LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

studentės Gabrielės Janušauskaitės

MIKROELEMENTŲ IR METALOTIONEINŲ SĄSAJOS SU GLIOBLASTOMA Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovė dr. Rima Naginienė Darbo konsultantė dr. Jurgita Šulinskienė

TURINYS

SANTRAUKA ... 3

SUMMARY ... 5

PADĖKA ... 7

INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 9

SANTRUMPOS ... 10

ĮVADAS ... 11

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

2.1. Mikroelementai. Bendra charakteristika ... 13

2.1.1. Cinkas ... 14 2.1.2. Varis... 15 2.1.3. Selenas ... 16 2.1.4. Kadmis ... 17 2.1.5. Švinas... 18 2.2. Metalotioneinai ... 19

2.3. Naviko formavimasis. Glioblastoma ... 21

3. TYRIMO METODAI ... 23

3.1. Tiriamieji ir tyrimo objektas ... 23

3.2. Mikroelementų koncentracijos nustatymas induktyviai susietos plazmos masių spektrometu ... 24

3.3. Metalotioneinų koncentracijos nustatymas spektrofotometru ... 24

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

5. IŠVADOS ... 40

SANTRAUKA

Baigiamojo magistro darbo autorė: Gabrielė Janušauskaitė

Baigiamojo magistro darbo pavadinimas: Mikroelementų ir metalotioneinų sąsajos su glioblastoma

Darbo vadovė: dr. Rima Naginienė

Darbo konsultantė: dr. Jurgita Šulinskienė

Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Toksikologijos laboratorija

Santraukos turinys:

Tikslas ir uždaviniai: Įvertinti mikroelementų: cinko (Zn), vario (Cu), seleno (Se), kadmio (Cd), švino (Pb), ir metalotioneinų (MT) sąsajas glioblastoma sergančių pacientų kraujyje bei smegenų naviko audiniuose. Iškelti uždaviniai: įvertinti mikroelementų koncentraciją glioblastoma sergančių pacientų ir kontrolinės grupės biologinėse terpėse, įvertinti metalotioneinų koncentraciją glioblastoma sergančių pacientų ir kontrolinės grupės biologinėse terpėse, įvertinti skirtumus tarp mikroelementų ir metalotioneinų kiekio kraujyje prieš naviko šalinimo operaciją ir po jos, įvertinti sąsajas tarp mikroelementų ir metalotioneinų kiekio glioblastoma sergančių pacientų ir kontrolinės grupės pacientų kraujyje, įvertinti sąsajas tarp mikroelementų ir metalotioneinų koncentracijų bei pacientų amžiaus, lyties ir išgyvenamumo.

Tyrimo objektas ir metodai: Tirti 2015-2018 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Neurochirurgijos klinikoje operuotų glioblastoma sergančių žmonių (n=47) bendras kraujas, plazma, naviko (IV stadija, pagal Pasaulinės sveikatos organizacijos klasifikaciją, histologiškai patvirtinta patologinės anatomijos specialistų) audinys. Gauti duomenys palyginti su kontroline grupe. Kontrolinę grupę sudarė 2018-2019 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Akių ligų klinikose gydyti, onkologinėmis ligomis nesergantys žmonės (n=200). Tirtas jų bendras kraujas ir plazma. Mikroelementų koncentracija nustatyta induktyviai susietos plazmos masių spektrometriniu (angl. inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) metodu. Metalotioneinų koncentracija nustatyta spektrofotometriniu metodu.

Rezultatai: Glioblastoma sergančių tiriamųjų kraujyje vario, seleno ir kadmio koncentracija gauta mažesnė (p<0,05), o švino bei metalotioneinų koncentracija didesnė (p<0,05) nei kontrolinės

grupės tiriamųjų kraujyje. Po naviko šalinimo operacijos glioblastoma sergančių tiriamųjų kraujyje švino, kadmio ir metalotioneinų koncentracija sumažėjo (p<0,05), o seleno – padidėjo (p<0,05). Regresinė analizė parodė, kad glioblastoma sergantiems nustatyta vario koncentracija plazmoje tiesiogiai susijusi su metalotioneinų koncentracija kraujyje. Kontrolinės grupės tiriamųjų kraujyje nustatyta švino koncentracija tiesiogiai susijusi su kadmio koncentracija. Jaunesniems nei 55 metai ligoniams švino koncentracija kraujyje nustatyta mažesnė (p<0,05) nei vyresniems ligoniams. Glioblastoma sergantiems vyrams kadmio ir švino koncentracija kraujyje nustatyta didesnė (p<0,05) nei moterims. Mažesnė seleno koncentracija kraujyje lemia prastesnę išgyvenamumo tikimybę. Kaplan – Meier išgyvenamumo kreivė parodė, jog didesnė metalotioneinų koncentracija bioterpėse lemia trumpesnį glioblastoma sergančių tiriamųjų išgyvenamumo laikotarpį.

SUMMARY

Master title: Correlation of trace elements and metallothioneins in patients with glioblastoma Supervisor: Rima Naginienė, PhD

Consultant: Jurgita Šulinskienė, PhD

Work was performed at: Laboratory of Toxicology, Neuroscience Institute, Lithuanian University of Health Sciences

Summary:

Aim and objectives: The aim of this study was to evaluate the relationship between content of trace elements: zinc (Zn), copper (Cu), selenium (Se), cadmium (Cd), lead (Pb) and content of metallothioneins (MT) in glioblastoma patients‘ whole blood, plasma and brain tumor tissue. To achieve this aim the tasks were set as follows: to determine the concentration of trace elements in human blood and plasma of glioblastoma patients‘ and control group, to assay the concentration of metallothioneins in case and control groups, to determine differences of the value of trace elements and MT in human blood and plasma before and after the surgery, to evaluate correlation between the content of trace elements and MT, to evaluate correlation between trace elements, MT, brain tumor disease, age, gender and survival of patients.

Materials and methods: The research was conducted using whole blood, plasma and brain tumor tissue of patients‘ (n=47) with glioblastoma (grade IV, World Health Organization, confirmed pathologically) during 2015-2018 undergoing a surgical intervention at Department of Neurosurgery of Kaunas Clinics, Hospital of Lithuanian University of Health Sciences. Obtained results were compared to control group of patients (n=200) without any oncological diseases during 2018-2019 undergoing a surgical intervention and treatment at Department of Ophtalmology, Hospital of Lithuanian University of Health Sciences. Trace elements and metallothioneins were determined in whole blood and plasma. Trace elements content was determined by inductively coupled plasma mass spectrometry, and MT content was assayed spectrophotometrically.

Results: The concentration of Cu, Se and Cd in glioblastoma patients‘ whole blood and plasma was lower (p<0.05), whereas Pb and MT concentration in glioblastoma patients‘ whole blood was higher (p<0.05) than controls‘ group. The concentration of Pb, Cd and MT in blood (p<0.05)

decreased after tumor removal, while concentration of Se (p<0.05) increased. Regression analysis showed that Cu content in glioblastoma patients‘ plasma was directly related to the concentration of MT in the blood (p<0.05). Value of Pb in control patients‘ whole blood was directly related to the concentration of Cd in whole blood (p<0.05). Content of Pb in blood was lower (p<0.05) in patients younger than 55 years compared to older ones. The concentration of Cd and Pb in glioblastoma men whole blood was found to be higher (p<0.05) than in women. Low whole blood level of selenium was associated with reduced survival. The Kaplan – Meier survival analysis has shown that higher concentration of MT in the whole blood may indicate shorter survival time of patients with glioblastoma.

PADĖKA

Dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos darbuotojams bei dr. Dainai Skiriutei už glaudų bendradarbiavimą. Noriu padėkoti LSMU Neuromokslų instituto Toksikologijos laboratorijos darbuotojams, ypač dr. Dalei Baranauskienei už pagalbą nustatant mikroelementų koncentraciją induktyviai susietos plazmos masių spektrometriniu metodu, dr. Rimai Kregždytei už vertingas pamokas atliekant statistinę analizę, taip pat dr. Loretai Strumylaitei už bendradarbiavimą ir pagalbą.

Dėkoju baigiamojo magistro darbo konsultantei dr. Jurgitai Šulinskienei už konsultacijas bei pagalbą nustatant metalotioneinų koncentraciją spektrofotometriniu metodu. Nuoširdus ačiū darbo vadovei dr. Rimai Naginienei už vertingas pamokas, kantrybę, supratingumą ir pasitikėjimą.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Mikroelementų ir metalotioneinų sąsajos su glioblastoma

Correlation of trace elements and metallothioneins in patients with glioblastoma

Darbas remiamas: Darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos fakulteto valstybės finansuojamomis lėšomis ir LSMU Neuromokslų instituto Toksikologijos laboratorijos valstybės biudžeto asignavimų bei iš dalies pajamų už teikiamas paslaugas lėšomis.

Tvirtinu, kad baigiamasis darbas atliktas ir parašytas savarankiškai, nepažeidžiant LSMU Neuromokslų instituto Toksikologijos laboratorijos kitiems mokslo darbuotojams priklausančių autorinių teisių. Autoriui interesų konflikto nebuvo.

Laboratorinės medicinos biologijos studentė: Gabrielė Janušauskaitė

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Baigiamasis magistrinis darbas atliktas vadovaujantis Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro 2019-12-11 leidimu Nr. BEC–LMB (M)–145.

Kontrolinės grupės tyrimas atliktas vadovaujantis Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto 2018-03-12 leidimu Nr. BE–2-6.

SANTRUMPOS

Cd – kadmis

CNS – centrinė nervų sistema Cu – varis

DNR – deoksiribonukleorūgštis

DTNB – 5,5 – ditobio, 2 – nitrobenzoinė rūgštis (Elmano reagentas) EDTA – etilendiamintetraacetatas

ICP-MS (angl. inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) – induktyviai susietos plazmos masių spektrometras

MT – metalotioneinas Pb – švinas

PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija RNR – ribonukleorūgštis

Se – selenas

-SH – merkapto grupė TNB – tionitrobenzoatas Zn – cinkas

ĮVADAS

Remiantis Lietuvos vėžio registro duomenimis, šalyje 2006 metais diagnozuota apie 17000 onkologinių susirgimų, iš kurių 296 buvo piktybiniai smegenų navikai, tuo tarpu 2012 metais diagnozuota apie 18000 susirgimų, iš kurių piktybinių smegenų navikų buvo šiek tiek mažiau – 275 [1,2]. Viena iš dažniausiai pasitaikančių smegenų naviko formų, sudarančių net 80,6 proc. visų glijos ląstelių navikų – daugiaformė glioblastoma. Navikas itin piktybiškas ir agresyvus: po chemoterapinio ir radioterapinio gydymo atsinaujina, o sergančiųjų išgyvenamumo trukmė nuo 7 iki 15 mėnesių [3,4]. Šios onkologinės ligos vystymosi priežastys ir mechanizmai nėra išaiškinti, todėl naviko formavimosi mechanizmų bei biožymenų paieškos tyrimai yra aktualūs ir reikalingi.

Mikroelementai yra natūrali žmogaus gyvenamosios ir darbo aplinkos dalis. Dalis mikroelementų yra reikalingi biologiniams procesams, jei jų koncentracija neviršija leistinos ribos [5]. Tyrimais įrodyta, jog mikroelementų pusiausvyros sutrikimas organizme sukelia genų mutacijas, to pasekmė – naviko formavimasis. Mikroelementų toksinio poveikio išraiška – oksidacinis stresas [6]. Viena iš apsauginių ląstelės reakcijų į oksidacinį stresą – viduląstelinių baltymų metalotioneinų (MT) – sintezė. Metalotioneinai – mažos molekulinės masės baltymai, kurių sudėtyje apie 30 proc. aminorūgščių sudaro cisteinas. Jie palaiko metalų jonų homeostazę, apsaugo audinius nuo laisvųjų radikalų, radiacijos poveikio [7].

Tikimasi, jog šio baigiamojo magistro tiriamojo darbo metu nustatytas būtinųjų ir toksiškųjų mikroelementų ryšys su metalotioneinais bus naudingas biomedicinos srityje, o nustatyti mikroelementų ir MT koncentracijų pokyčiai suteiks papildomos informacijos tiriant naviko formavimosi procesus. Tad šio baigiamojo darbo tikslas – nustatyti mikroelementų: cinko (Zn), vario (Cu), seleno (Se), kadmio (Cd) ir švino (Pb), koncentracijų sąsajas su metalotioneinų kiekiu glioblastoma sergančiųjų kraujyje bei naviko audiniuose.

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Įvertinti mikroelementų: cinko, vario, seleno, kadmio, švino, ir metalotioneinų sąsajas glioblastoma sergančių pacientų kraujyje bei smegenų naviko audiniuose.

Uždaviniai:

1. Įvertinti mikroelementų koncentraciją glioblastoma sergančių pacientų ir kontrolinės grupės biologinėse terpėse.

2. Įvertinti metalotioneinų koncentraciją glioblastoma sergančių pacientų ir kontrolinės grupės biologinėse terpėse.

3. Įvertinti skirtumus tarp mikroelementų ir metalotioneinų kiekio kraujyje prieš naviko šalinimo operaciją ir po jos.

4. Įvertinti sąsąjas tarp mikroelementų ir metalotioneinų kiekio glioblastoma sergančių pacientų ir kontrolinės grupės pacientų kraujyje.

5. Įvertinti sąsajas tarp mikroelementų ir metalotioneinų koncentracijų bei pacientų amžiaus, lyties ir išgyvenamumo.

2. LITERATŪROS APŽVALGA

Mikroelementai – tai fiziologinių savybių ir medžiagų apykaitos procesų palaikymui reikalingi elementai. Pagal Friedeno klasifikaciją, mikroelementais yra laikomi tie cheminiai elementai, kurių leistinas suvartojimo per parą kiekis sudaro mažiau nei 100 mg, pavyzdžiui, varis (Cu), geležis (Fe), cinkas (Zn), chromas (Cr), selenas (Se) ir kt. Kita Friedeno klasifikacijos grupė – papildomi mikroelementai, kurių funkcinė reikšmė nėra nustatyta ar nėra būtini gyvybiniams procesams užtikrinti, pavyzdžiui, kadmis (Cd), nikelis (Ni) ar aliuminis (Al) [8]. Remiantis Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) klasifikacija, cinkas, varis ir metaloidai, pavyzdžiui, selenas ir kiti, būtini organizmo medžiagų apykaitai bei fiziologiniams procesams užtikrinti, vadinami būtinaisiais mikroelementais. Cheminiai elementai, kurių tankis yra didesnis nei 3-7 g/cm³, dar vadinami sunkiaisiais metalais [8,9]. Dalis sunkiųjų metalų, tokių kaip geležis, cinkas, varis, chromas, kobaltas, molibdenas, yra gyvybiškai būtini normaliam organizmo funkcionavimui. Kai kurie metalai: geležis, manganas, chromas, cinkas, varis, ar metaloidas selenas yra kartu ir būtini organizmo gyvybinei veiklai palaikyti, ir toksiški, t.y. organizme jų turi būti tam tikra koncentracija, nes per mažos ar per didelės koncentracijos gali sukelti sveikatos sutrikimus [5-8]. Šiame baigiamajame darbe būtinaisiais mikroelementais bus vadinami varis, cinkas bei selenas, o toksiškais sunkiaisiais metalais – švinas ir kadmis.

Mikroelementų šaltiniai yra natūralūs gamtiniai ir dirbtiniai. Gamtiniams priskiriamas oras, dirvožemis, maistas ir vanduo, o dirbtiniai siejami su pramonine bei ūkine veikla. Sunkieji metalai dėl cheminio stabilumo, tvirtumo, šiluminio bei elektrinio laidumo naudojami statybų, automobilių, ginklų pramonėse [10,11]. Mikroelementų koncentracijos kraujyje turi būti stebimos ir koreguojamos dėl plataus jų naudojimo įvairiose pramonės šakose.

Literatūroje nurodoma, jog mikroelementai yra reikalingi daugelio fermentų, pavyzdžiui, citochromo c oksidazės, superoksido dismutazės ar lizilo oksidazės katalitiniam aktyvumui, ląstelės ciklo reguliacijai bei hemoglobino, mielino ar hormonų sintezei [5,8]. Nustatyta, jog priklausomai nuo koncentracijos, mikroelementai gali veikti kaip antioksidantai: neutralizuoti laisvuosius radikalus, apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso pažaidų, arba atvirkščiai, veikti kaip prooksidantai – sukelti oksidacinį stresą [5]. Nors būtinieji mikroelementai yra svarbūs įvairiems biologiniams procesams, per didelė jų koncentracija kraujyje gali sąlygoti toksinį metalų poveikį [12]. Pagrindinis mikroelementų toksiškumo mechanizmas – oksidacinis stesas, kurio metu metalų jonai, dalyvaudami nefermentinėse Fentono ir Haberio – Weiso reakcijose, aktyvina laisvųjų radikalų, sutrikdančių ląstelės DNR replikaciją, proliferaciją, diferenciaciją bei genetinės informacijos perdavimo mechanizmus,

susidarymą. Dažniausi tokių sutrikimų rezultatai – fermentopatiniai procesai bei navikų vystymasis [6].

2.1.1. Cinkas

Cinkas – IIB grupės, 4 eilės cheminis periodinės elementų lentelės metalas, žymimas Zn (lot. Zincum). Jo atominė masė – 65,409 a.m.v. Pagal PSO klasifikaciją, cinkas priskiriamas būtiniesiems mikroelementams. Leidžiama koncentracija žmogaus serume 58-121 μg/dl [8,13].

Pagrindiniai mikroelemento šaltiniai: grūdinės kultūros, ankštiniai augalai bei sėklos, mėsos, pieno ir žuvies produktai [8]. Gyvulinės kilmės baltymų aminorūgštys, gautos valgant jautieną, kiaušinius ar sūrį, suriša cinko jonus ir taip gerina su maistu gauto mikroelemento absorbciją. Cinkas plačiai naudojamas statybų, automobilių pramonėse, kosmetikos, dažų, tepalų, trąšų bei vaistinių preparatų gamyboje [14,15].

Pagrindinis cinko patekimo į organizmą būdas yra per virškinamąjį traktą su maistu [10]. Suaugusiems per parą rekomenduojama cinko suvartoti iki 15 mg [11]. Cinko žmogaus organizme yra nuo 2 iki 3 gramų. 60 procentų viso organizmo cinko sukaupta raumenyse, 30 proc. kauluose, 5 proc. kepenyse, 0,1 proc. kraujyje, 2 proc. kituose audiniuose [15]. Cinkas cirkuliuoja kraujyje susijungęs su kraujo plazmos baltymais albuminu ir transferinu, santykiu 6:1. Žinoma, jog transferinas yra susijungęs ir su geležies atomu, tad esant šio mikroelemento pertekliui, cinko absorbcija būna mažesnė, o esant geležies stygiui, ypač anemijos atveju, cinko koncentracija kraujo serume būna padidėjusi [8]. Ląstelės organelėse cinko koncentracija vyrauja: 50 proc. cinko yra citoplazmoje, 30-40 proc. branduolyje, 10 proc. ląstelės membranoje. Nuo 5 iki 15 proc. citoplazmoje esančio cinko yra susijungę su viduląsteliniais baltymais, pavyzdžiui, metalotioneinais (MT) [15].

Cinko biologinės funkcijos gali būti išskirtos į tris kategorijas: fermentus aktyvinanti (katalitinė), reguliuojanti bei struktūrinė. Elementas būtinas fermentiniam aktyvinimui, imuninės sistemos reakcijoms, žaizdų gijimui, baltymų, DNR, insulino sintezei, ląstelių dalijimosi procesams bei pasižymi antioksidantinėmis savybėmis. Cinko jonai gali būti prijungti prie 2800 viso genomo baltymų. Baltymai, savo sudėtyje turintys cinko atomą, sudaro 10 proc. žmogaus proteomo [5]. Lanksčios cinko koordinacinės geometrinės savybės lemia šio metalo tinkamumą fermentų aktyviesiems centrams. Žmogaus organizme yra daugiau nei 300 fermentų, kurių katalitinės savybės priklauso nuo Znjonų, pavyzdžiui, superoksido dismutazė, metionino sintazė, karboninė anhidrazė ir kiti [14].

Cinko jonai ypač reikalingi kūdikystės, paauglystės bei nėštumo laikotarpiu, organizmui augant bei vystantis. 25 proc. visos populiacijos žmonėms, ypač paaugliams bei pomenopauzinio

amžiaus moterims, yra nustatyta sumažėjusi cinko koncentracija serume [12]. Cinko jonų trūkumui būdingi klinikiniai požymiai: sutrikusi virškinimo trakto, imuninės ir reprodukcinės sistemos veikla, fiziologinė raida, organizmo augimas bei atmintis, būdinga neuronų atrofija. Dažnai pasireiškia odos problemos: alopecija, nepagydomos odos opos [14]. Literatūros šaltiniuose nurodoma, jog mažesnė cinko koncentracija kraujyje yra būdinga žmonėms, sergantiems piktybiniais susirgimais [16].

Cinko ir vario koncentracijos yra susijusios. Varis, kaip ir cinkas, yra būtinasis mikroelementas, reikalingas fermentų aktyvinimui, DNR sintezei, antioksidaciniams ir proliferaciniams procesams [8]. Pastarieji mikroelementai yra antagonistai: cinkas konkuruoja su organizme esančiu variu. Vario ir cinko koncentracijų santykis yra informatyvesnis žymuo nei kiekvieno mikroelemento koncentracija atskirai. Įrodyta, jog padidėjęs vario ir cinko koncentracijos santykis gali būti laikomas navikinių procesų biožymeniu [16,17].

2.1.2. Varis

Varis – IB grupės, 4 eilės periodinės elementų lentelės pereinamasis metalas, žymimas Cu (lot. Cuprum). Jo atominė masė – 63,546 a.m.v. Pagal PSO klasifikaciją, varis priskiriamas būtiniesiems mikroelementams [8]. Leidžiama vario koncentracija žmogaus serume 60–180 μg/dl. Leidžiama mikroelemento koncentracija gali vyrauti, priklausomai nuo amžiaus bei lyties [13].

Pagrindiniai mikroelemento šaltiniai: įvairios jūros gėrybės, ypač austrės, pilno grūdo produktai, pupelės, riešutai, mėsa, džiovinti vaisiai bei mielės [8]. Gamtoje varis randamas grynas ar įvairių junginių sudėtyje. Kiti vario šaltiniai – žemės ūkis, kur naudojamos organinės trąšos, bei pramoninė veikla. Varis pasižymi elektriniu laidumu, todėl yra naudojamas elektros ir metalurgijos pramonėse [11].

Pagrindinis vario patekimo į organizmą būdas yra per virškinamąjį traktą su maistu [10]. Suaugusiems per parą rekomenduojama vario suvartoti iki 2 mg [11]. Vario žmogaus organizme yra nuo 75 iki 100 mg. Mikroelemento sankaupos išsidėsčiusios smegenų, širdies, inkstų bei raumenų audiniuose. Varis cirkuliuoja kraujyje laisvas arba susijungęs su baltymu ceruloplazminu. Šis baltymas yra susijungęs su 90 proc. kraujotakoje cirkuliuojančiu variu bei yra atsakingas už jo pernešimą į audinius [5].

Vario biologinės funkcijos gali būti išskiriamos į tris kategorijas: katalitines, struktūrines bei sintetines. Varis yra svarbus daugelio fermentų, tokių kaip citochromo c oksidazės, superoksido dismutazės, tirozinazės, kofaktorius. Varis dalyvauja melanino, mielino, skydliaukės hormono tiroksino sintezėje [8]. Mikroelementas pasižymi ne tik antioksidantinėmis, bet ir prooksidantinėmis savybėmis. Kaip antioksidantas varis neutralizuoja laisvuosius radikalus, ir priešingai, veikdamas kaip

prooksidantas, skatina audinių oksidacinį pažeidimą [16]. Nors Cu yra būtinas fermentų aktyvumui, būdamas laisvas ar netaisyklingai prijungtas prie baltymų, dalyvauja oksidacines pažaidas sukeliančių aktyvių deguonies formų (ADF) susidaryme [6,12].

Vario kiekiui organizme sumažėjus pasireiškia plaukų ir odos hipopigmentacija, kaulų lūžiai, osteoporozė, sąnarių skausmai, kraujagyslių spazmai, nusilpsta imunitetas, išsivysto anemija ar neutropenija [5,8]. Nustatyta, jog vario trūkumas yra susijęs su įgimtomis kaulų formavimosi ligomis ar idiopatine mielopatija – nugaros smegenų patologiniais sutrikimais [8,12]. Ypač pavojinga sumažėjusi vario koncentracija naujagimiams. Menkės sindromo atveju, kai yra įgimtas vario homeostazės sutrikimas ir Cu organizme yra per mažai, atsiranda „metaliniai“ plaukai, progresuoja smegenų degeneracija ir ligonis miršta sulaukęs vos 3 metų amžiaus [12].

Sveikatos sutrikimus sukelia ir didesnė nei leistina vario koncentracija. Pavyzdžiui, Vilsono ligos atveju: esant įgimtai ATP7B geno mutacijai, sutrikdoma vario homeostazėje dalyvaujančių baltymų sintezė. Dėl besikaupiančio vario kepenyse sukeliamas hepatitas ar kepenų cirozė, o ilgai negydant šios ligos galimi negrįžtami neurologiniai pažeidimai. Ligoniams, sergantiems vario apykaitos sutrikimais, variui iš organizmo šalinti skiriami cinko preparatai [5,8].

2.1.3. Selenas

Selenas – VIA grupės, 4 eilės periodinės elementų lentelės metaloidas, žymimas Se (lot. Selenium). Jo atomo numeris yra 34, o atominė masė – 78,96 a.m.v. Pagal PSO klasifikaciją, selenas priskiriamas būtiniesiems mikroelementams [8]. Leidžiama seleno koncentracija žmogaus kraujyje 7– 14 μg/dl [18].

Pagrindiniai mikroelemento šaltiniai: jūros gėrybės, javai, pieno produktai, mėsa, vaisiai bei daržovės [19,20]. Maisto produktai, kuriuose seleno daugiausia: mėsa, žuvis ir jūros gėrybės [20]. Mikroelementas aptinkamas neorganinės ir organinės formos. Neorganinės seleno formos: selenitas, selenidas, o organinės: selenometioninas, selenocisteinas ir kiti. Organinių seleno formų bioprieinamumas didesnis. Labai maža seleno koncentracija (<1 μg/g) randama natūraliuose gamtiniuose šaltiniuose. Gamtiniai mikroelemento šaltiniai: vanduo, dirvožemis ir oras. Siekiant užtikrinti pakankamą seleno bioprieinamumą, mikroelemento junginiai naudojami žemės ūkio bei gyvulininkystės pramonėse. Selenas naudojamas organinių trąšų bei pašarų gamyboje [19]. Seleno junginiai pasižymi elektriniu laidumu, todėl metaloidas plačiai naudojamas ir pramonės šakose: saulės kolektorių, buitinės ir kompiuterinės technikos prietaisų gamyboje [20].

Pagrindinis seleno patekimo į organizmą būdas yra per virškinamąjį traktą su maistu [10]. Suaugusiems per parą rekomenduojama seleno suvartoti iki 0,07 mg. 70-95 proc. su maistu gauto

organinio seleno yra absorbuojama bei įjungiama į baltymų sudėtį. Įsisavintas neorganinis selenas kaupiamas kaip atsargos audiniuose: 30 proc. viso organizmo seleno sukaupta kepenyse, 15 proc. inkstuose, 30 proc. raumenyse ir 10 proc. laisvai cirkuliuoja kraujo plazmoje [19].

Selenas yra laikomas svarbiu ląstelių antioksidantu. Metaloidas yra antioksidantinėmis savybėmis pasižyminčių fermentų, pavyzdžiui, glutationo peroksidazės ar tioredoksino reduktazės, kofaktorius. Glutationo peroksidazė kartu su vitaminu E dalyvauja detoksikacijos procesuose, redukuodama vandenilio peroksidą ir kitus įvairius organinius hidroperoksidus bei ADF, taip apsaugodama ląsteles nuo oksidacinio streso [12,21,22]. Baltymų sudėtyje esantis selenas dalyvauja imuninėse reakcijose, ląstelių proliferaciniuose procesuose: reguliuodamas tirpių imuninės sistemos hormonų citokinų sintezę, lemia ląstelių atsparumą oksidaciniams pažeidimams [19].

Kaip ir visų mikroelementų, seleno kiekis organizme turi būti stebimas. Esant didesniam elemento kiekiui pasireiškia toksinis Se poveikis: būdingas pykinimas, vėmimas, pilvo skausmai, viduriavimas, nagų trapumas bei plaukų slinkimas [5]. Esant mažesnei seleno koncentracijai sutrinka širdies, kepenų bei skeleto raumenų veikla, pasireiškia nekrozinė kardiomiopatija, išsivysto Kešano liga, periferinė miopatija, nevaisingumas, sumažėja raumenų tonusas, išsivysto anemija [5,19]. Remiantis literatūros duomenimis, sumažėjusi seleno koncentracija kraujo serume nustatoma esant virusinėms infekcijoms, priešvėžinėms būklėms, plintant metastazėms, vystantis trombozei, aterosklerozei, esant didesniam laisvųjų radikalų kiekiui [19,23]. Onkologinėmis ligomis sergantiems pacientams atliekant radioterapines procedūras dažnai yra skiriami seleno preparatai. Organizmo pasisavintas metaloidas sumažina terapijos šalutinį poveikį bei stiprina imuninę sistemą, tačiau yra ir toksinis seleno poveikis. Pastebėta, jog gydymas seleno preparatais padidina riziką susirgti cukriniu diabetu [24,25].

2.1.4. Kadmis

Kadmis – IIB grupės, 5 eilės periodinės elementų lentelės pereinamasis metalas, žymimas Cd (lot. Cadmium). Jo atomo numeris 48, atominė masė – 112,41 a.m.v. Pagal PSO ir Friedeno elementų klasifikaciją, kadmis priskiriamas prie toksiškų mikroelementų. Kartu su kadmiu šiai kategorijai priskiriami ir kiti sunkieji metalai: nikelis, gyvsidabris bei švinas [8]. Leidžiama kadmio koncentracija žmogaus kraujyje 0,01–0,17 μg/dl [13].

Pagrindiniai mikroelemento šaltiniai yra dulkės, užterštas oras, maistas bei cigarečių dūmai [26]. Daugiausia kadmio į organizmą patenka pro kvėpavimo takus [10]. Kadmis yra lengvai apdirbamas metalas, todėl iš sunkiųjų metalų pastarasis plačiausiai naudojamas įvairiose pramonės šakose. Mikroelementas naudojamas elektrotechnikoje, atominėje pramonėje branduoliniuose

reaktoriuose, padangų gamyboje bei kuro pramonėje [26,27]. Iš maisto raciono kadmio daugiausia aptinkama lapinėse daržovėse, jūros gėrybėse bei grūdinės kultūros produktuose [27]. Suaugusiems suvartojamas kadmio kiekis per parą su maistu negali būti didesnis nei 0,005 mg [26]. 30 proc. organizmo pasisavinto kadmio kaupiama inkstuose, o likusi dalis – kepenyse. Sukaupto kadmio kiekio šalinimo pusperiodis yra nuo 10 iki 30 metų. Siekiant sumažinti šio toksiško mikroelemento absorbciją iš aplinkos, metalo naudojimas pramonės šakose turi būti griežtai ribojamas [27,28]. Pastebėta, jog didesnė kadmio koncentracija kraujo serume dažniausiai nustatoma moterims, manoma, dėl mažesnio geležies kiekio [27].

Tarptautinė vėžinių susirgimų tyrimų asociacija, remiantis ilgu šalinimo pusperiodžiu bei statistiškai reikšmingu ryšiu su neurotoksiniais pažeidimais, kadmį priskiria pirmajai kancerogenų grupei [10,29]. Didesnė nei leistina kadmio koncentracija sukelia genetines pažaidas, oksidacinį stresą, slopina DNR replikaciją ir ląstelių diferenciaciją, skatina ląstelių proliferaciją [12,27]. Ilgai besitęsiantis Cd toksinis poveikis gali sukelti lėtinį apsinuodijimą, galvos skausmus, nemigą, osteoparozę, įvairių organų hipofunkcijas, inkstų nepakankamumą, aterosklerozę bei onkologinės ligos formavimąsi [9,26,27]. Nustatyta, kad kadmio jonai konkuruoja ir pakeičia baltymų sudėtyje esančius cinko ar vario jonus, todėl sumažėja fermentų aktyvumas, sutrikdomas ląstelių membranų pralaidumas bei nervinių impulsų perdavimas. Ląsteles nuo sunkiojo metalo poveikio apsaugo viduląsteliniai baltymai metalotioneinai, kurie prisijungia ir nukenksmina kadmio jonus [27-29].

2.1.5. Švinas

Švinas – IVA grupės, 6 eilės periodinės elementų lentelės metalas, žymimas Pb (lot. Plumbum). Jo atomo numeris yra 82, o atominė masė – 207,2 a.m.v. Pagal Pasaulinės sveikatos organizacijos ir Friedeno mikroelementų klasifikaciją, švinas, taip pat kaip ir kadmis, yra priskiriamas toksiškiems mikroelementams: jų funkcinė svarba nenustatyta, o didesnės nei leistinos koncentracijos sukelia ląstelių pažeidimus. Leistina švino koncentracija žmogaus kraujyje 0,40–4,70 μg/dl [13]. Remiantis kitais šaltiniais, priklausomai nuo geografinės gyvenamosios vietos bei darbo specifikos, didžiausia leistina švino koncentracija kraujyje gali svyruoti nuo 10 iki 40 μg/dl, o profesinį kontaktą su švinu ir jo junginiais turintiems suaugusiems asmenims – iki 60-80 μg/dl [30,31]. Nepaisant gausių literatūros duomenų, šiuo metu nėra vieningų normatyvų, nustatančių didžiausią maksimaliai leidžiamą švino koncentraciją kraujyje [30].

Pagrindiniai mikroelemento šaltiniai yra užterštas vanduo, oras bei maistas, ypač jūros gėrybės ar žuvies produktai. Gamtoje švinas ir jo junginiai randami uolienose bei dirvožemyje [9]. Švinas yra lengvai apdorojamas metalas, pasižymintis lankstumu ir atsparumu korozijai, todėl

naudojamas įvairiose pramonės šakose. Pb junginiai naudojami automobilių, statybų, naftos pramonėje kaip antidetonuojanti priemonė, akumuliatorių, ginklų bei pigmentinių dažų gamyboje [32].

Suaugusiems suvartojamas švino kiekis per parą su maistu negali būti didesnis nei 0,001 mg [9]. Švinas į organizmą patenka pro kvėpavimo takus, įkvepiant užteršto oro, pjaustant ar lituojant metalus, pro virškinimo traktą, vartojant užterštą maistą ar geriamąjį vandenį. Nuo 35 iki 40 proc. įkvėptų švino dulkių kaupiama plaučių audiniuose, o apie 65 proc. švino dalelių patenka tiesiai į kraujotakos sistemą ir pernešama į smegenis [32]. Pb funkcinė svarba sveikatai nėra nustatyta, todėl švino ir jo junginių naudojimas pramonėje ir buityje yra griežtai kontroliuojamas.

Tarptautinė vėžinių susirgimų tyrimų asociacija šviną priskiria antrajai kancerogenų grupei, kaip galimai kancerogeninį poveikį turintį sunkųjį metalą [10]. Švino jonai sukelia oksidacinį stresą, slopina DNR pažaidų taisymą bei skatina ląstelių proliferaciją, to pasekmė – piktybinių navikų formavimasis. Nustatytas ryšys tarp padidėjusios švino koncentracijos ir skrandžio, smegenų, inkstų bei plaučių vėžinių susirgimų [33]. Toksiniam švino ir jo junginių poveikiui itin jautrūs kūdikiai, vaikai bei besilaukiančios moterys. Nėščioms moterims dėl didelės švino koncentracijos galima persileidimo tikimybė. Vaikai, kuriems nustatytas apsinuodijimas švino junginiais, dažniausiai serga anemija bei pasižymi agresyviu elgesiu, miego, mokymosi sutrikimais. Žmonėms, apsinuodijusiems švino junginiais vaikystėje, intelekto koeficientas yra mažesnis [32]. Didesnė nei leistina švino koncentracija veikia visus organus, tačiau itin toksiškas poveikis pasireiškia smegenų audiniams. Įrodyta, jog Pb geba praeiti kraujo – smegenų barjerą, kauptis smegenų ląstelėse, slopinti mielino formavimąsi, to pasekmė – sukeliamos genomo pažaidos, sutrikdoma sąmonė, o esant ūmiam toksiniam poveikiui, sukeliama smegenų mirtis [32,34].

2.2. Metalotioneinai

Metalotioneinai (MT) – tai viduląsteliniai, mažos molekulinės masės baltymai, kurių 30 proc. aminorūgščių sudaro cisteinas. Baltymų molekulinė masė 6-7 kDa [35]. Metalotioneinai dėl didelio cisteino aminorūgščių kiekio geba surišti ir nukenksminti sunkiųjų toksiškų metalų jonus bei laisvuosius radikalus. Baltymo struktūroje yra išskiriami α ir β domenai, sujungti lizino aminorūgštimi. Domenas α geba prisijungti keturis mikroelementų jonus, o β domenas – tris (1 pav.) [36]. Metalotioneinai dažniausiai suriša cinko, vario, kadmio, gyvsidabrio bei švino jonus [34,35]. Nustatyta, kad MT yra svarbūs mikroelementų homeostazės palaikymui, ląstelės proliferacijos bei diferenciacijos procesams, ląstelių apsaugai nuo oksidacinio streso bei uždegiminių reakcijų [35,37].

1 pav. Metalotioneinų struktūra: α ir β domenai (adaptuota iš [36], aut. Gumulec J)

Baltymai aptinkami normaliose bei neoplastinėse ląstelėse [36-38]. Žmogaus organizme aptinkamos keturios metalotioneinų izoformos: MT-I, MT–II, MT–III ir MT–IV. Izoformos skiriamos pagal struktūrą, aminorūgščių kiekį, jų išsidėstymo seką, sankaupų lokalizaciją bei sintezės vietą. Audiniuose daugiausia aptinkamos MT–I ir MT-II izoformos. Metalotioneinų MT-III izoforma sintetinama itin mažais kiekiais ir vyrauja smegenų ląstelėse, o MT-IV izoforma – epitelio ląstelėse [36-39].

Metalotioneinų sintezė yra užkoduota šešioliktoje chromosomoje. Sintezę skatina padidėjęs citokinų, augimo faktoriaus, būtinųjų mikroelementų vario, cinko bei sunkiųjų metalų kadmio ir švino koncentracijos. Nustatyta, kad vienas metalotioneinas gali susijungti su keliolika metalo jonų ir suformuoti mikroelementų ir MT kompleksus. Pastarieji apsaugo ląsteles nuo laisvųjų radikalų, radiacijos, citotoksinių medžiagų bei mutagenų poveikio [40].

Remiantis metalotioneinų struktūra bei funkcine reikšme, MT baltymų koncentracijos nustatymas gali būti naudojamas kaip vėžinio susirgimo žymuo [39-41]. Įprastai metalotioneinų koncentracija būna maža, tačiau veikiant toksinams, laisviesiems radikalams ir jų sukeltam oksidaciniam stresui, baltymų sintezė intensyvinama. Nustatyta, kad metalotioneinai gali veikti kaip antioksidantai ir, atvirkščiai, kaip kancerogenai. Dideli metalotioneinų kiekiai slopina baltymo p53 aktyvumą. Neveiklus baltymas p53 sutrikdo ląstelės ciklą, DNR pažeidimų taisymą, slopina ląstelių apoptozę, skatina jų proliferaciją, to išraiška – naviko formavimasis [41,42].

2.3. Naviko formavimasis. Glioblastoma

Ląstelių dalijimasis yra svarbus įvairiems biologiniams procesams: odos epitelio, endometriumo, virškinimo trakto gleivinės ląstelių atsinaujinimui, embriogenezei, augimui, vystymuisi bei prisitaikymui. Šis procesas yra griežtai kontroliuojamas [43]. Ląstelės, paveiktos aktyviomis deguonies formomis, siekiant apsaugoti DNR struktūrą sintetina laisvųjų radikalų nukensminimo baltymus – metalotioneinus, antioksidacinius fermentus bei vitaminus. Naujausi tyrimai atskleidė, jog ląstelės yra pažeidžiamos negrįžtamai, esant didesnei nei leistina sunkiųjų metalų koncentracijai. Švino, kadmio, nikelio, chromo ar kitų metalų žalingas poveikis pasireiškia DNR potransliacinių modifikacijų sutrikdymu, aktyvių deguonies formų susidarymu, oksidaciniu DNR pažeidimu [44]. Atsiradus tokioms kenksmingoms sąlygoms ląstelės gyvenimo ciklas sutrikdomas, apoptoziniai veiksniai išvengiami, ląstelės tampa piktybiškos, prasideda naviko formavimosi procesas [43,45,46].

2016 m. Pasaulinė sveikatos organizacija patvirtino centrinės nervų sistemos (CNS) navikų klasifikaciją pagal naviko histologinius bei molekulinius žymenis. Tokių navikų nustatyta daugiau nei 120 tipų. Suaugusiems centrinės nervų sistemos naviko atsiradimo tikimybė didėja su amžiumi, o vyresniems nei 80 metų žmonėms tikimybė didžiausia. Nustatyta, jog piktybiniai smegenų navikai dažniau pasitaiko vyrams nei moterims [44].

Gliomos – tai centrinės nervų sistemos navikai. Daugiaformė glioblastoma (angl. Glioblastoma multiforme) sudaro 55 proc. visų piktybinių smegenų navikų rūšių [47]. Nustatyta, kad tai yra pati dažniausia, agresyviausia bei blogiausią išgyvenamumo prognozę turinti naviko forma. Išgyvenamumas be gydymo siekia iki 6 mėnesių, o pritaikius chemoterapinį, radioterapinį gydymą bei pašalinus naviką – iki 15 mėnesių [48]. 90 proc. glioblastomos susirgimų atvejų yra de novo glijos ląstelių nekontroliuojamo dauginimosi pasekmė. Likę 10 proc. glioblastomos atvejų yra antrinės kilmės: susiformavę iš kitų, mažesnio piktybiškumo laipsnio neoplastinių darinių, astrocitomų. Glioblastomos navikinės ląstelės daugiausia išsidėsto galvos pusrutulių srityje, smegenų kamiene bei smegenėlese, pasižymi infiltratyviu augimu, todėl chirurginis gydymas yra sudėtingas. Tik 0,4-0,5 proc. sergančiųjų pasitaiko ekstrakranialiniai metastaziniai naviko dariniai. Naviko plitimą riboja kraujo – smegenų barjeras, tačiau besiplečiantis navikas didina intrakranialinį spaudimą ir sukelia hidrocefaliją [49,50].

Apibendrinant literatūros apžvalgos dalį, galima teigti, jog būtinieji mikroelementai yra svarbūs įvairiems fiziologiniams procesams, tačiau jų koncentracija žmogaus organizme turi būti stebima ir kontroliuojama dėl galimo toksiško poveikio – oksidacinio streso. Esant pavojingai mikroelementų koncentracijai išsivysto organizmo struktūriniai ir funkciniai pakitimai, aktyvinami fermentopatiniai bei neoplastiniai procesai. Vienas iš galimų oksidacinio streso apsaugos mechanizmų – metalotioneinų, viduląstelinių antioksidantinių baltymų, sintezė. Metalotioneinai gali veikti ne tik

kaip antioksidantai, bet ir kaip kancerogenai. Staigus MT koncentracijos pokytis, ląstelėse sužadina ląstelių proliferaciją ir sutrikdo ląstelės gyvenimo ciklą, todėl mikroelementų ir metalotioneinų tarpusavio ryšys siejamas su naviko patogeneze.

3. TYRIMO METODAI

Glioblastoma sergančių pacientų tyrimas atliktas vadovaujantis Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro 2019-12-11 leidimu Nr. BEC–LMB (M)–145. Kontrolinės grupės tyrimas atliktas vadovaujantis Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto 2018-03-12 leidimu Nr. BE–2-6.

Bendradarbiaujant su Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Molekulinės neuroonkologijos laboratorija buvo rinkta 2015-2018 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės (LSMUL) Neurochirurgijos klinikoje gydytų smegenų navikais sergančių pacientų biologinių ėminių bazė. Biologinės medžiagos bazę sudarė chirurginės intervencijos metu pašalintas paciento naviko audinys bei kraujo ėminiai, paimti į vakuuminius mėgintuvėlius su antikoaguliantu ličio heparinu (Greiner Bio-One, Austrija), prieš galvos smegenų naviko šalinimo operaciją ir praėjus penkioms dienoms po jos. Tiriamieji mėginiai iki analizės buvo saugomi -80o

C temperatūroje. Iš surinktos biologinių medžiagų bazės buvo atrinkti ėminiai, atitinkantys kriterijus, jog pacientas serga gydytojų patologų patvirtinta IV stadijos glioblastoma, yra kraujo ėminys, paimtas prieš naviko šalinimo operaciją ir po jos, bei navikinio audinio ėminys. Pritaikius pastaruosius kriterijus, buvo atrinkti (n=47) tiriamieji. Iš jų 55,3 proc. (n=26) sudarė moterys, 44,7 proc. (n=21) – vyrai. Sergančiųjų amžiaus vidurkis 58±2 metai, jauniausias tiriamasis 31 metų, vyriausias – 79. Duomenys apie pacientų (n=37) išgyvenamumo trukmę buvo gauti iš Higienos instituto Mirties atvejų ir jų priežasčių valstybės registro.

Bendradarbiaujant su LSMUL Akių ligų klinika buvo rinkta 2018-2019 m. klinikoje gydytų, onkologinėmis ligomis nesergančių, pacientų kontrolinė grupė (n=200), iš kurių 54,5 proc. (n=109) buvo moterys, 45,5 proc. (n=91) – vyrai. Tiriamųjų amžiaus vidurkis 71±1 metai, jauniausias tiriamasis 53 metų, vyriausias – 94. Biologinės medžiagos kontrolinę bazę sudarė kraujo ėminiai, paimti į vakuuminius mėgintuvėlius su antikoaguliantu ličio heparinu (Greiner Bio–One, Austrija). Kraujo mėginiai iki analizės buvo saugomi -80o_{C temperatūroje.}

Glioblastoma sergančių ir kontrolinės grupės tiriamųjų pacientų plazmoje buvo nustatytos vario bei cinko koncentracijos, bendrame kraujyje seleno, kadmio, švino bei metalotioneinų koncentracijos. Glioblastomos naviko audinyje buvo nustatyta metalotioneinų koncentracija. Duomenys analizuoti naudojant IBM SPSS Statistics 23 programą. Reikšmingumo lygmuo nustatytas, kai p<0,05. Paveikslai ir lentelės sudarytos naudojantis Microsoft Excel 2010 programa.

3.2. Mikroelementų koncentracijos nustatymas induktyviai susietos plazmos masių spektrometu

Masių spektrometrija (MS) – tai medžiagų tyrimo metodas, paremtas tiriamosios medžiagos molekulės jonizacija bei jonizuotos molekulės masės ir krūvio santykio (m/z) analize. Skystos fazės mėginys peristaltiniu siurbliu 1 ml/min greičiu patenka į purkštuvą. Analizatoriuje esantis plazmos šaltinis 6000-7000 o

C temperatūroje džiovina argono dujų nešamą mėginį ir paverčia jį į aerozolio lašelius. Aukštoje temperatūroje molekulės, esančios tiriamojoje medžiagoje, disocijuoja, netenka arba prisijungia elektronus ir virsta į teigiamą arba neigiamą krūvį turintį joną. Susidarę jonai atskiriami veikiant kintamam elektriniam laukui ir nukreipiami į masių spektrometrą. Iš kvadrupolio išėjęs jonų signalas, tiesiogiai proporcingas jonų kiekiui, yra fiksuojamas detektoriumi [51-53].

Mikroelementų cinko, vario, seleno, kadmio ir švino koncentracijos nustatytos induktyviai susietos plazmos masių spektrometro analizatoriumi NexION 300D ICP – MS (PerkinElmer, JAV). Atliekant analizę buvo pasirinktas standartinis spektrometro režimas, kai jonų nešiklis argono dujos. Vario ir cinko koncentracija buvo nustatyta kraujo plazmoje, o seleno, kadmio ir švino koncentracija nustatyta bendrame kraujyje. Kraujo ir plazmos mėginiai buvo skiesti tiesioginiu skiedimo metodu: 0,1 ml plazmos buvo praskiesta 1 proc. azoto rūgštimi, santykiu 1:25, o 0,3 ml kraujo buvo praskiesta skiedimo tirpalu, santykiu 1:10. Skiedimo tirpalo sudėtis: 5 g/l NH4OH (Fluka, Kanada) + 0,5 g/l

Triton X – 100 (Merck, Vokietija) + 0,5 g/l EDTA (Sigma Aldrich, Vokietija). Analizės kokybės kontrolė ir patikimumas buvo patikrinti naudojant referencines medžiagas: kraujo ClinChek®–control, whole blood control, level III, serumo – ClinChek®–control, serum control, level I (Recipe, Vokietija).

3.3. Metalotioneinų koncentracijos nustatymas spektrofotometru

Spektrofotometrija – tai medžiagų kiekybinis ir kokybinis tyrimo metodas, kurio metu matuojamas šviesos sugerties intensyvumas esant tam tikram bangos ilgiui. Nustatyta šviesos sugertis yra tiesiogiai proporcinga tiriamos medžiagos koncentracijai [54]. Metalotioneinų koncentracija nustatoma pagal baltymo sudėtyje esančias merkapto grupes (-SH). Elmano reagento sudėtyje esanti DTNB (5,5 – ditobio, 2 – nitrobenzoinė) rūgštis reaguoja su baltymo –SH grupėmis ir sudaro geltonos spalvos junginį – tionitrobenzoatą (TNB), kurio didžiausia sugertis 412 nm bangos ilgio šviesoje (2 pav.) [55,56].

2 pav. DTNB reakcija su baltymų – SH grupėmis (adaptuota iš [56], aut. Galdies C)

Į centrifuginius mėgintuvėlius buvo įdėta 1 ml kraujo ar atitinkamai 1 g naviko audinio, 3 ml 8,6 pH homogenizavimo buferio, kurį sudaro 1 M TRIS ir HCl su priedais: 0,006 mM leupeptino, 0,5 mM PMSF, 0,01 proc. merkapto etanolio. Homogenatas 20 minučių (0/-4o

C) centrifuguotas 30000xg pagreičiu. Į 1 ml gauto supernatanto buvo pridėta 1,05 ml šalto (-20 o_{C) etanolio ir 80 µl chloroformo.}

Atlikus frakcionavimą etanoliu ir chloroformu buvo pašalinti mažos molekulinės masės tirpūs tioliai, kurie galėjo reaguoti su DTNB ir iškreipti rezultatus. Gautas mišinys centrifuguotas 10 minučių (0/-4oC) 6000xg pagreičiu. Supernatantas išpiltas, nuosėdos resuspenduotos 150 µl 0,25 M NaCl ir 150 µl 1 N HCl/4 mM EDTA tirpalais, kuriais buvo pašalinti sunkiųjų metalų katijonai, susijungę su metalotioneinais. Į ištirpintas nuosėdas buvo pridėta 4,2 ml DTNB tirpalo ir centrifuguota 5 minutes 3000xg pagreičiu. Gautas supernatantas naudotas sugerčiai 412 nm bangos ilgyje nustatyti. Supernatanto sugertis buvo matuota UV/Vis spektrofotometru LAMBDA35 (PerkinElmer, JAV). Metalotioneinų koncentracijos kraujyje ir audiniuose nustatytos pagal formules [56]:

1) 𝑐(𝑀𝑇) = 𝐴 ∗ 450, kai c (MT) – metalotioneinų koncentracija kraujyje nM/ml, A – absorbcija 412 nm bangos ilgio šviesoje, 450 – koeficientas, kuris susideda iš ekstencijos koeficiento, -SH grupių skaičiaus, MT molinės masės ir skiedimo koeficiento.

2) 𝑐(𝑀𝑇) = 𝐴 ∗ 167, kai c (MT) – metalotioneinų koncentracija audiniuose µg/g, A – absorbcija 412 nm bangos ilgio šviesoje, 167 – koeficientas, kuris susideda iš ekstencijos koeficiento, -SH grupių skaičiaus, MT molinės masės ir skiedimo koeficiento.

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Nustatyta, kad glioblastoma sergančių tiriamųjų mikroelementų: vario ir cinko, koncentracijos vidurkiai plazmoje yra pasiskirstę pagal normalųjį skirstinį (p>0,05). Kitų mikroelementų – seleno, kadmio ir švino, koncentracijų vidurkiai pasiskirtę pagal nenormalųjį skirstinį (p<0,05). Tuo tarpu kontrolinės grupės tik vario koncentracija plazmoje pasiskirčiusi pagal normalųjį skirstinį (p>0,05), o likusių mikroelementų: cinko, seleno, kadmio bei švino, koncentracijų vidurkiai pasiskirtę pagal nenomalųjį skirstinį (p<0,05).

Pritaikius Stjudento – T kriterijų, nustatyta, kad sergančių glioblastoma tiriamųjų vario koncentracija plazmoje yra 6,8 proc. mažesnė (p<0,05) nei kontrolinės grupės (99,07±28,67 ir 106,34±21,96 µg/dl), cinko koncentracija statistiškai nereikšmingai mažesnė 2,3 proc. (78,02±17,58 ir 79,87±15,79 µg/dl) (3 pav.). Mokslininkai Khosdel ir kiti ištyrė gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžiu sergančius bei sveikus asmenis ir nustatė, jog vėžiu sergančių pacientų plazmoje mikroelementų vario ir cinko koncentracijos buvo statistiškai reikšmingai mažesnės, lyginant su kontroline sveikų asmenų grupe. Remiantis mokslininkų tyrimų duomenimis mažesnę mikroelementų koncentraciją lemiančios priežastys: netinkama mityba bei neigiamas priešnavikinių vaistų poveikis [16]. Mikroelementai cinkas ir varis yra pagrindinė antioksidantinių baltymų: glutationo peroksidazės, superoksido dismutazės ir metalotioneinų, sudedamoji dalis, todėl mažesnę vario ir cinko koncentraciją gali lemti intensyvesnė antioksidantų gamyba [17,57]. Iš literatūros apžvalgos žinoma, jog vario ir cinko koncentracijos sumažėjimas būdingas žmonėms, sergantiems onkologinėmis ligomis. Tad nustatyta mažesnė jų koncentracija plazmoje galimai rodo, jog ląstelėse slopinami DNR struktūrų išlaikymo bei antioksidaciniai procesai, o toksiškų sunkiųjų metalų poveikis intensyvesnis [57,58].

3 pav. Vario ir cinko koncentracija skirtingų grupių tiriamųjų plazmoje

(koncentracijos vidurkis ± standartinis nuokrypis,*p<0,05)

Pritaikius Mann – Whitney testą, nustatyta, jog sergančių glioblastoma tiriamųjų seleno koncentracija kraujyje yra 31,9 proc. mažesnė (p<0,05) nei kontrolinės grupės tiriamųjų kraujyje (10,47±3,59 ir 15,38±5,69 µg/dl) (4 pav.). Remiantis mokslinėmis publikacijomis mažesnę seleno koncentraciją lemia navikinės ląstelės, kurių metabolizmui sunaudojamas mikroelementas. Mokslininkai Jablonska ir kiti ištyrė gerybinius ir piktybinius krūties naviko audinius ir nustatė, jog selenas yra statistiškai reikšmingai susijęs su mestastazių susidarymo tikimybe [58]. Tam pritaria ir kiti mokslininkai, teigiantys: kuo mažesnė seleno koncentracija, tuo didesnė tikimybė susiformuoti metastazėms [57,60].

Priešingai nei kitų mikroelementų koncentracija, švino koncentracija glioblastoma sergančių pacientų kraujyje yra 7,2 proc. didesnė (p<0,05) nei sveikų asmenų kraujyje (4 pav.). Atlikta įvairių mokslinių studijų, tiriant švino sąsajas su navikų formavimusi. Teigiama, kad net mažos švino koncentracijos paveikia centrinės nervų sistemos ląsteles, sukelia oksidacinį stresą, pažeidžia genetinę medžiagą. Viso to pasekmė – galimas naviko formavimasis. Remiantis publikacija, kuomet buvo lyginama virškinamojo trakto vėžiu sergančių bei sveikų asmenų švino koncentracija plazmoje, nustatyta, jog piktybinį naviką turintiems asmenims švino koncentracija didesnė nei sveikiems, tačiau statistiškai nereikšmingai [61]. Mokslininkai Steenland ir kiti ištyrė apie 7000 asmenų, susirgusių įvairiomis naviko formomis, darant prielaidą, jog pastarieji galimai susirgo dėl apsinuodijimo švino junginiais darbo vietoje. Nustatyta statistiškai reikšminga sąsaja tarp švino koncentracijos kraujyje ir smegenų navikų: meningiomos ir gliomos, kancerogenezės mechanizmų. Teigiama, jog švinas pereina kraujo – smegenų barjerą, užimdamas kalcio jonų vietą tarpląsteliniuose baltymuose [62].

99,07±28,67 78,02±17,58 106,34±21,96* 79,87±15,79 0 20 40 60 80 100 120 140 Cu Zn M ikr o e le m e n tų ko n ce n tr ac ija p lazm o je (µ g/ d l) Mikroelementai Sergantys glioblastoma Kontrolinė grupė

4 pav. Seleno ir švino koncentracija skirtingų grupių tiriamųjų kraujyje

(koncentracijos vidurkis ± standartinis nuokrypis,*p<0,05)

Kadmio koncentracija sergančiųjų kraujyje nežymiai – tik 1,7 proc. mažesnė (p<0,05) nei kontrolinės grupės (0,059±0,041 ir 0,060±0,082 µg/dl) (5 pav.). Tuo tarpu mokslininkai Ding ir kiti ištyrė krūties vėžiu sergančias bei sveikas moteris ir nustatė, jog sergančiųjų serume kadmio koncentracija didesnė nei sveikųjų. Abejų tirtų grupių moterų amžiaus vidurkis nesiskyrė [63]. Žinoma, jog įsisavinto kadmio kiekio šalinimo pusperiodis iš organizmo yra 10–30 metų ir kadmio koncentracija didėja su amžiumi [17,64]. Kadangi mūsų tiriamajame darbe kontrolinės grupės tiriamųjų amžiaus vidurkis yra didesnis nei sergančių glioblastoma (71±1 ir 58±2 metai), galima daryti prielaidą, jog dėl šios priežasties žymaus mikroelemento kadmio koncentracijos skirtumo nėra.

5 pav. Kadmio koncentracija skirtingų grupių tiriamųjų kraujyje

(koncentracijos vidurkis ± standartinis nuokrypis,*p<0,05)

10,47±3,59 1,78±0,94 15,38±5,69* 1,66±1,70* 0 5 10 15 20 25 Se Pb M ikr o e le m e n tų ko n ce n tr ac ija kr au jy je (µ g/ d l) Mikroelementai Sergantys glioblastoma Kontrolinė grupė 0,059±0,041 0,060±0,082* 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 K ad m io k o n ce n tr ac ija kr au jy je (µ g/ d l) Cd Cd Sergantys glioblastoma Kontrolinė grupė

Glioblastoma sergančių atvejų metalotioneinų koncentracija kraujyje yra pasiskirsčiusi pagal nenormalųjį skirstinį (p<0,05), o kontrolinės grupės tiriamųjų kraujyje – pagal normalųjį skirstinį (p>0,05).

Pritaikius Stjudento – T kriterijų, nustatyta, kad sergantiems glioblastoma metalotioneinų koncentracija kraujyje yra 63,2 proc. didesnė (p<0,05) nei kontrolinės grupės tirtiems asmenims (0,266±0,083 ir 0,163±0,038 nM/ml) (6 pav.). Iš literatūros apžvalgos yra žinoma, jog metalotioneinai glaudžiai susiję ne tik su būtinaisiais mikroelementais, bet ir su sunkiaisiais metalais [40]. Viduląsteliniai baltymai palaiko mikroelementų koncentracijos pusiausvyrą, nukenksmina sunkiųjų metalų jonus, dalyvauja antioksidaciniuose procesuose. Vis daugiau mokslininkų tvirtina, jog metalotioneinų koncentracija kraujyje gali būti laikoma vėžio žymeniu, padedančiu įvertinti navikinių procesų intensyvumą, imuninės sistemos būklę [41]. Didelis metalotioneinų kiekis gali slopinti ląstelių apoptozę, imuninės sistemos atsaką, tuo pačiu skatinti ląstelių proliferaciją, naviko augimą bei metastazių formavimąsi [65]. Mokslininkai Krizkova ir kiti ištyrė įvairiomis vėžio formomis sergančius bei sveikus asmenis ir nustatė tris kartus didesnę metalotioneinų koncentraciją sergančių serume nei sveikų asmenų. Pastebėta, jog padidėjusi MT koncentracija būdinga rūkantiems asmenims: juos esą intensyviau veikia tabako gaminiuose esantys sunkieji metalai ir pastarųjų sukeliamas oksidacinis stresas. Teigiama, jog metalotioneinų koncentracija gali būti susijusi su naviko klinikine stadija bei jo išplitimo laipsniu [66].

6 pav. Metalotioneinų koncentracija skirtingų grupių tiriamųjų kraujyje

(koncentracijos vidurkis ± standartinis nuokrypis,*p<0,05)

Ištyrus glioblastoma sergančių tiriamųjų kraują, paimtą prieš naviko šalinimo operaciją, nustatyta, kad mikroelementų vario ir cinko koncentracija plazmoje pasiskirsčiusi pagal normalųjį

0,266±0,083 0,163±0,038* 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 M e talot io n e in ų k o n ce n tr ac ija kr au jy je (n M /m l) MT MT Sergantys glioblastoma Kontrolinė grupė

skirstinį (p>0,05), o likusių – seleno, kadmio ir švino koncentracijos kraujyje – pagal nenormalųjį skirstinį (p<0,05). Ištyrus glioblastoma sergančių tiriamųjų kraują po naviko šalinimo operacijos, nustatyta, kad mikroelementų vario ir seleno koncentracijos kraujyje ir plazmoje pasiskirsčiusios pagal normalųjį skirstinį (p>0,05), tuo tarpu kitų mikroelementų – pagal nenormalųjį skirstinį (p<0,05).

Po naviko šalinimo operacijos statistiškai nereikšmingai sumažėjo mikroelementų: vario 5,6 proc. (99,07±28,67 ir 93,49±26,11 µg/dl) ir cinko 0,7 proc. (78,02±17,58 ir 77,46±18,56 µg/dl) koncentracija plazmoje. Pritaikius Mann – Whitney kriterijų, nustatyta, jog sumažėjo (p<0,05) ir kitų mikroelementų: kadmio 22,0 proc. (0,059±0,041 ir 0,046±0,036 µg/dl) bei švino 14,6 proc. (1,78±0,94 ir 1,52±0,82 µg/dl) koncentracijos glioblastoma sergančių tiriamųjų kraujyje (1 lentelė). Mažesnė būtinųjų mikroelementų vario ir cinko koncentracija gali būti siejama su neigiamu priešnavikinių vaistų poveikiu, tuo tarpu sunkiųjų metalų – švino ir kadmio, mažesnės koncentracijos galimai rodo sumažėjusį ląstelių oksidacinį stresą.

Po chirurginės intervencijos, atvirkščiai nei kitų mikroelementų, seleno koncentracija glioblastoma sergančių pacientų kraujyje 7,5 proc. padidėjo (p<0,05) (1 lentelė). Iš literatūros analizės yra žinoma, jog seleno preparatai dažnai skiriami onkologinėmis ligomis sergantiems pacientams po radioterapinės procedūros: taip sumažinamas terapijos šalutinis poveikis bei stiprinama imuninė sistema [24]. Mokslinių tyrimų duomenys rodo, jog maža seleno koncentracija kraujyje gali rodyti prastą išgyvenamumą [67,68].Tad po naviko šalinimo operacijos padidėjusi seleno koncentracija gali būti siejama su mažesniu oksidacinių pažaidų laipsniu, stipresniu antioksidaciniu bei imuninės sistemos atsaku ar geresne išgyvenamumo tikimybe.

1 lentelė. Mikroelementų koncentracijos glioblastoma sergančių tiriamųjų bioterpėse (*p<0,05)

Bioterpė Analitė, matavimo vienetai Vidurkis Standartinis nuokrypis Mažiausia vertė Didžiausia vertė Prieš operaciją Plazma Cu (µg/dl) 99,07 28,67 33,79 161,08 Zn (µg/dl) 78,02 17,58 42,14 130,18 Kraujas Se (µg/dl) 10,48 3,59 4,00 21,89 Cd (µg/dl) 0,059 0,041 0,016 0,208 Pb (µg/dl) 1,78 0,94 0,64 4,75 Po operacijos Plazma Cu (µg/dl) 93,49 26,11 38,08 143,00 Zn (µg/dl) 77,46 18,56 50,63 154,87 Kraujas Se (µg/dl) 11,27* 3,90 4,66 23,31 Cd (µg/dl) 0,046* 0,036 0,014 1,191 Pb (µg/dl) 1,52* 0,82 0,48 4,24

Pritaikius Mann – Whitney kriterijų, nustatyta, kad metalotioneinų koncentracija po naviko šalinimo operacijos glioblastoma sergančių pacientų kraujyje (p<0,05) buvo 19,6 proc. mažesnė

(0,266±0,083 ir 0,214±0,083 nM/ml). Iš literatūros apžvalgos žinoma, jog metalotioneinai dėl didelio cisteino aminorūgščių kiekio geba surišti ir nukenksminti mikroelementų: cinko, vario, švino ar kadmio, jonus, užtikrinant mikroelementų homeostazę bei ląstelių apsaugą nuo oksidacinio streso [35,36]. Įrodyta, jog MT sintezę skatina padidėjęs laisvųjų radikalų kiekis ląstelėse [39]. Galima daryti prielaidą, jog po naviko šalinimo operacijos sumažėjus įvairių mikroelementų koncentracijai bei oksidaciniam stresui, metalotioneinų sintezė buvo pristabdyta.

Metalotioneinų koncentracijos vidurkis naviko audinyje nustatytas 62,96±35,84 µg/g audinio (2 lentelė). Tuo tarpu mokslininkai Florianczyk ir kiti tyrė smegenų naviko astrocitomos (PSO IV) audinius ir nustatė, kad MT koncentracija buvo 30,71±7,84 µg/g audinio [69]. Galima daryti prielaidą, jog didesnė metalotioneinų koncentracija audinyje ir kraujyje rodo, kad glioblastomos atveju MT sintezė yra intensyvesnė dėl stipresnio glijos ląsteles veikiančio oksidacinio streso. Statistiškai reikšmingo ryšio tarp metalotioneinų koncentracijos tiriamųjų kraujyje ir audiniuose nenustatyta.

2 lentelė. Metalotioneinų koncentracija kraujyje ir naviko audinyje (*p<0,05)

Bioterpė Analitė, matavimo

vienetai Vidurkis

Standartinis nuokrypis

Mažiausia

vertė Didžiausia vertė

Kraujas prieš operaciją Metalotioneinai (nM/ml) 0,266 0,083 0,163 0,499 Kraujas po operacijos Metalotioneinai (nM/ml) 0,214* 0,083 0,096 0,500 Naviko audinys Metalotioneinai (µg/g audinio) 62,96 35,84 13,07 249,58

Atlikus mikroelementų tarpusavio ryšių analizę, nustatyta, jog yra statistiškai reikšminga koreliacija tarp glioblastoma sergančių tiriamųjų vario ir cinko koncentracijos plazmoje: r=0,480, p=0,001. Žinoma, jog varis ir cinkas pasižymi tomis pačiomis cheminėmis savybėmis ir yra antagonistai [70]. Mokslininkai Russo ir kiti tyrė autizmu ir kitais neurologiniais sutrikimais besiskundžiančius asmenis ir nustatė mikroelementų vario bei cinko koncentracijų atvirkštinę tarpusavio priklausomybę. Didesnė cinko koncentracija skatina viduląstelinių baltymų sintezę, kurie suriša ir nukenksmina laisvus vario jonus [71]. Mokslininkai Olbert ir kiti tyrė vartojamo cinko oksido preparato įtaką vario koncentracijai serume ir įrodė antagonistinį mikroelementų ryšį [70]. Tvirtinama, jog didesnė vario koncentracija plazmoje susijusi su įvairiomis infekcijomis, uždegimais, traumomis, virškinimo trakto, kepenų, autoimuninėmis ligomis bei neurologiniais sutrikimais. Tokiu atveju siekiant sumažinti vario koncentraciją plazmoje yra taikomas terapinis gydymas cinko preparatais [71]. Šiame baigiamajame darbe nustatyta tiesioginė koreliacija tarp vario ir cinko, žinant pastarųjų

mikroelementų antagonistinį ryšį, manoma negalėtų būti laikoma kliniškai reikšminga. Statistiškai reikšmingo ryšio tarp kitų mikroelementų: seleno, švino ar kadmio, nenustatyta.

Iš kontrolinės grupės tiriamųjų bioterpėse nustatytų mikroelementų rasta statistiškai reikšminga sąsaja tarp vario koncentracijos plazmoje ir kadmio koncentracijos kraujyje (r=0,183, p=0,011). Iš literatūros apžvalgos žinoma, jog kadmis yra toksiškas sunkusis metalas, gebantis konkuruoti ir pakeisti baltymų sudėtyje esantį dvivalentį teigiamą krūvį turintį vario, cinko ar kalcio joną. Tokia mikroelementų sąveika lemia sumažėjusį fermentų aktyvumą bei intensyvesnį aktyvių deguonies formų susidarymą [27,29,72]. Antagonistinį vario ir kadmio jonų ryšį patvirtino mokslininkai Chasapis ir kiti, nustatę atvirkščiai proporcingą sąsają tarp vario ir kadmio koncentracijos [72]. Šiame baigiamajame darbe nustatyta tiesioginė koreliacija tarp vario ir kadmio koncentracijos manoma negalėtų būti laikoma kliniškai reikšminga.

Iš kontrolinės grupės tiriamųjų bioterpėse nustatytų mikroelementų rasta dar viena statistiškai reikšminga sąsaja. Nustatytas ryšys tarp švino ir kadmio koncentracijos kraujyje (r=0,155, p=0,030). Sunkieji metalai pasižymi tomis pačiomis cheminėmis savybėmis, konkuruoja su ląstelėse esančiais būtinųjų mikroelementų jonais [27]. Galima daryti prielaidą, jog kancerogenai švinas ir kadmis yra glaudžiai susiję, nes pasižymi tuo pačiu toksiškumo mechanizmu: sukelia oksidacinį stresą, DNR pažaidas ir skatina naviko formavimosi procesus [33,73].

Iš literatūros apžvalgos žinoma, jog savo struktūros ypatumų dėka metalotioneinai geba surišti kai kuriuos mikroelementus. Manoma, jog dėl šios priežasties MT koncentracija tiesiogiai priklauso nuo mikroelementų koncentracijos biologinėse terpėse [40,41]. Neparametrinis (Spearman) koreliacijos koeficientas parodė statistiškai reikšmingą koreliaciją tarp glioblastoma sergančių tiriamųjų metalotioneinų koncentracijos kraujyje ir vario koncentracijos plazmoje: r=0,314, p=0,032. Mokslininkai Okita ir kiti taip pat nustatė reikšmingą sasąją tarp MT ir Cu koncentracijos žinduolių audiniuose. Teigiama, jog metalotioneinai yra vieni iš svarbiausių viduląstelinių baltymų, dalyvaujančių vario koncentracijos reguliavime [74]. Mokslininkai Russo ir kiti taip pat patvirtina MT ir Cu koncentracijų sąsają. Įrodyta, jog didesnė vario koncentracija aktyvina metalotioneinų sintezę [71]. Tad galima daryti prielaidą, kuo didesnė vario koncentacija plazmoje, tuo didesnis metalotioneinų kiekis yra reikalingas šio mikroelemento homeostazei palaikyti.

Statistiškai reikšmingos sąsajos tarp metalotioneinų ir kitų mikroelementų koncentracijų glioblastoma sergančių tiriamųjų kraujyje nenustatyta. Tarp kontrolinės grupės tiriamųjų bioterpėse nustatytų MT ir mikroelementų koncentracijų sąsąjos taip pat nenustatyta.

Atsižvelgiant į mikroelementų pasišalinimo iš organizmo pusperiodį, galima daryti prielaidą, jog mikroelementų koncentracija gali priklausyti nuo tiriamojo amžiaus. Pritaikius Mann – Whitney kriterijų, nustatyta, jog mikroelementų kadmio ir švino koncentracijos priklauso nuo amžiaus. Kadangi ligonių amžius įvairus, buvo sudarytos dvi tiriamųjų amžiaus grupės: pirmoji <55 metai (40,4 proc.) ir

antroji ≥55 metai (59,6 proc.). Nustatyta, jog prieš chirurginę intervenciją ligoniams, jaunesniems nei 55 metai, kadmio koncentracija kraujyje buvo 6,6 proc didesnė (p<0,05) nei ligoniams virš 55 metų (0,061±0,035 ir 0,057±0,035 µg/dl). Po naviko šalinimo operacijos pirmajai grupei kadmio koncentracijos vidurkis kraujyje nustatytas 4,4 proc. didesnis (p<0,05) nei antrajai grupei (0,045±0,031 ir 0,043±0,029 µg/dl) (7 pav.). Priešingai, mokslininkai Khazen ir kiti nustatė statistiškai reikšmingą ryšį tarp kadmio koncentracijos kraujyje ir amžiaus: jaunesniems nei 51 metų žmonėms kadmio koncentracija buvo gauta mažesnė nei vyresniems [75]. Žinoma, kad kadmio šalinimo pusperiodis yra nuo 10 iki 30 metų, o glioblastoma sergančių pacientų amžiaus vidurkis 58±2 metai. Galima daryti prielaidą, jog dėl jaunesnės glioblastoma sergančių pacientų imties pastarųjų mokslininkų įrodyto kadmio koncentracijos skirtumo tarp amžiaus grupių šiame baigiamajame darbe nenustatyta.

7 pav. Kadmio koncentracija kraujyje skirtingose amžiaus grupėse prieš operaciją ir po jos

(koncentracijos vidurkis ± standartinis nuokrypis,*p<0,05)

Prieš naviko šalinimo operaciją jaunesniems nei 55 metai ligoniams švino koncentracija kraujyje nustatyta nežymiai (5,3 proc.) mažesnė (p<0,05) nei vyresniems, po operacijos – mažesnė 7,0 proc. (p<0,05). Prieš operaciją pirmajai grupei švino koncentracijos vidurkis kraujyje nustatytas 1,70±0,82 µg/dl, po – 1,43±0,69 µg/dl. Tuo tarpu vyresniems nei 55 metai ligoniams švino koncentracija kraujyje prieš chirurginę intervenciją nustatyta 1,79±0,94 µg/dl, po – 1,53±0,82 µg/dl (8 pav.). Mokslininkai Behinaein ir kiti tyrė švino koncentracijos priklausomybę nuo amžiaus ir taip pat nustatė pacientams virš 51 metų didesnę švino koncentraciją kraujyje nei jaunesniems [76].

0,061±0,035 _0,057±0,035 0,045±0,031* 0,043±0,029* 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 <55 ≥55 K ad m io k o n ce n tr ac ija kr au jy je (µ g/ d l) Amžiaus grupė Prieš operaciją Po operacijos

8 pav. Švino koncentracija kraujyje skirtingose amžiaus grupėse prieš operaciją ir po jos

(koncentracijos vidurkis ± standartinis nuokrypis,*p<0,05)

Statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp amžiaus ir kitų mikroelementų: vario, cinko, seleno – koncentracijos nenustatyta.

Mokslininkai teigia, jog yra statistiškai reikšminga sąsaja tarp metalotioneinų koncentracijos ir amžiaus [35]. Nustatyta, kad vyresniems nei 70 metų žmonėms pastarųjų baltymų gamyba susilpnėja [77]. Mūsų tiriamajame darbe taip pat nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys tarp metalotioneinų koncentracijos ir amžiaus grupių. Prieš naviko šalinimo operaciją ir po jos jaunesniems nei 55 metai ligoniams metalotioneinų koncentracija kraujyje nustatyta vos 1,1 proc. didesnė (p<0,05) nei vyresniems ligoniams. Prieš operaciją pirmajai grupei metalotioneinų koncentracijos vidurkis kraujyje nustatytas 0,269±0,077 nM/ml, po – 0,186±0,080 nM/ml. Prieš operaciją antrajai grupei MT koncentracijos vidurkis kraujyje nustatytas 0,266±0,078 nM/ml, po – 0,184±0,080 nM/ml (9 pav.).

1,70±0,82 1,79±0,94 1,43±0,69* 1,53±0,82* 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 <55 ≥55 Šv in o ko n ce n tr ac ija kr au jy je (µ g/ d l) Amžiaus grupė Prieš operaciją Po operacijos