GINTARĖ GIBIEŽAITĖ
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA VALGOMŲJŲ ČESNAKŲ (ALLIUM
SATIVUM L.) MILTELIŲ, CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC) METODĄ Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. dr. Andrejus Ževžikovas _________ _______ (Parašas) (Data)
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas -Prof. dr.Vitalis Briedis
Data
MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA VALGOMŲJŲ ČESNAKŲ (ALLIUM
SATIVUM L.) MILTELIŲ, CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS
SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC) METODĄ Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. dr. Andrejus Ževžikovas _________ _______ (Parašas) (Data) Kaunas, 2017 Darbą atliko Magistrantė Gintarė Gibiežaitė Data Recenzentas
Vardas Pavardė Parašas Data
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Valgomųjų česnakų svogūnų cheminė sudėtis ... 10
1.2 Aliino sintezė ir jo diastereoizomerai ... 11
1.3 Valgomųjų česnakų svogūnuose esančių biologiškai aktyvių junginių stabilumas ... 13
1.3.1 Alicino stabilumas etanoliniuose tirpaluose ir vandenyje ... 14
1.3.2 Alicino ir jo skilimo produktų stabilumas riebaliniuose tirpikliuose ... 15
1.3.3 Vandenyje tirpių biologiškai aktyvių junginių susidarymas iš nestabilaus γ-glutamil-S-alil-L-cisteino ... 17
1.3.4 Fermento alinazės aktyvumas ir stabilumas ... 18
1.4 Valgomųjų česnakų svogūnuose esančių biologiškai aktyvių junginių poveikis ... 18
1.4.1 Priešvėžinis poveikis ... 18
1.4.2 Poveikis širdžiai ir kraujagyslėms ... 19
1.4.3 Cholesterolį mažinantis poveikis ... 19
1.4.4 Antibakterinis poveikis ... 19
1.5 Maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų, gamyba ir cheminė sudėtis ... 20
1.6 Valgomųjų česnakų šalutinis poveikis ir kontraindikacijos ... 22
1.6.1 Kraujavimas ... 22
1.6.2 Citochromo fermentų aktyvumas ... 22
1.6.3 Virškinamojo trakto sutrikimai ir alergijos ... 22
1.7 Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) valgomųjų česnakų miltelių analizei ... 23
1.7.1 Jonų porų chromatografija (ang. Ion-pair chromatography) ... 23
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 25
2.1 Tyrimo objektas ir metodika ... 25
2.1.1 Tyrimo objektas ... 25
2.1.1.1 Maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, cheminė sudėtis ... 25
2.1.2 Kokybinis maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu ... 25
3.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodikos validacija biologiškai aktyvių
junginių maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, tyrimui ... 29
3.1.1 Specifiškumas ... 29
3.1.2 Tiesiškumas ... 30
3.1.3 Rezultatų preciziškumas (glaudumas) ... 31
3.1.4 (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino aptikimo ir nustatymo ribos ... 32
3.2 Maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių bei valgomųjų česnakų svogūnų ištraukų, kokybinės analizės rezultatai ... 33
3.2.1 Kokybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių ... 33
3.2.2 Kokybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose ... 35
3.3 Kiekybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu ... 36
3.3.1 Kiekybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių ... 37
3.3.2 Kiekybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose ... 39
4. IŠVADOS ... 42
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44
katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: maisto papildai, valgomasis česnakas, valgomųjų česnakų milteliai, efektyvioji skysčių chromatografija, alicinas, aliinas.
Darbo tikslas: Atlikti Lietuvoje notifikuotų maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų (Allium sativum L.) miltelių, biologiškai aktyvių junginių (BAJ) kokybinę ir kiekybinę analizę efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu.
Tyrimo objektas ir metodai: Siekiant pritaikyti ESC metodiką BAJ kokybiniam bei kiekybiniam įvertinimui maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, buvo tiriami skirtingų valstybių gamintojų maisto papildai: česnakų miltelių tabletės, Danija (toliau - maisto papildas-1), česnakų miltelių kapsulės, JAV (toliau - maisto papildas-2). BAJ ekstrakcijai iš maisto papildų naudoti metanolio-vandens (80:20, V/V) ir 0,05% skruzdžių rūgšties tirpalai (pH<3) (slopinant alinazės aktyvumą). Siekiant aktyvinti alinazę, ekstrakcijos tirpikliu pasirinktas vanduo. Tyrime naudotas skysčių chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi (Waters 996, 200 - 400 nm bangų ilgio diapazonas). Siekiant kokybiškai ir kiekybiškai palyginti BAJ maisto papilduose su valgomuosiuose česnakuose esančiais BAJ, buvo tiriamos valgomųjų česnakų svogūnų ištraukos.
Rezultatai ir išvados: Maisto papildo-1 (MP-1) tabletėje, kurioje yra valgomųjų česnakų miltelių, nustatytas (-)-L-aliino kiekis (1,921±0,02 mg) sudarė 91,48% gamintojo ant preparato pakuotės deklaruojamo kiekio. Ant maisto papildo-2 (MP-2) pakuotės gamintojas nedeklaruoja jokio BAJ kiekio, tačiau (-)-L-aliino vienoje kapsulėje nustatyta 3,802±0,01 mg. Lyginant 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių ir valgomųjų česnakų svogūnuose esančius BAJ, nustatyta, kad žaliavoje BAJ yra mažiau, nei tokioje pačioje masėje česnakų miltelių.
SUMMARY
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD FOR CHEMICAL COMPOSITION ANALYSIS OF FOOD SUPPLEMENTS, CONTAINING
GARLIC (ALLIUM SATIVUM L.) POWDER
Key words: food supplements, garlic, garlic powder, high-performance liquid chromatography, allicin, alliin.
Aim: To perform the qualitative and quantitative analysis of biologically active compounds determined in food supplements, containing garlic (Allium sativum L.) powder, using high performance liquid chromatography (HPLC) method.
Object and methods: In order to apply HPLC technique for qualitative and quantitative assessment of biologically active compounds in food supplements, containing garlic powder, there were evaluated two different food supplements, which have been manufactured in different countries: garlic powder tablets, Denmark (further – food supplement-1) and garlic powder capsules, USA (futher – food supplement-2). For the extraction of biologically active compounds from food supplements, containing garlic powder, methanol – water (80:20, V/V) and 0,05% formic acid solutions (pH<3) were used (when allinase is inhibited). In order to activate an allinase, water was selected as extraction solvent. In this study chromatograph Waters 2695 with photodiode array detector (Waters 996, 200 - 400 nm wave length) was used. In order to compare the qualitative and quantitative composition of biologically active compounds, determined in food supplements and in raw garlic bulbs, the raw garlic bulbs extracts were prepared and investigated.
Results: In one food supplement-1 tablet, containing garlic powder, there was estimated (-)-L-alliin (1,921±0,02 mg), which coincided with 91,48% of the manufacturer’s declared content, presented on the product package. The manufacturer does not declare on the food supplement-2 package any amount of biologically active compounds, however amount of (-)-L-alliin, which is equal 3,802±0,01 mg, was estimated in one garlic powder capsule. After comparison of an existing biologically active compounds determined in 1 gram of garlic powder and in raw garlic bulbs it was found that the amount of biologically active compounds in raw garlic is lower than in the same weight of garlic powder.
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija GLUAICs - γ-glutamil-S-alil-L-cisteinas GLUPeCs - γ-glutamil-S-(trans-1-propenil)-L-cisteinas GLUPheAla - γ-glutamilfenilalaninas GSAC - γ-glutamil-S-(2-propenil)-L-cisteinas GSMC - γ-glutamil-S-metil-L-cisteinas GST - glutationo S-transferazė
HDACi - histonų deacetilazės inhibitoriai (ang. Histone deacetylase inhibitors) MP-1 - maisto papildas-1
MP-2 - maisto papildas-2
PGC - poringa grafitinės anglies (ang. Porous graphitic carbon) PSO - Pasaulio sveikatos organizacija
RPM - apsisukimai per minutę (ang. Revolutions per minute) SAC - S-alil-L-cisteinas
SAMC - S-alilmerkaptocisteinas SMC - S-metil-L-cisteinas
ĮVADAS
Valgomasis česnakas (Allium sativum L.) - daugiametis žolinis, lelijinių (Liliaceae) šeimos augalas. Tai vienas seniausių tradicinių vaistinių augalų, kurį vartojo įvairios pasaulio kultūros daugeliui susirgimų bei ligų gydyti [50]. Šio augalo dėka buvo palaikomos imuninės, širdies ir kraujagyslių sistemos funkcijos, vėliau pastebėtas jo antioksidacinis, priešmikrobinis ir priešvėžinis aktyvumas [16]. Česnakas taip pat plačiai vartojamas kaip maisto produktas ar prieskonis [50; 38], o jo rūšių suskaičiuojama daugiau kaip trys šimtai [50].
Jau 16 a. pr. Kr. buvo žinomos gydomosios česnako savybės: atrasti ant Eberso papiruso (Egipte) užrašyti virš 20 susirgimų, kurie efektyviai buvo gydomi česnaku [39]. Romėnų laikais kareiviai kramtė šviežias česnakų svogūnų skilteles prieš mūšius, o slavai aiškino, kad česnakas apsaugo nuo gyvačių įkandimų. Afrikoje žvejai išsitepdavo odą česnakų ekstraktu, kad apsisaugotų nuo krokodilų. Europoje buvo tikima, kad česnakas gali apsaugoti nuo vampyrų, demonų, piktųjų dvasių bei turi kitų magiškųjų savybių [50]. Avicena savo knygoje „Al Qanoon Fil Tib“ („Medicinos kanonas“) rekomenduoja vartoti česnaką artrito, dantų skausmo, lėtinio kosulio, vidurių užkietėjimo, gyvačių ir vabzdžių įkandimų, ginekologinių ligų gydymui [13]. Ypač plačiai česnakas pradėtas vartoti II-ojo Pasaulinio karo metais, kuomet kariai sutrindavo jo skilteles ir dėdavo ant žaizdų, kad išvengtų infekcijų [26]. Priešvėžinės česnako savybės pirmą kartą aprašytos 1958 m. mokslininkų A. S. Weisberger ir J. Pensky. Mokslininkai ištyrė česnakų ekstrakto slopinamąjį poveikį vėžinių ląstelių augimui tiek in vitro, tiek in vivo [65]. Vėliau buvo atliekami intensyvūs laboratoriniai ir epidemiologiniai tyrimai, siekiant išsiaiškinti ir pagrįsti česnako priešvėžinio poveikio mechanizmus. Šiandien natūralioji medicina rekomenduoja česnaką vartoti virškinamojo trakto sutrikimų, žarnyno ligų, gerklės, grybelinių infekcijų, parazitozių gydymui [39].
Remiantis PSO duomenimis, širdies ir kraujagyslių ligos yra viena dažniausių mirties priežasčių visame pasaulyje. Apytiksliai apskaičiuota, kad nuo šių ligų iki 2030 metų mirs 23,3 mln. žmonių [70]. Europoje širdies ir kraujagyslių ligos sukelia daugiau kaip pusę visų mirčių [71]. Pastaruoju metu labai susidomėta česnako veiksmingumu gydant širdies ir kraujagyslių ligas, nes daugelis mokslinių tyrimų pagrindė šio augalo efektyvumą mažinant mažo tankio lipoproteinų („blogojo“ cholesterolio), trigliceridų kiekį kraujyje. Taip pat buvo ištirtas jo trombocitų agregaciją mažinantis bei hipotenzinis poveikis [16; 31].
Šiuo metu Lietuvoje notifikuojama vis daugiau maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, todėl renkantis maisto papildą svarbu žinoti, kiek ir kokių biologiškai aktyvių junginių jame yra.
1. Pritaikyti ESC metodiką biologiškai aktyvių junginių (BAJ) kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių.
2. Validuoti pasirinktą ESC metodiką.
3. Palyginti nustatytą BAJ kiekį tirtuose maisto papilduose su valgomųjų česnakų svogūnuose nustatytu kiekiu.
4. Palyginti nustatytą (-)-L-aliino kiekį maisto papilduose su kiekiu, deklaruojamu ant jų pakuočių.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Valgomųjų česnakų svogūnų cheminė sudėtis
Valgomųjų česnakų svogūnuose yra daugiau kaip 2000 komponentų: lakių, tirpių vandenyje ar riebaluose organinių sieros junginių, eterinių aliejų, maistinių skaidulų, cukrų, flavonoidų, pektinų, 17 aminorūgščių, vitaminų, mineralų [16; 18; 63], steroidinių saponinų [47] bei organinių seleno junginių (γ - glutamil-Se-metilselenocisteinas) [10]. 100 g česnakų skiltelių yra 31 mg vitamino C, 0,2 mg vit. B1, PP, B2, B3, provitamino A, mineralų: 400 mg kalio, 25 - 28 mg magnio, 100 mg kalcio,
mažais kiekiais geležies, vario, nikelio, kobalto, chromo, seleno, germanio [50]. Valgomųjų česnakų svogūnų skiltelėse gausu sieros organinių junginių, kurie yra įtraukti „Napralert“ duomenų bazę Illinois universitete Čikagoje (1 lentelė) [16].
1 lentelė. Sieros organiniai junginiai, išskirti iš šviežių valgomųjų česnakų svogūnų [16]
Ajoenai (5) Cisteinai (9) - S-alilcisteinas*
- S-alil-merkapto cisteinas*
Metioninas Tiosulfinatai (12)
Alicinas Cisteino sulfoksidai (7) Metilsulfidai (9) Trisulfidai (4) Aliinas γ-glutamilcisteinai (11) Propenilsulfidai (2) Vinilditiinai (9) Alildisulfidai (4) Cistinas Pseudoskordininai (2) Glutationas Alilsulfidai (2) Dialilsulfidai (7)
- Dialilsulfidas* - Dialildisulfidas* - Dialiltrisulfidas*
Skordininas
Aliltrisulfidai (2) Dimetilsulfidai (6) Sulfanai (4) Cikloaliinas Disulfidai (11) Tetratiolis
Pastaba: junginių skaičius, priklausantis atitinkamai grupei, nurodytas skliausteliuose.
* Išskirti svarbiausi grupės junginiai.
Pagrindiniai komponentai, esantys sveikuose valgomųjų česnakų svogūnuose, yra S-alil-L-cisteino sulfoksidas (aliinas) ir γ-glutamil-S-alkenil-L-S-alil-L-cisteino dariniai - GSAC, GLUPeCs, GSMC (1 pav.) [7; 12; 67; 68], mažesnėmis koncentracijomis identifikuojami kiti sulfoksidai - izoaliinas, metiinas, etiinas, propiinas, butiinas (2 pav.) [8]. Vidutiniškai vienoje česnako svogūno skiltelėje yra 0,9% γ-glutamilcisteino darinių ir iki 1,8% aliino [7]. Išdžiovintų ir susmulkintų česnakų svogūnų milteliuose pagrindiniai BAJ junginiai yra aliinas ir dialildisulfidas (DADS) [12]. Sieros organiniai junginiai česnakų svogūnuose jų laikymo metu kinta: γ-glutamilcisteino dariniai, dalyvaujant
1 pav. γ-glutamilcisteino dariniai, identifikuoti valgomųjų česnakų svogūnuose [68]
2 pav. Valgomųjų česnakų svogūnuose identifikuoti sulfoksidai [8]
1.2 Aliino sintezė ir jo diastereoizomerai
Aliino sintezė pirmą kartą atlikta mokslininkų Stoll ir Seebeck 1951 metais [62]. Buvo vykdoma alkilinimo reakcija L-cisteiną veikiant alilbromidu. Reakcijos produktas – deoksialiinas. Vėliau šis junginys buvo oksiduojamas naudojant vandenilio peroksidą (3 pav.). Gauti du aliino diastereoizomerai - (+)-L-aliinas bei (-)-L-aliinas. Šie junginiai skiriasi deguonies padėtimi prie sieros stereocentro (4 pav.).
3 pav. Cheminė aliino sintezė iš L-cisteino [62]
2013 metais mokslininkai B. Dethier, K. Nott ir M. L. Fauconnier šią sintezę pakartojo. Sintezė buvo vykdoma taip pat dviem etapais. Reakcijos produktas – du aliino diastereoisomerai: 58% (+)-L-aliinas ir 42 % (-)-L-aliinas [23]. Pasak mokslininkų I. Krest ir M. Keusgen (1999), fermentas alinazė, kuri dalyvauja fermentinėje reakcijoje aliinui virstant alicinu, t uri 4 kartus didesnį afinitetą (+)-L-aliinui nei (-)-L-aliinui [45]. Remiantis šiais duomenimis, B. Dethier ir kitų mokslininkų komanda atliko aliino diastereoizomerų atskyrimą, tyrimui naudodami šį fermentą. Alinazė buvo patalpinta į sintetinio (±)-L-aliino tirpalą, dalyvaujant piridoksalio fosfatui (fermento kofaktoriui) kalio fosfato buferyje (pH 6,2). Mišinys buvo laikomas 37 0C temperatūroje, mėginiai buvo imami kas 2 minutes, vėliau didesniais intervalais ir naudojami chromatografavimui ESC metodu (5 pav.) [23].
5 pav. Fermentinis aliino diastereoizomerų atskyrimas [23]
Gautose chromatogramose matoma, kad atliktas fermentinis aliino diastereoizomerų atskyrimas yra efektyvus. Esant nustatytoms sąlygoms, (+)-L-aliinas su fermentu alinaze visiškai sureaguoja per 6 minutes, o (-)-L-aliinas per maždaug 2 valandas [23].
Yra nedaug kitų ESC metodikų, skirtų šiems diastereoizomerams atskirti ir nustatyti kiekybiškai. Mokslininkai B. Dethier, M. Laloux ir kiti [22] nustatė, kad parūgštinus mobiliąją fazę skruzdžių, fosforo ar trifluoracto rūgštimi, galima taip pat atskirti aliino diasteroizomerus (6 pav.). Kai tirpalo pH mažesnis už aliino pKa, junginys dažniausiai yra protonizuotas (amino grupė – NH3+). Neparūgštinus judančiosios fazės, junginiai dažniausiai neatsiskiria ir
6 pav. (+)-L-aliino ir (-)-L-aliino chromatograma, gauta naudojant poringos grafitinės anglies (ang. PGC) kolonėlę (judančiosios fazės tėkmės greitis - 0,3 ml/min, temperatūra 30 0
C, gradientas: ACN 0%-16%, parūgštinta 0,1% trifluoracto rūgštimi). Smailės: a) (-)-L-aliinas; b)
(+)-L-aliinas [22]
1.3 Valgomųjų česnakų svogūnuose esančių biologiškai aktyvių junginių
stabilumas
Aliinas nustatomas česnakų svogūnų skiltelių ląstelių citoplazmoje, o fermentas alinazė - ląstelių vakuolėse. Kuomet česnakas pjaustomas, traiškomas ar kramtomas, vakuolė pažeidžiama ir iš jos išsiskiria alinazė. Ji dalyvauja fermentinės hidrolizės reakcijoje aliinui virstant alicinu, piruvatu ir amonio jonu (NH4+) [8; 14; 21; 51; 67; 68] (7 pav.). Alicinas yra pagrindinis
charakteringą kvapą česnakui suteikiantis junginys [7] ir manoma, kad yra stipresnis antibiotikas nei penicilinas ar tetraciklinas [67]. Optimali pH reikšmė alinazės aktyvumui - 6,5. Susidaręs alicinas yra nestabilus ir laikant ilgesnį laiką ar distiliacijos vandens garais metu jis skyla į kitus junginius (priklausomai nuo temperatūros, organinių tirpiklių) [8]. Jis stabilesnis 20% etanolyje nei vandenyje, tačiau nestabilus mažu poliškumu pasižyminčiuose tirpikliuose - augaliniuose aliejuose, n-heksane [27; 29].
Alinazė skrandžio sulčių aplinkoje yra užslopinama (alicino susidaro tik labai nedidelis kiekis), todėl valgomųjų česnakų miltelių tabletės yra padengiamos įvairiomis pagalbinėmis skrandžio rūgštims atspariomis medžiagomis. Alicinas didesnėmis koncentracijomis gali susidaryti tik žarnyne, esant optimaliam pH [8].
7 pav. Alicino, piruvato ir amonio jono (NH4+) susidarymas iš aliino fermentinės hidrolizės
reakcijos metu [8]
1.3.1 Alicino stabilumas etanoliniuose tirpaluose ir vandenyje
Didesni alicino kiekiai gaunami ekstrakcijos metu kaip ekstrahentą naudojant etanolinius tirpalus (8 pav.), tačiau kambario temperatūroje alicino kiekis tirpale palaipsniui mažėja ir beveik išnyksta per dvi savaites (ypač kai ekstrahentas 100% etanolis ar vanduo). Atlikus tyrimus buvo nustatyta, kad alicinas kambario temperatūroje stabiliausias 20% ir 50% etanolio tirpaluose (9 pav.) [29].
8 pav. Alicino kiekis valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose naudojant įvairius ekstrahentus (nustatyta naudojant ESC, kiekvienos ištraukos mėginius imant po penkis kartus) [29]
9 pav. Alicino stabilumas valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose kaip ekstrahentą naudojant įvairių koncentracijų etanolį ir vandenį [29]
Vandeninėse valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose alicino stabilumas esant skirtingai temperatūrai – 4 0C (šaldytuvo temperatūra) ir 37 0C (žmogaus kūno temperatūra) - akivaizdžiai
skiriasi (10 pav.). Laikant vandeninę ištrauką 4 0C temperatūroje mėnesį laiko, alicino kiekis sumažėja apie 15%, o laikant 37 0C temperatūroje - daugiau kaip 50% alicino kiekio sumažėja per
5 dienas [19]. Todėl siekiant terapinio česnako poveikio, vandeninės jo ištraukos turėtų būti vartojamos kaip įmanoma greičiau, kad būtų išvengiama alicino skilimo.
10 pav. Alicino stabilumas vandeninėse česnakų svogūnų ištraukose esant 4 0C („□“) ir 37 0C („♦“) temperatūrai (nustatyta naudojant ESC) [19]
1.3.2 Alicino ir jo skilimo produktų stabilumas riebaliniuose tirpikliuose
Riebaliniuose tirpikliuose alicinas yra nestabilus ir skyla į riebaluose tirpius stabilesnius sulfidus: daugiausiai į dialildisulfidą (DADS), šiek tiek mažiau į dialilsulfidą (DAS), dialiltrisulfidą (DATS), dialiltetrasulfidą (priklausomai nuo temperatūros, ekstrakcijos laiko, tirpiklio poliškumo). Taip pat gali susidaryti ir penta-, heksa- ar hepta- sulfidai, tačiau tik labai mažomis koncentracijomis [7; 39].
Atitinkamomis sąlygomis iš alicino gali susidaryti vinilditiinai, (Z)- ar (E)- ajoenai [39], pvz., kaip ekstrahentą naudojant n-heksaną ar sojų aliejų [48]. Šiuose tirpikliuose alicinas greitai
skyla į alilsulfeninę rūgštį bei tioakroleiną, iš kurių taip pat greitai susiformuoja didesnės molekulės - vinilditiinai ir ajoenai (11 pav.) [40].
Atliktas bandymas, kurio metu buvo tiriamas šešių riebaluose tirpių alicino skilimo produktų (DADS, DATS, (Z)- ir (E)- ajoenų, 2-vinil-4H-1,3-ditiino, 3-vinil-4H-1,2-ditiino) stabilumas valgomųjų česnakų aliejuje esant skirtingoms aplinkos temperatūroms – 4 0C, 10 0C, 25 0C ir 35 0C. Mėginiai tokiomis temperatūros sąlygomis buvo laikomi 3 mėnesius. Gauti rezultatai parodė, kad visi šie junginiai stabilūs 4 0C temperatūroje, tačiau nestabilūs 35 0
C temperatūroje (12 pav.). Po 3 mėnesių esant 35 0C temperatūrai DADS kiekis sumažėjo 49,74%, DATS - 30,31%, (Z)- ajoeno - 78,28%, 3-vinil-4H-1,2-ditiino - 40,97%, 2-vinil-4H-1,3-ditiino - 43,73%, o (E)- ajoeno kiekis pradėjo mažėti tik 10 savaitę. Pagal gautus duomenis galima daryti išvadą, kad DADS ir (Z)-ajoenas labai nestabilūs, vinilditiinai stabilesni nei ajoenai, o DATS išliko stabilus 35 0
C temperatūroje beveik 3 mėnesius [68].
12 pav. Riebaluose tirpių alicino skilimo produktų stabilumas valgomųjų česnakų aliejuje, esant skirtingoms aplinkos temperatūroms – 4 0C, 10 0C, 25 0C ir 35 0C. (A)- (Z)- ajoenas, (B)-
(E)- ajoenas, (C)- DADS, (D)- DATS, (E)- 3-vinil-4H-1,2-ditiinas, (F)- 2-vinil-4H-1,3-ditiinas (nustatyta naudojant ESC) [68]
1.3.3 Vandenyje tirpių biologiškai aktyvių junginių susidarymas iš nestabilaus
γ-glutamil-S-alil-L-cisteino
Vandenyje tirpūs junginiai (S-alil-L-cisteinas (SAC), S-alilmerkaptocisteinas (SAMC), S-metil-L-cisteinas (SMC)) susiformuoja vandeninės ekstrakcijos metu iš pirminio nestabilaus junginio - glutamil-S-alil-L-cisteino (GLUAICs). Reakcijoje dalyvauja fermentas γ-glutamiltranspeptidazė (γ-GT). SAC ir jo skilimo produktai (metil-L-cisteinas (SMC) ir S-alilmerkaptocisteinas (SAMC)) yra valgomųjų česnakų svogūnų vandeninių ištraukų komponentai ir pasižymi biologiniu aktyvumu tiek in vitro, tiek in vivo (13 pav.) [39].
13 pav. Vandenyje tirpių junginių susidarymas iš γ-glutamil-S-alil-L-cisteino, dalyvaujant fermentui γ-glutamiltranspeptidazei [39]
1.3.4 Fermento alinazės aktyvumas ir stabilumas
Alinazės aktyvumas slopinamas vykdant ekstrakciją metanolio (0,01M) : vandenilio chlorido/skruzdžių rūgšties mišiniu arba karštu vandeniu. Kuomet tirpalo pH mažesnis už 3,6, alinazės aktyvumas slopinamas negrįžtamai. Šio fermento denatūracija prasideda esant 42 0
C temperatūrai, o 60 0
C temperatūroje jis visiškai užslopinamas [8].
1.4 Valgomųjų česnakų svogūnuose esančių biologiškai aktyvių junginių poveikis
1.4.1 Priešvėžinis poveikis
Pastaraisiais metais didelis dėmesys skiriamas valgomųjų česnakų svogūnuose esančių BAJ biologinio aktyvumo mechanizmams išsiaiškinti. Buvo atlikta šimtai tyrimų tiek in vivo, tiek in vitro, kaip tyrimų objektą pasirenkant sieros organinius junginius, daugiausiai alilsulfidus ir jų metabolitus bei vandenyje tirpius junginius - SAC, SAMC [34]. Nors tikslus valgomųjų česnakų svogūnuose esančių BAJ priešvėžinio aktyvumo mechanizmas vis dar nežinomas, remiantis eksperimentinių tyrimų duomenimis, buvo pateikta keletas hipotezių: česnakuose esantys BAJ pasižymi antioksidaciniu poveikiu, slopina kancerogenų aktyvinimą, sukelia vėžinių ląstelių apoptozę, stabdo vėžinės ląstelės ciklą [39].
In vitro ir tyrimai su gyvūnais parodė, kad valgomųjų česnakų svogūnuose esantys sieros organiniai junginiai gali slopinti krūties, kraujo, šlapimo pūslės, skrandžio, burnos, tiesiosios žarnos, odos, gimdos, stemplės, plaučių vėžio plitimą organizme [6; 42; 52]. Nors sieros organiniai junginiai sukelia vėžinių ląstelių apoptozę, tačiau neveikia sveikų organizmo ląstelių, pvz., dialilsulfidas (DAS) sukelia SH-SY5Y neuroblastomos lastelių apoptozę nepažeisdamas neuronų [41]. DAS taip pat mažina oksidacinį stresą ir greitina testosterono metabolizmą [59]. Tiek DAS, tiek DADS aktyvina svarbius detoksikacijoje dalyvaujančius fermentus - glutationo S-transferazes (GST) - kurie šalina kenksmingus elektrofilus (kancerogenus), sujungdami juos su glutationu. Junginiai, kurie didina GST aktyvumą, manoma, gali būti vartojami vėžio profilaktikai [60]. Alil- junginiai ir izotiocianatai gali veikti kaip HDACi (histonų dea cetilazės inhibitoriai). Jie aktyvina genus vėžinėse ląstelėse, kurie stabdo ląstelės ciklą ir sukelia apoptozę [24]. Vandenyje tirpus junginys S-alilmerkaptocisteinas (SAMC) slopina vėžio metastazes plaučiuose ir antinksčiuose [36].
Kaip alicinas veikia vėžines ląsteles buvo ištirta molekuliniu lygiu. Išsiaiškinta, kad alicinas taip pat sukelia vėžinių ląstelių apoptozę. Šis junginys sukelia redokso pasikeitimą
1.4.2 Poveikis širdžiai ir kraujagyslėms
Česnakų svogūnuose esantys BAJ gali apsaugoti širdį nuo miokardo infarkto, priešvėžinio preparato doksorubicino sukelto toksinio poveikio širdžiai, aritmijų, hipertrofijos, išemijos - reperfuzijos sukeltos ląstelių žūties. Keliuose skirtinguose tyrimuose teigiama, kad česnakas mažina lipidų peroksidaciją [24; 43], pasižymi reikšmingu kraujospūdžio mažinimo efektu, slopina trombocitų agregaciją ir didina fibrinolitinį aktyvumą [66].
1.4.3 Cholesterolį mažinantis poveikis
Vartojant česnakų svogūnų skilteles, greitėja riebalų metabolizmas ir mažėja cholestorolio kiekis kraujyje. Didindami didelio tankio lipoproteinų („gerojo“ cholesterolio) ir mažindami mažo tankio lipoproteinų („blogojo“ cholesterolio) bei trigliceridų kiekį, biologiškai aktyvūs valgomųjų česnakų junginiai saugo kraujagysles ir širdį. BAJ, esantys valgomųjų česnakų svogūnuose, reikšmingai mažina fermento HMG-CoA reduktazės aktyvumą, įtakoja cholesterolio hidroksilazės ir kitų fermentų (riebalų rūgščių sintazės ir fermentų, dalyvaujančių pentozės - fosfato metabolizme) kiekius [56; 57; 58; 61]. Atliktas klinikinis tyrimas, kuriame dalyvavo 70 žmonių, parodė, kad vartojant po 6 česnakų aliejaus kapsules per dieną mėnesį laiko, sumažėjo bendrasis lipidų, mažo tankio lipoproteinų, lipidų peroksidacijos produktų kiekis bei padidėjo didelio tankio lipoproteinų kiekis kraujyje [25].
1.4.4 Antibakterinis poveikis
In vitro tyrimai parodė, jog valgomųjų česnakų svogūnuose esantys BAJ yra aktyvūs prieš daugelį Gram-neigiamų ir Gram-teigiamų bakterijų rūšių: Escherichia, Salmonella,
Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Proteus, Bacillus, Clostridium ir Mycobacterium tuberculosis. Valgomųjų česnakų eterinis aliejus pasižymėjo dideliu antibakteriniu aktyvumu prieš Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ir Escherichia coli [17]. Bakterijos, kurios įprastai atsparios antibiotikams (pvz., meticilinui - Staphylococcus aureus), yra jautrios valgomųjų česnakų svogūnuose esantiems BAJ. Valgomųjų česnakų (25%) ir svogūnų (75%) eterinių aliejų mišinys turi sinergistinį poveikį prieš Aspergillus versicolor ir pasižymi sterigmatocistino (STC) gamybos slopinamuoju poveikiu [44]. Kiti in vitro tyrimai parodė antibakterinį aktyvumą prieš Helicobacter pylori infekciją [46; 49; 55]. Manoma, kad antibakterinį poveikį sukelia alicinas bei sulfidų dariniai (DAD, DADS, DATS), turintys alil- grupę, kuri yra svarbiausia šiam poveikiui sukelti [17; 30].
1.5 Maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų, gamyba ir cheminė
sudėtis
Valgomųjų česnakų svogūnai yra apdorojami keturiais metodais: džiovinant šalčiu (liofilizacija), vykdant distiliaciją vandens garais, ruošiant aliejines bei etanolines ištraukas. Taikant šiuos metodus, gaminamos keturios pagrindinės maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų, formos: išdžiovinti česnakų milteliai, česnakų eterinis aliejus, česnakų aliejinė ištrauka, „subrandintas“ česnakų ekstraktas (ang. AGE - aged garlic extract). Priklausomai nuo pasirinkto gamybos metodo, sieros organinių junginių sudėtis skirtingose maisto papildų formose skiriasi [64; 68].
Valgomųjų česnakų eterinis aliejus yra gaunamas distiliacijos vandens garais metu. Česnakų svogūnų skiltelės supjaustomos, sutrinamos, užpilamos vandeniu ir distiliuojamos vandens garais. Tokiame aliejuje neidentifikuojami vandenyje tirpūs junginiai. Jame nustatomi alilsulfidai (DAS, DADS, DATS) bei vinilditiinai [7; 39; 50; 67], kurie susidaro skylant alicinui. Rinkoje esančių valgomųjų česnakų aliejaus kapsulių sudėtyje dažniausiai yra augalinis aliejus ir maži kiekiai (dėl aštraus kvapo) česnakų eterinio aliejaus arba augaliniame aliejuje ištirpintas valgomųjų česnakų ekstraktas [7; 68].
Valgomųjų česnakų aliejinė ištrauka - gelsvas skystis, netirpus vandenyje, turintis stiprų česnakų kvapą [50]. Aliejinės česnakų ištraukos iš pradžių buvo vartojamos kaip maisto pagardai. Kaip maisto papildai jie gaminami kapsulių forma, prieš tai česnakų svogūnų skilteles susmulkinus augaliniame aliejuje. Gamybos proceso metu, dalis aliino virsta alicinu, tačiau šis greitai skyla į vinilditiinus (70%) (izomerus 2-vinil-4H-1,3-ditiiną ir 3-vinil-4H-1,2-ditiiną), alilsulfidus (18%) ir ajoenus (12%). Etanolinėse česnako ištraukose vyrauja S-alilcisteinas (SAC), alilsulfidai (DADS, DATS, alilmetiltrisulfidas) [7; 67; 68].
esantis junginys, tačiau daugelio maisto papildų sudėtyje jis neidentifikuojamas dėl didelio jo nestabilumo [7; 39]. Kai kurie gamintojai tvirtina, kad tam tikras alicino kiekis gali susidaryti pačiame organizme, išgėrus valgomųjų česnakų miltelių kapsulę ar tabletę, tačiau tyrimai parodė, kad tik labai nedidelis šio junginio kiekis (< 5%) susidarė dirbtinėse skrandžio sultyse [28]. Mažų alicino kiekių susidarymo priežastis - alinazės, kuri aliiną verčia alicinu, slopinimas rūgštinėje aplinkoje. Alicinas taip pat nenustatytas kraujyje po maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, pavartojimo per os, todėl manoma, kad daugumą gydomųjų šio augalo savybių in vivo suteikia ne pats alicinas, bet jo skilimo produktai [7].
Gaminant valgomųjų česnakų ekstraktus, sveikos arba supjaustytos česnakų svogūnų skiltelės dedamos į ekstrahuojantį tirpalą (vandenį ar etanolį). Vėliau tirpalas atskiriamas nuo žaliavos ir koncentruojamas. Kartais gaminami ir sausieji ekstraktai. Ekstraktuose, ypač „subrandintuose“ česnakų ekstraktuose (AGE), gausu vandenyje tirpių junginių (daugiausiai SAC, šiek tiek mažiau SAMC), taip pat mažais kiekiais nustatoma ir riebaluose tirpių junginių - alilsulfidų [7; 39; 50], nėra alicino [50]. Šis „subrandintas“ ekstraktas gaminamas ekstrahuojant valgomųjų česnakų svogūnus 15-20% etanoliu ir laikomas 20 mėnesių kambario temperatūroje, vėliau filtruojamas ir koncentruojamas [39]. Per tokį ilgą laikotarpį nemalonaus kvapo, dirginantys junginiai virsta į stabilius, bekvapius ir mažiau dirginančius junginius [7; 39]. Vandenyje tirpūs organiniai sieros junginiai, susiformavę ekstrakto brandinimo metu, pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis [20]. Toks ekstraktas standartizuojamas pagal SAC [50], kurio turėtų būti ne mažiau kaip 0,05% [51].
Maisto papildai, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių ar aliejaus, dažniausiai gaminami kapsulių ir tablečių formomis. Paros dozė nenustatyta, tačiau daugelis tyrimų buvo atlikta su 400 - 1000 mg (atitinka 2 - 5 g šviežio česnako arba 1 - 2 česnakų svogūnų skilteles) standartizuotais valgomųjų česnakų maisto papildais. Ant kai kurių maisto papildų pakuočių gali būti nurodytos aliino koncentracijos [51].
Pastaraisiais metais maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių ar aliejaus, populiarumas akivaizdžiai išaugo, tačiau juose esančios bioaktyvios medžiagos tiriamos retai [68]. Gamintojai turi užtikrinti, kad tokie maisto papildai yra saugūs, efektyvūs bei atsparūs aplinkos poveikiui [7].
1.6 Valgomųjų česnakų šalutinis poveikis ir kontraindikacijos
1.6.1 Kraujavimas
Česnakas pasižymi trombocitų agregaciją mažinančiomis savybėmis, tačiau didina kraujavimo riziką, ypač šio augalo maisto papildus vartojant kartu su antikoaguliantais (heparinu, varfarinu) bei trombocitų agregaciją mažinančiais vaistais (aspirinu, klopidogreliu, tiklopidinu) [15; 51].
1.6.2 Citochromo fermentų aktyvumas
Tyrime su žmogaus kepenų Fa2N-4 hepatocitais buvo nustatyta, kad maisto papildai, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų, gali slopinti citochromo P450 CYP2C9 substratų metabolizmą (pvz., varfarino), tačiau neįtakoja fermento CYP3A4 aktyvumo [35]. Kitame tyrime su žmogaus kepenų mikrosomų preparatais in vitro buvo nustatyta, kad du junginiai, esantys valgomuosiuose česnakuose (S-alil- ir S-metil-L-cisteinas) 0,1 mg/ml koncentracijomis reikšmingai slopina CYP3A4 aktyvumą, tačiau neįtakoja CYP2C9, CYP2C19 ir CYP1A2 aktyvumo [32]. Kol atliekami tolimesni tyrimai, rekomenduojama vengti valgomųjų česnakų maisto papildų ir vaistų, metabolizuojamų fermento CYP3A4 (pvz., ciklosporino, ketokonazolo, itrakonazolo, gliukokortikoidų, oralinių kontraceptikų, verapamilio, diltiazemo, lovastatino, simvastatino, atorvastatino), derinių [50].
1.6.3 Virškinamojo trakto sutrikimai ir alergijos
Daugelis tyrimų pagrindė keletą valgomųjų česnakų nepageidaujamų reakcijų, susijusių su virškinamojo trakto sutrikimais: pilvo skausmai, vidurių pūtimas, dingęs apetitas, nemalonus česnakų kvapas, sklindantis iš burnos, ypač pavartojus šviežių valgomųjų česnakų svogūnų skiltelių. Česnakų nerekomenduojama vartoti sergant skrandžio ir plonosios žarnos gleivinės uždegimu, nes jie gali pabloginti ligos simptomus. Pernelyg gausus česnakų vartojimas gali sukelti kepenų pažeidimus bei gali būti žalingas raumenų ląstelėms. Pastebėtos ir alerginės reakcijos - alerginis kontaktinis dermatitas, generalizuota urtikarija, angioedema, anafilaksija. Nerekomenduojama česnakų dėti ant odos po drabužiais, nes gali būti sukeliami įvairūs odos sudirginimai [50].
fazę sudaro mažo skersmens dalelės. Ši chromatografija gali būti normaliųjų ir atvirkštinių fazių. Normaliųjų fazių chromatografijoje nejudančioji fazė yra polinė, o judančioji – nepolinė. Atvirkštinių fazių chromatografijoje nejudančioji fazė yra nepolinė, o judančioji – polinė [1; 2]. Beveik 90% tyrimų su mažos molekulinės masės junginiais atliekami taikant atvirkštinių fazių ESC metodą. Viena iš pagrindinių šio režimo didelio populiarumo priežasčių – gebėjimas atskirti tarpusavyje labai panašius junginius ir taip palengvinti jų identifikavimą [3; 5]. Kokybiškai ir kiekybiškai biologiškai aktyvūs junginiai nustatomi remiantis gauta chromatograma. Pirmiausia smailės identifikuojamos - nustatomos kokybiškai. Vėliau nustatant junginių koncentracijas svarbiausias parametras - smailės plotas [2].
1.7.1 Jonų porų chromatografija (ang. Ion-pair chromatography)
Jonų porų chromatografijos metodas yra taikomas krūvį turintiems junginiams atskirti. Jis plačiai naudojamas selektyviai rūgščių ir bazių analizei, ypač su atvirkštinių fazių chromatografija [69]. Jonų porų chromatografija yra kaip alternatyva jonų mainų chromatografijai, tačiau taikant jonų mainų chromatografiją rūgščių ir bazių mišinių atskyrimas nėra toks geras kaip taikiant jonų porų chromatografiją. Jonų porų chromatografijos principas - organinis joninis junginys (pvz., heptansulfoninė rūgštis, heksansulfoninė rūgštis) dedamas į judančiają fazę ir analizės metu suformuoja jonų porą su tiramajame mėginyje esančiu priešingo krūvio junginiu:
Analitė+
+ priešingo krūvio jonas- → [analitė+ priešingo krūvio jonas-] pora Analitė
+ priešingo krūvio jonas+ → [analitė- priešingo krūvio jonas+] pora [4].
Pavyzdys pateiktas 14 paveiksle. Šis skirstymo mechanizmas buvo pasirinktas ir pritaikytas BAJ nustatymui maisto papilduose, kuriuose yra valgomųjų česnakų miltelių, bei šviežioje valgomųjų česnakų žaliavoje.
14 pav. Jonų porų susidarymas tarp katijoninės analitės ir jonų poras sudarančio reagento
Siekiant pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką biologiškai aktyvių junginių kokybiniam bei kiekybiniam įvertinimui maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, buvo tiriami skirtingų valstybių gamintojų maisto papildai: česnakų miltelių tabletės, Danija (toliau - Maisto papildas-1), česnakų miltelių kapsulės, JAV (toliau - Maisto papildas-2).
Palyginimui buvo tirtos pagamintos valgomųjų česnakų svogūnų (kilmės šalys Lietuva ir Kinija) ištraukos.
2.1.1.1 Maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, cheminė
sudėtis
Maisto papildas-1 (MP-1). 1 tabletės sudėtis: valgomųjų česnakų (Allium sativum L.) milteliai (210 mg), užpildai (mikrokristalinė celiuliozė, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė), stabilizatorius (polivinilpirolidonas), emulsikliai (hidroksipropilmetilceliuliozė, riebalų rūgščių magnio druskos, riebalų rūgštys, karnaubo vaškas), dažiklis (titano dioksidas).
Maisto papildas-2 (MP-2). 1 kapsulės sudėtis: valgomųjų česnakų (Allium sativum L.) milteliai (400 mg), želatina, ryžių miltai, lipnumą reguliuojančios medžiagos (silicio dioksidas, magnio stearatas).
2.1.2 Kokybinis maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių,
vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu
Įranga
Tyrime naudotas skysčių chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi (Waters 996, 200 - 400 nm bangų ilgio diapazonas). Biologiškai aktyvių junginių atskyrimui naudota chromatografavimo kolonėlė - YMC-Triart C18 (150 mm x 3,0 mm), sorbento dalelių dydis 3 µm.
ESC metodo sąlygos
Atsižvelgiant į mokslininkų tyrimus (Arnault ir kt., 2003), tiriamųjų junginių atskyrimui taikytas gradientinis eliuavimas. Eliuentas A: 10 mM (1,56 g) natrio-divandenilio fosfato dihidratas, 5 mM (1,1 g) 1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska (pH 2,1, reguliuojamas su fosforo rūgštimi). Eliuentas B: acetonitrilas, 10 mM (1,56 g) natrio-divandenilio fosfato dihidratas, 5 mM (1,1 g) 1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska (50:50, V/V, pH 2,1). Eliuavimo gradientas nurodytas 2 lentelėje. Eliuentų tėkmės greitis - 0,4 ml/min, injekcijos tūris - 10 µl, kolonėlės temperatūra 38 0C, detekcija vykdyta prie 208 nm UV šviesos bangos ilgio. Vieno mėginio
chromatografavimo trukmė - 30 min.
2 lentelė. Judančiosios fazės gradientinės sistemos sudėtis
Tirpiklių sistemos sudėtis (%) Laikas, min 0 5 25 26 28 30 A 100 70 46 0 0 100 B 0 30 54 100 100 0 Medžiagos ir reagentai
Naudotos medžiagos ir reagentai yra analitinio švarumo. Etaloninis tirpalas buvo ruošiamas naudojant 99,9% metanolį (Roth, Vokietija). Darbinių tirpalų ruošimui buvo naudojamas išgrynintas vanduo, gautas naudojant vandens valymo sistemą Millipore (Bedford, JAV), metanolis (99,9%, Roth, Vokietija), skruzdžių rūgštis (≥96,0%, Sigma-Aldrich, Vokietija).
Eliuentų sistemai sudaryti buvo naudojamas natrio - divandenilio fosfato dihidratas (≥99,0%, Aldrich, Vokietija), 1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska (≥99,0%, Sigma-Aldrich, Vokietija), išgrynintas vanduo, acetonitrilas (99,8%, Sigma-Sigma-Aldrich, Vokietija), 85% fosforo rūgštis (99,99%, Sigma-Aldrich, Vokietija).
Etaloninio tirpalo ruošimas
Etaloninis (±)-L-aliino tirpalas buvo ruošiamas ištirpinant referentinį (±)-L-aliino (≥90%) standartą (4,10 mg) (Sigma-Aldrich, Vokietija) metanolyje (5 ml) ir filtruojant per PVDF (0,45μm) filtrą. Gauto tirpalo koncentracija 0,82 mg/ml.
Tiriamųjų tirpalų ruošimas
Tiriamieji tirpalai buvo ruošiami iš Lietuvoje notifikuotų maisto papildų, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, įsigytų Lietuvos vaistinėse. Šviežios žaliavos ištraukos buvo ruošiamos iš valgomųjų česnakų svogūnų, įsigytų viename Lietuvos prekybos centre. Mėginiai buvo ruošiami remiantis literatūroje nurodyta ekstrakcijos metodika [11].
MP-2 darbinio tirpalo ruošimas: grūstuvėje buvo sumaišytas 3-jų kapsulių turinys (kiekvienoje yra po 400 mg česnakų miltelių). Bendra kapsulių turinio masė 2,004 g. Pasverta 1,680 g gautos masės (atitinka 1 g česnakų miltelių), kuri perkelta į analitinę kolbutę ir kambario temperatūroje ekstrahuota 10 ml metanolio- vandens (80:20, V/V) ir 0,05% skruzdžių rūgšties tirpalu (pH<3). Mėginys praskiestas 5 kartus, maišytas ultragarso vonelėje 5 min., filtruotas per 0,22 µm PVDF filtrą ir naudotas chromatografavimui.
2. Valgomųjų česnakų miltelių ekstrakcija aktyvinant fermentą alinazę.
MP-1 darbinio tirpalo ruošimas: grūstuvėje buvo susmulkintos 5 tabletės (kiekvienoje po 210 mg česnakų miltelių). Bendra susmulkintų tablečių masė 1,691 g. Pasverta 1,616 g gautos masės (atitinka 1 g česnakų miltelių), kuri perkelta į analitinę kolbutę ir kambario temperatūroje ekstrahuota 10 ml vandeniu (pH 6-8). Mėginys praskiestas 5 kartus, maišytas ultragarso vonelėje 5 min., filtruotas per 0,45 µm PVDF filtrą ir naudotas chromatografavimui.
MP-2 darbinio tirpalo ruošimas: grūstuvėje buvo sumaišytas 3-jų kapsulių turinys (kiekvienoje yra po 400 mg česnakų miltelių). Bendra kapsulių turinio masė 1,993 g. Pasverta 1,665 g gautos masės (atitinka 1 g česnakų miltelių), kuri perkelta į analitinę kolbutę ir kambario temperatūroje ekstrahuota 10 ml vandeniu (pH 6-8). Mėginys praskiestas 5 kartus, maišytas ultragarso vonelėje 5 min., filtruotas per 0,45 µm PVDF filtrą ir naudotas chromatografavimui.
Valgomųjų česnakų svogūnų ištraukų ruošimas
Valgomųjų česnakų svogūnų (kilmės šalis Lietuva) ekstrakcija slopinant fermentą alinazę. 1,016 g valgomųjų česnakų svogūnų skiltelių buvo supjaustytos ir sutrintos grūstuvėje. Gauta masė perkelta į analitinę kolbutę. Tolimesni veiksmai buvo analogiški česnakų miltelių ištraukų paruošimui.
Valgomųjų česnakų svogūnų (kilmės šalis Kinija) ekstrakcija slopinant fermentą alinazę. 1,010 g valgomųjų česnakų svogūnų skiltelių buvo supjaustytos ir sutrintos grūstuvėje. Gauta masė perkelta į analitinę kolbutę. Tolimesni veiksmai buvo analogiški česnakų miltelių ištraukų paruošimui.
1,013 g valgomųjų česnakų svogūnų skiltelių buvo supjaustytos ir sutrintos grūstuvėje. Gauta masė perkelta į analitinę kolbutę. Tolimesni veiksmai buvo analogiški česnakų miltelių ištraukų paruošimui.
Valgomųjų česnakų svogūnų (kilmės šalis Kinija) ekstrakcija aktyvinant fermentą alinazę. 1,019 g valgomųjų česnakų svogūnų skiltelių buvo supjaustytos ir sutrintos grūstuvėje. Gauta masė perkelta į analitinę kolbutę. Tolimesni veiksmai buvo analogiški česnakų miltelių ištraukų paruošimui.
Analizė
Optimalių chromatografinių sąlygų parinkimas buvo vykdomas tiriant etaloninį (±)-L-aliino tirpalą. Tyrimo metu buvo keičiama kolonėlė, jos temperatūra, eliuentų tėkmės greitis.
Parinkus optimalias sąlygas, buvo pagaminti darbiniai tirpalai, siekiant įvertinti metodikos tinkamumą kokybiniam ir kiekybiniam BAJ nustatymui maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, bei valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose.
Duomenų analizė
Gauti eksperimentiniai duomenys buvo analizuojami ir vertinami naudojant „MS Excel 2010“ (Microsoft, JAV) programą bei „SPSS 20.0“ („IBM“, JAV) statistinių duomenų analizės paketą. Visi bandymai buvo kartojami tris kartus, vėliau buvo apskaičiuojami tyrimų rezultatų matematiniai vidurkiai bei standartiniai nuokrypiai. Statistiniam reikšmingumui įvertinti buvo pasirinktas reikšmingumo lygmuo (ɑ= 0,05).
specifinius parametrus ir yra tinkamas taikyti praktikoje. Remiantis ICH gairėmis, buvo įvertintas metodo tinkamumas ir atitikimas šiems parametrams: specifiškumui (ang. Specificity), tiesiškumui (ang. Linearity) bei rezultatų preciziškumui (ang. Precision) (jį sudaro pakartojamumas (ang. Repeatability) ir atkartojamumas (ang. Reproducibility)), taip pat buvo nustatytos aptikimo (ang. LoD - Limit of detection) ir nustatymo (ang. LoQ - Limit of quantitation) ribos [54; 59].
3.1.1 Specifiškumas
Specifiškumas yra metodo geba nustatyti ieškomą analitę mėginyje esant ir kitiems junginiams - įvairioms priemaišoms, degradacijos produktams. Tai gebėjimas atskirti analites nuo kitų į analitę panašių ar analizei trukdančių junginių. Šis validacijos parametras yra svarbiausias, nes jei metodas yra nespecifiškas, tuomet kiti validacijos parametrai netenka prasmės [33]. Siekiant įvertinti specifiškumą, buvo lyginamos etaloninio tirpalo ir tiriamųjų tirpalų chromatogramos, BAJ UV šviesos absorbcijos spektrai, sulaikymo laikai. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino etaloninio tirpalo sulaikymo laikai yra 9,039 min. ir 9,359 min. atitinkamai, tiriamuosiuose maisto papildų tirpaluose buvo identifikuotas tik (-)-L-aliino diastereoizomeras, kurio sulaikymo laikai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. (-)-L-aliino sulaikymo laiko tiriamuosiuose preparatuose reikšmės (matavimus kartojant 3 kartus)
Tiriamieji preparatai (-)-L-aliino sulaikymo laikas, min
MP-1 8,981
MP-2 8,929
Taip pat buvo palyginti etaloninio (±)-L-aliino tirpalo ir tiriamuosiuose tirpaluose identifikuoto (-)-L-aliino UV šviesos absorbcijos spektrai (15 pav.).
15 pav. A) (±)-L-aliino standarto tirpalo UV šviesos absorbcijos spektrai; B) (-)-L-aliino UV šviesos absorbcijos spektras mėginyje, paruoštame iš MP-1
Galima teigti, kad metodas atitinka specifiškumo parametrą, nes etaloniniame tirpale ir tiriamuosiuose tirpaluose identifikuoto (-)-L-aliino sulaikymo laikai bei UV šviesos absorbcijos spektrai sutampa.
3.1.2 Tiesiškumas
Tiesiškumas yra metodo geba gauti tyrimo rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi analičių koncentracijai tiriamuosiuose mėginiuose. Matavimai kartojami mažiausiai 3 kartus. ICH gairės nurodo, kad turi būti pateikti ne mažiau kaip 5 tirpalo koncentracijų duomenys su nurodytu intervalu [33; 59]. Tiesiškumas buvo įvertintas matuojant skirtingų koncentracijų (±)-L-aliino standarto tirpalus ir sudarant kalibracines kreives. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino kalibraciniai grafikai sudaryti nuo 0,00320 mg/ml iki 0,82 mg/ml. (-)-L-aliino koreliacijos koeficientas (R2) yra 0,999772, (+)-L-aliino koreliacijos koeficientas - 0,999774 (4 lentelė).
4 lentelė. (±)-L-aliino standarto tirpalo tiesiškumo charakteristikos
Analitė Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Tiesiškumo ribos (mg/ml) Sulaikymo laikas (-)-L-aliinas 0,999772 y=2,08*107x - 6,24*104 0,00320 - 0,82 9,039 (+)-L-aliinas 0,999774 y=1,98*107x + 1,01*104 0,00320 - 0,82 9,359
Tiesiškumo kriterijus atitinka reikalavimus, nes abiejų kalibracinių kreivių koreliacijos koeficientai >0,998 [54; 59].
Pakartojamumui įvertinti mėginys buvo injekuojamas penkis kartus tą pačią dieną ir tokiomis pačiomis sąlygomis (16 pav.). Analičių SSN apskaičiuotas smailės plotui ir sulaikymo laikui (5 lentelė). (-)-L-aliino sulaikymo laikas pakartojamumo tyrime kito nuo 9,039 min. iki 9,076 min., o (+)-L-(-)-L-aliino nuo 9,381 min. iki 9,422 min.
16 pav. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino pakartojamumas
5 lentelė. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino santykinis standartinis nuokrypis smailės plotui ir sulaikymo laikui pakartojamumo tyrime
Tiriamasis junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN) (%) Smailės plotui Sulaikymo laikui
(-)-L-aliinas 1,49 0,15
(+)-L-aliinas 0,94 0,16
Atkartojamumas buvo vertinamas esant tokioms pačioms eksperimentinėms sąlygoms dvi dienas iš eilės, injekuojant analitę po 5 kartus (17 pav.). Atkartojamumo parametras taip pat buvo įvertintas pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN). Analičių SSN apskaičiuotas smailės plotui ir sulaikymo laikui (6 lentelė). (-)-L-aliino sulaikymo laikas atkartojamumo tyrime kito nuo 8,960 min. iki 9,076 min., o (+)-L-aliino nuo 9,270 min. iki 9,422 min. Santykinis standartinis nuokrypis smailės
plotui ir sulaikymo laikui didesnis atkartojamumo tyrime, tačiau abiejuose tyrimuose neviršijo 5 proc. ribos.
17 pav. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino atkartojamumas
6 lentelė. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino santykinis standartinis nuokrypis smailės plotui ir sulaikymo laikui atkartojamumo tyrime
Tiriamasis junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN) (%) Smailės plotui Sulaikymo laikui
(-)-L-aliinas 3,66 0,51
(+)-L-aliinas 1,13 0,67
3.1.4 (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba (ang. LoD). ICH gairėse nurodoma, jog tai mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti aptinkamas analizuojamame mėginyje, bet nebūtinai įvertinamas kiekybiškai.
Nustatymo riba (ang. LoQ) - mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai įvertinamas analizuojamame mėginyje. Tai kiekybinės analizės parametras mažoms tiriamojo mėginio koncentracijoms, taip pat dažnai naudojamas priemaišoms ir degradacijos produktams nustatyti [54]. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino aptikimo ir nustatymo ribos pateikiamos 7 lentelėje.
7 lentelė. (-)-L-aliino ir (+)-L-aliino aptikimo ir nustatymo ribos
(-)-L-aliinas (+)-L-aliinas Aptikimo riba (LoD) (μg/ml) 0,285 0,275 Nustatymo riba (LoQ) (μg/ml) 0,95 0,925
3.2.1 Kokybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas maisto papilduose, kurių
sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių
Tiriamuosiuose maisto papilduose kaip pagrindinis BAJ buvo nustatytas (-)-L-aliinas. Šis junginys identifikuotas lyginant jo sulaikymo laikus bei UV šviesos absorbcijos spektrus standartiniame tirpale ir tiriamuosiuose maisto papildų tirpaluose (15 pav.). (-)-L-aliino standartinio tirpalo sulaikymo laikas - 9,039 min. Tiriamuosiuose tirpaluose (-)-L-aliino sulaikymo laikai pateikti 3 lentelėje. Be aliino maisto papilduose taip pat buvo identifikuota: S-alil-L-cisteinas (deoksialiinas - SAC), γ-glutamil-S-alil-L-cisteinas (GLUAICs), γ-glutamil-S-(trans-1-propenil)-L-cisteinas (GLUPeCs), γ-glutamilfenilalaninas (GLUPheAla) bei aktyvinant fermentą alinazę - dialiltiosulfinatas (alicinas) (19, 20 pav.). Šie junginiai identifikuoti pagal chromatografinį profilį [12] ir jų UV šviesos absorbcijos spektrus literatūroje (18 pav.) [29].
18 pav. Alicino UV šviesos absorbcijos spektrai: A) gautas eksperimento metu; B) pateiktas literatūros šaltinyje [29]
B A
19 pav. MP-1 chromatogramos: A) slopinant fermentą alinazę; B) aktyvinant fermentą alinazę
Maisto papildo-1 chromatogramose esančios smailės atitinka šiuos BAJ ir jų sulaikymo laikus: slopinant alinazę - (-)-L-aliinas - 8,981 min., SAC – 12,918 min., GLUAICs – 15,194 min., GLUPeCs – 16,790 min., GLUPheAla - 17,737 min.; aktyvinant alinazę - SAC – 12,900 min., GLUAICs – 15,107 min., GLUPeCs – 16,685 min., GLUPheAla - 17,611 min., alicinas – 21,976 min.
20 pav. MP-2 chromatogramos: A) slopinant fermentą alinazę; B)aktyvinant fermentą alinazę
Maisto papildo-2 chromatogramose esančios smailės atitinka šiuos BAJ ir jų sulaikymo laikus: slopinant alinazę - (-)-L-aliinas - 8,929 min., SAC – 12,987 min., GLUAICs – 15,240 min., GLUPeCs – 16,737 min., GLUPheAla - 17,794 min.; aktyvinant alinazę - SAC – 12,953 min., GLUAICs – 15,220 min., GLUPeCs – 16,710 min., GLUPheAla - 17,756 min., alicinas – 22,070 min.
svogūnų ištraukose
Atlikus valgomųjų česnakų svogūnų (tiek Lietuvoje, tiek Kinijoje užaugintų) ištraukų analizę, nustatyti tokie patys junginiai kaip ir valgomųjų česnakų miltelių maisto papilduose (21, 22 pav.). Ištraukose taip pat identifikuotas (-)-L-aliino diastereoizomeras. Literatūros duomenimis tik (+)-L-aliino diastereoizomeras yra natūrali (+)-L-aliino forma [22]. BAJ šviežios žaliavos ištraukose identifikuoti lyginant standartiniame tirpale ir tiriamosiose ištraukose esančių BAJ sulaikymo laikus bei UV šviesos absorbcijos spektrus. Taip pat buvo lyginami šviežios žaliavos ištraukose bei valgomųjų česnakų miltelių maisto papilduose esančių BAJ UV šviesos absobrcijos spektrai ir sulaikymo laikai.
21 pav. Valgomųjų česnakų svogūnų ištraukų chromatogramos (kilmės šalis Lietuva): A) slopinant fermentą alinazę; B) aktyvinant fermentą alinazę
Gautose chromatogramose esančios smailės atitinka šiuos BAJ ir jų sulaikymo laikus: slopinant alinazę - (-)-L-aliinas – 8,968 min., SAC – 12,963 min., GLUAICs – 15,311 min., GLUPeCs – 16,894 min., GLUPheAla - 17,802 min., alicinas – 22,166 min.; aktyvinant alinazę - SAC – 12,914 min., GLUAICs – 15,368 min., GLUPeCs – 16,821 min., GLUPheAla - 17,836 min., alicinas – 22,114 min.
22 pav. Valgomųjų česnakų svogūnų ištraukų chromatogramos (kilmės šalis Kinija): A) slopinant fermentą alinazę; B) aktyvinant fermentą alinazę
Chromatogramose esančios smailės atitinka šiuos BAJ ir jų sulaikymo laikus: slopinant alinazę - (-)-L-aliinas – 8,931 min., SAC – 12,984 min., GLUAICs – 15,265 min., GLUPeCs – 16,924 min., GLUPheAla - 17,966 min., alicino – 22,210 min.; aktyvinant alinazę - SAC – 12,892 min., GLUAICs – 15,342 min., GLUPeCs – 16,872 min., GLUPheAla - 17,823 min., alicinas – 22,232 min.
Tiek Lietuvoje, tiek Kinijoje užaugintų valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose identifikuoti tokie patys BAJ. Jų sulaikymo laikai labai panašūs. Lyginant su maisto papilduose esančiais valgomųjų česnakų milteliais pastebėta, kad šviežios žaliavos metanolinėse ištraukose alinazė slopinama nepakankamai, todėl chromatogramose identifikuojamas susidaręs alicinas (21 (A), 22 (A) pav.). Skirtingai nei šiose šviežios žaliavos ištraukose, maisto papildų metanolinėse ištraukose alinazė buvo visiškai užslopinta, todėl alicinas nesusidarė (19 (A), 20 (A) pav.).
3.3 Kiekybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas efektyviosios skysčių
chromatografijos (ESC) metodu
Šioje darbo dalyje siekiama ESC metodu kiekybiškai nustatyti BAJ maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, bei palyginti jų kiekį su kiekiu, deklaruojamu ant maisto papildų pakuočių. Taip pat atlikti kiekybinę valgomųjų česnakų svogūnų, augintų skirtingose valstybėse, ištraukų analizę.
Tiriamųjų junginių kiekiui nustatyti, chromatografinė analizė buvo atliekama slopinant ir aktyvinant fermentą alinazę. Slopinant alinazę maisto papilduose buvo nustatytas (-)-L-aliinas (alicinas susidarė tik aktyvinant šį fermentą) (19, 20 pav.). (-)-L-aliino kiekis maisto papilduose aritmetiškai buvo apskaičiuotas pagal kalibracinės kreivės lygtį: y(plotas)= 2,08*107
X-6,24*104. Kitų identifikuotų junginių kiekiai buvo skaičiuojami pagal (-)-L-aliiną. Gauti rezultatai pateikiami diagramose (23 pav.).
23 pav. BAJ kiekiai (mg), nustatyti 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių, esančių maisto papilduose (A - slopinant fermentą alinazę; B – aktyvinant fermentą alinazę)
Slopinant alinazę, maisto papildo-1 milteliuose didžiausias kiekis nustatytas GLUPeCs - 10,479±0,01 mg/g, mažiausias SAC - 3,093±0,008 mg/g. (-)-L-aliino nustatyta 9,154±0,01 mg/g, GLUAICs - 7,800±0,02 mg/g, GLUPheAla - 8,374±0,03 mg/g. Maisto papildo-2 milteliuose didžiausias kiekis nustatytas (-)-L-aliino - 9,505±0,01 mg/g, mažiausias, kaip ir maisto papildo-1 - SAC - 3,088±0,01 mg/g. GLUAICs nustatyta 7,656±0,01 mg/g, GLUPeCs - 5,943±0,02 mg/g, GLUPheAla - 8,714±0,03 mg/g.
Aktyvinant alinazę, maisto papildo-1 milteliuose didžiausias kiekis nustatytas GLUPeCs - 11,073±0,02 mg/g, mažiausias SAC - 2,781±0,01 mg/g. GLUAICs nustatyta 7,656±0,01 mg/g, GLUPheAla - 8,452±0,01 mg/g, alicino - 9,047±0,01 mg/g. Maisto papildo-2 milteliuose didžiausias kiekis nustatytas alicino - 9,486±0,01 mg/g, mažiausias, kaip ir maisto papildo-1 – SAC - 3,031±0,03 mg/g. GLUAICs nustatyta 8,324±0,01 mg/g, GLUPeCs - 8,695±0,01 mg/g, GLUPheAla - 9,457±0,02 mg/g.
Iš gautų rezultatų matoma, kad milteliuose iš abiejų maisto papildų tiek slopinant, tiek aktyvinant fermentą alinazę mažiausias kiekis nustatytas SAC. Maisto papildo-1 milteliuose abiem atvejais didžiausias kiekis nustatytas GLUPeCs, o maisto papildo-2 milteliuose didžiausi kiekiai nustatyti (-)-L-aliino (slopinant alinazę) ir alicino (aktyvinant alinazę). Tyrimo metu taip pat buvo apskaičiuotas bendras BAJ kiekis 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių, esančių maisto papilduose. Gauti rezultatai pateikiami diagramose (24 pav.).
24 pav. Bendras BAJ kiekis (mg), nustatytas 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių, esančių maisto papilduose (A - slopinant fermentą alinazę; B - aktyvinant fermentą alinazę)
Slopinant alinazę, bendras BAJ kiekis 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių iš MP-1 yra 38,900±0,03 mg/g, o iš MP-2 – 34,906±0,04 mg/g. Aktyvinant alinazę, BAJ kiekis milteliuose iš MP-1 yra 39,009±0,03 mg/g, o iš MP-2 – 38,993±0,03 mg/g. Iš pateiktų duomenų bei diagramų matoma, kad didesnis BAJ kiekis 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių, esančių maisto papilduose, nustatytas MP-1 milteliuose (tiek slopinant, tiek aktyvinant fermentą alinazę).
Remiantis gautais rezultatais, tyrimo metu taip pat buvo apskaičiuota, kiek BAJ yra vienoje tabletėje ir kapsulėje tiriamųjų maisto papildų. Gauti rezultatai pateikiami 8 lentelėje.
8 lentelė. Nustatyti BAJ kiekiai valgomųjų česnakų miltelių tabletėse ir kapsulėse
BAJ kiekis 1 tab./kaps. (mg)
Maisto papildas-1 (1-oje tab. yra 210 mg valg. česnakų miltelių)
Slopinant alinazę Aktyvinant alinazę (-)-L-aliinas 1,921±0,02 - SAC 0,649±0,02 0,583±0,02 GLUAICs 1,637±0,04 1,663±0,06 GLUPeCs 2,200±0,03 2,325±0,05 GLUPheAla 1,758±0,06 1,774±0,03 Alicinas - 1,899±0,02 32 33 34 35 36 37 38 39 Maisto papildas-1 Maisto papildas-2 Bendras BAJ kiekis (mg) 1 g miltelių 38,985 38,99 38,995 39 39,005 39,01 Maisto papildas-1 Maisto papildas-2 Bendras BAJ kiekis (mg) 1 g miltelių
A
B
Maisto papildo-1 vienoje tabletėje nustatytas (-)-L-aliino kiekis sudaro 91,48% gamintojo ant preparato pakuotės deklaruojamo kiekio. Deviacijos reikšmė -8,52%. Kadangi maisto papildo-2 gamintojas nedeklaruoja jokio BAJ kiekio vienoje kapsulėje, todėl jo palyginti neįmanoma, tačiau iš pateiktų diagramų (23 pav.) matoma, kad 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių maisto papilde-2 tam tikrų BAJ (pvz., aliino, GLUPheAla slopinant alinazę, SAC, GLUAICs, GLUPheAla, alicino aktyvinant alinazę) yra daugiau lyginant su maisto papildu-1.
3.3.2 Kiekybinis biologiškai aktyvių junginių įvertinimas valgomųjų česnakų
svogūnų ištraukose
Remiantis mokslininko P. Mason teorija, 400 mg valgomųjų česnakų miltelių yra ekvivalentiški 2 g šviežiai česnakų žaliavai [51]. Todėl siekiant išsiaiškinti, kur BAJ yra daugiau - česnakų milteliuose ar šviežiame česnake - buvo atliktas kiekybinis BAJ nustatymas valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose. Gauti rezultatai pateikiami diagramose (25 pav).
25 pav. BAJ kiekiai(mg), nustatyti 1-ame grame valgomųjų česnakų žaliavos (A - slopinant fermentą alinazę; B - aktyvinant fermentą alinazę)
Tiek Lietuvoje, tiek Kinijoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose didžiausias kiekis nustatytas alicino. Slopinant alinazę, Lietuvoje užaugintoje žaliavoje nustatyta 7,696±0,04 mg/g
0 2 4 6 8 10 Lietuvoje užaugintas valgomasis česnkas Kinijoje užaugintas valgomasis česnakas (-)-L-aliinas SAC GLUAICs GLUPeCs GLUPheAla Alicinas 0 2 4 6 8 10 12 Lietuvoje užaugintas valgomasis česnakas Kinijoje užaugintas valgomasis česnakas SAC GLUAICs GLUPeCs GLUPheAla Alicinas
A
B
alicino, o Kinijoje užaugintoje - šiek tiek daugiau - 8,113±0,03 mg/g. Aktyvinant alinazę, alicino nustatytas didesnis kiekis – Lietuvoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose jo buvo nustatyta 11,372±0,03 mg/g, o Kinijoje užaugintuose - 10,731±0,02 mg/g. Remiantis gautais rezultatais galima pastebėti, kad valgomųjų česnakų svogūnų ištraukose alinazė slopinama nepakankamai, todėl iš aliino susidaro alicinas, tačiau ne tokiais dideliais kiekiais, kuomet alinazė yra visiškai aktyvi. Kitų BAJ kiekiai Lietuvoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose (slopinant alinazę) – (-)-L-aliinas - 4,906±0,04 mg/g, SAC - 0,728±0,02 mg/g, GLUAICs - 2,189±0,01 mg/g, GLUPeCs - 0,398±0,05 mg/g, GLUPheAla - 0,767±0,02 mg/g , aktyvinant alinazę – SAC - 0,597±0,03 mg/g, GLUAICs - 2,038±0,02 mg/g, GLUPeCs - 0,296±0,01 mg/g, GLUPheAla - 0,784±0,02 mg/g. Kinijoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose (slopinant alinazę) - (-)-L-aliinas - 3,579±0,02 mg/g, SAC - 0,732±0,04 mg/g, GLUAICs - 1,113±0,03 mg/g, GLUPeCs - 0,247±0,01 mg/g, GLUPheAla - 0,297±0,01 mg/g, aktyvinant alinazę - SAC - 0,686±0,04 mg/g, GLUAICs - 1,054±0,05 mg/g, GLUPeCs - 0,157±0,03 mg/g, GLUPheAla - 0,309±0,02 mg/g.
Iš gautų duomenų nustatyta, kad BAJ kiekiai Lietuvoje ir Kinijoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose skiriasi statistiškai reikšmingai (p<0,05). Slopinant fermentą alinazę, Lietuvoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose nustatyta daugiau (-)-L-aliino, tačiau mažiau alicino lyginant su Kinijoje užaugintais valgomaisiais česnakais. Aktyvinant fermentą alinazę, Lietuvoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose nustatyta daugiau alicino lyginant su Kinijoje užauginta žaliava. Taip pat buvo apskaičiuotas bendras BAJ kiekis 1-ame grame šviežios valgomųjų česnakų žaliavos. Gauti rezultatai pateikiami diagramose (26 pav.).
26 pav. Bendras BAJ kiekis (mg), nustatytas 1 grame šviežios valgomųjų česnakų žaliavos (A - slopinant fermentą alinazę; B - aktyvinant fermentą alinazę)
Slopinant alinazę, bendras BAJ kiekis 1-ame grame šviežios žaliavos, užaugintos Lietuvoje, yra 16,684±0,03 mg/g, o užaugintos Kinijoje - 14,081±0,04 mg/g. Aktyvinant alinazę, BAJ kiekis Lietuvoje užaugintoje žaliavoje yra 15,087±0,04 mg/g, o Kinijoje - 12,937±0,04 mg/g. Remiantis gautais duomenimis buvo nustatyta, kad 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių BAJ yra daugiau
12 13 14 15 16 17 Lietuvoje užaugintas valgomasis česnakas Kinijoje užaugintas valgomasis česnakas Bendras BAJ kiekis 1 g žaliavos 11 12 13 14 15 16 Lietuvoje užaugintas valgomasis česnakas Kinijoje užaugintas valgomasis česnakas Bendras BAJ kiekis 1 g žaliavos
A
B
4. IŠVADOS
1. Pritaikius ESC metodiką maisto papilduose, kurių sudėtyje yra valgomųjų česnakų miltelių, kokybiškai nustatyti biologiškai aktyvūs junginiai: (-)-L-aliinas, alicinas, SAC, GLUAICs, GLUPeCs, GLUPheAla. Slopinant alinazę, abiejuose maisto papilduose mažiausiai nustatyta SAC, daugiausiai GLUPeCs (MP-1) ir (-)-L-aliino (MP-2). Aktyvinant alinazę, abiejuose maisto papilduose mažiausiai nustatyta SAC, daugiausiai GLUPeCs (MP-1) ir alicino (MP-2).
2. ESC metodika validuota atsižvelgiant į šiuos parametrus: specifiškumą, tiesiškumą, rezultatų glaudumą. Apskaičiuotos (-)-L-aliino aptikimo (0,285 μg/ml) ir nustatymo (0,95 μg/ml) ribos. 3. Palyginus BAJ kiekį 1-ame grame valgomųjų česnakų miltelių iš maisto papildų ir 1-ame grame
šviežios žaliavos, didesnis kiekis nustatytas česnakų milteliuose. BAJ kiekiai Lietuvoje ir Kinijoje užaugintuose valgomųjų česnakų svogūnuose statistiškai reikšmingai skiriasi (p<0,05). 4. Maisto papildo-1 valgomųjų česnakų miltelių tabletėje nustatytas (-)-L-aliino kiekis (1,921±0,02
mg) sudarė 91,48% ant preparato pakuotės gamintojo deklaruojamo kiekio, maisto papildo-2 kapsulėse esančių BAJ palyginimas negalimas, nes gamintojas nedeklaravo jų kiekių.
