Rasa Smalinskaitė
V kursas, 7 grupėGENETINIŲ VEIKSNIŲ SĄSAJOS SU BURNOS DUGNO
VĖŽIU
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbo vadovas
Prof. Habil dr. Ričardas Kubilius
2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA ODONTOLOGIJOS FAKULTETAS
VEIDO IR ŽANDIKAULIŲ CHIRURGIJOS KLINIKA
GENETINIŲ VEIKSNIŲ SĄSAJOS SU BURNOS DUGNO VĖŽIU
Darbą
atliko magistrantė ...
(parašas)
... (vardas pavardė, kursas, grupė)
20....m. ...
(mėnuo, diena)
Darbo vadovas ...
(parašas)
... (mokslinis laipsnis, vardas pavardė)
20....m. ...
(mėnuo, diena)
3 KLINIKINIO - EKSPERIMENTINIO BAIGIAMOJO MAGISTRINIO DARBO VERTINIMO
LENTELĖ
Įvertinimas: ...
Recenzentas: ...
(moksl. laipsnis, vardas pavardė)
Recenzavimo data: ...
Eil.
Nr. BMD dalys BMD vertinimo aspektai
BMD reikalavimų atitikimas ir įvertinimas Taip Iš dalies Ne 1
Santrauka (0,5 balo)
Ar santrauka informatyvi ir atitinka darbo turinį
bei reikalavimus? 0,2 0,1 0
2 Ar santrauka anglų kalba atitinka darbo turinį bei
reikalavimus? 0,2 0.1 0
3 Ar raktiniai žodžiai atitinka darbo esmę? 0,1 0 0
4 Įvadas, tikslas uždavini
ai (1 balas)
Ar darbo įvade pagrįstas temos naujumas,
aktualumas ir reikšmingumas? 0,4 0,2 0
5 Ar tinkamai ir aiškiai suformuluota problema, hipotezė, tikslas ir uždaviniai? 0,4 0,2 0
6
Ar tikslas ir uždaviniai tarpusavyje susiję? 0,2 0,1 0
7
Literatūros apžvalga (1,5 balo)
Ar pakankamas autoriaus susipažinimas su kitų
mokslininkų darbais Lietuvoje ir pasaulyje? 0,4 0,2 0 8
Ar tinkamai aptarti aktualiausi kitų mokslininkų tyrimai, pateikti svarbiausi jų rezultatai ir
išvados? 0,6 0,3 0
9
Ar apžvelgiama mokslinė literatūra yra pakankamai susijusi su darbe nagrinėjama
problema? 0,2 0,1 0
10 Ar autoriaus sugebėjimas analizuoti ir sisteminti mokslinę literatūrą yra pakankamas? 0,3 0,1 0 11 Medžiaga
ir metodai
Ar išsamiai paaiškinta darbo tyrimo metodika, ar
ji tinkama iškeltam tikslui pasiekti? 0,6 0,3 0
12
Ar tinkamai sudarytos ir aprašytos imtys, tiriamosios grupės; ar tinkami buvo atrankos kriterijai?
4 13 (2 balai)
Ar tinkamai aprašytos kitos tyrimo medžiagos ir priemonės (anketos, vaistai, reagentai, įranga ir pan.)?
0,4 0,2 0
14
Ar tinkamai aprašytos statistinės programos naudotos duomenų analizei, formulės, kriterijai, kuriais vadovautasi įvertinant statistinio patikimumo lygmenį?
0,4 0,2 0
15
Rezultatai (2 balai)
Ar tyrimų rezultatai išsamiai atsako į iškeltą
tikslą ir uždavinius? 0,4 0,2 0
16 Ar lentelių, paveikslų pateikimas atitinka
reikalavimus? 0,4 0,2 0
17 Ar lentelėse, paveiksluose ir tekste kartojasi
informacija? 0 0,2 0,4
18 Ar reikšmingumas? nurodytas duomenų statistinis 0,4 0,2 0 19 Ar tinkamai atlikta duomenų statistinė analizė? 0,4 0,2 0 20
Rezultatų aptarimas
(1,5 balo)
Ar tinkamai įvertinti gauti rezultatai (jų svarba,
trūkumai) bei gautų duomenų patikimumas? 0,4 0,2 0 21 Ar tinkamai įvertintas gautų rezultatų santykis su kitų tyrėjų naujausiais duomenimis? 0,4 0,2 0 22 Ar autorius pateikia rezultatų interpretaciją? 0,4 0,2 0 23
Ar kartojasi duomenys, kurie buvo pateikti kituose skyriuose (įvade, literatūros apžvalgoje, rezultatuose)?
0 0,2 0,3
24
Išvados (0,5 balo)
Ar išvados atspindi baigiamojo darbo temą,
iškeltus tikslus ir uždavinius? 0,2 0,1 0
25 Ar išvados pagrįstos analizuojama medžiaga; ar atitinka tyrimų rezultatus ? 0,2 0,1 0
26 Ar išvados yra aiškios ir lakoniškos? 0,1 0,1 0
27
Literatūros sąrašas (1 balas)
Ar bibliografinis literatūros sąrašas sudarytas
pagal reikalavimus? 0,4 0,2 0
28
Ar literatūros sąrašo nuorodos į tekstą yra teisingos; ar teisingai ir tiksliai cituojami literatūros šaltiniai?
0,2 0,1 0
29 Ar literatūros sąrašo mokslinis lygmuo tinkamas
moksliniam darbui? 0,2 0,1 0
30
Ar cituojami šaltiniai, ne senesni nei 10 metų, sudaro ne mažiau nei 70% šaltinių, o ne senesni kaip 5 metų – ne mažiau kaip 40%?
0,2 0,1 0
Papildomi skyriai, kurie gali padidinti surinktą balų skaičių
31 Priedai Ar pateikti priedai padeda suprasti nagrinėjamą temą? +0,2 +0,1 0
32
Praktinės rekomenda
cijos
Ar yra pasiūlytos praktinės rekomendacijos ir ar
5 Bendri reikalavimai, kurių nesilaikymas mažina balų skaičių
33
Bendri reikalavimai
Ar pakankama darbo apimtis (be priedų) 15-20 psl. (-2 balai)
<15 psl. (-5 balai) 34 Ar darbo apimtis dirbtinai padidinta? -2 balai -1 balas
35 Ar darbo struktūra atitinka baigiamojo darbo
rengimo reikalavimus? -1 balas -2 balai
36 Ar darbas parašytas taisyklinga kalba, moksliškai, logiškai, lakoniškai? -0,5 balo -1 balas 37 Ar yra gramatinių, stiliaus, kompiuterinio raštingumo klaidų? -2 balai -1 balas
38 Ar tekstui būdingas nuoseklumas, vientisumas, struktūrinių dalių apimties subalansuotumas? -0,2 balo -0,5 balo
39 Plagiato kiekis darbe
>20% (nevert.
) 40
Ar turinys (skyrių, poskyrių pavadinimai ir puslapių numeracija) atitinka darbo struktūrą ir yra tikslus?
-0,2 balo -0,5 balo
41
Ar darbo dalių pavadinimai atitinka tekstą; ar yra logiškai ir taisyklingai išskirti skyrių ir poskyrių pavadinimai?
-0,2 balo -0,5 balo
42 Ar buvo gautas (jei buvo reikalingas) Bioetikos
komiteto leidimas? -1 balas
43 Ar yra (jei reikalingi) svarbiausių terminų ir santrumpų paaiškinimai? -0,2 balo -0,5 balo
44
Ar darbas apipavidalintas kokybiškai (spausdinimo, vaizdinės medžiagos, įrišimo kokybė)?
-0,2 balo -0,5 balo
*Viso (maksimumas 10 balų): *Pastaba: surinktų balų suma gali viršyti 10 balų.
Recenzento pastabos: ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
6 ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
7
TURINYS
SANTRAUKA ... 9 SUMMARY ... 10 SANTRUMPOS ... 11 ĮVADAS ... 13 LITERATŪROS APŽVALGA ... 151.1 Burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinomos epidemiologija ... 15
1.2 Etiologija ... 16
1.3 Patogenezė ... 17
1.4 Diagnostika ... 18
1.5 Genetiniai veiksniai ... 18
1.6 TLR4 receptorius ... 18
1.7 Matrikso metalo proteinazės ... 20
1.7.1 Matrikso metalo proteinazė-8... 21
1.8 Kolagenas 2 A 1 ... 22
1.9 Genų polimorfizmo sąsajos su vėžiu ... 24
1.9.1 TLR4 geno sąsajos su navikais ... 24
1.9.2 MMP-8 geno sąsajos su navikais ... 24
1.9.3 Col2A1 sąsajos su vėžiu ... 25
TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 26
2.1 Tyrimo planavimas ... 26
2.2 Tyrimo objektas ... 26
2.3 Tiriamųjų atranka ... 26
2.4 Mėginių rinkimas ... 26
2.5 Deoksiribonukleino rūgšties išskyrimas ... 27
8
2.7 Polimerazės grandinės reakcija ... 27
2.8 TLR – PGR metodas ... 27
2.9 Statistinė duomenų analizė ... 29
REZULTATAI ... 30
3.1 TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genotipų ir alelių dažnis BDV sergančių pacientų grupėje ... 30
3.2 TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genų polimorfizmo sąsajos su polinkiu sirgti burnos dugno vėžiu ... 35
3.3 TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genų polimorfizmo ir rūkymo sąsajos pacientams sergantiems burnos dugno vėžiu. ... 36
REZULTATŲ APTARIMAS ... 41
IŠVADOS ... 43
9
GENETINIŲ VEIKSNIŲ SĄSAJOS SU BURNOS DUGNO VĖŽIU
SANTRAUKA
Burnos dugno vėžys yra vienas agresyviausių ir blogiausią prognozę turinčių navikų. Kancerogenezę skatina aplinkos ir genetiniai veiksniai, kurie dažnai veikia kartu, skatindami ląstelių piktybėjimą bei naviko židinio formavimąsi. Burnos dugno vėžiu sergančiųjų pacientų išgyvenamumas yra mažas. Tai skatina ieškoti naujų prognozinių žymenų ir molekuliniame lygmenyje tirti procesus, vykstančius piktybiniuose burnos dugno audiniuose.
Tyrimo tikslas: Nustatyti TLR4, MMP-8, COL2A1 genų polimorfizmo paplitimą burnos dugno vėžiu
sergantiems pacientams ir įvertinti šių genetinių veiksnių sąsajas su polinkiu sirgti burnos dugno vėžiu.
Tyrimo objektas ir metodai: Tirti 32 pacientai sergantys burnos dugno vėžiu ir 63 kontrolinės grupės
asmenys. Genų polimorfizmas buvo nustatytas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu. Statistinė duomenų analizė atlikta IBM SPSS Statistics programa.
Rezultatai: Tirtų genų genotipų pasiskirstymas BDV ir kontrolinėje grupėje atitinka Hardžio Veinbergo dėsnį. Nustatėme, kad Col2A1 geno polimorfizmas didina riziką sirgti burnos dugno vėžiu: moterų grupėje statistiškai reikšmingai (p = 0,0448) serga turinčios GT genotipą, lyginant su GG genotipą turinčiomis. Mutantinis T alelis, lyginant su G BDV riziką susirgti didina 2,5 karto (p=0,046). Nustatėme, kad rūkymas statistiškai patikimai susijęs su BDV sergančių pacientų 85 proc. rūkė ir 85,7 proc. rūkančiųjų buvo diagnozuota 4 ligos stadija. Asmenims, turintiems MMP8 geno mutantinį AA
genotipą ir rūkantiems, rizika sirgti burnos dugno vėžius penkis kartus didesnė, nei turintiems GG genotipą. MMP8 geno mutantinis AA genotipas ir rūkymas penkis kartiu BDV penkis kartus didesnė, nei turimtiems GG genotipą.
Išvados: Burnos dugno vėžiu sergančių pacientų TLR4, MMP-8 ir Col2A1 genotipų ir alelių dažniai
statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolinės grupės. Col2A1 rs1635529 mutantinis T alelis statistiškai reikšmingai 2,5 karto didina riziką sirgti burnos dugno vėžiu. MMP8 geno mutantinis AA genotipas ir rūkymas penkis kartus didina riziką susirgti burnos dugno vėžiu.
10
ASSOCIATION BETWEEN GENETIC FACTORS AND FLOOR OF
THE MOUTH CANCER
SUMMARY
Floor of the mouth cancer is one of the most aggressive tumors and it has one of the worst prognosis. Carcinogenesis is caused by environmental and genetic factors, that often work together causing cellular malignancy and tumor formation. The survival rate of the patients with floor of the mouth tumor is low. It encourages to search for the new predictive markers and to examine the processes, occurring in the malignant floor of the mouth tissues, at the molecular level.
The aim of the study: to determine the prevalence of polymorphism of TLR4, MMP-8, COL2A1 genes
in the patients with floor of the mouth cancer and to assess the relationship between these genetic factors and susceptibility to the floor of the mouth cancer.
Methods and Subjects of the research: 32 patients with floor of the mouth cancer and 63 subjects of
the control group were studied. Genotyping was done using a real-time polymerase chain reaction method. Statistical data analysis was done using IBM SPSS Statistics program.
Results: the distribution of researched genotypes in the floor of the mouth cancer and control group
coincides with Hardy Weinberg’s principle. It was determined that the polymorphism of the Col2A1 gene increases the risk of developing the floor of the mouth cancer: in the female group statistically significantly (p = 0.0448) are sick with GG genotype, compared to the ones with GG genotype. Mutant T allele, compared with G allele, increases the risk of disease 2,5 times (p=0,046). It was determined that smoking is statistically reliably related with patients with floor of the mouth cancer, 85% smoked and 85,7% of the smokers were diagnosed with stage 4 cancer. Risk of the floor of the mouth cancer for the individuals who have mutant AA genotype of the MMP-8 gene and smoke is five times higher as for the ones with GG genotype.
Conclusions: Rates of the TLR4, MMP-8, and Col2A1 genotypes and alleles in patients with floor of the
mouth cancer were not statistically significant from the control group. The Col2A1 rs1635529 mutant T allele has a statistically significant 2.5 times increase in the risk of developing floor of the mouth cancer. Risk of the floor of the mouth cancer for the individuals who have mutant AA genotype of the MMP-8 gene and smoke is five times higher as for the ones with GG genotype.
11
SANTRUMPOS
MMP – matrikso metalo proteinazė TLR - toll-like receptorius
Col - kolagenas
VNP – vieno nukleotido polimorfizmas PRR – patogenų atpažinimo receptorius C - citozinas
T - timinas
LPS - lipopolisacharidai
CD14 – diferencijavimo klasteris 14
TLR4/MD2 -toll-like receptorius 4 ir mieloidinio diferencijavimo faktorius 2
TIRAP – TIR domeną turintis batymas adaptorius (anglų k. TIR Domain Containing Adaptor Protein) MyD88 – mieloidinės diferencijacijos pirminis atsakas (anglų k. Myeloid Differentiation Primary Response 88)
IRAK – su interleukinu susijusi kinazė TIR - translokuotas intimino receptorius
TRAM – translokaciją reguliuojantis membranos baltymas (anglų k. Translocation Associated Membrane Protein)
TRIF – TIR domeną turintis adapteris indukuojantis interferoną-β (anglų k. TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β)
G - guaninas A - adeninas Bp – bazių poros
TIMP – metalo proteinazės audinių inhibitorius BDV – burnos dugno vėžys
EDTA - etilendiamintetraacetatas DNR – deoksiribonukleorūgštis
PGR – polimerazės grandininė reakcija
TL-PGR - tikro laiko polimerazės grandinės reakcija FAM – fluorescuojantis dažas
12 VIC – Fluorescuojantis dažas
SN – standartinis nuokrypis P – reikšmingumo lygmuo GS – galimybių santykis PI – pasikliautinumo intervalas
13
ĮVADAS
Burnos ir veido, žandikaulių srities vėžys yra dažnas galvos ir kaklo srities onkologinis susirgimas. Burnos vėžys Europoje sudaro 1–5 proc. visų vėžinių susirgimų. Kasmet Lietuvoje nustatoma virš 300 naujų burnos ir veido, žandikaulių srities vėžio atvejų. Burnoje ir veido, žandikaulių srityje dažniausiai išsivysto epitelio plokščiųjų ląstelių karcinoma [1]. Burnos dugno gleivinės navikai sudaro apie 20 proc. burnos navikų, tai vienas agresyviausių ir blogiausią prognozę turinčių navikų. Jis greitai plinta į gretimas struktūras ir organus: liežuvį, apatinį žandikaulį, kraujagysles, nervus, plačiai metastazuoja. Dažniausiai pasitaiko endofitinė arba mišri opėjanti forma, egzofitinė forma pasitaiko rečiau [2].
Kancerogenezę skatina aplinkos veiksniai: rūkymas, jonizuojantieji ir ultravioletiniai spinduliai, alkoholis, aplinkos užterštumas, netinkama mityba ar fizinio aktyvumo stoka, taip pat genetiniai veiksniai. Dažnai aplinkos veiksniai ir genetiniai veiksniai veikia kartu inicijuodami ląstelių piktybėjimą bei naviko židinio formavimąsi [3]. Prasta prognoze bei polinkiu plisti pasižymintys burnos ir veido, žandikaulių srities vėžiniai susirgimai, dažniausiai diagnozuojami 60-80 metų vyrams, tačiau dėl intensyvaus rūkymo ir alkoholio vartojimo pacientais tampa vis jaunesni asmenys. Nepaisant to, kad pastaraisiais metais tobulėja diagnostikos ir gydymo metodai, sergančiųjų burnos dugno vėžio pacientų išgyvenamumo rodiklis mažai pasikeitė lyginant su ankstesniais dešimtmečiais [3]. Todėl yra svarbu tirti procesus vykstančius piktybiniuose burnos dugno audiniuose ir molekuliniame lygmenyje ieškoti naujų vėžio žymenų.
Vėžys vystosi dėl genų mutacijų, reguliuojančių svarbias ląstelių funkcijas. Piktybinio proceso metu vyksta tarpląstelinio jungiamojo audinio remodeliavimasis ir šiame procese metu matrikso metalo proteinazės (MMP) atlieka vieną svarbiausių vaidmenų. MMP-8, kaip ir visos matrikso metalo proteinazės, dalyvauja tarpląstelinio užpildo makromolekulių degradavime, audinių persitvarkyme bei kolageno pluoštų skaidyme. MMP-8 priskiriamos tiek vėžio vystymąsi skatinančios, tiek ir priešvėžinės savybės .[4]
Toll – like receptorius 4 (TLR4) koduoja endotoksino signalizacijos receptorių, kuris atlieka pagrindinį vaidmenį nustatant patogeną ir aktyvinant įgimtą imunitetą. Įgimtas imuninis atsakas yra pirminė gynybos grandis nuo invazinių patogenų [5]. Lėtinis uždegimas atlieka svarbų vaidmenį skatinant keletą vėžio formų ir gali būti rizikos veiksnys daugelyje organizmo vietų. Ankstesni tyrimai parodė, kad uždegimas, sukeltas TLR, atlieka svarbų vaidmenį karcinogenezėje ir naviko progresavime, todėl galėtų būti prognozinis vėžio žymuo [6].
14 Kolagenas yra pagrindinis jungiamojo audinio struktūros, tame tarpe ir burnos gleivinės, elementas, todėl jo sudėtis kiekviename audinyje turi būti tiksliai sureguliuota siekiant išlaikyti audinio vientisumą. Kolageno 2A1 (Col2A1) geno mutacijos gali sutrikdyti kolageno susidarymą ir kremzlės formavimąsi [7].
Darbo tikslas
Nustatyti TLR4, MMP-8, COL2A1 genų polimorfizmo paplitimą burnos dugno vėžiu sergantiems pacientams ir įvertinti šių genetinių veiksnių sąsajas su polinkiu sirgti burnos dugno vėžiu.
Darbo uždaviniai
1. Nustatyti TLR4, MMP-8, COL2A1 genų polimorfizmo pasiskirstymą burnos dugno vėžiu sergantiems pacientams ir kontrolinėje grupėje.
2. Įvertinti TLR4, MMP-8, COL2A1 genų polimorfizmo sąsajas su polinkiu sirgti burnos dugno vėžiu.
15
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinomos epidemiologija
Onkologiniai susirgimai yra plačiai paplitę visame pasaulyje: kiekvienais metais užregistruojama daugiau nei 10 mln. sergančių vėžiu, o miršta beveik 7 mln. susirgusiųjų. Virš 16 tūkstančių naujų onkologinių susirgimų kiekvienais metais diagnozuojama Lietuvoje, o nuo piktybinių navikų kasmet miršta virš 8 tūkstančių gyventojų [1]. Burnos ir veido, žandikaulių srities navikų Lietuvoje kasmet nustatoma virš 300 atvejų, iš jų apie 20 proc. - burnos dugno gleivinės navikai. Dažniausiai nustatoma vėžio forma burnos srityje yra epitelio plokščialąstelinė karcinoma [8]. Nacionalinio vėžio instituto 2012 m. duomenimis naujų burnos vėžio susirgimų buvo 338, daugiausiai 60-74 metų amžiaus grupeje. (1 lentelė) [8]. Įvairių tyrimų duomenimis vyrai serga 3-5 kartus dažniau nei moterys. Burnos srities vėžinių susirgimų mirtingumas moterų tarpe yra yra palygint mažesnis, tačiau jis didėjantis, ypač paskutiniais dešimtmečiais [9].
Bendras pacientų, sergančių liežuvio ir burnos dugno plokščialąsteline karcinoma, išgyvenamumas yra mažas, nepaisant vis gerėjančios diagnostikos ir gydymo pažangos [10]. Nors dažniausiai burnos dugno plokščialąsteline karcinoma serga vyresnio amžiaus žmonės (vidurkis 62 metai), tačiau diagnozavus vėžį 40 metų ar jaunesniems pacientams, nustatyta sunkesnė ligos eiga ir blogesnės prognozės. Lyginant su kitomis Europos šalimis, Lietuvoje mirtingumo rodiklis nuo vėžio išlieka vieni aukščiausių. Nuolatinis ligos atvejų didėjimas buvo nustatytas ir kitose centrinės ir rytinės Europos šalyse, daugiausiai Vengrijoje, taip pat ir Baltarusijoje, Rumunijoje. [9]
1 lentelė. 2012 metų burnos vėžio statistika Lietuvoje
Lytis Atvejai Pasiskirstymas pagal amžiaus grupes Mirčių skaičius 15-29 30-44 44-59 60-74 74-89+ Vyrai 260 1 16 107 113 23 196 Moterys 78 - 5 26 33 32 43
16
1.2 Etiologija
Burnos dugnas yra U formos sritis po liežuviu, kuri apima ten esančią gleivinę ir malamąjį poliežuvio raumenį (lot. k. musculus mylohyoideus). Šioje srityje augantis piktybinis navikas yra vadinamas burnos dugno vėžiu. Būdingi požymiai – skausmas burnoje, baltos, raudonos arba tamsios dėmės, žandikaulio skausmas ar patinimas, vėliau atsiranda ir kaklo skausmas. Plokščialąstelinė karcinoma sudaro didžiausią dalį (90 proc.) burnos ertmės piktybinių navikų. Ji būna endofitinė, egzofitinė arba mišri. Burnos ertmėje gali būti ir metastazavusių kitų lokalizacijų pirminių navikų.
Susirgimas burnos vėžiu atsiranda dėl individualaus polinkio, susijusio su specifinėmis genetinėmis sąvybėmis ir kancerogeninių veiksnių poveikio, kurį sukelia gyvenimo būdo įpročiai. [2] Pagrindiniai aplinkos veiksniai, lemiantys tiek burnos ertmės, tiek ir gerklų vėžio išsivystymą yra rūkymas bei alkoholio vartojimas. Šių onkologinių susirgimų pasireiškimo tikimybė tiesiogiai susijusi su per dieną suvartojamo alkoholio ir surūkytų cigarečių kiekiu. Burnos plokščialąstelinė karcinoma su žalingais įpročiais dažniausiai yra siejama vyresniame amžiuje (virš 55 m.), tačiau yra mažai žinoma apie potencialius rizikos faktorius, siejamus su šia liga sergančiais jaunesniais pacientais [2, 3].
Vėžio (įskaitant burnos plokščialąstelinės karcinomos) vystymąsis siejamas su genetinių ir epigenetinių pokyčių atsiradimu, dėl kurių sutrinka signalo perdavimo būdai. Navikas yra sudėtinis audinys. Jame yra naviko ląstelių ir aplinkinės stromos, įvairių tipų mezenchiminių ląstelių ir ekstaląstelinės matricos – visa tai vadinama naviko mikro aplinka. Keičiantis naviko ląstelių vaizdui, keičiasi ir aplinkiniai komponentai. Kadangi vėžys progresuoja, aplinkinė mikro aplinka taip pat bendrai vystosi ir sudaro naviko – aplinkos sąveiką. [11]
Genetiniai ir epigenetiniai burnos plokščialąstelinės karcinomos pokyčiai gali sukelti ir baltymų pokyčius, įskaitant ir sumažėjusią ar padidėjusią raišką. Šių pokyčių kaupimasis onkogenuose ir navikus slopinančiuose faktoriuose, gali sukelti navikinių ląstelių suaktyvėjimą [11, 12].
1.2.1. Burnos ertmės mikroflora
Burnos ertmėje egzistuoja sudėtinga, daugiakomponentė mikroflora, kuri būna subalansuota esant normalioms sąlygoms. Tam tikros rūšys mikroorganizmų gali sutrikdyti šią pusiausvyrą, dėl to atsiranda mikrofloros disbiozė [13]. Burnos plokščialąstelinės karcinomos atveju pastebėtas žymiai didesnis P.
gingivalis ir fuzobakterijų kiekies, lyginant su sveika burnos ertme. Tiek P. gingivalis, tiek F. nucleatum
sukelia lėtines infekcijas, kurios paveikia epitelio ląsteles ir gali plisti sistemiškai bei sukelti daugiau burnos ertmės infekcijų ir pažeisti individo imuninę sistemą. Vėliau kitos bakterijos, esančios burnos
17 ertmėje, tokios kaip F. nucleatum, gali tapti oportunistiniais patogenais, o bendras disbiozinis mikrobų poveikis kartu su išbalansuotu imuniniu atsakiu, galiausiai sukelia burnos ertmės audinių ligas [14, 15].
1.3 Patogenezė
Ilgalaikis poveikis kancerogenų, tokių kaip tabakas, alkoholis, onkogeniniai virusai ir uždegimai gali paveikti atskirus genus, taip pat chromosomas. Pakitusių genų gausėjimas ir kaupimasis gali sukelti priešvėžinius pažeidimus, o vėliau ir karcinomą [16]. Šie genetiniai pakitimai apima mutacijų pagausėjimą ir onkogenų amplifikaciją, kurie atsakingi už ląstelės gyvavimą ir proliferaciją, taip pat stabdo naviką slopinančių genų proliferaciją. Dėl šių onkogenų ir naviką slopinančių veiksnių pokyčių, naviko ląstelės įgyja sąvarankišką, autonomišką augimą ir blokuoja naviko supresinius signalus, dėl to atsiranda nekontroliuojamas naviko augimas. Taigi, navikinės ląstelės išvengia užprogramuotos mirties ir sukelia nekontroliuojamą ląstelių skaičiaus augimą. Augant plokščialąstelinei karcinomai invazyviai ir metastazuojant, labai svarbus yra naujų kraujagyslių formavimąsis. Burnos plokščialąstelinė karcinoma, kaip ir dauguma karcinomų, yra pajėgi stimuliuoti kraujotakos aktyvumą, endotelio ląstelių proliferaciją ir naujų kraujagyslių formavimąsi [17]. Kancerogenezės metu vyrauja proangiogeniniai veiksniai, kurie yra būtini sėkmingam naviko formavimuisi. Vėlesnis plokščialąstelinės karcinomos progresas apima audinių invaziją ir metastazavimą. Augant invazyviai į sveiką audinį yra nuslopinamos ląsteles sujungiančios molekulės, tokios kaip integrinas ir kadherinas, kad onkogeninės ląstelės galėtų plisti už pirminio židinio ribų [16].
Vėžio požymiai: Hanahanas ir Weinbergas aprašė šešias pagrindines vėžinių ląstelių charakteristikas, skiriančias jas nuo normalių ląstelių [18] :
1. Augimo ląstelių sąvarankiškumas;
2. Nejautrumas signalams, slopinantiems augimą 3. Programuotos ląstelių mirties išvengimas
4. Nemirtingumas arba neribotas replikacijos potencialas 5. Nepertraukiama angiogenezė
6. Invazija į audinius ir metastazės
Šios charakteristikos yra labai naudingos vertinant pokyčius, atsirandančius kancerogenezės metu, taip pat progresavimą ir supiktybėjimo laipsnį [17].
18
1.4 Diagnostika
Pacientų, sergančių plokščialąsteline karcinoma, prognozė daugiausia priklauso nuo ligos stadijos diagnozavimo metu. Todėl yra svarbu tobulinti diagnostikos metodus, kad kuo anksčiau nustačius būtų pradėtas gydymas ir taip išvengta mirties atvejų. Todėl būtų tikslinga atlikti atrankines programas didelės rizikos grupėms, pvz., daug rūkantiems ar vartojantiems didelius kiekius alkoholio pacientams, taip pat anksčiau sirgusiems onkologinėmis ligomis galvos ir kaklo srityje ar už šios srities ribų [19]. Burnos dugno vėžio klinikinė diagnostika: paciento paprašoma atitraukti liežuvį atgal, tada apžiūrima ir palpuojama burnos ertmė. Ieškoma spalvos ir tekstūros pakitimų, patinimų, gleivinės paviršiaus pakitimų, kurie yra geriau pastebimi nusausinus gleivinę. Didesnė rizika karcinomai yra srityje tarp liežuvio ir apatinio žandikaulio ties moliarais, nes čia gleivinė yra labiau pažeidžiama [20]. Burnos plokščialąstelinės karcinomos klinikinės charakteristikos yra tipiškos pažengusio vėžio atveju, tačiau diagnozei patvirtinti neužtenka vien klinikinės diagnostikos – visada reikia atlikti biopsiją diagnozės patvirtinimui. Pažengusias stadijas reikia diferencijuoti nuo kitų piktybinių navikų, tokių kaip limfoma, taip pat metastazių, sarkomų. Ankstyvosiose stadijose neteisinga klinikinė diagnozė yra dar labiau tikėtina [21].
1.5 Genetiniai veiksniai
Plokščialąstelinės karcinomos atsiradimas yra daugybės genetinių pokyčių rezultatas, vykstantis skirtinguose genuose ir molekuliniuose lygmenyse [22].
Vieno nukleotido polimorfizmai (VNP) yra dažniausiai pasitaikančios genetinės variacijos (dažnis daugiau nei 1 proc. žmonių populiacijoje) ir yra aptinkami konkrečioje genomo vietoje [23]. Jei VNP yra koduojančioje arba reguliacinėje geno dalyje, tai, veikdamas su žalingais ir aplinkos veiksniais, lemia padidėjusią riziką vystytis onkologiniam susirgimui [24].
TLR4, MMP8, Col2A1 genų polimorfizmai yra svarbūs genetiniai veiksniai vėžio vystymuisi ir
progresavimui. Esant genetinėms mutacijoms šiuose genuose, rizika susirgti didėja.
1.6 TLR4 receptorius
Vieną iš pagrindinių vaidmenų įgimtame imuniniame atsake prieš bakterinės kilmės infekciją vaidina Toll-like receptoriai (angl. k. Toll-like receptors; TLR). TLR receptoriai lokalizuoti skirtingose ląstelėse plazminėje membranoje (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6) ir endosomose (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) [25]. Toll-like receptoriai priklauso patogenų atpažinimo receptorių (PRR) šeimai. Žinduolių ląstelėse ekspresuojami Toll baltymo homologai, kurių išoriniai domenai atpažįsta patogenų (pvz.,
19 bakterijų) ligandus ir per ląstelės viduje esančio domeno sukeltą atsaką užtikrina organizmo nespecifinį imunitetą [2]. Šiuo metu yra nustatyta žmogaus ir ląstelėse 10 TLR, kurie dalyvauja nespecifiniam imuniniam atsake ir turi didelę įtaką pradiniam uždegiminiui atsakui. TLR receptoriai lokalizuoti skirtingose ląstelėse plazminėje membranoje (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6) ir endosomose (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) [26].
TLR4 genas yra 117,704,175 iki 117,717,491 bazių porų, lokalizuotas yra 9 chromosomos ilgojo peties 33.1 lokuse (9q33.1)
1pav. TLR4 geno vieta 9 chromosomoje (9q33.1) (rodo rodyklė). Adaptuota pagal ,,TLR4 toll like receptor 4 Homo sapiens (human)“. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7099
Žmonių populiacijoje yra nustatyta daug vieno nukeotido polimorfizmų (VNP) TLR4 gene. Vienas iš jų yra TLR4 rs1927911, introne kur nukleotidas citozinas (C) yra pakeistas į timiną (T). Esant šiai VNP, pakinta geno raiška.
Lipopolisachridai (LPS) yra gramneigiamų bakterijų komponentai, juos atpažįsta TLR4 receptorius, kuris aktyvuoja priešuždegiminių mediatorių gamybą, siekiant pašalinti bakterijas. Tipiniu atveju LPS prijungiami prie CD14 baltymų, kurie yra įsitvirtinę membranoje cholesterolio- sfingolipidų turinčiais mikrodomenais, vadinamais plaustais [27]. CD14 perkelia LPS į kompleksą TLR4/ MD-2. Receptoriaus komplekso dimerizacija sukelia TIRAP, MyD88 ir IRAK kinazes į midosomą TIR domene, kuris sukelia signalinį kelią, iššaukiantį priešuždegiminių citokinų gamybą. Po endocitozės, TRAM ir TRIF yra susiję su TLR4 sukurtu signaliniu keliu, kuris kontroliuoja I tipo interferonų ir kitų citokinų gamybą [6]. Taigi, TLR veikia kaip patogenų jutiklis ir aptinkamas ląstelėse tokiose kaip dendritinės ląstelės ir makrofagai.
20
2 pav. TLR4 aktyvavimas bakterijų lipopolisacharidais. Adaptuota pagal A. Plociennikowska “Co-operation of TLR4 and raft proteins in LPS-induced pro-inflammatory signaling”.
1.7 Matrikso metalo proteinazės
Matrikso metalo proteinazės (MMP) yra didelė grupė proteazių, kurių savo sudėtyje yra Ca ir Zn jonų. Proteinazės ardo tarpląstelinio jungiamojo audinio komponentus esant fiziologinėms sąlygoms ir patologinės audinių remodeliacijos metu. Yra nustatyti 24 genai, koduojantys priklausančias žmogaus MMP šeimai proteinazes [4; 29]. MMP kartu gali degraduoti visus tarpląstelinio užpildo komponentus, taip pat pasižymi gebėjimais sintetinti augimo faktorius, citokinus, receptorius, ląstelių adhezijos molekules, baltymų inhibitorius bei aktyvuoti kitas proteinazes. MMP dalyvauja įvairiuose fiziologiniuose procesuose, tokiuose kaip: embriogenezė, uždegiminiai procesai, žaizdų gijimas, kaulų pertvarkymas, taip pat ir vystantis patofiziologinėms būklėms - artritui bei lėtinėms žaizdoms, aterosklerozei, širdies nepakankamumui, taip pat siejamos su auglių metastazavimu, invazyvumu ir angiogeneze [30]. MMP pošeimiai yra skirstomi pagal pirminę struktūrą, substratą ir lokalizaciją: kolagenazės, kurios ardo fibrilinį kolageną; stromelizinai, kurie ardo fibronektiną, lamininą ir nefibrilinį kolageną; želatinazės, kurios ardo želatiną, fibrilinį bei IV ir V tipo kolageną; membraninio tipo MMP, kurios ardo proteoglikanus, glikoproteinus ir želatinazes bei kitos MMP [31].
21
3 pav. MMP struktūra. Adaptuota pagal T. Grzela “Matrix metalloproteinases in aortic aneurysm – executors or executioners?”.
1.7.1 Matrikso metalo proteinazė-8
Matrikso metalo proteinazė-8 (MMP-8), yra 85 kDa molekulinės masės fermentas priklausantis MMP kolagenazių grupei [32]. MMP-8 daugiausiai yra sintetinama neutrofiluose, kurių granulėse, kaulų čiulpuose neaktyvus pro-fermentas yra saugomas, bet kai tarpląstelinis stimulas sukelia neutrofilų degranuliaciją, jis aktyvuojamas ir greitai išskiriamas į kraujotakos sistemą [33]. Nors daugiausiai MMP-8 išsiskiria vykstant neutrofilų degranuliacijai, fermento raiška stebima ir fibroblastuose, endotelio, epitelio bei plazmos ląstelėse, keratinocituose bei makrofaguose [34].
MMP-8, kaip ir visos matrikso metalo proteinazės, dalyvauja tarpląstelinio užpildo makromolekulių degradavime, audinių persitvarkyme bei kolageno pluoštų skaidyme. Didžiausiu efektyvumu fermentas pasižymi skaidant I tipo kolageną [35], MMP-8 veikia kaip lėtinio ir ūminio uždegimo mediatorius, kadangi jis būtinas neutrofilų chemotaksiui bei judėjimui į audinius. Šis fermentas, ardydamas ir pertvarkydamas tarpląstelinį užpildą bei kraujagyslių pamatinę membraną, palengvina leukocitų migraciją į uždegimo vietą. MMP-8 taip pat gali suskaidyti ne tik tarpląstelinio užpildo komponentus,bet ir angiotenziną, chemokinus bei proteazių inhibitorius [36].
22
MMP-8 gene nustatyta daug VNP, vienas iš jų - rs11225395 yra promotoriaus regione. Esant mutacijai,
4206 bazių poroje guaninas yra pakeistas adeninu. Atliekus eksperimentus in vitro nustatyta, jog kai yra mutantinis A alelis, MMP-8 geno promotoriaus aktyvumas padidėja 1,8 karto, nei kai yra laukinio tipo G alelis. Manoma, kad tai lemia sąveika su branduolio baltymais kurie veikia kaip transkripcijos stiprikliai o tai lemia didesnį A alelio promotoriaus aktyvumą [36].
1.8 Kolagenas 2 A 1
Kolagenų (COL) genai koduoja baltymus kolagenus, kurie sudaro trečdalį organizmo baltymų masės [37]. Kolagenas – vienas svarbiausių užląstelinio matrikso atraminių baltymų, randamas jungiamuosiuose audiniuose ir epitelinio audinio bazinėje membranoje [7]. Kolagenai yra sudaryti iš kelių grandinių tipų fibriles formuojantys kolagenai ( I, II, III ir V tipai), nefibriliniai bazinės membranos kolagenai (IV tipas), kurių kiekvienas tipas turi daug izoformų [38]. Iki šiol yra žinomi ir gerai ištirti 28 kolageno tipai [39], dažniausi yra I –V. I tipas aptinkamas odoje, sausgyslėse, kauluose; II tipas – kremzlėse, stiklakūnyje; III tipas – tinklainėje; IV tipas formuoja bazinę membraną; V tipas aptinkamas ląstelių paviršiuje, plaukuose. Daugiausia kolagenų gamina fibroblastai, kurių yra daug epitelinėse ląstelėse ir įvairaus tipo jungiamajame audinyje ir [40].
Ląstelėse kolagenai atlieka įvairias funkcijas. Kai kurie iš jų atlieka svarbų vaidmenį ląstelių adhezijoje, kuri yra svarbi normalios audinio struktūros ir funkcijos palaikymui [41]. Bet, svarbiausia yra tai, kad kolagenai yra pagrindinė užląstelinio matrikso sudedamoji dalis [42]
COL2A1 geno koduojamos II tipo kolageno alfa-1 grandinės yra spiralinės molekulės su abiejuose
galuose esančiais N- ir C-propeptidais. Tokios trys alfa-1 grandinės susisukdamos tarpusavyje sudaro triviję, į virvę panašią prokolageno molekulę, kuri yra II tipo kolageno pagrindas [43]. Vėliau prokolageno molekulės išskiriamos į užląstelinę ertmę ir apdorojamos fermentų – N- ir C-proteinazių [44]. Po amino ir karboksilo terminalinių galų nuo prokolageno molekulės nuėmimo, apdorotos
4 pav. MMP-8 geno lokalizacija 11-oje chromosomoje (rodo rodyklė). Adaptuota pagal http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MMP8&keywords=mmp8]
23 molekulės tampa kolagenu ir susikomponuoja į plonas, labai organizuotas fibriles, kurios kryžmiškai jungiasi viena su kita. Kryžminiai fibrilių ryšiai suformuoja labai stiprias ir brandžias II tipo kolageno skaidulas, kurios suteikia stuktūrą ir stiprumą jungiamiesiems audiniams, kurie palaiko kūno raumenis, sąnarius ir odą. [45] II tipo kolageno fibrilių ir skaidulų formavimasis pavaizduotas 5 paveiksle.
COL2A1 genas yra 12 žmogaus chromosomos ilgajame petyje – 12q13.11 (12 chromosomos ilgojo peties
1 regiono 3 segmento 1 subsegmento 1 ruožas). Molekulinė COL2A1 vieta: nuo 47,972,965 bazių poros (bp) iki 48,025,286 bp. Geno dydis – 52322 bazės [46]. Genas sudarytas iš 57 egzonų [46]. Geno lokalizacija chromosomoje pavaizduota 6 paveiksle.
5pav. II tipo kolageno susidarymas. Adaptuota pagal B.R. Olsen
6pav. COL2A1 geno lokalizacija 12-oje chromosomoje (rodo rodyklė). Adaptuota pagal
24 Šis genas koduoja baltymą – II tipo kolageno alfa-1 grandinę, fibrilinį kolageną, kuris jungiamiesiems audiniams suteikia tvirtumo bei reikiamą struktūrą. Baltyminis produktas sudarytas iš 1487 aminorūgščių, jo molekulinė masė – 141785 Da [45].
Manoma, kad 48001319 nukleotido srityje yra mutacija (NCBI VNP indentifikacija rs1635529) – G nukleotido pokytis į T (NC_000012.12:g.48001319G>T). Ši nukleotidų pakaita lemia geno raiškos pokyčius [46]
1.9 Genų polimorfizmo sąsajos su vėžiu
1.9.1 TLR4 geno sąsajos su navikais
Navikai yra glaudžiai susiję su lėtiniu uždegimu, kurio metu vyksta įvairūs pokyčiai uždegiminėse vietose – imuninių ląstelių infiltracija, proliferacija, citokinų gamyba ir imuninų ląstelių sąveika su audiniais. Šie pokyčiai sukelia dinamišką ir sudėtingą mikroaplinką, palankią naviko augimui, invazijai ir metastazėms.
Toll-like receptorius 4 yra pirmas identifikuotas tokio tipo receptorių šeimos narys, kuris gali atpažinti su patogenais susijusius molekulinius modelius ir su žala susijusiu molekulinius modelius. TLR atpažįsta ne tik imunines, bet ir navikines ląsteles. Įvairūs tyrimai yra įrodę, kad TLR4 naviko aplinkoje gali ne tik sustiprinti priešvėžinį imunitetą, bet tam tikrais atvejais ir atvirkščiai – sukelti navikinių ląstelių progresavimą [6].
1.9.2 MMP-8 geno sąsajos su navikais
MMP, esant normaliai organizmo fiziologinei būklei, raiškos lygis audiniuose ir kūno skysčiuose yra
mažas ir aktyvumas žymiai padidėja esant patologonei būklei, pavyzdžiui uždegiminėms ligoms ir vėžiui. Įvairiuose vėžio tipuose buvo nustatyta padidėjusi MMP raiška [47].
Yra ištirta daugybės neoplastinių ligų gebėjimas gaminti kolagenolitinius fermentus ir kai kuriems epitelio kilmės navikų tipams yra labai didelis kolagenolitinis aktyvumas. Tuo tarpu mezenchiminės kilmės neoplastinės ligos ir ne neoplastiniai audiniai tik retai gamina kolagenazes. Taigi, MMP-8 gali skatinti naviko augimą, bet jis taip pat turi ir antimetastazinį vėžio vaidmenį [47].
Keli tyrimai teigia, kad MMP-8 skatina naviko augimą ir metastazes ir yra naviko progresavimo žymuo. Pavyzdžiui, MMP-8 yra išreikštas galvos srities plokščiųjų ląstelių karcinomos atveju [48].
25
1.9.3 Col2A1 sąsajos su vėžiu
Daugelyje epitelio sluoksnių, įskaitant burnos ertmę, užląstelinis matriksas yra sudarytas iš laminino, kolageno, fibronektino glikozaminoglikanų, išskirtinai nuo keratinicitų ir stromos ląstelių ar nuo šių ląstelių tarpusavio sąveikos. Audiniuose kolagenas tradiciškai laikomas tik fiziniu barjeru nuo vėžio invazijos ir naviko ląstelių migracijos [49].
Sveikuose epitelio audiniuose ląstelės išsidėsto glaudžiai ir lygiagrečiai, sudaro sluoksnį su skirtingais apikaliniais ir bazaliniais paviršiais. Kai genuose, kontroliuojančiuose ląstelių augimą ir mirtį, įvyksta epigeniniai pokyčiai ir somatinės mutacijos, mutavusios ląstelės proliferuoja nekontroliuojamai ir palankiai veikia karcinomos vystymąsi in situ [50].
Burnos dugno plokščialąstelinės karcinomos vystymąsis yra trijų pakopų procesas, apimantis naviko ląstelių adhezijos pokyčius, molekulių, tokių kaip bazalinės membranos, užląstelinio matrikso ir MMP ir naviko ląstelių migraciją proteolitiškai modifikuotu užląsteliu matriksu.
Kadangi genetinių veiksnių svarba BDV patogenezėje yra akivaizdi, ieškoma naujų genetinių žymenų sąsajų su BDV pasireiškimu ir progresavimu. TLR4, MMP-8 ir COL2A1 genų vieno nukleotido polimorfizmai (VNP) galėtų būti svarbūs molekuliai žymenys.
26
TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tyrimo planavimas
Magistro baigiamojo darbo tyrimai atlikti LSMU Veido ir žandikaulių chirurgijos klinikoje. Prieš pradedant šį darbą buvo analizuojamas problemos aktualumas, renkama informacija apie anksčiau atliktus mokslinius tyrimus, aiškinančius burnos dugno plokščialąstelinės karcinomos etiopatogenezę, nagrinėjami tirti genų pakitimai ir jų ryšys su burnos dugno plokščialąsteline karcinoma. Vėliau analizuojamos genetinių tyrimų metodikos ir jos įsisavinamos bei užsakomi reagentai ir laboratorinės priemonės, reikalingos TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genų vieno nukleotido polimorfizmui nustatyti. Gavus LSMU bioetikos centro leidimą (Nr. BEC–OF-52) buvo pradėtas magistro baigiamojo darbo tyrimas.
2.2 Tyrimo objektas
Tyrime dalyvavo burnos dugno vėžiu sergantieji pacientai, buvo ištirta 33 asmenys: 25 vyrai ir 8 moterys, kurių amžiaus vidurkis 59, 6 metai. Kontrolinė grupė sudaryta iš 63 asmenų: 43 vyrų ir 20 moterų, jų amžiaus vidurkis 60,5 metų.
2.3 Tiriamųjų atranka
Tyrimo metu burnos vėžiu sergantiems pacientams ir kontrolinės grupės asmenims buvo ištirtas TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genų polimorfizmai, Tiriamųjų imtis sudaryta laikantis kriterijų: pacientai, kuriems diagnozuotas burnos vėžys, nesergantys kitomis onkologinėmis ligomis, gera bendra būklė ir raštiškas tiriamųjų sutikimas dalyvauti tyrime. Kontrolinė grupė sudaryta pagal kriterijus: jų raštiškas sutikimas, gera bendra būklė, nesergantys jokiomis onkologinėmis ligomis.
2.4 Mėginių rinkimas
Tyrimui kraujas iš pacientų ir kontrolinės grupės asmenų buvo paimtas į vakuuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatas), kad nesukrešėtų. Iki DNR skyrimo mėgintuvėliai buvo laikomi - 20 ºC temperatūroje.
27
2.5 Deoksiribonukleino rūgšties išskyrimas
Genominė DNR buvo iš periferinio kraujo leukocitų išskirta silikagelio kolonėlių metodu, naudojant gDNR universalų rinkinį gDNR valymo universalus rinkinys (PureLink Genomic DNA, Invitrogen, AB Thermo Fisher, Lietuva). DNR išskyrimas vykdytas pagal gamitojo rekomendacijas.
2.6 DNR koncentracijos matavimas
DNR koncentracija ir švarumas buvo nustatytas spektrofotometriniu metodu. Naudojomės “Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis” spektrofotometru. Optinių tankių 260nm/280nm santykis rodo DNR tirpalų švarumą, kuris turi būti 1,8 -2,0.
2.7 Polimerazės grandinės reakcija
Genų polimorfizmo tyrimas TLR4 (C/T), MMP8 (-799G/A)ir Col2A1 (G/T) polimorfizmų tyrimas buvo atliktas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos (TL-PGR) metodu. TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genotipavimui buvo naudoti rinkiniai (,,Applied Biosystem“, JAV). PGR yra metodas trumpoms DNR sekų gausinti in vitro. Darbo eiga: TL-PGR mėginių paruošimas, gausinimas, PGR reakcijos produktų nustatymas ir analizė. Pagrindiniai TL-PGR komponentai yra: genominė DNR, universalus genotipavimo mišinys (TagMan Universal PCR Master Mix) ir pradmenys su molekuliniais zondais (SNP Genotypimg Assay). TLR4 (C/T), MMP-8 (-799G/A) ir Col2A1 (G/T) genų polimorfizmai nustatyti ABI 7900HT (“Applied Biosystems”, JAV) TL-PGR aparatu. Buvo naudojami reagentai: fluorescensiniais dažais pažymėti molekuliniai zondai, sterilus vanduo ir 2X Maxima™ Probe/ROX qPCR Master mix buferis. Buvo paruoštas atitinkamas TL–PGR mišinys TLR4
(C/T), MMP8 (-799G/A)ir Col2A1 (G/T) genų VNP nustatymui.
Paruošiami mėginiai genotipavimui: į 96 mėginių plokštelę išpilstomas paruoštas PGR mišinys ir įpilama tiriamųjų DNR, 1 kontrolinis mėginys ir paskutinis mėginys - kontrolė su vandeniu. Ant plokštelės buvo užklijuota optinė plėvelė ir centrifuguota 15 sekundžių, esant 10 000 aps./min.
2.8 TLR – PGR metodas
VNP TaqMan® genotipavimo metodo principas paremtas PGR ir DNR polimerazės 5´ nukleaziniu aktyvumu, kuris veikia fluorescenciškai žymėtus zondus. Reakcijai vykti reikalingas trijų etapų ciklas: denatūracija, pradmenų bei zondų hibridizacija ir DNR fragmento pagausinimas. Tačiau iš pradžių vyksta iniciacijos etapas, kuris reikalingas AmpliTaqGold® DNR polimerazės aktyvacijai. Ši reakcija
28 vykdoma 95°C temperatūroje 10 minučių. Po to cikliškai vykstant TL-PGR reakcijai yra pasikartojantys etapai:
1. DNR denatūracija: šio etapo metu dėl aukštos temperatūros nutrūksta vandenilinės jungtys ir DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos tapdamos viengrandėmis. Denatūracijos sąlygos paprastai yra 94–95°C temperatūra,
2. Pradmenų ir zondų hibridizacija. Sumažinus temperatūrą iki 40–60°C, pradmenys ir zondai komplementariai prisijungia prie norimo pagausinti DNR fragmento.
3. Atsiskyrus DNR grandinėms vykdoma hibridizacijos ir elongacijos reakcijos. DNR fragmento
amplifikacija. Pakėlus temperatūrą iki 70–75°C ir reakciją katalizuojant fermentui
AmpliTaqGold® DNR polimerazei sintetinamas naujas, komplementarus matricinei, norimas
pagausinti DNR fragmentas.
Ciklas gali būti kartojamas 25–40 kartų – su kiekvienu ciklu susintetintų fragmentų skaičius padvigubėja, o fluorescencijos intensyvėjimas kiekvieno ciklo metu stebimas realiu laiku.
Genotipavimui naudojamos dvi TL - PGR programos: ,,Alelių nustatymas“ ir ,,Absoliutus gausinimas”. Genotipavimo rezultatų pavyzdys pateiktas 7 paveiksle. Pagal skirtingų detektorių fluorescensijos intensyvumo santykį programa nustatė individų genotipus. X ašyje buvo pasirinktas VIC fluorescensiniais dažais arba Yakima Yellow žymėtas molekulinis zondas, o Y ašyje FAM fluorescensiniais dažais žymėtas molekulinis zondas.
29 Paveiksle homozigotai pagal pirmą alelį (GG) atitinka mėlynos spalvos tašką, heterozigotai, turintys abu alelius (GT), - žalios spalvos tašką, o homozigotai pagal retesnį antrą alelį (TT) – raudonos spalvos tašką. × simbolis vaizduoja nenustatytą mėginį, o juodas kvadratas grafiko kairiajame apatiniame kampe – neigiama kontrolė.
2.9 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterinę programą „IBM SPSS Statistics 20.0“. Naudojantis SPSS programiniame pakete prieinamais aprašomosios statistikos įrankiais apskaičiuotos tiriamųjų charakteristikos. Rezultatai pateikiami realiaisiais skaičiais, mediana, mažiausia ir didžiausia vertėmis. Geno polimorfizmo genotipų ir alelių pasiskirstymas sergantiems bei kontrolinėje grupėse buvo vertintas pagal Hardžio-Veinbergo pusiausvyros dėsnį. Genotipų pasiskirstymas tarp sergančiųjų ir kontrolinės grupės lygintas taikant χ² kriterijų. Tiriamųjų nepriklausomų grupių skirtumams nustatyti naudotas Kruskal-Wallis H kriterijus. Ligos pasireiškimo kiekviename paveldėjimo modelyje galimybių santykis (GS) apskaičiuotas atlikus dvinarę logistinę regresiją. GS pateikiamas su 95 proc. patikimumo intervalu (PI). Skirtumai ar ryšiai vertinti kaip statistiškai reikšmingi, kai p<0,05 (p vertė – reikšmingumo lygmuo).
7 pav. TL-PGR metodu nustatyti alelių pasisikrstymo rezultatai (rs1635529
30
REZULTATAI
Tyrimo metu buvo sudarytos dvi grupės: pacientai, sergantys BDV ir kontrolinės grupės asmenys. BDV sergančiųjų grupę sudarė 32 asmenys: 25 buvo vyrai ir 8 moterys, tiriamųjų amžiaus mediana – 59 metai. Kontrolinę grupę sudarė 63 asmenys: 43 buvo vyrai ir 20 moterų ir amžiaus mediana - 60 metų. Tiriamųjų charakteristika pateikta 2 lentelėje. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta lyginant sergančius su kontroline grupe.
2 lentelė. Tiriamųjų charakteristika
Charakteristika Pacientai, sergantys BDV N, (proc.) Kontrolinė grupė N, (proc.) p reikšmė Vyrai 25 (75,8) 43 (68,2) 0,360 Moterys 8 (24,2) 20 (31,8) Amžius Vidurkis (SN) 59,6 (12,18) 60,5 (9,62) 0,727
BDV – burnos dugno vėžys; SN – standartinis nuokrypis; p – reikšmingumo lygmuo, rezultatai statistiškai reikšmingi, kai p<0,05
3.1 TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genotipų ir alelių dažnis BDV sergančių pacientų grupėje
Įvertinome TLR4 (C/T), MMP8 (-799G/A)ir Col2A1 (G/T) genotipų ir alelių dažnį BDV pacientams ir kontrolinės grupės asmenims; kontrolinėje bei BFV grupėse genotipų pasiskirstymas atitinka Hardžio Veinbergo dėsnį (p>0,05). Statistiškai reikšmingų skirtumų visų tirtų genų genotipų ir alelių dažnių tarp BVD sergančiųjų grupės ir kontrolinės nenustatėme.
31
3 lentelė. TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai BDV bei kontrolinėje grupėse
Genas Genotipas, alelis Dažnis (proc.) BDV N (proc.) p vertė HWE Kontrolinė grupė N (proc.) p vertė HWE p vertė TLR4 rs1927911 TT TC CC Iš viso T C 3 (9,1) 13 (39,4) 17 (51,5) 33 (100) 19 (28,8) 47 (71,2) p=0,899 4 (6,3) 23 (36,5) 36 (57,1) 63 (100) 31 (24,6) 95 (75,4) p=0,822 p=0,821 MMP-8 rs11225395 AA AG GG Iš viso A G 8 (24,2) 16 (48,5) 9 (27,3) 33 (100) 32 (48,5) 34 (51,5) p=0,825 12 (19,0) 30 (47,6) 21 (33,3) 63 (100) 54 (42,9) 72 (57,1) p=0,866 p=0,764 Col2A1 rs1635529 GG GT TT Iš viso G T 21 (63,6) 11 (33,3) 1 (3,0) 33 (100) 53 (80,3) 13 (19,7) p=0,403 51 (81,0) 12 (19,0) 0 (0) 63 (100) 114 (90,5) 12 (9,5) p=0,758 P=0,099
p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
32 Įvertinome TLR4, MMP-8 ir Col2A1 genotipų ir alelių dažnį BDV pacientams ir kontrolinės grupės asmenims, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį. BDV sergančių pacientų moterų grupėje TLR4 genotipai ir aleliai pasiskirstė taip: TT genotipas nenustatyta, TC 62,5 proc. ir CC – 37,5 proc. ir T alelis 31,25 proc., C – 68,75 proc. Kontrolinės moterų grupės genotipai pasiskirstė atitinkamai 5 proc., 40 proc. ir 55 proc. bei aleliai 25 proc. ir 75 proc. BDV sergančių vyrų grupėje TT genotipo nustatyta 7 proc., TC – 32 proc. ir CC – 56 proc. ir T alelis 28, C – 72. Kontrolinės vyrų grupės genotipai pasiskirtė atitinkamai taip: 7 proc., 34,9 proc. ir 58,1 proc. bei aleliai 24,4 proc. ir 75,6 proc. TLR4 polimorfizmo alelių ir genotipų dažniai tarp burnos vėžiu sergančiųjų ir kontrolinės imties buvo palyginti tiriamuosius skirstant į grupes pagal lytį, tačiau statistiškai reikšmingi skirtumai nebuvo nustatyti (4 lentelė)
4 lentelė. TLR4 rs1927911 polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai BDV bei kontrolinėje grupėse,
atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Genas Genotipas, alelis Moterys P reikšmė Vyrai p reikšmė BDV grupė N (proc.) Kontroli nė grupė N (proc.) BDV grupė N (proc.) Kontroli nė grupė N (proc.) TLR4 rs1927 911 TT 0 (0) 1 (5) 0,503 3 (7) 3 (7) 0,777 TC 5 (62,5) 8 (40) 8 (32) 15 (34,9) CC 3 (37,5) 11 (55) 14 (56) 25 (58,1) Viso 8 (100) 20 (100) 25 (100) 43 (100) Alelis 0,633 0,645 T 5 (31,25) 10 (25) 14 (28) 21 (24,4) C 11 (68,75) 30 (75) 36 (72) 65 (75,6)
BDV – burnos dugno vėžys; SN – standartinis nuokrypis; p – reikšmingumo lygmuo, rezultatai statistiškai reikšmingi, kai p<0,05
33 BDV sergančių pacientų moterų grupėje MMP-8 genotipai ir aleliai pasiskirstė taip: AA genotipas nustatytas 12,5 proc. , AG- 62,5 proc. ir GG – 25 proc. ir A alelis 43,75 proc., G – 56,25 proc. Kontrolinės moterų grupės genotipai pasiskirstė atitinkamai 10 proc., 60 proc. ir 30 proc. bei aleliai 40 proc. ir 60 proc. BDV sergančių vyrų grupėje AA genotipo nustatyta 28 proc., AG – 44 proc. ir GG – 28 proc. ir A alelis 50, G – 50. Kontrolinės vyrų grupės genotipai pasiskirtė atitinkamai taip: 23,3 proc., 41,9 proc. ir 34,9 proc. bei aleliai 44,2 proc. ir 55,8 proc. MMP-8 polimorfizmo alelių ir genotipų dažniai tarp burnos vėžiu sergančiųjų ir kontrolinės imties buvo palyginti tiriamuosius skirstant į grupes pagal lytį, tačiau statistiškai reikšmingi skirtumai nebuvo nustatyti (5 lentelė).
5 lentelė. MMP-8 rs11225395 polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai BDV bei kontrolinėje grupėse,
atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Genas Genotipas Moterys P reikšmė Vyrai p reikšmė BDV grupė N (proc.) Kontrolinė grupė N (proc.) BDV grupė N (proc.) Kontrolinė grupė N (proc.) MMP-8 rs11225 395 AA 1 (12,5) 2 (10) 0,956 7 (28) 10 (23,3) 0,822 AG 5 (62,5) 12 (60) 11 (44) 18 (41,9) GG 2 (25) 6 (30) 7 (28) 15 (34,9) Viso 8 (100) 20 (100) 25 (100) 43 (100) Alelis 0,797 0,512 A 7 (43,75) 16 (40) 25 (50) 38 (44,2) G 9 (56,25) 24 (60) 25 (50) 48 (55,8)
BDV – burnos dugno vėžys; SN – standartinis nuokrypis; p – reikšmingumo lygmuo, rezultatai statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
34 BDV sergančių pacientų moterų grupėje Col2A1 genotipai ir aleliai pasiskirstė taip: GG genotipas nustatytas 75 proc. , GT - 25 proc. ir TT– nenustatyta ir G alelis 87,5 proc., T – 12,5 proc. Kontrolinės moterų grupės genotipai pasiskirstė atitinkamai 185 proc., 15 proc. ir taip pat nenustatyta bei aleliai 92,5 proc. ir 7,5 proc. BDV sergančių vyrų grupėje GG genotipo nustatyta 60 proc., GT – 36 proc. ir TT – 4 proc. ir G alelis 78, T – 22. Kontrolinės vyrų grupės genotipai pasiskirtė atitinkamai taip: 79,1 proc., 20,9 proc. ir nenustatyta. bei aleliai 89,5 proc. ir 10,5 proc. Nustatėme, kad moterų grupėje statistiškai reikšmingai BDV serga turinčios GT genotipą (vieną mutavusį alelį), lyginant su GG genotipą turinčiomis. (6 lentelė)
6 lentelė. Col2A1 rs1635529 polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai BDV bei kontrolinėje grupėse,
atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Genas Genotipas Moterys P reikšmė Vyrai P reikšmė BDV grupė N (proc.) Kontrolinė grupė N (proc.) BDV grupė N (proc.) Kontrolinė grupė N (proc.) Col2A1 rs16355 29 GG 6 (75) 17 (85) 0,0448* 15 (60) 34 (79,1) 0,127 GT 2 (25) 3 (15) 9 (36) 9 (20,9) TT 0 (0) 0 (0) 1 (4) 0 (0) Viso 8 (100) 20 (100) 25 (100) 43 (100) Alelis 0,553 0,067 G 14 (87,5) 37 (92,5) 39 (78) 77 (89,5) T 2 (12,5) 3 (7,5) 11 (22) 9 (10,5)
BDV – burnos dugno vėžys; SN – standartinis nuokrypis; p – reikšmingumo lygmuo, rezultatai statistiškai reikšmingi, kai *p= 0,0448 moterų, sergančių BDV grupę lyginant su kontroline grupe.
35
3.2 TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genų polimorfizmo sąsajos su polinkiu sirgti burnos dugno vėžiu
Įvertinome genų polimorfizmo sąsają su polinkiu sirgti BDV. TLR4 rs1927911 polimorfizmo įtaka BDV
pasireiškimui nustatyta atlikus dvinarę logistinę regresiją sudarant penkis paveldėjimo modelius. Analizuojant šio geno genotipų įtaką BDV pasireiškimui statistiškai reikšmingi skirtumai nenustatyti (7 lentelė).
7 lentelė. TLR4 rs1927911 polimorfizmo genotipų BDV sergančiųjų ir kontrolinėje grupėse dvinarės logistinės regresijos analizė
Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė Kodominantinis TC vs. CC TT vs. CC 1,197 (0,491-2,920) 1,588 (0,319-7,900) 0,693 0,572 Dominantinis TC + TT vs. CC 1,255 (0,539-2,923) 0,599 Recesyvinis TT vs. TC+ CC 1,475 (0,310-7,020) 0,625 Viršdominantinis TC vs. TT + CC 1,130 (0,475-2,689) 0,782 Adityvinis C 1,232 (0,635-2,391) 0,536
GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinumo intervalas; , p vertė – reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05
Analizuojant MMP-8 rs11225395 genotipų įtaką BDV pasireiškimui statistiškai reikšmingi skirtumai nenustatyti (8 lentelė).
8 lentelė. MMP8 rs11225395 polimorfizmo genotipų BDV sergančiųjų ir kontrolinėje grupėse dvinarės logistinės regresijos analizė
Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė Kodominantinis AG vs. GG AA vs. GG 1,244 (0,463-3,345) 1,556 (0,474-5,100) 0,665 0,466 Dominantinis AG + AA vs. GG 1,333 (0,527-3,373) 0,543 Recesyvinis AA vs. AG + GG 1,360 (0,493-3,751) 0,552 Viršdominantinis AG vs. AA + GG 1,053 (0,446-2,405) 0,936 Adityvinis A 1,247 (0,690-2,252) 0,464
GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinumo intervalas; p vertė – reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05
36 Analizuojant COL2A1 rs1635529 genotipų ir alelių įtaką BDV pasireiškimui statistiškai nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas. Analizės rezultatai parodė, kad mutantinisT alelis, lyginant su G BDV riziką didina 2,5 karto (p=0,046) (9 lentelė)
9 lentelė. COL2A1 rs1635529 polimorfizmo genotipų BDV sergančiųjų ir kontrolinėje grupėse dvinarės
logistinės regresijos analizė
Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė Kodominantinis GT vs. GG TT vs. GG 2,226 (0,850-5,832) 0 0,103 1,000 Dominantinis GT + TT vs. GG 2,429 (0,941-6,266) 0,067 Recesyvinis TT vs. GT + GG 0 1,000 Viršdominantinis GT vs. GG + TT 2,125 (0,815-5,543) 0,123 Adityvinis T 2,504 (1,017-6,165) 0,046*
GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinumo intervalas; *p=0,046 T alelį lyginant su G aleliu.
3.3 TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genų polimorfizmo ir rūkymo
sąsajos pacientams sergantiems burnos dugno vėžiu.
Rūkymas yra vienas iš didžiausių rizikos veiksnių susirgti BDV. Duomenų apie rūkymą buvo surinkta iš 20 BDV ligonių, iš kurių rūkė 85 proc., nerūkė 15 proc. kontrolinėje grupėje atitinkamai 50,8 proc. ir 49,2 proc. Statistiškai reikšmingai daugiau (p = 0.005) rūkančių yra BDV grupėje (10 lentelė).
10 lentelė. Rūkančiųjų pasiskirstymas BDV ir kontrolinėje grupėje
Rūkymas BDV grupė Kontrolinė grupė P reikšmė Nerūko 3 (15) 31 (49,2) 0,005* Rūko 17 (85) 32 (50,8)
37 Pagal turimus negausius pacientų duomenis, nustatėme ar rūkymas gali turėti sąsajas su ligos stadija. Iš rūkusių pacientų grupės net 85,5 proc. sirgo 4 stadijos BDV (11 lentelė). Statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo nustatyta, reiktų atlikti didesnės studijos tyrimą.
11 lentelė. Ligos stadijų pasikirstymas BDV sergančių pacientų grupėje, atsižvelgiant į rūkymo faktorių
Rūkymas Stadija P reikšmė
2 N, (proc.) 3 N, (proc.) 4 N, (proc.) Nerūko 1 (33,3) 0 2 (14,3) 0,515 Rūko 2 (66,7) 3 (100) 12 (85.7)
Įvertinome TLR 4 rs1927911, MMP8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 genų polimorfizmo sąsają su
rūkymu (12 lentelė). Palyginome visų rūkančių genotipų ir alelių dažnius BDV sergančiųjų su kontroline grupe. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme.
38
12 lentelė. TLR 4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai BDV ir kontrolinėse grupėse, atsižvelgiant į rūkymą
Genas Genotipas, alelis Dažnis (proc.) BDV grupė N (proc.) Kontrolinė grupė N (proc.) p vertė TLR4 rs1927911 TT TC CC Iš viso T C 1 (5) 7 (35) 12 (60) 20 (100) 9 (22,5) 31 (77,5) 1 (1,6) 19 (30,2) 43 (68,2) 63 (100) 21 (16,5) 105 (83,5) p=0,569 MMP8 rs11225395 AA AG GG Iš viso A G 5 (25) 10 (50) 5 (25) 20 (100) 20 (50) 20 (50) 4 (6,3) 36 (57,1) 23 (36,5) 63 (100) 44 (34,9) 82 (65,1) p=0,080 Col2A1 rs1635529 GG GT TT Iš viso G T 13 (65,0) 7 (35,0) 0 (0) 20 (100) 33 (82,5) 7 (17,5) 41 (65,1) 21 (33,3) 1 (1,6) 63 (100) 103 (81,7) 23 (18,3) p=0,860
p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
39 Atlikus dvinarę logistinę regresiją, sudarėme penkis paveldėjimo modelius. Analizuojant TLR4 rs1927911 polimorfizmo genotipų įtaką, atsižvelgiant į rūkymo faktorių BDV pasireiškimui statistiškai reikšmingi skirtumai nenustatyti (13 lentelė).
13 lentelė. TLR4 rs1927911 polimorfizmo genotipų BDV sergančiųjų dvinarės logistinės regresijos analizė, atsižvelgiant į rūkymą
Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė Kodominantinis TC vs. CC TT vs. CC 1,306 (0,450-3,786) 3,917 (0,228-67,263) 0,624 0,347 Dominantinis TC + TT vs. CC 1,424 (0,510-3,981) 0,500 Recesyvinis TT vs. TC+ CC 3,579 (0,214-59,928) 0,375 Viršdominantinis TC vs. TT + CC 1,231 (0,430-3,525) 0,699 Adityvinis C 1,497 (0,604-3,710) 0,384
GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinumo intervalas; , p vertė – reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05
Analizavome MMP-8 rs11225395 polimorfizmo įtaką, atsižvelgiant į rūkymo faktorių, BDV
pasireiškimui. Nustatėmė, kad BVG sergantiems pacientams, turintiems AA genotipą (lyginant su GG) ir rūkantiems, galimybių santykis susirgti vėžiu yra statistiškai patikimai (p= 0.044) penkis kartus didesnis..Turintiems GG+AG genotipus galimybių santykis susirgti BDV yra statistiškai reikšmingai (p= 0,037) didesnis 4,3 karto. (14 lentelė) .
14 lentelė. MMP8 rs11225395 polimorfizmo genotipų BDV sergančiųjų dvinarės logistinės regresijos analizė, atsižvelgiant į rūkymą
Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė Kodominantinis AG vs. GG AA vs. GG 1,282 (0,392-4,194) 5,0 (1,042 – 23,985) 0,681 0,044* Dominantinis AG + AA vs. GG 1,705 (0,553-5,250) 0,353 Recesyvinis AA vs. AG + GG 4,267 (1,094-16,643) 0,037** Viršdominantinis AG vs. AA + GG 0,769 (0,284-2,086) 0,606 Adityvinis A 2,085 (0,924-4,701) 0,077
GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinumo intervalas; *p=0,044, AA genotipą lyginant su GG, **p=0.037, GG+AG genotipus lyginant su GG.
40 Analizuojant COL2A1 rs1635529 enotipų įtaką, atsižvelgiant į rūkymo faktorių, BDV pasireiškimui statistiškai reikšmingi skirtumai nenustatyti (15 lentelė).
15 lentelė. COL2A1 rs1635529 polimorfizmo BDV sergančiųjų dvinarės logistinės regresijos analizė,
atsižvelgiant į rūkymą
Modelis Genotipas/alelis GS (95 proc. PI) p reikšmė Kodominantinis GT vs. GG TT vs. GG 1,054 (0,370-3,002) 0 0,922 1,000 Dominantinis GT + TT vs. GG 1,010 (0,355-2,868) 0,986 Recesyvinis TT vs. GT + GG 0 1,000 Viršdominantinis TT vs. GG 0 1,000 Adityvinis T 0,952 (0,352-2,578) 0,923
41
REZULTATŲ APTARIMAS
Lietuvos nacionalinio vėžio registro [8] bei Amerikos vėžio draugijos duomenimis burnos ir gerklų vėžys dažniau diagnozuojamas vidutinio amžiaus vyrams nei moterims. Mes ištyrėme 32 pacientus, sergančius BDV, kurių amžiaus vidurkis apie 60 metų. Didžiąją dalį iš visų tirtų pacientų (75,8 proc.) sudarė vyrai. Pacientų pasiskirstymas pagal lytį sutapo su K. Markou ir bendraautorių tyrimu, kuriame analizavo burnos vėžio epidemiologinius duomenis ir nustatė, jog didžioji dalis sergančiųjų buvo vyrai (96,8 proc.), kurių amžiaus vidurkis – 62,1 metai [51].
BVD sergantiems pacientams ir kontrolinės grupės asmenims nustėme TLR4 rs1927911, MMP-8 rs11225395 ir Col2A1 rs1635529 vieno nukleotido polimorfizmus. Buvome iškėlę hipotezę, kad mutacijos šiuose genuose gali turėti sąsajų su ligos atsiradimu ir progresavimu. Yra daug publikacijų, kuriose parodyta TLR4 geno įtaka BDV, tačiau mes savo darbe statistiškai reikšmingų šio tipo vėžio sąsajų su TLR4 rs1927911 geno polimorfizmu nenustatėme. Šio geno reikšmė plačiai tirta aiškinantis įvairių organizmo sričių, tame tarpe ir burnos, karcinogenezę. R. Sutmuleris ir bendraautoriai pateikia duomenis, kad burnos plokščialąstelinė karcinoma vystosi imuninių ląstelių gausioje aplinkoje. Uždegiminio atsako ląstelės naviko mikroaplinkoje aktyvina priešuždegiminių citokinų sekreciją ir sukuria priešvėžinį poveikį. Tuo pačiu metu navikinės ląstelės gali aktyvinti įvairius, mažinančius priešvėžinį atsaką mechanizmus (reguliuoja citokinų ir T-ląstelių slopinimą) [52].
Atlikę MMP-8 polimorfizmo rs11225395 tyrimą pastebėjome, kad AA genotipas dažnesnis BDV sergančių pacientų nei kontrolinėje grupėje (24,2 proc. vs. 19,0 proc.), o AG genotipo dažnis šiose grupėse skyrėsi labai nežymiai (48,5 proc. vs. 47,6 proc.), tačiau statistiškai reikšmingi rezultatai nebuvo gauti (p>0,05). Analizuojant mokslines publikacijas apie MMP8 sąsajas su vėžiu, radome daug prieštaringų duomenų. Kai kurie autoriai nurodo MMP-8 geną kaip rizikos veiksnį vėžio vystymuisi. [53, 54]. Kiti autoriai teigia, kad turint mutantinį A alelį yra mažesnė metastazių tikimybė ir geresnis išgyvenamumo procentas, nei turint G alelį. Moilanen M. su bendraautoriais pateikė ekspermentinių tyrimų rezultatus, kad geresnė vėžio prognozė yra tada, kai yra padidėjusi MMP8 geno raiška [55]. Prieinamose duomenų bazėse nėra daug publikacijų apie Col2A1 rs1635529 polimorfizmo sąsajas su BDV. Plačiau yra tirtos kitos vėžio formos, pavyzdžiui, nustatytos CO2A1 geno sąsajos su chondrosarkoma. P. Tarpey su bendraautoriais pateikia tyrimų rezultatus, kad iš tirtų chondrosarkomos atvejų (18/49), net 37 proc. COL2A1 gene yra nustatytos mutacijos. COL2A1 yra ekspresuojamas pagrinde normaliuose chondrocituose ir koduojamas kaip II tipo kolageno α 1 grandinė, kuris yra pagrindinis kremzlės komponentas. COL2A1geno mutacijų dažnis buvo nustatytas didesnis, palyginus
