Donatas Cirulis
5 kursas 8 grupėBALTYMO FLAGELINO IR RIZIKOS FAKTORIŲ
ĮTAKA BURNOS DUGNO PLOKŠČIALĄSTELINEI
KARCINOMAI
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbo vadovas
MEDICINOS AKADEMIJA ODONTOLOGIJOS FAKULTETAS
VEIDO IR ŽANDIKAULIŲ CHIRURGIJOS KLINIKA
BALTYMO FLAGELINO IR RIZIKOS FAKTORIŲ ĮTAKA
BURNOS DUGNO PLOKŠČIALĄSTELINEI
KARCINOMAI
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbą atliko magistrantas ... (parašas) Darbo vadovas ... (parašas) ...
(vardas pavardė, kursas, grupė)
... (mokslinis laipsnis, vardas pavardė 20....m. ... 20....m. ...
(mėnuo, diena) (mėnuo, diena)
KLINIKINIO - EKSPERIMENTINIO BAIGIAMOJO MAGISTRINIO DARBO VERTINIMO LENTELĖ
Įvertinimas: ... Recenzentas: ...
(moksl. laipsnis, vardas pavardė)
Recenzavimo data: ... Eil
.N r.
BMD dalys BMD vertinimo aspektai
BMD reikalavimų atitikimas ir įvertinimas
Taip Iš dalies Ne
1
Santrauka (0,5 balo)
Ar santrauka informatyvi ir atitinka darbo turinį
bei reikalavimus? 0,2 0,1 0
2 Ar santrauka anglų kalba atitinka darbo turinį
bei reikalavimus? 0,2 0.1 0
3 Ar raktiniai žodžiai atitinka darbo esmę? 0,1 0 0
4 Įvadas,
tikslas uždaviniai
(1 balas)
Ar darbo įvade pagrįstas temos naujumas,
aktualumas ir reikšmingumas? 0,4 0,2 0
5 Ar tinkamai ir aiškiai suformuluota problema,
hipotezė, tikslas ir uždaviniai? 0,4 0,2 0
6 Ar tikslas ir uždaviniai tarpusavyje susiję? 0,2 0,1 0
7
Literatūros apžvalga (1,5 balo)
Ar pakankamas autoriaus susipažinimas su kitų
mokslininkų darbais Lietuvoje ir pasaulyje? 0,4 0,2 0 8
Ar tinkamai aptarti aktualiausi kitų
mokslininkų tyrimai, pateikti svarbiausi jų rezultatai ir išvados?
0,6 0,3 0
9
Ar apžvelgiama mokslinė literatūra yra pakankamai susijusi su darbe nagrinėjama problema?
0,2 0,1 0
10 Ar autoriaus sugebėjimas analizuoti ir
sisteminti mokslinę literatūrą yra pakankamas? 0,3 0,1 0
11 Medžiaga ir
metodai (2 balai)
Ar išsamiai paaiškinta darbo tyrimo metodika,
ar ji tinkama iškeltam tikslui pasiekti? 0,6 0,3 0
12 Ar tinkamai sudarytos ir aprašytos imtys,
kriterijai?
13
Ar tinkamai aprašytos kitos tyrimo medžiagos ir priemonės (anketos, vaistai, reagentai, įranga
ir pan.)? 0,4 0,2 0
14
Ar tinkamai aprašytos statistinės programos naudotos duomenų analizei, formulės, kriterijai, kuriais vadovautasi įvertinant statistinio patikimumo lygmenį?
0,4 0,2 0
15
Rezultatai (2 balai)
Ar tyrimų rezultatai išsamiai atsako į iškeltą
tikslą ir uždavinius? 0,4 0,2 0
16 Ar lentelių, paveikslų pateikimas atitinka
reikalavimus? 0,4 0,2 0
17 Ar lentelėse, paveiksluose ir tekste kartojasi
informacija? 0 0,2 0,4
18 Ar nurodytas duomenų statistinis
reikšmingumas? 0,4 0,2 0
19 Ar tinkamai atlikta duomenų statistinė analizė? 0,4 0,2 0
20
Rezultatų aptarimas (1,5 balo)
Ar tinkamai įvertinti gauti rezultatai (jų svarba,
trūkumai) bei gautų duomenų patikimumas? 0,4 0,2 0
21 Ar tinkamai įvertintas gautų rezultatų santykis
su kitų tyrėjų naujausiais duomenimis? 0,4 0,2 0
22 Ar autorius pateikia rezultatų interpretaciją? 0,4 0,2 0
23
Ar kartojasi duomenys, kurie buvo pateikti kituose skyriuose (įvade, literatūros apžvalgoje, rezultatuose)?
0 0,2 0,3
24
Išvados (0,5 balo)
Ar išvados atspindi baigiamojo darbo temą,
iškeltus tikslus ir uždavinius? 0,2 0,1 0
25 Ar išvados pagrįstos analizuojama medžiaga; ar
atitinka tyrimų rezultatus ? 0,2 0,1 0
26 Ar išvados yra aiškios ir lakoniškos? 0,1 0,1 0
27
Literatūros sąrašas (1 balas)
Ar bibliografinis literatūros sąrašas sudarytas
pagal reikalavimus? 0,4 0,2 0
28
Ar literatūros sąrašo nuorodos į tekstą yra teisingos; ar teisingai ir tiksliai cituojami literatūros šaltiniai?
0,2 0,1 0
29 Ar literatūros sąrašo mokslinis lygmuo
tinkamas moksliniam darbui? 0,2 0,1 0
30
Ar cituojami šaltiniai, ne senesni nei 10 metų, sudaro ne mažiau nei 70% šaltinių, o ne senesni kaip 5 metų – ne mažiau kaip 40%?
0,2 0,1 0
Papildomi skyriai, kurie gali padidinti surinktą balų skaičių
31 Priedai Ar pateikti priedai padeda suprasti nagrinėjamą
32
Praktinės rekomendaci
jos
Ar yra pasiūlytos praktinės rekomendacijos ir
ar jos susiję su gautais rezultatais? +0,4 +0,2 0
Bendri reikalavimai, kurių nesilaikymas mažina balų skaičių
33
Bendri reikalavimai
Ar pakankama darbo apimtis (be priedų)
15-20 psl. (-2 balai) <15 psl. (-5 balai)
34 Ar darbo apimtis dirbtinai padidinta? -2 balai -1 balas
35 Ar darbo struktūra atitinka baigiamojo darbo
rengimo reikalavimus? -1 balas -2 balai
36 Ar darbas parašytas taisyklinga kalba,
moksliškai, logiškai, lakoniškai? -0,5 balo -1 balas
37 Ar yra gramatinių, stiliaus, kompiuterinio
raštingumo klaidų? -2 balai -1 balas
38 Ar tekstui būdingas nuoseklumas, vientisumas, struktūrinių dalių apimties subalansuotumas? -0,2 balo -0,5 balo
39 Plagiato kiekis darbe
>20% (nevert.
) 40
Ar turinys (skyrių, poskyrių pavadinimai ir puslapių numeracija) atitinka darbo struktūrą ir yra tikslus?
-0,2 balo -0,5
balo
41
Ar darbo dalių pavadinimai atitinka tekstą; ar yra logiškai ir taisyklingai išskirti skyrių ir poskyrių pavadinimai?
-0,2 balo -0,5 balo 42 Ar buvo gautas (jei buvo reikalingas) Bioetikos
komiteto leidimas? -1 balas
43 Ar yra (jei reikalingi) svarbiausių terminų ir
santrumpų paaiškinimai? -0,2 balo
-0,5 balo 44
Ar darbas apipavidalintas kokybiškai (spausdinimo, vaizdinės medžiagos, įrišimo kokybė)?
-0,2 balo -0,5 balo
*Viso (maksimumas 10 balų): *Pastaba: surinktų balų suma gali viršyti 10 balų.
SANTRAUKA... 8
SUMMARY ... 10
ĮVADAS ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
2. MEDŽIAGA IR METODAI ... 17
2.1. Ekspermentinė ir kontrolinė grupės ... 17
2.2. Anoniminė anketa ... 18
2.3. Seilių mėginiai ir ELISA ... 19
2.4. Duomenų analizė ... 20
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 21
3.1. Demografinių ir socialinių veiksnių įtaka BDPLK ... 21
3.2. Rūkymo įtaka BDPLK ... 22
3.3. Alkoholio įtaka BDPLK ... 23
3.4. Burnos higienos ir burnos būklės įtaka BDPLK ... 24
3.5. Baltymo flagelino koncentracija ir įtaka BDPLK ... 27
4. DISKUSIJA ... 28 4.1. Rezultatų aptarimas ... 28 4.2. Padėka ... 30 4.3. Interesų konfliktas ... 30 IŠVADOS ... 31 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 32 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 34 PRIEDAI ... 37 Priedas Nr.1 ... 37 Priedas Nr.2 ... 38 Priedas Nr.3 ... 39 Priedas Nr.4 ... 39 Priedas Nr.5 ... 41 Priedas Nr.6 ... 42 Priedas Nr.7 ... 42 Priedas Nr. 8 ... 43 Priedas Nr. 9 ... 43
Baltymo flagelino ir rizikos faktorių įtaka burnos dugno plokščialąstelinei karcinomai
SANTRAUKA
Problemos aktualumas ir darbo tikslas: ankstesnės kitų autorių studijos nustatė reikšmingą baltymo flagelino ir epitelyje esančių receptorių TLR5 įtaką skrandžio, seilių liaukų, liežuvio, plaučių karcinogenezėje. Baltymas flagelinas tiesiogiai jungiasi prie TLR-5 receptoriaus epitelinėse ląstelėse ir per citoplazmoje esančius baltymus sukelia branduolyje transkripcijos ir vėliau citoplazmoje transliacijos pokyčius. Susintetinami interleukinai-1β, 6, kurių įtaka reikšmingai nustatyti karcinogenezėje. Taip pat svarbų vaidmenį karcinogenėje vaidina rūkymas, alkoholio vartojimas, genetika, prasta burnos higiena. Esant blogai burnos higienai, sergant periodonto ligomis burnos mikrofloroje gausu žiuželinių bakterijų. Žiuželių pagrindinė sudedamoji dalis yra baltymas flagelinas. Bakterijoms žuvus flagelinas su kitomis liekonomis nuplaunamas seilių, nusėda burnos dugne ir veikia epitelio ląsteles. Kyla pagrįstas hipotetinis klausimas, kodėl burnos karcinoma dažniausiai lokalizuojasi burnos dugne? Tyrimo tikslas buvo įvertinti rizikos faktorių (alkoholio, rūkymo, blogos burnos higienos) bei baltymo flagelino įtaką burnos dugno plokščialąstelinės karcinomos (BDPLK) etiopatogenezei.
Medžiaga ir metodai: Buvo gautas LSMU Etikos komiteto leidimas Nr. BEC – OF - 04. Tyrime dalyvavo 45 pacientai, stacionarizuoti LSMUL KK Veido ir žandikaulių chirurgijios skyriuje. Sergančiųjų BDPLK (tiriamoji grupė) buvo 16, amžiaus vidurkis 57,81±11,94 m. Kontrolinėje grupėje (nesergantys BDPLK) – 29, amžius 57,29±12,05m. Žodžiu buvo apklausti pacientai ir užpildytos anketos (demografija, rizikos faktoriai, su liga susijusi informacija). Iš kiekvieno tiriamojo rytais surinktos nestimuliuotos seilės į sterilius indelius, tą pačią dieną centrifuguotos 6800 aps./min greičiu ir gautas skystis užšaldytas 1,5 ml mėgintuvėliuose -80oC temperatūroje. Seilių mėginiuose flagelino koncentracija nustatyta ELISA žmogaus flagelino rinkiniu, apšvietus 450 nm ilgio šviesa, o bendras baltymų kiekis seilių mėginiuose Bradfordo reagentu. Gauti rezultatai apskaičiuoti SPSS 23 programa, patikimumo lygmuo 95%.
Rezultatai: Rūkymo bei alkoholio vartojimo įtakos BDPLK nenustatyta, p>0,05. Tiriamoji grupė dantis valėsi rečiau nei kartą per dieną arba visai nesivalė, tuo tarpu kontrolinė grupė bent kartą per dieną ir dažniau, p<0,05. Tiriamoji grupė turėjo mažesnį vidutinį likusių dantų skaičių burnoje 10,88 lyginant su kontrole 16,66, p<0,05. Tiriamojoje grupėje Silness-Loe apnašų indekso
vertė didesnė nei kontrolinėje grupėje atitinkamai 2,31 ir 1,53, p<0,05. Sergančiųjų BDPLK 31,3% visai nesilankydavo profilaktiniams patikrinimams pas odontologus bei 56,3% valydavosi rečiau nei kartą per dieną. Flagelino koncentracija reikšmingai nesiskyrė tarp kontrolinės grupės 3,3 pg/mg ir tiriamosios 2pg/mg, p> 0,05. Patikimos koreliacijos tarp flagelino koncentracijos seilėse ir rizikos faktorių (rūkymo, alkoholio vartojimo, burnos higienos) bei burnos dugno vėžio stadijos nenustatyta.
Išvados: Rūkymo bei alkoholio vartojimo įtaka BDPLK nenustatyta. Sergantys pacientai BDPLK turi blogus burnos higienos įpročius, mažai rūpinasi arba visai nesirūpina burnos sveikata. Sergančiųjų BDPLK seilėse yra baltymo flagelino, jo koncentracijai burnos higiena, rūkymas, alkoholio vartojimas įtakos neturi. Reikalingi tyrimai TLR-5 repceptoriaus kiekiui bei išreikštumui nustatyti sergančiųjų BDPLK gleivinės mėginiuose, kad būtų galima teigti, kad baltymas flagelinas kartu su TLR-5 receptoriumi užima svarbų vaidmenį BDPLK etiopatogenezėje.
Raktiniai žodžiai: flagellin, TLR-5, epithelial squamous cells carcinoma, oral cancer, risk factors
The Flagellin and risk factors role of squamous cell carcinoma of floor of the mouth
SUMMARY
Relevance of the problem and aim of the work: Flagellin after flagella bacteria death joins to Toll-like receptor 5 (TLR-5). TLR-5 is expressed by multiple cells of the immune system, a setting in which it stimulates inflammatory responses, but also by epithelial and cancer cells. In malignant cells, TLR-5 not only promotes inflammatory responses but also stimulates invasion, migration and chemokine secretion. During carcinogenesis (bacterial components, alcohol, smoking), the expression pattern of TLR5 changes from a basolateral to diffuse, and in layered epithelia expression extends to the upper cell layers. Such an abnormal expression of TLR-5 has been proposed as a biomarker for epithelial dysplasia in gastric epithelia. Risk factors and flagellin action in oral fundus squamous cell carcinoma has not been studied before. The aim of this study is to assess the flagellin in saliva and risk factors (smoking, alcohol, bad oral hygiene) would relate important role to squamous cell carcinoma of floor of the mouth (SCCFM).
Material and the methods: The studies included 45 patients hospitalized in derpartment of Maxillofacial Surgery of LUHS KK. SCCFM had 16 patients (experimental group), the age average was 57,81 ±11,94 years old, control group 29 patients, age average 57,29±12,05 years old. Patients were interviewed and filled in questionnaires (demographics, risk factors, and disease-related information). From both groups non-stimulated saliva collected in sterile containers, on the same day centrifuged 6800 rpm speed and the resulting liquid frozen in 1.5 ml tubes -80oC. The flagellin concentration in saliva samples was determined with ELISA kit for human flagellin, illuminated by 450 nm light, and the total protein content of saliva samples with Bradford reagent. The results are calculated with the SPSS 23 program, 95% confidence level.
Results: No smoking and alcohol affect in SCCFM group was found, p> 0.05. Expermental group has less teeth in the mouth (10,88 versus control 16,66), 31,3% did not brush teeth, had bigger Silness-Loe plaque index 2,31 compared to control group 1,53, p <0.05. There is no statistically significant difference between flagellin concentration in saliva for both groups, p>0.05. Flagellin concentration does not depend on smoking, alcohol using, oral hygiene, from stage of the cancer of the mouth floor, p>0,05.
Conclusions: The patients with SCCFM have bad oral hygiene habits and do not care about their oral health. There is no smoking and alcohol affect in SCCFM. Saliva of SCCFM patient contains of flagellin amounts, but the concentration of protein is not depending on smoking, alcohol using, oral hygiene. Need further research in TLR-5 amounts in epithelial layer cells and TLR5 signaling pathway which assessment the role of flagellin and TLR-5 in squamous cells carcinogenesis.
ĮVADAS
Pasaulyje burnos vėžiu serga 2-4% populiacijos, sergančios piktybiniais navikais. Pakistane sergamumas siekia net 10 % visų piktybinių navikų [1]. Burnos vėžys gali lokalizuotis seilių liaukų, gerklų, bet kurioje burnos ertmės srityje: gomurio, liežuvio, skruosto, burnos dugno. Plokščiųjų ląstelių karcinoma labiausiai burnos ertmėje paplitęs piktybinis navikas, būdingas 90 % visų burnos navikų atvejų [1-3]. Literatūroje įvardinami faktoriai, lemiantys vėžio išsivystymą: genetika, rūkymas, alkoholio vartojimas, bloga burnos higiena.
Blogos burnos higienos atveju nėra aiškaus patogenenezės mechanizmo, lemiančio burnos plokčialąstelinės karcinomos išsivystymą [2,3]. Esant prastai burnos higienai, ant dantų paviršių kaupiasi apnašas, akmenys, tai buveinė periodonto ligas sukeliančioms anaerobinėms bakterijoms. Labiausiai paplitusios Treponema denticola, spirochetos, jų didelės populiacijos randamos dantenų kišenėse, kelių dienų apnašose. Tai flagella bakterijų šeimai priskiriamos bakterijos, kurios turi žiuželius, sudarytus iš tvirtą erdvinę struktūrą turinčio baltymo flagelino . Pas pacientus, kurie neturi gerų burnos higienos įpročių, nesivalo dantų, gausu apnašo, o jame anaerobinės mikrofloros, turinčios žiuželius. Bakterijų kiekis yra ženkliai didesnis pas pacientus, turinčius nepakankamą burnos higieną, nei pas tuos, kurių burnos higienos įpročiai yra geri ar labai geri [4-7]. Žiuželį turinčioms bakterijoms žuvus dantenų vagelių skystis, seilės nuplauna flageliną, kitas bakterijų, epitelio liekanas, endotoksinus bei egzotoksinus. Susidaręs mišinys nusėda ant burnos dugno ir veikia epitelio ląsteles [8]. Rūkymas, alkoholio vartojimas, bloga burnos higiena, bakterijų išskiriami endotoksinai (lipopolisacharidai- LPS), egzotoksinai dirgina gleivinės epitelį, prasideda lėtinis uždegimas, kuris užsitęsia. Sveikame epitelyje tik ties pamatine membrana yra epitelio ląstelės turinčios TLR-5 receptorių. Ilgą laiką veikiant uždegimui, šios ląstelės proliferuoja ir migruoja į paviršinį epitelio sluoksnį, kur kontaktuoja su burnos skysčiais, ir gali prisijungti žuvusių bakterijų flageliną prie membranoje esančių TLR-5 receptorių [2]. Yra 10 skirtingų TLR grupės receptorių, tačiau baltymas flagelinas jungiasi tik prie TLR-5 receptoriaus [8-10]. TLR-5 bei flagelino kompleksas, remiantis literatūra, pasižymi skirtingu poveikiu: imuninės ląstelės turinčios TLR-5 receptorių po prisijungimo yra aktyvinamos ir skatinamos sunaikinti pažeistas, netvarkingai besidalijančias, mažai diferencijuotas ląsteles, o tuo tarpu epitelinės ląstelės skatinamos išskirti citokinus, chemokinus, lemiančius karcinomos ląstelių susidarymą, netvarkingą dalijimąsi, migraciją, invaziškumą į aplinkinius audinius. Šią pusiausvyrą suardo ilgą laiką besikartojantis ir užsitęsęs uždegimas[2,10,11].
Kiti autoriai yra nustatę reikšmingą baltymo flagelino ir epitelyje esančių receptorių TLR-5 įtaką skrandžio, seilių liaukų, liežuvio karcinogenezėje[2-4]. Baltymas flagelinas tiesiogiai jungiasi prie TLR-5 receptoriaus epitelinėse ląstelėse ir per citoplazmoje esančius baltymus sukelia branduolyje transkripcijos ir vėliau citoplazmoje transliacijos pokyčius. Susintetinami interleukinai -1β bei 6, kurių įtaka reikšmingai
nustatyta karcinogenezėje [3]. Taip pat yra reikšmingai nustatytas TLR-5 receptoriaus kiekio padidėjimas plokščialąsteline karcinoma sergančiųjų grupėje [4].
Nėra straipsnių, kurie tirtų flagelino ir TLR-5 įtaką burnos dugno plokščialąstelinės karcinomos etiopatogenezei. Taip pat nėra mokslinių publikacijų apie baltymo flagelio koncentraciją seilėse sergančiųjų BDPLK (burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinoma) bei panašaus amžiaus sveikų pacientų grupėje. Burnos dugno gleivinė yra nuolatos veikiama susikaupusių seilių. Nepakankama burnos higiena lemia didesnį anaerobinių bakterijų kiekį, o šioms žūnant lemia nuolatinį gleivinės dirginimą bakterijų išskirtais toksinais, ypatingai burnos dugno srityje. Iškėlėme hipotezę, kad BDPLK etiopatogenezėje svarbų vaidmenį gali vaidinti bloga burnos higiena bei bakterijų išskirtas flagelinas (vėliau flagelinas jungiasi prie TLR-5 receptoriaus ir aktyvuojamas nuo TLR-5 receptoriaus priklausomas signalo perdavimas ląstelės viduje ). Tiriamųjų burnos būklei, burnos higienos įpročiams įvertinti sudaryta anoniminė anketa. Taip pat nuspręsta į anketą įtraukti kitus rizikos faktorius : alkoholio bei tabako vartojimą bei įvertinti šių faktorių įtaką BDPLK.
Tiklas: Išsiaiškinti rizikos faktorių (alkoholio, rūkymo, burnos higienos) bei baltymo flagelino kiekio įtaką burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinomos (BDPLK) etiopatogenezei.
Uždaviniai:
1. Sudaryti anketas ir surinkti bendrą demografinę bei su liga susijusią informaciją iš BDPLK sergančių (tiriamoji grupė) bei sveikų pacientų (eksperimentinė grupė).
2. Įvertinti rūkymo, alkoholio vartojimo įtaką BDPLK etiopatogenezei.
3. Palyginti burnos higienos įpročius, burnos būklę, rūpinimąsi burnos sveikata tiriamojoje ir kontrolinėje grupėse.
4. Nustatyti ir palyginti vidutinę flagelino koncentraciją nestimuliuotose seilėse tiriamojoje bei kontrolinėje grupėse.
5. Įvertinti baltymo flagelino kiekio priklausomybę nuo BDPLK stadijos, burnos higienos įpročių, rūkymo, alkoholio vartojimo.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
Literatūros apžvalga buvo atlikta skaitant straipsnius mokslinių publikacijų elektroninėse bazėse PubMed, Science Direct, Willey online. Vesti raktiniai žodžiai: oral cancer, epithelial squamous cells carcinoma, , TLR-5 and flagellin, TLR-5 and oral cancer. Apžvelgta straipsniuose rizikos faktorių įtaka plokščialąstelinės karcinomos etiopatogenezei. TLR-5 (Toll like receptor) vaidmuo carcinogenezėje. TLR-5 metaboliniai keliai vykstantys ląstelės viduje po flagelino prisijungimo. Flagelino ir TLR-5 įtaka imuninėms ir epitelinėms ląstelėms. Nepakankamos burnos higienos įtaka burnos mikroflorai. Flageliną turinčių bakterijų rūšys gyvenančios burnos ertmėje. Apžvelgtos metodikos, kurios aptaria baltymų kiekio nustatymą biologiniuose skysčiuose surinktuose iš tiriamųjų grupių.
Burnos vėžio rizikos faktoriais autoriai įvardija: tabako, alkoholio vartojimą, nepakankamą burnos higieną, genetinius veiksnius. Labiausiai burnos srityje paplitęs piktybinis navikas plokščiųjų ląstelių karcinoma [1]. Straipsniuose teigiama, kad dažniausiai ligos atsiradimą lemia keli rizikos faktoriai, kurie ilgą laiką veikė organizmo ląsteles. Dėl ilgai trunkančio, uždelsto uždegimo, įvyksta pokyčiai epitelio paviršiniame sluoksnyje, kas lemia vėlesnį plokščiųjų ląstelių netaisyklingą pasidalijimą ir karcinomos išsivystymą [1,2, 4, 11].
Apžvelgiant kitų autorių straipsnius, publikacijose įvardijama reikšminga receptorių TLR (Toll-like receptors) įtaka piktybinių navikų vystymosi procesuose [3,9]. TLR receptoriai yra transmembraniniai baltymai, randami epitelio ,navikinėse, imuninėse ląstelėse. Yra 10 skirtingų rūšių TLR receptorių. Dalis jų tiesiogiai yra aktyvinami bakterijų išskirtų produktų: lipopeptidų – TLR-2, lipopolisacharidų (LPS) išskirtų Porphyromonas gingivalis– TLR-4, baltymo flagelino– TLR-5. Nemažai studijų rodo, kad aktyvuojami TLR receptoriai, aktyvina plokščiųjų ląstelių karcinogenezę: padidindami ląstelių proliferaciją, metastazes, skatina angiogenezę ir imunosupresiją [3,4,10,11-14]. Kiti autoriai nustatė reikšmingą TLR-5 receptoriaus įtaką liežuvio, seilių liaukų, skrandžio vėžio kancerogenezėje [2-4]. Didesnis TLR-5 receptoriaus kiekis buvo nustatytas sergančiųjų liežuvio karcinoma nei sveikųjų grupėje [2]. Flagella bakterijų šeimai priklausanti Helicobacter pylori ir receptoriaus TLR-5 nustatytas svarbus vaidmuo skrandžio vėžio etiopatogenezėje [4,15]. Kitų studijų metu nustatyta, kad seilių liaukų adenokarcinomos išsivystymui įtakos turi baltymo flagelino aktyvinami TLR-5 receptoriai, kurie skatina ląstelių
migraciją ir invaziją. Autoriai priduria, kad TLR-5 receptorių nustatymas parodo epitelio displazijos židinius [3].
Baltymą flageliną išskiria Flagella bakterijų šeimai priklausančios bakterijos, kurių žiuželiai sudaryti iš baltymo flagelino. Tai globulinis, tirpus baltymas, kuris tiesiogiai jungiasi prie ląstelės membranoje esančio TLR-5 receptoriaus ir jį aktyvuoja. TLR-5 receptorių turi epitelinės ląstelės ir imuninės ląstelės [2-4,9,10]. Autoriai nustatė, kad prisijungus imuninėms ląstelėms baltymą flageliną, aktyvuojamos imuninės reakcijos ir sunaikinamos netaisyklingai besidalijančios, svetimos ląstelės, slopinamas kancerogenezės procesas. Tačiau jei prisijungia flagelinas prie epitelinių arba navikinių ląstelių membranoje esančių TLR-5 receptorių, skatinama proliferacija, ląstelių migracija, invazija, metastazės, chemokinų ir citokinų sintezė [3-5]. Įprastai TLR-5 receptorių turinčios epitelio ląstelės yra ties epitelio pamatine membrana, tačiau nuolatos veikiant uždegiminiam procesui, šios proliferuoja ir migruoja į epitelio paviršių kur gali laisvai prisijungti bakterijų išskirtą flageliną [2,6].
Kiti autoriai studijose nagrinėjo TLR-5 signalo perdavimo kelią ląstelės viduje po flagelino prisijungimo (žr. Priedai. Priedas Nr.1) . TLR-5 aktyvacija sukelia ląstelės viduje biologinių faktorių produkciją, kuri vėliau lemia uždegiminių procesų atsiradimą. Studijos parodė, kad ilgai užsitęsus ir besikartojant uždegiminiam procesui išskirti citokinai ir chemokinai gali įtakoti vėžio atsiradimą, o vėliau ir metastazių plitimą [17]. Pirmasis baltymas pernašantis informaciją po TLR-5 aktyvacijos ląstelės citoplazmoje yra baltymas MyD88. Šis baltymas dalyvauja visų 10 skirtingų TLR receptorių informacijos perdavime ląstelės viduje. Studijos nustatė, kad MyD88 baltymas vaidina svarbią rolę vėžio etiopatogenezėje [16]. Toliau metaboliniame kelyje sutinkamas ne mažiau svarbus baltymas NF-kβ (Nucleus factor), kuris priima informaciją ląstelės citoplazmoje bei perduoda ją branduoliui. Branduolyje sukelia transkripcijos pokyčius, o vėliau ir citoplazmoje transliacijos: susintetinami interleukinas 6 (IL-6), interleukinas -1β (IL-1β) ir naviko nekrozės faktorius (TNF-tumor necrosis factor). Šie citokinai skatina plokščialąstelinės karcinomos išsivystymą skandyje, plonojoje žarnoje, odoje, krūtinės srityje [17,18]. Kitos studijos parodė, kad TLR receptoriaus metaboliniame kelyje aktyvuojamas NF-kβ baltymas vaidina svarbų vaidmenį navikinių ląstelių išgyvenamumui bei proliferacijai plaučių, prostatos, storosios žarnos plokščialąstelinės karcinomos atvejais. TLR receptorių aktyvinimas skatina navikinio proceso progresavimą ir imuninio atsako išvengimą [10,19,20].
Nėra studijų, kurios būtų nagrinėję baltymo flagelino bei receptoriaus TLR-5 įtaką burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinomai. Reikia žiuželinių bakterijų (flagelino šaltinio), kad flagelinas patektų į seiles. Toliau remiantis kitų autorių atliktomis studijomis, nustatyta, kad nepakankamos burnos higienos, lėtinėmis periodonto ligomis sergančių pacientų dantenų kišenėse, apnašose patologinių bakterijų (sukeliančių periodonto ligas) kiekis yra ženkliai didesnis nei sveikų pacientų grupėje. Vyraujančios patologinės bakterijos yra spirochetos bei Treponema denticola. Jos turi žiuželius, o pastarųjų pagrindinė sudedamoji dalis yra baltymas flagelinas [5-7]. Šioms žuvus baltymas flagelinas nuplaunamas vagelių skysčio ir seilių, nusėda burnos dugne ir čia nuolatos veikia gleivinės epitelio ląsteles.
TLR-5 receptoriaus kiekis studijose buvo nustatomas atliekant imunohistochemiją arba imunofluorescencija su paimtais mėginiais iš sergančių plokščiųjų ląstelių karcinoma bei sveikų tiriamųjų burnos dugno gleivinės [2,21]. Flagelino įtaka ląstelėms turinčioms TLR-5 receptorius, buvo nustatoma tiriant išskirtų citokinų kiekį supernatante su ELISA rinkiniais. Ląstelių šaltiniai buvo mėginiai iš sveikų bei sergančių plokščialąsteline karcinoma tiriamųjų [3]. Nei viena studija netyrė baltymo flagelinio kiekio seilėse sergant burnos ertmės (liežuvio, skruosto, gomurio, burnos dugno) plokščialąsteline karcinoma.
Kadangi nėra studijų apie baltymo flagelino koncentraciją seilėse bei įtaką sergant BDPLK (burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinoma), taip pat nėra publikacijų, kurios tirtų blogos higienos įtaką BDPLK, tai nuspręsta, ištirti flagelino įtaką BDPLK sergamumui. Įvertinti ir palyginti burnos higienos įpročių bei burnos būklės ypatumus sergant BDPLK bei sveikų pacientų grupėse. Taip pat įvertinti kitų rizikos faktorių: rūkymo, alkoholio, demografinės-socialinės padėties įtaką BDPLK sergamumui. Po rizikos faktorių bei baltymo flagelino duomenų įvertinimo pateikti BDPLK prevencijos rekomendacijas.
2. MEDŽIAGA IR METODAI
2.1. Ekspermentinė ir kontrolinė grupės
Buvo gautas LSMU Bioetikos centro leidimas Nr. BEC – OF – 04 (žr. Priedai Nr.2). Tyrimas buvo vykdomas 2016-2017 metais. Tyrime dalyvavo 45 pacientai, bendrąja tvarka stacionarizuoti į LSMUL KK Veido ir žandikaulių chirurgijos skyrių. Ekspermentinę grupę sudarė sergantys BDPLK (burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinoma). Sergančių BDPLK buvo 16 pacientų, kurių amžiaus vidurkis siekė 57,81 m, kontrolę grupę sudarė BDPLK nesergantys 29 pacientai, amžiaus vidurkis 57,64 m. Tiriamojoje grupėje buvo 11 vyrų ir 5 moterys. Kontrolinėje grupėje: vyrų buvo 14, o moterų 15.
Į eksperimentinę grupę įtraukti pacientai, kurie anksčiau gyvenime nebuvo sirgę piktybiniais navikais, pirminis navikas nustatytas burnos dugno gleivinėje, paliežuvio, pasmakrio sričių gleivinėje, pagal biopsijos rezultatus- plokščiųjų ląstelių karcinoma. Piktybiniam navikui burnos dugno srityje prieš chirurginį gydymą nebuvo taikyta spindulinė ar chemoterapija. Pacientai sergantys BDPLK pagal klinikinius duomenis, pirminio naviko dydį, išplitimą, metastazių buvimą, suskirstyti į stadijas: I, II,III, IV (I stadija – navikas iki 3 cm, metastazių nėra. II stadija – navikas iki 5 cm; taip pat gali būti metastazės sritiniuose limfmazgiuose. III stadija – navikas didesnis kaip 5 cm, peraugęs gretimus organus, metastazės sritiniuose limfmazgiuose; jei sritiniuose limfmazgiuose metastazės pavienės ar jų nėra. IV stadija – navikas išplitęs į kitus, taip pat atokius organus) [22]. I stadijos 0 pacientų, II stadijos-3, III-8, IV-5.Į ekspermentinę grupę nebuvo įtraukti pacientai anksčiau gyvenime sirgę piktybiniais navikais, sergantieji ne epitelinės kilmės piktybiniais navikais, taip pat sergantys BDPLK pacientai, kuriems buvo taikyta spindulinė terapija ar chemoterapija prieš chirurginį gydymą, pacientai sirgę kitų sričių piktybinias navikais: seilių liaukų, gomurio, skruostų, lūpų, gerklų piktybiniais navikais.
Į kontrolinę grupę įtraukti ne jaunesni nei 40 metų amžiaus pacientai, niekada gyvenime nesirgę piktybiniais navikais, veido ir žandikaulių chirurgijos skyriuje stacionarizuoti bendrąja tvarka veido kaulų lūžių, cistų, neuralgijų, gėrybinių darinių gydymo tikslais. Į kontrolinę grupę nebuvo įtraukti pacientai sergantys veido ir žandikaulių srities pūlynais, anksčiau gyvenime sirgę piktybiniais navikais, jaunesni nei 40 metų amžiaus pacientai (remiantis literatūra burnos srities piktybiniais navikais dažniausiai serga 5-6-ame gyvenimo dešimtmečiais [1].
Ekspermentiniame tyrime pacientai dalyvavo savo noru, savo sutikimą patvirtindami raštu, pasirašydami sutikimo formoje (žr. Priedai, Nr.3). Informacija surinkta apie pacientus yra anonimiška, niekur neviešinama. Informacija panaudota tik mokslinio darbo tikslais.
2.2. Anoniminė anketa
Visi tyrime dalyvavę 45 pacientai apklausti žodžiu ir jų atsakymai surašyti sudarytoje anketoje (žr. Priedai Nr.4). Anketa sudaryta siekiant įvertinti demografijos ir rizikos faktorių: rūkymo, blogos burnos higienos, alkoholio vartojimo įtaką BDPLK sergamumui. Anketoje buvo 16 klausimų.
Iš pacientų surinkta demografinė/ socialinė informacija: lytis, amžius, išsilavinimas, gyvenamoji vieta. Surinkti duomenys apie rizikos faktorius. Informacija apie rūkymo įtaką: ar pacientas rūko, kiek cigarečių per parą, kiek metų rūko. Alkoholio įtaka: ar vartoja alkoholį, kaip dažnai, kokie alkoholiniai gėrimai ir jų kiekis (vėliau suvartotas alkoholio kiekis standartizuotas verčiant standartiniais alkoholio vienetais, remiantis PSO Lietuvoje vienas standartinis alkoholio vienetas yra 10 g gryno etilo alkoholio ir atitinka: 200 ml alaus/ 25ml 40 % stiprumo alkoholio/ 100 ml vyno). Taip pat pacientų klausta kokiomis bendrinėmis ligomis serga. Anketose įrašyta pagrindinė liga, dėl kurios pacientas buvo guldomas į veido ir žandikaulio chirurgijos skyrių.
Anketose surinkta informacija susijusi su paciento burnos higienos įpročiais. Reikėjo įvertinti paciento burnos higieną, kaip pacientas rūpinasi savo burnos sveikata, ar nuo jos priklauso baltymo flagelino koncentracija seilėse. Tiriamųjų klausta: kaip dažnai valosi dantis pasta ir šepetėliu, ar naudoja skalavimo skystį, dantų siūlą/ tarpdančių šepetėlius, kaip dažnai lankosi pas gydytoją odontologą. Vertintas apnašų kiekis ant dantų paviršių naudojant Silness-Loe apnašų indeksą (0- apnašų ant dantų paviršiaus nėra, 1- apnašas matomas ties dantenų vagelės kraštu, 2-apnašas ties vagele ir dantenų papila, 3- apnašas aiškiai matomas ir dengia vagelę/ papilą ir dantų paviršių). Vertintas vienas dantis iš kiekvieno sekstanto, vėliau visi gauti skaičiai sudėti ir padalinti iš vertintų dantų skaičiaus. Taip pat surašytos kiekvieno paciento dantų formulės ir suskaičiuotas burnoje likusių dantų skaičius. Pacientai įvardijo dantų netekimo priežastis: periodonto ligų, ėduonies komplikacijos, traumos pasekmė, įgimtas danties užuomazgos nebuvimas.
2.3. Seilių mėginiai ir ELISA
Iš visų 45 tyrime dalyvusių tyriamųjų buvo surinkti seilių mėginiai. Nestimuliuotos seilės buvo renkamos rytais 7:00- 7:30. Tiriamosios ir kontrolinės grupės pacientai po atsikėlimo neišsivalę dantų, neatsigėrę vandens, nieko nevalgę spjaudydavo sėdimoje padėtyje seiles į sterilų užsukamą indelį. Seilių mėginio surinkimo procesas trukdavo nuo 15 iki 20 min. Seilių mėginio tūris 4-7 ml. Baltymas flagelinas, remiantis literatūros šaltiniais yra tirpus baltymas, o seilėse gausu deskvamuoto epitelio liekanų, netirpių baltymų ir kitų netirpių liekanų, kurios yra neinformatyvios. Paruošiant seilių mėginius ir išgaunant reikalingą biologinį skystį, seilės po paėmimo tą pačią dieną būdavo centrifuguojamos 6800 aps/min greičiu 10 min atšaldytoje iki 4oC temperatūros centrifugoje. Taip seilių skystis būdavo atskirtas nuo nuosėdų, kurios po centrifugavimo likdavo mėgintuvėlio dugne (žr. Priedai Nr.5). Biologinis skystis atskiriamas nuo nuosėdų ir supilstomas į 1,5 ml „Eppendorf“ mėgintuvėlius, papildomai įdedamas 1,5 µl proteinazės inhibitorius (slopina seilėse esančių baltymų įrimą), ant mėgintuvėlio užklijuojamas tiriamojo numeris. Paruoštas mėginys iškart užšaldomas -80oC temperatūroje ir laikomas iki tyrimų dienos. Užšaldyti mėginiai negali būti kelis kartus pakartotinai atšildyti ir vėl užšaldyti, nes tai gali turėti reikšmingos įtakos galutiniams rezultatams nustatant baltymų kiekį seilėse.
Užsakius iš UAB „LaboChema“ žmogaus flagelino ELISA rinkinį,0,1ng/ml- 10ng/ml 96 šulinėliai, (Catalog No.:abx051553) ir gavus, visi surinkti seilių mėginiai atšildyti (žr. Priedai Nr.6). Sekant ELISA rinkinio naudojimosi protokolu į šulinėlius išpilstyti žinomos koncentracijos flagelino standartiniai tirpalai, reikalingi kalibracinei kreivei gauti ir seilių mėginiuose flagelino koncentracijoms apskaičiuoti. Paliktas vienas kontrolinis šulinys su standartiniu tirpalu. Į likusius supilstyti seilių mėginiai. Kontrolinės ir tiriamųjų grupių seilių mėginiai atlikti po 2 pakartojimus. Į vieną šulinėlį įpiltos neskiestos seilės 50 µl , į kitą skiestos santykiu 1:1 su standartiniu tirpalu. Plokštelė su šulinėliais inkubuota 37 oC temperatūroje 30 min. Vėliau plauta su plovimu buferiu. Į visus šulinius išskyrus kontrolinį įdėtas HRP konjunguojantis reagentas ir toliau plokštelė su šulinėliais inkubuota 37 oC temperatūroje 30 min. Pakartotinai šulinėliai išplauti su plovimo buferiu. Į šulinelius sulašinti TMB A ir B substratai po 50 µl, papildomai inkubuota 15 min ir galiausiai įdėtas į šulinėlius stabdomasis tirpalas („Stop solution“), kas lemia šuliniuose geltonos spalvos atsiradimą. Spalvos intensyvumas priklauso nuo baltymo flagelino koncentracijos. (žr. Priedai Nr. 7). Šviesos absorbcija nustatyta vėliau apšvietus 450 nm ilgio šviesa plokštelę.
Kiekvieno mėginio flagelino koncentracija (ng/ml) šulinelyje apskaičiuota iš gautos kalibracinės kreivės.
Flagelino koncentracijos seilėse standartizavimui reikalingas bendras baltymų kiekis seilėse. Bendras baltymų kiekis seilių mėginuose nuostatytas Bradfordo reagentu, seiles atskiedus 5 kartus ir į jas įpilus po 3 ml Bradfordo reagento (žr. Priedai Nr. 8). Po 10 min įvykus reakcijai, nustatytos absorbcijos atskirai kiekvienam mėginiui. Iš absorbcijos rezultatų vėliau apskaičiuotas bendras baltymų kiekis (mg/ml) seilėse, remiantis Bradfordo kalibracine keive (žr. Priedai Nr.9).
Padalinus flagelino koncentraciją iš bendro baltymų kiekio seilėse gauname, kiek yra nanogramų baltymo flagelino 1 miligrame baltymų (ng/mg).
2.4. Duomenų analizė
Visų anketų duomenys surinkti į Microsoft Excel programą. Vėliau papildyta informacija apie flagelino koncentraciją seilėse ir nusiųsti statistikos specialistui gautų duomenų analizei. Duomenys apdoroti SPSS 23 programa. Priklausomybės tarp dviejų požymių įvertinmui naudotas chi kvadrato požymių priklausomybės testas, o vidurkių statistiniam reikšmingumui nustatyti t-testas (t-stjudento kriterijus). Statistinio patikimumo lygmuo pasirinktas P=95%. Statistiškai reikšmingi skirtumai buvo nustatyti, kai p<0.05. Naudotas grafinis duomenų atvaizdavimas.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Demografinių ir socialinių veiksnių įtaka BDPLK
Tyrime dalyvavo iš viso 45 pacientai. Sergančiųjų BDPLK buvo 16 (tiriamoji grupė), o sveikų 29 (kontrolinė grupė) (1 pav.).
1 pav. Tyrime dalyvavusių pacientų pasiskirstymas pagal sergamumą BDPLK.
Tiriamojoje grupėje buvo 11 vyrų bei 5 moterys, o kontrolinėje: 14 vyrų, 15 moterų. Statistiškai reikšmingos priklausomybės tarp lyties ir sergamumo BDPLK nenustatyta (χ=1.757; lls=1; p>0.05). Amžiaus vidurkis tiriamojoje grupėje siekė 57,81 m (SD 11,94), kontrolinėje 57,29 (SD 12,05). Nėra nustatyta statistiškai reikšmingo amžiaus vidurkių skirtumo tarp abiejų grupių pacientų (t=-0.288; lls=43; p>0.244). Tyrime dalyvavusiųjų visų vyrų amžiaus vidurkis 54,60 metai (SD 10,48), visų moterų vidutinis amžius 61,3 (SD 14,52). Jauniausias tiriamasis susirgęs BDPLK buvo 40 metų amžiaus,vyriausias 82 metų.
Kontrolinėje grupėje vidurinį ar žemesnį išsilavinimą turėjo 72,4% apklaustųjų, o tuo tarpu tiriamojoje grupėje turėjo 87,5%, tačiau statistiškai reikšmingos priklausomybės tarp išsilavinimo ir sergamumo BDPLK nenustatyta (χ=1.358; lls=1; p=0.224).
Tarp gyvenamosios vietos ir sergamumo BDPLK yra nustatyta statistiškai reikšminga priklausomybė (χ=5,237; lls=1; p=0.022).). Daugiau sergančiųjų yra iš miesto, jie sudaro 62,5% (2 pav.).
64% 36%
Nesergantys BDPLK
2 pav. Gyvenamoji vieta ir sergamumas BDPLK.
3.2. Rūkymo įtaka BDPLK
Tiriamojoje grupėje 81,3 % pacientų rūko, kai tuo tarpu kontrolinėje grupėje rūkančiųjų yra 55,2% (3 pav.). Statistiškai reikšmingos rūkymo įtakos BDPLK nenustatyta (χ=3,060; lls=1; p=0.08). 3 pav. Rūkymas ir BDPLK. 72,40% 37,50% 27,60% 62,50% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Nesergantys BDPLK Serga burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinoma Kaimas Miestas 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nesergantys BDPLK Serga BDPLK Nerūko Rūko
Sergantys BDPLK ir vartojantys tabaką vidutiniškai rūkė 28 (SD 7.27) metus, po 16,36 (SD 6.4) cigarečių per parą, tuo tarpu kontrolinėje grupėje vidutiniškai rūko 26,81 (SD 8.167) metus po 16,06 (SD 4.634) cigaretės per parą. Reikšmingo skirtumo tarp grupių rūkymo, surūkytų cigarečių kiekio bei rūkymo laikotarpio nenustatyta (atitinkamai p=0,69 bei p=0,96).
3.3. Alkoholio įtaka BDPLK
4 pav. Alkoholio vartojimas ir BDPLK.
Tiriamojoje grupėje alkoholį vartoja 81,3 % apklaustųjų, o kontrolinėje 58,6% (4 pav.), statistiškai reikšmingos alkoholio vartojimo įtakos BDPLK nenustatyta (χ=2,376; lls=1, p=0,123). Tiriamojoje grupėje iš vartojančiųjų alkoholį viduniškai vienam asmeniui teko po 17,15 alkoholio vienetų, dažnis bent kartą per savaitę ir dažniau, tuo tarpu kontrolinėje grupėje po 10,65 alkoholio vienetų bent kartą ar dažniau per mėnesį.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nesergantys BDPLK Serga BDPLK Nevartoja alkoholio Vartoja alkoholį
3.4. Burnos higienos ir burnos būklės įtaka BDPLK
5 pav. Dantų valymasis šepetėliu ir BDPLK.
Tarp dantų valymosi ir sergamumo BDPLK nustatyta statistiškai reikšminga priklausomybė (χ=7,405; lls=2, p=0,025). Kontrolinėje grupėje 17,2% tiriamųjų valosi dantis rečiau nei kartą per dieną, tuo tarpu sergančiųjų BDPLK 56,3% (5 pav.).
Sergančiųjų BDPLK grupėje 81,3% nenaudoja skalavimo skysčio bei 87,5 % dantų siūlo/tarpdančių šepetėlių, kontrolinėje grupėje atitinkamai nenaudoja 75,9 bei 82,8 %. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp skalavimo skysčio ir tarpdančių siūlo/šepetėlio naudojimo abiejose grupėse nerasta (p>0,05). Abi grupės menkai naudoja papildomas burnos priežiūros priemones.
Tarp apsilankymų skaičiaus pas gydytoją odontologą abiejose grupėse (6 pav.) statistiškai reikšmingo skirtumo nerasta (χ =4,83, lls=2, p=0.09). Sergančiųjų BDPLK 31,3% visai nesilankydavo profilaktiniams patikrinimams pas odontologus.
0 2 4 6 8 10 12 14 Nesergantys BDPLK Serga BDPLK
Valosi dantis rečiau nei kartą per dieną Valosi dantis kartą per dieną
Valosi dantis 2 kartus per dieną
6 pav. Apsilankymų skaičius pas gydytoją odontologą ir BDPLK
Nustatyta statistiškai reikšminga priklausomybė tarp Silness-Loe apnašų indekso ir BDPLK (χ =9,57, lls=3, p=0.023) (7 pav.). Apnašų buvo daugiau ant danties paviršiaus, dantenų vagelės, papilos sergančiųjų BDPLK, indekso vidutinė reikšmė 2,31, o kontrolinėje grupėje 1,53. 4 tiriamieji neturėjo dantų, todėl jų Silness-Loe apnašų indeksas nebuvo įvertintas.
10,30% 6,30% 44,80% 12,50% 41,40% 50,00% 3,40% 31,30% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% Nesergantys BDPLK Serga BDPLK Pacientas neturi dantų
1-Apnašas dantenų vagelyje
2-Apnašas dantenų vagelėje ir ant papilos
Nustatytas statistiškai reikšmingas dantų skaičius vidurkio skirtumas tarp tiriamosios ir kontrolinės grupių (t=2,050; lls=43; p=0.46) (8 pav.). Sergantys BDPLK dantų burnoje turėjo mažiau lyginant su nesergančiais. Pagrindinė dantų praradimo priežastis buvo ėduonies ir periodonto ligų komplikacijos gyvenimo eigoje. Visi pacientai neturėjo įgimtos nuolatinių dantų adentijos. Tai prastos burnos higienos pasekmė.
8 pav. Likusių dantų skaičius burnoje ir BDPLK.
Tiriamojoje gruėje nebuvo paciento turinčio I stadijos BDPLK. II stadijos buvo 17,65%, visi likusieji 82,35% III arba IV stadijos. Tai parodo, kad navikai jau buvo užleisti, dėl paciento nepakankamo rūpinimosi savo burnos sveikata, nesilankymo pas gydytojus bei pavėluoto kreipimosi. 16,66 10,88 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Neserga BDPLK Serga BDPLK
Dantų skaičius burnoje
3.5. Baltymo flagelino koncentracija ir įtaka BDPLK
9 pav. Baltymo flagelino koncentracija seilėse bei BDPLK.
Tiriamojoje grupėje vidutinė flagelino koncentracija seilėse 0,311 (SD 0,128) ng/ml, o 1 mg seilių baltymų yra 2 pg flagelino (2pg/mg). Kontrolinės grupės pacientų seilėse flagelino koncentracija 0,3565 (SD 0,162) ng/ml, 1 mg seilių baltymų flagelino koncentracija yra 3,3 pg/mg (9 pav.). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp baltymo flagelino vidutinės koncentracijos abiejose grupėse nenustatyta (t=0,908, lls=39, p=0.37).
Patikimos koreliacijos tarp flagelino koncentracijos seilėse priklausomai nuo burnos dugno vėžio stadijos (p=0.488), nuo Silness-Loe apnašų indekso (p=0.588), dantų skaičiaus burnoje (p=0,365), rūkymo (p=0.368), alkoholio vartojimo (p=0,263) nenustatyta.
0,3565 0,3111 0,28 0,3 0,32 0,34 0,36 Neserga BDPLK Serga BDPLK
Vidutinė flagelino koncentracija
seilėse, ng/ml
4. DISKUSIJA
4.1. Rezultatų aptarimas
Mūsų studijų metu tiriamosios grupės amžiaus vidurkis buvo 57,81±11,94 m, sirgusių vyrų ir moterų santykis 2,2:1, daugiausiai sirgusiųjų BDPLK 51-60 metų amžiaus. Rahman ir kt. tyrė pacientus, sirgusius burnos vėžiu bei gydytus Khulna (Bangladešas) universitetinės ligoninės Burnos chirurgijos skyriuje. Tiriamųjų amžiaus vidurkis buvo 50.46±3,78, liga labiausiai paplitusi buvo 51-60 metų amžiaus grupėje. Sergančiųjų vyrų ir moterų santykis buvo 1,5:1 [2]. Guha ir kiti atliktų studijų metu sirgę burnos, gerklų, stemplės vėžiu, vyresni nei 50 metų amžiaus sudarė daugiau nei 80% sirgusiųjų. Vyrai 5 kartus dažniau sirgo nei moterys [23]. Burnos vėžiu serga dažniau vyresni nei 50 metų amžiaus, vyrai serga dažniau nei moterys.
Tyrime buvo nustatyta reikšminga priklausomybė tarp gyvenamosios vietos ir sergamumo BDPLK, p=0.022. Dažniau serga BDPLK mieste gyvenantys žmonės, 62,5% iš visų tyrime sirgusiųjų burnos dugno vėžiu. Kadangi tyrime dalyvavo 45 asmenys, o sergančiųjų buvo tik 16, tikėtina, kad padidinus sergančiųjų BDPLK imtį, ši priklausomybė tarp gyvenamosios vietos ir sergamumo gali išnykti, ypač jei papildomi pacientai būtų iš kaimo. Kita priežastis gali būti, kad Lietuvoje daugiau žmonių gyvena mieste nei kaime, todėl ir sergančių BDPLK yra daugiau iš miesto. Remiantis 2011m. Kovo 1d. Lietuvos statistikos departamento gyventojų surašymo duomenis mieste gyveno 66,7%, kaime 33,3% žmonių [24].
Iš sergančiųjų BDPLK rūko 81,3%. Rūkimo vidutinė trukmė siekia 26,81±8.167 metų, surūkoma po daugiau nei 16 cigarečių per parą. Taip pat 81,3% sergantieji nevengia ir alkoholio vartojimo, dažnis nuo karto per savaitę iki beveik kasdien, po 17,15 alkoholio vienetų. Tyrime nerasta statistiškai reikšmingos priklausomybės tarp alkoholio vartojimo, rūkymo bei BDPLK, p>0,05. Viena iš priežasčių gali būti per maža imtis, antroji- LSMUL KK Veido ir žandikaulių chirurgijos skyriaus pacientai, kurie sudarė kontrolinę grupę nesirgo BDPLK, tačiau rūkė ir vartojo alkoholinius gėrimus taip pat. Kontrolinėje grupėje vartoja alkoholį 58,6%, o rūkė 55,2%. Konduru A. ir kitų autorių studijų metu nustatė, kad iš burnos vėžiu sirgusių žmonių 68,5% vartojo alkoholį, o 67.1% vartojo tabaką [25]. Tuo tarpu Rahman ir kt. studijose sergantys burnos vėžiu vartojo kramtomąjį tabaką ir alkoholį 66% sirgusiųjų, ir nustatė reikšmingą kramtomojo tabako įtaką burnos vėžio sergamumui [2]. Ilgą laiką veikiant žalingiems faktoriams (rūkymas,
alkoholio vartojimas), jų vaidmuo ir reikšmė burnos vėžio plokščialąstelinės karcinomos sergamumui didėja.
Sergantys BDPLK rečiau lankėsi arba visai nesilankė profilaktiniams patikrinimams pas gyd. odontologą iki susirgimo BDPLK (p<0,05), taip pat nesivalo dantų arba valosi rečiau nei kartą per dieną. Konduru A. ir kt. tyrimo metu 43,5% sergantys burnos vėžiu dantis valėsi rečiau nei kartą per dieną, p= 0.522, o 47 % sirgusiųjų profilaktiniams patikrinimams pas odontologą lankėsi rečiau nei kartą per metus, p=0.568 [25].
Prastą burnos higieną BDPLK grupėje parodo aukštas Silness-Loe apnašų indeksas (p<0,05), vidurkis 2,31. Nepakankamos higienos rezultatą parodo menkas likusių dantų skaičius sergančiųjų BDPLK grupėje (p<0,05), vidutinis likusių dantų skaičius 10,88 (SD 7,92), tuo tarpu kontrolinėje grupėje 16.66 (SD 9,60). Guha ir kt. nustatė, kad vėžiu sergantys ir nepakankamus burnos higienos įpročius turintys pacientai burnoje turi mažiau dantų, nei sveiki pacientai [23].
Dar vienas rodiklis parodantis BDPLK sergančiųjų nesirūpinimą savo burnos sveikata, vėžio stadijos. Dauguma navikų buvo užleisti, III, IV stadijos, šios stadijos sudarė 82,35 % visų sergančiųjų BDPLK. Taigi sergančiųjų BDPLK sąmoningumas, rūpinimasis burnos sveikata yra per mažas. Kitų autorių studijos parodė, kad burnos vėžiu sergantys pacientai nesirūpina burnos sveikata ir priežiūra lyginant su sveikais pacientais [1,2,23,25].
Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp vidutinės flagelino koncentracijos seilėse sergančiųjų BDPLK ir sveikųjų grupėse nenustatyta. Patikimos koreliacijos tarp flagelino koncentracijos seilėse ir rizikos faktorių (rūkymo, alkoholio vartojimo, burnos higienos) bei burnos dugno vėžio stadijos nenustatyta.Tačiau seilėse baltymo flagelino yra, vadinasi, jis gali prisijungti prie savo taikinio TLR-5 receptoriaus ir turėti įtakos BDPLK etiopatogenezėje. Tyrime buvo nustatyta mažesnė flagelino koncentracija sergančiųjų grupėje. Norint iki galo įvertinti fagelino ir TLR-5 receptoriaus įtaką reikalingi tyrimai nustatant TLR-5 receptoriaus kiekį bei pasiskirstymą epiteliniame sluoksnyje sergančiųjų BDPLK grupėje. Nustatyti ir palyginti sergančių BDPLK po TLR-5 aktyvacijos (po baltymo flagelino prisijungimo) toliau ląstelės viduje susidarančių citokinų: interleukinų-1β bei interleukino-6 kiekį seilėse bei kraujo serume, kurių svarbus vaidmuo nustatytas plokščiųjų ląstelių karcinogenezėje kitų autorių studijų metu [17,18].
4.2. Padėka
Noriu išreikšti didžiausią pagarbą prisidėjusiems prie šio darbo: Magistrinio darbo vadovui Gintarui Janužiui
Prof. dr. Rasai Banienei konsultavusiai bei padėjusiai atlikti baltymo flagelino kiekio seilėse nustatymą su ELISA rinkiniu.
Gyd. rezidentui Ignui Barauskui
LSMU KK Veido ir žandikaulių chirurgijos skyriaus pacientams, sutikusiems dalyvauti klinikinėje studijoje.
Taip pat UAB „Plandent“ bendra Lietuvos ir Suomijos įmonei, kuri prisidėjo finansine parama prie ELISA žmogaus flagelino rinkinio įsigijimo.
LSMU MA Biochemijos katedrai, kuri leido naudotis katedros centrifuga seilių mėginių paruošimui ir šaldikliu, kuriame -80oC temperatūroje buvo laikomi apdoroti mėginiai iki ištyrimo dienos.
4.3. Interesų konfliktas
Autorius interesų konflikto neturėjo. Atliktų studijų metu baltymo flagelino koncentracijai seilėse nustatyti buvo įsigytas žmogaus flagelino ELISA rinkinys,0,1ng/ml- 10ng/ml 96 šulinėliai, (Catalog No.:abx051553) iš UAB „LaboChema“ Įm. kodas: 300670772, Vilkpėdės g. 22, Vilnius.
ELISA rinkinį įsigyti padėjo rėmėjas UAB „Plandent“ bendra Lietuvos ir Suomijos įmonė, įmonės kodas: 1106723219, adresas: Gedimino g. 15, Kaunas, Lietuva.
IŠVADOS
1. Sudaryta anketa siekiant įvertinti kiekvieno tiriamojo socialinę, demografinę padėtį, rūkymą, alkoholio vartojimą, burnos būklę bei burnos higienos įpročius sergančiųjų BDPLK bei sveikų pacientų grupėse.
2. Rūkymo ir alkoholio vartojimo įtakos BDPLK nenustatyta.
3. BDPLK sergančių pacientų burnos higiena yra bloga, jie nesirūpina savo burnos sveikata ir priežiūra.
4. Vidutinė flagelino koncentracija nestimuliuotose seilėse yra didesnė nesergančių BDPLK grupėje, tačiau reikšmingos koncentracijos įtakos nenustatyta.
5. Baltymo flagelino koncentracija seilėse nepriklauso nuo rūkymo, alkoholio vartojimo, burnos higienos, nuo BDPLK vėžio stadijos.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Klinikinėje praktikoje gydant pacientus reikėtų atkreipti jų dėmesį į rizikos faktorius, padidinančius tikimybę susirgti burnos srities piktybiniais navikais. Ne tik rūkymas ar alkoholio vartojimas, bet ir blogi burnos higienos įpročiai vaidina svarbų vaidmenį plokščialąstelinės karcinomos išsivystymui burnos srityje, kaip parodė ir mūsų eksperimentinis tyrimas bei kitų autorių atlikti tyrimai. Neatliekant periodiškai profesionalios burnos higienos procedūrų, nevalant dantų, ant dantų paviršiaus, dantenų kišenėse gausiai susikaupia apnašų, o jose patogeninių bakterijų, kurios skatina periodonto ligų progresavimą bei vėlesnį dantų netekimą. Sergančiųjų BDPLK tarpe nustatytas mažesnis dantų skaičius lyginant su sveikų pacientų grupe. Mikroorganizmų nuolatos išskiriami endotoksinai, egzotoksinai dirgina burnos gleivinės ląsteles, šios išskiria chemokinus ir citokinus, prasideda lėtiniai uždegiminiai procesai. Uždegimui užsitęsus ilgą laiką, vyksta pokyčiai epitelio sluoksnyje, kas gali ateityje lemti plokščiųjų ląstelių supiktybėjimą ir karcinomos atsiradimą. Jauniausiais BDPLK sergantis pacientas buvo 40 metų amžiaus. Atliekantvyresnio nei 40 metų amžiaus rūkančio, vartojančio alkoholio ar blogos burnos higienos įpročius turinčio paciento, burnos ištyrimą, būtina nuodugniai apžiūrėti ar nėra gleivinės pakitimų ar opų burnos dugno, alveolinės ataugos, liežuvio, skruosto, gomurio, ryklės, gerklų srityse. Anksti diagnozavus piktybinį naviką išvengiama jo metastazių, gydymas yra žymiai lengvesnis. I, II stadija yra dažnai pagydoma. Deja mūsų tyrime dalyvavusių BDPLK sergančių pacientų navikai buvo užleisti, dauguma III, IV stadijos, jie reguliariai nesilankydavo pas odontologą, atsiradus gleivinės pokyčiams ilgai niekur nesikreipė. Tokių pacientų gydymo prognozė yra bloga ir išgyvenamumas yra žemas. Radikalios operacijos trunka ilgai, po operacijos susidaro didelis kietųjų, minkštųjų audinių defektas, kuris užpildomas pasitelkiant atkuriamąją chirurgiją (atliekama osteosintezė su kauliniais autotransplantatais iš blauzdikaulio, šeivikaulio, klubakaulio, plastika vietiniais audiniais, pasukamieji, transpoziciniai lopai, pvz. m. pectoralis lopas). Todėl būtina didinti pacientų sąmoningumą rūpintis savo burnos sveikata. Privaloma kartą per metus apsilankyti profilaktiniam patikrinimui pas gyd. odontologą, 2 savaites ir ilgiau negyjančias žaizdas būtina ištirti histologiškai. Paaiškinti pacientui, kad dantis reikia valytis šepetėliu 2 kartus per parą, tarpdančius išsivalyti dantų siūlu ar tarpdančių šepetėliais. Supažindinti pacientą su burnos higienos instruktažu. Jei pacientas rūko ar vartoja alkoholį, skatinti ir motyvuoti atsisakyti šio žalingo įpročio. Tyrime dalyvavę sergantys BDPLK rūkė cigaretes nuolatos 25-40 metų, po beveik cigarečių pakelį per dieną. Atsisakius žalingų įpročių, palaikant gerą burnos
higieną, reguliariai apsilankant pas gyd. odontologą, sergamumą burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinoma ar kitų burnos sričių būtų galima sumažinti arba anksti nustačius ligą lengvai išgydyti.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Rahman SS, Sarker MK. Clinical profile of oral squamous cell carcinoma patients attending a tertiary care hospital. Bang Med J Khulna. 2014; 47 : 3-6.
2. Kauppila HJ et al. Toll-like receptor 5 (TLR5) expression is a novel predictive marker for recurrence and survival in squamous cell carcinoma of the tongue. British Journal of Cancer 2013; 108, 638–643.
URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3593548/
3. Park JH et al. Toll-like receptor 5 activation promotes migration and invasion of salivary gland adenocarcinoma. J Oral Pathol Med . 2011; 40: 187–193.
URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-0714.2010.00929.x/full URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jop.12233/abstract
4. Kauppila HJ et al. Toll-like receptor 5 and the emerging role of bacteria in carcinogenesis. OncoImmunology 2013; 2:4, e23620.
URL: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.4161/onci.23620
5. Ramniwas M. Kumawat, Sindhu M et al. Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola in chronic and aggressive periodontitis patients: A comparative polymerase chain reaction study. Contemporary Clinical Dentistry. 2016 ;7(4):481-486.
6. Takeuchi Y. Treponema socranskii, Treponema denticola, and Porphyromonas gingivalis Are Associated With Severity of Periodontal Tissue Destruction. Journal of Periodontology. 2001; Vol. 72, No. 10, Pages 1354-1363.
URL: http://www.joponline.org/doi/abs/10.1902/jop.2001.72.10.1354
7. Riviere G, Elliot KS et al. Relative Proportions of Pathogen-Related Oral Spirochetes (PROS) and Treponema denticola in Supragingival and Subgingival Plaque From Patients With Periodontitis. Journal of Periodontology. February 1992, Vol. 63, No. 2, Pages 131-136.
8. Rich AM, Hussaini HM et al. Toll-like receptors and cancer, particularly oral squamous cell carcinoma. Front Immunol. 2014 Sep 24; 5:464.
9. Song EJ, Kang MJ et al. Flagellin promotes the proliferation of gastric cancer cells via the Toll-like receptor 5. Int J Molecular Med. 2011 Jul; 28(1):115-9.
10. Sun L, Jiang Q et al. Toll-like receptors and breast cancer. Integr Cancer Sci Therap, 2016; Volume 3(2): 432-436.
11. Omar AA, Korvala J et al. Toll-like receptors -4 and -5 in oral and cutaneous squamous cell carcinomas. J Oral Pathol Med. 2015; 44: 258–265.
URL: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2014.00464/full
12. Kim S, Takahashi H, Lin WW et al. Carcinoma-produced factors activate myeloid cells through TLR2 to stimulate metastasis. Nature 2009; 457: 102–6.
URL: http://www.nature.com/nature/journal/v457/n7225/full/nature07623.html
13. Harmey JH, Bucana CD, Lu W, et al. Lipopolysaccharide-induced metastatic growth is associated with increased angiogenesis, vascular permeability and tumor cell invasion. Int J Cancer 2002; 101: 415–22.
URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ijc.10632/full
14. Ilvesaro JM, Merrell MA, Swain TM, et al. Toll like receptor-9 agonists stimulate prostate cancer invasion in vitro. Prostate 2007; 67: 774–81.
URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pros.20562/full
15. Brent Polk B, Peek R. Helicobacter pylori gastric cancer and beyond. Nat Rev Cancer 2010 June ; 10(6): 403–414.
URL: http://www.nature.com/nrc/journal/v10/n6/abs/nrc2857.html
16. Aviello G, Corr SC, Johnston DG et al. MyD88 adaptor-like (Mal) regulates intestinal homeostasis and colitis-associated colorectal cancer in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2014 May 1; 306(9):G769-78.
URL: http://ajpgi.physiology.org/content/306/9/G769
17. Cai Z, Sanchez A, et al. Activation of Toll-like receptor 5 on breast cancer cells by flagellin suppresses cell proliferation and tumor growth. . Cancer Res. 2011; 71: 2466-2475.
URL: http://cancerres.aacrjournals.org/content/71/7/2466.short
18. Takeuchi S, Baghdadi M, Tsuchikawa T, Wada H, Nakamura T, et al.Chemotherapy-Derived Inflammatory Responses Accelerate the Formation of Immunosuppressive Myeloid Cells in the Tissue Microenvironment of Human Pancreatic Cancer. Cancer Res, 2015; 75: 2629-2640.
URL: http://cancerres.aacrjournals.org/content/75/13/2629.short
19. Luddy KA, Robertson-Tessi M, Tafreshi NK, Soliman H, Morse DL. The role of toll-like receptors in colorectal cancer progression: evidence for epithelial to leucocytic transition. Front Immunol 2014. 5: 429.
20. Bhattacharya D, Yusuf N et al. Expression of toll-like receptors on breast tumors: taking a toll on tumor microenvironment. Int J Breast Cancer 2012; Article ID 716564.
URL: https://www.hindawi.com/journals/ijbc/2012/716564/abs/
21. Wang R, Ahmed J et al. Airway Epithelial Expression of Toll-like Receptor 5 is Down-regulated in Healthy Smokers and Smokers with Chronic Obstructive Pulmonary Disease J Immunol 2012; 189(5): 2217–2225.
URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579667/ 22. Skyrius: Navikai
L. Griciūtė. Patologinė anatomija. Navikų išplitimo stadijos. 2001. URL: http://www.pathonet.lt/Fundamentine_patologija/8%20dalis.htm
23. Guha N, Boffetta P. Oral health and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck and esophagus: results of two multicentric case-control studies. Am J Epidemiol. 2007 Nov 15;166(10):1159-73.
URL: https://academic.oup.com/aje/article/166/10/1159/157336/Oral-Health-and-Risk-of-Squamous-Cell-Carcinoma-of
24. Skyriaus pavadinimas: Gyventojų sudėtis.
Statistikos dapartamentas. 2011m. gyventojų surašymo rezultatai. 2012. p.4.
URL:https://osp.stat.gov.lt/documents/10180/217110/Lietuvos_gyventojai_2011.pdf/8321a3c1-c8b9-4468-825c-52a7b753f281
25. Konduru R, Konduru, Newtonraj A. Oral cancer awareness of the general public in coastal village areas of Tamilnadu, India: a population based cross sectional study. Int J Community Med Public Health. 2016 Jul;3(7):1932-1939.
PRIEDAI
Priedas Nr.1
Signalo perdavimo kelias ląstelės viduje po flagelino prisijungimo prie TLR-5 receptoriaus. Pirmasis baltymas pernašantis informaciją po TLR-5 aktyvacijos ląstelės citoplazmoje yra baltymas MyD88. Šis baltymas dalyvauja visų 10 skirtingų TLR receptorių informacijos perdavime ląstelės viduje. Kitų autorių studijos nustatė, kad MyD88 baltymas vaidina svarbią rolę vėžio etiopatogenezėje. Toliau metaboliniame kelyje sutinkamas ne mažiau svarbus baltymas NF-kβ (Nucleus factor), kuris priima informaciją ląstelės citoplazmoje bei perduoda ją branduoliui. Branduolyje sukelia transkripcijos pokyčius, o vėliau ir citoplazmoje transliacijos: susintetinami interleukinai 6, 12 (IL-6, 12), interleukinas -1β (IL-1β) ir naviko nekrozės faktorius (TNF-tumor necrosis factor). Šie uždegimą sukeliantys citokinai skatina plokščialąstelinės karcinomos išsivystymą, navikinių ląstelių proliferaciją bei atsparumą imuniniam atsakui.Sun ir kiti. [5]
Priedas Nr.2
Bioetikos centro leidimas Nr. BEC – OF – 04 vykdyti apklausą ir eksperimentinį tyrimą 2015-2016 m. LSMU KK veido ir žandikaulių chirurgijos skyriuje. Nuotraukos autorius Donatas Cirulis
Priedas Nr.3
TIRIAMOJO ASMENS SUTIKIMO FORMA
Aš, ________________________________________________, sutinku dalyvauti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto odontologijos fakulteto studento Donato Cirulio atliekamame tyrime, skirtame nustatyti ryšį tarp rizikos faktorių ir baltymo flagelino burnos dugno plokščiųjų ląstelių karcinomai.
Tiriamasis:
______________________________________________________________________ (Vardas Pavardė, Parašas)
Nr. _____ Data _______________
Priedas Nr.4
Anoniminė anketa. Apklausa atliekama kiekvieną pacientą apklausiant žodžiu ir atsakymus sužymint anketoje.
Tiriamojo Nr. _______ Pagrindinė liga: ___________________________________
1. Lytis : ○ Vyras ○ Moteris ○ kita 2. Amžius ________m.
3. Išsilavinimas:
o Aukštasis ○ Aukštesnysis ○ Vidurinis ○ Žemesnis nei vidurinis 4. Gyvenamoji vieta:
o Miestas ○ Kaimas
5. Ar vartojate tabaką/rūkote? ○ Taip ○ Ne o Kiek metų rūkote? _________ m.
o Kiek cigarečių (vnt.) per parą? ___________ cigarečių
6. Kaip dažnai vartojate alkoholinius
gėrimus? Niekada
Rečiau nei kas mėnesį
Kas
mėnesį Kas savaitę
Kasdien ar bemaž kasdien ○ Kokį kiekį alkoholinių gėrimų*
paprastai išgeriate vienu kartu? (*standartinio alkoholio vnt.) 1-2 vnt. 3-4 vnt. +5 vnt. Alkoholinio gėrimo kiekis (litrais) ir rūšis _______
daugiausiai išgeriate vienu kartu? (alkoholio vnt.)
gėrimo kiekis ir rūšis
*Standartinis alkoholinis vienetas 10g gryno etilo alkoholio atitinka: ~200ml alaus ; ~25ml 40% stiprumo gėrimo ; ~100ml vyno
7. Kaip dažnai valote dantis su šepetėliu ir pasta? o Rečiau nei kartą per savaitę
o Rečiau nei kartą per dieną, bet bent kartą per savaitę o Kartą per dieną
o Dažniau nei kartą per dieną
8. Ar naudojate dantų skalavimo skystį? Taip / Ne
9. Ar naudojate dantų siūlą/ tarpdančių šepetėlius? Taip / Ne
10. Kaip dažnai lankotės pas gyd. Odontologą profilaktiniams patikrinimams? o Nesilankau
o Rečiau nei kartą per metus o Kartą per metus
o Dažniau nei kartą per metus
11. Ar kiti šeimos nariai turėjo onkologinių susirgimų? Taip / Ne 12. Silness Loe apnašų indeksas: _______
1. 2. 3.
4. 5. 6.
13. Dantų formulė: 14. Dantų skaičius: ___ 15. Dantų nebuvimo priežastis:
o Ėduonies komplikacijos o Periodonto ligos
o Traumos pasekmė ( danties išmušimas,vainiko, šaknies lūžis) o Įgimta adentija
Priedas Nr.5
Seilių mėginio paruošimas. Seilės po surinkimoo tą pačią dieną būdavo centrifuguojamos 6800 aps/min greičiu 10 min atšaldytoje iki 4oC temperatūros centrifugoje. Mėgintuvėlio dugne po centrifugavimo nusėsdavo nuosėdos, viršuje likdavo skystis, kuris buvo surenkamas ir -80o
C temperatūroje šaldomas iki tyrimų dienos. Nuotraukos autorius Donatas Cirulis
Priedas Nr.6
Atšildyti seilių mėginiai 1,5 ml „Eppendorf“ mėgintuvėliuose baltymo flagelino kiekio nustatymui su ELISA rinkiniu.Nuotraukos autorius Donatas Cirulis
Priedas Nr.7
ELISA rinkinio plokštelė su paruoštais šuliniais žmogaus flagelino kiekiui seilėse nustatyti prieš šviesos absorbcijos matavimą. Šulinių geltonos spalvos intensyvumas priklauso nuo flagelino koncentracijos mėginyje. Nuotraukos autorius Donatas Cirulis
Priedas Nr. 8
Bendras baltymų kiekis seilių mėginuose nuostatytas Bradfordo reagentu, seiles atskiedus 5 kartus ir į jas įpilus po 3 ml Bradfordo reagento. Nuotrauka padaryta praėjus 10 min po reagento įpilimo, įvykus reakcijai. Nuotraukos autorius Donatas Cirulis
Priedas Nr. 9
Bradfordo kalibracinė kreivė baltymų kiekiui seilėse nustatyti 100 µl seilių skysčio (µg/µl).
y = 0,015x + 0,0584 R² = 0,9014 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 10 20 30 40
