 µg/g) and rutin (133,87 ± 0,76 µg/g) was de-termined in Ignalina. The highest amount of dihydroxy benzoic acid (215,76 ± 28,14 µg/g) was deter-mined in Kaunas. The highest total amount of phenolic acids using HPLC assay was deterdeter-mined in Ignalina (1266,417 ± 9,38 µg/g) and the highest total amount of flavonoids was determined in Vilka-viškis (641,39 ± 0,88 µg/g).
SANTRUMPOS
DMAC - 4 - (dimetilamino)-cinamaldehidas DNPH - 2,4 – dinitrofenilhidrazinas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. High performance liquid chromatography) ROS - reaktyviosios deguonies formos
RNS - reaktyviosios azoto formos
ABTS - 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
CUPRAC - vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (angl. Cupric ion reducing antioxidant capaci-ty)
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
FRAP - geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) TPTZ - 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (angl. 2,4,6-tripyridyl-s-triazine)
GAE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. Gallic acid equivalents) QE – kvercetino ekvivalentai (angl. Qercetin equivalents) TE – trolokso ekvivalentai (angl. Trolox equivalents)
ĮVADAS
Fenoliniai junginiai – svarbi biologiškai aktyvių junginių grupė, turinti organizmą stiprinantį ir nuo ligų saugantį poveikį [1]. Fenolinių junginių šaltiniai yra daugelis daržovių, vaisių, sėklų, grūdi-nių kultūrų, žoligrūdi-nių augalų rūšių. Jie dažniausiai kaupiasi augalo lapuose, žieduose, stiebuose ir žolėje [2].
Smulkiažiedė galinsoga (Galinsoga parviflora L.) yra vienmetis augalas, priklausantis astri-nių (Asteraceae L.) augalų šeimai. Galinsogų augalinė žaliava yra renkama žydėjimo metu [3]. Auga-las yra paplitęs visoje Lietuvoje. Smulkiažiedžių galinsogų žolė pasižymi fenolinių junginių įvairove [4,5,6].
Fenoliniai junginiai yra svarbūs smulkiažiedžių galinsogų farmakologiniam poveikiui. Moks-lininkų tyrimų metu, nustatyta, kad Galinsoga parviflora L augalų ekstraktai pasižymi hepatoprotekci-niu, hipoglikemihepatoprotekci-niu, priešuždegimihepatoprotekci-niu, antioksidacihepatoprotekci-niu, priešartritihepatoprotekci-niu, antitrombozihepatoprotekci-niu, žaizdų gyjimą skatinančiu, antibakteriniu poveikiu prieš Gram teigiamas bakterijas: B. subtilis, M. luteus, S. aureus ir Gram neigiamas bakterijas: K. pneumoniae, S. typhimurium, E. coli ir P. aeruginosa. Taip pat nustaty-tas stiprus priešgrybelinis poveikis prieš A. niger ir C. albicans [7].
Darbo naujumas. Lietuvoje nerasta mokslinių šaltinių, kuriuose būtų aprašyti smulkiažiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje esančių fenolinių junginių kiekio ir žaliavos antioksidacinio aktyvumo tyrimai. Gauti tyrimo rezultatai gali būti reikšmingi farmacijos pramonėje, kuriant naujus augalinius vaistinius preparatus ar maisto papildus.
Šio darbo tikslas yra įvertinti Lietuvoje augančių smulkiažiedžių galinsogų (Galinsoga parvif-lora L.) žolėje esančių fenolinių junginių cheminės sudėties ir kiekio įvairavimą skirtingose mėginių rinkimo vietose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti Lietuvoje augančių smulkiažiedžių galinsogų (Galinsoga parviflora L.) žolėje esančių fenolinių junginių cheminės sudėties ir kiekio įvairavimą skirtingose mėginių rinki-mo vietose.
Darbo uždaviniai:
1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas fenolinių junginių nustatymui smulkiažiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje.
2. Palyginti bendrą fenolinių junginių kiekį galinsogų žolėje taikant spektrofotometrinį Folin – Ciocalteu metodą skirtingose žaliavos rinkimo vietose.
3. Palyginti bendrą flavonoidų kiekį smulkiažiedžių galinsogų žolėje skirtingose žaliavos rin-kimo vietose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą.
4. Palyginti galinsogų žolės ekstraktų antioksidantinį aktyvumą spektrofotometriniu CUP-RAC metodu.
5. Parinkti tinkamiausią ESC metodiką fenolinių junginių įvertinimui smulkiažiedžių galin-sogų augalinėse žaliavose bei validuoti ESC tyrimo metodiką.
6. Pagal parinktą metodiką įvertinti galinsogų žolės kiekybinę ir kokybinę fenolinių junginių cheminę sudėtį ESC metodu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Smulkiažiedė galinsoga (Galinsoga parviflora L.), paplitimas ir morfologiniai
požymiai
Smulkiažiedė galinsoga (Galinsoga parviflora L.), dar vadinama galantiškuoju kariu, yra me-tinis augalas, kuris priskiriamas astrinių šeimai (Asteraceae L.). Didžiausias kiekis galinsogų aptinka-mas regionuose, kuriuose vyrauja subtropinis klimatas. Galinsoga plačiai paplitusi visoje Europoje, Jungtinėse Amerikos Valstijose, Pietų Amerikoje, Afrikoje, Azijoje, Australijoje ir Naujojoje Zelandi-joje. Paprastai auga apleistose buveinėse, tokiose kaip dykvietės, pakelės, nedirbami laukai arba at-virkščiai - žemės ūkio srityje: laukuose, gėlynuose, daržuose. Smulkiažiedė galinsoga pasižymi trumpu gyvavimo ciklu ir savybe greitai augti bei pasiekti brandą, todėl sezono metu gali užaugti kelios kartos. Pagrindinis augimo laikotarpis kovo – spalio mėnesiai [3,8].
Smulkiažiedė galinsoga yra metinis dviskiltis augalas, priskiriamas astrinių šeimai. Augalo aukštis paprastai yra 60 cm. Jauni augalai turi apvalias sėklaskiltes su šiek tiek dantytu galiuku. Stiebas stačias su šakotu kamienu, kuris dažniausiai lygus, retais atvejais plaukuotas. Lapai simetriški, prieši-niai, ovalūs ar lancetiški su smailia viršūne, trigysliai, lapo pagrindas apvalus. Lapo paviršius gali būti padengtas plaukeliais iš abiejų pusių, lapo kraštas smulkiai arba stambiai dantytas. Graižai smulkūs, išsidėstę ant ilgų žiedynkočių. Turi dviejų tipų žiedus: kraštiniai liežuviški, sudaryti iš 3 – 5 baltų žiedlapių, viduriniai - geltoni, vamzdiški. Vaisiai dviejų tipų: lūkštavaisiai su skristuku arba be [8,9].
1.2. Biologiškai aktyvios medžiagos
Susisteminus mokslinių tyrimų ir literatūros duomenis, buvo įvertinta smulkiažiedės galinso-gos biologiškai aktyvių junginių sudėtis. Buvo nustatyta, kad Galinsoga parviflora L. augalai kaupia šias veikliąsias medžiagas: flavonoidus (apigeninas, liuteolinas, izokvercitrinas, kvercimeritrinas (kvercetino –7–O- gliukozidas), kvercetagetrinas (kvercetagetino – 7-O- gliukozidas), galinsosidas A, galinsosidas B, 7, 3, 4 – trihidroksiflavononas, 3, 5, 7, 3, 4 – pentahidroksiflavononas, patulitrinas, kemferolis), fenolines rūgštis ir depsidus (kavos rūgštis ir kavos rūgšties derivatai, chlorogeno rūgštis, p - hidroksibenzoinė rūgštis, 3, 4 – dihidroksibenzoinė rūgštis, p - kumaro rūgštis, galo rūgštis, vanili-no rūgštis, izovanilivanili-no rūgštis, 3, 4 – dimetoksicinamovanili-no rūgštis, protokatechivanili-no rūgštis, fumaro rūgš-tis). Išskirti 88 skirtingi eteriniai aliejai, iš kurių pagrindiniai yra: β - kariofilenas, γ – bisabolenas, bi-sabol – 11 - olis, 3 – heksen – 1 – olis, 6 – dimetoksiageratochromas, fitolis, terpenai ir steroliai (stig-masterolis, β – sitosterolis, 7 - hidroksistigmasterolis), aromatiniai esteriai (galinozoatai A - C) ir vita-minas C [8,11,12,7,13,14,4]. Mineralinės medžiagos: kalcis, fosforas, natris, cinkas, magnis, manga-nas, geležis, varis [9,15].
1.3. Farmakologinės savybės ir panaudojimas
Kai kuriose Centrinės Lotynų Amerikos dalyse ir Tanzanijoje smulkiažiedė galinsoga yra lai-koma valgomu augalu, todėl, kad pasižymi didele maistine verte. Ji valgoma tiek žalia, tiek apdorota termiškai, taip pat džiovinama ir vartojama kaip prieskonis [9].
Galinsogos ekstraktų farmakologinį poveikį didžiąja dalimi lemia fenoliniai junginiai. Fenoli-nės rūgštys ir flavonoidai, randami Galinsoga L. genties augaluose, yra svarbūs, nes pasižymi antioksidantinėmis savybėmis ir suriša laisvuosius radikalus [4]. Dėl sudėtyje esančios 3, 4, -dimetoksicinamono, protokatechino, chlorogeno, fumaro rūgščių taip pat fitolio ir sterolių smulkiažie-dė galinsoga pasižymi hepatoprotekciniu ir hipoglikeminiu poveikiu [7,6]. Taip pat smulkiažie-dėl susmulkiažie-dėtyje esan-čios kavos rūgšties ir jos derivatų, augalinė žaliava pasižymi antioksidaciniu ir priešuždeginimiu po-veikiu [16].
Augaliniai ekstraktai naudojami dermatologinėms ligoms gydyti, tokioms kaip: egzemos, sunkiai gyjančios žaizdos, opos. Mokslininkų tyrimų duomenimis galinsogos ekstraktai gali paspartinti žaizdų gyjimą. Nustatyta galinsogų ekstraktų daroma įtaka fibroblastų judėjimui ir padidėjimui sužalo-tame monosluoksnyje. Taip pat ekstraktai pasižymėjo mažu citotoksiniu poveikiu [11].
Tradicinėje Kenijos medicinoje galinsogos lapai ir stiebai buvo naudojami peršalimams ir žaizdoms gydyti. Toks žaliavos antibakterinis ir priešuždegimnis poveikis paaiškinamas in vitro tyrimų metu, kuriuose buvo nustatytas antibakterinis poveikis prieš Gram teigiamas bakterijas: Bacillus subti-lis, Micrococcus luteus ir Staphylococcus aureus bei ciklooksigenazės – 1 inhibavimas [17]. Antibak-terinis poveikis nustatytas ir prieš Gram neigiamas bakterijas: K. pneumoniae, S. typhimurium, E. coli ir P. aeruginosa. Taip pat nustatytas stiprus priešgrybėlinis poveikis prieš A. niger ir C. albicans [7].
Remiantis eksperimentiniu tyrimu, buvo pastebėta, kad smulkiažiedės galinsogos ekstraktas gali būti naudojamas kaip perspektyvus vaistas, kovojant su artritu ir tromboze. Šiuo poveikiu galinso-gos augalinė žaliava pasižymi dėl sudėtyje esančių flavonoidų ir fenolinių rūgščių ir jų antioksidanti-nio veikimo [18].
1.4. Fenolinių junginių apžvalga
Fenoliniai junginiai yra augaluose susidarantys antriniai metabolitai. Jie sudaryti iš vieno ar daugiau aromatinių žiedų ir turi prisijungusių vieną ar daugiau hidroksi grupių. Yra žinoma daugiau nei 8000 skirtingų fenolinių junginių. Augaluose fenoliai atlieka apsauginę funkciją prieš ultravioleti-nius (UV) spindulius ar patogenus, parazitus, grobuonis, prisideda prie augalo organoleptinių savybių. Fenolinių junginių grupę sudaro: didžiausia grupė flavonoidai (flavonai, flavononai, flavonoliai, anto-cianai, izoflavonai, flavanoliai), fenolinės rūgštys (hidroksibenzoinės, hidroksicinamono rūgštys), ta-ninai, paprastieji fenoliai, kumarinai, stilbenai ir lignanai, ligninai [19,2]. Fenoliniai junginiai pasižymi plačiu fiziologinio poveikio spektru: antialerginiu, antimikrobiniu, antioksidantiniu, priešuždegiminiu, antitromboziniu, kardioprotekciniu, vazodiliataciniu poveikiu [20,21]. Bendra fenolinių rūgščių ir fla-vonoidų struktūra pavaizduota 2 paveiksle [22].
Fenolinės rūgštys skirstomos į dvi klases: hidroksibenzoinės rūgštys ir hidroksicinamono rūgštys [19]. Hidroksibenzoinėms rūgštims priskiriamos: galo, p – hidroksibenzoinė, protokatechino, vanilino, syringo rūgštis, kurių bendra strūktūra yra C6 – C1. Hidroksicinamo rūgštims priskiriamos: kavos, ferulinė, sinapo, p – kumaro, kurių bendra struktūra yra C6 – C3 [20]. Fenolinių rūgščių variaci-ja priklauso nuo hidroksi grupių vietos ir skaičiaus aromatiniame žiede [23]. Hidroksibenzoinės rūgš-tys aptinkamos aluje, avietėse, akai uogose, hidroksicinamono - obuoliuose, kavoje, cinamone, grū-duose [2].
3 pav. Fenolinių rūgščių struktūrų pavyzdžiai [23]
Flavonoidai yra labiausiai paplitę polifenoliniai junginiai. Jų struktūros pagrindą sudaro fla-vano žiedas (1, 3 – difenilpropanas), sudarytas iš 15 anglies atomų, kurie yra išsidėstę į tris žiedus C6 – C3 – C6, jie paprastai žymimi A, B ir C raidėmis. Aromatinis A žiedas yra sintezuojamas aceta-to/malonato keliu, B žiedas sintezuojamas iš alanino šikimato keliu. Flavonoidų struktūros yra labai skirtingos ir priklauso nuo hidroksilinimo, metilinimo, alkilinimo ir glikozilinimo būdo ir laipsnio [19,20,24]. Flavonoidai gali būti laisvi arba aglikonų ar β – glikozidų formos [25]. Visi flavonoidai yra kilę iš aromatinių amino rūgščių, fenilalanino ir tirozino [22,26].
Flavonoidai gali būti sugrupuoti į įvairias klases. Vertinant pagal gausą, flavonoidai skirstomi į šias klases: flavonoliai, flavonai, izoflavonai, flavanonai, flavandioliai, antocianai, proantocianidinai ir katechinai. Kitoms flavonoidų klasėms priklauso flavan – 3 - oliai, antocianidinai, chalkonai, auro-nai, dihidrochalkoauro-nai, biflavonoidai [27].
3 pav. Pagrindinių flavonoidų klasių struktūrų pavyzdžiai [28]
Flavonoidai yra viena didžiausių pigmentų grupių augaluose kartu su karotenoidais ir chloro-filu, suteikiantys mėlyną, geltoną, oranžinę, purpurinę ir raudoną spalvas [22]. Augaluose flavonoidai įtraukti į kvėpavimo ir fotosintezės procesų kontroliavimą, energijos perdavimą, fotosensitizaciją, mor-fogenezę, taip pat apsaugo nuo neigiamo UV spindulių poveikio ir grybelinių infekcijų. Paros flavo-noidų dozė gaunama su vaisiais ir daržovėmis yra 1 – 2 g [29]. Be anksčiau paminėtų fenoliniams jun-giniams būdingų farmakologinių savybių, flavonoidai slopina lipidų peroksidazės procesą, kapiliarų pralaidumą ir trapumą, ciklooksigenazės ir lipoksigenazės fermentų veiklą. Toks poveikis pasireiškia, nes flavonoidai veikia kaip antioksidantai, dvivalenčių katijonų chelatoriai, laisvųjų radikalų surišėjai. Nustatyta, kad flavonoidai slopina įvairius fermentus, tokius kaip hidrolazės, šarminės fosfatazės, aril-sulfatazės, ciklinio adenozino monofosfato (cAMP) fosfodiesterazės, lipazės, α – gliukozidazės ir ki-nazės [29,30].
1.5. Fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Siekiant nustatyti fenolinius junginius pirmiausia reikia juos išekstrahuoti iš augalinės žalia-vos. Fenoliniai junginiai gali būti ekstrahuojami iš šviežių, šaldytų ir džiovintų mėginių [27]. Dažniau-siai vykdoma augalinių žaliavų ekstrakcija su tirpikliais. Cheminė ekstrakcija priklauso nuo naudoja-mo tirpiklio, temperatūros, pH, ekstrakcijos laiko, tirpiklio ir žaliavos kiekio, mėginio fizikinių ir che-minių charakteristikų.Tokie tirpikliai kaip metanolis, etanolis, acetonas, etilo acetatas ir jų kombinaci-jos, taip pat šių tirpiklių mišiniai su vandeniu įvairiomis proporcijomis, yra naudojami fenolinių jungi-nių ekstrakcijai iš augalų. Tinkamas tirpiklio parinkimas svarbus išekstrahuojamų fenolijungi-nių jungijungi-nių kiekiui. Metanolis veiksmingiausias mažos molekulinės masės fenoliams ekstrahuoti, o didelės mo-lekulinės masės flavanoliai geriau išekstrahuojami su vandeniniu acetono tirpalu. Etanolis yra geras
polifenolių junginių ekstrahentas ir yra saugus vartoti žmonėms [19]. Naudojant grynus organinius tirpiklius polinės fenolinės rūgštys visiškai neišsiekstrahuos, todėl geriau naudoti alkoholio – vandens ar acetono - vandens mišinius [31].
Žinoma daug augalinės žaliavos ekstrakcijos metodų. Augalinių žaliavų ekstrakcijai galima naudoti superkritinius skysčius, ultragarsą, mikrobangas, suslėgtus skysčius, Soksleto aparatą ir ma-ceraciją [24,32]. Ekstrakcija Soksleto aparatu ir maceracija, lyginant su kitais metodais, užima daug laiko, reikalauja didelio kiekio tirpiklių, o efektyvumas yra gana mažas [19].
1.6. Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai
Fenolinių junginių analizės metodas parenkamas pagal tai, ar norima nustatyti bendrą fenoli-nių jungifenoli-nių kiekį, ar specifinę grupę [19]. Fenolifenoli-nių jungifenoli-nių kiekio nustatymui ekstraktuose galima naudoti įvairius spektrofotometrinius ir chromatografinius metodus. Taip pat galima taikyti kapiliarinę elektroforezę ir kapiliarinę zonų elektroforezę. Naudojami Folin – Denis, Folin – Ciocalteu (FC), va-nilino, 4 - (dimetilamino) - cinamaldehido spektrometriniai metodai, kolorimetrija su geležies drusko-mis ir UV absorbcija. Dažniausiai naudojami chromatografiniai metodai yra dujų chromatografija, e-fektyvioji skysčių chromatografija (ESC), ee-fektyvioji skysčių chromatografija – masių spektrometrija (ESC-MS) [19,33].
Folin – Ciocalteu yra dažniausiai naudojamas bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo me-todas. Šis kolorimetrinis metodas pagrįstas tuo, kad šarminėje aplinkoje fenoliniai junginiai perduoda elektronus fosfomolibdano - fosfovolframo rūgščių kompleksui ir susiformuoja mėlynos spalvos kompleksas. Susidariusio tirpalo absorbcija yra nustatoma spektrofotometru esant 760 nm bangos il-giui [34,35]. Metodas nėra specifiškas fenolinių junginių atskirų klasių identifikavimui. Kitas metodo trūkumas, kad fenolinių junginių nustatymui gali trukdyti mėginyje esantys kiti junginiai [27].
Vanilino metodas plačiai taikomas proantocianidinų (kondensuotų taninų) kiekybiniam nusta-tymui augalinėje žaliavoje. Metodas specifiškas flavan - 3 - oliams, dihidrochalkonams ir proantocia-nidinams, kurie turi viengubą ryšį 2 ir 3 pozicijoje bei laisvą meta-hidroksi grupę B žiede. Taikant šį metodą, dažniausiai naudojamas standartas yra katechinas. Šis metodas yra specifiškas, jautrus proan-tocianidinų nustatymui [27].
4 - (dimetilamino) - cinamaldehido (DMAC) metodas taip pat naudojamas proantocianidinų nustatymui. Reakcijos metu proantocianidinams sureagavus su 4 - (dimetilamino) - cinamaldehidu su-sidaro žalios spalvos chalkonas [27]. DMAC metodas, lyginant su vanilino metodu, yra žymiai
jaut-resnis. Šviesos absorbcija yra matuojama esant 640 nm bangos ilgiui, tai sumažina tikimybę antociani-dinų trukdymui [36].
Spektrofotometrinis metodas, paremtas reakcija su AlCl3, yra tinkamas panašios struktūros flavonoidų rutinininei analizei atlikti. Kompleksus su aliuminio chloridu geriau sudaro flavonai ir fla-vonoliai. Absorbcija matuojama esant 404 – 430 nm bangos ilgiui po 2 – 60 minučių. Flavonoliai su-daro kompleksus su C - 3 ir C - 5 hidroksilo grupėmis ir dihidroksilo grupes su B žiedu [37]. Nustaty-ta, kad bet koks hidroksilo grupės blokavimas glikozilinant C - 3 padėtyje trukdo AlCl3 chelatų susida-rymui [38].
Spektrofotometrinis metodas, paremtas reakcija su 2, 4 – dinitrofenilhidrazinu (DNPH). Me-todas selektyviau reaguoja su flavanono tipo flavonoidais nei flavonais ar flavonoliais [39]. Metodo principas pagrįstas DNPH reagento reakcija su ketoninėmis ar aldehidinėmis grupėmis, kai susidaro raudonos spalvos 2, 4 - dinitrofenilhidrazono junginiai. Reakcija vykdoma metanolio aplinkoje, esant 50 °C temperatūrai 50 minučių vandens vonelėje. Tirpalui atvėsus iki kambario temperatūros, absor-bcija matuojama prie 486 nm bangos ilgio [40].
Chromatografiniai metodai yra vieni dažniausiai naudojamų metodų fenolinių junginių atsky-rimui ir kiekybiniam nustatymui augalinėje žaliavoje [22]. Efektyvioji skysčių chromatografija naudo-jama fenolinių junginių atskyrimui ir kiekybiniam nustatymui. Šiam metodui nustatyti visus analizuo-jamus komponentus netrukdo susidarę galimi derivatai ir degradacijos produktai. Daugeliu atveju ga-lima nustatyti ir labai mažus analičių kiekius. ESC svarbūs parametrai yra mėginių grynumas, mobili fazė, kolonėlės tipas ir detektorius. Paprastai fenolinių junginių nustatymui naudojama atvirkštinių fa-zių ESC [22,27].
1.7. Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas
Laisvieji radikalai yra natūralaus ląstelių metabolizmo produktai. Laisvasis radikalas gali būti apibūdinamas kaip atomas ar molekulė, turinti vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų išorinėje orbita-lėje ir galinti egzistuoti nepriklausomai. Neįprastas laisvojo radikalo elektronų skaičius padaro jį nes-tabilų, trumpo gyvavimo ir labai reaktyvų. Dėl didelio reaktyvumo laisvieji radikalai gali prisitraukti elektronus iš kitų junginių ir taip įgyti stabilumą. Molekulė, iš kurios pasisavinamas radikalas, tampa laisvuoju radikalu. Tęsiant įvykių grandinę, sukeliama ląstelių pažaida [41]. Pažeidžiamos makromo-lekulės, tokios kaip: lipidai, baltymai, angliavandeniai, deoksiribonukleorūgšties (DNR) pažeidimai, dėl kurių gali pasireikšti homeostazės sutrikimai ir ląstelų pažeidimai [42]. Daugiausiai laisvųjų
radi-kalų susidaro mitochondrijose, mažesni kiekiai aptinkami endoplazminiame tinkle, plazmoje ir bran-duolio membranose [43].
Bendrai oksidantais yra vadinamos reaktyviosios deguonies formos (ROS)/reaktyviosios azo-to formos (RNS). ROS ir RNS gali būti klasifikuojamos į dvi grupes: radikalinės ir neradikalinės reak-tyviosios formos (1 lentelė) [41]. Radikalinės formos pasižymi didesniu reaktyvumu nei neradikalinės, bet yra mažiau stabilios [44]. Laisvieji radikalai gali susidaryti dėl vidinių ir išorinių veiksnių. Vidiniai veiksniai, dėl kurių susidaro ROS: uždegiminių procesų metu gaminasi makrofagai ir neutrofilai, neut-rofilams kovojant su svetimkūniais, neutrofilų ir lipidų oksidacijos metu, ksantino ir mitochondrinės citochromų oksidazės metu, generuojama arachidono rūgšties, trombocitų, makrofagų ir raumenų ląs-telių metabolizmo metu, industrinės prigimties – alkoholio ir vaistų vartojimo metu, tam tikri herbici-dai ir pesticiherbici-dai, chemikalai, ksenobiotikai. Išoriniai veiksniai, sukeliantys radikalų susidarymą, yra rūkymas, radiacija, sunkiųjų metalų jonai, teršalai, hiperoksija, ozonas [42,44,45].
Oksidacinis stresas pasireiškia, kai balanasas tarp antioksidantų ir laisvųjų radikalų sutrinka, išeikvojami antioksidantai arba kaupiasi laisvieji radikalai [43,45]. Užsitęsus oksidaciniam stresui, su-keliami ląstelių pažeidimai ar ląstelių žūtis. Oksidacinis stresas yra vienas iš pagrindinių faktorių, le-miančių daugelio chroniškų ir degeneracinių ligų vystymąsi, tokių kaip vėžys, artritas, senėjimo pro-cesas, autoimuniniai sutrikimai, kardiovaskulinės ir neurodegeneracinės ligos, [46,47] diabetas, akių ligos, įgytas imuninio nepakankamumo deficitas (AIDS), virškinamojo trakto ligos [44].
1 lentelė. ROS ir RNS klasifikacija [41]
Pavadinimas Simbolis Pavadinimas Simbolis
Reaktyvaus deguonies formos Reaktyvaus azoto formos
Radikalinės Radikalinės
Superoksidas O2˙- Azoto oksidas NO˙
Hidroksilas OH˙ Azoto dioksidas NO2˙
Alkoksilas RO˙ Neradikalinės
Peroksilas RO2˙ Peroksinitritas ONOO-
Neradikalinės Nitrozilo katijonas NO+
Vandenilio peroksidas H2O2 Nitrozilo anijonas NO-
Hipochlorito rūgštis HOCl Diazoto trioksidas N2O3
Singletinis deguonis 1O2 Diazoto tetraoksidas N2O4
Pavadinimas Simbolis Pavadinimas Simbolis
Ozonas O3 Peroksinitritas ONOOH
Hipobromido rūgštis HOBr Nirilchloridas NO2Cl
1.8. Antioksidantai, antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai
Antioksidantai – molekulės, kurios yra pakankamai stabilios, kad atiduotų elektroną nestabi-liam laisvajam radikalui ir jį neutralizuotų, taip sumažindamos ląstelėms daromą žalą. Antioksidantai neutralizuodami laisvąjį radikalą, suformuoja naują radikalą, kuris yra stabilus, dėl susidariusių intra-molekulinių vandenilinių jungčių [42,48]. Kai kurie antioksidantai žmogaus organizme susidaro nor-malaus metabolizmo metu, kitus - žmogus gauna iš augalinių žaliavų ir maisto [42].
Antioksidantai pagal kilmę yra skirstomi į dvi dideles grupes: fermentai antioksidantai ir ne-fermentiniai antioksidantai. Taip pat antioksidantai yra grupuojami į endogeninius ir egzogeninius. Egzogeniniai dar skirstomi į natūralius ir sintetinius [48].
Fermentai antioksidantai pagal apsauginius mechanizmus skirstomi į pirminius ir antrinius. Pirminiams priskiriami: glutationo peroksidazė, katalazė, superoksido dismutazė. Jų poveikis pasireiš-kia net esant mažoms koncentracijoms. Antriniams: gliukozės – 6 - fosfato dehidrogenazė ir glutationo reduktazė. Antriniai fermentai nedalyvauja tiesioginiame laisvųjų radikalų neutralizavime, bet priside-da prie kitų endogeninių antioksipriside-dantų poveikio [48].
Nefermentiniai antioksidantai: endogeniniai - vitaminas A, kofermentas Q10, šlapimo rūgš-tis, glutationas; egzogeniniai - vitaminai (C, E, K), karotenoidai (β – karotenas, likopenas, luteinas), fenoliai (stilbenai, fenolinės rūgštys - benzoinė rūgštis, hidroksidenzoinė rūgštis, cinamono rūgštis ir hidroksicinamono rūgšties derivatai, flavonoidai – flavonoliai, flavanai, flavanonai, flavanoliai, flavo-nai ir antocianidiflavo-nai) [48,49], mineralai (cinkas, selenas), amino ir riebalų rūgštys, skaidulos, N – ace-tilcisteinas, feritinas, albuminas, bilirubinas, melatoninas, tioliai, omega - 3 ir omega - 6 riebiosios rūgštys ir kiti [44,47].
Antioksidantų efektyvumą prieš laisvuosius radikalus lemia šie faktoriai: cheminis reaktyvu-mas prieš laisvuosius radikalus ir stechiometrinis skaičius, susidariusio radikalo likireaktyvu-mas, sąveika su kitu antioksidantu, koncentracija ir judrumas aplinkoje bei absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas, šalinimas [50]. Antioksidantai veikia pagal kelis skirtingus mechanizmus: 1) surasti junginius, kurie inicijuoja peroksidaciją, 2) metalų jonų chelacija, 3) ˙O2- numalšinimas, siekiant išvengti peroksidų
susidarymo, nutraukiant autoksidacijos reakcijų grandinę ir 4) lokalizuoto O2 koncentracijos sumaži-nimas [51].
Organizmui svarbi subalansuota ir antioksidantais praturtinta mityba, kuri gali padėti gintis nuo oksidacinio streso ir laisvųjų radikalų sukeltos žalos. Antioksidantų gausu daržovėse, vaisiuose, grūdinėse kultūrose, prieskoniuose, arbatoje, riešutuose ir kituose produktuose. Didžiausia antioksida-cine verte pasižymi flavonoidai, polifenoliai, karotenoidai ir vitaminai, aptinkami augalinėje žaliavoje [51,52,53].
Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti yra sukurta daugybė metodų, kurių kiekvienas turi pri-valumų ir trūkumų [48]. Dažniausiai naudojami spektrofotometriniai metodai skirstomi į dvi kategori-jas - laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas (ABTS, DPPH) ir redukcinio aktyvumo nustatymas (CUP-RAC ir FRAP) [54]. Šie metodai matuoja antioksidanto gebėjimą perduoti elektroną oksidantui, kuris po redukcijos pakeičia spalvą. Spalvos pasikeitimo laipsnis koreliuoja su antioksidanto koncentracija mėginyje [55].
ABTS laisvųjų radikalų surišimo metodas – paprastas ir patogus metodas bendram antioksi-daciniam aktyvumui nustatyti. Metodas išmatuoja antioksidantų gebėjimą surišti stabilų ABTS˙+ kati-jono radikalą (2, 2' - azino-bis - (3 - etilbenztiazolin - 6 - sulfono rūgštis)). Reakcijos metu mėlynai žalios spalvos chromogeninis reagentas praranda savo spalvos intensyvumą, išreiškiamą trolokso ekvi-valentais. Absorbcija matuojama prie 600 - 750 nm bangos ilgio [56,57]. ABTS˙+ katijono radikalas susidaro iš ABTS veikiant stiprioms oksiduojančioms medžiagoms. Antioksidantai neutralizuoja kati-jono radikalą tiesioginės redukcijos metu arba vandenilio atomų perdavimu, metodas priklauso nuo antioksidanto struktūros, terpės pH [57]. Reakcijos laikas, lyginant su DPPH, yra žymiai trumpesnis 5 - 30 minučių [54]. Šiuo metodu bendras antioksidacinis aktyvumas gali būti nustatytas grynose me-džiagose, kūno skysčiuose ir augalinėse žaliavose [57].
DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas – pagrįstas antioksidanto ar bet kurios kitos mo-lekulės, turinčios silpną vandenilinę jungtį, reakcija su organiniu azoto DPPH (2, 2 – difenil – 1 - pik-rilhidrazilas) radikalu, turinčiu ryškiai violetinę spalvą, sukeldamas tirpalo spalvos pasikeitimą. Reak-cija pagrįsta DPPH radikalo pasikeitimu į 1, 1 – difenil - pikrilhidraziną [58]. Reakcijos laikas yra 20 – 60 minučių. Antioksidantų redukcija prieš DPPH reagentą gali būti įvertinta absorbciją matuojant prie 515-528 nm bangos ilgio [56].
CUPRAC redukcinio aktyvumo nustatymo metodas – universalus, paprastas, nebrangus an-tioksidantų tyrimo metodas. Metodas pagrįstas anan-tioksidantų gebėjimu redukuoti dvivalentį varį (Cu (II)) į vienvalentį (Cu (I)). Naudojamas vario (II) - neokuproino reagentas, kuris ruošiamas lygiomis dalimis sumaišant vario (II) chloridą, neokuproiną ir amonio acetatą, pH turi būti 7. Po 30 minučių
absorbcija matuojama prie 450 nm bangos ilgio [56]. CUPRAC reagentas yra stabilesnis ir prieina-mesnis nei kiti chromogeniniai reagentai (ABTS, DPPH). Šiuo metodu galima nustatyti tiolio tipo an-tioksidantų aktyvumą priešingai nei FRAP metodu. Redukcijos reakcija, suteikianti vienvalenčio vario chelatui spalvą, yra santykinai mažiau jautresnė daugeliui parametrų (pH, saulės šviesa, drėgmė, oras) nei kitų reagentų, tokių kaip DPPH, iki tam tikro laipsnio [56,55].
FRAP geležies jonų redukcijos metodas – pagrįstas trivalentės geležies (Fe (III)) - ligando komplekso redukcija į intensyviai mėlynos spalvos dvivalentės geležies (Fe (II)) kompleksą rūgštinėje aplinkoje (pH 3,6). Rūgštinė aplinka reikalinga geležies tirpumui palaikyti ir elektronų perdavimui. FRAP metode naudojamas 2, 4, 6 – tripiridil – s - triazinas (TPTZ) kaip geležį surišantis ligandas. FRAP metodas paprastas, nebrangus ir nereikalaujantis specialios aparatūros [57,59]. FRAP metodas mažai skiriasi nuo ABTS metodo, tik ABTS atliekamas neutralioje aplinkoje, o FRAP rūgštinėje [56].
1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Fenoliniai junginiai yra labai paplitę gamtoje. Jie pasižymi įvairiomis biologinėmis savybė-mis, daro įtaką augalų ir žmogaus fiziologiniams procesams ir yra taikomi medicinoje.
Apibendrinant mokslinėje literatūroje rastą informaciją, galima teigti, kad smulkiažiedė galin-soga pasižymi fenoliniams junginiams būdingomis terapinėmis savybėmis ir gali būti naudojama me-dicinoje. Smulkiažiedžių galinsogų (Galinsoga parviflora L.) žolė yra potencialus fenolinių junginių šaltinis, kuris nereikalauja ypatingų augimo sąlygų ir yra nebrangi.
Siekiant įvertinti fenolinių junginių bendrą kiekį augalinėje žaliavoje paprastai naudojamas Folin – Ciocalteu metodas. Šis metodas nėra specifiškas atskirų fenolinių junginių grupių nustatymui, todėl norint atskirai įvertinti bendrą flavonoidų kiekį žaliavoje, geriausia rinktis spektrofotometrinį metodą, paremtą reakcija su aliuminio chloridu. Šis metodas dažnai naudojamas rutininei analizei. Biologiškai aktyvių junginių - antioksidantų aktyvumui įvertinti dažnai naudojamas CUPRAC re-dukcinės galios įvertinimo metodas, kuris išsiskiria savo paprastumu, nėra brangus ir neužima daug laiko. Konkretiems analizuojamiems fenoliniams junginiams identifikuoti ir įvertinti jų kiekį mišinyje naudojama dideliu atrankumu pasižyminti atvirkštinių fazių ESC. Tai šiuolaikiškas, tikslus ir patiki-mas tyrimo metodas.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimams naudota augalinė žaliava – smulkiažiedžių galinsogų (Galinsoga parviflora L.) žo-lė, rinkta žydėjimo metu įvairiuose Lietuvos miestuose 2015 m. birželio – rugpjūčio mėnesiais. Augalo žaliava rinkta Anykščiuose, Kaune, Kėdainiuose, Ignalinoje ir Vilkaviškyje. Augalinės žaliavos rinki-mo vietos pateiktos 4 paveiksle.
4 pav. Smulkiažiedės galinsogos rinkimo vietos [60]
2.2. Naudoti reagentai ir aparatūra
Reagentai. Buvo naudoti šie reagentai ir standartinės medžiagos: troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) (98%), įsigytas iš „FlukaChemika“ (Buchs, Šveica-rija), hiperozidas (93,51%) iš „HWIAnalytikGMBH“, rutinas (97,11%) ir chlorogeno rūgštis (95,33%), įsigyti iš „Extrasynthese“ (Genay, Prancūzija), izokvercitrinas (94,16%), gautas iš „Chromadex“ (San-ta Ana, JAV). CUPRAC reagentui sudaryti buvo naudojamas vario (II) chlorido dihidra(San-tas, gau(San-tas iš „Alfa Aesar GmbH & Co KG“ (Karlsruhe, Vokietija), neokuproinas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich Che-mie“ (Vokietija). Buferinei sistemai sudaryti buvo naudojamas amonio acetatas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich“ (Belgija). Aliuminio chlorido heksahidratas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Steinheim, Vokietija), natrio karbonatas, kvercetino dihidratas iš „Carl Roth GmbH + Co“ (Karlsruhe,
Vokietija), heksametilentetraminas - iš „Alfa Aesar“ (Massachusetts, JAV), ledinė acto rūgštis, Folin - Ciocalteu reagentas ir galo rūgšties monohidratas - iš ,,Sigma-Aldrich‘‘ (St. Louis, JAV), 96,3% (v/v) etanolis - iš AB ,,Stumbras‘‘ (Kaunas, Lietuva). Acetonitrilas (ACN) (Buchs, Šveicarija) ir skruzdžių rūgštis - iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija).
Aparatūra. Ekstraktų filtravimui buvo naudoti 0,22 µm nailono mikrofiltrai (diametras – 13 mm, įsigyti iš „Carl Roth GmbH & Co. KG“ (Vokietija), glicerolio vonia su grįžtamuoju šaldytuvu (Heidolph, Vokietija) ir analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija). Tyrimams naudotas chromatografas Waters 2690/5 (Waters Corporation, Milford, 23 JAV) su YMC-Pack ODS-A (150 x 4,6 mm I.D; S - 3µm) kolonėle (YMC Europe Gmbh, Vokietija). Junginių identifikavimui buvo naudotas diodų matricos detektorius Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, JAV) (200,0 - 500,0 nm).
2.3. Galinsogos ekstraktų paruošimas
Smulkiažiedės galinsogos žolė džiovinta kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spin-dulių apsaugotoje vietoje. Sausa žaliava susmulkinta elektriniu malūnėliu. Pasveriama 5,33 g (0,0001 tikslumu) žaliavos, užpilama 100 ml 70 % (v/v) etanolio. Mišinys kaitinamas 1,5 val 90 °C temperatū-roje glicerolio vonioje su prijungtu grįžtamuoju šaldytuvu. Gauti ekstraktai buvo filtruojami pro popie-rinį filtrą į kolbutes.
2.4. Tyrimo metodikos
Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas. Bendras fenolinių junginių kiekis nustato-mas spektrofotometriniu metodu, naudojant darbinį Folin – Ciocalteu reagentą. Darbinis Folin – Cio-calteu reagentas gaminamas, praskiedžiant motininį tirpalą distiliuotu vandeniu 10 kartų. Rezultatai įvertinami naudojant galo rūgšties kalibracinę kreivę.
Tiriamieji tirpalai ruošiami: 1 ml ekstrakto sumaišomas su 5 ml darbinio Folin – Ciocalteu reagento, 4 ml 7,5 % natrio karbonato tirpalo, sumaišoma ir palieka 60 minučių stovėti tamsioje vieto-je, kambario temperatūroje. Po 60 minučių spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 760 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamasis tirpalas, bet vietoje 1 ml ekstrakto pilama 1 ml 70 % (v/v) etanolio.
Galo rūgšties kalibracinei kreivei gauti buvo ruošiami etaloniniai galo rūgšties tirpalai. Jie buvo ruošiami tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1 ml ekstrakto pilami 1 ml 5 - ių žinomų skirtingų koncentracijų, intervale 0,03125 - 0,5 mg/ml, galo rūgšties tirpalų.
Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui ab-soliučiai sausos žaliavos pagal kalibracinę kreivę. Apskaičiuojama pagal formulę:
𝐺𝐴𝐸 = 𝑐 ×𝑉 𝑚(
𝑚𝑔 𝑔 )
c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);
g – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
Galo rūgšties kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas (R2) ir tiesinė regresijos lygtis (y) pavaizduoti 5 paveiksle.
5 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė
Bendras flavonoidų kiekio nustatymas. Bendras flavonoidų kiekis nustatomas aliuminio chlorido spektrofotometriniu metodu. Rezultatai įvertinami, naudojant kvercetino kalibracinę kreivę.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 10 ml matavimo kolbutę, įpilant 0,4 ml tiriamojo ekstrakto, 4 ml 96 % (v/v) etanolio, 0,2 ml 30 % acto rūgšties tirpalo, 0,6 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo. Pa-gamintas mišinys laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 30 min. Po 30 minučių į tirpalą pilama 0,8 ml 5 % heksametilentetramino tirpalo, kolbutės turinys praskiedžiamas distiliuotu vandeniu
y = 0,9068x + 0,0617 R² = 0,996 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Abso rb cija , A
iki žymės ir sumaišomas. Matuojamas tirpalo absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu, esant 407 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas: į 10 ml matavimo kolbutę įpilama 4 ml 96 % (v/v) etanolio, pridedama 0,2 ml 30 % acto rūgšties tirpalo, praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės.
Kvercetino kalibracinei kreivei gauti ruošiami etaloniniai kvercetino tirpalai. Jie ruošiami to-kiomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamieji tirpalai, bet vietoje 0,4 ml paruošto augalinės žaliavos tiriamojo ekstrakto pilama 0,4 ml 6 - ių žinomų skirtingų koncentracijų kvercetino tirpalai, intervale 0,01562 - 0,5 mg/ml.
Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais (QE) gramui absoliučiai sau-sos žaliavos pagal kalibracinę kreivę. Apskaičiuojama pagal formulę:
𝑄𝐸 = 𝑐 × 𝑉
𝑚(𝑚𝑔/𝑔)
c – kvercetino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);
g – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
Kvercetino kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas (R2) ir tiesinė regresijos lygtis (y) pa-vaizduoti 6 paveiksle.
6 pav. Kvercetino kalibracinė kreivė
y = 0,8787x + 0,0247 R² = 0,9976 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 0,5 1 1,5 2 Abso rb cija , A
Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu. CUPRAC reagentas ruošiamas su-maišant 10 mM vario (II) chlorido, 7,5 % neokuproino ir 1 M amonio acetato buferio tirpalus lygiomis dalimis.
Tiriamajam tirpalui paruošti imama 3 ml darbinio CUPRAC reagento, pridedama 10 µl tiria-mojo ektrakto ir sumaišoma. Mišinys laikomas 60 minučių kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Po 60 minučių spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Palygi-nimasis tirpalas ruošiamas tokiomis pačiomis sąlygomis, tik vietoje 10 µl tiriamojo ekstrakto dedama 10 µl 70 % (v/v) etanolio.
Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
𝑇𝐸CUPRAC = c ×𝑉
𝑚(µ𝑚𝑜𝑙/𝑔) c – trolokso koncentracija (µmol/L), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (L);
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
Trolokso kalibracinė kreivė gaunama tokiomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoj tiriamojo tirpalo pilama 10 µl 6 – ių skirtingų žinomų koncentracijų trolokso tirpalaų in-tervale 50 – 800 µmol/l. Redukcinis aktyvumas vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono trolokso kalibracinę kreivę. Trolokso kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas (R2) ir tiesinė regre-sijos lygtis (y) pavaizduoti 7 paveiksle.
7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė CUPRAC metodu y = 0,0397x + 0,1335 R² = 0,9901 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 5 10 15 20 25 Abso rb cija , A
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant 5 - μm ACE C18 analitinę kolonėlę (250 × 4,6 mm). Injekcijos tūris – 10 µl, mobiliosios fazės greitis – 1,0 ml/min. Tyrimo metu naudota mobiliosios fazės gradientinė sistema, sudaryta iš 1% (v/v) skruzdžių rūgšties ir acetonitrilo. Mobiliosios fazės sudėtis skirtingais intervalais nurodyta 2 len-telėje. Junginių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių juginių sulaikymo laikų bei UV absorbcijos spektrų 200 – 500 nm intervalo ribose atitikimus. Identifikavimui naudotas diodų matricos detektorius (DMD). Flavonoidai nustatyti prie 360 nm bangos ilgio, fenolinės rūgštys, išskyrus dihid-roksibenzoinę, prie 320 nm, dihidroksibenzoinė rūgštis 220 nm bangos ilgio.
2 lentelė. ESC mobiliosios fazės sudėtis skirtingais laiko intervalais Laikas (min) Tėkmės greitis
(ml/min)
Komponentų koncentracija (%) Skruzdžių rūgštis (1 %) Acetonitrilas
1,00 95,0 5,0 45,00 1,00 70,0 30,0 55,00 1,00 60,0 40,0 56,00 1,00 10,0 90,0 63,00 1,00 10,0 90,0 64,00 1,00 95,0 5,0
2.5. Duomenų statistinis įvertinimas
Tyrimų duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV), „SPSS 23“ (IBM, JAV) ir Empower® v.2.0 programomis. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN). Skirtumai tarp grupių buvo nustatyti, naudojant Krus-kalo – Voliso (angl. Kruskal Wallis) kriterijų, kai lygintos daugiau nei dvi grupės, ir Mano Vitnio (angl. Mann - Whitney), kai lygintos dvi grupės. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.
Visi atlikti tyrimai schematiškai pavaizduoti 8 paveiksle.
8 pav. Bendra visų vykdytų tyrimų schema Duomenų statistinė analizė
Smulkiažiedės galinsogos (Galinsoga
parviflora L.) ekstrakcijos sąlygų
parinkimas Bendro fenoli-nių jungifenoli-nių kiekio nusta-tymas spektro-fotometriniu metodu su Folin - Ciocal-teu (n=5) Bendro flavo-noidų kiekio nustatymas spektrofotomet-riniu metodu su AlCl3 (n= 5) Antioksidacinio aktyvumo nus-tatymas spekt-rofotometriniu CUPRAC
me-todu (n= 5) kokybinė feno-Kiekybinė ir linių rūgščių analizė ESC metodu (n= 5)
ESC metodikos parin-kimas ir validacija Kiekybinė ir kokybinė fla-vonoidų analizė ESC metodu (n= 5)
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Ekstrahento parinkimas. Siekiant nustatyti tinkamiausią ekstrahentą ir jo koncentraciją, au-galinė žaliava ekstrahuojama vandeniu ir įvairios koncentracijos etanoliu. Šie tirpikliai buvo pasirinkti, remiantis 2015 m. vykdytu mokslininkų tyrimu [12]. Geriausia ekstrahento koncentracija pasirinkta, įvertinus vandeniniame ir įvairios koncentracijos (40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 96 %) etanoliniuose ekstraktuose esantį chlorogeno rūgšties ir kavos rūgšties kiekį ESC metodu (9 pav.).
9 pav. Ekstrahento parinkimas
Lyginant gautus rezultatus nustatyta, kad didesnis rūgščių kiekis gaunamas etanoliniuose tir-pikliuose nei vandenyje. Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad statistiškai reikšmingas skir-tumas tarp etanolinių ir vandeninio tirpiklio yra (p=0,022). Vandenyje nustatytas mažiausias chloroge-no r. 18,75 ± 0,01 µg/g ir kavos r. 37,5 ± 0,01 µg/g kiekis. Didžiausi kiekiai nustatyti 70 % ir 80 % etanoliniuose ekstraktuose. 70 % etanoliniame ekstrakte nustatyta 131,332 ± 0,001 µg/g chlorogeno r. ir 506,567 ± 0,001 µg/g kavos r., o 80 % etanoliniame ekstrakte 131,332 ± 0,001 µg/g chlorogeno r. ir 469,043 ± 0,001 µg/g kavos r. Chlorogeno rūgšties kiekis mėginiuose nesiskiria, o kavos rūgšties kie-kis 70 % etanolio ekstraktuose yra didesnis. Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad skirtums
56,285 131,332 131,332 112,57 112,57 112,57 18,75 363,996 469,043 506,567 337,711 337,711 318,949 37,5 0 100 200 300 400 500 600 Etanolis 96 % Etanolis 80 % Etanolis 70 % Etanolis 60 % Etanolis 50 % Etanolis 40 % Vanduo K ieki s µ g/g Ekstrahentas Chlorogeno rūgštis Kavos rūgštis
tarp 70 % ir 80 % etanolinių ektraktų nėra (p=0,333) statistiškai reikšmingas, todėl ekstrakcijai galima naudoti abi koncentracijas. Remiantis literatūros duomenimis, dažniausiai naudojamas 70 % etanolis, todėl tyrimams pasirinkome jį [61].
Ekstrakcijos metodo parinkimas. Ekstrakcijos metodo parinkimui buvo naudojama: ultra-garso vonelė, glicerolio vonia su prijungtu grįžtamuoju šaldytuvu ir maceracija. Ultraultra-garso vonelėje smulkiažiedžių galinsogų žaliava buvo ekstrahuojama 0,5 val., maceracija buvo atliekama 72 val. ir glicerolio vonioje kaitinama 90 °C temperatūroje su prijungtu grįžtamuoju šaldytuvu 1,5 val. Ekstrak-cijos metodai pasirinkti, atsižvelgiant į kitų mokslininkų tyrimus su smulkiažiede galinsoga. Gautuose ekstraktuose buvo nustatomas chlorogeno r. ir kavos r. kiekis ESC metodu. Rezultatai pateikti 10 pa-veiksle.
10 pav. Ekstrakcijos metodo parinkimas
Lyginant gautus rezultatus, nustatyta, kad didžiausias fenolinių rūgščių kiekis išgaunamas kai-tinant 90 °C temperatūroje su prijungtu grįžtamuoju šaldytuvu - chlorogeno r. 168,75 ± 0,01 µg/g, kavos r. 412,5 ± 0,02 µg/g. Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad statistiškai reikšmingas skirtumas tarp ekstrakcijos metodų yra (p=0,02). Tolimesnių tyrimų atlikimui ekstraktai bus ruošiami ekstrahuojant smulkiažiedžių galinsogų žolę kaitinimo metodu glicerolio vonioje 90 °C temperatūroje su prijungtu grįžtamuoju šaldytuvu.
Ekstrakcijos laikas. Ekstrakcijos laikas buvo parenkamas ekstrahuojant smulkiažiedžių ga-linsogų žolę 70 % etanoliu, kaitinant 90 °C temperatūroje su prijungtu grįžtamuoju šaldytuvu: 0,5 val., 1,0 val., 1,5 val. ir 2,0 val.
37,5 168,75 37,5 131,25 412,5 93,75 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Maceracija 72 val. Kaitinimas 1,5 val. Ultragarso vonelė 0,5 val.
K ieki s µ g/g Ekstrakcijos metodas Chlorogeno rūgštis Kavos rūgštis
Lyginant gautus rezultatus, nustatyta, kad didžiausias kiekis chlorogeno ir kavos rūgščių iš-siskiria po 1,5 val.: chlorogeno r. – 168,856 ± 0,001 µg/g, kavos r. – 412,758 ± 0,001 µg/g, o mažiau-sias - po 0,5 val.: chlorogeno r. – 131,332 ± 0,001 µg/g, kavos r. - 225,141 ± 0,001 µg/g (11 pav.). At-likus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad statistiškai reikšmingo skirtumo tarp skirtingo ekstrak-cijos laiko nėra (p=0,083).
11 pav. Ekstrakcijos laiko parinkimas
Apibendrinant gautus rezultatus, nustatyta, kad tinkamiausias ekstrakcijos metodas yra ekstrahuoti smulkiažiedžių galinsogų žolę 70 % (v/v) etanoliu ir kaitinti glicerolio vonioje 90 °C tem-peratūroje su prijungtu grįžtamuoju šaldytuvu 1,5 val.
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas smulkiažiedžių galinsogų žolės
ekstraktuose spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu
Suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas smulkiažiedžių galinsogų žolės etanoliniuo-se ekstraktuoetanoliniuo-se. Tyrimo rezultatai pateikti 12 pav. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Vilkaviškyje 40,216 ± 1,37 mg/g. Mažesnis kiekis - Ignalinoje 37,275 ± 0,91 mg/g ir Kėdainiuose 35,329 ± 1,04 mg/g rinktose augalinėse žaliavose. Tarp Vilkaviškyje ir Ignalinoje gautų rezultatų yra nedidelis fenolinių junginių kiekio skirtumas. Mažiausi rezultatai nustatyti Kaune 31,6 ± 0,46 mg/g ir Anykščiuose 31,932 ± 1,37 mg/g augusiose smulkiažiedėse galinsogose.
131,332 150,094 168,856 131,332 225,141 281,426 412,758 337,711 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0,5 val. 1,0 val. 1,5 val. 2,0 val.
K ieki s µ g/g Ekstrakcijos laikas Chlorogeno rūgštis Kavos rūgštis
Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad skirtumai tarp fenolinių junginių kiekių, nustatytų žaliavose iš skirtingų augimviečių, yra statistiškai nereikšmingi (p=0,086). Taigi, galima teigti, kad skirtingose Lietuvos vietovėse surinktose augalinėse žaliavose bendras fenolinių junginių junginių kiekis skiriasi mažai.
12 pav.Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas smulkiažiedžių galinsogų ekstraktuose skir-tinguose miestuose (n=5)
Gauti rezultatai lyginti su 2010 m. mokslininkų atliktais tyrimais Čilėje [6]. Bendras fenolinių junginių kiekis Galinsoga parviflora L. žaliavoje buvo nustatytas apie 45 mg/g. Šiame tyrime nustaty-tas bendras didžiausias fenolinių junginių kiekis yra 40,216 mg/g (12 pav.). Lyginant tyrimus, skirtu-mas tarp Čilėje gautų rezultatų ir didžiausio kiekio Lietuvoje yra 1,12 karto. Abu tyrimai buvo vykdyti Folin – Ciocalteu metodu, tačiau skyrėsi proceso principas ir ekstraktų paruošimo metodas. Apibendri-nus, galima teigti, kad bendras fenolinių junginių kiekis Galinsoga parviflora L. augalinėje žaliavoje Čilėje ir Lietuvoje yra panašus.
3.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas smulkiažiedžių galinsogų žolės
ekstrak-tuose spektrofotometriniu metodu
Ištyrus fenolinius junginius, toje pačioje augalinėje žaliavoje, buvo nustatytas ir bendras fla-vonoidų kiekis. Rezultatai pateikti 13 pav. Flafla-vonoidų kiekis galinsogų žaliavoje svyravo nuo 19,36 iki 29,5 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas Kėdainiuose 29,5 ± 0,11 mg/g augusiose galinso-gų žolėse. Mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas Ignalinoje 19,36 ± 0,08 mg/g ir Kaune 20,022 ± 0,06 mg/g rinktose galinsogos žaliavose. Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad skirtumai
31,932 37,275 31,6 35,329 40,216 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Anykščiai Ignalina Kaunas Kėdainiai Vilkaviškis
F en oli n ių j u n gin ių k ie k is m g/g Vietovės
tarp bendro flavonoidų kiekio smulkiažiedžių galinsogų augalinėse žaliavose, rinktose skirtingose au-gimo vietose, yra statistiškai reikšmingi (p=0,028), todėl galima teigti, kad vyrauja flavonoidų kiekio skirtumai tarp skirtinguose miestuose rinktų galinsogos žaliavų.
13 pav.Suminis flavonoidų kiekio įvairavimas smulkiažiedžių galinsogų ekstraktuose skirtingose vietovėse (n=5)
Apibendrinus gautus rezultatus, galima teigti, kad didžiausi flavonoidų kiekiai nustatyti Kė-dainiuose ir Vilkaviškyje rinktose smulkiažiedėse galinsogose ir nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp augimviečių (p=0,028).
3.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas smulkiažiedžių galinsogų žolės
ekstrak-tuose
Smulkiažiedžių galinsogų augalinės žaliavos antioksidacinis aktyvumas buvo įvertintas CUPRAC redukcinio aktyvumo nustatymo metodu. Rezultatai pateikti 14 paveiksle. Gauti rezultatai svyravo nuo 2,925 ± 0,02 µmol/g iki 3,9 ± 0,14 µmol/g. Didžiausias kiekis buvo nustatytas Anykš-čiuose 3,9 ± 0,14 µmol/g rinktose žaliavose. Taip pat didelė redukcinė geba nustatyta Vilkaviškyje 3,77 ± 0,06 µmol/g. Mažesne redukcine geba pasižymėjo Ignalinoje 3,481 ± 0,15 µmol/g bei Kaune 3,213 ± 0,09 µmol/g augusios smulkiažiedės galinsogos, o mažiausias antioksidacinis aktyvumas nus-tatytas Kėdainiuose 2,925 ± 0,02 µmol/g.
25,172 19,36 20,022 29,5 26,868 0 5 10 15 20 25 30 35
Anykščiai Ignalina Kaunas Kėdainiai Vilkaviškis
F lavon oid ų k ieki s m g/g Vietovės
14 pav. Redukcinio aktyvumo (TE, µmol/g) įvairavimas smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstraktuose (n=5)
Apibendrinus, galima teigti, kad antioksidacinės galios skirtumai tarp smulkiažiedžių galinso-gų ekstraktų iš skirtingalinso-gų augimviečių yra statistiškai reikšmingi (p=0,018). Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas Anykščiuose rinktose augalinėse žaliavose.
3.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygų parinkimas
Renkantis ESC metodiką smulkiažiedžių galinsogų ekstraktų analizei pirminiu variantu buvo atsižvelgta į 2015 m. Lenkijoje vykdytus Galinsoga parviflora L. tyrimus [12]. Tyrimų metu jie nau-dojo atvirkštinių fazių ESC su Zorbax SB kolonėle (150 mm × 2,1 mm, 1,9 µm), acetonitrilo/skruzdžių rūgšties (100 : 0,1 v/v) mobilią fazę, injekcijos tūris buvo 5 µl ir metodikos trukmė 30 minučių. Mūsų tyrimų eigoje pritaikyta kita analitinė kolonėlė 5 - μm ACE C18 (250 × 4,6 mm), didesnis injekcijos tūris 10 µl bei ilgesnis analizės laikas 64 minutės. Šių faktorių pakeitimas padarė įtaką geresniam jun-ginių chromatografiniam skirstymui ir palengvino jų analizę. Kadangi buvo keistos analizės sąlygos, pritaikytam metodui buvo atlikta metodikos validacija.
3.6. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija
Norint efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką taikyti tiriamųjų smulkiažiedžių ga-linsogų ekstraktų nustatymui, būtina įrodyti metodikos tinkamumą ją validuojant. Remiantis ICH
(In-3,9 2,925 3,213 3,769 3,481 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Anykščiai Kėdainiai Kaunas Vilkaviškis Ignalina
Antiok sid an tin is ak tyvum as TE , µm ol/g Vietovės
ternational Conference on Harmonisation) analitinių procedūrų validacijos gairėmis, buvo pasirinkti ir įvertinti šie parametrai [62]:
specifiškumas (angl. Specifity);
rezultatų glaudumas (angl. Precision): rezultatų pakartojamumas (angl. Repeatability) ir rezultatų tarpinis preciziškumas (angl. Intermediate Precision);
tiesiškumas (angl. Linearity);
ribos (angl. Range): aptikimo riba (angl. Limit of detection) ir nustatymo riba (angl. Limit of quantitation).
3.6.1. Specifiškumas
Metodikos specifiškumas – gebėjimas vienareikšmiškai nustatyti analitės buvimą [62]. Kiek-viena chromatografinė smailė parodo atskirą junginį, kuris yra visapusiškai atskiriamas nuo priemaišų ir kitų junginių. Specifiškumas pagrindžiamas analičių ir standartinių tirpalų chromatogramos palygi-nimu (smailių sulaikymo laikų).
Lyginant galinsogos žolės ir standartinių tirpalų sulaikymo laikus, nustatyta, kad sulaikymo laikas ir spektriniai duomenys sutampa (3 lentelė).
3 lentelė. Standartinių tirpalų sulaikymo laikai Mėginio pavadinimas Sulaikymo trukmė
(min)
Mėginio pavadinimas Sulaikymo truk-mė (min)
Rutinas 29,265 Kavos rūgštis 19,604
Hiperozidas 29,852 Chlorogeno rūgštis 16,678
Izokvercitrinas 30,533 Dihidroksibenzoinė rūgštis 10,904
3.6.2. Pakartojamumas
Pakartojamumas parodo tyrimo metodikos tikslumą tomis pačiomis veikimo sąlygomis per trumpą laiko tarpą, tyrimą vykdant tą pačią dieną, naudojant tą pačią įrangą ir dirbant tam pačiam ana-litikui. Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kitaip vadinamas santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN), kuris kiekybiniam nustatymui neturėtų viršyti 5 % [62]. Tyrimo metu
pakartoja-mumas buvo vertinamas, skaičiuojant sulaikymo laikus, vieną po kitos tiriant 5 vienodas tiriamųjų tir-palų injekcijas (4 lentelė).
4 lentelė. Metodikos rezultatų pakartojamumas
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN) % Sulaikymo laikui (%) Chlorogeno rūgštis 0,16 Kavos rūgštis 0,13 Dihidroksibenzoinė rūgštis 0,18 Rutinas 0,9 Hiperozidas 2,4 Izokvercitrinas 0,4
Pagal gautus rezultatus matome, kad analičių pakartojamumas SSN sulaikymo laikui skiriasi, tačiau nėra didesnis nei 5 %. Daugiausia varijuoja hiperozido sulaikymo laikas – 2,4 %, o mažiausiai - izokvercitrino – 0,4 %.
Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, kad tiriamųjų tirpalų santykinis standartinis nuokrypis sulaikymo trukmei neviršija 5 % ribos ir rezultatų atkartojamumas atitinka reikalavimus. Remiantis šiuo kriterijumi, metodas yra tinkamas kiekybiniam fenolinių junginių įvertinimui.
3.6.3. Tarpinis preciziškumas
Tarpinis preciziškumas yra variacijos koeficientas, kuris kiekybiniam metodui neturi viršyti 10 % [62]. Tarpiniam preciziškumui įvertinti 2 dienas buvo tiriamos vienodos tirpalų injekcijos, po 5 injekcijas kasdien. Buvo skaičiuojamos SSN reikšmės sulaikymo laikui (5 lentelė).
5 lentelė. Metodikos rezultatų tarpinio preciziškumo įvertinimas
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN) % Sulaikymo laikui (%)
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN) % Sulaikymo laikui (%) Kavos rūgštis 0,16 Dihidroksibenzoinė rūgštis 0,27 Rutinas 1,3 Hiperozidas 3,0 Izokvercitrinas 0,6
Pagal gautus rezutatus matome, kad tirtų junginių tarpinio preciziškumo SSN sulaikymo lai-kui skiriasi, bet neviršija 10 %. Mažiausiai varijuoja izokvercitrino sulaikymo laikas – 0,6 %, daugiau-siai hiperozido – 3,0 %.
Apibendrinant gautus rezultatus, matome, kad tarpinio preciziškumo SSN reikšmės neviršija 10 %, todėl tyrimo metodika atitinka keliamus reikalavimus ir yra tinkama kiekybiniams fenolinių junginių tyrimams atlikti.
3.6.4. Tiesiškumas
Tiesiškumas – gebėjimas gauti detektoriaus atsako įverčius chromatogramose, kurie tiesiogiai proporcingi analitės kiekinei koncentracijai [62]. Tiesiškumas įvertinamas kalibravimo kreivės suda-rymo metodu, nustatomas koreliacijos koeficientas R2, kurio reikšmė turi būti ne mažesnė kaip 0,98 (6 lentelė).
6 lentelė. Tiriamųjų junginių kalibracinių kreivių lygtys ir koreliacijos koeficientai Junginys Kalibracinės kreivės lygtis Koreliacijos koeficientas R2
Chlorogeno rūgštis y = 4,52×107x – 5,86×104 0,999 Kavos rūgštis y = 1,96×107x – 6,45×103 0,999 Dihidroksibenzoinė rūgštis y = 1,75×107x – 2,78×104 0,999 Rutinas y = 2,27×107x + 4,02×103 0,999 Hiperozidas y = 2,05×107x +1,24×104 0,999 Izokvercitrinas y = 6,42×107x – 1,13×103 0,999
Apibendrinant gautus rezultatus galima daryti išvadą, kad ESC metodikos tiesiškumas atitinka visus keliamus reikalavimus. Remiantis šiuo kriterijumi, metodas yra tinkamas fenolinių junginų kie-kybiniam tyrimui.
3.6.5. Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba – mažiausais analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, bet nebūtinai tiksliai nustatomas kiekybiškai. Nustatymo riba – mažiausias analitės kiekis mėginyje, kuris gali būti kiekybiškai įvertinamas tiksliai ir teisingai [62]. Chlorogeno, kavos, dihidroksibenzoinės rūgščių, ruti-no, hiperozido, izokvercitrino aptikimo ir nustatymo ribos buvo apskaičiuojamos, lyginant analitės smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Rezultatai yra pateikiami 7 lentelėje.
7 lentelė. Aptikimo ir nustatymo ribos
Junginys Aptikimo riba µg/ml Nustatymo riba µg/ml
Chlorogeno rūgštis 0,038 0,12 Kavos rūgštis 0,018 0,063 Dihidroksibenzoinė rūgštis 0,01 0,03 Rutinas 0,3 1,3 Hiperozidas 0,3 1,0 Izokvercitrinas 0,1 0,4
Gauti rezultatai parodė, kad tirtų junginių aptikimo ir nustatymo ribos skiriasi. Didžiausios aptikimo ir nustatymo ribos yra rutino, o mažiausios – dihidroksibenzoinės rūgšties.
Įvertinus pasirinktus validacijos kriterijus ir remiantis gautais rezultatais, galima daryti išvadą, kad ESC metodika yra tinkama chlorogeno, kavos, dihidroksibenzoinės rūgščių, rutino, hiperozido, izokvercitrino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui. Validuota ESC metodika bus naudojama šių junginių kiekybiniam nustatymui.
3.7. Fenolinių junginių nustatymas smulkiažiedžių galinsogų augalinėje žaliavoje
ESC metodu
Spektrofotometriniais metodais neįmanoma nustatyti atskirų komponentų kiekių, tik bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį, o ESC metodu ištyrus smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstrak-tus, galime įvertinti atskirų junginių kiekį augalinėje žaliavoje.
Atlikus ESC analizę smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstraktuose, nustatytos fenolinės rūgš-tys: chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, dihidroksibenzoinė rūgštis, ir flavonoidai: rutinas, hiperozidas, izokvercitrinas. Smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstraktų chromatogramos pateiktos 15 paveiksle.
15 pav. Smulkiažiedžių galinsogų žolės ekstraktų chromatogramos, a) λ =258nm, 1 – dihidroksi-benzoinė r.; b) λ = 320 nm, 1 – chlorogeno r., 2 – kavos r.; c) λ = 360 nm., 1 - rutinas, 2 –
