LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
DEIMANTAS AUŠKALNIS
MAISTO PAPILDUOSE ESANČIOS GELEŽIES KIEKYBINIS
ĮVERTINIMAS FOTOELEKTROKOLORIMETRIJOS IR
SPEKTROFOTOMETRIJOS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. Asta Kubilienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
MAISTO PAPILDUOSE ESANČIOS GELEŽIES KIEKYBINIS
ĮVERTINIMAS FOTOELEKTROKOLORIMETRIJOS IR
SPEKTROFOTOMETRIJOS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. Asta Kubilienė Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantas Deimantas Auškalnis Data
KAUNAS, 2019
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 10
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 13
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
1. 1. Maisto papildų vartojimas ... 14
1. 2. Geležies elemento paplitimas ... 15
1. 3. Geležies stokos anemija ... 15
1. 4. Geležies vaidmuo žmogaus organizmui... 17
1. 5. Geležies maisto papildai, jų farmakokinetika ... 18
1. 6. Geležies tapatybės nustatymas ... 20
1. 7. Kiekybinis geležies nustatymas ... 21
1. 7. 1. Spektrofotometrija... 21
1. 7. 2. Fotoelektrokolorimetrija ... 22
1. 8. Apibendrinimas... 23
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2. 1. Tyrimo objektas ... 24
2. 2. Fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodika ... 24
2. 2. 1. Aparatūra ... 24
2. 2. 2. Reagentai ... 24
2. 2. 3. Standartinių tirpalų paruošimas ... 25
2. 2. 4. Maisto papildų tirpalų paruošimas tyrimui ... 26
2. 2. 5. Tiriamosios medžiagos analizė ... 26
2. 2. 5. 1. Fotoelektrokolorimetrinė tiriamosios medžiagos analizė ... 26
2. 2. 5. 2. Spektrofotometrinė tiriamosios medžiagos analizė ... 26
2. 3. Duomenų statistinė analizė ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3. 1. Gradavimo grafiko sudarymas... 28
3. 3. Kiekybinis geležies nustatymas spektrofotometrijos metodu ... 31
3. 4. Metodų ir rezultatų palyginimas ... 32
3. 5. Nustatytų geležies kiekių atitiktis deklaruojamiems kiekiams ... 33
4. IŠVADOS ... 36
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 37
SANTRAUKA
D. Auškalnio magistro baigiamasis darbas „Maisto papilduose esančios geležies kiekybinis įvertinimas fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodais“. Magistro baigiamojo darbo vadovas doc. Asta Kubilienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2019.
Tyrimo tikslas – kiekybiškai įvertinti geležies įvairavimą maisto papilduose.
Uždaviniai: nustatyti geležies kiekį maisto papilduose, taikant fotoelektrokolorimetrijos ir
spektrofotometrijos metodus; palyginti skirtingais analizės metodais maisto papilduose nustatytą geležies kiekį; įvertinti, ar maisto papilduose nustatytas geležies kiekis atitinka ženklinimo etiketėse deklaruojamą kiekį.
Tyrimo objektas: 8 maisto papildai, kurių sudėtyje yra geležies. Kilmės šalis: MP Nr. 1 –
Italija, MP Nr. 2 – Jungtinė Karalystė, MP Nr. 3 – Kipras, MP Nr. 4 – Lietuva, MP Nr. 5 – Danija, MP Nr. 6 – Jungtinė Karalystė, MP Nr. 7 – Lietuva, MP Nr. 8 – Lietuva.
Metodai: fotoelektrokolorimetrija, spektrofotometrija.
Tyrimo rezultatai: atlikus kiekybinę analizę fotoelektrokolorimetrijos metodu nustatyti šie
geležies kiekiai: MP Nr. 1 – 29,49±0,5 mg, MP Nr. 2 – 29,93±0,9 mg, MP Nr. 3 – 14,25±0,3 mg, MP Nr. 4 – 19,63±0,3 mg, MP Nr. 5 – 12,22±0,2 mg, MP Nr. 6 – 23,04±0,4 mg, MP Nr. 7 – 23,45±0,4 mg, MP Nr. 8 – 17,33±0,3 mg. Taikant spektrofotometrijos metodą nustatyti geležies kiekiai yra šie: MP Nr. 1 – 30,18±0,5 mg, MP Nr. 2 Fe – 29,40±0,9 mg, MP Nr. 3 – 14,33±0,3 mg, MP Nr. 4 – 16,50±0,3 mg, MP Nr. 5 – 12,77±0,3 mg, MP Nr. 6 – 23,38±0,5 mg, MP Nr. 7 – 23,80±0,3 mg, MP Nr. 8 – 11,32±0,4 mg.
Išvados: fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodais gautos gradavimo grafiko
tiesės yra tinkamos geležies kiekybiniam įvertinimui (R2=0,999; R2=0,998). Atlikus maisto papildų kiekybinę analizę abiem metodais, nustatytas geležies kiekio įvairavimas nuo 11,32 mg iki 30,18 mg. Lyginant nustatytą geležies kiekį tarp fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodų, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tiriant MP Nr. 4, MP Nr. 8 (p<0,05). Tyrimo metu nustatyto geležies kiekio skirtumui turėjo įtakos – cianokobalaminas. Nustatyta, kad fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodai yra netinkami geležies kiekio įvertinimui tiriant MP Nr. 4 ir MP Nr. 8. Vertinant ženklinimo etiketėse deklaruojamo geležies kiekio atitiktį nustatytam geležies kiekiui, nustatyta, kad MP Nr. 1, MP Nr. 2 ir MP Nr. 5 atitinka ženklinimo etiketėse deklaruojamą kiekį. Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp abiem metodais nustatyto geležies kiekio ir deklaruojamo kiekio nustatytas MP Nr. 6, MP Nr. 7 (p<0,05).
Praktinės rekomendacijos: remiantis atliktais fotoelektrokolorimetriniais ir spektrofotometriniais tyrimais bei gautais rezultatais, nustatyta, kad geležies kiekybiniam įvertinimui turi įtakos cianokobalaminas, todėl siekiant tiksliai nustatyti geležies kiekį maisto papilduose, kurių sudėtyje yra ir cianokobalamino, rekomenduojama taikyti tikslesnius analizės metodus. Tikslinga atlikti tolimesnius tyrimus siekiant išsiaiškinti sudedamųjų medžiagų įtaką geležies kiekio nustatymui.
SUMMARY
Final master's thesis of D. Auškalnis: „Quantitative analysis of iron in food supplements using photoelectric colorimetry and spectrophotometry methods“. Scientific supervisor doc. Asta Kubilienė. Lithuanian University of Health Sciences Faculty of Pharmacy Department of analytical and toxicological chemistry. Kaunas, 2019.
The aim of the research: to evaluate quantity of iron in food supplements.
Main tasks: to determine the amount of iron in food supplements using photoelectric
colorimetry and spectrophotometry methods; to compare the amount of iron in food supplements in different methods of analysis; to evaluate if the amount of iron in food supplements match the declared quantity on the label.
The object of the research: 8 food supplements containing iron. Country of origin: FS No.1
– Italy, FS No. 2 – United Kingdom, FS No. 3 – Cyprus, FS No. 4 – Lithuania, FS No. 5 – Denmark, FS No. 6 – United Kingdom, FS No. 7 – Lithuania, FS No. 8 – Lithuania.
Methods: photoelectric colorimetry, spectrophotometry.
Results: after quantitative analysis using photoelectric colorimetry method it was determined,
that FS No. 1 Fe the amount is 29,49±0,5 mg, FS No. 2 – 29,93±0,9 mg, FS No. 3 – 14,25±0,3 mg, FS No. 4 – 19,63±0,3 mg, FS No. 5 – 12,22±0,2 mg, FS No. 6 – 23,04±0,4 mg, FS No. 7 – 23,45±0,4 mg, FS No. 8 – 17,33±0,3 mg. Using spectrophotometry method it was determined, that FS No. 1 Fe the amount is 30,18±0,5 mg, FS No. 2 – 29,40±0,9 mg, FS No. 3 – 14,33±0,3 mg, FS No. 4 – 16,50±0,3 mg, FS No. 5 – 12,77±0,3 mg, FS No. 6 – 23,38±0,5 mg, FS No. 7 – 23,80±0,3 mg, FS No. 8 – 11,32±0,4 mg.
Conclusions: graduation graphs attained using photoelectric colorimetry and spectrophotometry methods are usable for quantitative evaluation of iron (R2=0,999; R2=0,998). After food supplements analysis using both methods, the variation of iron quantity is from 11,32 mg to 30,18 mg. Comparing measured iron quantity between photoelectric colorimetry and spectrophotometry methods, determined statistically significant difference in measures FS No. 4, FS No. 8 (p<0,05). The impact to differnece of evaluated iron quantity had cyanocobalamin. It was determined that photoelectric colorimetry and spectrophotometry methods are improper for the evaluation of iron quantity in FS No. 4, FS No. 8. Evaluating declared iron quantity on labeling tag equivalency to the measured iron quantity, it was determined that FS No. 1, FS No. 2 ir FS No. 5 match declared quantity on labeling tag. Statistically significant difference between the measured iron quantity using both methods and declared amount was determined in FS No. 6, FS No. 7 (p<0,05).
Recommendation: based on accomplished photoelectric colorimetry and spectrophotometry
analysis and results, it was determined that cyanocobalamin has impact on evaluation of iron quantity, therefore it is recommended to use more accurate analysis methods for evaluation of iron quantity in food supplements that have cyanocobalamin in their composition. It is appropriate to do further research to find out the impact of additional substances on evaluation of iron quantity.
PADĖKA
Dėkoju savo magistrinio darbo vadovei doc. Astai Kubilienei už pagalbą rašant magistrinį darbą. Taip pat noriu padėkoti už patarimus atliekant tyrimo metodiką Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui ir lekt. Mindaugui Marksai.
SANTRUMPOS
AAS – atominės absorbcijos spektrometrijaCNS – centrinė nervų sistema Hb – hemoglobinas
HCl – vandenilio chloridas Fe – geležis
MP – maisto papildas
PSO – pasaulio sveikatos organizacija UV – ultravioletiniai spinduliai
ĮVADAS
Didėjant gyvenimo tempui ir greito maisto vartotojų skaičiui, vis dažniau susiduriama su neracionalia mityba. Maitinantis neracionaliai žmogaus organizme gali pradėti stigti įvairių vitaminų ar mineralinių medžiagų, įskaitant ir geležį.
Geležies trūkumas yra pagrindinė lėtinės anemijos atsiradimo priežastis. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO), siekdama įvertinti anemijos paplitimą pasaulyje, sukūrė visuotinę duomenų bazę, apimančią mokslinių tyrimų analizę. Remiantis duomenimis buvo apskaičiuota, kad ketvirtadalis pasaulio gyventojų (t.y. 1,6 mlrd. žmonių) kenčia nuo anemijos. [1] Kiek naujesnio, panašaus pobūdžio PSO atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad nuo 1990 m. iki 2011 m. pasaulyje dažniausias anemijos paplitimas (apie 800 mln.) yra Afrikos ir Pietryčių Azijos regionuose. [2] Lietuvos privalomojo sveikatos draudimo informacinės sistemos „SVEIDRA“ 2016 m. duomenimis iš 1000 Lietuvos gyventojų geležies stokos anemija serga 13,64 gyventojai. [3]
Geležis yra hemoglobino, mioglobino ir daugelio fermentų, kurie dalyvauja įvairiose medžiagų apykaitos funkcijose, sudedamoji dalis. Ji dalyvauja pernešant deguonį, DNR sintezėje, katecholaminų metabolizme, taip pat reikalinga ląstelių augimui, reprodukcijos procesui, žaizdų gijimui. [4,5,6] Žmogaus organizme yra apie 3-4 g geležies. Didžiausias geležies kiekis organizme nustatomas raudonųjų kraujo kūnelių baltymo hemoglobino sudėtyje. [7]
Žmogaus organizmui geležies atsargas nuolat būtina papildyti. Daugiausia geležies galima pasisavinti vartojant raudonąją mėsą, žuvį, įvairias žalias daržoves. Tačiau, remiantis Lietuvoje atliktu tyrimu, nustatyta, kad daugelis Lietuvos gyventojų vis dar maitinasi neracionaliai. [8] Todėl vartojant su maistu per mažai geležies, būtina kompensuoti jos stygių vartojant maisto papildus, kurių sudėtyje yra geležies.
Lietuvos rinkoje yra labai platus asortimentas maisto papildų, kurių sudėtyje yra geležies. Maisto papildai rinkai tiekiami dozuotomis formomis – tabletėmis, kapsulėmis, granulėmis, milteliais bei įvairiais skysčiais. Geležis maisto papilduose gali būti skirtingų druskų formose: geležies karbonatas, geležies citratas, geležies amonio citratas, geležies gliukonatas, geležies fumaratas, natrio geležies difosfatas, geležies laktatas, geležies sulfatas, geležies difosfatas (geležies pirofosfatas), geležies sacharatas ir kt. [9]
Europos Sąjungoje nėra taikomų griežtų reikalavimų kiekybiniam įvertinimui maisto papilduose esančioms sudėtinėms medžiagoms. Todėl ypač svarbu atlikti maisto papildų kiekybinę analizę, siekiant nustatyti realų sudedamųjų medžiagų kiekį.
Šio tyrimo metu kiekybiškai analizuoti 8 maisto papildai, kurių sudėtyje yra geležies. Kiekybinei geležies analizei taikomi fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodai. Tyrimo tikslas – kiekybiškai įvertinti geležies įvairavimą maisto papilduose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas – kiekybiškai įvertinti geležies įvairavimą maisto papilduose. Uždaviniai:
1) Nustatyti geležies kiekį maisto papilduose, taikant fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodus.
2) Palyginti skirtingais analizės metodais maisto papilduose nustatytą geležies kiekį.
3) Įvertinti, ar maisto papilduose nustatytas geležies kiekis atitinka ženklinimo etiketėse deklaruojamą kiekį.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1. 1. Maisto papildų vartojimas
Šiandieninėje visuomenėje maisto papildų vartojimas yra plačiai paplitęs. Daugelis žmonių dėl nepilnavertės mitybos, vitaminų ar mineralinių medžiagų trūkumo pradeda vartoti maisto papildus. ,,Maisto papildas – įprastam racionui papildyti skirtas maisto produktas, kuris yra koncentruotas vienos arba kelių maistinių arba kitų medžiagų, turinčių mitybinį arba fiziologinį poveikį, šaltinis. Maisto papildai tiekiami rinkai dozuotomis formomis – kapsulėmis, pastilėmis, piliulėmis, tabletėmis, kitomis panašiomis formomis bei miltelių maišeliais, skysčių ampulėmis, buteliukais su lašų dozatoriais bei kitomis panašiomis skysčių ir miltelių, skirtų vartoti mažais dozuotais kiekiais, formomis.“ [10]
Siekiant išsiaiškinti maisto papildų vartojimo ypatumus yra atliekami įvairūs tyrimai. 2013 metais Lietuvoje atlikta anketinė apklausa apie mitybos įpročius bei vartojamus maisto papildus atskleidė, kad Lietuvos gyventojų mityba yra nepilnavertė – valgoma per mažai vaisių, daržovių, žuvies produktų. Dėl to, atlikus maisto papildų vartojimo analizę, buvo nustatyta, kad maisto papildus vartoja net 64 % Lietuvos gyventojų. [8] 2017 metais atliktais tyrimo duomenimis nustatyta, kad iš 1012 apklaustų respondentų, daugiau nei pusė vartoja maisto papildus, o net 61,9 % respondentas planuoja ateityje vartoti maisto papildus, kad sustiprintų savo imuninę sistemą ir išvengtų įvairių ligų. [11]
Europos šalyse maisto papildų vartojimas yra skirtingas. Pavyzdžiui, Vokietijoje maisto papildus vartoja 43 %, o Danijoje – 59 % suaugusių gyventojų, tuo tarpu Airijoje ir Ispanijoje – mažiau (atitinkamai 23 % ir 9 %). [12, 13, 14, 15]
Remiantis Nacionalinės sveikatos tyrimo duomenimis, 2014-2015 metais Australijoje atlikto tyrimo metu išsiaiškinta, kad 43,2 % suaugusiųjų (34,9 % vyrų, 50,3 % moterų), 20,1 % paauglių (19,7 % vyrų, 20,6 % moterų) ir 23,5 % vaikų (24,4 % berniukų, 22,5 % mergaičių) per pastarąsias dvi savaites vartojo bent po vieną maisto papildą. [16]
Apibendrinant atliktų tyrimų rezultatus, galima teigti, kad Lietuvoje ir pasaulyje maisto papildai yra vartojami dėl nepilnavertės mitybos, kai siekiama sustiprinti imuninę sistemą, vitaminų ar mineralinių medžiagų, įskaitant ir geležį, trūkumui kompensuoti bei įvairių ligų profilaktikos atveju.
1. 2. Geležies elemento paplitimas
Geležis – cheminis elementas, kuris žymimas atominiu simboliu Fe. Geležies atominis skaičius yra 26, svoris – 55,85. [17] Tai ketvirtas labiausiai paplitęs Žemės plutos elementas (~5 %) bei gerai ištirtas mikroelementas. Dažniausiai Žemėje gryno geležies elemento nesutinkama, todėl grynas geležies metalas gaunamas iš geležies rūdos. [18, 19]
Geležis yra pagrindinis visų gyvųjų organizmų metabolizmo elementas. Ji egzistuoja dviejose biologiškai svarbiose oksidacijos būsenose: dvivalentė geležis (Fe2+) ir trivalentė geležis (Fe3+). [20] Geležis yra daugelio baltymų ir fermentų sudedamoji dalis bei palaiko svarbias biologines funkcijas. [4, 20]
Maiste geležis yra dviejų pavidalų – heminė (Fe2+ gerai absorbuojama) ir nehemo forma (Fe3+ lėtai absorbuojama). [7, 23] Fe2+ yra mėsoje, o Fe3+ – augaluose. Maiste didžiausias geležies kiekis aptinkamas – raudonoje mėsoje (jautienoje, veršienoje, kepenyse), žuvyje ir vištienoje, šiek tiek mažiau žaliose daržovėse (špinatuose), burokėliuose, pupose, krienuose, grybuose, kiaušinių tryniuose, granatuose, kai kuriuose grūduose. [21]
1. 3. Geležies stokos anemija
PSO duomenimis geležies stokos anemija yra labiausiai paplitusi liga pasaulyje. [1, 8] Nors yra nediskriminuojamos išsivysčiusios ir besivystančios šalys, tačiau nustatyta, kad vis dėlto, didesnis anemijų dažnis pasireiškia besivystančiose šalyse. PSO tyrimai atskleidė, jog Pietryčių Azijoje net 65,5 % ikimokyklinio amžiaus vaikai ir 45,7 % moterys ir nėščiosios moterys kenčia nuo geležies anemijos. [1]
Anemija yra raudonųjų kraujo kūnelių ir (arba) hemoglobino trūkumas, dėl kurio kraujyje mažėja deguonies kiekis. [22] Dažniausiai, anemija sergantis asmuo yra tas, kurio kraujyje hemoglobino koncentracija yra mažesnė nei 120 g/l, tačiau hemoglobino koncentracijai įtakos turi amžius, lytis, organizmo geležies poreikis. Esant anemijai, hemoglobino koncentracija kraujyje būna [1, 23, 24] : 1. Vaikai (0,5-5 m.) < 110 g/l 2. Vaikai (5-12 m.) < 115 g/l 3. Vaikai (12-15 m.) < 120 g/l 4. Moterys(≥ 15m.) < 120 g/l 5. Nėščiosios moterys < 110 g/l 6. Vyrai (≥ 15 m.) < 130 g/l
Anemiją sukelia ilgalaikis geležies disbalansas, kuris, laikui bėgant, organizme išeikvoja geležies atsargas. [25, 26] Šios atsargos yra būtinos raudonųjų kraujo ląstelių gamybai, todėl esant nepakankamam jų kiekiui, sumažėja hemoglobino gamyba, o vėliau – raudonųjų kraujo kūnelių gamyba [25, 26, 27].
Dažniausiai pasitaikantys geležies stokos anemijos rizikos veiksniai: skurdas [23, 28], dietų laikymąsis (pavyzdžiui, ryžių [29]), genetinė hemoglobinopatija [30], neapdoroto vandens vartojimas [31], lytis (dažniau moterys, nei vyrai [32]), tėvų išsilavinimas [31, 33], motinos anemija [34]. Paprastai veiksniai susideda iš kelių: socialinių, ekologinių, biologinių, ekonominių. Apžvelgus mokslinius tyrimus, galima teigti, kad skurdas yra svarbiausias veiksnys, turintis įtakos anemijos išsivystymui.
Geležies stokos anemijos požymiai ir simptomai dažnai yra skirtingi ir individualūs kiekvienam žmogui, bet poveikis neretai žalingas. Pagrindiniai geležies trūkumo simptomai – sumažėjęs darbingumas, blyškumas, imuninės sistemos disfunkcija, nuovargis, galvos svaigimas, neurokognityvinis sutrikimas, dusulys, apetito praradimas. [25, 27, 28]
Menstruacinio amžiaus moterims dažniau atsiranda anemija, nes geležis eliminuojama su menstruaciniu krauju, todėl joms ypač svarbu vartoti didesnį geležies kiekį turinčius maisto produktus arba papildyti šio elemento atsargas maisto papildais.
Nėščiosios ir pagimdžiusios moterys dažniau stokoja geležies, nes nėštumo metu arba po jo padidėja geležies poreikis. Gimdymo metu padidėja rizika nukraujuoti, o dėl kraujo netekimo išsivysto sunki anemija, o vėliau gali ištikti netgi mirtis. [35, 36]
Vaikams taip pat labai dažnai pasireiškia geležies trūkumas ir dėl to gali išsivystyti anemija. Geležies poreikis padidėja vaikui augant. Vaiko organizmui trūkstant geležies gali sutrikti ūgio ir svorio augimas, sulėtėti elgesys, mokymosi geba. [33] Manoma, kad pažinimo ir psichomotorinio vystymosi sutrikimų pasekmė taip pat gali atsirasti dėl geležies trūkumo. [35]
Naujausiais tyrimo duomenimis geležies stoka pasireiškia ir vyresnio amžiaus žmonėms. [7] Kai sumažėja geležies koncentracija kraujyje, vyresnio amžiaus žmonėms, gali pasireikšti fizinio aktyvumo ir raumenų jėgos sumažėjimas, pažinimo sutrikimai bei depresija. [37, 38, 39]
Kraujo donorams taip pat gali išsivystyti anemija, dėl kraujo netekimo, todėl jiems rekomenduojama vartoti preparatus, kurių sudėtyje yra geležies. [17]
1. 4. Geležies vaidmuo žmogaus organizmui
Žmogaus organizmui geležies vaidmuo yra reikšmingas. Geležis įeina į daugelio baltymų sudėtį, dalyvauja įvairiuose medžiagų apykaitos procesuose – deguonies transporte, oksidacijos procesuose, ląsteliniame kvėpavime, dezoksiribonukleorūgšties (DNR) sintezėje. Taip pat geležis reikalinga ir reprodukcijos procesui, ląstelių augimui bei žaizdų gijimui. Pagrindinis geležies vaidmuo yra deguonies transportavimas į audinius. [4, 5, 20]
Žmogaus organizme yra apie 3-4 g geležies, didžioji jos dalis (apie 70 %) yra raudonųjų kraujo kūnelių baltymų hemoglobino sudėtyje. [7] Vidutiniškai per dieną prarandama 12 mg geležies, nes ji išsiskiria su prakaitu, išmatomis, šlapimu bei gleivinės ląstelėmis. Plazmoje yra 2-4 mg geležies, susijungusios su serumo transferinu. Raudonųjų kraujo kūnelių gamybai ir metabolizmui kasdien reikia 20-25 mg geležies. Tačiau eritrocitų gyvavimo laikas žmogaus organizme yra apie 120 dienų. Kai eritrocitas žūva, blužnis hemoglobiną suskaido į hemą, kuris metabolizuojamas į bilirubiną ir dvivalentę geležį, o vėliau dvivalentė geležis gali vėl prisijungti prie naujos hemoglobino molekulės. Deja, dažnai nepakanka vien šios atsinaujinančios dvivalentės geležies, todėl esant poreikiui rekomenduojama vartoti geležies preparatus.
Geležies homeostazei pagrindinis vaidmuo skiriamas hepcidinui. Tai yra baltymas, sudarytas iš 25 aminorūgščių, sintezuojamas blužnyje, kepenyse, mieloidinėse ląstelėse. Hepcidinas slopina tiek geležies transportą iš enterocitų į plazmą proksimalinėje dvylikapirštėje žarnoje, tiek ir geležies pašalinimą iš organizmo. Pacientams, sergantiems geležies stokos anemija, serumo hepcidino kiekis yra nedidelis, todėl žarnyne padidėja geležies absorbcija ir iš makrofagų išsiskiria geležis. Hepcidino kiekį galima nustatyti tiriant šlapimą ar kepenų mRNR lygį. Uždegiminių sutrikimų metu, hepcidino gamybą skatina padidėjusi interleukino-6 gamyba kepenyse, todėl žarnyne yra blokuojama geležies absorbcija arba atsipalaidavimas. [40, 41, 42, 43, 44]
Pagal nacionalinį sveikatos institutą suaugusiesiems vyrams rekomenduojama geležies paros dozė yra nuo 8 iki 11 mg per parą, o moterims nuo 8 iki 18 mg, tačiau nėštumo metu rekomenduojama paros dozė yra didesnė, t.y. apie 27 mg per parą. [21] Kiek didesnė paros dozė, pagal 2011 m. PSO rekomendacijas, skiriama suaugusioms moterims ir paauglėms mergaitėms, kurioms rekomenduojama kasdien vartoti po 60 mg geležies, kad būtų išvengta anemijos, menstruacijų metu. [45, 46]
Kasmet pasaulyje miršta apie 4 milijonai naujagimių gimdymo metu, net 75 % naujagimių miršta per 7 gyvenimo dienas. [47, 48] Atliktoje apžvalgoje nustatyta, kad visame pasaulyje 70 % naujagimių mirčių būtų galima išvengti, įgyvendinus universalią intervenciją nėštumo, gimdymo metu ir pogimdyviniu laikotarpiu. [49] Nustatyta, kad vartojant geležies ir folio rūgšties preparatus nėštumo metu, sumažėja priešlaikinio gimdymo rizika bei padidėja kūdikio svoris. [29, 50] Kinijoje atlikto
tyrimo duomenimis, geležies ir folio rūgšties preparatų vartojimas nėštumo metu sumažina naujagimių mirtingumą apie 54 %. [51] Mažesnis mirtingumas sietinas su sumažėjusia priešlaikinio gimdymo ir naujagimių asfiksijos rizika. Tai patvirtina ir Jungtinės Amerikos Valstijose (JAV) atlikti tyrimai, kurių metu nėščiosioms moterims vartojant geležies preparatus, priešlaikinis gimdymo dažnis sumažėjo, o naujagimio kūno svoris padidėjo. [52, 53]
Tačiau per didelis geležies kiekis organizme gali būti toksiškas, nes jos perteklius reaguoja su peroksidais, ir gali sukelti įvairias sveikatos problemas, pavyzdžiui, širdies, endokrininių ligų, artrito, diabeto ir kepenų ligų atsiradimo riziką. [54] PSO nustatė, kad geriamajame vandenyje geležies kiekis neturi viršyti 2,0 mg/l-1. [55] Todėl Europoje nustatyta didžiausia leistina geležies koncentracija vandenyje – 200 µg/l-1. [56] Be to, esant geležies pertekliui žmogaus organizme didėja infekcijų atsiradimo rizika, aktyviai gaminasi laisvieji deguonies radikalai, kurie gali pažeisti ląstelių membraną, nukleino rūgštis, baltymus. [57, 58] Nustatyta, kad didžiausias geležies kiekis, kurį vartojant suaugusiems žmonėms nepasireiškia nepageidaujamas poveikis, yra 45 mg per parą. [17]
1. 5. Geležies maisto papildai, jų farmakokinetika
Nuo 2016 m. Lietuvos rinkai tiekiami maisto papildai turi būti notifikuojami (pranešami) Valstybinei maisto ir veterinarijos tarnybai, kuri įvertina maisto papildų teisės aktų reikalavimų atitikimą. [59]
Remiantis Europos Komisijos reglamentu Nr. 1170/2009, maisto papildų gamybai gali būti naudojamos šios geležies formos: geležies karbonatas, geležies citratas, geležies amonio citratas, geležies gliukonatas, geležies fumaratas, natrio geležies difosfatas, geležies laktatas, geležies sulfatas, geležies difosfatas (pirofosfatas), geležies sacharatas, elementinė geležis (karbonilas-elektrolitas-redukuotasis vandenilis), geležies bisglicinatas, geležies L-pidolatas, geležies fosfatas, geležies (II) tauratas. [9]
Geležies maisto papildai turi būti vartojami prieš valgį. Siekiant pagerinti geležies biologinį prieinamumą – kartu vartojama askorbo rūgštis, tačiau neretai ji gali padidinti nepageidaujamo poveikio pasireiškimo riziką, pavyzdžiui, pilvo skausmą, pykinimą, viduriavimą, vidurių užkietėjimą. Dėl geležies vartojimo pakinta išmatų spalva, jos tampa juodos, tačiau tai nėra kenksminga ir galima tęsti geležies preparatų vartojimą. Tad norint išvengti šių nepageidaujamų poveikių pasireiškimo, geležies preparatus galima vartoti valgio metu, tačiau tai sumažina geležies absorbciją iki 40 %. Taip pat galima sumažinti geležies dozes arba pakeisti geležies druską, pavyzdžiui, geležies sulfatą pakeisti į geležies gliukonatą. [24]
Siekiant išsiaiškinti geležies druskos toleravimo ir nepageidaujamo poveikio pasireiškimą riziką, atliktas tyrimas, kurio metu tirtos skirtingos geležies druskos formos: geležies sulfatas, geležies sulfatas su mukoproteaze, geležies sukcinatas, geležies fumaratas, geležies gliukonatas, geležies glicino sulfatas. Užtikrinant rezultatų tikslumą, analizuojami duomenys suskirstyti į tris grupes: 1) pagal bendrą nepageidaujamą poveikį, 2) pagal nepageidaujamą poveikį išskirtinai virškinimo traktui, 3) pagal vartojamą terapinę paros dozę 80-120 mg geležies per parą. Gauti rezultatai pateikti 1 lentelėje. Nustatyta, kad nepageidaujamas poveikis virškinimo traktui pasireiškė 3,7 % vartojant geležies sulfatą su mukoproteaze, 7,0 % vartojant geležies sukcinatą, 18,5 % geležies glicino sulfatą, 29,9 % geležies gliukonatą, 30,2 % geležies sulfatą ir 43,4 % geležies fumaratą. Apibendrinant tyrimo rezultatus, galima daryti išvadą, kad geriausiai toleruojama geležies sulfato druska su mukoproteaze, o dažniausi nepageidaujami poveikiai pasireiškia vartojant geležies fumarato druską. Geresnė geležies sulfato su mukoproteaze tolerancija virškinimo trakte siejama su mukoproteazės savybe – apsaugoti virškinimo trakto gleivinę. [60]
1 lentelė. Analizuojamų duomenų santrauka
Hemoglobino koncentracija kraujyje padidėja antrą geležies preparatų vartojimo savaitę. Kai atstatomas hemoglobino reikiamas kiekis, geriamoji geležis turėtų būti vartojama dar tris mėnesius, kad organizmas susikauptų papildomų geležies atsargų. [24]
Geležies maisto papildai rekomenduojami kūdikiams ir vaikams (nuo 6 mėn. iki 4 m.), ankstyvojoje paauglystėje, moters reprodukcinio periodo metu, nėštumo metu bei vegetarams. [6]
Geriamieji geležies papildai Tyrimai (n) Bendras pacientų skaičius (n) Vartojama Fe dozė (mg/parą) Bendri nepageidaujami poveikiai (n) Bendri virškinimo trakto nepageidaujami poveikiai (n) Geležies sukcinatas 10 4198 88 308 295 Geležies sulfatas 40 3271 120 1056 869 Geležies sulfatas su mukoproteaze 32 1293 105 53 48 Geležies fumaratas 11 757 105 356 298 Geležies glicino sulfatas 8 604 121 142 112 Geležies gliukonatas 10 572 175 177 171
Kontraindikuotinas geležies vartojimas turėtų būti tiems žmonėms, kuriems organizme yra geležies perteklius (hemochromatozė, hemosiderozė) bei virškinimo trakto sutrikimai. [6]
Maisto papildai, kurių sudėtyje yra geležies, gali sąveikauti su tam tikrais vaistais ir mineralinėmis medžiagomis. Pavyzdžiui, sąveikauja su antacidiniais preparatais, kurių sudėtyje yra aliuminio, magnio ir kalcio, mažėja geležies absorbcija. Geležies absorbciją taip pat mažina ir 4-chinolonai (ciprofloksacinas, norfloksacinas, ofloksacinas), tetraciklinai, varis, cinkas. Norint išvengti mažesnio biologinio pasisavinimo, reikėtų daryti mažiausiai dviejų valandų pertrauką tarp geležies preparatų ir šių vaistų bei mineralinių medžiagų vartojimo. Tačiau geležies preparatai taip pat gali sumažinti kitų vaistinių medžiagų, tokių kaip levodopos, metildopos, penicilaminų, bisfosfonatų bei vitamino E ir mangano absorbciją, todėl tarp šių sąveikaujančių preparatų vartojimo taip pat reikėtų daryti dviejų valandų pertrauką. [6]
1. 6. Geležies tapatybės nustatymas
Remiantis Europos farmakopėja, geležies (II) jonus ištirpusius vandenyje galima identifikuoti pagal šią metodiką: ištirpinti apie 10 mg geležies (Fe2+) 1 ml vandenyje ir įpilti 1 ml kalio ferocianido tirpalo. Susidaro mėlynos nuosėdos, kurios netirpsta 5 ml HCl praskiestoje rūgštyje. [61]
Kitas identifikavimo būdas: 30 ml vandenyje ištirpinti tiriamosios medžiagos kiekį, atitinkantį 1 mg geležies (Fe3+). Į 3 ml šio tirpalo, įpilama praskiestos druskos rūgšties ir 1 ml kalio tiocianato tirpalo. Esant Fe3+ jonui susidaro [Fe(SCN)(H2O)5]2+ kompleksas, kuris tirpalą nudažo raudona spalva. Paimami 2 ml gauto tirpalo. Į 1 ml įpilama 5 ml izoamilo alkoholio arba 5 ml eterio. Supurtoma ir paliekama pastovėti. Organinis sluoksnis tampa rožinis. Į likusį 1 ml įpilama 2 ml gyvsidabrio chlorido tirpalo, raudona spalva išblunka. [61]
Geležies (II) jonui reaguojant su natrio hidroksidu susidaro kompleksas – netirpstančios vandenyje žalsvos nuosėdos, o ilgiau pastovėjus patamsėja: Fe2+ + 2OH- Fe(OH)2. Deguonis oksiduoja geležies (II) hidroksido nuosėdas į geležies (III) hidroksidą, tirpalo viršuje susidaro oranžinės spalvos sluoksnis. Kai trivalentė geležis reaguoja su hidroksido jonais, tuomet susidaro oranžinės spalvos tirpalas: Fe3+ + 3OH- Fe(OH)3. [62]
1. 7. Kiekybinis geležies nustatymas
Metalų jonų kiekybinėje analizėje siekiama naudoti paprastus, efektyvius ir greitus metodus. Siekiant didesnio geležies kiekybinės analizės preciziškumo, dažnai taikomi induktyviai susietos plazmos optinės emisijos spektrometrijos (ICP-OES) ir atominės absorbcijos spektrometrijos (AAS) metodai. ICP-OES ir AAS yra labai jautrios bei selektyvios, vienu metu gali užregistruoti kelis cheminius elementus tiriamąjame bandinyje. Atliekant analizę, yra sužadinamas atomas, kuris išspinduliuoja tik tam atomui būdingą elektromagnetinės spinduliuotės spektrą. Mėginių ir standarto ruošimui naudojama azoto rūgštis ir vandenilio peroksidas. [63]
Kiekybiniam geležies nustatymui taip pat naudojami ir potenciometrijos, chemiliuminescencijos, fluorimetrinės analizės, izotopų skiedimo metodai, fotoelektrokolorimetrija, spektrofotometrija, tūrių analizė ir kt. [64]
1. 7. 1. Spektrofotometrija
Spektrofotometrijos metodas – paprastas metodas, nustatant geležies kiekį. Tai molekulių sugerties spektro matavimas. Jo metu atliekama tiriamos medžiagos analizė, kai yra matuojama monochromatinės spinduliuotės absorbcija. Absorbcija matuojama esant optimaliam bangos ilgiui.
Nustatant geležies kiekį spektrofotometrijos metodu, gali būti naudojami 1,10-fenantrolinas, acetilacetonas, tiocianatas, indolo-3-acto rūgštis, 2-dipiridinas, antranilo rūgštis (2-aminobenzenkarboksirūgštis), ksilenolio oranžinis, kurie sudaro kompleksinius junginius su geležimi. Geležis su kompleksadariais reaguoja greitai, o kiekvieno komplekso stabilumo laikas yra individualus. [65]
Vienas dažniausiai spektrofotometrijos analizėje naudojamų geležies kompleksadarių yra 1,10-fenantrolinas. Ruošiant mėginį, pirmiausia, į jį įpilamas hidroksilamino hidrochloridas, kuris trivalentę geležį, paverčia dvivalente. Mėginys šildomas, o atvėsus įpilama amonio acetato buferio (pH=3,2) ir 1,10-fenantrolino tirpalo, susidaro raudonai oranžinės spalvos kompleksas. Palyginus spektrofotometrinės analizės rezultatus su atominės absorbcijos spektroskopija, nustatyta, kad gauti rezultatai yra panašūs, todėl padaryta išvada, kad spektrofotometrinis metodas yra tinkamas geležies analizei. [66]
Mokslinėje literatūroje taip pat aprašytas kitas spektrofotometrinis tyrimas – tiocianato metodas. Rūgščioje terpėje geležis reaguoja su tiocianatu. Gaunamas kompleksas, dėl kurio tirpalas įgauna raudoną spalvą: [Fe(H2O)6] 3+ + SCN− [Fe(H2O)5SCN]2+ + H2O. Absorbcija matuojama esant
480 nm bangos ilgiui. Šis metodas naudojamas labai mažiems geležies kiekiams nustatyti. [67] Raudonos spalvos kompleksas taip pat susidaro, kai geležis susijungia su 2-dipiridinu. Tačiau literatūroje rasta įrodymų, kad šis kompleksas yra nestabilus, nes jis gali reaguoti su deguonimi arba su vandeniu. [68]
Spektrofotometriškai nustatoma geležis naudojant ksilenolio oranžinio kompleksadarį. 20 ml tiriamoji medžiaga neutralizuojama natrio hidroksidu, įpilamas 1 ml vandenilio peroksido, po to 5 ml buferinio tirpalo (pH=1,5) ir 4 ml ksilenolio oranžo. Gautas tirpalas šildomas, o atšaldžius, tirpalas įgauną raudoną spalvą, dėl susidariusio kompleksinio junginio. Šis kompleksas išlieka stabilus apie 2 valandas. Tiriamosios medžiagos absorbcija matuojama esant 585 nm bangos ilgiui. Tyrimo rezultatai įrodė, kad šis spektrofotometrinis metodas taip pat yra tinkamas kiekybiniam geležies nustatymui. [65]
1. 7. 2. Fotoelektrokolorimetrija
Fotoelektrokolorimetrinis metodas yra labai paprastas, greitas ir pigus. Šis metodas gali būti atliekamas naudojant įvairaus tipo dažiklius, tokius kaip 1,10-fenantrolinas, batofenantrolinas, ferozinas ir bipiridinas ir kt. [69]
Fotoelektrokolorimetrinės analizės metu, tirpale esančios medžiagos koncentracija gali būti nustatyta, lyginant spalvos intensyvumą su standartiniais tirpalais, kurių koncentracijos yra žinomos. Tiriamosios medžiagos tirpalo optinis tankis yra tiesiogiai proporcingas tirpalo koncentracijai. Atliekant fotoelektrokolorimetrinę analizę, tiriamosios medžiagos tirpalas – spinduliuojamas polichromatine šviesa.
Mokslinėje literatūroje aprašytas fotoelektrokolorimetrinės geležies analizės maisto papilduose tyrimas, naudojant fenantroliną. Reakcijos metu, dvivalentė geležis reguoja su 1,10-fenantrolinu. Tirpalas įgauna raudonai oranžinę spalvą, del kompleksinis junginio susidarymo. Gauto tirpalo optinio tankio maksimumas fiksuojamas esant 508 nm bangos ilgiui. Geležies koncentracija nustatoma pagal standartinę gradavimo grafiko kreivę. [70]
2012 m. Nigerijoje, Kebbi Valstybinis mokslų ir technologijos universitetas atliko tyrimą, kuriuo buvo siekiama išsiaiškinti ar maisto papilduose esantis geležies kiekis atitinka gamintojo deklaruojamą kiekį. Šiam tikslui pasirinkti kolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodai. Geležies kiekio lyginamoji analizė atlikta 5 skirtingos sudėties maisto papildams. Koreliacijos koeficiento reikšmė (R2) buvo teigiama tiek spektrofotometriniams, tiek kolorimetriniams standartams, o vertės buvo 0,998 ir 0,964. Tyrimo metu nė vienoje kapsulėje nebuvo nustatytas etiketėje deklaruotas
geležies kiekis. Lyginant taikytus metodus nustatyta, kad spektrofotometrijos jautrumas yra didesnis, nei kolorimetrijos. [71]
1. 8. Apibendrinimas
Apibendrinant literatūros apžvalgą, galima teigti, kad pasaulyje maisto papildų vartojimas yra labai plačiai paplitęs. Dažniausiai geležies maisto papildus žmonės pradeda vartoti atsiradus geležies trūkumui dėl nepilnavertės mitybos. Geležies maisto papildai rekomenduojami kūdikiams ir vaikams, ankstyvoje paauglystėje, moterims reprodukcinio periodo metu, nėščiosioms ir pagimdžiusioms moterims, vyresnio amžiaus žmonėms bei vegetarams. Nustatyta, kad geležies druskos formos turi įtakos geležies bioprieinamumui. Kiekybiniam geležies įvertinimui siekiama naudoti vis paprastesnius, efektyvesnius bei greitesnius metodus, tad išskiriama – spektrofotometrija ir fotoelektrokolorimetrija. Nustatant geležies kiekį spektrofotometrijos metodu, naudojamas 1,10-fenantrolinas, acetilacetonas, tiocianatas, indolo-3-acto rūgštis, 2,2-dipiridinas, antranilo rūgštis (2-aminobenzenkarboksirūgštis), ksilenolio oranžinis, o fotoelektrokolorimetrijoje – 1,10-fenantrolinas, batofenantrolinas, ferozinas, bipiridinas.
2. TYRIMO METODIKA
2. 1. Tyrimo objektas
Šio tyrimo metu analizuoti 8 maisto papildai, kurių sudėtyje yra geležies. Kilmės šalis:
MP Nr. 1 (Fe 30 mg, kapsulės) – Italija
MP Nr. 2 (Fe 29 mg, tabletės) – Jungtinė Karalystė MP Nr. 3 (Fe 15 mg, kapsulės) – Kipras
MP Nr. 4 (Fe 21 mg, kapsulės) – Lietuva MP Nr. 5 (Fe 12 mg, tabletės) – Danija
MP Nr. 6 (Fe 17 mg, kapsulės) – Jungtinė Karalystė MP Nr. 7 (Fe 30 mg, kapsulės) – Lietuva
MP Nr. 8 (Fe 20 mg, kapsulės) – Lietuva.
2. 2. Fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodika
Tyrimo metu naudojamas fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodas.
2. 2. 1. Aparatūra
Fotoelektrokolorimetrijos metodu tyrimas atliktas naudojant fotoelektrokolorimetrą
KFK-2MP (Rusija). Matavimams parinktos 1 cm kiuvetės.
Spektrofotometrijos metodu tyrimas atliktas naudojant Halo DB-26 20 UV/VIS dvigubo
spindulio spektrofotometrą, taip pat 1 cm standartinę kiuvetę.
2. 2. 2. Reagentai
Tyrimo metu naudoti reagentai:
Amonio hidroksidas (NH4OH) (10 %, Sigma-Aldrich Corporation, Germany) Sulfosalicilo rūgštis (C7H6O6S) (10 %, Sigma-Aldrich Corporation, Germany)
Vandenilio chlorido rūgštis (HCl) (Sigma-Aldrich Corporation, Germany)
Kalio permanganatas (KMnO4) (Carl Roth, Germany) (Šviežiai gaminamas 0,15 mol/l KMnO4 tirpalas: pasverti 2,4 g KMnO4 milteliai tirpinami distiliuotame vandenyje ir skiedžiami tuo pačiu tirpikliu iki 100 ml)
Distiliuotas vanduo
2. 2. 3. Standartinių tirpalų paruošimas
Analitinėmis svarstyklėmis tiksliai pasvertas 0,08 g geležies amonio alūnas ((NH4)Fe(SO4)2×12H2O), kuris tirpinamas nedideliame vandens ir koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties mišinio (1:2) kiekyje. Tirpalas įdėtas į ultragarso vonelę (apie 30 min.), kad visiškai ištirptų geležies amonio alūnas, o vėliau kiekybiškai perkeliamas į 250 ml talpos matavimo kolbą ir skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės. Iš gauto tirpalo pipete perkeliama 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, 2,5 ml, 3,0 ml į 50 ml matavimo kolbas, ten pat įpilama 10 ml C7H6O6S tirpalo (10 %). Tirpalo spalva tampa violetinė dėl komplekso susidarymo. Po to įpilama NH4OH (10 %), tirpalas įgauna raudoną spalvą, ir toliau pilama NH4OH (10 %) iki nekintančios geltonos tirpalo spalvos, o tada skiedžiama distiliuotu vandeniu iki 50,0 ml. [72, 73] Gauti šeši skirtingų koncentracijų etaloniniai tirpalai (0,4 µg/ml, 0,8 µg/ml, 1,2 µg/ml, 1,6 µg/ml, 2,0 µg/ml, 2,4 µg/ml). (1 pav.)
2. 2. 4. Maisto papildų tirpalų paruošimas tyrimui
Tyrimo metu analizuotas kapsules (MP Nr. 1, MP. Nr. 3, MP Nr. 4, MP Nr. 6, MP Nr. 7, MP Nr. 8) ir tabletes (Nr. 2 ir MP Nr. 5) smulkinama iki vienalytės masės, ir analitinėmis svarstyklėmis pasveriama bendra masė, kuri tirpinama nedideliame vandens ir koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties mišinio (1:2) kiekyje. Tirpalas įdedamas į ultragarso vonelę (apie 30 min.). Išskirtinai į maisto papildų tirpalą, kuriame yra Fe2+, įlašinama 0,15 mol/l KMnO4 iki nekintančios purpurinės spalvos, o kai ši spalva išlieka – įlašinama 2 ml to paties tirpalo. [74] Gautas tirpalas kiekybiškai perkeliamas į 500 ml talpos matavimo kolbą ir skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės. Iš gauto tirpalo pipete perkeliama 2,0 ml į 50 ml matavimo kolbą, ten pat įpilama 10 ml C7H6O6S tirpalo (10 %). Tirpalo spalva tampa violetinė dėl komplekso susidarymo. Po to įpilama NH4OH (10 %), tirpalas įgauna raudoną spalvą, ir toliau pilama NH4OH (10 %) iki nekintančios geltonos tirpalo spalvos, o tada skiedžiama distiliuotu vandeniu iki 50,0 ml. [72, 73]
2. 2. 5. Tiriamosios medžiagos analizė
2. 2. 5. 1. Fotoelektrokolorimetrinė tiriamosios medžiagos analizė
Pasirinktas optimalus bangos ilgis, kuriam esant, matuotas optinis tankis yra didžiausias. Atsitiktinai pasirinktos dvi kiuvetės. Į vieną kiuvetę įpilta distiliuoto vandens, o į antrą kiuvetę – vidutinės koncentracijos etaloninio tirpalo. Optinis tankis matuojamas 315-520 nm bangos ilgio intervale. Didžiausias optinis tankis nustatytas esant 400 nm bangos ilgiui. Taip pat parinktos optimalios 1 cm kiuvetės.
Kiekybinei analizei pasirinktas gradavimo grafiko metodas. Atliekama tiriamosios medžiagos analizė. Gautų tiriamųjų tirpalų optinis tankis matuojamas esant 400 nm bangos ilgiui, naudojant 1 cm kiuvetes. Lyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo. Geležies kiekis įvertinamas pagal gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį.
2. 2. 5. 2. Spektrofotometrinė tiriamosios medžiagos analizė
Matavimams pasirinktas bangos ilgis, kuriam esant, nustatoma didžiausia šviesos absorbcija. Naudojamos dvi 1 cm kiuvetės, į vieną įpilta vidutinės koncentracijos etaloninio tirpalo, o į antrą
kiuvetę, kaip lyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo. Absorbcija matuojama 200-500 nm bangos ilgio intervale. Didžiausia šviesos absorbcija nustatyta esant 423 nm bangos ilgiui.
Kiekybinei analizei pasirinktas gradavimo grafiko metodas. Matuojama skirtingų koncentracijų etaloninių tirpalų šviesos absorbcija.
Atliekama tiriamosios medžiagos analizė. Visų paruoštų tiriamųjų tirpalų šviesos absorbcija matuojama esant 423 nm bangos ilgiui. Naudojamos optimalios 1 cm kiuvetės. Geležies kiekis įvertinamas pagal gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį.
2. 3. Duomenų statistinė analizė
Duomenų statistinis įvertinimas atliktas ,,MS Excel 2007“ (,,Microsoft“, JAV) programa ir ,,IBM SPSS Statistics 24 2016“ (,,IBM“, JAV) statistiniu paketu. Visi eksperimentai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN). Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirstinių buvo nustatyti naudojant dviejų nepriklausomų imčių T-kriterijų (angl. independent-samples T-test). Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α=0,05. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatomas, kai gauta p-reikšmė mažesnė už 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Tiriamoji analizė atliekama siekiant kiekybiškai įvertinti geležies įvairavimą maisto papilduose. Šiam tikslui taikomi fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodai. Analizei parinkti 8 maisto papildai, kurių sudėtyje yra geležies. Kiekvieno maisto papildo tyrimui ruošiami 3 mėginiai (n=3). Tyrimo metu paruošti 27 tiriamieji tirpalai.
3. 1. Gradavimo grafiko sudarymas
Gradavimo grafiko sudarymui paruošti šeši etaloniniai tirpalai. Taikant fotoelektrokolorimetrijos metodą, etaloninių tirpalų optinis tankis matuotas esant 400 nm bangos ilgiui. Sudarytas gradavimo grafikas, kuris išreiškia optinio tankio priklausomybę nuo tirpalo koncentracijos. (2 pav.)
Gauta tiriamųjų tirpalų geležies koncentracija įvertinama pagal gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį:
y = 0,087x + 0,019 (1); čia
y – optinio tankio dydis;
x – bendras geležies kiekis, µg/ml.
Kreivės determinacijos koeficiento reikšmė (R2=0,999) yra arti vieneto, todėl galima teigti, kad gauta tiesė yra tinkama geležies kiekybiniam įvertinimui.
Taikant spektrofotometrijos metodą, gradavimo grafiko sudarymui naudojami identiški etaloniniai tirpalai kaip ir fotoelektrokolorimetrijos metodo metu. Etaloninių tirpalų absorbcija matuojama esant 423 nm bangos ilgiui. Sudarytas gradavimo grafikas, kuris išreiškia absorbcijos priklausomybę nuo tirpalo koncentracijos. (3 pav.)
Tiriamųjų tirpalų geležies koncentracijos įvertinamos pagal gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį:
y = 0,107x + 0,009 (2); čia
y – absorbcijos dydis;
x – bendras geležies kiekis, µg/ml.
Remiantis kreivės determinacijos koeficiento reikšme (R2=0,998), galima teigti, kad gauta tiesė yra tinkama geležies kiekybiniam įvertinimui, nes koeficiento reikšmė yra arti vieneto.
3 pav. Spektrofotometrijos metodu gauta gradavimo kreivė
Apibendrinant fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodais gautos gradavimo tiesės rezultatus, nustatyta, kad fotoelektrokolorimetrijos metodu gradavimo tiesės koeficiento reikšmė yra 0,1 % tikslesnė už spektrofotometrijos metodo gautą koeficiento reikšmę, tačiau šis skirtumas neturi reikšmingos įtakos kiekybinės analizės jautrumui.
Teigiama koreliacijos koeficiento reikšmė nustatyta ir A. U. Itodo, A. Usman ir kt. (2012 m.) Nigerijoje atliktame tyrime, kurio metu, taikant fotoelektrokolorimetrijos metodą, nustatyta
koreliacijos koeficiento reikšmė 0,964, o taikant spektrofotometrijos metodą – 0,998. [71] Didesnis jautrumas nustatytas taikant spektrometrijos metodą.
3. 2. Kiekybinis geležies nustatymas fotoelektrokolorimetrijos metodu
Maisto papilduose esančios geležies kiekio įvertinimas buvo atliktas pagal 2.2. (2.2.4., 2.2.5.1.) skyriuje aprašytą metodiką.
Fotoelektrokolorimetrijos metodu maisto papilduose nustatyti geležies kiekiai pateikti 4 paveiksle. Tyrimo metu didžiausias geležies kiekis nustatytas MP Nr. 2 (29,93±0,9 mg). Šiek tiek mažesnis geležies kiekis nustatytas MP Nr. 1 (29,49±0,5 mg). Mažiausias geležies kiekis nustatytas MP Nr. 5 (12,22±0,2 mg). Tačiau, lyginant tyrime nustatytą geležies kiekį su ženklinimo etiketėse deklaruojamu kiekiu, didžiausias geležies kiekis turėjo būti nustatytas MP Nr. 1 (30 mg) ir MP Nr. 7 (30 mg), šiek tiek mažesnis MP Nr. 2 (29 mg). Iš visų tirtų maisto papildų mažiausias geležies kiekis, pagal gamintojų deklaracijas, turėjo būti MP Nr. 5 (12 mg), o gauti rezultatai tai ir patvirtino.
4 pav. Nustatytas geležies kiekis (mg) maisto papilduose, taikant fotoelektrokolorimetrijos metodą (n=3)
Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp nustatyto geležies kiekio ir ženklinimo etiketėse deklaruojamo kiekio pastebimas MP Nr. 4, MP Nr. 6, MP Nr. 7, MP Nr. 8 (p<0,05), o kituose maisto papilduose šio skirtumo nenustatyta (p>0,05).
3. 3. Kiekybinis geležies nustatymas spektrofotometrijos metodu
Maisto papilduose esančios geležies kiekio įvertinimas buvo atliktas pagal 2.2. (2.2.4., 2.2.5.2.) skyriuje aprašytą metodiką.
Remiantis 5 paveikslo duomenimis, tyrimo metu didžiausias geležies kiekis nustatytas MP Nr. 1 (30,18±0,5 mg), kuriame ir turėjo būti gautas didžiausias kiekis (30 mg). Taip pat nustatytas didžiausias kiekis turėjo būti ir MP Nr. 7 (30 mg), tačiau gauti rezultatai skiriasi – MP Nr. 7 (23,80±0,3 mg) nustatytas 21,8±1,3 % mažesnis geležies kiekis nei deklaruojama. Mažiausias geležies kiekis nustatytas MP Nr. 8 (11,32±0,4 mg), kuris, nuo deklaruojamo kiekio, skyrėsi 43,4±2,0 %. Tačiau mažiausias geležies kiekis turėjo būti aptiktas MP Nr. 5 (12 mg), tačiau nustatytas 6,4±3,1% didesnis kiekis, nei deklaruojama ženklinimo etiketėje.
5 pav. Nustatytas geležies kiekis (mg) maisto papilduose, taikant spektrofotometrijos metodą (n=3) MP Nr. 4, MP Nr. 6, MP Nr. 7, MP Nr. 8 tarp nustatyto geležies kiekio ir ženklinimo etiketėse deklaruojamo kiekio gautas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Kituose maisto papilduose šio statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05).
3. 4. Metodų ir rezultatų palyginimas
Pagrindinis tarp šių metodų skirtumas toks, kad fotoelektrokolorimetrinės tiriamosios medžiagos analizėje matuojama polichromatinė spinduliuotės absorbcija, o spektrofotometrijoje – monochromatinė.
Standartinių tirpalų paruošimui naudojamas tas pats geležies amonio alūno ((NH4)Fe(SO4)2 × 12H2O) standartas. Abiem atvejais, kiekybinei analizei pasirinktas gradavimo grafiko metodas, kurio taikymas yra patogus tiriant nedidelės koncentracijos tirpalus. Tyrimo eigoje pasirinktas etaloninių tirpalų koncentracijos intervalas, kuris atitinka pagrindinį fotometrijos dėsnį: tirpalo optinis tankis tiesiogiai proporcingas šviesą absorbuojančios medžiagos koncentracijai tirpale.
Pritaikytas optimalus bangos ilgis: fotoelektrokolorimetrijos metodu didžiausias optinis tankis nustatytas esant 400 nm bangos ilgiui, o spektrofotometrijos metodu didžiausia absorbcija – esant 423 nm bangos ilgiui. Abiem atvejais, matuota vidutinė etaloninio tirpalo koncentracija. Tad paruošti tiriamieji tirpalai analizuojami esant šiems bangos ilgiams, o rezultatų palyginimai pateikti 6 paveiksle.
6 pav. Nustatyto geležies kiekio (mg), taikant fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodus, palyginimas (n=3)
Gauti rezultatai rodo, kad tiriant geležies kiekį MP Nr. 1, MP Nr. 2, MP Nr. 3, MP Nr. 5, MP Nr. 6, MP Nr. 7, nėra statistiškai reikšmingo skirtumo kuriuo metodu bus atliktas šis tyrimas (p>0,05). Tiek fotoelektrokolorimetrijos metodas, tiek spektrofotometrijos metodas yra tinkamas geležies kiekybiniam įvertinimui šiuose maisto papilduose. (6 pav.)
Lyginant MP Nr. 4 ir MP Nr. 8 nustatytą geležies kiekį fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodais, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Toks skirtumas yra sietinas su tuo, kad šių maisto papildų sudėtyje yra cianokobalaminas, kurio padarytas ultravioletinių spindulių (UV) šviesos absorbcijos spektras parodė, kad 395-423 nm bangos ilgio intervale yra nustatytas cianokobalamino šviesos absorbcijos padidėjimas ir sumažėjimas. (7 pav.) Kadangi fotoelektrokolorimetrijos metodu geležies didžiausia šviesos absorbcija nustatyta esant 400 nm bangos ilgiui, o spektrofotometrijoje – 423 nm bangos ilgiui, todėl preciziškam geležies kiekio nustatymui šie taikomi metodai yra netinkami tiriant MP Nr. 4 ir MP Nr. 8.
7 pav. Cianokobalamino UV šviesos absorbcijos spektras
3. 5. Nustatytų geležies kiekių atitiktis deklaruojamiems kiekiams
Atlikus maisto papilduose esančios geležies kiekybinį tyrimą, nustatyta, kad trijuose maisto papilduose geležies kiekis atitinka ženklinimo etiketėse deklaruojamą kiekį – MP Nr. 1, MP Nr. 2, taikant fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodus bei MP Nr. 5, taikant fotoelektrokolorimetrijos metodą. Priešingai, jau minėto A. U. Itodo, A. Usman ir kt. (2012 m.) atlikto tyrimo metu, nustatyta, kad nei vienas maisto papildas neatitiko gamintojo deklaracijose nurodyto geležies kiekio. [71] Be to, pastebėta, kad dviejuose maisto papilduose nustatytas geležies kiekis viršijo ženklinimo etiketėse deklaruojamą kiekį – MP Nr. 5 (taikant spektrofotometrijos metodą), MP Nr. 6 (taikant abu metodus), o kituose maisto papilduose (MP Nr. 3, MP Nr. 7) nustatytas geležies kiekis, taikant abu metodus, mažesnis nei ženklinimo etiketėse deklaruojamas kiekis. (8 pav.)
Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp abiem metodais nustatyto geležies kiekio ir deklaruojamo kiekio MP Nr. 6, MP Nr. 7 (p<0,05), o kitiems maisto papildams (MP Nr. 1, MP Nr. 2, MP Nr. 3, MP Nr. 5) šio statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05).
8 pav. Maisto papildų gamintojų deklaruojamo Fe kiekio (mg) palyginimas su tyrimo metu nustatytu Fe kiekiu (mg)
Siekiant įvertinti maisto papilde nustatyto geležies kiekio atitiktį ženklinimo etiketėje nurodytam kiekiui, nustatytos geležies kiekio deviacijos reikšmės, kurios pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Geležies kiekio deviacijos reikšmės tirtuose maisto papilduose
Maisto papildas
Deviacija, %
Fotoelektrokolorimetrijos metodas Spektrofotometrijos metodas
Nr. 1 –1,7±1,7 +0,6±1,7 Nr. 2 +3,1±3,1 +1,4±3,1 Nr. 3 –5,0±2,0 –4,5±2,5 Nr. 5 +1,7±1,7 +6,4±3,1 Nr. 6 +35,5±2,4 +37,5±3,0 Nr. 7 –21,8±1,3 –20,7±1,0
2012 m. gruodžio mėn. Europos komisija parengė rekomendacinį dokumentą dėl deklaruojamų maistinių medžiagų verčių leistinų nuokrypių nustatymo, kuriame rekomenduojamas, maisto papilduose esančioms mineralinėms medžiagoms, įskaitant ir geležį, leistinas kiekio verčių nuokrypis +45 % ir –20 %. [75] Šis dokumentas yra tik rekomendacinio pobūdžio, jis neturi oficialaus
teisinio statuso, todėl gamintojas nėra priverstas juo vadovautis. Tačiau siekiant įvertinti ar gamintojai vadovaujasi Europos komisijos parengta rekomendacija, atskleista, kad visuose tirtuose maisto papilduose (MP Nr. 1, MP Nr. 2, MP Nr. 3, MP Nr. 5, MP Nr. 6, MP Nr. 7) nustatytas geležies kiekis, taikant fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodus, atitiko šios rekomendacijos leistinus nuokrypius, todėl padaryta išvada, kad šių maisto papildų gamintojai vadovaujasi šiomis rekomendacijomis.
4. IŠVADOS
1. Fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodais gautos gradavimo grafiko tiesės yra tinkamos geležies kiekybiniam įvertinimui (R2=0,999; R2=0,998). Atlikus maisto papildų kiekybinę analizę abiem metodais, nustatytas geležies kiekio įvairavimas nuo 11,32 mg iki 30,18 mg.
2. Lyginant nustatytą geležies kiekį tarp fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodų, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tiriant MP Nr. 4, MP Nr. 8 (p<0,05). Tyrimo metu nustatyto geležies kiekio skirtumui turėjo įtakos – cianokobalaminas. Nustatyta, kad fotoelektrokolorimetrijos ir spektrofotometrijos metodai yra netinkami geležies kiekio įvertinimui tiriant MP Nr. 4 ir MP Nr. 8.
3. Vertinant ženklinimo etiketėse deklaruojamo geležies kiekio atitiktį nustatytam geležies kiekiui, nustatyta, kad MP Nr. 1, MP Nr. 2 ir MP Nr. 5 atitinka ženklinimo etiketėse deklaruojamą kiekį. Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp abiem metodais nustatyto geležies kiekio ir deklaruojamo kiekio nustatytas MP Nr. 6, MP Nr. 7 (p<0,05).
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1) Remiantis atliktais fotoelektrokolorimetriniais ir spektrofotometriniais tyrimais bei gautais rezultatais, nustatyta, kad geležies kiekybiniam įvertinimui turi įtakos cianokobalaminas, todėl
siekiant tiksliai nustatyti geležies kiekį maisto papilduose, kurių sudėtyje yra ir cianokobalamino, rekomenduojama taikyti tikslesnius analizės metodus.
2) Tikslinga atlikti tolimesnius tyrimus siekiant išsiaiškinti sudedamųjų medžiagų įtaką geležies kiekio nustatymui.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Benoist B, McLean E, Egli I, Cogswell M. Worldwide Prevalence of Anemia: Who Global Database on Anemia. World Health Organization: Geneva, Switzerland; 2008.
2. World Health Organization. The global prevalence of anaemia in 2011. Geneva, Switzerland; 2015.
3. Gaidelytė R, Garbuvienė M, Madeikytė N. Lietuvos gyventojų sveikata ir sveikatos priežiūros įstaigų veikla 2016 m. Higienos instituto Sveikatos informacijos centras. Vilnius; 2017.
4. Burden RJ, Pedlar CR. Understanding iron deficiency and exercise: looking beyond ferritin. St. Mary’s university, Twickenham, UK; English institute of sport, Manchester, UK. Acta Haematol; 2018; 139:183–184.
5. Kiely M. North/South Ireland food consumption survey: food and nutrient intakes, anthropometry, attitudinal data and physical activity patterns. Irish universities nutrition alliance; 2001.
6. Mason P. Dietary supplements, fourth edition. Pharmaceutical Press, London, UK; 2012; p. 276. 7. Joosten E. Iron deficiency anemia in older adults: A review, department of internal medicine,
division of geriatric medicine, university hospitals Leuven. Leuven, Belgium; 2017
8. Dobrovolskij V, Stukas R. Lietuvos gyventojų mitybos įpročiai 2013 metais. Lietuva; 2016. Prieiga internetu: DOI:10.5200/sm-hs.2013.089
9. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1170/2009 2009 m. lapkričio 30 d. iš dalies keičiantis Europos Parlamento ir Tarybos direktyvą 2002/46/EB ir Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1925/2006 dėl vitaminų ir mineralinių medžiagų bei jų formų, kurių galima pridėti į maisto produktus, įskaitant maisto papildus, sąrašų. Prieiga internetu: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/LT/TXT/PDF/?uri=CELEX:32009R1170&from=LT
10. Lietuvos Respublikos Sveikatos apsaugos ministro įsakymas „DĖL LIETUVOS HIGIENOS NORMOS HN 17:2016 „MAISTO PAPILDAI“ PATVIRTINIMO, 2010 m. gegužės 13 d. Nr. V-432", Vilnius; 2010.
11. Dobrovolskij V. Prevalence of food supplement use and opinion about food supplements among Lithuanian residents. European journal of public health, volume 28, November 2018. Available from: https://doi.org/10.1093/eurpub/cky218.066
12. Mensink GB, Fletcher R, Gurinovic M. Mapping low intake of micronutrients across Europe. British Journal of Nutrition; 2012; 14:1-19. Available from: DOI:10.1017/S000711451200565X 13. Beitz R, Mensink GB, Rams S. Vitamin- und mineralstoffsupplementierung in Deutschland (Use
of vitamin and mineral supplements in Germany). Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz; 2004; 47:1057–1065.
14. Tetens I, Biltoft-Jensen A, Spagner C. Intake of micronutrients among Danish adult users and non-users of dietary supplements. Food and nutrition research. Denmark; 2011; 55:7153.
15. Rovira MA, Grau M, Castañer O. Dietary supplement use and health-related behaviors in a Mediterranean population. Journal of nutrition education and behavior; 2013; 45(5):386-391. 16. Stacey K, Malacova E, Jill L, Lucinda J. The prevalence and predictors of dietary supplement use
in the Australian population. School of public health, Curtin University, Bentley, WA, Australia; 2017. Available from: DOI:10.3390/nu9101154
17. Los Alamos National Laboratory. Elements, Iron. Available from: https://www.worldofmolecules.com/elements/iron.htm
18. Erdman JWJ, Macdonald IA, Zeisel SH. Present knowledge in nutrition. 10 th edition. Ames: Wiley-Blackwell; 2012; 506-520.
19. Ross AC, Caballero BH, Cousins RJ, Tucker KL, Ziegler TR. Modern nutrition in health and disease: Eleventh edition. Wolters kluwer health adis. Philadelphia, London, New york; 2012 . 20. Linus Pauling Institute. Micronutrient information center. Oregon state university. Corvallis,
Oregon; April 2016. Retrieved 6 March 2018.
21. National institutes of health. 2018. Available from: https://livertox.nlm.nih.gov/Iron.htm#top 22. Loney M, Chernecky C. Anemia. Continuing education 2000; 27(6) 951-962.
23. Balarajan Y, Ramakrishnan U, Ozaltin E, Shankar AH, Subramanian SV. Anemia in low-income and middle-income countries. The Lancet 2011; 378 2123-35. Available from: DOI:10.1016/S0140-6736(10)62304-5
24. Lopez A, Cacoub P, Macdougall IC, Peyrin-Biroulet L. Iron deficiency anaemia. France; 2016. Available from: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(15)60865-0
25. Clark SF. Iron deficiency anemia. Nutrition in clinical practice. California; 2008; 23(2) 128-41. Available from: DOI:10.1177/0884533608314536
26. Johnson-Wimbley TD, Graham DY. Diagnosis and management of iron deficiency anemia in the 21st century. Therapeutic Advances in Gastroenterology. Baylor college of medicine, Houston, Texas, USA; 2011. Available from: DOI:10.1177/1756283X11398736
27. Means R. Iron deficiency anemia. Hematology clinic. University of Kentucky College of Medicine, Lexington, KY, USA; 2013; 18(5), 305-6. DOI:10.1179/1024533213Z.000000000197 28. Charles CV. Iron Deficiency Anemia: A Public Health Problem of Global Proportions. University
of Guelph, Canada; 2011. Available from: DOI:10.5772/37655
29. Lynch SR. Why nutritional iron deficiency persists as a worldwide problem. The journal of nutrition. Eastern Virginia Medical School; Norfolk; 2011. Available from: DOI:10.3945/jn.110.130609
30. George J, Yiannakis M, Main B, Devenish R, Anderson C, Williams SM, Gibson RS. Genetic hemoglobin disorders, infection, and deficiencies of iron and vitamin A determine anemia in young Cambodian children. The journal of nutrition. New Zealand; 2012; 142(4) 781-7. Available from: DOI:10.3945/jn.111.148189
31. Cotta RM, Oliveira FC, Magalhães KA, Ribeiro AQ, Sant'Ana LF, Priore SE, Franceschini SC. Social and biological determinants of iron deficiency anemia. Brasil; 2011; 27(2) S309-20.
32. Tengco LW, Rayco-Solon P, Solon JA, Sarol JN, Solon FS. Determinants of anemia among preschool children in the Philippines. Journal of the American college of nutrition. Philippines; 2008; 27(2) 229-43.
33. Choi HJ, Lee HJ, Jang HB, Park, JY, Kang JH, Park KH, Song J. Effects of maternal education on diet, anemia, and iron deficiency in Korean school-aged children. South Korea; 2011; 11 870-878. Available from: DOI:10.1186/1471-2458-11-870
34. Pasricha SR, Black J, Muthayya S, Shet A, Bhat V, Nagaraj S, Prashanth NS, Sudarshan H, Biggs B, Shet AS. Determinants of anemia among young children in rural India. Department of Medical Oncology, St Johns national academy of health sciences, Sarjapur Road, Bangalore, India; 2010; 126(1) 140-9. Available from: DOI:10.1542/peds.2009-3108
35. Stoltzfus RJ, Mullany L, Black RE. Iron deficiency anemia. Comparative quantification of health risks. Geneva; Switzerland; 2004; 164-209.
36. Brabin B, Hakimi M, Pelletier D. Ananalysis of anemia and pregnancy-related maternal mortality. The journal of nutrition. Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, England and University of Amsterdam; 2001. Available from: DOI:10.1093/jn/131.2.604S.
37. Beghé C, Wilson A, Ershler WB. Prevalence and out comes of anemia in geriatrics: a systematic review of the literature. USA; 2004. Available from: DOI:10.1016/j.amjmed.2003.12.009
38. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Prevalence of anemia in persons 65 years and older in the United States: evidence for a high rate of unex plained anemia. The American society of hematology; 2004; Available from: DOI:10.1182/blood-2004-05-1812 39. De la Cruz-Góngora V, Manrique-Espinoza B, Villalpando S, Téllez-Rojo Solís MM,
Salinas-Rodriguez A. Short-Term Impact of Anemia on Mortality: Evidence From a Sample of Mexican Older Adults. National Institute of Public Health, Cuernavaca, Mexico; 2014. Available from: https://doi.org/10.1177/0898264314529331
40. Girelli D, Nemeth E, Swinkels DW. Hepcidin in the diagnosis of iron disorders. The American Society of Hematology. Blood, 9 June 2016. Available from: DOI:10.1182/blood-2015-12-639112
41. Ganz T. Hepcidin and iron regulation, 10 years later. Departments of medicine and pathology, David Geffen school of medicine, Los Angeles, CA; Blood; 2011. Available from: https://doi.org/10.1182/blood-2011-01-258467
42. Nemeth E. Iron regulation and erythropoiesis. University of California, Los Angeles, California, USA; 2008. Available from: DOI:10.1097/MOH.0b013e3282f73335.
43. Evstatiev R, Gasche C. Iron sensing and signalling. Gut; Austria; 2012. Available from: DOI:10.1136/gut.2010.214312
44. Weiss G, Goodnough LT. Anemia of chronic disease. The new England journal of medicine; Massachusetts; 2005; 352: 1011–1023. Available from: DOI:10.1056/NEJMra041809
45. WHO. Guideline: intermittent iron and folic acid supplementation in menstruating women. Geneva: World Health Organization; 2011.
46. Fernández-Gaxiola AC, De-Regil LM. Intermittent iron supplementation for reducing anaemia and its associated impairments in menstruating women. Cochrane Collaboration; 2011.
47. Lawn JE, Cousens S, Zupan J. 4 million neonatal deaths: When? Where? Why? Lancet Neonatal Survival Steering Team. Lancet; 2005; 365:891–900. Available from: DOI:10.1016/S0140-6736(05)71048-5
48. WHO. The world health report 2005: make every mother and child count. Geneva; 2005.
49. Darmstadt GL, Bhutta ZA, Cousens S, Adam T, Walker N, de Bernis. Evidence-based, cost-effective interventions: how many newborn babies can we save? Lancet; 2005; 365:977–88. Available from: DOI:10.1016/S0140-6736(05)71088-6
50. Moll R, Davis B. Iron, vitamin B12 and folate, Clinical sciences; 2017.
51. Zeng L, Dibley MJ, Cheng Y, Dang S, Chang S, Kong L. Impact of micronutrient supplementation during pregnancy on birth weight, duration of gestation, and perinatal mortality in rural western China: double blind cluster randomised controlled trial. China; 2008. Available from: DOI:10.1136/bmj.a2001
52. Cogswell ME, Parvanta I, Ickes L, Yip R, Brittenham GM. Iron supplementation during pregnancy, anemia, and birth weight: a randomized controlled trial. American Society for Clinical Nutrition; 2003. Available from: DOI:10.1093/ajcn/78.4.773
53. Siega-Riz AM, Hartzema AG, Turnbull C, Thorp J, McDonald T, Cogswell ME. The effects of prophylactic iron given in prenatal supplements on iron status and birth outcomes: A randomized controlled trial. American Journal of Obstetrics and Gynecology; 2006; 194:512–9. Available from: DOI: 10.1016/j.ajog.2005.08.011
