KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

Augalinio vaistinio preparato kiekybinio stabilumo pagrindimas efektyviosios

skysčių chromatografijos metodu

Magistro diplominis darbas

Darbo vadovai:

prof. dr. Liudas Ivanauskas

doc. dr. Valdas Jakštas

Darbą atliko:

FF V k. studentė Giedrė Kaduševičiūtė

2010

2

TYRINYS

1. ĮVADAS ... 4

2. LITERATŪROS APŽVALGA... 6

2.1. Tikrojo margainio apibūdinimas ... 6

2.1.1. Botaninis apibūdinimas ... 6

2.1.2. Kilmė ir paplitimas ... 6

2.2. Cheminė sudėtis ... 7

2.3. Ekstrakto paruošimas... 8

2.4. Aktyvių komponentų identifikavimas ir nustatymas ... 8

2.4.1. Tapatybės nustatymas ... 8

2.4.2. Kiekybinis nustatymas ... 9

2.5. Farmakokinetika ... 17

2.6. Biologinės savybės ir veikimas ... 17

2.7. Klinikinis taikymas... 23

2.8. Dozavimas ... 25

2.9. Toksiškumas ir šalutiniai poveikiai ... 25

2.10. Kontraindikacijos ir atsargumo priemonės ... 26

3. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS ... 27

3.1. Tyrimo objektas ... 27

3.2. ESC tyrimo metodika ... 27

3.3. Stabilumo tyrimo metodika ... 30

3.4. Duomenų apdorojimas ... 31

4. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 32

4.1. ESC metodo optimizavimas ... 32

4.2. ESC metodo validacija ... 32

4.2.1. Metodikos atrankumas arba specifiškumas (angl. specificity) ... 32

3

4.2.2.1. Pakartojamumas (angl. repeatability) ... 34

4.2.2.2. Tarpinis preciziškumas (angl. intermediate precision) ... 35

4.2.3. Ribos (angl. range) ir tiesiškumas (angl. linearity) ... 36

4.3. Stabilumo tyrimo rezultatai ... 40

5. IŠVADOS ... 50

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 51

PRIEDAI ... 60

SANTRAUKA ... 66

4

1. ĮVADAS

Ženklią pasaulinės vaistų ir maisto papildų rinkos dalį sudaro įvairūs vienkomponenčiai ar daugiakomponenčiai vaistai bei maisto papildai, kurių sudėtyje yra iš augalų išgautos veikliosios medžiagos. Tačiau iki tol, kol augalinis vaistinis preparatas patenka į vaistines, turi būti garantuotas jo efektyvumas ir saugumas, kuriems užtikrinti reikia atlikti daug ir įvairių tyrimų. Pirmiausia reikia atlikti išsamius tyrimus nustatant, kokias medžiagas kaupia augalas, kurie iš tų junginių pasižymi vertingomis terapinėmis savybėmis. Identifikavus tokias medžiagas – sukurti ir validuoti tiek kokybinius, tiek kiekybinius jų nustatymo metodus. Reikia sukurti farmacinę formą – tirpalą, tepalą, tabletes, kapsules ar kitą formą, kuri būtų tinkamiausia pacientų vartojimui. Neužtenka vien tik parinkti preparato sudėtį (veikliųjų ir pagalbinių medžiagų kompoziciją) – reikia patikrinti ar preparatas yra tinkamas vartojimui – ar jis yra stabilus ir saugus, ar laikymo metu sudėtinės medžiagos neskyla, ar nesusidaro pašalinės, galbūt net toksiškos medžiagos. Galiausiai reikia pasirinkti vartojimo tinkamumo terminą. Visa tai nustatoma atliekant sukurto preparato stabilumo tyrimus. Ir būtent čia susiduriama su problema – šių tyrimų metodika taip pat turi būti validuota. Labai dažnai vaistų gamintojas turi pats sukurti ir validuoti stabilumo tyrimams tinkamą kiekybinio nustatymo metodą, kadangi Farmakopėjoje yra pateikiami straipsniai tik veikliosioms medžiagoms.

Taigi stabilumo tyrimo metodikos įteisinimas yra labai svarbus preparato kūrimo etapas, be kurio neįmanomas moksliškai pagrįstas patvirtinimas, kad galutiniam vartotojui skirtas preparatas yra saugus ir efektyvus.

Darbo tikslas:

Pagrįsti augalinio vaistinio preparato kiekybinį stabilumą validuotu ESC metodu.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti mokslinės literatūros šaltinių analizę įvertinant pasirinkto augalinio vaistinio preparato savybes bei aktyvių junginių nustatymo metodikas.

2. Optimizuoti ir validuoti ESC metodiką kiekybiniam augalinio vaistinio preparato Silymarinum – Aconitum 140 mg kietomis kapsulėmis įvertinimui.

3. Validuotu metodu atlikti eksperimentinių augalinio vaistinio preparato serijų stabilumo kiekybinę analizę.

4. Apdoroti ir įvertinti augalinio vaistinio preparato stabilumo duomenis ir gautais rezultatais pagrįsti preparato stabilumą.

5

Darbo naujumas:

Naujas optimizuotas ir validuotas ESC metodas buvo pritaikytas augalinio vaistinio preparato kokybės kontrolei bei stabilumo tyrimams.

Darbo praktinė reikšmė:

Eksperimentinių kapsulių serijų stabilumo tyrimo duomenimis pagrįstas pasirinkto augalinio vaistinio preparato, kurio veiklioji medžiaga standartizuotas sausasis tikrojo margainio ekstraktas, kiekybinės sudėties stabilumas.

6 2 pav. Tikrojo margainio sėklos

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Tikrojo margainio apibūdinimas

Tikrasis margainis (lot. Silybum marianum (L.) Gaertn (sinonimai – cardus marianus, cardo blanco, cardo de burro, chandon marie, holy thistle, lady‘s milk, lady‘s thistle, Mariendistel, Marian thistle, Mary thistle, milk thistle, true thistle, blessed milk-thistle, spotted thistle, variegated thistle) priklauso astrinių (Asteraceae), kitaip graižažiedžių (Compositae), šeimai [34]. Angliškas pavadinimas „milk thistle“ (pieno dagys) arba „St. Mary‘s thistle“ (Šv. Mergelės Marijos dagys) kilęs dėl šiam augalui būdingų smailių lapų su baltom gyslom, kuriomis, pasak legendos, tekėjo Šv. Mergelės Marijos pienas [8].

2.1.1. Botaninis apibūdinimas

Tai vienmetis arba dvimetis žolinis, 60 – 150 cm aukščio augalas (1 pav. [74]). Stiebas status, tvirtas, vagotas, šakotas, plikas arba stiebo viršūninė dalis voratinkliškai plaukuota. Lapai stambūs, plačiai lancetiški ar kiaušiniški, pliki, odiški, palei gyslas išmarginti pailgomis baltomis dėmėmis. Kraštai dantyti, lapų skiaučių ir dantelių viršūnės baigiasi dygliu. Apatiniai lapai stambūs, plunksniškai iškarpyti ar suskaldyti, trumpakočiai; viršutiniai ištisiniai, apimantys stiebą. Žiedai – pavieniai graižai, dideli, iki 6 cm skersmens, sukrauti ūglių viršūnėse. Vainiklapiai rausvi ar purpuriniai, esama ir baltų. Žydi liepos – rugsėjo mėnesiais [73, 5, 55]. Vaisius – atvirkščiai kiaušiniškas lukštavaisis, iš šonų suplotas, viršūnėje su nedideliu, geltonu apvadėliu, stora, geltonos spalvos liemenėlio liekana. Išilgai ir skersai neryškiai raukšlėtas, truputį blizgantis, labai įvairių spalvų (nuo baltos iki rudos su tamsesnėmis išilginėmis juostelėmis), 6 – 7 mm ilgio, iki 3 mm pločio ir apie 1,5 mm storio [27]. Kaip žaliava naudojamos subrendusios sėklos, surinktos iš kultivuojamų augalų rugsėjo mėnesį (2 pav. [10]).

2.1.2. Kilmė ir paplitimas

Augalas natūraliai kilęs iš Viduržemio jūros pakrantės regiono (pietų Europos ir šiaurės Afrikos) ir vakarų Azijos. Pastebėjus jo naudingas medicinines savybes, pradėtas kultivuoti visame 1 pav. Žydintis tikrasis margainis

7 pasaulyje - centrinėje Europoje, Šiaurės ir Pietų Amerikoje, Australijoje. Lietuvoje tikrasis margainis savaime neauga, tačiau yra kultivuojamas kaip medicininis ir dekoratyvinis augalas [69].

2.2. Cheminė sudėtis

Margainio vaisiuose yra 20 – 30 proc. riebalinių aliejų trigliceridų pavidale. Daugiausia aptinkama linoleinės rūgšties (60 proc.), oleininės rūgšties (30 proc.), palmitininės rūgšties (9 proc.). Randama tokoferolio (vit. E) (0,038 proc.), sterolių (0,63 proc.), tokių kaip cholesterolis, kampesterolis, stigmasterolis, sitosterolis, bei apie 25 – 30 proc. baltymų ir nedidelis kiekis gleivių. Farmakologinį poveikį apsprendžia flavonolignanų mišinys (2 – 3 proc.), bendrai vadinamas silimarinu. Pagrindinis ir aktyviausias jo komponentas yra silibininas. Jis sudaro apie 50 proc. silimarino ir yra randamos dvi jo izomerinės formos - silibininas A (3 pav.) ir silibininas B (4 pav.). Taip pat randami nedideli kiekiai izosilibinino A (5 pav.) ir izosilibinino B (6 pav.), silikristino (7 pav.), silidianino (8 pav.). Tikrojo margainio vaisiuose randami nedideli kiekiai kitų flavonoidų ir jų darinių: taksifolino, kvercetino, dihidrokemferolio, apigenino, naringino, eriodiktiolio.

3 pav. Silibininas A

5 pav. Izosilibininas A 6 pav. Izosilibininas B

7 pav. Silikristinas 8 pav. Silidianinas

8

2.3. Ekstrakto paruošimas

Vaistinė žaliava yra subrendusios ir išdžiovintos tikrojo margainio sėklos, iš kurių yra gaminamas ekstraktas. Grupė mokslininkų 2003 – 2005 metais atliko išsamų tyrimą, siekdami nustatyti, kuris ekstrahentas ir kokiomis sąlygomis duoda geriausią išeigą [75, 3, 76]. Ekstrakcijai buvo naudojamas vanduo, metanolis, etanolis, acetonitrilas, acetonas. Išeiga buvo tikrinama esant įvairioms tirpiklių temperatūroms – nuo kambario iki virimo temperatūros.

Buvo nustatyta, kad geriausia išeiga gaunama naudojant 1000C temperatūros vandenį. Pastebėta, kad 850C temperatūros vanduo geriau išekstrahuoja labiau polines medžiagas – taksifoliną ir silikristiną, o verdantis vanduo labiau tinka mažiau polinėms medžiagoms – silibininui A ir silibininui B. Antras pagal efektyvumą tirpiklis – etanolis. 600C temperatūros etanolis geriau nei verdantis vanduo išekstrahuoja silibininą A ir silibininą B, bei izosilibininą A ir izosilibininą B.

Todėl remiantis šių autorių tyrimų duomenimis darome išvadą, kad ekstrahentą geriausia rinktis pagal tai, kokias medžiagas siekiama išekstrahuoti.

2008 metais išleistoje 6 Europos Farmakopėjoje straipsnyje 01/2008: 2071 nurodoma, kad tinkamiausi tirpikliai tikrojo margainio sėklų ekstraktui ruošti yra [18]:

 Etilo acetatas

 Acetonas ar jo mišinys su vandeniu  Etanolis ar jo mišinys su vandeniu

 Metanolis ar jo mišinys su vandeniu

2.4. Aktyvių komponentų identifikavimas ir nustatymas

2.4.1. Tapatybės nustatymas

Gauto ekstrakto tapatybei nustatyti 6 Europos Farmakopėjos straipsnis 01/2008:2071 nurodo naudoti plonasluoksnę chromatografiją:

 Tiriamasis tirpalas: 0,250 g tiriamojo ekstrakto ištirpinama 5 ml metanolio R;

 Lyginamasis tirpalas: 2 mg silibinino R ir 5 mg taksifolino R ištirpinama 10 ml metanolio R;

 Plokštelė: PC silikagelio plokštelė R (5 – 40 µm) arba PC silikagelio plokštelė R (2 – 10 µm);

9  Judri fazė: bevandenė skruzdžių rūgštis R, acetonas R, metileno chloridas R

(8,5:16,5:75 V/V/V);

 Analizės vykdymas: ant „starto linijos“ užlašinama 10 µl (ar 8 µl) tiriamojo tirpalo ir 10 µl (ar 2 µl) lyginamojo tirpalo. Tirpiklio „pakilimo“ kelias – 10 cm (ar 6 cm);  Džiovinimas: 100 – 1050C temperatūroje;

 Nustatymas: plokštelė apipurškiama 10 g/l difenilboro rūgšties aminoetilo esterio R tirpalu metanolyje R ir po to iškart apipurškiama 50 g/l makrogolio 400 R tirpalu metanolyje R. Plokštelei leidžiama išdžiūti ore maždaug 30 minučių. Tuomet ji apšvitinama UV šviesa prie 365 nm bangos ilgio, išmatuojamas tiriamųjų medžiagų nueitas kelias, apskaičiuojamos jų Rf reikšmės. Gauti rezultatai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Chromatografijos rezultatai.

Plokštelės viršus Silibininas: gelsvai žalia fluorescuojanti zona

_____

Taksifolinas: oranžinė fluorescuojanti zona

Gelsvai žalia fluorescuojanti zona (silibininas) _____

Oranžinė florescuojanti zona (taksifolinas)

Gelsvai žalia florescuojanti zona (kiti tikrojo margainio komponentai)

Florescuojanti zona („starto linija“)

Lyginamasis tirpalas Tiriamasis tirpalas

2.4.2. Kiekybinis nustatymas

Literatūroje aprašyti pagrindiniai kiekybinės tikrojo margainio sudėties įvertinimo metodai – spektrofotometrija (SFM), efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) ir kapiliarinė elektroforezė (KE).

Kiekybiniam tikrojo margainio sudėties nustatymui pirmiausia pradėtas naudoti metodas – spektrofotometrija (SFM). Ji aprašoma DAB 1999 monografijoje „Tikrojo margainio vaisiai“ [12].

Mėginio paruošimas ir analizė:

200 mg sausojo tikrojo margainio ekstrakto (70 proc.) ištirpinama 50 ml metanolio R, tirpimui pagerinti naudojama ultragarso vonelė. 1 ml šio tirpalo perkeliamas į 10 ml matavimo

10 kolbutę. Pridedama 2 ml tirpalo, sudaryto iš 1 g difenilhidrazino ir 96 proc. sieros rūgšties tirpalo 100 ml metanolio. Matavimo kolbutė uždaroma ir 50 min. laikoma termostate prie 500C temperatūros. Tirpalas ataušinamas iki kambario temperatūros, praskiedžiamas iki 10 ml žymos su metanoliniu KOH tirpalu ir homogenizuojamas. (Pastaba – tirpalas turėtų būti aušinamas 15 min. kambario temperatūroje, o ne vandens vonelėje ar po vandens srove). Po homogenizavimo praėjus 120 s., 1 ml gauto tirpalo ištirpinamas 20 ml metanolio R ir centrifuguojama esant 3500 aps./min. Gautas skaidrus tirpalas perkeliamas į 50 ml matavimo kolbutę, o nuosėdos pakartotinai ištirpinamos 20 ml metanolio R, 1 min. palaikoma ultragarso vonelėje ir vėl centrifuguojama. Gautas skaidrus tirpalas perkeliamas į tą pačią matavimo kolbutę ir praskiedžiamas metanoliu R iki žymos. Tirpalo absorbcija matuojama prie 490 nm bangos ilgio, kaip lyginamasis tirpalas

naudojamas metanolis. Absorbcijos koeficientas % = 585.

Šis metodas nėra visiškai tikslus, nes neatspindi tikslios kokybinės ir kiekybinės sausojo tikrojo margainio ekstrakto sudėties, o tik bendrą flavanonolių kiekį, esantį ekstrakte. Tobulėjant analizės metodams ir praktikoje ėmus naudoti ESC, buvo sukurta metodika ir tikrojo margainio ekstraktui tirti.

2001 m. grupė mokslininkų, taikydami ESC, pabandė nustatyti kiekybinę 40 proc. ir 60 proc. etanolinės tikrojo margainio tinktūros sudėtį ir įvertinti jos, kaip farmacinės formos tinkamumą [4].

Tyrimo sąlygos:

 Kolonėlė: Lichrosorb RP18 (250 mm x 4 mm I.D., 5 µm);

 Judri fazė: acetonitrilas: vanduo. Pastoviai tirpalo pH palaikyti yra naudojama fosforo rūgšties buferinė sistema (pH 3,0).

 Biologiškai aktyvių junginių tinktūroje nustatymui buvo panaudotas linijinis gradientinis metodas. Eliuentų kitimai pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties kitimo priklausomybė nuo laiko.

Laikas (min.) Vanduo (proc.) Acetonitrilas (proc.)

0,10 88,0 12,0

10,0 82,0 18,0

15,0 82,0 18,0

11

Laikas (min.) Vanduo (proc.) Acetonitrilas (proc.)

35,0 0,0 100,0

42,0 0,0 100,0

50,0 88,0 12,0

 Tekmės greitis: 1,3 ml/min;

 Nustatymas: 280 nm bangos ilgyje panaudojant diodų matricos detektorių.

Rezultatai:

Atlikus tyrimą nustatyta, kad tinktūroje, kurioje etanolio yra 60 proc., flavonolignanų yra daugiau nei 40 proc. tinktūroje. Taip pat jie padarė išvadą, kad tinktūra nėra tinkama kaip tikrojo margainio farmacinė forma, nes remiantis rekomenduojama paros doze (200 – 400 mg) ir medžiagų kiekiu, nustatytu tinktūroje (175 mg/100 ml), jos reikėtų išgerti 100 – 200 ml per dieną, norint pasiekti terapinį poveikį

Iš autorių pateiktos chromatogramos matyti, kad pasirinkta metodika yra nepakankamai efektyvi, nes smailės chromatogramoje nėra pilnai atskirtos (9 pav. [4]).

9 pav. Tinktūros chromatograma: 1m – taksifolinas, 2m – silidianinas, 3m – silikristinas, 4m – silibinino/izosilibinino oksi derivatų izomerai, 5m, 6m – silibinino/izosilibinino 2,3 – dehidro derivatų izomerai, 7m – silibininas, 8m – izosilibininas.

12 2003 m. grupė mokslininkų palygino ESC metodą su kapiliarinės elektroforezės (KE) metodu. Gauti duomenys buvo lyginami tarpusavyje. Autoriai tyrimą atliko remdamiesi 1997 metais išleista Čekijos Farmakopėja (2.2.29) [40].

ESC tyrimo sąlygos:

 Izokratinis metodas;

 Kolonėlė: Purospher RP18 (150 x 4 mm; 5µm);

 Judri fazė: 85 proc. fosforo rūgštis: metanolis: vanduo (0,5:46:64 V/V/V);

 Tekmės greitis: 1 ml/min;

 Nustatymas: spektrofotometru 288 nm bangos ilgyje;  Standartai ir tiriamasis tirpalas ištirpinti judriojoje fazėje.

KE tyrimo sąlygos:

 Hidrodinamiškai sandari sistema;

 Analizė atlikta floruotame metileno – propileno kopolimero (FEP) kapiliare 25 cm (efektyvus ilgis 20 cm) x 320 µm I.D.;

 Elektrolitas: 10 µM EACA + 100 mM amonio hidroksidas + 0,5 proc. PVP + 0,1 proc. HEC;

 Į kapiliarą paduodama pastovi 100 µA srovė;

 Mėginiai paduodami per vožtuvą vidinės kilpos pagalba (200 nl);

 Nustatymas: 254 bangos ilgyje;

 Panaudotas išorinis silibinino standartas: 10, 25, 50, 100 ir 200 µg/ml);  Standartai ir tiriamasis tirpalas ištirpinti 0,01M amonio hidrokside.

Rezultatai:

Atlikus tyrimą buvo padarytos išvados, kad PVP 10 turi didelę įtaką flavonolignanų atsiskyrimui. Be jo izomeriniai junginiai visai neatskiriami. Kuo jo įdedama daugiau, tuo geriau atsiskiria silibininas A ir silibininas B bei silikristinas ir silidianinas. Autoriai taip pat pastebėjo, kad silikristinas nuo silidianino šiuo metodu atsiskiria geriau nei taikant ESC metodą. Tai aiškiai matosi jų pateiktoje chromatogramoje (10 pav. [40]) ir elektroferogramoje (11 pav. [40]). Taip pat remiantis chromatograma galima daryti išvadą, kad jų pasirinkta ESC metodika nėra visiškai tinkama, nes chromatogramos smailės nėra pilnai atskirtos.

13 Nors KE atitinka Farmakopėjos kriterijus, tačiau ESC yra tinkamesnis metodas dėl geresnio silimarino komponentų atskyrimo, nors jį atlikti reikia dvigubai daugiau laiko.

10 pav. ESC chromatograma: SC – silikristinas, SD – silidianinas, SBA – silibininas A, SBB –

silibininas B, ISBA – izosilibininas A, ISBB – izosilibininas B.

11 pav. Elektroferograma: SD – silidianinas, SC – silikristinas, ISBA,B – izosilibininas A ir B, SBA –

14 Kiekybiniam tikrojo margainio standartizuoto ekstrakto įvertinimui 2008 metais išleistos 6 Europos Farmakopėjos straipsnis 01/2008:2071 nurodo naudoti efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC):

 Tiriamasis tirpalas: 60,0 mg tiriamojo ekstrakto ištirpinama metanolyje R ir praskiedžiama iki 100,0 ml tuo pačiu tirpikliu;

 Lyginamasis tirpalas: metanolyje R ištirpinamas standartizuoto tikrojo margainio ekstrakto kiekis, atitinkantis 10,0 mg silibinino ir praskiedžiamas iki 100,0 ml tuo pačiu tirpikliu;

 Kolonėlė: 0,125 m ilgio, 4 mm vidinio skersmens;

 Nejudri fazė: oktadecilsilikagelio sorbentas R (5 µm);  Judri fazė:

 Judri fazė A: fosforo rūgštis R, metanolis R, vanduo R (0,5:35:65 V/V/V);  Judri fazė B: fosforo rūgštis R, metanolis R, vanduo R (0,5:50:50 V/V/V);  Gradientinis eliuentų kitimas pateiktas 3 lentelėje;

3 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties kitimo priklausomybė nuo laiko.

Laikas (min.) Judri fazė A (proc. V/V) Judri fazė B (proc. V/V)

0 – 28 28 – 35 35 – 36 36 - 51 100 → 0 0 0 → 100 100 0 → 100 100 100 → 0 0

 Tekmės greitis: 0,8 ml/min;  Injekcijos tūris: 10 µl;

 Nustatymas: spektrofotometru 288 nm bangos ilgyje;

 Smailių sulaikymo trukmė: silibinino ~ 30 min. Kiti junginiai nustatomi remiantis chromatogramomis, pateikiamomis su tikrojo margainio sausojo ekstrakto standartais.

Bendras silimarino kiekis (proc.), išreikštas kaip silibininas, skaičiuojamas pagal formulę:

(F + F + F + F + F + F ) × m (F + F ) × m

15 Silikristino ir silidianino kiekių suma (%), išreikšta nuo bendro silimarino kiekio, skaičiuojama pagal formulę:

(F + F ) × 100 F + F + F + F + F + F

Silibinino A ir silibinino B kiekių suma (proc.), išreikšta nuo bendro silimarino kiekio, skaičiuojama pagal formulę:

(F + F ) × 100 F + F + F + F + F + F

Izosilibinino A ir izosilibinino B kiekių suma (%), išreikšta nuo bendro silimarino kiekio, skaičiuojama pagal formulę:

(F + F ) × 100 F + F + F + F + F + F

F1 – tiriamojo tirpalo silikristino smailės plotas;

F2 – tiriamojo tirpalo silidianino smailės plotas;

F3 – tiriamojo tirpalo silibinino A smailės plotas;

F4 – tiriamojo tirpalo silibinino B smailės plotas;

F5 – tiriamojo tirpalo izosilibinino A smailės plotas;

F6 – tiriamojo tirpalo izosilibinino B smailės plotas;

F7 – lyginamojo tirpalo silibinino A smailės plotas;

F8 – lyginamojo tirpalo silibinino B smailės plotas;

m1 – lyginamojo tirpalo gamybai paimta silibinino masė g;

m2 – tiriamojo tirpalo gamybai paimta ekstrakto masė g.

Sparčiai tobulėjant analitinei aparatūrai ir naujiems analizės metodams, tokiems kaip ESC, pakeičiant senesnius metodus, tokius kaip spektrofotometrija (SFM), atsirado būtinybė atnaujinti farmakopėjinius straipsnius bei įvairių organizacijų, tokių kaip ESCOP (Europos

16 mokslinis fitoterapijos susivienijimas) ar HMPC (augalinių vaistinių preparatų komitetas) monografijas bei rekomendacijas. Problema ta, kad atsiranda neatitikimų tiek kokybiniame, tiek kiekybiniame nustatyme, tuo pačiu ir nustatant rekomenduojamą preparato paros dozę. Taip yra todėl, kad SFM metodas nėra toks specifiškas ir selektyvus kaip ESC, ir taikant šį metodą yra nustatomos didesnės kiekybinės vertės lyginant su mažesnėmis, bet tikslesnėmis bei patikimesnėmis ESC metodu nustatytomis vertėmis.

Norint išvengti tokių neatitikimų buvo pasiūlyta įvesti pakeitimo faktorių (angl. conversion factor). Jis buvo apskaičiuotas remiantis koreliacija duomenų, gautų analizuojant tuos pačius ekstraktus SFM (pagal Vokietijos Farmakopėją) ir ESC (pagal Europos Farmakopėją).

Taikant SFM metodą apskaičiuojamas bendras flavanonolių kiekis, išreikštas silimarinu, tuo tarpu taikant ESC metodą pirmiausia įvertinamas atskirų tikrojo margainio ekstrakto komponentų (silibinino A ir B, izosilibinino A ir B, silidianino ir silikristino) kiekis, ir tik po to išreiškiama jų suma kaip silibininas. Todėl ESC metodu apskaičiuotos vertės yra mažesnės nei taikant SFM.

Siekiant suvienodinti abiem metodais gautus duomenis, buvo pasiūlyta taikyti pakeitimo faktorių, atitinkantį 1,2. Dėl padidėjusių reikalavimų pradinėms medžiagoms bei tirpikliams, pakeitimo faktorius buvo perskaičiuotas iki 1,25. Tačiau pradėjus taikyti naujus standartizuotus tikrojo margainio ekstraktus ir pabandžius jų analizei pritaikyti naujausio 6 Europos Farmakopėjos straipsnio reikalavimus paaiškėjo, kad neseniai patvirtintą 1,25 pakeitimo faktorių gali tekti įvertinti iš naujo.

Šio darbo ėmėsi 4 licencijuotos Vokietijos laboratorijos – 2 iš jų tos pačios serijos bandinius vertino SFM metodu, kitos 2 – ESC [23]. SFM analizė rėmėsi DAB 1999 monografija „Tikrojo margainio vaisiai“, o ESC – 6 Europos Farmakopėjos straipsniu 01/2008:2071. 1 priedų lentelėje pateikiami ESC metodu gauti duomenys, 2 priedų lentelėje – SFM metodu gauti duomenys, 3 priedų lentelėje – apskaičiuotas pakeitimo faktorius (PF) (jis gautas SFM metodu nustatytą reikšmę padalijus iš ESC metodu nustatytos reikšmės).

Rezultatai ir išvados:

Tarplaboratoriniai tyrimo rezultatai, naudojant ESC, yra pastovūs (koreliacijos koeficientas ~ 2 proc.). Nedideli skirtumai galėjo atsirasti dėl naudojamos skirtingos aparatūros, nors ji pilnai atitiko Europos Farmakopėjos reikalavimus. Tuo tarpu tarplaboratoriniai tyrimo rezultatai, gauti naudojant SFM metodą, ženkliai skiriasi (koreliacijos koeficientas ~ 10 proc.).

17 Tokie dideli skirtumai galėjo atsirasti dėl skirtingo tiriamojo tirpalo atvėsinimo laiko ar naudojamų reagentų kokybės. Dėl šių skirtumų atsiranda sunkumų apskaičiuojant PF – gaunamas ganėtinai didelis jo intervalas: nuo 1,03 iki 1,46.

Remiantis šiuo tyrimu nustatytas 1,25 PF galėtų būti suapvalinamas iki 1,3 – būtent tokią jo reikšmę tyrimo autoriai siūlo naudoti ateityje. Taip pat jų rekomendacija – detalizuoti SFM metodo aprašymą, ypatingą dėmesį teikiant tiriamojo tirpalo ruošimo sąlygoms, ypač – tirpalo atvėsinimo laikui. Tai padėtų suvienodinti gaunamus rezultatus naudojant šį metodą bei sumažintų PF skaičiavimo paklaidą.

2.5. Farmakokinetika

Silimarinas yra netirpus vandenyje, todėl ruošti arbatas yra netikslinga ir neefektyvu. Dėl šios savybės jis yra naudojamas cukrumi dengtų tablečių arba standartizuoto ekstrakto kapsuliuota forma. Kadangi iš virškinamojo trakto absorbuojama tik 23 – 47 proc., todėl geriausia vartoti standartizuotą (70 – 80 proc.) silimarino ekstraktą. Iki 80 proc. silimarino dozės, nesvarbu ar suvartotos p/o ar i/v būdu, yra šalinama su tulžimi kaip sulfatas ir gliukorinoido konjugatas. Nedidelė preparato dalis šalinama per inkstus. Maksimali koncentracija kraujo plazmoje po 600 mg

p/o silimarino dozės yra pasiekiama per 1 – 3 val. Pusinės eliminacijos laikas: laisvo silimarino 1 –

3 val., konjuguoto 3 – 6 val, bendro – 6 – 8 val. [53, 78].

2.6. Biologinės savybės ir veikimas

2.6.1. Pagrindiniai poveikiai 2.6.1.1. Hepatoprotekcinis poveikis

In vivo tyrimai su pelėmis ir žiurkėmis parodė, kad silimarinas ir silibininas pasižymi

apsauginiu poveikiu nuo staigaus kepenų pažeidimo sukelto įvairių toksinių medžiagų, kurios pasižymi skirtingu veikimo mechanizmu. Šios medžiagos – tai chloroformas, galaktozaminas, tioacetaminas, etanolis, paracetamolis, ciklosporinas, fenotiazinas, butirofenonas, eritromicinas, amitriptilinas, nortriptilinas, estradiolis, takrinas (cholinesterazės inhibitorius), talis, faloidinas ir α-amanitinas (pagrindiniai žalsvosios musmirės nuodingi komponentai) [50, 49, 14, 24, 68]. Tiriant chronišką kepenų toksiškumą, sukeltą pakartotino chloroformo, sunkiųjų metalų, tioacetamido ir kai kurių vaistų, tokių kaip azatioprinas ir indometacinas, vartojimo nustatyta, kad silimarino ir silibinino vartojimas apsaugo nuo jų žalojančio poveikio. Keli tyrimai nustatė, kad silimarinas apsaugo nuo kepenų pažeidimo, sukelto kepenų išemijos ir γ-radiacijos.

18 Silimarino poveikis tulžies rūgščių sekrecijai buvo pastebėtas atliekant tyrimus su pelėmis. Intraperitoniniu būdu naudojamas silimarinas 25, 50, 100 ar 150 mg/kg per dieną per 5 dienas sukėlė nuo dozės priklausomą tulžies tekmės ir tulžies rūgščių sekrecijos padidėjimą. Tulžies rūgšties sekrecijos stimuliacija padidino hepatoprotekcinių tulžies rūgščių – β-muricholato ir ursodeoksicholato sekreciją.

Tikslus silimarino veikimo mechanizmas nėra žinomas, tačiau mokslininkai iškėlė kelias teorijas:

 Toksinų blokada:

Silimarinas ir silibininas įsiterpia į hepatocitų ląstelių membranų hidrofobinį – hidrofilinį bisluoksnį, tokiu būdu pakeisdami membranų struktūrą [51, 79]. Be to, in vitro silibininas inhibuoja nuo cAMP priklausomą fosfodiesterazę, kas sukelia cAMP kiekio padidėjimą ir lizosomų membranų stabilizaciją [39]. Abu veiksmai pakeičia ląstelės membranos funkciją, kas gali būti svarbu apsaugant ląstelę nuo toksinų sukeltos žalos. Taip pat, tikrojo margainio komponentai gali prisijungti prie hepatocitų membranų receptorių inhibuodami toksinų prisijungimą prie jų [48].

 Antioksidacinis poveikis:

Nustatyta, kad laisvųjų radikalų (pvz.: aktyviojo deguonies), poveikis turi įtakos kepenų ligų vystymuisi. Taip yra todėl, kad laisvųjų radikalų poveikyje vyksta polinesočiųjų riebiųjų rūgščių, įeinančių į membranų sudėtį, peroksidacija, kuri sukelia grandininę lipidų peroksidacijos reakciją. Šis procesas pažeidžia ląstelės membraną ir sukelia tolesnę ląstelės lipidų ir baltymų oksidaciją. To pasėkoje yra pažeidžiami ląstelės DNR, RNR ir kiti ląstelės komponentai, nes viskas joje susideda iš baltymų [53].

Buvo pastebėtas tiek tiesioginis, tiek netiesioginis laisvųjų radikalų poveikį mažinantis tikrojo margainio flavonolognanų efektas. Silimarinas ir silibininas yra antioksidantai, kurie reaguoja su laisvaisiais radikalais ir paverčia juos į labiau stabilius ir mažiau aktyvius junginius, todėl antioksidacinės savybės turi svarbią įtaką šio augalo hepatoprotekciniam poveikiui, ypatingai, kai kepenų pažeidimai yra susiję su laisvųjų radikalų poveikiu. Panašu, kad silibininas yra atsakingas už silimarino antioksidacinį poveikį, tuo tarpu silikristinas ir silidianinas veikia kaip pro – oksidantai, tačiau jie mažai įtakoja bendrą silimarino antioksidacinį poveikį.

19  Geležį surišantis poveikis:

Didelis geležies kiekis yra žalingas žmogaus organizmui – jis gali sukelti kepenų pažeidimus. Geležies perteklius organizme yra kaupiamas kepenų parenchiminėse ląstelėse. Padidėjęs geležies kiekis kepenų ląstelėse sukelia šių ląstelių lipidų peroksidaciją, kas galiausiai veda prie kepenų fibrozės ir cirozės. Tiek silimarinas, tiek silibininas dėka antioksidacinių savybių pasižymi apsauginiu poveikiu prieš geležies pertekliaus sukeltus kepenų pažeidimus. Turima duomenų, kad tai gali būti susiję su geležies surišimu – sudarant chelatus, tačiau kol kas šią teoriją patvirtinantys duomenys yra kontraversiški ir kad juos patvirtinti, būtini tolimesni tyrimai [52, 46, 7, 54].

2.6.1.2. Gastroprotekcinis poveikis

Tikrojo margainio ekstraktas pasižymi nuo dozės priklausomu priešopiniu aktyvumu, kuris buvo patvirtintas atliekant histologinius tyrimus su pelėmis, kurioms buvo sukelta opaligė naudojant indometaciną [38]. Priešopinis tikrojo margainio poveikis yra susijęs su sumažėjusia skrandžio rūgšties ir padidėjusia gleivių sekrecija, taip pat padidėjusiu prostaglandino E2 ir

sumažėjusiu leukotrienų atsipalaidavimu.

2.6.1.3. Priešuždegiminis poveikis

Priešuždegiminį silimarino poveikį lemia keli mechanizmai: antioksidacinis ir membranas stabilizuojantis poveikis, uždegimo mediatorių, tokių kaip arachidono rūgšties metabolitų, gamybos ar atpalaidavimo inhibicija. Tyrimuose in vivo ir in vitro buvo pastebėtas lipooksigenazės, ciklooksigenazės ir prostaglandinų sintezę inhibuojantis poveikis.

NF-κB yra pagrindinis uždegiminių ir imuninių reakcijų reguliatorius. Atlikus tyrimus su kepenų ląstelėmis paaiškėjo, kad silimarinas slopina NF-κB DNR jungčių aktyvumą ir nuo jo priklausomų genų ekspresiją. Inhibuojantis silimarino poveikis į NF-κB aktyvaciją galėtų būti viena iš jo priešuždegiminių savybių priežasčių [56].

Buvo atliktas tyrimas su pelėmis, siekiant patvirtinti teoriją, kad silimarinas gali moduliuoti uždegiminį imuniteto atsaką [35]. Tyrimo metu 6 pelių grupės 1 kartą per dieną buvo gydytos atitinkamai 0, 10, 50 ir 250 mg/kg silimarino. Tyrimas parodė, kad CD3+ ir CD4+ T-limfocitų kiekis pelėse, gydytose 10 mg/kg silimarino, buvo reikšmingai sumažėjęs, lyginant su kontroline grupe. B-limfocitų blastogenezė reikšmingai padidėjusi buvo 10 ir 50 mg/kg pelių grupėse. Panašiai, TNF-α, IL-1β ir IL-6 mRNR ekspresija didėjo priklausomai nuo dozės. Buvo pastebėta, kad NF-κB aktyvacija, kurią sukelia TNF-α, nebuvo paveikta silimarino. Tokiu būdu

20 buvo pademonstruotas nuo silimarino priklausomas inhibicijos kelias. IL-2 ir IL-4 ekspresija reikšmingai sumažėjo pelėse, gydytose 10 mg/kg silimarino.

Apibendrinus rezultatus galima daryti išvadą, kad mažos silimarino dozės slopina, o didelės – skatina uždegiminius procesus.

2.6.1.4. Nefroprotekcinis poveikis

Siekiant įvertinti tikrojo margainio flavonolignanų poveikį inkstų ląstelėms, buvo atliktas tyrimas su žaliųjų Afrikos beždžionių inkstų ląstelėmis [66]. Jų efektyvumui įvertinti pasirinkti šie parametrai: proliferacijos greitis, DNR baltymų sintezė ir fermento laktato dehidrogenazės aktyvumas (kaip ląstelių metabolinio aktyvumo rodiklis). Silibininas ir silikristinas pademonstravo stiprų stimuliuojantį poveikį šiems parametrams, tuo tarpu izosilibininas ir silidianinas pasirodė esą neaktyvūs.

Laboratoriniai tyrimai su inkstų ląstelėmis, pažeistomis paracetamolio, cisplatinos ar vinkristino, parodė, kad silibinino vartojimas prieš ar po cheminės traumos gali padėti sumažinti arba visai išvengti nefrotoksinio poveikio. Studijos su laboratorinėmis pelėmis, paveiktomis cisplatina, patvirtino, kad silimarino vartojimas prieš ar 2 val. po cisplatinos injekcijos apsaugo nuo jos sukeltos inkstų traumos [37].

2.6.1.5. Putliųjų ląstelių stabilizacija

1975 metais grupės tyrėjų buvo nustatyta, kad silimarinas stabilizuoja putliųjų ląstelių membranas ir tokiu būdu neleidžia iš jų išsiskirti histaminui [42]. Keleriais metais vėliau atlikti išsamesni tyrimai parodė, kad silimarinas inhibuoja nuo neutrofilų priklausomą histamino atsipalaidavimą ir šis poveikis priklauso nuo dozės [20]. Šia kryptimi tyrimai buvo tęsiami, ir prieš kelis metus atlikus tyrimus su sensibilizuotomis jūrų kiaulytėmis pastebėta, kad silimarino panaudojimas žymiai sumažino ankstyvos stadijos bronchospazmą, sukeltą antigeno. Tačiau po antigeno poveikio praėjus 1 val. silimarinas neturėjo jokio poveikio. Todėl remiantis tyrimo rezultatais galima sakyti, kad silimarinas stiprina apsauginį poveikį esant ankstyvajai astmos stadijai [9].

2.6.1.6. Antifibrozinis poveikis

Kepenų fibrozė gali sukelti kepenų struktūros pokyčius, kurie veda prie kepenų nepakankamumo, vartų venos hipertenzijos ir kepenų encefalopatijos. Šie procesai vyksta dėl sąveikos tarp ląstelių ir mediatorių. Iniciacijos fazėje prasideda kepenų parenchiminių ląstelių

21 proliferacija. Žvaigždėtųjų kepenų ląstelių (angl. hepatic stellar cells) virtimas į miofibroblastus yra laikomas pagrindine fibrinogenezės priežastimi. Silimarinas inhibuoja NF-κB ir slopina žvaigždėtųjų ląstelių aktyvaciją. Jis taip pat inhibuoja kinazes, kurios dalyvauja signalų perdavime, o tai gali įtakoti viduląstelinius signalų perdavimus [25].

Dar anksčiau nei buvo padaryti šie atradimai, siekiant įvertinti silimarino antifibrozinį poveikį buvo atlikti tyrimai su pelėmis, kurioms buvo sukelta tulžies latako okliuzija, kuri veda prie kepenų fibrozės. Tyrimo eigoje buvo stebėtas kepenų kolageno akumuliacijos žymenų kiekis (jie parodo fibrozės vystymosi lygį). Bandymo rezultatai parodė, kad pelėse, kurios buvo gydytos silimarinu, šių žymenų kiekis buvo žymiai mažesnis nei kontrolinėje grupėje, o tai reiškia, kad silimarinas skatina antifibrozinį poveikį [6].

2.6.1.7. Priešvėžinis poveikis

Atlikus daug tyrimų su gyvūnų ir žmogaus ląstelių sistemomis, nustatyta, kad silimarinas ir jo komponentai pasižymi priešvėžinėmis savybėmis.

Studijų in vitro metu nustatyta, kad silimarinas pasižymi išskirtinai aukštu vėžio prevenciniu efektu įvairiuose pelių odos vėžio modeliuose. Ištyrus išviršinio naudojimo silimarino savybės beplaukėms pelėms prieš cheminę karcinogenezę ir fotokarcinogenezę, rezultatai parodė, kad silimarinas pasižymi apsauginiu poveikiu. Rezultatus patvirtino statistiškai patikimas vėžinių ląstelių paplitimo, įvairovės ir vėžinių ląstelių kiekio vienoje pelėje sumažėjimas gydytose pelėse. Taip pat, vartojant ant pelių odos, silimarinas apsaugojo nuo vėžio aktyvatorių – 12 – O – tetradekanoilforbolio (TPA) ir okaidinės rūgšties (OA) poveikio [81].

Atlikus tyrimus su įvairiomis žmogaus vėžinių ląstelių kultūromis nustatyta, kad silimarinas turi stiprų priešvėžinį poveikį žmogaus odos, šlapimo pūslės, gaubtinės žarnos, prostatos ir krūtų vėžinėms ląstelėms [80, 60, 1, 67, 83, 84]. Pagrindinis silimarino poveikis pasireiškia per ląstelių ciklo G1 fazės nutraukimą ir ląstelių apoptozę (mirtį). Taip pat nustatyta, kad silimarinas

inhibuoja nuo androgenų priklausomą prostatos vėžinių ląstelių proliferaciją. Šis poveikis pasireiškia dėl silimarino inhibuojančio poveikio į androgeninių receptorių aktyvumą [82]. Visai neseni tyrimai taip pat patvirtino, kad silibininas yra biologiškai aktyvus prieš kepenų vėžio ląsteles. Jis inhibuoja vėžinių ląstelių augimą, vartojant didesnėmis dozėmis ir ilgesnį laiką – sukelia apoptozę [72]. Preliminariais duomenimis, silimarinas taip pat apsaugo peles nuo plaučių vėžio, tačiau dėl poveikio žmogaus ląstelėms dar reikia išsamesnių tyrimų [61].

22

2.6.2. Kiti poveikiai

2.6.2.1. Cholesterolį mažinantis poveikis

Silimarino hipocholesteroleminis poveikis buvo įvertintas keliuose tyrimuose su pelėmis [64, 63, 62]. Pelių, kurios buvo maitintos įprastu laboratoriniu maistu ir papildomai gavusių silimarino, cholesterolio kiekis serume nesikeitė, tačiau buvo pastebėtas nedidelis DTL kiekio padidėjimas. Tuo tarpu pelių, kurios buvo maitintos daug cholesterolio turinčiu maistu ir papildomai gavusių silimarino, MTL serumo kiekis sugrįžo į normos ribas žymiai greičiau nei pelių, kurios gavo tik daug cholesterolio turintį maistą. Parenteriniu būdu įvestas silimarinas neveikė tiek įprastu, tiek daug cholesterolio turinčiu maistu maitintų pelių cholesterolio kiekio serume.

Nors tikslus veikimo mechanizmas nėra aiškus, remiantis tyrimų rezultatais manoma, kad silimarinas, kaip hipocholesteroleminis vaistas, gali veikti dėl cholesterolio absorbcijos iš žarnyno inhibicijos. Manoma, kad šis poveikis yra susijęs su HMG – CoA reduktazės veikimu. Su maistu gaunamas didelis cholesterolio kiekis kaupiasi kepenyse, o tai slopina HMG – CoA reduktazės, kuri inhibuoja cholesterolio sintezę, aktyvumą ir tai sukelia padidėjusią labai mažo tankio lipoproteinų (LMTL) sekreciją. Kadangi silimarinas slopina cholesterolio absorbciją iš žarnyno, HMG – CoA aktyvumas nėra slopinamas ir LMTL sintezė organizme yra slopinama natūraliai.

2.6.2.2. Neuroprotekcinis poveikis

Preliminariais tyrimais buvo įrodytas silimarino neuroprotekcinis poveikis [77]. Atliktuose tyrimuose buvo nustatyta, kad silimarinas gali efektyviai apsaugoti dopaminerginius neuronus nuo lipopolisacharidų sukelto neurotoksiškumo. Poveikis pasireiškia mikroglijos aktyvacijos inhibicija. Mikroglija – tai pastovus į makrofagus panašių ląstelių kiekis smegenyse, kurios atlieka apsauginę ir audinius atstatančią funkciją CNS. Nustatyta, kad mikroglijos aktyvacija ir iš to kylantis uždegiminių ir /ar citotoksinių faktorių, tokių kaip IL – 1, TNF – α, NO atpalaidavimas prisideda prie neurodegeneracinių pokyčių, kurie vyksta vystantis tokiems CNS sutrikimams kaip išsėtinė sklerozė, Parkinsono ar Alzheimerio liga. Atlikti laboratoriniai tyrimai parodė, kad silimarinas efektyviai inhibuoja lipopolisacharido (LPS) sukeltą mikroglijos aktyvaciją ir uždegiminių mediatorių gamybą ir sumažina jų žalą dopaminerginiams neuronams. Manoma, kad inhibuojantis silimarino poveikis į mikroglijos aktyvaciją yra dėl jo inhibuojančio poveikio į NF – κB aktyvaciją.

23

2.6.2.3. Poveikis kepenų CYP fermentams

Dėl silimarino poveikio kepenų fermentams buvo atlikta nemažai tyrimų, tačiau jų rezultatai yra prieštaringi ir vieningos nuomonės šiuo klausimu nėra. Yra įrodymų, kad silimarinas pasižymi nuo dozės priklausoma fermentų CYP3A4, CYP2E1, CYP1A2 ir CYP2D6 inhibicija [71, 28]. Tai gali padidinti vaistų, kurie metabolizuojami šių fermentų, plazmos koncentraciją, sumažinti jų klirensą ir tai gali sukelti apsinuodijimą tais vaistais.

Tačiau kiti tyrimai in vitro nepatvirtino inhibuojančio poveikio į šiuos fermentus [47, 41, 29]. 2003 m. atliktame tyrime su sveikais savanoriais paaiškėjo, kad silimarino vartojimas nedaro jokio aiškaus poveikio indinaviro plazmos koncentracijai, o tai reiškia, kad nėra žymaus poveikio žmogaus CYP3A4 fermentui [16]. Kitame tyrime nustatyta, kad silimarinas vis dėl to sąveikauja su minėtais fermentais, tačiau žymiai didesnėmis nei terapinėmis dozėmis, tad vartojant jį pagal terapines indikacijas jokios įtakos vaistų metabolizmui neturėtų būti [85].

Tad akivaizdu, kad norint įvertinti silimarino poveikį kepenų CYP fermentams reikės atlikti dar daug tyrimų, nes kol kas atlikti tyrimai prieštarauja vieni kitiems.

2.7. Klinikinis taikymas

2.7.1. Dispepsija

Nors tikrasis margainis daugiausiai tirtas ir naudojamas kaip hepatoprotekcinė priemonė, tačiau Europos komisija patvirtino jo naudojimą dispepsiniams sutrikimams, tokiems kaip apetito stoka, blogas virškinimas ir viršutinio virškinamojo trakto diskomfortas, gydyti, ypatingai jeigu jie yra susiję su tulžies pūslės funkciniu sutrikimu [11, 19].

2.7.2. Toksinis kepenų pažeidimas

Europos komisija taip pat patvirtino standartizuotą tikrojo margainio ekstraktą (70-80 proc. silimarino) toksinio kepenų pažeidimo gydymui.

2.7.2.1. Apsinuodijimas grybais (Amanita phalloides – Žalsvoji musmirė)

Nėra jokių kontroliuojamų klinikinių tyrimų, kurie galėtų įvertinti gydymą apsinuodijus Amanita phalloides (Žalsvoji musmirė) grybais. Galima remtis tik individualių atvejų studijomis ir klinikine praktika. Pykinimas, vėmimas, pilvo spazmai ir stiprus viduriavimas pasireiškia praėjus 8 – 12 val. po grybų nurijimo. Išplitusi kepenų nekrozė pasireiškia per 1 – 2 dienas. Negydant dauguma atvejų baigiasi mirtimi.

24 Apibendrinus informaciją iš 2354 apsinuodijimo A. phalloides grybais atvejų [65, 36, 17, 15, 22], nustatyta, kad pavartojus 20 – 50 mg/kg silibinino per dieną i/v per 48 val. nuo grybų nurijimo galima apsisaugoti nuo kepenų pažeidimo. Be to, nustatytas žymiai mažesnis mirtingumas ar liekamieji neigiami padariniai paciento organizmui, jei buvo laiku panaudotas silimarinas.

2.7.2.2. Aplinkos toksinai ir vaistai (jatrogeninis kepenų pažeidimas)

Kai kurie gydymui reikalingi vaistai sukelia nepageidaujamą šalutinį poveikį – kepenų pažeidimą. Atlikus keletą klinikinių tyrimų nustatyta, kad kartu su potencialiai hepatotoksišku vaistu vartojant silimariną galima išvengti ar sumažinti jo nepageidaujamą poveikį.

Alzheimerio gydymui vartojamas takrinas daugeliui pacientų sukelia tiek kepenų pažeidimą, tiek virškinamojo trakto sutrikimus. Atlikus dvigubai aklą, placebo kontroliuojamą tyrimą nustatyta, kad kartu su takrinu vartojant silimariną šie šalutiniai reiškiniai buvo žymiai retesni.

Taip pat silimarinas yra rekomenduojamas vartoti kartu su rifampicinu, izoniazidu, butirofenonu, fenotiazinais, ypač jeigu šie vaistai turi būti vartojami ilgą laiką [2, 45].

2.7.2.3. Alkoholio sukeltas kepenų pažeidimas

Ilgalaikis alkoholio vartojimas gali sukelti daugybę klinikinių sindromų ir patologinių pokyčių – nuo kepenų suriebėjimo ar fibrozės iki kepenų cirozės. Vienintelis pripažintas šios būklės gydymas yra susilaikymas nuo tolimesnio alkoholio vartojimo ir papildomų gydomųjų priemonių vartojimas.

Atlikus klinikinius tyrimus su pacientais, kurių kepenys yra pažeistos alkoholio [57, 21, 58, 13], nustatyta, kad ilgalaikis (3 – 6 mėn.) silimarino vartojimas ne tik žymiai pagerino kepenų funkciją, bet ir teigiamai veikė kepenų audinį. Serumo transaminazių (ALT, AST, γ -GT) lygis ir bendro bilirubino kiekis normalizavosi žymiai greičiau nei placebo grupėje. Atlikus kepenų biopsiją, teigiami histologiniai pokyčiai silimarinu gydytoje grupėje buvo žymiai dažnesni nei placebo grupėje. Taip pat pagerėjo ne tik pacientų fizinė sveikata, bet ir gyvenimo kokybė.

2.7.3. Papildoma virusinio hepatito gydymo priemonė

Esant virusinei infekcijai vyksta kaskada reiškinių, kurių pasekmė – toksiniai ir uždegiminiai kepenų ląstelių pokyčiai. Nors silimarinas neveikia virusų dauginimosi, jis gali turėti svarbios reikšmės virusinio hepatito gydymui dėl savo priešuždegiminių ir citotoksinį poveikį mažinančių savybių. Be to, silimarinas skatina ląstelių regeneraciją ir normalizuoja kepenų

25 fermentų kiekį bei veiklą. Atliekant klinikinius tyrimus su pacientais, sergančiais hepatitu, nustatyta, kad lyginant su placebo grupe, silimarino grupėje kepenų veiklos rodikliai, tokie kaip AST, į normos ribas grįžo žymiai greičiau [44, 26, 43, 59]. Be to, pagerėjo pacientų gyvenimo kokybė.

2.7.4. Cukrinis diabetas

Silimarinas taip pat buvo tirtas su pacientais, sergančiais II tipo cukriniu diabetu, siekiant įvertinti jo poveikį gliukozės kiekio organizme kontrolei. Kelių klinikinių tyrimų rezultatai [70, 30, 31] parodė, kad silimarinas turi keleriopą teigiamą poveikį: jis sumažina lipoperoksidaciją, gliukozuriją, rezistentiškumą insulinui, taip pat žymiai sumažina injekcinio (egzogeninio) insulino poreikį. Visa tai rodo pagerėjusią gliukozės kontrolę. Be to, kaip papildomas efektas, buvo pastebėtas kūno masės indekso sumažėjimas.

2.7.5. Hipercholesterolemija

Laboratorinių tyrimų metu buvo patvirtintas tikrojo margainio hipocholesteroleminis poveikis. Nors konkrečiai šiai indikacijai patvirtinti klinikinių tyrimų buvo atlikta vos keli, tačiau yra pakankamai daug informacijos iš kitų klinikinių tyrimų, kurių metu buvo pastebėtas gretutinis teigiamas poveikis cholesterolio kiekio organizme kontrolei. Pastebėta, kad vartojant silimariną sumažėja bendras cholesterolio ir MTL kiekis, o DTL kiekis nežymiai padidėja. Nors šis poveikis nėra labai stiprus, ir neprilygsta hipocholesteroleminių vaistų sukeliamam efektui, tačiau esant pradinei hipercholesterolemijai, derinant dietą ir silimarino vartojimą galima gana efektyviai reguliuoti cholesterolio apykaitą organizme.

2.8. Dozavimas

Esant lengvo ar vidutinio sunkumo kepenų ligai rekomenduojama standartizuoto (70 proc. silibinino) tikrojo margainio ekstrakto paros dozė – 105 – 210 mg. Dozė turi būti išgeriama per 3 kartus. Sunkiais atvejais dozuotę galima padvigubinti. Vaikams šio augalo preparatus galima skirti nuo 5 metų amžiaus: paros dozė – 5 mg/kg. Ji geriama per 2 – 3 kartus.

Apsinuodijimo A. phalloides grybais atveju – 20 – 50 mg/kg silibinino per dieną i/v per 48 val. nuo grybų nurijimo.

2.9. Toksiškumas ir šalutiniai poveikiai

Silimarino preparatų toksiškumas yra labai mažas. Toksiškumo tyrimai su pelėmis ir žiurkėmis parodė, kad silimarinas, netgi kasdieninėmis dozėmis, siekiančiomis 2500 – 5000 mg/kg,

26 nesukelia jokio matomo toksiškumo. Klinikinių tyrimų metu taip pat nepastebėtas jo toksinis poveikis.

Vartojant 240 – 900 mg silimarino per dieną nepastebėta jokių šalutinių poveikių. Dozėmis, didesnėmis kaip 1500 mg silimarino per dieną, gali atsirasti vidurius laisvinantis poveikis, kuris greičiausiai atsiranda dėl padidėjusios tulžies sekrecijos ir tekmės. Taip pat galimos lengvos alerginės reakcijos, tačiau jos nesukelia būtinybės nutraukti gydymą. Apžvelgus klinikinius tyrimus, kuriuose dalyvavo daugiau kaip 7000 tiriamųjų, buvo nustatyti tik 3 rimtų šalutinių poveikių atvejai – 2 anafilaksijos ir 1 gastroenterito simptomų atvejis. Apskritai, šalutinių poveikių dažnumas buvo toks pats kaip ir placebo grupėje, ir varijavo nuo 2 proc. iki 10 proc. kontroliuojamuose tyrimuose.

2.10. Kontraindikacijos ir atsargumo priemonės

Šio augalo preparatai yra kontraindikuotini žmonėms, kurie yra alergiški Asteraceae (graižažiedžių arba kitaip astrinių) šeimos augalams. Taip pat tikrojo margainio preparatus reikėtų vartoti atsargiai tiek nėštumo, tiek laktacijos metu, nes nėra pakankamai patikimos informacijos apie jo poveikį šiais ypatingais periodais.

27

3. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS

3.1. Tyrimo objektas

Eksperimentinės augalinio vaistinio preparato Silymarinum – Aconitum 140 mg kietos kapsulės, kurių pagrindinė veiklioji medžiaga yra silimarinas, (Aconitum, Lietuva) ir standartizuotas (80 proc.) sausasis tikrojo margainio ekstraktas, serijos Nr. B51/10/A7 (Naturex, Prancūzija).

Tyrimui buvo pasirinktos trys šio eksperimentinio augalinio vaistinio preparato kapsulių serijos: EP0404, EP0405 ir EP0406.

Eksperimentinių kapsulių turinio sudėtis:

Silimarinas 140,00 mg

Bevandenio kalcio hidrogenofosfatas 130,00 mg

Natrio karboksimetilkrakmolas 18,00 mg

Talkas 12,00 mg

Magnio stearatas 5,00 mg

Silicio dioksidas 3,00 mg

3.2. ESC tyrimo metodika

Cheminės medžiagos.

Metanolis R (Sigma – Aldrich, Vokietija) ir 85 proc. fosfato rūgštis R (Merck, Vokietija). Išgrynintas vanduo ruošiamas vandens paruošimo sistema Millipore (ser. Nr. F9KM82365E) (Prancūzija).

Įranga.

Analizei naudojama chromatografinė sistema Waters 2690 (Waters, Milford, JAV), su diodų matricos detektoriumi Waters 996. Atskyrimui naudojama nerūdijančio plieno kolonėlė su atvirkščios fazės oktadecilsilikageliniu sorbentu R SunFire C18, 150 mm ilgio ir 3,0 mm vidinio skersmens, 3,5 µm porų dydžio ir prieškolonėle SunFire C18, 20 mm ilgio ir 3,0 mm vidinio skersmens, 3,5 µm porų dydžio.

28

Analizė.

Pasirinkto chromatografinio metodo judri fazė sudaryta iš tirpiklio A (metanolio R) ir tirpiklio B (0,5 proc. fosfato rūgšties vandeninio tirpalo R, kuris gaunamas skiedžiant 85 proc. fosfato rūgšties tirpalą išgrynintu vandeniu). Eliucijos gradientas pateikiamas 4 lentelėje.

4 lentelė. Eliuentų kiekybinės sudėties kitimo priklausomybė nuo laiko.

Laikas, min. Eliuentas A, proc. Eliuentas B, proc.

0 35 65 25,0 50 50 30,0 50 50 40,0 47 53 45,0 35 65 50,0 35 65

Eliuentų tekmės greitis – 0,3 ml/min., injekcijos tūris – 10 µl., kolonėlės temperatūra – 300C. Junginių detekcija atliekama prie 288 nm bangos ilgio. Biologiškai aktyvios medžiagos nustatomos pagal jų sulaikymo laiką, lyginant jį su etalonų sulaikymo laiku: silikristino – apie 19 min., silidianino – apie 22 min., silibinino A – apie 32 min., silibinino B – apie 34 min., izosilibinino A – apie 40 min., izosilibinino B – apie 42 min.

Etaloninio tirpalo ruošimas:

Standartizuotas sausojo tikrojo margainio ekstrakto kiekis, atitinkantis 10 mg silibinino (A ir B izomerai), ištirpinamas ir praskiedžiamas metanoliu R iki 100,0 ml. Gaunamas 0,1 mg/ml koncentracijos etaloninis tirpalas, kuris pieš suleidžiant į chromatografinę kolonėlę yra filtruojamas pro 0,22 µm porų dydžio PVDF filtrą (Restek, Kinija).

Tiriamojo pradinės medžiagos tirpalo ruošimas:

60,0 mg tiriamųjų tikrojo margainio miltelių ištirpinama metanolyje R ir praskiedžiama tuo pačiu tirpikliu iki 100,0 ml. Gaunamas 0,6 mg/ml koncentracijos tirpalas, kuris prieš suleidžiant į chromatografinę kolonėlę yra filtruojamas pro 0,22 µm porų dydžio PVDF filtrą (Restek, Kinija).

29

Tiriamojo vaistinio preparato tirpalo ruošimas:

Atsveriama apie 30 mg kapsulių turinio miltelių (atitinka 10 mg silimarino), ištirpinama apie 70 ml metanolio chromatografijai R2 naudojant ultragarso vonelę (Biosonic UC 100, Coltene/Whaledent, JAV) 15 min. ir praskiedžiama tuo pačiu tirpikliu iki 100,0 ml. Gaunamas apie 0,1 mg/ml koncentracijos tirpalas, kuris prieš suleidžiant į chromatografinę kolonėlę yra filtruojamas pro 0,22 µm porų dydžio PVDF filtrą (Restek, Kinija).

Kiekybinis nustatymas:

Kiekybinė tiriamųjų kapsulių turinio miltelių sudėtis nustatoma remiantis chromatografinių smailių plotais.

Bendras silimarino kiekis (proc.), išreikštas kaip silibininas, skaičiuojamas pagal formulę:

X =( )

( . . ) ×

.

. × × C ., proc.

Silikristino ir silidianino kiekių suma (proc.), išreikšta nuo bendro silimarino kiekio, skaičiuojama pagal formulę:

( )

× 100, proc.

Silibinino A ir silibinino B kiekių suma (proc.), išreikšta nuo bendro silimarino kiekio, skaičiuojama pagal formulę:

( )

× 100, proc.

Izosilibinino A ir izosilibinino B kiekių suma (proc.), išreikšta nuo bendro silimarino kiekio, skaičiuojama pagal formulę:

( )

× 100, proc.

Bendras silimarino kiekis kapsulėje (mg/kaps.) skaičiuojamas pagal formulę:

= × , mg/kaps.

30 A2 – tiriamojo tirpalo silidianino smailės plotas, µVxs;

A3 – tiriamojo tirpalo silibinino A smailės plotas, µVxs;

A4 – tiriamojo tirpalo silibinino B smailės plotas, µVxs;

A5 – tiriamojo tirpalo izosilibinino A smailės plotas, µVxs;

A6 – tiriamojo tirpalo izosilibinino B smailės plotas, µVxs;

Aet. A – etaloninio tirpalo silibinino A smailės plotas, µVxs;

Aet. B – etaloninio tirpalo silibinino B smailės plotas, µVxs;

met. – etaloninio tirpalo gamybai pasvertas tikrojo margainio ekstrakto kiekis, g;

mx – tiriamojo tirpalo gamybai pasvertas tiriamųjų miltelių kiekis, g;

mk – vidutinė tiriamųjų kapsulių turinio masė, mg;

Vet. – etaloninio tirpalo praskiedimas, ml;

Vx – tiriamojo tirpalo praskiedimas, ml;

Cet. – silibinino grynumas etaloninėje medžiagoje, proc.

3.3. Stabilumo tyrimo metodika

Bandinių laikymo trukmė:

Ilgalaikiai stabilumo tyrimai turi būti atliekami mažiausiai 12 mėn. Pirmus tyrimo metus bandinių analizę rekomenduojama atlikti kas 3 mėn., įskaitant pradinius tyrimus t.y. 0 mėn., 3 mėn., 6 mėn., 9 mėn. ir 12 mėn. Antrais tyrimo metais analizę kartoti užtenka kas 6 mėn., t.y. 18 mėn. ir 24 mėn.

Šio tyrimo metu, bendro silimarino kiekio eksperimentinėse kapsulėse nustatymas, siekiant įvertinti preparato stabilumą, buvo atliekamas šiais laiko intervalais: po 3 mėn., po 6 mėn., po 9 mėn., po 12 mėn., po 18 mėn. ir po 24 mėn.

Bandinių laikymo sąlygos:

Kiekvienai pasirinktai eksperimentinių kapsulių serijai pirmiausia yra nustatomas pradinis bendras silimarino kiekis kapsulėje mg. Tuomet kiekviena kapsulių serija yra padalinama į

31 dvi dalis – kiekviena jų bus laikoma termostate prie skirtingos temperatūros bei drėgmės. Viena dalis kapsulių yra laikoma esant 250C ± 20C temperatūrai ir 60 proc. ± 5 proc. santykinei drėgmei, kita – esant 300C ± 20C temperatūrai ir 65 proc. ± 5 proc. santykinei drėgmei.

3.4. Duomenų apdorojimas

Duomenys rinkti ir analizuoti personalinio kompiuterio programinės įrangos Empower 2 Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) bei Microsoft Office Excel 2007 pagalba. Statistiniai įverčiai pasirinkti atsižvelgiant į mokslinių gairių reikalavimus.

32

4. EKSPERIMENTINĖ DALIS

4.1. ESC metodo optimizavimas

Eksperimentinių augalinio vaistinio preparato kapsulių stabilumui įvertinti pasirinktas tyrimo metodas – efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), aprašyta 6 Europos Farmakopėjoje, straipsnyje 01/2008:2071, skirtu standartizuoto sausojo tikrojo margainio ekstrakto tyrimui. Jis buvo optimizuotas gatavos produkcijos – kapsulių – stabilumo tyrimui ir pritaikytas turimai laboratorinei įrangai.

Parinkta chromatografinė kolonėlė ir atitinkamai pagal slėgį parinktas tinkamiausias judriosios fazės tekmės greitis, kad tiriamieji junginiai atsiskirtų geriausiai. Optimizuotas judriosios fazės gradientas, atsižvelgiant į naudotos kolonėles savybes.

Optimizuotos metodikos tinkamumo pagrindimui buvo pasirinkti šie esminiai validacijos parametrai: atrankumas, glaudumas ir tiesiškumas ir ribos [33].

4.2. ESC metodo validacija

Validacijos metu atlikti bandymai šioms analizės metodo charakteristikoms nustatyti:

 Metodikos atrankumas arba specifiškumas (angl. specificity)

 Rezultatų glaudumas (angl. precision)

o Rezultatų pakartojamumas (angl. repeatability)

o Rezultatų tarpinis preciziškumas (angl. intermediate precision)  Ribos (angl. range) ir tiesiškumas (angl. linearity)

4.2.1. Metodikos atrankumas arba specifiškumas (angl. specificity)

Metodikos atrankumas arba specifiškumas yra gebėjimas vienareikšmiškai įvertinti analitės buvimą. Metodo atrankumas parodo, kad kiekviena smailė chromatogramoje atitinka po vieną analitę. Tuo tikslu kiekvienai smailei registruojami UV absorbcijos spektrai penkiose smailės vietose. Esant vienam junginiui, spektrai sutampa, esant mišiniui – skirtingose smailės vietose užregistruoti spektrai skiriasi.

Esant daugiakomponenčiui mišiniui pateikiama standartinio palyginamojo tirpalo (CRS) mėginio chromatograma, tiriamojo mėginio chromatograma, ,,tuščio” mėginio (injektuojamas

33 atitinkamas kiekis tirpiklio) chromatograma bei pagalbinių medžiagų chromatograma. Tokiu būdu yra įsitikinama ar kiekvieno junginio smailė sutampa ir ar nustatymui netrukdo tirpiklis bei pagalbinės medžiagos. Chromatogramos pateiktos 12 pav.

12 pav. Standartinio palyginamojo tirpalo (CRS), tiriamojo mėginio, tirpiklio ir pagalbinių medžiagų chromatogramos.

Iš pateiktų chromatogramų matyti, kad tiek standartinio palyginamojo tirpalo CRS, tiek tiriamojo mėginio komponentų chromatografinės smailės pagal sulaikymo laiką sutampa, jos yra tolygios, pašalines medžiagas identifikuojančių smailių nėra. Taip pat matyti, kad tiek mėginių paruošimui naudojamas tirpiklis, tiek eksperimentinių kapsulių gamybai pasirinktos pagalbinės medžiagos tiriamame spektre nesukelia atsako, todėl jos neturi įtakos analizuojamų veikliųjų medžiagų nustatymui. Visa tai patvirtina pasirinkto metodo specifiškumą.

34

4.2.2. Rezultatų glaudumas arba preciziškumas (angl. precision)

Metodikos rezultatų glaudumas nustatomas atlikus matavimų seriją naudojant tą patį tiriamą mėginį. Vertinant glaudumą analitinės procedūros paprastai išreiškiamos dispersija, standartiniu nuokrypiu arba variacijos koeficientu iš eilės matavimų. Metodikos glaudumas įvertinamas pakartojamumu ir tarpiniu preciziškumu.

Pagal dominančių smailių sulaikymo laikų, smailių plotų vidurkius ir standartinį nuokrypį skaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis SSN proc. (standartinio nuokrypio ir vidurkio reikšmės santykis), kitaip variacijos koeficientas (angl. RSD proc. arba CV proc.). Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris nėra tiksliai apibrėžtas, tačiau kiekybiniam metodui neturėtų viršyti 5 proc.

4.2.2.1. Pakartojamumas (angl. repeatability)

Pakartojamumas išreiškia tikslumą tomis pačiomis veikimo sąlygomis per trumpą laiko tarpą. Jis skaičiuojamas iš tą pačią dieną viena po kitos atliktų analizių rezultatų. Gali būti skaičiuojama iš mažiausiai šešių analizės pakartojimų naudojant 100 proc. tiriamąjį tirpalą arba iš devynių analizės pakartojimų – panaudojant trijų pakartotinių injekcijų trijų skirtingų koncentracijų duomenis.

Tyrimo metu pakartojamumas sulaikymo laikui ir smailės plotui buvo apskaičiuotas iš septynių analizės pakartojimų tą pačią dieną naudojant 100 proc. tiriamąjį tirpalą. Gauti rezultatai pateikiami 5 lentelėje.

5 lentelė. Tiriamųjų tirpalų komponentų pakartojamumo SSN proc. sulaikymo laikui ir smailės plotui.

Junginys

Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc.

Sulaikymo laikui Smailės plotui

Silikristinas 0,3 0,6

Silidianinas 0,2 2,0

35

Junginys

Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc.

Sulaikymo laikui Smailės plotui

Silibininas B 0,1 0,6

Izosilibininas A 0,1 0,5

Izosilibininas B 0,1 1,1

Pakartojamumo SSN proc. sulaikymo laikui daugumos komponentų buvo 0,1 proc., nežymiai išsiskyrė tik silikristinas ir silidianinas. Pakartojamumo SSN proc. smailės plotui svyravimai buvo taip pat nedideli, daugumos komponentų jis buvo 0,6 proc., ryškiau išsiskyrė silidianinas ir izosilibininas B, kurių SSN proc. buvo atitinkamai 2,0 proc. ir 1,1 proc.

Apibendrinat rezultatus reikia pažymėti, kad visų tiriamųjų tirpalų komponentų SSN proc. tiek sulaikymo laikui, tiek smailės plotui neviršija rekomenduojamų 5 proc., taigi rezultatų pakartojamumas atitinka keliamus reikalavimus ir remiantis šiuo kriteriju, metodas yra tinkamas kiekybiniam tirpalų tyrimui.

4.2.2.2. Tarpinis preciziškumas (angl. intermediate precision)

Tarpinis preciziškumas skaičiuojamas: iš diena po dienos – kelias dienas (nebūtinai iš eilės) atliktų to paties bandinio analizių. Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris nėra tiksliai apibrėžtas, tačiau kiekybiniam metodui neturėtų viršyti 10 proc.

Tarpiniam preciziškumui sulaikymo laikui ir smailės plotui įvertinti buvo atlikta 18 vieno ir to paties mėginio injekcijų: per 3 skirtingas dienas atlikta po 6 pakartotines injekcijas. Gauti rezultatai pateikiami 6 lentelėje.

6 lentelė. Tiriamųjų tirpalų komponentų tarpinio preciziškumo SSN proc. sulaikymo laikui ir smailės plotui.

Junginys

Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc.

Sulaikymo laikui Smailės plotui

36

Junginys

Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), proc.

Sulaikymo laikui Smailės plotui

Silidianinas 0,3 3,5

Silibininas A 0,3 0,7

Silibininas B 0,3 0,9

Izosilibininas A 0,3 1,0

Izosilibininas B 0,3 0,9

Tarpinio preciziškumo SSN proc. sulaikymo laikui visų komponentų buvo vienodas – 0,3 proc. Daugumos komponentų tarpinio preciziškumo SSN proc. smailės plotui buvo artimas 1,0 proc. Didžiausia variacija būdinga silidianinui – net 3,5 proc., mažiausia – silibininui A – 0,7 proc.

Apibendrinant rezultatus reikia pažymėti, kad visų tiriamųjų tirpalų komponentų SSN proc. tiek sulaikymo laikui, tiek smailės plotui neviršija rekomenduojamų 10 proc., taigi tarpinis preciziškumas atitinka keliamus reikalavimus ir remiantis šiuo kriteriju, metodas yra tinkamas kiekybiniam tirpalų tyrimui.

4.2.3. Ribos (angl. range) ir tiesiškumas (angl. linearity)

Tiesiškumas – tai gebėjimas (nustatytose ribose) gauti detektoriaus atsako įverčius chromatogramose, kurie tiesiogiai proporcingi analitės kiekinei koncentracijai mėginyje. Ribos vaistiniam preparatui, kurias turi pagrįsti tiesiškumas, yra nuo 80 proc. iki 120 proc. Įvertinama kalibravimo kreivės metodu. Kartu nustatomas ir koreliacijos koeficientas (R2), kuris turi būti ne mažesnis kaip 0,98.

Tiesiškumui ir riboms įvertinti buvo analizuoti eksperimentiniai tirpalai, kuriuose ištirpintas kapsulės kiekis sudarė: 80 proc., 90 proc., 100 proc., 110 proc. ir 120 proc. Pagal juos buvo sudaryti kalibraciniai grafikai silikristinui, silidianinui, silibininui A, silibininui B, izosilibininui A ir izosilibininui B. Gauti rezultatai pateikiami 13 – 18 pav.

37 13 pav. Kalibracinis grafikas silikristinui.

Iš gauto silikristino kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 vertė yra artima 1, kas rodo stiprią tiesinę priklausomybę.

14 pav. Kalibracinis grafikas silidianinui.

Iš gauto silidianino kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 vertė yra artima 1, kas rodo stiprią tiesinę priklausomybę.

y = 21288x - 89069 R² = 0,988 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 70 80 90 100 110 120 130 C h r o m ato gr am o s sm ai lė s p lo tas , µ V x s

Eksperimentinio tirpalo koncentracija, proc.

y = 4550,x - 14792 R² = 0,981 0 100000 200000 300000 400000 500000 70 80 90 100 110 120 130 C h r o m ato gr am o s sm ai lė s p lo tas , µ V x s

38 15 pav. Kalibracinis grafikas silibininui A.

Iš gauto silibinino A kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 vertė yra artima 1, kas rodo stiprią tiesinę priklausomybę.

16 pav. Kalibracinis grafikas silibininui B.

Iš gauto silibinino B kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 vertė yra artima 1, kas rodo stiprią tiesinę priklausomybę.

y = 20884x - 79988 R² = 0,988 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 70 80 90 100 110 120 130 C h r o m ato gr am o s sm ai lė s p lo tas , µ V x s

Eksperimentinio tirpalo koncentracija, proc.

y = 31373x - 76316 R² = 0,983 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 70 80 90 100 110 120 130 C h r o m ato gr am o s sm ai lė s p lo tas , µ V x s

39 17 pav. Kalibracinis grafikas izosilibininui A.

Iš gauto izosilibinino A kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 vertė yra artima 1, kas rodo stiprią tiesinę priklausomybę.

18 pav. Kalibracinis grafikas izosilibininui B.

Iš gauto izosilibinino B kalibracinio grafiko matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška analizuotame koncentracijų intervale. Koreliacijos koeficiento R2 vertė yra artima 1, kas rodo stiprią tiesinę priklausomybę.

Apibendrinus tiesiškumo rezultatus matyti, kad smailės ploto priklausomybė nuo koncentracijos yra tiesiška visiems junginiams analizuotame koncentracijų intervale. Visų komponentų koreliacijos koeficientų R2 vertės yra artimos 1. Taigi tiesiškumas atitinka keliamus reikalavimus ir remiantis šiuo kriteriju, metodas yra tinkamas kiekybiniam tirpalų tyrimui.

y = 6935,x + 16938 R² = 0,987 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 70 80 90 100 110 120 130 C h r o m ato gr am o s sm ai lė s p lo tas , µ V x s

Eksperimentinio tirpalo koncentracija, proc.

y = 1635,x + 7786, R² = 0,988 0 50000 100000 150000 200000 250000 70 80 90 100 110 120 130 C h r o m ato gr am o s sm ai lė s p lo tas , µ V x s