MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
IEVA RATAUTAITĖ
LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DEKSPANTENOLIU
FORMULAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. Dr. Vitalis Briedis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data:
LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DEKSPANTENOLIU
FORMULAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof.dr. Vitalis Briedis Data
Recenzentas Darbą atliko:
Magistrantė Ieva Ratautaitė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
PADĖKA ... 8
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Lipidinių nanonešiklių taikymas lokaliam gydymui. Dekspantenolis. ... 12
1.2 Lipidiniai nanonešikliai ... 14
1.3 Lipidinių nanonešiklių struktūros ypatybės ... 14
1.3.1 Fosfolipidai ... 15
1.3.2 Cholesterolis. Lipidinių nanonešiklių stabilumas ... 16
1.3.3 Paviršinio aktyvumo medžiagos ... 17
1.4 Lipidinių nanonešiklių klasifikacija ... 17
1.5 Lipidinių nanonešiklių gamybos metodai ... 19
1.5.1 Mechaniniai metodai ... 19
1.5.2 Metodai pagrįsti organinio tirpiklio pakeitimu ... 20
1.5.3 Metodai pagrįsti detergentu pašalinimu ... 22
1.6 Lipidinių nanonešiklių charakterizavimas ... 22
1.6.1 Dalelių dydžio analizė ... 23
1.6.2 Paviršiaus krūvis. Zeta potencialas ... 23
1.6.3 Vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumas ... 24
2 METODIKA ... 25
2.1 Tyrimo objektas ... 25
2.2 Tyrimo medžiagos ir įranga ... 25
2.2.1 Reagentai: ... 25
2.2.2 Įranga ... 25
2.3 Dekspantenolio kiekybinio nustatymo metodika ... 25
2.3.1 Pirminės lipidinių nanonešiklių formuluotės pasirinkimas. ... 26
2.3.2 Lipidinių nanonešiklių formuluotės optimizavimo plano sudarymas. ... 27
2.3.3 Optimalios lipidinių nanonešiklių formuluotės pasirinkimas ... 27
2.1 Lipidinių nanonešiklių gamybos metodika ... 28
2.2 Lipidinių nanonešiklių fizikinių savybių nustatymas ... 28
2.4 Dekspantenolio atpalaidavimo iš lipidinių nanonešiklių in vitro tyrimai... 29
2.5 Lipidinių nanonešiklių stabilumo vertinimas ... 29
2.6 Statistinė duomenų analizė ... 30
3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
3.1 Pirminės lipidinių nanonešiklių formuluotės pasirinkimo analizė. ... 31
3.2 Optimizacija ... 32
3.2.1 Optimizuotų lipidinių nanonešiklių formuluočių fizikinės savybės ... 33
3.2.2 Inkorporavimo efektyvumas ... 34
3.2.3 Dekspantenolio atpalaidavimas iš lipidinių nanonešiklių in vitro. ... 35
3.3 Optimalios formuluotės kokybės vertinimas ... 36
3.4 Dekspantenolio įtaka lipidinių nanonešiklių kokybei ... 40
3.5 Lipidinių nanonešiklių stabilumo nustatymas ... 41
IŠVADOS ... 44
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 46
SANTRAUKA
LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DEKSPANTENOLIU FORMULAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
I. Ratautaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. V. Briedis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas- įvertinanti įvairių lipidinių nanonešiklių formuluočių su inkorporuotu
dekspantenoliu fizikines savybes, stabilumą, dekspantenolio in vitro atpalaidavimą ir inkorporavimo efektyvumą.
Darbo uždaviniai- Sudaryti optimizavimo planą siekiant atrinkti tinkamą lipidinių
nanonešiklių su dekspantenoliu formuluotės komponentų sudėtį; pagaminti lipidinius nanonešikius ir įvertinti jų fizikines savybes, in vitro atpalaidavimą ir inkorporavimo efektyvumą; ištirti dekspantenolio įtaką lipidinių nanonešiklių kokybei; ištirti lipidinių nanonešiklių stabilumą.
Metodai. Lipidinių nanonešiklių formuluotės optimizavimas atliktas naudojant Design
Expert® 7 (Stat-Ease) kompiuterinę programą. Lipidinių nanonešiklių gamybai naudojamas ultragarsinis metodas. Lipidinių nanonešiklių vidutinis dalelių dydis, polidispersiškumo indeksas ir zeta potencialas nustatytas naudojant Zetasizer Nano (Malvern, JK) analizatorių. Dekspantenolio atpalaidavimo iš lipidinių nanonešiklių tyrimai in vitro atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes. Inkorporavimo efektyvumui nustatyti atskirtas laisvas dekspantenolis nuo lipidinės nanonešiklio suspensijos. Dekspantenolio kiekis nešikliuose nustatytas ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Dalelių stabilumas vertintas matuojant optimalių formuluočių fizikines savybes praėjus 1d., 1 sav., 2sav., 3sav., ir 1 mėn. po pagaminimo.
Rezultatai. Lipidinių nanonešiklių su dekspantenoliu optimali formuluotė buvo atrinka
vertinant 10 skirtingų formuluočių. Remiantis gautais rezultatais apskaičiuotas fosfolipido kiekis optimaliai formuluotei buvo 797 mg. Šių lipidinių nanodalelių dydis, polidispersiškumo indeksas, pH ir zeta potencialas atitinkamai buvo 64,75 ± 0,94 nm, 0,224 ± 0,006, 7,2 ± 0,08 ir -10,33 ± 1,25 mV. Atpalaiduotas dekspantenolio kiekis iš lipidinių nanonešiklių in vitro siekė 3,46 ± mg/cm2, tuo tarpu iš dekspantenolio tirpalo atsipalaidavo 44,19% daugiau. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumas siekė 53,67 ± 1,01%. Lyginant optimizavimo plano suformuluotus teorinius kokybės rodiklius su tyrimų gautais rezultatais statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p>0,05). Nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai parodė, kad suformuotos nanodispersinės sistemos yra stabilios. Vertinant deskspantenolio įtaką lipidinių nanonešiklių savybėms nustatyta, kad dekspantenolio inkorporavimas į nanonešiklius įtakos jų fizikinėms savybėms neturėjo.
Išvados. Tyrimų rezultatai patvirtino optimizavimo plano sudarytos formuluotės tinkamumą
lipidinių nanonešiklių su inkorporuotu dekspantenoliu kokybės prognozavimui ir gamybai. Pagaminti lipidiniai nanonešikliai turi būti toliau tiriami siekiant nustatyti jų skvarbą į odą.
SUMMARY
FORMULATION AND BIOPHARMACEUTICAL EVALUATION OF LIPID NANOCARRIERS WITH INCORPORATED DEXPANTHENOL
I. Ratautaitė Master thesis/ scientific supervisor prof. dr. V. Briedis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
The aim: to evaluate physico-chemical properties, stability, in vitro release and incorporation
efficiency of vesicular carriers containing dexpanthenol.
Tasks: to prepare optimization plan for the selection of a suitable components for lipid
nanoparticle formulation containing dexpanthenol; to prepare vesicular carriers and evaluate their physical properties, in vitro release and entrapment efficiency; to assess the impact of dexpanthenol on the quility of lipid nano-carriers; to assess stability of vesicular carriers;
Methods. Optimization plan of lipid nano-carriers was prepared using experimental design
software Design Expert® 7 (Stat-Ease). Lipid nanoparticles were prepared by using ultrasonic method. Particle size, polydispersion index and zeta potential of lipid nano- carriers was determined by using the Zetasizer Nano (Malvern, UK) analyzer. In vitro release studies were performed using modified Franz type diffusion cells. To evaluate incorporation efficiency of vesicular carriers, first of all, free dexpanthenol was separated from suspension. Amount of dexpanthenol was evaluated by using ultra-high performance liquid chromatography method. Stability of nano-carriers was evaluated by measuring particles size, polydispersion index, pH for 28 days.
Results. The response optimization of experiments was the liposome formulation containing
797,0 mg of PC per 10 mL of preparation. The experimental results of characterization of optimal liposome formulation were in good agreement with those predicted by the optimization software. The characteristics of obtained optimal formulation were: particle size 64,75 ± 0,94 nm, polydispersity index was 0,224 ± 0,006, pH 7,2 ± 0,08, ζ-potential-10,33 ± 1,25 mV. Dexpanthenol release from nano-carriers formulations in vitro was 3,46 ± mg/cm2, the release from dexpanthenol solution was 44,19% higher. Optimized lipid nano-carriers formulations showed no significant differences in their particle size, PDI, pH and ζ-potential after more than 4 weeks under the room temperature.
Conclusions. The optimization procedure allowed formulation of an optimal and stable lipid
nanoparticle based on their size, PDI, ζ-potential, pH, EE and in vitro release. Prepared formulations should be tested for skin penetration for further evaluation of their suitability for their application.
PADĖKA
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, pagalbą ir patarimus rengiant mokslinį darbą nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui, Klinikinės farmacijos katedros vedėjui prof. dr. Vitaliui Briedžiui.
Už pagalbą bei patarimus atliekant mokslinius tyrimus ir rašant magistro baigiamąjį darbą nuoširdžiai dėkoju Klinikinės farmacijos katedros doktorantui Vyčiui Čižinauskui.
SANTRUMPOS
DLD- daugiasluoksnės lipidinės dalelės
DVLD- didelės vienasluoksnės lipidinės dalelės DXP- dekspnatenolis
HLB- hidrofilinis lipoifilinis balansas IE- inkorporavimo efektyvumas
MVLD- mažos vienasluoksnės lipidinės dalelės PAM- paviršinio aktyvumo medžiagos
PC- fosfotidilcholinas
PDI- polidispersiškumo indeksas SM- sfingomielinas
UESC- ultra-efektyvioji skysčių chromatografija UV- ultravioletiniai spinduliai
VDD- vidutinis dalelių dydis
ĮVADAS
Žmogaus oda yra sudėtingas fiziologinis kompleksas, formuojantis veiksmingą barjerą tarp organizmo ir aplinkos. Dėl didelio paviršiaus ploto ir lengvo prieinamumo oda nuolat pažeidžiama įvairių aplinkos dirgiklių, sutrikdančių odos barjero funkciją ir atveriančių kelią daugelio odos ligų atsiradimui. Uždegiminės odos ligos yra vienos iš sparčiausiai augančių ir dažniausiai pasitaikančių ligų įvairiose žmonių populiacijos grupėse. Ieškant efektyvaus gydymo ir alternatyvos vartojamiems vaistams, nuolat auga susidomėjimas įvairiais vaistais nuo uždegimo, tokiais kaip dekspantenolis.
Dekspantenolis, tai alkoholio pantoteno rūgšties analogas, kuris plačiai vartojamas uždegiminių odos ligų, tokių kaip atopinis dermatitas, eritema, gydymui [1, 2]. Tačiau dėl sudėtingo odos barjero pralaidumo šios medžiagos skvarba į gilesnius odos sluoksnius yra ribota. Daugybė tyrimų buvo atliekami naudojant lipidines nanostruktūras kaip alternatyvą, siekiant pagerinti įvairių lokaliai naudojamų vaistinių medžiagų savybes [3, 4, 5], todėl aktualu ištirti įvairių dekspantenoliu inkorporuotų lipidinių nanonešiklių formuluočių poveikį šios medžiagos fizikinėms savybėms, atpalaidavimui ir inkorporavimo efektyvumui.
Lipidinių nanonešiklių panaudojimas odos ligų gydymui pagrįstas lipidinių struktūrų dvisluoksnio ir membranos panašumu. Priklausomai nuo lipidų sudėties lipidinės dalelės geba keisti ląstelės membranos takumą ir jungtis prie jos, tokiu būdu pristatydamos vaistines medžiagas tikslinėms ląstelių sritims [6]. Pagrindinės lipidinių nanonešiklių savybės, kurios daro įtaką jų kokybei, priklauso nuo juos sudarančių komponentų pasirinkimo, todėl reikia atsargiai parinkti juos formuojančias medžiagas.
Tyrimo metu siekiant tinkamai pasirinkti lipidinių nanonešiklių formuluotės komponentus sudaromas optimizavimo planas. Remiantis pagrindiniais optimizavimo kriterijais- fosfolipido kiekiu, nešiklių fizikinėmis-cheminėmis savybėmis, in vitro atpalaidavimu bei inkorporavimo efektyvumu galima pasirinkti optimalią lipidinių nanonešiklių su dekspantenoliu formuluotę.
Darbo tikslas- įvertinanti įvairių lipidinių nanonešiklių formuluočių su inkorporuotu dekspantenoliu fizikines-chemines savybes, stabilumą, dekspantenolio in vitro atpalaidavimą bei inkorporavimo efektyvumą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti įvairių lipidinių nanonešiklių formuluočių su inkorporuotu
dekspantenoliu fizikines savybes, stabilumą, dekspantenolio in vitro atpalaidavimą bei inkorporavimo efektyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Sudaryti optimizavimo planą siekiant atrinkti tinkamą lipidinių nanonešiklių su dekspantenoliu formuluotės komponentų sudėtį.
2. Pagaminti lipidinius nanonešikius ir įvertinti jų fizikines savybes, dekspantenolio in vitro atpalaidavimą ir inkorporavimo efektyvumą.
3. Ištirti dekspantenolio įtaką lipidinių nanonešiklių kokybei. 4. Ištirti lipidinių nanonešiklių stabilumą.
1 LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Lipidinių nanonešiklių taikymas lokaliam gydymui. Dekspantenolis.
Oda yra didžiausias kūno organas, susidedantis iš sudėtinės sluoksnių struktūros formuojančios barjerą tarp organizmo ir aplinkos, kuris apsaugo nuo žalingo įvairių medžiagų poveikio, taip pat ir nuo vandens praradimo. Tačiau šis barjeras yra nuolat pažeidžiamas įvairių aplinkos dirgiklių, sukeliančių odos susirgimus. Įvairūs aplinkos alergenai ir ultravioletinė spinduliuotė yra pagrindiniai faktoriai, sukeliantys dažniausiai pasireiškiančius odos susirgimus, tokius kaip atopinis dermatitas ar eritema [7]. Viena iš dažniausiai pasitaikančių ligų įvairiose žmonių populiacijos grupėse yra atopinis dermatitas. Tai lėtinė uždegiminė odos liga, susijusi su odoshiperaktyvumo reakcijomis į išorinius odos dirgiklius. Ši liga paveikia iki 20 proc. suaugusiųjų ir iki 3 proc. vaikų visame pasaulyje ir nuolat plinta tiek gerai ekonomiškai išsivysčiusiose, tiek vargingesnėse šalyse [8]. Todėl ieškant efektyvaus gydymo ir alternatyvos vartojamiems vaistams šiuo metu auga susidomėjimas nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo, tokiais kaip dekspantenolis. Lyginamojo mokslinio tyrimo metu buvo nustatyta, kad 5 proc. dekspantenolio tepalo veiksmingumas, gydant atopinį dermatitą, yra toks pat, kaip 1 proc. hidrokortizono tepalo [2].
Dekspantenolis (vitaminas B5)- tai kofermento A komponentas, kuris tarnauja kaip daugelis fermento-katalizuojamų reakcijų, kurios svarbios angliavandenių, riebalų, rūgščių, baltymų, sterolių, steroidinių hormonų ir porfirinų metabolizmui, kofermentas. Lokaliai vartojamas dekspantenolis veikia kaip drėkiklis, pagerindamas raginio sluoksnio hidrataciją, mažindamas transepiderminį vandens netekimą ir išlaikydamas odos švelnumą ir elastingumą. Taip pat, dekspantenolis aktyvina fibroblastų proliferaciją, kuri skatina žaizdų gijimą. Dekspantenolis pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, ypatingai esant ultravioletinių spindulių sukeltai odos eritemai ir atopiniam dermatitui. Vitaminas B5 yra plačiai vartojamas lokaliai kaip vaistinis preparatas įvairiose formose, pvz. tirpalų, aerozolių, kremų ir tepalų pavidalu. Tačiau ekspermentinių ir klinikinių tyrimų rezultatai parodė, kad dekspantenolis, vartojamas kremo formoje, sunkiai prasiskverbia iki reikiamo odos sluoksnio ir neatpalaiduoja pakankamai vaistinės medžiagos uždegimo apimtose srityse ir taip nepasiekia reikiamo terapinio efekto, ypač nuo ultravioletinių spindulių poveikio [1].
Taip yra todėl, kad daugybė vaistų negali prasiskverbti į odą dėl sudėtingo jos pralaidumo [9, 10, 11]. Odos barjero funkciją atspindi jos daugiasluoksnė struktūra, sudaryta iš kelių anatomiškai skirtingų sluoksnių: raginio sluoksnio, epidermio ir dermos. Išorinis odos sluoksnis, raginis sluoksnis, sudarytas iš kondensuotų keratinocitų, apsuptų lipidų dvisluoksnio, sudaro barjerą daugelio vaistų absorbcijai. Šis sluoksnis, priešingai nei kiti gilesni hidrofiliniai epidermio sluoksniai, yra ypač
hidrofobinis. Todėl, norint pasiekti veiksmingą absorbciją,vaistas turi išlaikyti afinitetą tiek lipidinei, tiek vandeninei aplinkai. Norint vaistinei medžiagai pasiekti odos kapiliarines kilpas ir būti sistemiškai absorbuotai, molekulės turi būti tinkamo poliškumo, dydžio, stabilios ir nežymiai surištos su odos baltymais [12]. Dar vienas iš galimų lokaliai vartojamų vaistų trūkumų tai, kad fermentų, tokių kaip peptidazių ir esterazių, buvimas odoje gali metabolizuoti vaistinę medžiagą į terapiškai neaktyvią formą taip sumažinant vaisto veiksmingumą [9].
Tačiau per pastarąjį dešimtmetį atsirado daugybė naujų metodų, skirtų optimizuoti ir palengvinti vaistinių medžiagų pernašą odoje. Lipidinių nanonešiklių formuluočių taikymas vaistinių medžiagų pernašai susilaukė daug dėmesio [9, 13]. Fosfolipidinių nanonešiklių panaudojimas odos ligų gydymui pagrįstas lipidinių struktūrų dvisluoksnio ir membranos panašumu. Priklausomai nuo lipidų sudėties lipidinės dalelės geba keisti ląstelės membranos takumą ir jungtis prie jos, tokiu būdu pristatydamos vaistines medžiagas tikslinėms ląstelių sritims [6]. Lipidinių nanodispersijų, kaip vaistinių medžiagų pernešimo sistemų funkcijos, yra kontraversiškos, sukeliančios skirtingą poveikį organizmui. Jos gali kontroliuoti vaistinės medžiagos atpalaidavimą. Kai vaistinės medžiagas turinčios lipidinės nanostruktūros yra dedamos ant odos, jos susilieja su ląstelių membranomis ir įterptos vaistinės medžiagos yra atpalaiduojamos į odos ląsteles taip sumažinamas vaistinės medžiagos prasiskverbimas į gilesnius odos sluoksnius, siekiant mažinti sisteminę vaisto absorbciją ir užtikrinant vietinį terapinį poveikį. Taip pat galima pagerinti terapinės medžiagos absorbciją pro įvairius odos sluoksnius, užtikrinant sisteminį vaisto poveikį. Dėl tokio įvairaus poveikio šių nanostruktūrų veikimo mechanizmas, transportuojant vaistines medžiagas, yra sudėtingas ir plačiai tyrinėjamas [14].
Daugybė tyrimų buvo atliekami naudojant lipidines nanostruktūras kaip alternatyvą, siekiant pagerinti įvairių lokaliai naudojamų vaistinių medžiagų, tarp jų ir dekspantenolio, savybes [3, 4, 5]. Kelių tyrimų metu dekspantenolis buvo ruošiamas derinyje su lipidų mišiniu nanokoloidinėje formuluotėje. Klinikiniai tyrimai parodė šios lipidų ir dekspantenolio formuluotės veiksmingumą ir pranašumą jautrios odos priežiūrai bei atopinio dermatito gydymui lyginant su įprastine vaisto forma [15]. Buvo nustatyta, kad toks preparatas perneša didesnį dekspantenolio kiekį, nesukeldamas pašalinio poveikio bei užtikrindamas ilgesnį tolygų vaistinės medžiagos atpalaidavimą. Taip pat pasiekiama stipresnio drėkinamojo bei priešuždegiminio poveikio. Kito tyrimo metu buvo siekiama padidinti dekspantenolio apsauginį veiksmingumą nuo ultravioletinės spinduliuotės. Buvo įrodyta, kad dekspantenoliu inkorporuotos nanostruktūros buvo žymiai pranašesnė lyginant su placebu, gydanat ultravioletinių spindulių sukeltą eritemą [16]. Šių tyrimų rezultatais remiantis galima teigti, kad dekspantenolio inkorporavimas į lipidinius nanonešiklius yra svarbus veiksnys, didinantis šios medžiagos efektyvumą odos ligų gydymui. Dėl nuolat tobulėjančio nanodispersinių sistemų pritaikymo vaistinių medžiagų pernešimui ir didėjančio dekspantenolio poreikio yra aktualu ištirti įvairių
dekspantenoliu inkorporuotų lipidinių nanonešiklių formuluočių poveikį šios medžiagos fizikinėms, cheminėms savybėms, atpalaidavimui ir inkorporavimo efektyvumui.
1.2 Lipidiniai nanonešikliai
Vaistų pernašos sistemos mokslinėje literatūroje apibūdinamos kaip formuluotės, gebančios pernešti terapines medžiagas į organizmą, pagerinančios jų veiksmingumą bei saugumą, leidžiančios kontroliuoti vaistinės medžiagos atpalaidavimo organizme kiekį, laiką ir vietą. Lipidiniai nanonešikliai dažniausiai naudojami kaip vaistų pernašos sistemos, dėl savo unikalių savybių, tokių kaip dalelės paviršiaus ir ploto santykis, kuris yra daug didesnis nei kitų koloidinių dalelių, bei gebėjimas absorbuoti ir pernešti įvairius junginius [17]. Šios nanosistemos- tai mikrodalelių koloidiniai nešikliai, susiformuojantys tuomet, kai tam tikri lipidai yra hidratuoti vandeninėje terpėje. Jie susideda iš mažų, uždarų skystųjų skyrių, nuo juos supančios aplinkos atskirtų, vienu ar keliais lipidų dvisluoksniais [18]. Šios mažos sferinės sistemos pagamintos iš tos pačios medžiagos kaip ir ląstelės membrana. Lipidiniai nešikliai gali būti pripildyti vaistinėmis medžiagomis ir naudojami jų pernešimui gydant įvairias ligas [19].
Lipidiniai nanonešikliai pirmą kartą paminėti hematologo Alec D. Bangham ir kolegų ,1964m. pranešusių apie netikėtai susiformavusias lipidines daleles. Šios dalelės buvo pavadintos „Bangasomomis“ mokslininko, išradusio liposomas, garbei. 1968 m. mokslininkas Weissmann pristatė labiau tinkantį terminą „liposomos“ [20]. Pats pavadinimas liposoma yra kilęs iš graikų kalbos: žodis „Lipos“ reiškia riebalą ir žodis „Soma“ – kūną [19]. Mokslinėje literatūroje liposoma apibrėžiama kaip dirbtinė mikroskopinio dydžio pūslelė, sudaryta iš centrinio vandeninio skyriaus, apsupto vienu ar daugiau fosfolipidų sluoksnių, kurioje gali būti įterptos hidrofilinės, hidrofobinės ir amfoterinės medžiagos, taip leidžiančios liposomas pritaikyti medicinoje [21]. Lipidinių nanonešiklių savybės priklauso nuo gamybos metodo ir naudojamų medžiagų. Šių transporto sistemų formuluotės paprastai susideda iš natūralių arba sintetinių fosfolipidų ir cholesterolio, taip pat gali turėti ir lipoproteinų [22]. Dėl formuluočių įvairovės lipidinės pernašos sistemos yra universalios tiek hidrofilinių, tiek hidrofobinių vaistinių medžiagų transportavimui.
1.3 Lipidinių nanonešiklių struktūros ypatybės
Lipidinės nanodispersinės sistemos, tai struktūros, sudarytos iš amfifilinių junginių, disperguotų vandeninėje terpėje. Šių molekulių poliarinės galvos grupės sąveikauja su vandeniu, o hidrofobinės lipidų molekulių dalys, kurios linkusios jungtis tarpusavyje, išsidėsto aplink vandeninę terpę, formuodamos dvisluoksnio struktūras. Lipidinių nanonešiklių dvisluoksnis sudaro fizinį barjerą ,apsaugantį nuo didelių, krūvį turinčių ,ar mažų, polinių molekulių, difuzijos į membraną. Dėl santykinio
tirpumo vandenyje ir lipiduose mažos nepolinės molekulės gali praeiti pro membraną į vandeningą lipidinių struktūrų dalį, mažiau tirpios vandenyje, gali būti įterptos į membraną [23, 24, 25].
Lipidinių nanonešiklių formuluotės komponentų pasirinkimas nulemia svarbiausias lipidinės dalelės savybes: tvirtumą, stabilumą bei dvisluoksnio krūvį, kurios daro įtaką nešiklių kokybei. Todėl gaminant šias nanodispersines sistemas reikia atsargiai parinkti jas formuojančias medžiagas.
1.3.1 Fosfolipidai
Fosfolipidai yra pagrindinis lipidines nanodaleles formuojantis komponentas. Nanodalelių gamyboje yra naudojami įvairios kilmės fosfolipidai. Fosfolipidai- tai lipidai, kurių sudėtyje yra fosforo, poliarinės ir ne poliarinės struktūros elementų. Pagal alkoholių grupes, esančias fosfolipidų sudėtyje, jie gali būti skirstomi į glicerofosfolipidus ir sfingomielinus. Glicerofosfolipidai- tai pagrindiniai eukariotinių ląstelių fosfolipidai, kurių struktūros pagrindą sudaro glicerolis [26]. Tai amfipatinės molekulės, kurių struktūroje glicerolio tiltelis jungia hidrofobines grandines ir hidrofilines poliarines grupes, turinčias fosfato grupę. Hodrofilinę molekulės dalį (galvutę) sudaro 2-etilamonio fosfato fragmentas, o hidrofobinė molekulės dalis (uodegėlė) susideda iš dviejų, sočiųjų ar nesočiųjų riebalų rūgščių, esterifikuotų angliavandenilių grandinių, kurių ilgis gali siekti nuo 10 iki 28 anglies atomų. Riebalų rūgščių liekanos lipidų molekulėje pobūdis nulemia dvigubų jungčių grandinėje skaičių, kuris atsakingas už pagrindines dvisluoksnio savybes, tokias kaip fosfolipido elastingumas ir fazinio virsmo temperatūra [27]. Fosfatinės galvutės grupės padėtis nulemia skirtingas fosfolipidų rūšis, tokias kaip fosfotidiletanolaminas (PE), fosfotidilserinas (PS), fosfotidilcholinas (PC), fosfotidilglicerolis (PG) [28].
Sfingomielinai savo struktūra gana panašūs į glicerofosfolipidus, tačiau turi keletą esminių skirtumų- SM struktūros pagrindą sudaro ne glicerolis, o sfingosinas, taip pat SM molekulėje daugiau hidrofobinių sričių lyginant su PC [24].
Daugybė skirtingų lipidų tipų ir lipidų mišinių gali būti naudojami tam, kad būtų gaunamos tam tikros lipidinių nanonešiklių rūšys. Lipidinių nanonešiklių gamyboje dažniausiai naudojami natūralios kilmes fosfolipidai, kurių pagrindiniai šaltiniai yra augaliniai aliejai, tokie kaip sojos, kukurūzai, saulėgrąžos, rapsai ir gyvūnų audiniai. Dėl brangaus ir sudėtingo sintezės proceso rečiau yra naudojami sintetiniai ir pusiau sintetiniai fosfolipidai [24].
Renkantis fosfolipidus, kaip lipidinių nanonešiklių struktūros pagrindą, svarbu atkreipti dėmesį į grynumo laipsnį bei fazinio virsmo temperatūrą, nes nuo šių savybių priklauso pagrindinės gauto produkto savybės, tokios kaip dalelių dydis, pasiskirstymas, dvisluoksnio tvirtumas bei inkorporavimo efektyvumas.
1.3.2 Cholesterolis. Lipidinių nanonešiklių stabilumas
Lipidinėse nanostruktūrose gali atsirasti cheminiai ir fizikiniai pakitimai, kurie sutrumpina jų galiojimo laiką, apriboja vaisto stabilumą ir sunkina laikymo sąlygas [29]. Šių pernašos sistemų stabilumas gali būti suskirstytas į tarpusavyje susijusius fizikinį, cheminį ir biologinį stabilumą. Kadangi, dažniausiai fosfolipidai formuoja dvisluoksnio pagrindą, jų cheminis stabilumas yra svarbus. Dviejų tipų cheminės reakcijos gali turėti įtakos fosfolipidų dvisluoksnio kokybei: esterio jungčių prisijungimas riebalų rūgštimis prie glicerolio pagrindo ir nesočiųjų acilo grandinių peroksidacija. Lipidų oksidacija ir hidrolizė gali sukelti trumpos grandinės lipidų pakitimus, dėl kurių tirpūs dariniai gali formuoti membraną ir atitinkamai sumažinti lipidinių produktų kokybę [30]. Oksidacijos lygis gali būti išlaikytas iki minimumo imantis tam tikrų priemonių, pvz., naudojant šviežiai išvalytus lipidus ir šviežiai distiliuotus tirpiklius, vengiant procedūrų aukštoje temperatūroje, parenkant gamybos metodus, nenaudojančius deguonies, pašalinant deguonį iš vandeninių tirpiklių naudojant azotą, laikant lipidų suspensijas inertiškoje atmosferoje [30, 31].
Fizikiniai procesai, tokie kaip agregacija/flokuliacija ir fuzija/koalecencija, taip pat daro įtaką lipidinių nešiklių produktų galiojimo trukmei [30]. Biologinis lipidinių sistemų stabilumas priklauso nuo to, kaip baltymai sąveikauja su jais ir nuo jų patekimo į organizmą būdo. Metodai, naudojami sustiprinti lipidinių dalelių biologinį stabilumą, pagerina lipidinių nanonešiklių tarpininkaujamą vaistinės medžiagos paskirstymą in vivo ir padidina cirkuliacijos kraujyje trukmę [32].
Siekiant sumažinti šias problemas, yra naudojami įvairūs lipidų membranos struktūros komponentai, galintys keisti dvisluoksnio savybes. Sterolai, dažniausiai naudojamos medžiagos ,gerinančios membranos tvirtumą ir stabilumą. Cholesterolis yra labiausiai paplitęs sterolas žinduolių membranose, kuris dažniausiai naudojamas lipidinių nanonešiklių gamyboje. Cholesterolio molekulės yra fosfolipidai su tricikliu žiedu, įterptu tarp dviejų pirmų riebalų rūgščių acilo grandinių, anglies atomų [29]. Šis sterolas sumažina vandenyje tirpių molekulių pralaidumą pro membraną, gerina jos tvirtumą ir membranos dvisluoksnio stabilumą biologiniuose skysčiuose, tokiuose kaip kraujas/plazma [21]. Taip pat cholesterolis apsaugo nuo lipidinių nanonešiklių ir kraujo baltymų, tokių kaip albuminas, m- trasferinas, makroglobulinas, tarpusavio sąveikos ir destabilizacijos. Šios sąveikos su kraujo baltymais sumažėjimas sąlygoja sumažėjusį rišimąsi su plazmos opsoninais, atsakingais už greitą lipidinių sistemų klirensą iš sisteminės kraujotakos [33]. Įvairios cholesterolio kompozicijos variacijos gali turėti didelį poveikį lipidinių dalelių formavimuisi, membranos stabilumui ir pralaidumui. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad 30 mol proc. cholesterolio inkorporavimas į lipidinius nanonešiklius pašalina fazinį diacilfosfolipidų virsmą, sumažina membranos pralaidumą ir verčia dvisluoksnį į stabilų, gelį primenantį būvį. Mažesnės už 30 mol proc. cholesterolio koncentracijos ne visiškai stabilizuoja fosfolipidų dvisluoksnį, o didesnės už 50 mol proc. atskiria membraną ir sudaro kristalus [34]. Todėl norit gauti
stabilias nanodispersines sistemas reikia tinkamai pasirinkti cholesterolio koncentracijas, atsižvelgiant į gamyboje naudojamo lipido kiekį.
1.3.3 Paviršinio aktyvumo medžiagos
Paviršinio aktyvumo medžiagos (PAM) naudojamos, kaip lipidų dvisluoksnio minkštinimo komponentai, kurių dedama į lipidinių nanodalelių formuluotes, siekiant padidinti lipidų dvisluoksnio lankstumą ir pralaidumą [35]. Šios medžiagos yra amfipatinės molekulės, sudarytos iš nepolinės hidrofobinės dalies, dažniausiai tiesios arba šakotos hidro anglies ar fluoro anglies grandinės, susidedančios iš 8-18 anglies atomų, prijungtos prie hidrofilinės molekulės dalies. PAM, inkorporuotos į lipidų dvisluoksnį, dažniausiai jį destabilizuoja, sumažindamos jo paviršiaus įtempimą [35]. Norint pasiekti norimų rezultatų, yra naudojami įvairūs PAM tipai. Pavyzdžiui, naudojant paviršiaus aktyvatorius, pasižyminčius stipresnėmis hidrofobinėmis savybėmis, gaunamos mažesnio dydžio lipidinės dalelės. Hidrofilinės PAM dėl didelio tirpumo vandenyje nepasiekia koncentruotos sistemos būsenos, leidžiančios sudaryti sąlygas laisvai hidratuoti agregatus ir formuoti vienasluoksnę struktūrą [36]. Tuo tarpu daugelis nejoninės kilmės paviršinio aktyvumo medžiagų, tokių kaip tween 80, eksponuoja žemą neigiamą zeta potencialą [37].
Tinkamas PAM pasirinkimas lipidinių pūslelių formuluotėms vykdomas, atsižvelgiant į hidrofilinio lipofilinio balanso (HLB) vertę. HLB - geras rodiklis, rodantis medžiagos sugebėjimą suformuoti pūsleles, HLB vertė tarp 4 ir 8 tinkamiausia lipidinės sistemos formavimuisi [36]. PAM fazinio virsmo temperatūra taip pat daro įtaką vaistinių medžiagų inkorporavimo į pūsleles efektyvumui. Spanai (Span 40, Span 60), turintys aukščiausią fazinio virsmo temperatūrą, sąlygoja didžiausią vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumą [36]. Tinkamas PAM parinkimas lipidinių nanonešiklių formuluotei gali padidinti inkorporuojamos medžiagos efektyvumą. Taigi, pagrindiniai lipidinių nanosistemų komponentai yra fosfolipidai, stabilizuoti cholesteroliu, kartais yra dedama stabilizatorių mišinių priklausomai nuo konkretaus fosfolipidinio nešiklio panaudojimo.
1.4 Lipidinių nanonešiklių klasifikacija
Nepriklausimai nuo monomero pobūdžio (fosfolipidas, paviršinio aktyvumo medžiaga, ar polimeras) susidariusios lipidinės nanodispersijos gali turėti skirtingą morfologiją ir dydį. Veiksniai, tokie kaip temperatūra, pH, joninė tirpalo būklė, monomero koncentracija ir gamybos metodas, daro įtaką įvairių struktūrų formavimuisi.
Lipidiniai nanonešikliai dažniausiai klasifikuojami atsižvelgiant į jų struktūros pagrindą ar į gamybos metodą [29, 38].
I. Klasifikacija, atsižvelgiant į struktūros savybes.
Lipidinių nanonešiklių dydis svyruoja nuo labai mažų (0,025μm) iki didelių (2,5 μm) dalelių, turinčių vienasluoksnes ar dvisluoksnias membranas. Lipidinių nanodispersijų dydis ir membranos fosfolipidų dvisluoksnių skaičius daro didžiulę įtaką vaistinės medžiagos inkorporavimo nanonešiklių sistemose efektyvumui. Atsižvelgiant į lipidinių nešiklių dydį ir fosfolipidų dvisluoksnių skaičių, jos skirstomos į 2 pagrindines grupes:
1. Daugiasluoksnės lipidinės dalelės (DLD). Šios lipidinės dalelės turi svogūną
primenančią struktūrą ir yra sudarytos iš daugiau nei vieno fosfolipidų dvisluoksnio. Jų dydis svyruoja nuo 100 μm iki kelių mikrometrų, priklausomai nuo jų paruošimo būdo. Dažniausiai kelios vienasluoksnės struktūros formuojasi viena kitos viduje, sudarydamos daugiasluoksnę fosfolipidų sritį, atskirtą vandens sluoksniais.
2. Vienasluoksnės. Tai lipidinės dalelės, turinčios vieną fosfolipidų dvisluoksnį, apgaubiantį vandeninę terpę. Jos gali būti suskirstytos į dvi kategorijas:
Didelės vienasluoksnės lipidinės dalelės (DVLD). Dalelių dydis nuo o 100 μm iki kelių mikrometrų.
Mažos vienasluosnės lipidinės dalelės (MVLD). Dalelių dydis nuo 20 iki 100 μm [25]. II. Klasifikacija, atsižvelgiant į gamybos metodą:
1. REV- vienąsluoksnės lipidinės dalelės, pagamintos atvirkštinių fazių išgarinimo metodu. 2. VLD/REV- vienasluoksnės lipidinės dalelės, pagamintos atvirkštinių fazių evaporacijos
metodu.
3. FPV-lipidinės dalelės, paruoštos prancūziško presu. 4. DRV-dehidracijos-rehidracijos vezikulės [38].
Nanodalelių dydis, taip pat kaip kitos fizikocheminės savybės, gali paveikti šių sistemų vaistinių medžiagų transportavimo efektyvumą [11]. Remiantis moksline literatūra, mažos vienasluoksnės lipidinės dalelės (MVLD), kurių diametras nuo 25-50 μm, yra mažiau tinkamos vaistų pernašai dėl savo mažo stabilumo ir talpos, kuri yra per maža įterpti vaistines medžiagas. Lipidinių nanodalelių skvarba į odos raginį sluoksnį mažėja didėjant dalelių diametrui [39]. Todėl tinkamiausios struktūros vaistinių medžiagų pernašai yra didelės vienasluoksnės lipdinės dalelės (DVLD), kurių diametras siekia nuo 50- 500 μm.
1.5 Lipidinių nanonešiklių gamybos metodai
Lipidinių nanodispersijų gamybos metodus galima suskirstyti atsižvelgiant į jų gamybos
strategijas, literatūroje išskiriami trys pagrindiniai lipidinių nanonešiklių gamybos metodai [40, 41]: 1. Mechaniniai metodai
2. Metodai, pagrįsti organinio tirpiklio pakeitimu 3. Metodai, pagrįsti detergentų pašalinimu
1.5.1 Mechaniniai metodai
Lipidų formuluočių savybės gali kisti priklausomai nuo jų sudėties ( katijoninės, anijoninės ir neutralios lipidų rūšies). Tas pats paruošimo metodas gali būti naudojamas visiems lipidiniams nešikliams nepriklausomai nuo jų kompozicijos. Bendrieji lipidinių dalelių mechaniniai paruošimo procedūros etapai yra hidratacija su maišymu ir tolygus lipidinių dalelių dydžio paskirstymas [26].
Hidratacija plonu lipidų sluoksniu. Hidratacija plonu lipidų sluoksniu, dar kitaip vadinamas
Bangham metodas, vienas iš pirmųjų naudojamų lipidinių nanonešiklių gaminimui [42]. Šio metodo metu fosfolipidų ir cholesterolio mišinys yra tirpinamas organiniame tirpiklyje, kuris pašalinamas išgarinimo būdu ( naudojant rotacinį garintuvą). Tuomet sausa lipidų plėvelė nusėda ant kolbos sienelių, hidratuojant vandeniniu buferiniu tirpalu ir esant temperatūrai aukštesnei už lipidų fazinio virsmo temperatūrą. Šio metodo gauti, disperguoti vandeniniame buferyje fosfolipidai sudaro nevienalytes lipidines struktūras, kurių dydis yra 1-5 μm skersmens [21]. Tokių lipidinių nešiklių dydis yra mažinamas ultragarsu [43] ar išspaudimu pro polikarbonato filtrus [44], formuojant mažesnes ir vienalytiškesnes mikrodaleles [21].
B. V. Mitkari ir kt. paruošė flukonazolu inkorporuotas liposomas taikydami hidratacijos plonu lipido sluoksniu metodą. Pagamintos liposomų dispersijos buvo tiriamos ir rezultatai parodė, kad įvairūs kintamieji, tokie kaip fosfolipido ir stabilizatoriaus kiekis, turėjo didelį poveikį dalelių dydžiui ir inkorporavimo efektyvumui. Lokalaus naudojimo liposominis flukonazolo gelis, turintis 2% veikliosios medžiagos, buvo paruoštas naudojant carbopol 934 kaip gelį formuojančią medžiagą. Tyrimų duomenimis, flukonazolo liposomų dispersijos geliai pasiekė geresnę veikliosios medžiagos skvarbą į gilesnius odos sluoksnius, lyginant su įprastine farmacine kompozicija [45].
Hidratacijos plonu lipido sluoksniu metodas turi kelis privalumus. Jis gali būti naudojamas įvairiems skirtingos rūšies lipidų mišiniams. Taip pat šis metodas yra lengvai atliekamas ir yra pasiekiamas aukštas lipidų ir vandenyje tirpių medžiagų inkorporavimo efektyvumas. Tačiau esminis metodo trūkumas yra tas, jog sunku atlikti didelės apimties dalelių gamybą (reikalingi didelės talpos indai- kolbos iki 10 litrų). Be to procesas užima daugybę laiko ir sąnaudų dėl papildomų gamybai rekomenduojamų procesų [41].
Homogenizavimo metodai
Išspaudimas (Ekstruzija). Vienas iš lipidinių nanodalelių dydžio sumažinimo metodų, yra
išspaudimas. Taikant šį metodą, lipidinės struktūros yra praleidžiamos pro membranas. Išspaudimas pro polikarbonato filtrus buvo pirmą kartą publikuotas mokslininkų Olson ir kt. [46]. Mayer ir kt. tyrė kokią įtaką lipidų sudėtis daro išspaudimui ir membranų savybėms. Priklausomai nuo įrenginio naudojamo šio metodo metu ir proceso masto, membranų skersmuo gali svyruoti nuo 25 iki 142 μm. Visiems dalelių mažinimo metodams, lipidinės dalelės turi būti išstumiamos esant žemesnei temperatūrai, negu lipidų kompozicijos fazinio virsmo temperatūra.
Ultragarso metodas. Tai vienas plačiausiai naudojamų metodų mažų vienasluoksnių lipidinių
nanonešiklių, kurių dydis siekia nuo 15-25 μm, gamybai. Fosfolipidų vandeninė dispersija yra veikiama ultragarsu, naudojant dviejų tipų homogenizatorius [40]:
a) Homogenizatorius su įleidžiamu zondu. Naudojant šio tipo homogenizatorių, lipidų dispersiją yra tiesiogiai veikiama ultragarso. Naudojamos didelės energijos amplitudės, todėl lipidinės dalelės turi būti nuolat vėsinamos. Taip pat nuo homogenizatoriaus zondo, gali nusilupti titano dalelės ir užteršti lipidų tirpalą.
b) Ultragarsinė vonelė. Liposomų dispersija yra talpinama cilindro formos inde į ultragarsinę vonelę. Kontroliuoti lipidų dispersijos temperatūrą homogenizavimo metu, taikant ši metodą yra gana lengva. Homogenizavimo metu užtikrinamos sterilios sąlygos [47].
Pagrindinis šio metodo trūkumas, tai kad metodo metu galima fosfolipidų ir inkorporuojamų medžiagų degradacija, didelių molekulių eliminacija, ir zondo sukeliama metalo dalelių taršą [40, 25].
Mechaniniai lipidinių mikrodalelių gamybos metodai yra puikus pasirinkimas siekiant nedideliais kiekiais pagaminti mažas, vienalytes lipidines nešiklių struktūras, pasižyminčias dideliu vaistines medžiagos inkorporavimo efektyvumu. Tačiau vienas iš didžiausių šio metodo trūkumų, jog negalima didelio masto lipidinių nanonešiklių gamyba.
1.5.2 Metodai pagrįsti organinio tirpiklio pakeitimu
Taikant šiuos metodus lipidai yra tirpinami organiniame tirpale, kuris paskleidžiamas į vandeninę fazę, kurios sudėtyje yra į lipidines daleles inkorporuojama vaistinė medžiaga. Šie metodai yra dviejų tipų [40]:
Atvirkštinių fazių išgarinimas. Šio metodo metu, lipidai yra hidratuojami, juos tirpinant
organiniame tirpiklyje, ir po to įvedami į vandeninę fazę. Organinis tirpiklis negali maišytis su vandenine faze, todėl tinkama terpė yra aliejus/vandenyje tipo emulsija, kuri yra skiedžiama su vandenine faze, siekiant formuoti lipidines nanosistemas [48]. Šiuo būdu gauti lipidiniai nanonešikliai yra 30 kartų didesni nei ultragarsu susmulkintos dalelės. Šio metodo privalumas yra tas, kad šiose lipidiniuose
nešikliuose yra didelė vandeninės fazės dalis, siekianti iki 62%, todėl šių mikrodispersinių sistemų inkorporavimo efektyvumas yra didelis (daugiau negu 50%), net ir stambiamolekulių agregatų [40, 41, 49]. Šio metodo pagrindinis trūkumas yra tas, kad didelio masto gamyba, gali būti įvykdoma, tik turint reikiamo dydžio maišymo įrenginius skirtus emulsijos gamybai, ir tinkamus siurblius skiedimo procesui [41].
Tirpiklio injekcija. Tirpiklio injekcijos metodo metu, lipidai yra ištirpinami organiniame tirpiklyje (dažniausiai etanolyje arba eteryje), vėliau lipidų tirpalai yra injekuojami į vandeninę terpę, formuojant lipidinius nanonešiklius [21].
Etanolio injekcijos metodas. Pagrindinis etanolio injekcijos metodo principas yra tai, kad mažų
lipidinių nanodalelių (iki 100 nm), tolygus pasiskirstymas gali būti pasiektas tiesiogiai injekuojant etanolinį lipidų tirpalą į vandenį, nenaudojant išspaudimo, ar ultragarso [50]. Šis metodas pirmą kartą aprašytas 1970 m, Batzri ir Korn [51], kaip alternatyva mažų vienasluoksnių nanodalelių gamybai ultragarso pagalba. Mokslininkai atlikę eksperimentus naudojant mažą lipidų koncentraciją, gavo mažo dydžio lipidines struktūras su mažu vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumu. Toliau darbus šioje srityje tęsė daugybė mokslininkų, taikant skirtingus etanolio injekavimo būdus.
Wagner ir kt., tai pat intensyviai dirbo šioje srityje, vystydami kryžminio- srauto injekcijos sistemą. Remdamiesi etanolio injekcijos technika, jie sukūrė parametrų dydžio reguliuojamą, sterilų gamybos metodą, nuo įprastinio periodinio gamybos proceso vedantį į nepertraukiamą technologijos procesą [52]. Pagrindinis šio metodo elementas, specialiai sukurtas kryžminio-srauto injekcijos modelis [53]. Jis sugeba nustatyti ir apibūdinti injekcijos srautus, ir sudaro galimybes steriliai lipidinių dalelių gamybai nepriklausomai nuo jos apimties. Visos medžiagos, tokios kaip buferiniai tirpalai, lipidų etanolio tirpalai, nustatant įpurškimo slėgį yra perkeliamos į sterilizuotą sistemą naudojant 0,2 μm filtrus, užtikrinant aseptines gamybos sąlygas [54]. Lipidinių mikrodalelių dydis, gali būti kontroliuojamas pagal vietinę lipidų koncentraciją injekcijos vietoje, kurią apibūdina lipidų koncentracija etanolyje, injekcijos skersmuo, injekcijos slėgis ir srauto tekėjimo greitis vandeninėje fazėje. Keičiant šiuos parametrus, galima paruošti įvairaus dydžio lipidines struktūras. Tam tikro proceso parametrai gali būti atkuriami, atsižvelgiant į pagamintos dalelės skersmenį ir vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumą [55].
Vienas iš šio metodo privalumų, yra gebėjimas inkorporuoti daugybę skirtingų vaistinių medžiagų, tokių kaip dideli hidrofiliniai proteinai, ar mažos amfifilinės medžiagos [56]. Pagrindinis etanolio injekcijos trūkumas yra tai, kad nevienalytes lipidinės dalelės yra labai praskiestos, o etanolį pašalinti yra sunku, nes jis sudaro azeotropą su vandeniu [25].
Eterio injekcijos metodas . Eterio injekcijos metodas nuo etanolio injekcijos skiriasi tuo, kad
eteris, kitaip nei etanolis, nesimaišo su vandenine faze. Šio proceso metu lipidų tirpalas ištirpinamas eterio-etanolio mišinyje ir palaipsniui suleidžiamas į vandeninį tirpalą, kuris turi būti šildomas nuo 55°C
iki 65°C tam, kad tirpiklis būtu pašalinamas iš lipidinio produkto. Metodas apima eterio-lipido tirpalo injekavimą į pašildytą, virš eterio virimo temperatūros, vandeninę fazę. Eteris išgaruoja susidūrus su vandenine faze, ir disperguoti lipidai formuoja pirmines vienasluoksnes lipidines pūsleles. Eterio injekcijos metodo pranašumas, lyginant su etanolio injekcijos metodu, yra tas kad tirpiklio pašalinimas nuo produkto, leidžia procesui tęstis ilgą laiką formuojant koncentruotus lipidinius produktus su dideliu vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumu [21, 25]. Pagrindinis metodo trūkumas, kad gaunama nevienalytė sistema ir medžiagos turi būti inkorporuojamos į organinius tirpiklius esant aukštai temperatūrai.
1.5.3 Metodai pagrįsti detergentu pašalinimu
Taikant šias lipidinių nanonešiklių paruošimo procedūras, detergentai, tokie kaip, tulžies
druskos arba alkilglikozidai, yra naudojami lipidų tirpinimui micelinėse sistemose. Priešingai negu lipidai, detergentai yra gerai tirpūs tiek vandeninėje, tiek organinėje terpėje. Susidariusių lipidinių mikrodalelių dydis ir forma priklauso nuo detergento cheminės prigimties ir koncentracijos, taip pat kaip ir nuo gamyboje naudojamų lipidų savybių [41]. Dažniausios procedūros, naudojamos detergento pašalinimui nuo micelių, yra skiedimas [57], gelio chromatografija [58] ir dializė pro tuščiavidurį pluoštą [59], arba pro membraninius filtrus [41, 60].
Šių metodų privalumas tas, kad gaunamas platus lipidinių nešiklių dalelių dydžio diapazonas (40-180 nm), ir didelis vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumas. Tačiau, šie metodai reikalauja didelių organinių tirpiklių kiekių ir visiško jų pašalinimo, nes yra kenksmingi aplinkai ir žmogaus sveikatai. Be to, šie metodai susideda iš daugelio etapų reguliuojančių lipidinių mikrodispersijų dalelių dydį ir vienalytiškumą, kurie reikalauja didelio kiekio energijos, todėl masinei gamybai netinkami [21].
Daugybė atrastų lipidinių nanonešiklių gamybos metodų, daugiausia pritaikyta laboratoriniams gamybos tikslams, dėl to didelio masto lipidinių mikrodalelių sistemų gamyba yra sudėtingas ir retai įgyvendinamas procesas.
1.6 Lipidinių nanonešiklių charakterizavimas
Lipidinių nanonešiklių savybių charakteristika yra būtina norint įvertinti pagaminto produkto kokybę.
1.6.1 Dalelių dydžio analizė
Apibūdinant lipidines nanodaleles, pirmiausia įvertinamas dalelių dydžio pasiskirstymas ir morfologija. Dalelių dydis daro didelį poveikį vaistinės medžiagos atpalaidavimui iš lipidinių sistemų: kuo mažesnio dydžio nanodalelės tuo didesnis jų paviršiaus plotas, sąlygojantis greitą vaisto atpalaidavimą. Didėjant analitinių priemonių pažangai, įvairūs metodai yra prienami norint nustatyti lipidinės sistemos nanostruktūrų dydį.
Fotonų koreliacijos spektroskopija (FKS), arba dinaminės šviesos sklaidos metodas.
Populiariausias ir greičiausias metodas, naudojamas lipidinių nanonešiklių dalelių dydžio analizei, fotonų koreliacijos spektroskopija, kitaip vadinama dinaminės šviesos sklaidos metodu. Šis metodas remiasi Brauno dalelių judėjimu. Atliekant matavimus yra nustatomas pro mėginį praėjusios šviesos išsklaidymo intensyvumas, gauti signalai apdorojami ir gaunami grafikai, kurias remiantis nustatomas dalelių dydis mėginyje [61, 62].
Skenavimo elektronų mikroskopija (SEM). Ši elektronų mikroskopija pagrįsta technika nustato
dalelių dydį, formą ir paviršiaus morfologiją tiesiogiai vizualizuojant nanodaleles. Nors šis metodas turi keletą privalumų, tačiau SEM teikia ribotą informaciją apie dalelių dydžio pasiskirstymą. SEM metodo metu, lipidinių nanodalelių tirpalas turi būti paverčiamas į sausus miltelius. Sausi milteliai montuojami ant mėginio laikiklio, kuris padengiamas laidžiuoju metalu (pvz. auksu). Tuomet visas mėginys analizuojamas daleles kryptingai skenuojant elektronų srautu [63]. Šis metodas nėra populiarus, nes užima daug laiko, yra brangus ir dažnai gautos informacijos apie dalelių dydį nepakanka.
Atominės jėgos mikroskopija (AJM). Atominės jėgos mikroskopija remiasi fizikiniu mėginių
submikroniniame lygyje nuskaitymu, naudojant aukštos rezoliucijos skenuojantį zondo mikroskopą. Priklausomai nuo nanodalelių savybių, mėginiai skenuojami kontaktiniu, arba nekontaktiniu rėžimu. Naudojant kontaktinį rėžimą, topografinis vaizdas yra generuojamas priliečiant zondą prie mėginio paviršiaus, tuo tarpu skenuojant nekontaktiniu būdu zondas būna virš laidaus paviršiaus. Vienas pagrindinių AJM privalumų, tai kad norint vaizduoti nelaidžius junginius, nereikalingas specialus rėžimas. Ši funkcija leidžia atvaizduoti polimerines nano ir mikrostruktūras [64].
1.6.2 Paviršiaus krūvis. Zeta potencialas
Dalelių paviršiaus krūvis lemia nanodalelių sąveika su biologinę aplinka, taip pat jų elektrostatinę sąveiką su bioaktyviais junginiais. Koloidinės medžiagos stabilumas dažniausiai analizuojamas matuojant dalelių zeta potencialą. Dalelės zeta potencialas yra krūvis, kurį dalelė įgauna būdama tam tikroje terpėje. Tai fizikinė savybė kurią eksponuoja kiekviena dalelė esanti suspensijoje. Jei visos dalelės esančios suspensijoje turės didelį neigiamą ar teigiamą zeta potencialą, tada jos bus linkusios stumti viena kitą, todėl tokios dalelės nebus linkusios agreguotis. Zeta potencialas nustatomas
elektroforezės šviesos sklaidos metodu. Specialaus šviesos šaltinio skleidžiamas lazerio spindulys praeina pro mėginio centrą. Sukurtas elektrinis laukas, kuris visoms dalelėms, suteikia šviesos srauto kitimus ir taip yra pamatuojamas dalelių judėjimas. Ši informacija yra perduodamą į skaitmeninį signalų procesorių, tuomet į kompiuterį, kuris apskaičiuoja zetą potencialą [21, 65]. Tai puikus ir lengvai išmatuojamas parametras nusakantis sistemos stabilumą.
1.6.3 Vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumas
Norint įvertinti lipidinių nanonešiklių kokybę, svarbu įvertinti vaistinės medžiagos inkorporavimo efektyvumą. Įvairūs metodai, tokie kaip UV spektroskopija ar efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) yra naudojami norint įvertinti inkorporuotos medžiagos lipidinėje nanosistemoje kiekį. Šio parametro nustatymo metodai reikalauja, kad inkorporuotas vaistas būtų atskirtas nuo jo nešiklio [61]. Dažniausiai inkorporavimo efektyvumas apskaičiuojamas procentais, lyginant medžiagos kiekį, esanti lipidiniuose nanonešikliuose, su kiekiu naudotu gamyboje.
Lipidinių nanonešiklių charakterizavimo metodai nusakantys pagamintų produktų kokybę, yra nesudėtingi ir lengvai atliekami laboratorijoje, turint tam skirtą įrangą.
Taigi, mokslinių tyrimų duomenys patvirtina lipidinių nanonešiklių pritaikymo vaistinių medžiagų transportavimui galimybes. Daugybė įvairių medžiagų, gamybos ir optimizavimo metodų yra sukurta norit efektyviai inkorporuoti vaistines medžiagas į nanodispersines sistemas ir palengvinti gydymo procesą. Anksčiau minėtas dekspantenolis yra plačiai vartojamas pasaulyje gydant uždegimines odos ligas. Tačiau dėl organizmą saugančio odos barjero, ši medžiaga negali efektyviai parsiskverbti į gilesnius odos sluoksnius ir greitai sukelti gydomąjį poveikį. Todėl aktualu ištirti įvairių sudėčių dekspantenoliu inkorporuotų lipidinių nanonešiklių poveikį šios medžiagos fizikinėms savybėms, atpalaidavimui ir inkorporavimo efektyvumui.
2 METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas- lipidiniai nanonešikliai su dekspantenoliu.
2.2 Tyrimo medžiagos ir įranga
2.2.1 Reagentai:
Dekspantenolis, BASF SE, Vokietija
S100, Lipoid (>95 %), Lipoid GmbH, Šveicarija Cholesterolis, Sigma Aldrich, Vokietija
Polisorbatas 80, Sigma Aldrich, Vokietija
Metanolis (≥ 99,9), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija Etanolis 96,6 proc. (v/v), AB ,,Stumbras“, Lietuva Puslaidė membrana, Grant Instruments Ltd.,UK
2.2.2 Įranga
Ultra-efektyvusis skysčių chromatografas: Waters Acquity UPLC System, Waters, MA, JAV
pHmetras: ph-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija
Svarstyklės: : Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija
Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga: IKAMAG C-MAG HS7, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija
Dinaminės šviesos sklaidos analizatorius: Zetasizer Nano ZS, Malvern, Didžioji Britanija Ultragarsinis homogenizatorius su įleidžiamu zondu: Soniprep 150, MSE Crowley, JK
2.3 Dekspantenolio kiekybinio nustatymo metodika
Kiekybinė dekspantenolio analizė buvo atliekama efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, išvystytu Klinikinės farmacijos katedroje. Analizė buvo atliekama naudojant Waters Acquity ultra-efektyvųjį skysčių chromatografą (Waters, MA, USA) sujungtą su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi. Dekspantenolio atskyrimui naudota Acquity UPLC BEH C18 kolonėlė (130Å, 1.7 µm, 2.1 mm X 50 mm, Waters). Analizės metu nustatyta 30 ºC kolonėlės temperatūra. Pasirinktas
dekspantenolio nustatymo bangos ilgis buvo UV regione 200 nm. Mobilioji fazė sudaryta iš 0,1 proc. trifluoracto rūgšties (tirpiklis A) ir metanolio (tirpiklis B). Mobiliosios fazės tėkmės greitis nustatytas 0,5 mL/min, pasirinktas linijinis gradientas nuo 95- 85% (tirpiklio A) į 5-15 % (tirpiklio B) per 3 min. Mėginio injekcijos tūris 1,0 µl. Pagal šias chromatografijos sąlygas dekspantenolio sulaikymo laikas 1,683 min.
Dekspantenolio kokybinio nustatymo riba (LOD) buvo 0,898 µg/ml, kiekybinio nustatymo riba (LOQ) buvo 2,994 µg/ml. Kalibracinė kreivė buvo sudaryta naudojant standartinius tirpalus (4 – 64 µg/ml). Kalibracinė kreivė buvo nubrėžta remiantis tiesinės regresijos analize. Kreivės koreliacijos koeficientas (R2) 0,9997. Metodas validuotas remiantis ICH Q2 (R1) gairių rekomendacijomis. (1 lentelė).
1 lentelė. Chromatografijos metodo validacijos parametrai dekspantenoliui
Junginys Pakartojamumas Atkuriamumas
Tikslumas, % Glaudumas, % Tikslumas, % Glaudumas, % Dekspantenolis 98,6 – 102,4 2,37 – 3,83 97,1 – 103,1 1,32 – 2,82
2.3.1 Pirminės lipidinių nanonešiklių formuluotės pasirinkimas.
Siekiant pagaminti optimalią lipidinių nanonešiklių inkorporuotų dekspantenoliu formuluotę, buvo gaminamos skirtingų fosfolipido, koncentracijų lipidiniai nanonešikliai stabilizuoti cholesteroliu su ir be surfaktanto tween 80. Pirminės lipidinių nanonešiklių formuluotės pateikiamos 2 lentelėje.
2 lentelė. Pirminių lipidinių nanonešiklių su dekspantenoliu formuluočių sudėtys. Formuluotės
pavadinimas
Formuluotės komponentai (mg)
Lipoid S100 Despantenolis Cholesterolis Tween 80
L.350 350 1 10,5 28 L.400 400 1 12 32 L.500 500 1 15 40 L.350 + T80 350 1 10,5 28 L.400 + T80 400 1 12 32 L 500 + T80 500 1 15 40 L.600 + T80 600 1 18 48 L.800 + T80 800 1 24 64 L.1000 + T80 1000 1 30 80 L.1500 + T80 1500 1 45 120 L.2000 + T80 2000 1 60 160
2.3.2 Lipidinių nanonešiklių formuluotės optimizavimo plano sudarymas.
Lipidinių nanonešiklių formuluotės optimizavimas atliktas naudojant Design Expert® 7 (Stat-Ease, JAV) kompiuterinę programą. Pagrindiniais optimizavimo faktoriais pasirinkti lipidinių nanodalelių dydis, polidispersiškumo indeksas, pH ir zeta potencialas. Optimizavimo plano atrinktos formuluotės pateikiamos 3 lentelėje.
3 lentelė.Optimizuotų lipidinių nanonešiklių su dekspantenoliu formuluočių sudėtys Formuluotės
pavadinimas
Formuluotės komponentai (mg)
Lipoid S100 Despantenolis Cholesterolis Tween 80
L.500 500 1 15 40 L.500 500 1 15 40 L.667 667 1 20 53,36 L.833,5 833,5 1 25 66,68 L.1000 1000 1 30 80 L.1000 1000 1 30 80 L.1166,5 1166,5 1 34,99 93,32 L.1333 1333 1 39,99 106,64 L.1500 1500 1 45 120 L.1500 1500 1 45 120
2.3.3 Optimalios lipidinių nanonešiklių formuluotės pasirinkimas
Remiantis optimizuotų lipidinių nanonešiklių formuluočių gautais fizikinių savybių, inkorporavimo efektyvumo ir in vitro atpalaidavimo tyrimų rezultatais, buvo pasirinktas fosfolipido kiekis optimaliai formuluotei. (4 lentelė
).
4 lentelė. Optimalios lipidinių nanonešiklių su dekspantenoliu formuluotė sudėtis Formuluotės
pavadinimas
Formuluotės komponentai (mg)
Lipoid S100 Dekspantenolis Cholesterolis Tween 80
L.797 797 1 23,91 63,76
2.1 Lipidinių nanonešiklių gamybos metodika
Gaminamos 1 proc. dekspantenolio lipidinės suspensijos. Fosfolipidų dvisluoksniui suformuoti pasirinktas iš sojų pupelių išskirtas >95 proc. fosfatidilcholinas - Lipoid S100. Lipidinių nešiklių stabilizavimui naudojamas cholesterolis ir surfaktantas tween 80. Lipidinių nanonešiklių sudėtys pateiktos 2,3,4 lentelėse.
Lipidinės suspensijos gamyba. Apskaičiuoti reikalingi dekspantenolio, cholesterolio ir tween
80 kiekiai ištirpinami 5 % etanolyje, maišant magnetine maišykle. Gamybos metu kontroliuojamas maišymo greitis ir trukmė. Pagaminta fosfolipidų suspensija paliekama brinkti 24 val.
Lipidinių nanonešiklių dalelių dydžio sumažinimas. Siekiant sumažinti ir suvienodinti lipidinių
nanonešiklių dalelių dydį suspensijoje naudojamas vienas iš homogenizavimo metodų. Bandymai atlikti naudojant ultragarsinį homogenizatorių su įleidžiamu zondu (diametras, 13 mm, amplitudė 60mm/ss). Pagamintos lipidinės suspensijos supilamos į stiklinius buteliukus, į kurios įleidžiamas zondas. Suspensija homogenizuojama 1 kartą 30 sekundžių, esant amplitudei ± 50%. Procesas kartojamas 30-35 kartus, tarp intervalų darant 30 sekundžių pertrauką.
2.2 Lipidinių nanonešiklių fizikinių savybių nustatymas
pH reikšmių nustatymas. Formuluočių pH nustatyta pH-metru (pH-meter 766 Calimatic, Knick
Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija) su elektrodu Knick SE 104 N.
Vidutinio dalelių dydžio (VDD) ir Polidispersiškumo indekso (PDI) nustatymas: Pagamintų
lipidinių nanonešiklių dalelių dydžio vidurkis ir polidispersiškumo indeksas įvertintas dinaminės šviesos sklaidos metodu, naudojant Zetasizer Nano ZS analizatorių (Malvern Instruments, Didžioji Britanija). Kiekvienam matavimui buvo imama 50µl mėginio, kuris skiedžiamas 950µl dejonizuotu vandeniu. Fosfolipidų suspensijų VDD ir PDI matuojamas 173° kampu, 25 °C temperatūroje.
Zeta (ζ) potencialo nustatymas. Lipidinių nanonešiklių zeta (ξ) potencialas nustatytas lazerinės
doplerio elektroforezės metodu. Tyrimui naudotas Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, Didžioji Britanija) analizatorius. Zeta (ξ) potencialo matavimai buvo atliekami siekiant nustatyti koloidinės sistemos stabilumą. Kiekvienam matavimui buvo imama 50µl mėginio, praskiestu 950µl dejonizuoto vandens. Lipidinių suspensijų zeta (ξ) potencialas matuojamas 12° kampu, 25 °C temperatūroje.
2.3 Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumas.
Lipidiniai nanonešikliai atskirti nuo laisvo dekspantenolio dializės metodu. Iš kiekvienos skirtingos suspensijos imama 2 ml mėginio ir įterpiama į membranos vidų. Akceptorinė terpė – 500 ml vandens, kuris nėra keičiamas visos dializės metu. Membranos su mėginiais patalpinamos vandens
vonelėse ir uždedamos ant magnetinės maišyklės. Tyrimas atliekamas 5- 10 °C temperatūroje, kuri palaikoma nuolat ledu šaldant akceptorinę terpę. Praėjus 2 valandoms nuo tyrimo pradžios iš membranų imama 100 µl mėginio, kuris siekiant atskirti lipidinius nanonešiklius nuo dekspantenolio, skiedžiamas metanoliu 5 kartus. Po 5-10 min 500 µl mėginio perkeliami į 5 ml kolbutę ir skiedžiama vandeniu. Dekspantenolio kiekis lipidinėse suspensijose nustatomas prieš ir po dializės. Mėginiai analizuojami UESC metodu. Inkorporavimo efektyvumas iš kiekvienos formuluotės tiriamas 3 kartus. Procentinis inkorporavimo efektyvumas apskaičiuojamas pagal lygtį:
Inkorporavimo efektyvumas = konc. A x 100 / konc. B A- mėginys iki dializės
B- mėginys po dializės
2.4 Dekspantenolio atpalaidavimo iš lipidinių nanonešiklių in vitro tyrimai
Dekspantenolio atpalaidavimo tyrimai in vitro atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes. Į celės donorinę dalį įdedama donorinės fazės (lipidinio nanonešiklio) begalinė dozė (~1 ml). Donorinės dalies atvirasis galas uždengiamas celiuliozine membrana Cuprophan® (Medicell International Ltd., Londonas, Didžioji Britanija). Prieš tyrimą celiuliozinė membrana yra laikoma išgrynintame vandenyje ne mažiau 30 min. Membranos difuzijos plotas – 1,54 cm2 . Akceptorinė dalis užpildoma akceptorine terpe - 25 ml išgrynintuoju vandeniu. Donorinė fazė patalpinama į akceptorinę terpę. Akceptorinė terpė maišoma magnetine maišykle. Tyrimas atliekamas +32 ± 0,5° C temperatūroje. Akceptorinės terpės mėginiai imami po 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 valandų. Imamas 1 ml akceptorinės terpės ir grąžinamas toks pats tūris šviežios akceptorinės terpės. Paimti mėginiai skiedžiami 5 kartus ir analizuojami UESC metodu. Atpalaiduotas DPX kiekis išreiškiamas srautu (mg/cm2 ) bei procentais nuo donorinėje fazėje esančio DPX kiekio. Atpalaidavimas iš kiekvienos formuluotės tiriamas 3 kartus. Dekspantenolio atpalaidavimui iš lipidinių nanonešiklių palyginimui buvo analizuojamas 1 % DPX tirpalas.
2.5 Lipidinių nanonešiklių stabilumo vertinimas
Optimalių lipidinių nanonešiklių formuluočių stabilumas nustatytas stebint polidispersiškumo indekso (PDI) ir vidutinio dalelių dydžio(VDI), zeta (ξ) potencialo ir pH pakitimus. Mėginiai analizuoti praėjus skirtingiems laiko intervalams nuo pagaminimo: 1 dienai, 1 savaitei, 2 savaitėms, 3 savaitėms ir 4 savaitėms. Stabilumo tyrimo metu nanonešikliai laikyti uždaruose stikliniuose buteliukuose, kambario temperatūroje. Zeta (ξ) potencialo, PDI, VDD, pH nustatymo metodika aprašyta skirsnyje 2.5.1.
2.6 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2013 ir IBM SPSS 22 programas. Apskaičiuoti tyrimų duomenų vidurkiai, standartiniai nuokrypiai. Statistinis duomenų reikšmingumas nustatytas kai p < 0,05.
3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Pirminės lipidinių nanonešiklių formuluotės pasirinkimo analizė.
Siekiant parinkti tinkamą formuluotę ir įvertinti ją sudarančių komponentų įtaką lipidinių nanonešiklių kokybei, buvo vertinamos pagamintų nanodispersinių sistemų fizikinės savybės. Lipidinių struktūrų kokybė vertinta nustatant šiuos parametrus: vidutinį dalelių dydį (VDD), polidispersiškumo indeksą (PDI) bei zetą potencialą.
Buvo vertinama tween 80 įtaka nešiklių formavimuisi. Pagamintų lipidinių nanonešiklių VDD, PDI ir zeta (ξ) potencialas buvo vertinamas dinaminiu šviesos sklaidos metodu. 5 lentelėje pateikiami matavimų rezultatai, gauti po nanonešiklių homogenizacijos praėjus 1 dienai. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 2 lentelėje.
5 lentelė. Lipidinių nanonešiklių fizikinių savybių tyrimo rezultatai Lipidinis
nanonešiklis
Fizikinės savybės
VDD PDI Zeta (ξ) potencialas
L.350 229,8 0,417 -4,83 L.350+T80 84,57 0,299 -10,79 L.400 173,0 0,331 -7,34 L.400+T80 80,51 0,276 -11,57 L.500 156,8 0,306 -5,37 L.500+T80 75,38 0,252 -10,45
Tyrimų rezultatai parodė, kad lipidinių nanodalelių dydis ir polidispersiškumas kinta priklausomai nuo surfaktanto tween 80. Tyrimo duomenimis nanodispersijų dalelės, savo sudėtyje neturinčios tween 80, formuoja dideles (>100), mažo polidispersiškumo indekso (>0,300) nanodispersines sistemas. Atitinkamai mažesni dalelių (<100) ir polidispersiškumo indekso (<0,300) dydžiai nustatyti lipidinėse suspensijose, pagamintose naudojant šį surfaktantą. Remiantis rezultatų duomenimis galima teigti, kad tween 80 padeda suformuoti mažesnio dydžio, polidispersiškesnes lipidines sistemas.
Nustatytos lipdinių formuluočių zeta potencialo reikšmės yra neigiamos nuo 4,83 iki -11,57mV. Gauti rezultatai rodo, kad nanodalelių savo formuluotėje, turinčių tween 80, zeta potencialas yra neigiamesnis už lipidinių mikrodalelių susiformavusių be šio surfaktanto. Galima teigti, kad tween 80, esantis lipidinių nanonešiklių sudėtyje, eksponuoja žemesnį zetą potencialą.
Įvertinta fosfolipido koncentracijos įtaka lipidinių nanonešiklių fizikinėms charakteristikoms. Gauti rezultatai pateikiami 6 lentelėje. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 2 lentelėje.
6 lentelė. Lipidinių nanonešiklių fizikinių savybių tyrimo rezultatai Lipidinis
nanonešiklis
Fizikinės savybės
VDD PDI Zeta (ξ) potencialas
L.350 + T80 84,57 0,299 -10,79 L.400 + T80 80,51 0,276 -10,57 L.500 + T80 64,77 0,231 -10,45 L.600 + T80 64,06 0,220 -9,57 L.800 + T80 63,43 0,205 -9,32 L.1000 + T80 63,02 0,204 -10,5 L.1500 + T80 61,43 0,202 -9,22 L.2000 + T80 66,18 0,220 -9,96
Iš tyrimo rezultatų pastebima, kad didžiausio diametro ir polidispersiškumo dalelės gautos lipidinėse suspensijose, kurių sudėtyje fosfolipido kiekis mažiausias (L.350; L400). Nanodispersinių formuluočių, kurių sudėtyje lipido kiekis 500-1500 mg ribose, nustatytas mažiausias dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas. Fosfolipido kiekį didinant nuo 1500 mg arba mažinant nuo 500 mg fosfolipido kiekį VDD ir PDI reikšmės didėja. Statistinė duomenų analizė neparodė reikšmingo skirtumo tarp šių formuluočių zeta potencialo (p > 0,05).
Įvertinus formuluotės komponentų įtaką lipidinių nanonešiklių fizikinėms charakteristikoms, nustatyta, kad lipidinės suspensijos, savo sudėtyje turinčios tween 80 ir fosfolipido 500- 1500 mgribose, suformuoja homogeniškas, stabilaus dalelių dydžio nanonešiklių sistemas.
3.2 Optimizacija
Norint pasirinkti tinkamiausią lipidinių nanonešiklių formuluotę, buvo atliekamas metodo optimizavimas. Optimizavimo planas buvo sudaromas siekiant pasirinkti tinkamą fosfolipido kiekį 500- 1500 mg intervale norit gauti mažo polidispersiškumo indekso lipidinius nanonešiklius, kurių dalelių dydis svyruotų nuo 60- 70 nm, zeta potencialas nuo -11 iki -7,5, pH 6- 7,5, pasižyminčius didele inkorporavimo geba bei prailgintu vaistinės medžiagos atpalaidavimu. Remiantis šiais kriterijais, optimizavimo programa atrinko 10 lipidinių nanonešiklių formuluočių (3 lentelė).
3.2.1 Optimizuotų lipidinių nanonešiklių formuluočių fizikinės savybės
Suformavus optimizavimo plano atrinktus lipidinius nanonešiklius su 1 proc. DXP, atliktas jų kokybės vertinimas.
Vizualinis vertinimas. Pagamintos 1 proc. DXP lipidinės suspensijos įvertintos vizualiai.
Lipidinės nanosistemos yra skaidrios, nėra iškritusių nuosėdų.
Fizikinių savybių vertinimas. Suformavus lipidinius nanonešiklius su 1 proc. DXP, atliktas jų
fizikinių savybių nustatymas. Vidutinio dalelių dydžio (VDD), polidispersiškumo indekso (PDI), pH bei zeta potencialo matavimų rezultatai pateikiami 7 lentelėje. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 3 lentelėje.
7 lentelė. Optimizuotų lipidinių nanonešiklių fizikinių savybių tyrimo rezultatai Lipidinis nanonešiklis Fizikinės savybės VDD PDI Zeta (ξ) potencialas pH L.1166,5 61,53 0,170 -11 7,6 L.1500 60,59 0,251 -8,13 6,8 L.667 64,11 0,226 -8,26 7,59 L.833,5 63,64 0,207 -6,9 7,42 L.1333 64,65 0,206 -10,1 7,17 L.1500 61,18 0,202 -9,63 6,98 L.667 64,92 0,201 -9,08 7,55 L.1000 61,26 0,193 -7,88 7,23 L.500 63,77 0,189 -8,1 7,47 L.1000 61,33 0,199 -7,39 7,34
VDD ir PDI nustatymas. Gamybos metu buvo siekiama pagaminti vienasluoksnes,
homogeniškas lipidines daleles, kurių VDD siektų nuo 60- 70 nm. Remiantis moksline literatūra, nanodispersinės sistemos, kurių dalelių dydis yra nuo 20 iki 100 nm, yra laikomos vienasluoksnėmis [25]. Gautų lipidinių suspensijų nustatytas dalelių dydis svyruoja nuo 60,59- 64,65 nm., todėl atitinka vienasluoksnėms nanodispersinėms dalelėms keliamus reikalavimus. Suformuotų lipidinių nanonešiklių VDD statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p > 0,05), todėl fosfolipido kiekis dalelių dydžiui įtakos neturėjo. Nustatytos PDI reikšmės yra iki 0,266, tai rodo, kad gautos nanosistemos yra homogeniškos [67].
