DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Eterinio aliejaus ir bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtinguose Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) morfologiniuose organuose“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Monika Bacevičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Monika Bacevičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Asta Kubilienė
(data) (vadovės vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
Liudas Ivanauskas
(aprobacijos data ) (katedros vedėjo vardas, pavardė) (parašas) Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MONIKA BACEVIČIŪTĖ
ETERINIO ALIEJAUS IR BENDRO FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKIO
ĮVAIRAVIMAS SKIRTINGUOSE SOSNOVSKIO BARŠČIŲ (HERACLEUM
SOSNOWSKYI M.) MORFOLOGINIUOSE ORGANUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Asta Kubilienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas: Prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
ETERINIO ALIEJAUS IR BENDRO FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKIO
ĮVAIRAVIMAS SKIRTINGUOSE SOSNOVSKIO BARŠČIŲ (HERACLEUM
SOSNOWSKYI M.) MORFOLOGINIUOSE ORGANUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Asta Kubilienė Data Recenzentas: Parašas Data Darbą atliko: Monika Bacevičiūtė Data KAUNAS, 2020
TURINYS
SANTRAUKA ... 6
SUMMARY ... 8
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) mokslinė klasifikacija ir morfologiniai požymiai ... 13
1.2. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) istorija ir paplitimas ... 14
1.3. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) augalinės žaliavos cheminė sudėtis ... 15
1.4. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) poveikis žmogaus sveikatai ... 16
1.5. Eteriniai aliejai ... 16
1.6. Eterinio aliejaus ekstrakcija ir kokybinė – kiekinė analizė augalinėje žaliavoje ... 18
1.7. Fenoliniai junginiai ... 21
1.8. Fenolinių junginių ekstrakcija ir kiekinė analizė augalinėje žaliavoje ... 22
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1. Tyrimo objektas ... 24
2.2. Naudoti reagentai ... 25
2.2.1. Reagentai, naudoti eterinių aliejų tyrimo metu ... 25
2.2.2. Reagentai, naudoti fenolinių junginių tyrimo metu ... 25
2.3. Naudota įranga ... 25
2.3.1. Įranga, naudota eterinių aliejų tyrimo metu ... 25
2.3.2. Įranga, naudota fenolinių junginių tyrimo metu ... 26
2.4. Eterinių aliejų ekstrakcija ... 26
2.5. Eterinio aliejaus kokybinė – kiekinė analizė ... 27
2.6. Fenolinių junginių ekstrakcija ... 27
2.7. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 28
2.8. Statistinė duomenų analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos eterinių aliejų kokybinė - kiekinė analizė ... 30
3.1.1. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos eterinių aliejų komponentų kokybinė analizė ... 31
5 7
3.1.2. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos bendro eterinių aliejų komponentų kiekio
analizė ... 36
3.1.3. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos eterinių aliejų komponentų kiekinė analizė . 37 3.2. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos ekstraktuose ... 40
3.3 Rezultatų aptarimas ... 42
4. IŠVADOS ... 44
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 46
7. TYRIMŲ REZULTATŲ SKLAIDA ... 51
SANTRAUKA
M. Bacevičiūtės magistro baigiamasis darbas “Eterinio aliejaus ir bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtinguose Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) morfologiniuose organuose”. Mokslinė vadovė Doc. dr. A. Kubilienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020.
Darbo tikslas: Atlikti skirtinguose Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) morfologiniuose organuose kaupiamų eterinių aliejų kokybinės ir kiekinės sudėties bei bendro fenolinių junginių kiekio analizę augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
Darbo uždaviniai: 1. Pasirinkti tinkamiausius metodus eterinių aliejų ir fenolinių junginių išskyrimui iš tiriamosios Heracleum sosnowskyi augalinės žaliavos. 2. Nustatyti eterinių aliejų kokybinę sudėtį skirtinguose Heracleum sosnowskyi morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu. 3. Įvertinti bendrą Heracleum sosnowskyi eterinių aliejų komponentų kiekį skirtinguose morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu. 4. Įvertinti pagrindinių Heracleum sosnowskyi eterinių aliejų komponentų kiekinę sudėtį skirtinguose morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu. 5. Įvertinti bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą skirtinguose Heracleum sosnowskyi morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
Tyrimo metodika: Augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu surinkta Heracleum sosnowskyi M. šaknų, stiebų, lapų ir žiedų augalinė žaliava buvo džiovinama, eteriniai aliejai išgauti hidrodistiliacijos metodu, kokybinė - kiekinė eterinių aliejų analizė atlikta dujų chromatografijos - masių spektrometrijos (DC - MS) metodu. Fenoliniai junginiai išgauti ultragarsu skatinama ekstrakcija, o bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą.
Rezultatai ir išvados: Kokybinės analizės metu nustatyta, kad dominuojanti H. sosnowskyi EA grupė - monoterpenai, didžiausias procentinis kiekis monoterpeninių junginių aptinkamas stiebuose, augimo pradžioje. Visuose mėginiuose aptinkami tik β – ocimenas ir β – mircenas. Daugiausiai EA komponentų nustatyta lapuose, masinio žydėjimo metu. Kiekinės analizės metu, nustatyta, kad didžiausias EA kiekis, pagal bendrą smailių plotą, kaupiasi žieduose, masinio žydėjimo metu 165,79 ± 0,17 × 107. β – ocimeno daugiausiai kaupiasi lapuose (6,87 proc.), o β – mirceno – žieduose (1,17 proc.), masinio žydėjimo metu. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis aptinkamas lapuose, masinio žydėjimo laikotarpiu (17,66 mg/g). Statistiškai įvertinus duomenis, nustatyta, kad EA, β – ocimeno bei bendro fenolinių junginių kiekiai reikšmingai skiriasi (p < 0,05) priklausomai nuo morfologinio organo ir vegetacijos tarpsnio, β-mirceno kiekis - reikšmingai nesiskiria (p > 0,05). Galima tvirtinti, kad EA sudėtis bei kiekis ir bendras
fenolinių junginių kiekis priklauso nuo morfologinio augalo organo, iš kurio jis yra ekstrahuojamas, bei augimo tarpsnio.
SUMMARY
Final master's thesis of M. Bacevičiūtė: “Diversification of essential oil and total amount of phenolic compounds in different morphological organs of Sosnowsky's hogweed (Heracleum sosnowskyi M.)”. Scientific supervisor doc. A. Kubilienė; Lithuanian University of Health Sciences Faculty of Pharmacy Department of analytical and toxicological chemistry. Kaunas, 2020.
The aim of work: To perform the analysis of the qualitative and quantitative composition of essential oils and the total amount of phenolic compounds accumulated in different morphological organs of Sosnowsky's hogweed (Heracleum sosnowskyi M.) at the beginning of growth and during mass flowering.
Main tasks: 1. To select the most appropriate methods for the extraction of essential oils and phenolic compounds from the Heracleum sosnowskyi plant material. 2. To determine the qualitative composition of essential oils in different morphological organs of Heracleum sosnowskyi at the beginning of growth and during mass flowering. 3. To evaluate the total amount of Heracleum sosnowskyi essential oil components in different morphological organs at the beginning of growth and during mass flowering. 4. To evaluate the quantitative composition of the main components of Heracleum sosnowskyi essential oils in different morphological organs at the beginning of growth and during mass flowering. 5. To evaluate the total variation of phenolic compounds in different morphological organs of Heracleum sosnowskyi at the beginning of growth and during mass flowering.
Methodology: At the beginning of growth and during mass flowering, the plant material of Heracleum sosnowskyi M. roots, stems, leaves and flowers was dried, essential oils were obtained by hydrodistillation, and qualitative – quantitative analysis of essential oils was performed by gas chromatography - mass spectrometry (GC - MS). Phenolic compounds were extracted by ultrasound and the total phenolic compounds were determined spectrophotometrically using Folin - Ciocalteu reagent. Results and conclusions: Qualitative analysis revealed that the dominant H. sosnowskyi EO group is monoterpenes, the highest percentage of monoterpene compounds is found in the stems at the beginning of growth. Only β-ocimene and β-myrcene are detected in all samples. Most EO components were found in the leaves during mass flowering. Quantitative analysis showed that the highest amount of EO, in terms of total peak area, accumulates in the flowers, during mass flowering 165,79 ± 0,17 × 107. β -ocimene is mostly found in leaves (6,87 pct.) and β - myrcene in flowers (1,17 pct.) during mass flowering.The highest total amount of phenolic compounds is found in the leaves during the period of mass flowering (17,66 mg/g). Statistical evaluation of the data showed that the amounts of EO, β - ocimene and total phenolic compounds differ significantly (p < 0,05) depending on the morphological
organ and the stage of vegetation, the amount of β - myrcene - does not differ significantly (p > 0,05). It can be argued that the composition and amount of EO and the total amount of phenolic compounds depend on the morphological organ of the plant from which it is extracted and the growth stage.
SANTRUMPOS
BFJK – bendras fenolinių junginių kiekis CO2 – anglies dioksidas
DC - MS (GC - MS) – dujų chromatografija - masių spektrometrija (ang. gas chromatography - mass spectrometry)
EA (EO) – eteriniai aliejai (ang. essential oils) FJ – fenoliniai junginiai
FR – fenolinės rūgštys
LAP – lapai augimo pradžioje LMŽ – lapai masinio žydėjimo metu SAP – stiebai augimo pradžioje SMŽ – stiebai masinio žydėjimo metu ŠAP – šaknys augimo pradžioje ŠMŽ – šaknys masinio žydėjimo metu UV – ultravioletiniai spinduliai
ĮVADAS
Eteriniai aliejai (EA) - tai natūralios kilmės medžiagos, išgaunamos iš augalų. Lakieji aliejai yra plačiai naudojami įvairiose pramonės srityse visame pasaulyje [1]. Eteriniai aliejai yra sudėtingi mišiniai, sudaryti iš lakiųjų ar pusiau lakiųjų junginių [2]. Iš augalinės žaliavos šios medžiagos yra išgaunamos pasirinkus tinkamą ekstrakcijos metodą, kuris nekeičia originalios eterinių aliejų sudėties proceso metu [3]. Populiariausi eterinių aliejų ekstrakcijos metodai yra tradiciniai hidrodistiliacijos ir ekstrakcijos organiniais tirpikliais metodai bei netradicinis - ekstrakcijos superkritiniais skysčiais metodas [4]. Dėl būdingo eterinių aliejų sudėties įvairialypiškumo, dažniausiai naudojamas analizės būdas yra dujų chromatografija - masių spektrometrija (DC - MS). Šis metodas leidžia detaliai išanalizuoti EA sudėtį, palyginti, kaip tarp skirtingų morfologinių organų pasiskirsto komponentai [5].
Viena iš pagrindinių fitocheminių grupių - fenoliniai junginiai (FJ), kurie yra kaupiami augaluose, kaupiančiuose ir aromatinius junginius. Šie junginiai pasižymi įvairiomis jutiminėmis ir funkcinėmis savybėmis, todėl jų vartojimas globaliu mastu yra nuolat augantis [6]. Tai natūralūs metabolitai, kurių struktūrą sudaro aromatinis žiedas, su prie jo prisijungusiu vienu ar keliais hidroksilo pakaitais [56]. Dažniausiai naudojamas ekstrakcijos metodas yra ultragarsu skatinama ekstrakcija, o bendras fenolinių junginių kiekis (BFJK) paprastai nustatomas naudojant kolorimetrinius metodus, pavyzdžiui, Folin – Ciocalteu metodą [6,7].
Šio darbo tiriamasis objektas - Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.), priklausančių Salierinių (Apiaceae) / Skėtinių (Umbelliferae) šeimai, augalinė žaliava [8]. Šie augalai masiškai kaupia eterinius aliejus, fenolinius junginius, tačiau juose aptinkama ir tokių biologiškai aktyvių medžiagų kaip baltymai, cukrai, polisacharidai, mikro-, makroelementai ir kt. [9,10]. Sosnovskio barščiai pasižymi fotodinaminėmis savybėmis, jie sukelia sunkius odos bei gleivinės nudegimus, retais atvejais – apakimą [11,12,13]. Biologiškai aktyvios medžiagos, pasižyminčios fotojautrumu, gali būti panaudojamos medicinoje, taikant sinergiškai kartu su ultravioletinių spindulių (UV) šviesos terapija, gydant vilkligę ar žvynelinę [14]. Be to, H. sosnowskyi būdingas antivirusinis ir alelopatinis poveikiai [15].
Darbo naujumas ir aktualumas - pirmą kartą buvo atliekama Lietuvoje augančių Sosnovskio barščių, skirtingų morfologinių organų, surinktų skirtingu vegetacijos periodu, eterinių aliejų komponentų analizė, kiekinis jų įvertinimas bei bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas. Užsienio šalyse tyrimai su Sosnovskio barščių augaline žaliava nėra masiškai atliekami. Daugiausiai eksperimentams yra naudojamos H. sosnowskyi sėklos, rečiau šaknys, surinktos vienu augimo tarpsniu. Lietuvoje buvo vykdomi tyrimai, susiję su bendru fenolinių junginių kiekio nustatymu, tačiau nebuvo analizuojama vegetacijos periodo įtaka. Sosnovskio barščiai yra plačiai paplitę, jie auga greitai, yra
atsparūs neigiamam aplinkos poveikiui, todėl jų derlius yra itin gausus. Šios invazinės rūšies potencialas nėra išnaudojamas, todėl šio darbo rezultatai gali būti reikšmingi ateityje tęsiant tyrimus ir modeliuojant augalinius vaistinius preparatus ar maisto papildus su Sosnovskio barščiais, skirtus naudoti kartu su UV šviesos terapija gydant odos ligas. Be to, tolimesni tyrimai gali padėti įrodyti, kad Sosnovskio barščių kaupiami eteriniai aliejai gali būti naudojami maisto, kosmetikos ir parfumerijos pramonėse. Kita vertus, H. sosnowskyi cheminės sudėties tyrimai yra naudingi siekiant sukurti invazinės rūšies plitimo valdymo planą.
Šio darbo tikslas - atlikti skirtinguose Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) morfologiniuose organuose kaupiamų eterinių aliejų kokybinės ir kiekinės sudėties bei bendro fenolinių junginių kiekio analizę augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Atlikti skirtinguose Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) morfologiniuose organuose kaupiamų eterinių aliejų kokybinės ir kiekinės sudėties bei bendro fenolinių junginių kiekio analizę augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
Darbo uždaviniai:
1. Pasirinkti tinkamiausius metodus eterinių aliejų ir fenolinių junginių išskyrimui iš tiriamosios Heracleum sosnowskyi augalinės žaliavos.
2. Nustatyti eterinių aliejų kokybinę sudėtį skirtinguose Heracleum sosnowskyi morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
3. Įvertinti bendrą Heracleum sosnowskyi eterinių aliejų komponentų kiekį skirtinguose morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
4. Įvertinti pagrindinių Heracleum sosnowskyi eterinių aliejų komponentų kiekinę sudėtį skirtinguose morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
5. Įvertinti bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą skirtinguose Heracleum sosnowskyi morfologiniuose organuose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) mokslinė klasifikacija ir
morfologiniai požymiai
Heracleum sosnowskyi klasifikacija: Domenas: Eukariotai (Eukaryota)
Karalystė: Augalai (Plantea)
Pokaralystė: Induočiai (Tracheobionta)
Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Erškėčiažiedžiai (Rosidae) Eilė: Salieriečiai (Apiales)
Šeima: Salieriniai (Apiaceae) / Skėtiniai (Umbelliferae) Gentis: Barštis (Heracleum) [8,16,17].
Sosnovskio barščiai (Heracleum sosnowskyi M.) - tai vieni iš didžiausių vienmečių arba dvimečių žolinių augalų pasaulyje [8,16]. H. sosnowskyi yra monokarpinis augalas, žydintis ir vaisius brandinantis vieną kartą per gyvenimą, išbarstęs sėklas nuvysta [18]. Susidarius nepalankioms aplinkos sąlygoms, pavyzdžiui, esant nepakankamam saulės šviesos kiekiui, trūkstant kritulių bei maistingųjų medžiagų dirvožemyje, augalo žydėjimas yra atidedamas ir augalas gali gyvuoti iki dvylikos metų [19]. Sosnovskio barščių žydėjimas tęsiasi nuo liepos vidurio iki rugsėjo pabaigos, augalas žydi apie dvi ar tris savaites [8,18]. Sėklas barsto rugsėjo – spalio mėnesiais [20].
H. sosnowskyi turi liemeninių šaknų sistemą, kuri pasižymi stora ir ilga pagrindine šaknimi bei daug atsišakojančių plonesnių šoninių šaknų [21]. Tokio tipo šaknys pasiekia gilesnius dirvožemio sluoksnius, todėl augalas gali absorbuoti ten slypinčias maistingąsias medžiagas [8].
Sosnovskio barščiai gali užaugti iki 5 metrų aukščio, priklausomai nuo augavietėje vyraujančių aplinkos sąlygų, vidutiniškai jų aukštis siekia 3 - 3,5 m [8,11,20]. Jų stiebas yra tvirtas tuščiaviduris ir briaunuotas, negausiai padengtas plaukeliais, o jo skersmuo gali būti net iki 12 cm [8,22].
Augalo lapija yra iki dviejų metrų pločio, ją sudaro apie penkiolika lapų, kurie yra palmiškai suskaldyti į tris panašaus dydžio skiltis [11,16,21]. Apatinis lapų paviršius yra padengtas retais plaukeliais, ant lapų viršaus plaukelių nebūna [22].
Žiedynas yra skėčio formos, jis sudarytas iš mažų (9 mm ilgio) baltų arba retais atvejais rausvų žiedelių, kurie prie žiedynkočio yra prisitvirtinę ilgais koteliais (stipinais), jų viename žiedyne gali būti apie 150 [8,19,21]. Žiedyno skersmuo varijuoja nuo 50 iki 80 centimetrų [22].
H. sosnowskyi brandina vaisius, sudarytus iš dviejų merikarpių, kurių ilgis yra 7 - 9 mm, o plotis 4 - 6 mm [11,20]. Vaisiai gali būti ovalo, kiaušinio, elipsės formos [20,22]. Iš pradžių jie būna žalios spalvos, vėliau bręsdami tampa rudais [19]. Kiekviename merikarpyje yra po vieną sėklą [21].
Vidutiniškai vieno H. sosnowskyi išbarstytų sėklų kiekis varijuoja nuo 10000 iki 40000, bet yra augalų, kurie išbarsto ir iki 100000 sėklų [16,19].
1.2. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) istorija ir paplitimas
Sosnovskio barščiai buvo atrasti XVIII a. pabaigoje, tačiau jie nebuvo išskirti kaip nauja rūšis [8,21]. I. P. Mandenova 1944 metais pirmą kartą juos aprašė kaip atskirą rūšį ir pavadino Kaukazo augaliją tyrinėjusio botaniko Prof. D. I. Sosnowskyi garbei [16]. XX a. penktajame dešimtmetyje Sovietų Rusijoje H. sosnowskyi buvo pradėti auginti kaip gyvulių pašaras [23,24]. Dėl specifinio kvapo, kurį įgaudavo produktai, pavyzdžiui pienas ar mėsa, gauti iš gyvulių, šertų Sosnovskio barščiais, buvo atsisakyta toliau kultivuoti šiuos augalus [25].
H. sosnowskyi - tai rūšis, kuri yra kilusi iš Kaukazo regiono [26]. Natūraliai šie augalai auga vakarinėje Gruzijos dalyje, Dagestane, šiaurės rytų Turkijoje, šiaurinėje Armėnijos dalyje [24,27]. Iš būdingų augaviečių Sosnovskio barščiai buvo atgabenti į Sovietų Rusijos Europinę dalį, iš kurios jie paplito po Europoje esančias šalis: Baltijos šalis (Lietuvą, Latviją, Estiją), Ukrainą, Baltarusiją [20,24,25,27]. Ši invazinė rūšis taip pat paplito ir po Lenkiją, Vokietiją, Vengriją [21,26,27].
Šie augalai yra geriausiai prisitaikę prie vidutinio klimato, tad daugiausiai paplitę vidutinio klimato juostoje [28]. Paprastai auga pievose, netoli kelių ar traukinių bėgių, upių pakrantėse, netoli ežerų, miškų pakraščiuose [22,28,29,30]. Dažniausiai augavietės aptinkamos drėgnose vietose, kuriose dirvožemis yra neutralaus pH [21,27].
Spartų rūšies plitimą lemia augalo morfologiniai požymiai, tai aukšti augalai, todėl dalį sėklų išbarsto vidutiniškai 4 metrų spinduliu [19]. Likusią dalį sėklų išnešioja vėjas, vanduo, transportas, žmonės ar gyvūnai [19,31].
1.3. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) augalinės žaliavos cheminė
sudėtis
Įvairiuose Sosnovskio barščių morfologiniuose organuose yra nustatoma eterinio aliejaus, fenolinių junginių, augaluose yra kaupiami vandenyje tirpūs polisacharidai, pektininės medžiagos [30,32,33]. Be to, juose yra nustatomi vitaminai C ir P, amino bei folio rūgštys, taninai, mikroelementai bei makroelementai [10].
Heracleum genties augaluose kaupiamų eterinių aliejų kokybinė ir kiekinė sudėtis priklauso nuo augalo vegetacinio periodo, aplinkos sąlygų bei morfologinio organo [11,34]. Daugiausiai tyrimų, susijusių su Heracleum sosnowskyi eterinių aliejų sudėtimi, yra atlikta su šių augalų sėklomis bei šaknimis. A. Synowiec ir D. Kalemba (2015) ištyrę Sosnovskio barščių eterinį aliejų, išskirtą iš sėklų, nustatė, kad dominuojantys komponentai: oktilo acetatas (39,5 proc.), heksil 2 - metilbutanoatas (14,4 proc.), heksil 2 - metilpropanoatas (6 proc.), heksilbutanoatas (5,4 proc.) ir oktanolis (8,6 proc.) [9]. D. Bobit, C. Garlea ir kt. (2016) tyrė H. sosnowskyi šaknų eterinį aliejų. Atlikę eterinio aliejaus cheminę analizę, nustatė, kad pagrindiniai junginiai yra p - cimenas (40,73 proc.), anetolis (23,64 proc.), γ - terpinenas (8,50 proc.), p - anisaldehidas (3,99 proc.) ir terpinolenas (3,63 proc.) [29]. Sosnovskio barščių eteriniame aliejuje yra kaupiami fototoksiški junginiai - furanokumarinai. Aptinkami tokie junginiai kaip psoralenas, bergaptenas, pimpinelinas, angelicinas, metoksalenas, imperatorinas ir kiti [11,35].
L. Baležentienės ir E. Bartkevičiaus (2013) tyrimas atskleidžia, kad fenolinių junginių galima nustatyti visuose Sosnovskio barščių morfologiniuose organuose. Bendras fenolinių junginių kiekis (BFJK) varijuoja priklausomai nuo augalų amžiaus, aplinkos sąlygų, kuriose augo, morfologinių organų, augimo stadijos. Mažiausias BFJK nustatytas augalų šaknyse (9,22 mg/ml) po sėklų subrandinimo, didžiausias - augalo žydėjimo periodu antžeminiuose organuose: lapuose BFJK - 92,61 mg/ml, žieduose - 81,03 mg/ml, stiebuose - 20,94 mg/ml [30].
Remiantis E. G. Shakhmatov, P. V. Toukach ir kt. (2014), nustatyta, kad Sosnovskio barščių lapuose esančių vandenyje tirpių polisacharidų frakcijos sudėtyje yra galaktoarabinoksiloglukano, kurį sudaro galaktozė, gliukozė, arabinozė ir ksilozė [33].
Pagrindinė H. sosnowskyi pektinų sudedamoji dalis, pasak O. A. Patova, V. V. Golovchenko ir kt. (2016), yra galakturono rūgštis, be to, šiuose augaluose yra kaupiama daug žemo metoksilo pektinų [23].
1.4. Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) poveikis žmogaus sveikatai
Švieži ir sudžiūvę Sosnovskio barščiai yra pavojingi žmogaus sveikatai, tačiau priklausomai nuo aplinkos sąlygų, metų laiko bei vegetacijos periodo, pavojingumo laipsnis gali kisti [27,36]. Žmogaus sveikatai pavojingos organizmo reakcijos, susijusios su H. sosnowskyi, intensyvėja šviečiant saulei, esant aukštesnei oro temperatūrai, kai oro drėgmė yra didesnė [22,37]. Be to, grėsmė priklauso ir nuo individualių žmogaus savybių bei kontakto su augalu trukmės, rizika didėja, jei individas prakaituoja [37]. Susiformavus palankioms sąlygoms, tiesioginis kontaktas su augalu nėra būtinas, pakanka stovėti nedideliu atstumu nuo jo, kad kiltų pavojus sveikatai [13]. Sosnovskio barščių skaidriose vandeningose sultyse yra kaupiami fotosensibilizuojantys furanokumarinai [13,22]. Šiuos organinius junginius aktyvuoja ultravioletinė A spinduliuotė, kurios bangos ilgio ribos yra nuo 315 nanometrų iki 400 nanometrų. Aktyvuoti furokumarinai sukelia fitofotodermatitą, jie jungiasi prie branduolinės DNR bei RNR, taip inicijuodami ląstelių oksidacinį stresą, kuris sukelia membranų pažeidimus [37]. Toks toksinio poveikio mechanizmas lemia jautrumą saulės šviesai ir sukelia 1-3 laipsnio odos nudegimus [14,36]. Odos paviršiuje gali atsirasti žaizdų, vandeningų, seroziniu skysčiu užpildytų pūslių, o nudegintos vietos parausta, jas pradeda niežėti [22,27]. Nudegimai sunkiai gyja, palieka randus, todėl jie ypač pavojingi vaikams [13]. Laiku nepradėjus gydymo, prasideda odos nekrozė, kurią galima gydyti gliukokortikoidais arba chirurgine procedūra [16,37]. Sosnovskio barščių sultims patekus į akis galimas apakimas [12]. Taip pat, įkvėpus H. sosnowskyi žiedadulkių, nudeginama kvėpavimo takų sistema, patinsta gerklos. Šie augalai sukelia stiprias alergines reakcijas ar net anafilaksinį šoką [13]. Alerginės reakcijos gali pasireikšti per 15 min. po kontakto su augalu, odos uždegimas tęsiasi nuo dviejų parų iki kelių mėnesių [37].
Furanokumarinai, pasižymintys fotojautrumu, gali būti išgaunami iš Heracleum sosnowskyi ir dėl šios savybės gali būti panaudojami gydant vilkligę, žvynelinę ir kitas panašaus tipo ligas, nes sustiprina gydymo UV šviesa efektyvumą [14].
1.5. Eteriniai aliejai
Eteriniai aliejai (EA) arba kitaip dar vadinami lakiaisiais aliejais ar aromatinėmis augalų esencijomis yra natūralūs lakiųjų junginių mišiniai, kaupiami augaluose [38,39,40]. Terminas “eteriniai aliejai” pirmą kartą pavartotas XVI amžiuje, tačiau pirmosios užuominos apie šių medžiagų panaudojimą medicinoje pasirodė dar senovės Egipto rašytiniuose šaltiniuose [39]. EA paprastai kambario temperatūroje yra skysti, tačiau dalis jų yra kieti ar panašios į dervą konsistencijos [39,41].
Didžioji jų dalis yra bespalviai arba blankiai geltonos spalvos. Yra išimčių, kai EA yra raudonos, mėlynos ar žalios spalvos [2]. Eteriniai aliejai pasižymi stipriu specifiniu kvapu, jie yra netirpūs vandenyje, tačiau gerai tirpsta riebaluose, alkoholyje, organiniuose tirpikliuose ir kitose hidrofobinėmis savybėmis pasižyminčiose medžiagose [42]. Jie pasižymi dideliu optiniu aktyvumu, lūžio rodiklis yra aukštas, tai nulemia asimetrinė junginių struktūra [2,41].
Augalų šeimos, kurioms priklausantys augalai kaupia eterinį aliejų, yra: Asteraceae (Compositae), Lamiaceae (Labiatae), Pinaceae, Cupressaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Piperaceae, Santalaceae, Zingiberaceae, Apiaceae, Geraniaceae, Illiciaceae, Myristicaceae, Oleaceae, Rosaceae, Acoraceae, Poaceae, Alliaceae, Hypericaceae, Fabaceae, Liliaceae, Zygophyllaceae [2,38,40,42]. Eterinių aliejų pėdsakų galima aptikti įvairiuose jį kaupiančių augalų organuose, pavyzdžiui, stiebuose, šakose, medienoje, žiedpumpuriuose, lapuose, žieduose, vaisiuose, sėklose, šaknyse, šakniastiebiuose, medžių žievėje [2,39,43]. EA yra kaupiamas augalų paviršiuje esančiose išorinėse sekrecijos struktūrose arba vidiniuose audiniuose esančiose vidinėse sekrecijos struktūrose. Išorinėms sekrecijos struktūroms yra priskiriamos trichomos, epidermio ląstelės, sekreciniai plaukeliai, o vidinėms - idioblastai, sekrecinės ertmės bei latakai [38,41].
Eterinių aliejų klasifikacija yra paini, yra išskiriamos dvi pagrindinės EA cheminės klasės: terpenai ir fenilpropanoidai, ir viena papildoma - sieros ir azoto junginių klasė [2,42].
Terpenai - tai izopreno polimerai, kur izopreno molekulės jungiasi galvos - uodegos principu [2,42]. Terpenai yra skirstomi į dvi grupes: terpeninius angliavandenilius ir terpenoidus [2]. Terpeniniai angliavandeniliai pagal izopreno molekulių skaičių struktūroje yra skirstomi į: hemiterpenus (1 molekulė), monoterpenus (2 molekulės), seskviterpenus (3 molekulės), diterpenus (4 molekulės) [42]. Dažniausiai eteriniuose aliejuose nustatoma monoterpenų ir seskviterpenų [38]. Terpenoidai yra oksigenuoti terpeniniai angliavandeniliai, kuriems priskiriami alkoholiai, aldehidai, ketonai, fenoliai, rūgštys, esteriai ir laktonai [2].
Fenilpropanoidų cheminė klasė yra rečiau ir ne taip gausiai aptinkama eteriniuose aliejuose [42]. Dauguma fenilpropanoidų, aptinkamų lakiuosiuose aliejuose, yra fenoliai arba fenolių eteriai [38].
Sieros ir azoto junginių eteriniame aliejuje pasitaiko retai, tačiau šie junginiai suteikia EA stiprų, savotišką kvapą [42].
Eterinių aliejų kokybinė - kiekinė sudėtis priklauso nuo vidinių ir išorinių faktorių, veikiančių EA kaupiančius augalus. Vidiniams faktoriams yra priskiriama augalo genetika, vegetacijos periodas, morfologinis organas [38]. Prie išorinių faktorių priskiriami ekologiniai ir aplinkos veiksniai, pavyzdžiui, temperatūra, apšvietimas, dienos trukmė, vandens kiekis, dirvožemio savybės, geografinė lokalizacija, radiacijos lygis, sezoniškumas, klimatas ir kt. [2,38,42].
Eteriniai aliejai juos kaupiantiems augalams suteikia specifinį kvapą, kuris padeda pritraukti augalus apdulkinančius vabzdžius ir atbaido kenkėjus [41]. Dauguma EA pasižymi antibakteriniu poveikiu, nes dėl lipofilinės prigimties jie lengvai patenka į bakterijų ląstelių membranas ir sukelia jų pakitimus, tačiau antibakterinis aktyvumas labiau pasireiškia prieš Gram teigiamas bakterijas [41,42]. Be to, EA pasižymi antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu [41]. Priešvėžinis eterinių aliejų poveikis susijęs su laisvųjų radikalų pašalinimu ir sukeliamais ląstelių membranų pokyčiais. EA pasižymi priešgrybeliniu poveikiu, jis stabdo tokių grybelių kaip Aspergillus, Candida augimą [42]. Taigi, eteriniai aliejai yra naudojami įvairiose pramonės srityse, pavyzdžiui, kosmetikos, maisto, higienos prekių pramonėse, bei medicinoje [2,43].
1.6. Eterinio aliejaus ekstrakcija ir kokybinė – kiekinė analizė augalinėje žaliavoje
Eteriniai aliejai iš augalinės žaliavos gali būti išgaunami įvairiais metodais. EA ekstrakcijos metodai yra skirstomi į dvi grupes: įprastus (tradicinius) ir pažangius (netradicinius) metodus. Ekstrakcijos procesas negali turėti įtakos eterinių aliejų cheminei sudėčiai, EA kokybinė ir kiekinė sudėtis privalo nepakisti [4].
Klasikiniai metodai yra vis dar plačiai naudojami. Šiai ekstrakcijos metodų grupei yra priskiriami įvairūs distiliacijos metodai, ekstrakcija naudojant organinius tirpiklius, šaltas spaudimas, ekstrakcija riebalais (ang. enfleurage), maceracija [44].
Dažniausiai naudojami tradiciniai eterinių aliejų ekstrakcijos metodai: 1. Hidrodistiliacija
Hidrodistiliacija yra vienas iš seniausių metodų, naudojamų eterinių aliejų išgavimui iš augalinės žaliavos [4]. Tai saugus, paprastas bei ekologiškas būdas atskirti vandenyje netirpius bioaktyvius junginius, kurių virimo temperatūra yra aukšta [3,45,46].
Atliekant hidrodistiliaciją augalinė žaliava yra dedama į apvaliadugnę kolbą ir užpilama vandeniu, mišinys yra kaitinamas kaitinimo elemento, o šilumos reguliatorius reguliuoja temperatūrą. Veikiami temperatūros, lakiojo aliejaus junginiai ir vanduo tampa dujomis. Dujinėje fazėje susidaro azeotropinis mišinys. Vandens ir eterinio aliejaus mišinys yra toliau distiliuojamas, tarsi jis būtų viena medžiaga, vėliau išgarinamas esant tam pačiam slėgiui, kondensuojamas ir surenkamas. Dėl hidrofobiškų EA savybių jis nesimaišo su vandeniu, todėl distiliate susidaro dvi fazės, kurias galima atskirti paprastu dekantavimo būdu [4,47].
Hidrodistiliacijos metodas turi privalumų ir trūkumų. Šio metodo pranašumai prieš kitus metodus yra tai, kad ekstrakcija nereikalauja didelių piniginių kaštų, yra selektyvi eteriniams aliejams,
apsaugo lakiuosius junginius nuo oksidacijos [4,45]. Be to, ši technologija leidžia medžiagų distiliaciją atlikti žemesnėje nei 100 ° C temperatūroje ir apsaugo EA termolabilius junginius nuo skilimo [3]. Hidrodistiliacijai nenaudojami brangūs tirpikliai, naudojamas vanduo [46]. Kita vertus, hidrodistiliacija trunka ilgai (3-6 val.), suvartojama daug energijos, prarandama dalis polinių molekulių, o išgaunamas eterinio aliejaus kiekis nėra didelis [4,44,45].
Hidrodistiliacijos metodas gali būti skirstomas į tris pogrupius: distiliavimą garais, distiliavimą vandeniu ir distiliavimą vandens ir garų deriniu [48].
2. Ekstrakcija organiniais tirpikliais
Ekstrakcija naudojant organinius tirpiklius siekiant išskirti eterinius aliejus yra dar vadinama skysčių - skysčių ekstrakcija. Tai būdas atskirti mišinius, remiantis jų dalių tirpumu. Ekstrakcija atliekama naudojant du tarpusavyje nesimaišančius skysčius, pavyzdžiui, vandenį ir acetoną ar heksaną, metanolį, etanolį, ar kitus organinius tirpiklius [3,44]. Ekstrakcija organiniais tirpikliais dažniausiai atliekama Soksleto ekstrakcijos ar šaltosios perkoliacijos būdais [47].
Atliekant Soksleto ekstrakciją augalinė žaliava yra susmulkinama ir dedama į ekstraktoriuje esantį celiuliozinį įdėklą (1 paveikslas).
1 pav. Soksleto aparatas: 1 – celiuliozinis įdėklas, 2 – distiliavimo kolba, 3 – šildymo elementas, 4 – ekstraktoriaus vamzdelis, 5 – šaldytuvas, 6 – sifonas [49]
Į distiliavimo kolbą yra įpilama organinio tirpiklio, kuris yra kaitinamas šildymo elemento. Įkaitęs tirpiklis ima garuoti ir per ekstraktoriaus vamzdelį pasiekia šaldytuvą, kuriame tirpiklio garai yra kondensuojami. Tirpiklio kondensatas pradeda lašėti ant žaliavos. Kai sifonas yra užpildomas skysčio,
5
6
1
2
3
4
šis yra išsiurbiamas atgal į kolbą. Procesas yra kartojamas tol, kol visas eterinis aliejus yra išekstrahuojamas iš augalinės žaliavos [6,49]. Gautas ekstraktas yra koncentruojamas išgarinant tirpiklio perteklių [3]. Soksleto ekstrakcijos privalumai yra tie, kad metodas yra paprastas, įranga nebrangi, po ekstrahavimo gautų produktų nereikia filtruoti [44,49,50]. Šis metodas turi ir trūkumų: ilgai trunkantis procesas, didelis tirpiklio kiekio iššvaistymas koncentruojant galutinį produktą, ilgas kaitinimo procesas, lemiantis termolabilių junginių skilimą [44,50].
Šaltosios perkoliacijos esmė yra masių pernaša tarp tirpiklio ir žaliavos, tačiau šio metodo efektyvumas nėra didelis [47].
Dažniausiai naudojamas netradicinis eterinių aliejų ekstrakcijos metodas yra: Superkritinių skysčių ekstrakcija.
Tai ekstrakto išskyrimas iš kietos matricos naudojant superkritinius skysčius [51]. Superkritiniai skysčiai yra išgaunami esant tam tikram kritiniam slėgiui ir temperatūrai. Jie pasižymi: maža klampa, dideliu difuziškumu, tankiu, atitinkančiu skysčių tankį [4]. Plačiausiai naudojamas superkritinis skystis yra anglies dioksidas (CO2), kai kuriais atvejais, jis yra modifikuojamas metanoliu ar etanoliu [44]. CO2 dažnai naudojamas, nes yra mažai toksiškas, nedegus, bekvapis, beskonis, inertiškas ir nebrangus, be to, naudojant anglies dioksidą dėl žemo kritinio slėgio ir žemos temperatūros lengva pasiekti kritinį tašką. Eterinių aliejų ekstrakcijai CO2 tinka, nes superkritinio skysčio poliškumas yra artimas lipofiliškiems junginiams bei neagresyvus termolabiliems junginiams [4,51].
Superkritinių skysčių ekstrakcijos proceso metu CO2 patenka į talpą su augaline žaliava. Suslėgtas iki superkritinio skysčio anglies dioksidas veikia kaip tirpiklis, taip iš žaliavos yra išekstrahuojamas eterinis aliejus [48].
Ekstrahuojant superkritiniais skysčiais išgaunamas didesnis kiekis eterinių aliejų, tai našesnis metodas, EA kokybė yra geresnė, jame nelieka tirpiklio pėdsakų, šie ekstraktai pasižymi stipresniu biologiniu aktyvumu, tačiau tai brangios ir sudėtingos aparatūros reikalaujantis metodas [3,4,44].
Eterinių aliejų cheminė analizė gali būti atliekama įvairiais instrumentinės analizės metodais. Dažniausiai naudojami chromatografiniai metodai: dujų chromatografija, kuri skirta analizuoti lakiuosius EA junginius, ir skysčių chromatografija, skirta nelakiųjų EA komponentų analizei [40]. Dujų chromatografija atliekama kartu su liepsnos jonizacijos, branduolinio magnetinio rezonanso ar masių spektrometrijos detektoriais. EA sudėtis analizuojama efektyviosios skysčių chromatografijos ar efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrofotometrijos metodais [2,52].
Dažniausiai naudojamas eterinių aliejų kokybinės ir kiekinės sudėties analizės metodas yra dujų chromatografija ir masių spektrometrija [5]. Analizės procesas gali būti išskaidytas į dvi dalis: dujų chromatografija atsakinga už cheminių medžiagų išskaidymą į atskirus komponentus, o masių spektrometrija - cheminių medžiagų išskaidymą į unikalius spektrus [53]. Dujų chromatografijos metu
išsiskyrus atskiriems junginiams, šie paverčiami jonais elektronų smūgio jonizacijos arba cheminės jonizacijos būdu. Jonai, turintys skirtingą masės ir krūvio santykį, patenka į masių spektrometrijos detektorių [54]. Iš detektoriaus informacija įrašoma į kompiuterį ir gaunama chromatograma, kurioje užfiksuotas analizės metu aptikto fragmento signalo intensyvumas [53].
1.7. Fenoliniai junginiai
Fenoliai - tai organiniai junginiai, kurie kaupiami augaluose kaip antriniai metabolitai [55]. Natūraliai fenoliai egzistuoja kaip konjugatai su monosacharidais ir polisacharidais [56]. Fenolinius junginius augalai sintetina iš dalies kaip atsaką į ekologinį ar fiziologinį stresą, pavyzdžiui, patogenus, vabzdžius, mechaninius pažeidimus, UV spinduliuotę ir kt. [57].
Fenoliniai junginiai (FJ) yra skirstomi į dvi pagrindines klases: paprastuosius fenolius ir polifenolius. Paprastieji fenoliai skirstomi į: kumarinus (skirstomi į: paprastuosius kumarinus, furanokumarinus, piranokumarinus, pakaitinius kumarinus), ir fenolines rūgštis (FR), šios skirstomos į: hidroksicinamo rūgštis, hidroksibenzoino rūgštis ir acetofenonus bei fenilacto rūgštis. Polifenoliai skistomi į: flavonoidus ir neflavonoidus. Flavonoidams priklauso: flavonai, flavanoliai, flavanonai, flavanonai, flavan - 3 - oliai, antocianidinai. Neflavonoidai skirstomi į taninus, lignanus, stilbenus [58,59].
Kumarinai yra 5,6-benzo-2-pirono (α-chromono) dariniai, susidarantys iš hidroksicinamo rūgšties ciklizuojant ir uždarant žiedą o-hidroksi ir karboksilo grupių [60,61]. Paprastai kumarinai kaupiasi Apiaceae, Rutaceae, Moraceae, Leguminosae, Asteraceae, Fabaceae, Thymelaeaceae, Oleaceae šeimų augaluose [58]. Daugiausiai kumarinų sintetinama lapuose, tačiau ne mažiau jų nustatoma ir vaisiuose, šaknyse bei stiebuose [61].
Fenolinių rūgščių cheminė struktūra yra sudaryta iš fenolio žiedo ir funkcinės karboksirūgšties grupės. Jos gamtoje aptinkamos glikozidų, amidų ar esterių pavidalu, rečiau būna laisvos formos [57].
Flavonoidai yra dažniausiai nustatoma FJ grupė, randama daugelyje augalų, įvairiuose jų organuose [56,61]. Jiems būdingas C15 skeletas (C6-C3-C6), struktūrą sudaro du aromatiniai žiedai, sujungti trečiuoju benzopirano (chromano) žiedu [56]. Visi flavonoidai yra kildinami iš aminorūgščių fenilalanino ir tirozino. Šie junginiai yra geltonos, raudonos, oranžinės, mėlynos, violetinės ir kt. spalvų [57].
Taninai - tai santykinai didelės molekulinės masės FJ grupė, gebanti sudaryti stiprius oksidacinius ryšius su angliavandeniais ir baltymais [57,61]. Leguminosae, Rosaceae, Polygonaceae, Rhyzophoraceae, Myrtaceae augalų šeimos augalai yra naudojami kaip taninų šaltinis [58].
Lignanai yra fitocheminės medžiagos, kurios susidaro dimerizavus du fenilpropanoidų vienetus, šios grupės struktūros pagrindas yra C6 - C3 - C3 - C6 [7].
Stilbenų struktūros pagrindas yra C6 - C2 - C6 [60].
Fenoliniai junginiai augaluose atlieka įvairias funkcijas, pavyzdžiui, suteikia augalams spalvą bei kvapą, skonį, kurie padeda pritraukti apdulkinančius vabzdžius ar gyvūnus, padedančius paskleisti sėklas [56]. Be to, spalva gali būti įspėjamasis augalo signalas, kad atbaidytų kenkėjus arba spalvą suteikiantys fenoliai apsaugo augalą nuo žalingo UV spinduliuotės poveikio ir leidžia efektyviau įsisavinti maistines medžiagas [61].
Fenoliniai junginiai pasižymi priešuždegiminiu, antimikrobiniu, priešvėžiniu, antialerginiu, antioksidaciniu poveikiu [60]. Šie junginiai gerina širdies veiklą ir kraujagyslių būklę, nes mažina spaudimą, skystina kraują bei plečia kraujagysles. FJ palaiko virškinimo funkciją, mažina II tipo diabeto bei vėžinių susirgimų riziką [58].
1.8. Fenolinių junginių ekstrakcija ir kiekinė analizė augalinėje žaliavoje
Fenolinių junginių ekstrakcija gali būti atliekama tradiciniais ir netradiciniais ekstrakcijos metodais. Klasikiniai ekstrakcijos metodai, dažniausiai naudojami FJ ekstrakcijai yra: Soksleto ekstrakcija, maceracija, hidrodistiliacija. Pažangūs ekstrakcijos metodai - ultragarsu skatinama ekstrakcija [6].
Maceracija yra paprastas ir nereikalaujantis didelių piniginių kaštų metodas [44]. Augalinė žaliava yra išdžiovinama ir visa ar susmulkinta dedama į indą su tirpikliu, indas uždaromas, kad tirpiklis neišgaruotų. Maceracija vykdoma kambario temperatūroje bent tris dienas [6]. Žaliavos ir tirpiklio mišinys turi būti nuolat maišomas, taip didinama difuzija, spartinamas procesas [44]. Baigus ekstrahavimą, ekstraktas yra filtruojamas.
Ultragarsu skatinamos ekstrakcijos metu ultragarso bangos praeidamos pro tirpiklį, kuriame yra augalinė žaliava, skatina augalų ląstelių viduje esančių fenolinių junginių išsiskyrimą į tirpiklį. Šis metodas yra efektyvus, greitas, saugus naudoti išgaunant termolabilius junginius, nes nenaudojama aukšta temperatūra [6].
Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė dažniausiai yra atliekama taikant dujų chromatografiją kartu su masių spektroskopija ir efektyviąją skysčių chromatografiją kartu su masių spektroskopija, ultravioletinių spindulių spektroskopija, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija [57]. Bendras fenolinių junginių kiekis yra įvertinamas naudojant kolorimetrinius metodus.
Dažnai yra taikomas Folin – Ciocalteu metodas, nes yra greitai ir lengvai atliekamas [7]. Šis metodas yra pagrįstas chemine redukcija [57]. Fosfomolibdato ir fosfovolframo rūgščių kompleksas reaguoja su fenoliais. Įvykus reakcijai susidaro melsvos spalvos tirpalai, kurių absorbcija yra matuojama naudojant UV spektrofotometrą, esant 750 nm bangos ilgiui. Pagal galo rūgšties ekvivalentą yra apskaičiuojamas bendras fenolinių junginių kiekis [62].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas - augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu surinkta ir išdžiovinta Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) augalinė žaliava. Augalinė žaliava - skirtingi augalo morfologiniai organai: šaknys, stiebai, lapai, žiedai. Išsami informacija apie tyrimo objektą yra pateikiama 1 lentelėje.
1 lentelė. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos informacija Mėginio žymėjimas Augalinė žaliava Augalinės žaliavos rinkimo data Augalo vegetacijos tarpsnis Vieta, kurioje rinkta augalinė žaliava
ŠAP Šaknys 2018-06-06 Augimo pradžia
Kauno miestas, Bačkonių g. (N 54°55'27.4872",
E 23°50'57.7644")
ŠMŽ Šaknys 2018-09-08 Masinis žydėjimas
SAP Stiebai 2018-06-06 Augimo pradžia
SMŽ Stiebai 2018-09-08 Masinis žydėjimas
LAP Lapai 2018-06-06 Augimo pradžia
LMŽ Lapai 2018-09-08 Masinis žydėjimas
ŽMŽ Žiedai 2018-09-08 Masinis žydėjimas
Surinkta H. sosnowskyi augalinė žaliava buvo džiovinama patalpoje, į kurią nepateko tiesioginiai saulės spinduliai, drėgmė, ir buvo užtikrinamas geras vėdinimas. Išdžiovinta žaliava buvo sufasuota į popierinius ženklintus maišelius ir laikoma sausoje patalpoje, kambario temperatūroje (23 ± 2 °C).
2.2. Naudoti reagentai
2.2.1. Reagentai, naudoti eterinių aliejų tyrimo metu
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Millipore, Darmstadt, Vokietija); Heksanas („Sigma – Aldrich”, Steinheim, Vokietija);
Helio dujos („AGA GAS”, Lietuva).
2.2.2. Reagentai, naudoti fenolinių junginių tyrimo metu
Metanolis 99,8 proc. (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Natrio karbonatas ≥ 99,5 proc. (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Millipore, Darmstadt, Vokietija); Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98 proc., “ACROS ORGANICS”). Galo rūgštis 70 proc. (Sigma-Aldrich, Vokietija)
2.3. Naudota įranga
2.3.1. Įranga, naudota eterinių aliejų tyrimo metu
Vandens gryninimo sistema MILLIPORE (Darmstadt, Vokietija); Automatinės pipetės „Eppendorf” (Hamburgas, Vokietija); Termostatinė vonelė „Heidolph” (Vokietija);
Dujų chromatografas su masių spektrometru „SHIMADZU GCMS-QP2010 Ultra” (Japonija);
Elektroninės svarstyklės ,,Sartorius AG“ (Götingen, Vokietija); Laboratorinis malūnėlis “A11 basic” (IKA, Vokietija).
2.3.2. Įranga, naudota fenolinių junginių tyrimo metu
Elektroninės svarstyklės ,,Sartorius AG“ (Götingen, Vokietija); Laboratorinis malūnėlis “A11 basic” (IKA, Vokietija).
Ultragarso vonelė “WiseClean”;
Spektrofotometras “Dynamica, HALO DB-20”; Kiuvetės (1 cm skersmens).
2.4. Eterinių aliejų ekstrakcija
Eterinių aliejų ekstrakcija vykdoma taikant tradicinį hidrodistiliacijos metodą, kurio technologija yra nesudėtinga, nereikalaujanti naudoti brangių reagentų, yra efektyvi. Tyrime naudota aparatūra pavaizduota 1 paveiksle. Augalinė žaliava (šaknys, stiebai, lapai, žiedai), apie 3 minutes smulkinama laboratoriniu malūnėliu iki miltelių. 30 gramų tiriamos žaliavos atsveriama elektroninėmis svarstyklėmis. Mėginys suberiamas į apvaliadugnę kolbą ir užpilamas 1000 ml išgryninto vandens. Išmaišius kolba prijungiama prie hidrodistiliacijai skirto Clevenger tipo aparato (2 pav.). Kolba kaitinama glicerolio vonioje, kurioje pastovi temperatūra yra 120 °C.
2 pav. Hidrodistiliacijos aparatūra: 1 - apvaliadugnė kolba, 2 - glicerolio vonia, 3 - Clevenger tipo aparatas
1
3
Hidrodistiliacija trunka 2,5 ± 0,5 val., kol išsiskiria eterinis aliejus. Į surinktą produktą įpilama 1 ml heksano. Susidarius heksano sluoksniui, šis atskiriamas ir tiriamas DC – MS metodu. Mėginys iki analizės yra laikomas vėsioje ir tamsioje vietoje stikliniame, sandariai uždarytame, buteliuke.
2.5. Eterinio aliejaus kokybinė – kiekinė analizė
Eterinių aliejų cheminė analizė atliekama naudojant dujų chromatografą GCMS-QP2010 (Shimadzu, Japonija) su masių spektrometru (kolonėlė – RXI – 5 MS, 30 m × 0,25 mm × 0,25 μm; Restek, JAV). Dujos nešėjos - helio dujos. Dujų chromatografijos sąlygos: kolonėlės pradinė temperatūra - 50 °C, injektoriaus - 260 °C, jonų srauto - 200 °C, sąsajos - 280 °C. Injekcija atlikta split 10.0 metodu. Pradinė 50 °C kolonėlės temperatūra buvo palaikoma 5 min., tada palaipsniui 2 °C/min greičiu pakelta iki 200 °C temperatūros. Nuo 200 °C pastoviu 15 °C/min greičiu temperatūra buvo pakelta iki 315 °C temperatūros ir palaikoma 1 min. Vieno mėginio bendras analizės laikas - 98 min. Mėginių chromatogramos analizuojamos Lab Solution GMSS solution Shimadzu programa. Sosnovskio barščių eterinio aliejaus komponentai identifikuojami analizuojant masių spektrus NIST Mass spectral programa. Masių spektrometrijos detektoriaus sąlygos: jonų srauto temperatūra yra 200 °C, interferencinė - 280 °C, tirpiklio išėjimas trunka 2 min., o bendras analizės laikas - 98 min., skenavimo greitis 2500, pradžia m/z – 29,00, pabaiga m/z 500,00.
2.6. Fenolinių junginių ekstrakcija
Fenoliniai junginiai ekstrahuojami naudojant ultragarsu skatinamos ekstrakcijos metodą. Augalinė žaliava (šaknys, stiebai, lapai, žiedai), apie 3 minutes smulkinama laboratoriniu malūnėliu iki miltelių. Elektroninėmis svarstyklėmis atsvėrus 0,05 g susmulkintos žaliavos, ji užpilta 10 ml, 70% (v/v) metanoliu. Ekstrakcija atliekama ultragarso vonelėje “WiseClean” 50 min. Ekstraktai filtruojami naudojant 0,22 mikrometrų porų dydžio švirkštų filtrus (Frisenette) (25 mm skersmens). Nufiltruoti ekstraktai (3 paveikslas) supilami į sandariai uždaromus stiklo buteliukus ir juose laikomi iki tolimesnių tyrimų.
3 pav. Heracleum sosnowskyi M. ekstraktai: 1 – ŠAP, 2 – ŠMŽ, 3 – SAP, 4 – SMŽ, 5 – LAP, 6 – LMŽ, 7- ŽMŽ
2.7. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas kolorimetriniu Folin – Ciocalteau metodu. Iš 17,5 g natrio karbonato, kuris yra tirpinamas 250 ml distiliuoto vandens, paruošiamas darbinis 7% natrio karbonato tirpalas. Tirpalas maišomas apie 10 min., kol tampa skaidrus. Tiriamasis mėginys ruošiamas 25 ml matavimo kolbutėje iš 1 ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, 1 ml Folin-Ciocalteu reagento ir 9 ml išgryninto vandens. Mišinys paliekamas 5 min., tada įpilama 10 ml 7% natrio karbonato tirpalo ir praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymos. Mėginys gerai sumaišomas ir paliekamas 1,5 val. kambario temperatūroje tamsioje vietoje.
Lyginamasis tirpalas yra ruošiamas tokiu pačiu principu kaip tiriamasis mėginys, tačiau vietoje 1 ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto yra naudojamas 1 ml išgryninto vandens.
Po 90 min. lyginamojo ir tiriamųjų tirpalų (4 pav.) absorbcija matuojama 750 nm šviesos bangos ilgyje spektrofotometru. Matavimai kartojami tris kartus.
4 pav. Tiriamieji Heracleum sosnowskyi M. tirpalai: 1 – ŠAP, 2 – ŠMŽ, 3 – SAP, 4 – SMŽ, 5 – LAP, 6 – LMŽ, 7- ŽMŽ, 8 – lyginamasis tirpalas
2
Gauti duomenys vertinami remiantis galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtimi:
y = 0,9068x + 0,0617; 𝑅2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.
2.8. Statistinė duomenų analizė
Eksperimentinės analizės duomenys apdoroti naudojant SPSS 22.0 (IBM, JAV) ir Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, JAV) statistinius duomenų analizės paketus. Eksperimentai, skirti įvertinti eterinių aliejų kokybinę ir kiekybinę sudėtį, atliekami tris kartus, gauti duomenys išreikšti vidurkiais, apskaičiuoti santykiniai standartiniai nuokrypiai. Tarp skirstinių statistiškai reikšmingi skirtumai įvertinti naudojant porinį T - kriterijų (angl. Paired -Samples T Test) bei keleto nepriklausomų imčių vidurkių palyginimo dispersinės analizės (angl. One-Way ANOVA) testą. Reikšmingumo lygmuo parinktas, kai α = 0,05. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal formulę. Gauti duomenys suvesti į duomenų bazę, kurioje apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį, santykinį standartinį bei standartinį nuokrypį, jie buvo statistiškai įvertinti. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas, kai p < 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos eterinių aliejų kokybinė - kiekinė
analizė
Atlikus dujų chromatografijos - masių spektrometrijos analizę, ištirtas Sosnovskio barščių (Heracleum sosnowskyi M.) eterinis aliejus. Tyrimo metu išanalizuoti 7 mėginiai, kurie pagaminti iš vienoje augavietėje augimo pradžioje ir masinio žydėjimo laikotarpiu rinktų Sosnovskio barščių šaknų, stiebų, lapų, žiedų.
Atlikus cheminę analizę, įvertinti pagrindiniai eterinių aliejų junginiai skirtinguose Heracleum sosnowskyi organuose dviejų skirtingų vegetacijos periodų metu. Eterinių aliejų kiekis mėginiuose įvertintas pagal bendrą smailių plotą. Remiantis EA komponentų smailių procentine sudėtimi, nustatyti pagrindinių junginių kiekiai bandiniuose.
Eterinių aliejų kokybinės ir kiekinės analizės metu gautos chromatogramos pavyzdys pateikiamas 5 pav., kuriame pavaizduota Sosnovskio barščių šaknyse, surinktų masinio žydėjimo laikotarpiu (mėginys ŠMŽ), identifikuotų eterinių aliejų komponentų sudėties chromatograma.
5 pav. Eterinių aliejų sudėties H. sosnowskyi M. šaknų žaliavoje chromatograma (mėginys ŠMŽ)
ŠMŽ mėginyje EA junginys - para - cimenas (5), kuris sudaro 80,40 proc. visos eterio aliejaus sudėties.
3.1.1. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos eterinių aliejų komponentų kokybinė analizė
Dujų chromatografijos - masių spektrometrijos analizės metu nustatyti eterinių aliejų komponentų kiekiai skirtinguose H. Sosnowskyi M. organuose skirtingais vegetacijos laikotarpiais (6 pav.).
6 pav. Nustatytų eterinių aliejų junginių kiekis Heracleum sosnowskyi M. šaknyse, stiebuose, lapuose ir žieduose augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu
Visuose mėginiuose kartu buvo nustatyti 142 eterinio aliejaus junginiai. Palyginus Heracleum sosnowskyi mėginių eterinio aliejaus nustatytų komponentų kiekį, daugiausia jų aptikta lapų mėginiuose: 34 komponentai augimo pradžioje ir 41 – masinio žydėjimo metu. Kiek mažiau junginių (33) nustatyta šaknyse masinio žydėjimo metu. Sosnovskio barščių stiebuose EA junginių skaičius varijavo nuo 32 (augimo pradžioje) iki 30 (masinio žydėjimo metu), o žieduose nustatyta 30 junginių. Mažiausiai EA komponentų nustatyta šaknyse, rinktose augimo pradžioje - 26 komponentai.
Cheminės analizės metu identifikuoti eterinio aliejaus komponentai Sosnovskio barščių šaknų, stiebų, lapų bei žiedų mėginiuose skirtingais vegetacijos laikotarpiais pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Heracleum sosnowskyi M. augalinėje žaliavoje identifikuoti eterinio aliejaus komponentai 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Šaknys Stiebai Lapai Žiedai
26 32 34 33 30 41 30 Nustat ytų jun gin ių k ieki s
Augimo pradžia Masinis žydėjimas
Mėginio žymėjimas
Eterinio aliejaus komponentas ŠAP ŠMŽ SAP SMŽ LAP LMŽ ŽMŽ
β - ocimenas + + + + + + +
β - pinenas + + + para - cimenas + + + + + + Limonenas + + + + + + cis - β - ocimenas + + γ - terpinenas + + + + + + α - terpinolenas + + + + + 2 – Cikloheksen – 1 olis + 1,4 - Heksadienas + + + + meta - cimen-8-olis + + 4 - Decenalis + trans – 2 - oktenalis + 2 - Decenalis + β - elemenas + + Nerolidolis + + Spatulenolis + + + + 1 - Heksadekanolis + 3 – Tujenas + + α- pinenas + + + 4 (10) - Tujenas + + + + + β-mircenas + + + + + + +
(3E) – 4,8 -Dimetilnona - 1,3,7 - trienas +
Etanonas +
3-Cikloheksen-1-olis +
para – cimen – 8 - olis + +
Timolis + α - kubebenas + Kopaenas + + + + Bergamotenas + β - kariofilenas + + Seskvisabinenas + 2-Pentadekanolis + Kubebolis + δ - kadinenas + + + Heksadekanalis + Epikubenolis + Kadagių kamparas + α - ocimenas + + + + + Cikloheksenas + Anizolis + Karvakrolis + + + Aromadendrenas + + + + 3 – Fenilpropil izobutiratas + Germakrenas D + + + + + 2 – (3H) - Furanonas + + + + +
para – menta – 1,5,8 - trienas +
Anetolis + +
β - burbonenas + + + +
* ŠAP – šaknys augimo pradžioje, ŠMŽ – šaknys masinio žydėjimo metu, SAP – stiebai augimo pradžioje, SMŽ – stiebai masinio žydėjimo metu, LAP – lapai augimo pradžioje, LMŽ – lapai masinio žydėjimo metu, ŽMŽ – žiedai masinio žydėjimo metu
Visuose mėginiuose didesniais ar mažesniais kiekiais identifikuoti tik du tie patys junginiai: β – ocimenas, β-mircenas. Visų bandinių tarpusavio panašumas yra 6,19 proc. Augimo pradžioje rinktų šaknų, stiebų bei lapų eteriniame aliejuje identifikuoti: β – ocimenas, β – pinenas, Limonenas, β-mircenas. Šaknų, stiebų ir lapų, surinktų augimo pradžioje, panašumas - 13,04 proc. Didžiausias panašumas nustatytas tarp masinio žydėjimo laikotarpiu surinktų skirtingų augalo organų - 17,91 proc., sutampantys junginiai: β – ocimenas, para-cimenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas. Procentais išreikštas panašumas tarp skirtingų mėginių EA kokybinės sudėties yra pateikiamas 7 paveiksle. β - eudesmenas + Kariofileno oksidas + + + meta - ksilenas + 1,6 - Ciklodekadienas + 1,5 - Ciklodekadienas + 1H-Ciklopropa[A]naftalenas + Nonanalis (pelargonaldehidas) + Aloocimenas +
para – cimen – 7 - olis +
2 - Undekanonas + Izogermakrenas D + Germakrenas B + α - farnesenas + Eudesma - 3,7(11) - dienas + Neofitadienas + Oktanalis + 1 - Oktanolis + α - murolenas +
7 pav. Heracleum sosnowskyi M. eterinio aliejaus kokybinės sudėties panašumas tarp skirtingų mėginių
Didžiausias nustatytas panašumas yra tarp masinio žydėjimo laikotarpiu rinktų stiebų ir žiedų eterinio aliejaus kokybinės sudėties - 46,67 proc. Mažiausiai sutampanti EA kokybinė sudėtis yra tarp šaknų, rinktų masinio žydėjimo metu, ir lapų, rinktų augimo pradžioje - 11,94 proc. Tarp mėginių sutampantys junginiai yra pateikiami 3 lentelėje.
3 lentelė. Tarp skirtingų Heracleum sosnowskyi M. mėginių sutampantys eterinio aliejaus komponentai
Mėginių
žymėjimas Eterinio aliejaus komponentai
ŠAP/ŠMŽ β – ocimenas, para-cimenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, Nerolidolis, Spatulenolis, β-mircenas
ŠAP/SAP β – ocimenas, Kamfenas, β – pinenas, para-cimenas, Limonenas, cis - β – ocimenas, γ – terpinenas, 1,4 – Heksadienas, β-mircenas
ŠAP/SMŽ β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, 1,4 – Heksadienas, meta - cimen-8-olis, Spatulenolis, β-mircenas
ŠAP/LAP β – ocimenas, β – pinenas, Limonenas, β – elemenas, Spatulenolis, β-mircenas ŠAP/LMŽ β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, β-mircenas ŠAP/ŽMŽ β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, 1,4 –
Heksadienas, β-mircenas
ŠMŽ/SAP β – ocimenas, para-cimenas, γ – terpinenas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, para – cimen – 8 – olis,
ŠMŽ/SMŽ β – ocimenas, para-cimenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, Spatulenolis, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas,
ŠMŽ/LAP β – ocimenas, Spatulenolis, β-mircenas, Kopaenas
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 23,73 31,0332,14 20 17,91 25 18,46 22,22 11,94 24,32 34,92 38,71 24,24 30,14 32,26 31,25 45,0746,67 26,67 28,13 45,07 S u tapi m as, %
ŠMŽ/LMŽ β – ocimenas, para-cimenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, α – pinenas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, Kopaenas, δ - kadinenas
ŠMŽ/ŽMŽ β – ocimenas, para-cimenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, 3 – Tujenas, α – pinenas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, Kopaenas, β – kariofilenas, δ - kadinenas
SAP/SMŽ
β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, 1,4 – Heksadienas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, α – ocimenas, Karvakrolis, Aromadendrenas, Germakrenas D,
2-(3H)-Furanonas,
SAP/LAP β – ocimenas, β – pinenas, Limonenas, β-mircenas, α – ocimenas, Aromadendrenas, Germakrenas D, 2-(3H)-Furanonas,
SAP/LMŽ β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, α – ocimenas, Karvakrolis, Aromadendrenas, Germakrenas D, 2-(3H)-Furanonas SAP/ŽMŽ β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, 1,4 – Heksadienas, 4 (10) –
Tujenas, β-mircenas, α – ocimenas, Germakrenas D, 2-(3H)-Furanonas SMŽ/LAP β – ocimenas, Limonenas, Spatulenolis, β-mircenas, α – ocimenas, Aromadendrenas,
Germakrenas D, 2-(3H)-Furanonas, β – burbonenas, α – humulenas,
SMŽ/LMŽ Tujenas, β-mircenas, α – ocimenas, Karvakrolis, Aromadendrenas, Germakrenas D, 2-β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, 4 (10) – (3H)-Furanonas, Anetolis, β – burbonenas, α – humulenas, Kariofileno oksidas SMŽ/ŽMŽ β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, 1,4 – Heksadienas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, α – ocimenas, Germakrenas D,
2-(3H)-Furanonas, β – burbonenas, α – humulenas, Kariofileno oksidas
LAP/LMŽ β – ocimenas, Limonenas, β-mircenas, Kopaenas, α – ocimenas, Aromadendrenas, Germakrenas D, 2-(3H)-Furanonas, β – burbonenas, α – humulenas,
LAP/ŽMŽ β – ocimenas, Limonenas, β-mircenas, Kopaenas, α – ocimenas, Germakrenas D, 2-(3H)-Furanonas, β – burbonenas, α – humulenas,
LMŽ/ŽMŽ β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, α- pinenas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, Kopaenas, δ – kadinenas, α – ocimenas, Germakrenas D,
2-(3H)-Furanonas, β – burbonenas, α – humulenas, Kariofileno oksidas
* ŠAP – šaknys augimo pradžioje, ŠMŽ – šaknys masinio žydėjimo metu, SAP – stiebai augimo pradžioje, SMŽ – stiebai masinio žydėjimo metu, LAP – lapai augimo pradžioje, LMŽ – lapai masinio žydėjimo metu, ŽMŽ – žiedai masinio žydėjimo metu
Didžiausias panašumas stebimas tarp masinio žydėjimo metu surinktų antžeminių augalio organų, sutampa 13 eterinio aliejaus komponentų (β – ocimenas, para-cimenas, Limonenas, γ – terpinenas, α – terpinolenas, 4 (10) – Tujenas, β-mircenas, α – ocimenas, Germakrenas D, 2-(3H)-Furanonas, β – burbonenas, α – humulenas, Kariofileno oksidas). Labiausiai eterinių aliejų kokybinė sudėtis skiriasi tarp požeminės ir antžeminės augalo žaliavos, surinktos skirtingu vegetacijos periodu.
Sosnovskio barščių skirtinguose morfologiniuose organuose, skirtingu vegetacijos metu dominuoja monoterpenams ir seskviterpenams priskiriami junginiai, kurių kiekiai, išreikšti procentais, pateikiami 8 paveiksle.
8 pav. Procentinė terpenų sudėtis Heracleum sosnowskyi M. žaliavoje
Monoterpeniniai junginiai sudarė nuo 14,71 proc. lapuose, iki 43,75 proc. stiebuose, rinktuose augimo pradžioje. Seskviterpeninių junginių kiekis svyravo nuo 3,13 proc. stiebų žaliavoje, kuri buvo surinkta augimo pradžioje, iki 30,3 proc. šaknų mėginiuose masinio žydėjimo metu.
Susisteminus rezultatus, galima teigti, kad dominuojanti eterinių aliejų grupė H. sosnowskyi augalinėje žaliavoje yra monoterpenai. Lapų, surinktų augimo pradžioje, mėginys yra vienintelė išimtis, kai dominuojanti eterinių aliejų grupė yra seskviterpenai. Ryškiausi skirtumai tarp dominuojančių grupių stebimi stiebų, surinktų augimo pradžioje, bandinyje, skirtumas - beveik 14 kartų didesnė monoterpenų procentinė dalis. Panašiausi kiekiai tarp monoterpenų ir seskviterpenų yra šaknų ir žiedų mėginiuose, rinktuose masinio žydėjimo metu.
3.1.2. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos bendro eterinių aliejų komponentų kiekio analizė
Atlikus GC - MS analizę, pagal chromatogramose registruotą Sosnovskio barščių mėginių EA sudėtinių komponentų bendrą smailių plotą, nustatytas bendras eterinio aliejaus komponentų kiekis kiekviename bandinyje. Rezultatai pateikti 9 paveiksle.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
ŠAP ŠMŽ SAP SMŽ LAP LMŽ ŽMŽ
38,46 33,33 43,75 36,67 14,71 34,15 33,33 11,54 30,3 3,13 23,33 23,53 26,83 30 K ieki s, % Monoterpenai Seskviterpenai
9 pav. Eterinio aliejaus komponentų kiekis pagal bendrą smailių plotą Heracleum sosnowskyi M. augalinėje žaliavoje augimo pradžioje ir masinio žydėjimo metu
Atlikus kiekybinį Heracleum sosnowskyi mėginių eterinio aliejaus įvertinimą, nustatyta, kad didžiausias EA komponentų kiekis, pagal bendrą smailių plotą yra žiedų, rinktų masinio žydėjimo metu, mėginyje. Mažiausias EA kiekis nustatytas lapų, rinktų augimo pradžioje, mėginyje. Didesnis eterinio aliejaus komponentų kiekis kaupiamas šaknyse masinio žydėjimo metu negu augimo pradžioje. Lapų eterinio aliejaus komponentų didesnis kiekis, užfiksuotas masinio žydėjimo metu.
Palyginus rezultatus, nustatyta, kad mažesni eterinio aliejaus kiekiai nustatyti žaliavoje, rinktoje augimo pradžioje, išskyrus stiebų mėginius. Tarp masinio žydėjimo metu rinktų žaliavų, daugiausiai EA užfiksuota žieduose, o mažiausiai - stiebuose. Tarp augimo pradžioje rinktų mėginių, daugiausiai EA nustatyta stiebuose, o mažiausiai - lapuose. Vegetacijos periodas didžiausią įtaką padarė šaknų eterinio aliejaus kiekiui, šis išaugo beveik 24 kartus. Mažiausiai augimo laikotarpis įtakos turėjo stiebų mėginių EA kiekiui, skirtumas tarp jų - apie 2 kartai.
Statistiškai įvertinus tyrimo rezultatus, nustatyta, kad bendras eterinio aliejaus komponentų kiekis, remiantis bendru smailių plotu, Sosnovskio barščių šaknų, stiebų, lapų bei žiedų mėginiuose skirtingu vegetacijos periodu reikšmingai skiriasi (p < 0,05, p = 0,002).
3.1.3. Heracleum sosnowskyi M. augalinės žaliavos eterinių aliejų komponentų kiekinė analizė
Atliktos GC - MS analizės metu nustatyta, kurie tie patys du junginiai mažesniais ar didesniais 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Šaknys Stiebai Lapai Žiedai
6,13 59,2 6,02 144,97 29,09 90,64 165,79 B en d ras sm ail ių p lotas × 10 7
