LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

IVETA KVIETELAITYTĖ

PROPOLIO FLAVONOIDŲ SKVARBOS Į ODĄ BIOFARMACINIS

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. Vitalis Briedis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė

Prof. dr. Ramunė Morkūnienė

Data:

IVETA KVIETELAITYTĖ

PROPOLIO FLAVONOIDŲ SKVARBOS Į ODĄ BIOFARMACINIS

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. Vitalis Briedis

Data:

Recenzentas

Darbą atliko

Vardas, Pavardė, parašas

Magistrantė

Data:

Iveta Kvietelaitytė

Data:

TURINYS

SUMMARY ... 7

SANTRUMPOS ... 9

ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Propolio cheminė sudėtis ... 12

1.2. Flavonoidai ... 13

1.3. Geografinė įtaka propolio sudėčiai ... 15

1.4. Propolio farmakologinės savybės ... 16

1.4.1.Antinavikinis propolio poveikis ... 17

1.4.2. Antibakterinis, antivirusinis, priešgrybelinis propolio poveikis ... 18

1.4.3. Antioksidacinis propolio veiksmingumas ... 19

1.4.4. Priešuždegiminis propolio veiksmingumas ... 20

1.4.5. Širdies ir kraujagyslių sistemos protekcijos veiksmingumas ... 21

1.4.6. Imunomoduliacinis propolio veiksmingumas ... 21

1.5. Odos struktūra. Skvarbos į odą keliai. ... 22

1.5.1. Odos struktūra. ... 22

1.5.2. Skvarbos į odą keliai. ... 22

2. TYRIMO METODIKA ... 24

2.1. Tyrimo objektas ... 24

2.2. Naudoti reagentai ir tirpikliai ... 24

2.3. Įranga ir priemonės ... 24

2.4. Propolio ekstraktų paruošimas ... 24

2.5. Propolio ekstraktų analizė chromatografiniais metodais ... 25

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29

3.1. Flavonoidų analizė chromatografiniais metodais. ... 29

3.2. Flavonoidų skvarbos į odą ex vivo tyrimas ... 37

3.3. Fenolinių rūgščių skvarbos į odą tyrimas ... 41

4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 43

5. IŠVADOS ... 44

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44

SANTRAUKA

I.Kvietelaitytės Magistro baigiamasis darbas, mokslinis vadovas – prof. dr. Vitalis Briedis, Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas, Farmacijos fakultetas, Klinikinės Farmacijos katedra, Kaunas.

Raktiniai žodžiai: propolis, flavonoidai, skvarba, oda, efektyvioji skysčių chromatografija. Tyrimo tikslas:ištirti ir įvertinti propolio flavonoidų skvarbą į odą ex vivo.

Tyrimo uždaviniai:

1. Parinkti tinkamus metodus bei kiekybiškai ir kokybiškai įvertinti flavonoidus, esančius propolyje.

2. Nustatyti flavonoidų sudėtį įvairių Lietuvos regionų propolio pavyzdžiuose.

3. Įvertinti propolio flavonoidų skvarbą į odą. Išanalizuoti skvarbą gerinančių medžiagų bei barjerinę funkciją sukuriančių odos komponentų pašalinimo poveikį skvarbos efektyvumui.

4. Nustatyti propolio flavonoidų poveikio sritis, remiantis skvarbos rezultatais.

Tyrimo objektas ir metodai: propolio flavonoidų pasiskirstymo įvertinimas skirtingose Lietuvos apskrityse efektyviąja skysčių chromatografija bei propolio flavonoidų skvarbos į odą tyrimas.

Tyrimo rezultatai:Vertinant propolio flavonoidų pasiskirstymo analizę skirtingų Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose, matyti, jog flavonoidai apigeninas ir kamferolis yra tolygiai pasiskirstę visose tirtose apskrityse, tai flavonoidai būdingi visoms tirtoms Lietuvos apskritims. Flavonoidų chrizino, galangino ir pinocembrino svyravimo ribos buvo mažiausios Vakarų Lietuvos apskrityse, todėl galima daryti prielaidą, jog šie flavonoidai yra būdingi Vakarų Lietuvos propoliui. Atlikus skvarbos į odą tyrimą, naudojant skirtingas membranas (sveika oda, sveika oda su pašalintu raginiu sluoksniu, sveika oda su pašalintais raginio sluoksnio riebaliniais komponentais, sveika oda paveikto oleino rūgštimi bei D – limonenu), gauti rezultatai, rodo, jog flavonoidų skvarbą į epidermį ir dermą yra sąlyginai ribota, prasiskverbęs kiekis buvo mažesnis už aptikimo ribą.

Išvados:

1. Flavanoidų apigenino ir kamferolio kiekio svyravimo ribos tirtuose Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose kito mažai, todėl galima teigti, jog apigeninas ir kamferolis yra būdingi flavonoidai Lietuvos propolyje, tuo tarpu flavonoidų chrizino, galangino ir pinocembrino kiekio

svyravimo ribos mažai kito propolio pavyzdžiuose, surinktuose Vakarų Lietuvos apskrityse, todėl galima teigti, jog šie flavonoidai yra būdingi Vakarų Lietuvos propoliui.

2. Prasiskverbęs į odą flavonoidų kiekis buvo mažesnis už aptikimo ribą. Skvarbą gali apsunkinti flavonoidų molekulinė struktūra, etanolio poveikis odai, ribotas flavonoidų tirpumas vandenyje arba mažas flavonoidų ir tirpiklio afinitetas.

3. Flavonoidų skvarba nėra ribojama raginio sluoksnio bei jo riebalinių komponentų, o rezultatai iš etanolinės propolio ištraukos su oleino rūgštimi bei D – limonenu, nesiskyrė nuo skvarbos rezultatų, gautų iš grynos etanolinės ištraukos. Todėl, galima teigti, jog tipiniai flavonoidų skvarbos skatintojai, skvarbos nepagerino.

4. Gauti flavonoidų skvarbos rezultatai, leidžia prognozuoti, kad panašios struktūros flavonoidų turinčių augalinių ekstraktų poveikis bus lokalizuotas odos paviršiuje.

Rekomendacijos:

 Kuriant ant odos vartojamus produktus su augaliniais ekstraktais, rekomenduojama atlikti ekstrakto sudėtyje esančių flavonoidų transderminės skvarbos tyrimus.

 Siekiant užtikrinti mažai skvarbių į odos sluoksnius flavonoidų patekimą į epidermį ir dermą, rekomenduojama kurti nano struktūrinius nešiklius.

SUMMARY

I. Kvietelaityte‘s Master Thesis, Term paper advisor prof. dr. Vitalis Briedis, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy, Kaunas.

Key words: propolis, flavonoids, permeation, skin, high pressure liquid chromatography. Aim of the study: to examine and determine propolis flavonoids permeation through the skin ex vivo.

Reserch goals:

1. Qualitative and quantitative determination of propolis flavonoids, selection of the research methods.

2. Evaluation of propolis flavonoids penetration to the skin.

3. Influence of penetration enhancers and elimination ofbarrier actingskin components to the penetration efficiency.

4. Determination of propolis flavonoids activity location according to penetration results. Research object and methods:evaluation of propolis flavonoids distribution throughout various regions of Lithuania using high pressure liquid chromatography and propolis flavonoids penetration to the skin.

Results:the analysis of propolis flavonoids examples from various regions of Lithuaniashows that flavonoids apigenin and kaempferol are nearly equaly distributed in all of the examined regions, these are the flavonoids which are resident in all of the examined regions. The quantity variantion of flavonoids chrysin, galangin and pinocembrin was insignificant in the propolis examples from Western regions of Lithuania, for this reason a conclusion could be made that chrysin, galangin and pinocembrin are the resident flavonoids of Western Lithuania propolis. The penetration evaluation research, using different membranes (unharmed skin, unharmed skin with removed stratum corneum layer, unharmed skin with removed stratum corneum fatty components, unharmed skin affected by oleinic acid and unharmed skin affected by D – limonene) showed that penetration of flavonoids to the epidermis and derma is limited, the quantity of penetrated flavonoids was lower than the limit of detection.

Conclusions:

1. The quantity variantions of flavonoids apigenin and kaempferol were nearly equaly distributed in all of the examined propolis examples from various regions, these are the flavonoids

which are resident in all of the examined regions. The quantity variantion of flavonoids chrysin, galangin and pinocembrin was insignificant in the propolis examples from Western regions of Lithuania, for this reason a conclusion could be made that chrysin, galangin and pinocembrin are the resident flavonoids of Western Lithuania propolis.

2. The quantity of penetrated flavonoids was lower than the limit of detection. The penetration could be influenced by flavonoids molecule structure, ethanol effect to the skin, limited flavonoids solubility in water or low affinity of the flavonoids and the solvent.

3. The penetration of flavonoids is not limited by stratum corneum layer or its fatty components, the results from ethanolic propolis extract with oleinic acid and D – limonene did not differ from the results obtained from pure ethanolic propolis extract. The conclusion could be made that typical penetration enhancers did not improve the penetration of flavonoids.

4. The results obtained from the flavonoids penetration research, offers a conclusion that the action of the extracts containing similar structure flavonoids would be localised on the surface of the skin.

Recommendations:

 The transdermic penetration research of flavonoids in the extract is recommended while producing topical skin products with plant extracts.

 The nano systems creation is recommended in order to ensure the penetration of hardly penetrating flavonoids to epidermis and derma.

SANTRUMPOS

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

AR – aptikimo riba

AK – aptiktas kiekis

UV – ultravioletinė spinduliuotė

HBA – vandenilinio ryšio akceptoriai

HBD – vandenilinio ryšio donorai

MAPK – mitogenų aktyvuota proteinkinazė

RDF – reaktyvios deguonies formos

NO – azoto oksidas

AKF – angiotenziną konvertuojantis fermentas

cAMP – ciklinis adenozino monofosfatas

ĮVADAS

Propolis, tai klampi masė, bičių surenkama iš įvairių augalų šaltinių. Dėl savo farmakologinių ir biologinių savybių, nuo pat antikos laikų buvo naudojamas tradicinėje medicinoje Egipte, Graikijoje, Arabų šalyse ir kt.

Nustatyta, jog propolis pasižymi įvairiomis farmakologinėmis savybėmis, tokiomis kaip antibakterinis, antivirusinis, priešuždegiminis, priešvėžinis poveikis. Propolio sudėtis bei farmakologinis poveikis labai priklauso nuo to, kokioje vietoje jis buvo išgautas, pavyzdžiui, Europos propolis daugiausiai susideda iš įvairių flavonoidų bei fenolinių esterių, o propolis išgautas Brazilijoje, savo sudėtyje daugiausia turi terpenoidų bei p-kumaro rūgšties derivatų [1].

Propolis vis dar plačiai naudojamas daugelyje šalių žaizdų bei nudegimų gydimui, gerklės skausmui malšinti, skrandžio opoms gydyti ir tt. Dėl šios priežasties, propolio farmakologiniai ir cheminiai tyrimai smarkiai išaugo per pastaruosius 30 metų [2].

Žmogaus oda apsaugo organizmą nuo fizinių, cheminių, biologinių ir aplinkos faktorių [21]. Išoriniai faktoriai ir UV radiacija gali sukelti odos pakitimus, kurie pasireiškia oksidaciniu stresu, priešlaikiniu odos senėjimu bei odos vėžiu [19]. Nustatyta, jog fenolinės rūgštys ir flavonoidai gali veikti kaip UV blokatoriai, sumažinti uždegiminius procesus, oksidacinį stresą ir DNR pakitimus [20]. Todėl svarbu išanalizuoti propolio flavonoidų, kurie pasižymi antioksidaciniu poveikiu, skvarbos į odą galimybes.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

TIKSLAS: ištirti ir įvertinti propolio flavonoidų skvarbą į odą ex vivo. UŽDAVINIAI:

1. Parinkti tinkamus metodus bei kiekybiškai ir kokybiškai įvertinti flavonoidus, esančius propolyje.

2. Nustatyti flavonoidų sudėtį įvairių Lietuvos regionų propolio pavyzdžiuose.

3. Įvertinti propolio flavonoidų skvarbą į odą. Išanalizuoti skvarbą gerinančių medžiagų bei barjerinę funkciją sukuriančių odos komponentų pašalinimo poveikį skvarbos efektyvumui.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Propolio cheminė sudėtis

Išvertus iš graikų kalbos, propolis reiškia „prieš miesto įėjimą“ [9].Nustatyta, jog propolis pasižymi ne tik įvairiu farmakologiniu, tačiau ir apsauginiu poveikiu. Propolis naudojamas avilių statybai ir apsaugai – bitės juo užkamšo įtrūkimus avilyje, sustiprina korio sieneles, balzamuoja negyvus įsibrovėlius, kurių negali pašalinti iš avilio. Taip pat, propolis yra stiprus avilio cheminis ginklas, kadangi apsaugo avilį nuo patogeninių mikroorganizmų. Tai lipni, tamsios spalvos medžiaga, kurią bitės išgauna iš lapuočių augalų pumpurųir spygliuočų bei lapuočių žievės įtrūkimų, sumaišo su vašku ir mandibuliarinių bei hipofaringinių liaukų sekretu [3].Pagrinde susideda iš dervų, kurios sudaro apie 50% propoliosudėties ir vaško, kuris sudaro apie 30% propolio sudėties, apie 10% užima eteriniai ir aromatiniai aliejai, apie 5% žiedadulkės, o likusius 5 %– kitos įvairios medžiagos (1 Diagrama)[4].

1. Diagrama. Propolio cheminė sudėtis [4].

Į propolio sudėtį įeina daugiau kaip 200 įvairių komponentų, tokių kaip fenolinės rūgštys ir jų esteriai, flavonoidai, amino rūgštys, alifatinės rūgštys, aromatiniai esteriai ir rūgštys, riebalų rūgštys, angliavandeniai, aldehidai, amino rūgštys, ketonai, chalkonai, dihidrochalkonai, terpenoidai, vitaminai (A, B1, B2, B6, C, E), metalai (aliuminis, cinkas, kalcis, varis, geležis, litis, manganas, gyvsidabris, nikelis, sidabras, vanadis, kalis, natris, cezis, magnis). Propolis savo sudėtyje turi didelę įvairių biologinių junginių įvairovę, tačiau propolio sudėtis labai priklauso ir nuo augalo bei geografinės zonos, kurioje jis auga [3, 4].

50% 30%

10% 5% 5%

Propolio cheminė sudėtis

1.2. Flavonoidai

Flavonoidai nuo seno naudojami gydymo tikslais, o jų farmakologinis aktyvumas svarbus ir šiuolaikinėje medicinoje dėl antioksidacinio, antibakterinio, priešvirusinio, priešuždegiminio poveikio.Todėl tapo aktualu analizuoti bei atlikti tyrimus su flavonoidais. Farmacijos industrija nuolat ieško naujų gydymo būdų, augalų komponentų, kurie galėtų būti kaip pradinis naujų gydymo būdų vystymo modelis [16].

Flavonoidai, tai augalų pigmentai, kurie sintetinami iš fenilalanino ir yra atsakingi už augalo žiedlapių spalvą, ryškiai florescuoja apšviesti UV šviesa. [15]. Tai grupė fenolinių junginių, kurių pagrindinis elementas yra C6-C3-C6 grandinė, sudaryta iš 15 anglies atomų, kurių išsidėstymą lemia ir grandinėje esantys benzeno žiedas bei fenilpropano elementas (2 Formulė) [10].

2. Formulė. Bendroji flavonoidų struktūrinė formulė [14].

Fenoliniai junginiai (flavonoidai ir fenolinės rūgštys) yra pagrindiniai propolio dervų komponentai, dėl kurių propolis pasižymi gydomosiomis savybėmis ir yra naudojamas kaip antibakterinis, antivirusinis ir priešuždegiminis preparatas [12]. Flavonoidai taip pat pasižymi antioksidaciniu poveikiu, kuris yra siejamas su jų struktūra. Tai orto-dihidroksi grupė B žiede, dvigubas ryšys tarp C2 ir C3 anglies atomų, bei keturių oksi grupių egzistavimas C žiede, taip pat hidroksilo grupės prie C3 ir C5 anglies atomų. Glikolizacijos procesai prie C3 anglies atomo sumažina antioksidacinį aktyvumą, todėl flavonoidų aglikonai pasižymi labiau išreikštomis antioksidacinėmis savybėmis nei jų glikozilintos formos [16]. Priešuždegiminis aktyvumas pasireiškia dėl antioksidacinių flavonoidų savybių. Nustatyta, jog priešuždegiminis aktyvumas atsiranda tuomet, kai prie C3 ir C4 anglies atomų B žiede yra hidroksilo grupės [17].

Priešvirusiniu aktyvumu labiausiai pasižymi flavonai, po jų – izoflavonai, flavononai, flavanoliai. Kad pasireikštų priešvirusinis aktyvumas, flavonoidų struktūroje, B žiede 4 bei 7 pozicijoje turi būti hidroksilo grupė, prie C4 anglies atomo – hidroksi grupė, o tarp C2 ir C3 anglies atomų – dvigubas ryšys. Glikolizacijos procesai žymiai sumažina priešvirusinį flavonoidų aktyvumą [18].

Pagrindinės flavonoidų klasės yra šios: flavonai, flavonoliai, flavononai, flavononoliai, izoflavonai, katechinai (flavan-3-oliai), chalkonai, antocianidinai ir leukoantocianidinai. Flavonoidai egzistuoja kaip aglikonai, glikozilinti arba metilinti dariniai (3. Formulės) [16].

3. Formulės. Propolio flavonoidai.

Propolio komponentų skvarbos per odą intensyvumas priklauso nuo jų individualių fizikocheminių savybių bei nešiklio sistemos struktūros [31]. Kitas ypatingai svarbus faktorius, lemiantis skvarbos procesą – medžiagos aktyvumas donoriniame tirpale. Tyrimai įrodė, jog tirpiklio ir komponento giminingumo laipsnis yra vienas iš svarbiausių faktorių, nulemiančių skvarbos procesus per membraną [45]. Išanalizavus gautus tyrimų duomenis, padaryta išvada, jog skvarbos koeficientas yra susijęs su logP reikšme. Kuo didesnė logP reikšmė, tuo greičiau įvyko flavonoido katechino bei kvercetino migracija per membraną, tačiau svarbu paminėti, jog skvarbos aktyvumas didėja tik iki tam

tikos logP ribos [33]. Remiantis Lipinskio taisykle, skvarba yra aktyviausia tuo metu, kai logP reikšmė neviršija 5, HBA – 10, HBD – 5, o molekulinė masė – 500 g/mol (4 Lentelė) [46].

4. Lentelė. Flavonoidų fizikocheminiai rodikliai [47].

Flavonoidas logP reikšmė HBA HBD Molekulinė masė

Apigeninas 2,71 5 3 270,237g/mol

Kamferolis 2,46 6 4 286,236g/mol

Chrizinas 3,01 4 2 254,241g/mol

Pinocembrinas 3,14 4 2 256,257g/mol

Galanginas 2,76 5 3 270,240g/mol

Siekiant apibūdinti hidrofilinių medžiagų įtaką flavonoidų skvarbos aktyvumui, buvo nustatyta, jog hidrofilinių medžiagų pridėjimas į nešiklio sistemą pagerina flavonoidų tirpumą dėl to sumažėja skvarbos aktyvumas [33]. Apibendrinant, flavonoidų farmakologinį poveikį nulemia jų struktūra, o skvarbai įtaką daro įvairūs fizikocheminiai rodikliai, tokie kaip logP reikšmė, HBA, HBD, molekulinė masė, tirpiklio ir flavonoido giminingumas.

1.3.Geografinė įtaka propolio sudėčiai

Cheminė propolio sudėtis, kvapas, bei spalva labai priklauso nuo kilmės vietos bei augalo rūšies (5 Lentelė)[3]. Pagrindinis vidutinių platumų propolio šaltinis visame pasaulyje yra klampus, dažniausiai juodųjų tuopų (Populus nigra) pumpurų eksudatas. Dėl to, Europinis propolis daugiausiai susideda iš fenolinių junginių – flavonoidų aglikonų (flavonų ir flavanonų), fenolinių rūgščių ir esterių. Tuopos yra paplitę tik vidutinių platumų klimato zonose, todėl kitose klimato zonose, pavyzdžiui tropikuose ir subtropikuose, bitės turi propolį išgauti iš kitų augalų, todėl skiriasi ir propolio cheminė sudėtis bei intensyvesnis propolio poveikis vienokiu ar kitokiu atžvilgiu (5 lentelė) [2].Nustatyta, jog propolio kiekybinę ir kokybinę flavonoidų sudėtį gali lemti ir propolį renkančių bičių rūšis [13].

5. Lentelė. Propolio cheminė sudėtis, atsižvelgiant į geografinę zoną [6].

Propolio tipas Geografinė zona Pagrindiniai komponentai

Tuopų propolis Europa, Š. Amerika, netropiniai Azijos regionai, N. Zelandija

Flavonai, flavanonai, cinamono rūgštys ir jų esteriai

Žaliasis propolis (braziliškasis)

Brazilija Prenilintos P-kumaro rūgštys, diterpeninės rūgštys

Propolio tipas Geografinė zona Pagrindiniai komponentai

Raudonasis propolis

Kuba, Brazilija, Meksika Izoflavonoidai

Viduržemio propolis

Sicilija, Graikija, Kreta, Malta Diterpenai

„Clusia“ propolis

Kuba, Venesuela Poliprenilinti benzofenonai

Ramiojo vandenyno regiono propolis

Okinava, Taivanas, Indonezija C-prenilinti-flavanonai

Braziliškasis, pietų ir Amazonės regionų propolis, daugiausiai susideda iš fenilintų fenilpropanoidų ir polipropilintų benzofenonų, tuo tarpu Ramiojo vandenyno regiono (pvz., Okinava, Taivanas) propolis, pagrinde sudarytas iš geranilflavononų. Viduržemio regione (pvz., Graikija, Kreta, Turkija), daugiausiai vyrauja diterpenoidai. Taigi, įvairių regionų propolis yra surinktas iš skrtingų rūšių augalų, todėl pasižymi skirtingu biologiniu aktyvumu, dėl kaupiamų elementų kiekio [4].

1.4.Propolio farmakologinės savybės

Propolis buvo plačiai naudojamos ir Antikos laikų tradicinėje medicinoje įvairiose šalyse. Tai skatino susidomėjimą jo sudėtimi ir kaupti naujus duomenis apie propolio panaudojimą farmakologijoje [47, 48]. Atliktityrimai įrodė jo farmakologinį poveikį – antibakterinį, antivirusinį, priešgrybelinį, priešuždegiminį, hepatoprotekcinį, antioksidacinį, priešvėžinį, antihipertenzinį, imunomoduliacinį, antihiperalerginį, antiparazitinį poveikį. Pagrindiniai elementai, nulemiantys propolio biologinį aktyvumą, tai flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai (6 Lentelė) [4].

6. Lentelė. Skirtingų propolio tipų komponentai, atsakingi už biologinį aktyvumą [2]. Propolio tipas Antibakteri nis aktyvumas Priešuždegimin is aktyvumas Antinavikini s aktyvumas Hepatoprote-kcinis aktyvumas Antioksidacinis aktyvumas Europinis propolis Flavanonai, flavonai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai Flavanonai, flavonai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai Kofeino rūgštis ir fenetilesteris Kofeino rūgštis, ferulinės rūgštys, kofeino rūgšties feniletilesteris Flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai Braziliškasi s propolis (žaliasis) P-kumaro rūgštys, labdono diterpenai Nenustatyta P-kumaro rūgštys, klerodano diterpenai, benzofuranai P-kumaro rūgštys, flavonoidai, lignanai, kafeoilkvininės rūgštys P-kumaro rūgštys, flavonoidai

Propolio tipas Antibakteri nis aktyvumas Priešuždegimin is aktyvumas Antinavikini s aktyvumas Hepatoprote-kcinis aktyvumas Antioksidacinis aktyvumas Kubiškasis propolis (raudonasis ) Benzofenon ai

Nenustatyta Benzofenonai Nenustatyta Benzofenonai

Taivaniškas is propolis (raudonasis

)

Nenustatyta Nenustatyta Flavanonai Nenustatyta Flavanonai

Apibendrinant, skirtingų propolio tipų komponentai, nulemia panašų propolio biologinį aktyvumą – antibakterinį, priešuždegiminį, antinavikinį, hepatoprotekcinį, antioksidacinį. Pagrindiniai komponentai, nulemiantys biologinį aktyvumą – flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai.

1.4.1. Antinavikinis propolio poveikis

Nustatyta, jog daugiau kaip 70proc. priešvėžinių preparatų yra pagaminti iš natūralių gamtoje randamų komponentų [50]. Dėl didelio flavonoidų, terpenoidų ir fenolinių komponentų kiekio savo sudėtyje, propolis buvo intensyviai tiriamas, siekiama patvirtinti jo antiproliferacinį poveikį, naudojant įvairius in vivo/in vitro vėžio modelius gyvūnų ląstelėse [9]. Vienas iš tokių tyrimų buvo atliktas su propoliu iš Tailando, nustatyta, jog jis pasižymėjo dideliu antiproliferaciniu efektu, kuris buvo vertinamas pagal MTT (3-(4,5-dimetil-iazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) testo ant adenokarcinominių žmogaus alveolių epitelio ląstelių (A549) ir žmogaus gimdos kaklelio epitelio karcinomos ląstelių (HeLa) po 24, 48 ir 72val gydymo nuo dozės priklausomu būdu [51].

Kitas atliktas tyrimas su propoliu iš Alžyro, kurio metu nustatyta, jog galanginas, esantis propolyje, pasižymi priešvėžiniu poveikiu [52]. Galanginas slopino melanomos ląstelių apoptozę, aktyvuodamas p38 MAPK (p38 mitogenų aktyvuotą proteinkinazę) ir inhibavo in vivo auglio augimą ir metastazavimą pelių melanomos modeliuose [53, 54].

Turkijos mokslininkai atliko tyrimus su 5 vėžinėmis žmogaus ląstelių linijomis bei propoliu iš Turkijos (7 Lentelė). Nustatyta, jog etanolinis propolio ekstraktas pasižymi stipriu citotoksiniu poveikiu hepatoceliularinės karcinomos(HepG2), žarnyno adenokarcinomos (WiDr), HeLa, krūties vėžio adenokarcinomos (MCF-7) ir prostatos adenokarcinomos (PC3) ląstelėms. Didžiausias citotoksinis aktyvumas nustatytas tiriant PC-3 ląsteles su puse maksimalios inhibitorinės koncentracijos (20,7±3,4mg/ml) [55]. Taip pat, įvertinta, jog etanolinis ekstraktas iš Lenkijos propolio inhibuoja žmogaus pyktibinės melanomos ląstelių (Me 45) ir kolorektalinio vėžio (HCT 116) proliferaciją [9].

7. Lentelė. Įvairių flavonoidų priešvėžinis poveikis su skirtingomis ląstelių linijomis in vitro [7].

Vėžio tipas Panaudota ląstelių linija Flavonoidas

Žmogaus plaučių vėžys A549, H441, H661, SW900 Kvercetinas, flavonai

Žmogaus burnos vėžys HSC-2, HSG, SCC-25 Kvercetinas, chalkonai

Žmogaus skydliaukės vėžys ARO,WRO,NPA Apigeninas, kamferolis, katechinas, liuteolinas,

genisteinas

Žmogaus prostatos vėžys DU145, PC3 Miricetinas, apigeninas, liuteolinas, katechinas, epikatechinas, silimarinas

Žmogaus krūties vėžys MCF-7 Kvercetinas, liuteolinas, genisteinas

Žmogaus leukemija HL-60, K562 Kvercetinas, miricetinas, apigeninas, chalkonai

Žmogaus žarnyno vėžys HCT-15, IEC-6,HT-29 Genisteinas, kvercetinas, antocianinas

Pelių melanoma 4A5 Chalkonai

Irano mokslininkai, tyrę propolį, patvirtino, jog jis pasižymi citotoksiniu poveikiu AGS žmogaus virškinamojo trakto ląstelėms. Ekstraktai inhibavo AGS ląstelių proliferaciją, naudojant 60, 30 ir 15mg/ml dozes, po 24, 48 ir 72val gydymo. Žiurkių modeliuose, virškinamojo trakto vėžys gali būti inhibuotas naudojant etanolinį Irano propolio ekstraktą, kuris sumažina auglio proliferaciją ir įvairių pažeidimų kiekį, lyginant su negydomais pacientais [9]. Taigi, nuolat atliekami tyrimai, siekiant patvirtinti propolio antiproliferacinį poveikį, kuris gali būti nulemtas flavonoidų, terpenoidų ir fenolinių junginių propolio sudėtyje.

1.4.2. Antibakterinis, antivirusinis, priešgrybelinis propolio poveikis

Įvairių šalių propolio mėginiai tirti dėl savo antibakterinio (prieš S. Aureus ir E. Coli bakterijas), priešgrybelinio (prieš C. Albicans grybelį) ir antivirusinio (prieš A. Influenza virusą) poveikio (8 Lentelė). Visi tirti pavyzdžiai buvo efektyvūs prieš grybelius bei Gram-teigiamas bakterijų padermes (todėl slopino S. Aureus, tačiau neveikė prieš E. Coli bakterijas) ir daugelis pasižymėjo efektyviu antivirusiniu poveikiu. Poveikio stiprumas buvo panašus, nepriklausomai nuo propolio cheminės sudėties [8].

Vidutinių platumų zonos propolio mėginiuose, antivirusinis, priešgrybelinis ir antibakterinis poveikis pasireiškė dėl sudėtyje esančių flavonoidų ir fenolinių rūgščių esterių. Tropinių zonų propolio sudėtyje nebuvo aptikta flavonoidų ar fenolinių rūgščių esterių, tačiau jis vistiek pasižymėjo panašiu farmakologiniu poveikiu. Manoma, jog skirtinguose mėginiuose, skirtingų komponentų kombinacijos yra atsakingos už priešgrybelinį, antivirusinį ir antibakterinį farmakologinį poveikį. Todėl galima

teigti, jog propolio farmakologinį poveikį nulemia komponentų mišinys, o ne konkretūs pavieniai komponentai [8].

8. Lentelė. Įvairių propolio mėginių antibakterinis, antigrybelinis ir priešvirusinis aktyvumas. (Ekstraktai su 70proc. Etanoliu) [8].

Propolio mėginys Antibakterinis aktyvumas Antigrybelinis aktyvumas Priešvirusinis aktyvumas Bg 13.7±0.3 17.7±1.2 8 Mong 16.2±0.3 18.0±1.0 4 Alb 13.8±0.6 17.0±1.0 4 Egypt 15.3±1.5 17.3±0.4 Neištirta Br1 12.0±1.0 14.3±0.6 2 Br2 11.8±0.8 17.2±1.2 4 Br3 11.0±1.0 15.7±1.0 0 Br4 11.8±0.8 18.2±0.3 4 G1 12.7±0.6 17.0±0.5 35 G3 11.2±1.0 16.2±1.0 4 K1 29.0±0.7 18.0±1.0 Neištirta K2 17.3±1.2 17.0±0.7 Neištirta Nistatinas - 32.0±1.0 - Streptomicinas 28.0±1.0 - -

Kitas atliktas tyrimas su etanoliniu propolio ekstraktu iš Kenijos, parodė žymius antibakterinius pasikeitimus, kurie vertinami pagal inhibicijos zonos bakterijų agare diametrą [34]. Buvo tirtos P. Aeroginosa, S. Typhi, E. Coli, S. Aureus ir B. Subtilis padermės. Braziliškasis etanolinis propolio ekstraktas pasižymėjo S. Aureus, E. Coli ir Enterococcus sp. padermes slopinančiu poveikiu. Taip pat nustatyta, jog braziliškojo propolio flavonoidai pasižymi priešgrybeliniu efektyvumu, tirtos 3 Candida grybelių rūšys – Parapsilosis, Tropicalis ir Albicans [9]. Apibendrinant, skirtinguose propolio mėginiuose, skirtingų komponentų kombinacijos yra atsakingos už priešgrybelinį, antivirusinį ir antibakterinį farmakologinį poveikį. Todėl galima teigti, jog propolio farmakologinį poveikį nulemia komponentų mišinys, o ne konkretūs pavieniai komponentai.

1.4.3. Antioksidacinis propolio veiksmingumas

Propolis, tai potencialus natūralių antioksidantų, tokių kaip fenolinės rūgštys ir flavonoidai, šaltinis. Natūralūs antioksidantai mažina antioksidacinio streso padarinius, kurie sukelia įvairias ligas. Laisvieji radikalai oksiduoja ląstelių baltymus, nukleinines rūgštis ir lipidus. Jie sukelia ląstelių senėjimą, mutagenezę, karcinogenezę, bei įvairių ligų vystymąsi, tokių kaip diabetas, Alzheimerio liga, vėžys, aterosklerozė, Parkinsono liga. Taip pat, didėja kardiovaskuliarinių ligų rizika [9, 14, 56].

Polifenolių antioksidacinio poveikio mechanizmas grindžiamas šiais veiksmais[56, 57, 58, 59]:

 Aktyvių enzimų inhibavimu, dėl kurio sumažėja reaktyvių deguonies formų atsiradimas (ROS);

 Susijungimu į chelatus su metalų jonais, kurie dalyvauja laisvųjų radikalų susidarymo procese;

 Reaktyvių deguonies formų (RDF) suardymu, lipidų peroksidacijos reakcijų sutrikdimo;

 Sinergistinio veikimu su kitais antioksidantais.

Taigi, apibendrinant, propolio flavonoidų bei fenolinių rūgščių antioksidacinis aktyvumas gali padėti išvengti ląstelių senėjimo, mutagenezės, karcinogenezės ir įvairių ligų vystymosi, o jų poveikio mechanizmas grindžiamas aktyvių enzimų inhibavimu, susijungimu į chelatus su metalų jonais, RDF suardymu bei sinergistiniu veikimu su kitais antioksidantais.

1.4.4.Priešuždegiminis propolio veiksmingumas

Priešuždegiminis aktyvumas yra susijęs su sumažėjusia prostaglandino E2 (PGE2), tromboksano A2, Leukotrieno B4 ir azoto oksido, kurie dalyvauja uždegiminių procesų susidaryme, sinteze. Inhibuojama arachidono rūgšties transformacijų kaskada dėl fosfolipazės A2, lipooksigenzės (5-, 12-, 15-), ciklooksigenazės (COX-2), azoto oksido sintazės (iNOS) veikimo slopinimo[40]. Dėl didelio kiekio polifenolinių junginių sudėtyje, propolis pasižymi priešuždegiminiu aktyvumu, esant ūminiams ir lėtiniams uždegiminiams procesams [60]. Propolis mažina prostaglandinų E ir leukotrienų koncentraciją. Taip pat propolis mažina Interleukino IL1β sintezę (inhibuojant mRNA IL1β ir NO sintazę), kuris atsakingas už uždegimo atsiradimą ir sklidimą. Chrizinas, kamferolis, kvercetinas ir galanginas, flavonoidai, esantys propolyje, veikia mRNA ekspresiją [61, 62].

Vykdyti tyrimai su artrito modeliais žiurkėse, parodė, jog propolis veiksmingai veikia uždegimo simptomus, dėl prostaglandinų inhibicijos[35]. Propolis taip pat prisidėjo prie kepenų enzimų aktyvinimo, lipidų ir bilirubino kiekio reguliavimo, esant uždegiminiams procesams ir toksiniams pažeidimams kepenyse. Gautas poveikis, buvo susijęs su sumažėjusiu IL-6, TNF-α ir CRP kiekiu [10]. Taigi, propolis pasižymi priešuždegiminiu veikimu dėl didelio kiekio polifenolinių junginių savo sudėtyje, mažina prostaglandinų E ir leukotrienų koncentraciją, Interleukino IL1β sintezę.

1.4.5. Širdies ir kraujagyslių sistemos protekcijos veiksmingumas

Polifenoliniai junginiai, dažniausiai flavonoidai, stabilizuoja ir sustiprina kraujagysles. Vazoprotekcinis aktyvumas susijęs su chelatų sudarymu su vario jonais, kurie inhibuoja hialuronidazę, depolimerizuojama hialurono rūgštis ir hialuronidazė, kuri hidrolizuoja elastiną, dėl to stiprinamas kraujagyslių endotelis [10]. Kraujagyslių pralaidumas, taip pat, netiesiogiai mažinamas inhibuojant katecholaminų metabolizmą. Dėl to, jie gali būti naudojami kraujavimui, aterosklerozei, venų varikozei išvengti [10, 17].

Polifenoliai, taip pat, gerina koronarinę cirkuliaciją ir sukelią hipotenzinį poveikį, kuris greičiausiai atsiranda dėl jų cheminės struktūros panašumo į β-blokatorius [10]. Polifenoliai pagerina NO biologinį prieinamumą, padidindami endotelinio NO sintazės aktyvumą, o taip pat inhibuoja angiotenzino konvertazės fermentą, sukeliant vazodilatacinį poveikį, slopina trombocitų agregaciją ir mažina tromboksano koncentraciją [37]. Tyrimai atskleidė, jog puerarinas ir daidzeinas kraujagysles veikia kaip nitroglicerinas. Tai pasireiškia dėl AKF, cAMP ir ciklooksigenazės aktyvumo inhibavimo. Tuo tarpu, nustatyta, jog kvercetinas, trokserutinas ir rutinas inhibuoja trombocitų agregaciją efektyviau nei acetilsalicilo rūgštis tomis pačiomis dozėmis. Flavonoidai inhibuoja ksantino oksidazę, todėl teigiamai veikia kraujagyslių endotelį ir širdies raumenį. Slopinamas superoksido ir hidroksido laisvųjų radikalų susidarymas širdies išemijos metu [38, 39, 14].

Propolio flavonoidai kvercetinas, kamferolis ir ramnetinas blokuoja kalcio transportavimą per ląstelių membranas į citoplazmą, dėl to kraujagyslės išsiplečia ir sumažėja kraujo spaudimas. Dėl to, propolis yra naudojamas kraujotakos sistemos ligoms išvengti. Šis propolio poveikis buvo moksliškai įrodytas, pasitelkiant žiurkių modelius. Kardioprotekcinis poveikis buvo pasiektas, sukėlus eksperimentinę kardiomiopatiją žiurkėms, įvedant propolio ekstraktą intraperitoniniu būdu. Pagerėjo ne tik biocheminiai, bet ir histologiniai širdies raumens parametrai [10]. Taigi, polifenoliniai junginiai propolyje, stabilizuoja ir sustiprina kraujagysles, gerina koronarinę cirkuliaciją ir sukelią hipotenzinį poveikį.

1.4.6. Imunomoduliacinis propolio veiksmingumas

Tirtas Braziliškasis žaliasis propolis, tyrimo metu propolio etanolinis ekstraktas (200mg/kg) buvo duodamas pelėms 3dienas iš eilės, išanalizavus rezultatus, paaiškėjo, kad propolis sustiprino imunitetą, aktyvuodamas pagrindinius imuninio atsako etapus, reguliuojant TLR-2 ir TLR-4 ekspresiją ir pro-uždegiminius citokinų (IL-1 ir IL-6) produkciją, kas padeda atpažinti mikroorganizmus ir aktyvuotis limfocitams[41]. Braziliškasis propolis (2,5 ir 5mg/kg), taip pat, padidino vandenilio peroksido generaciją, dėl to mikroorganizmų inaktyvinimas tapo efektyvesnis[42]. Kitas atliktas bandymas su žmonėmis, kuriems 2 savaites buvo duodamos propolio kapsulės (500mg),

patvirtinoakivaizdų LPS-sukeltą citokinų (TNF, IL-1, IL-6 ir IL-8) sekrecijos padidėjimą periferiniame kraujyje [43]. Braziliškojo propolio flavonoidai (2.5, 5 ir 10mg/kg), taip pat, smarkiai inhibuoja splenocitų proliferaciją ir inicijuoja imunosupresinį limfoproliferacinio atsako poveikį [44]. Buvo patvirtinta, kad propolis slopina žmogaus periferinio kraujo mononukleininių ląstelių DNR sintezę ir išgrynina T ląsteles, tokį poveikį sukėlė kofeino rūgšties fenetilesteris ir flavonoidai (kvercetinas ir hesperidinas) esantys propolyje [11]. Taigi, propolis pasižymi imunomoduliaciniu veiksmingumu aktyvuodamas pagrindinius imuninio atsako etapus, taip pat padidindamas vandenilio peroksido generaciją.

1.5. Odos struktūra. Skvarbos į odą keliai.

1.5.1. Odos struktūra.

Žmogaus oda apsaugo organizmą nuo fizinių, cheminių, biologinių ir aplinkos faktorių [21]. Išoriniai faktoriai ir UV radiacija gali sukelti odos pakitimus, kurie pasireiškia oksidaciniu stresu, priešlaikiniu odos senėjimu bei odos vėžiu [19]. Nustatyta, jog fenolinės rūgštys ir flavonoidai gali veikti kaip UV blokatoriai, sumažinti uždegiminius procesus, oksidacinį stresą ir DNR pakitimus [20].Todėl svarbu išanalizuoti propolio flavonoidų, kurie pasižymi antioksidaciniu poveikiu, skvarbos į odą galimybes.

Oda sudaryta iš trijų pagrindinių sluoksnių –epidermio, dermos ir hipodermos [22]. Raginis sluoksnis (lot. Stratum Corneum), išorinis epidermio sluoksnis, sudarytas iš 10 – 25 negyvų, pailgų, pilnai keratinizuotų korneocitų, kurie yra įsiterpę į dvigubą lipidų sluoksnį [23]. Išorinį epidermio sluoksnį 40proc. sudaro baltymai, kurių 80proc. - keratinas [24]. Raginio sluoksnio lipidai daro įtaką pralaidumui, o jų kiekis ir rūšis priklauso nuo kūno vietos [25]. Vidinis epidermio sluoksnis sudarytas iš keratinocitų, melanocitų, langerhanso ir Merkelio ląstelių. Derma susideda iš kolegeno, elastino, glikozaminoglikanų bei fibroblastų [26]. Taigi, žmogaus oda apsaugo organizmą nuo įvairių žalingų aplinkos faktorių.

1.5.2. Skvarbos į odą keliai.

Oda – tai organizmo apsauginis barjeras, tačiau kai kurios medžiagos geba jį praeiti, todėl skvarbos per odą mechanizmai yra plačiai tyrinėjami [29]. Pagrindis skvarbos procesus stabdantis faktorius – tai lėta difuzija per raginį odos sluoksnį, kuris dar vadinamas „negyvuoju sluoksniu“ [27]. Raginio sluoksnio lipidai yra itin svarbūs barjerinei funkcijai palaikyti [28]. Egzistuoja trys pagrindiniai skvarbos keliai:

2. Transląstelinė difuzija per keratinocitus ir lipidų lameles; 3. Difuzija per plaukelių folikulus ir prakaito latakus [29].

Pakankama skvarba per odą yra pagrindinis faktorius, lemiantis sėkmingą fotoprotekcinį poveikį, todėl skvarba gali būti pagerinama naudojant atitinkamas skvarbą gerinančias medžiagas. Fotoprotekcinis propolio aktyvumas gali būti padidinamas išvystant efektyvią nešiklių sistemą, kuri perneštų reikalingą aktyvių komponentų kiekį į reikiamą odos vietą. Manoma, jog mikroemulsijos yra tinkama nešiklio sistema, kadangi veikia, kaip tirpiklis hidrofiliniams ir lipofiliniams junginiams [32]. Nustatyta, jog flavonoidų skvarbą per odą efektyviai gerina D- limonenas bei lecitinas, o hidrofilinių medžiagų, tokių kaip glicerolis, PEG400 ir PEG1500,egzistavimas tirpaleskvarbą mažina [30, 33]. Taigi, sudėtinga odos anatominė struktūra užtikrina apsaugą nuo aplinkos faktrių ir sudaro barjerą vaistinių medžiagų patekimui.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Bičių produkto propolio flavonoidai. Tyrimai atlikti su sausu, smulkintu propoliu. Propolio žaliavos gautos iš UAB „Apiproduktai“, Lietuva.

2.2. Naudoti reagentai ir tirpikliai

Išgrynintas vanduo, paruoštas Milipore vandens gryninimo sistema (Bedford, MA), acetonitrilas (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija), metanolis (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija), acto rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija), natrio chloridas (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija), natrio azidas (POCh, Gliwice, Lenkija), oleino rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija), D-limonenas (Alfa Aesar, United Kingdom), acetonas (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija).Ekstraktų gamybai naudoti ekstrahentai – išgrynintas vanduo bei maistinis rektifikuotas etilo alkoholis (etanolis) (AB ”Vilniaus degtinė“, Lietuva).

2.3. Įranga ir priemonės

Svarstyklės Scaltec SBC 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija), Agilent 1260 Infinity kapiliarinis skysčių chromatografas (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) su diodų matricos detektoriumi, Bronaugh tipo pratakios difuzinės celės (skvarbos į odą ex vivo sistema), ultragarso vonelė (DT 156, Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlynas, Vokietija).

2.4. Propolio ekstraktų paruošimas

Etanolinis propolio ekstraktas pagamintas naudojant 96proc. maistinį rektifikuotą etilo

alkoholį (etanolį), žaliavos – ekstrahento santykis 1:50. Etanolinės propolio ištraukos gamyba vykdyta, maišant 1val. ant magnetinės maišyklės (IKA-Werke GmbH & Co.KG, Staufen, Vokietija) kambario temperatūroje. Maišymo greitis – 150 aps./min. Pagamintos etanolinės propolio ištraukos iš propolio žaliavos filtruotos pro membraninį filtrą(Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Vokietija).

Vandeninis propolio ekstraktas pagamintas 70°C temperatūroje iš propolio žaliavos,

naudojant išgrynintą vandenį, žaliavos-ekstrahento santykis 1:50. Vandeninės propolio ištraukos gamyba vykdyta, maišant 1 val. ant magnetinės maišyklės IKAMAG® C-MAG HS7 (IKA-Werke GmbH & Co.KG, Staufen, Vokietija). Maišymo greitis – 150 aps./min. Pagamintos vandeninės propolio ištraukos filtruotos pro membraninį filtrą (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Vokietija).

2.5. Propolio ekstraktų analizė chromatografiniais metodais

Siekiant atlikti propolio ištraukų kiekybinę ir kokybinę analizę, naudotas laboratorijoje įdiegtas ir validuotas chromatografinis metodas, pritaikytas lietuviškojo propolio ištraukų analizei.

Kolonėlė ReproSil-Pur Basic C18-HD

Kolonėlės parametrai 250 x 0,5 mm, dalelių dydis – 5 μm Kolonėlės

temperatūra

25°C

Eliuentai A – 0,5% vandeninis acto rūgšties tirpalas

B – acetonitrilas

Gradientas 0–15 min. 30–33% B

15–25 min. 33–36% B 25–55 min. 36–55% B

Vieno mėginio analizės trukmė – 60 min.

Tekėjimo greitis 10 μl/min.

Injekcijos tūris 0,2 μl

Detekcija λ = 320 nm

Tyrimas atliktas naudojant Agilent 1260 Infinity kapiliarinį skysčių chromatografą su diodų matricos detektoriumi. Fenolinių junginų atskyrimui naudota ReproSil-Pur Basic C18-HD kolonėlė (250 x 0,5mm, dalelių dydis 5μm)su C18 5μm prieškolone. Judri fazė sudaryta iš 0,5 proc. vandeninio acto rūgšties tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Injekcijos tūris 0,2 μl, tėkmės greitis – 10 μl/min. Kolonėlės temperatūra – 25°C. Fenolinių junginių smailių integravimas atliktas esant 320 nmbangos ilgiui. Visi mėginiai filtruojami pro 0,20 μm nailoninius membraninius švirkštų filtrus (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Vokietija).

2.6. Propolio flavonoidų skvarbos į odą ex vivo tyrimai

Propolio flavonoidų skvarbos į odą ex vivo tyrimai buvo atlikti, naudojant žmogaus odos pavyzdžius, kurie gauti iš Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Plastinės ir rekonstrukcinės

chirurgijos klinikos. Gauta oda buvo laikoma šaldiklyje, kuriame palaikoma -20 °C temperatūra, ne ilgiau kaip 6 mėnesius. Tyrimui įvykdyti būtinas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas.

Siekiant įvertinti propolio flavonoidų skvarbą į odą, atliktas tyrimas, pasitelkiant Bronaugh tipo pratakias difuzines celes. Jos patalpinamos ant specialaus metalinio bloko, kuriame cirkuliuojantis vanduo, naudojant cirkualiacinę vandens vonelę Grant GD120, palaiko 37°C temperatūrą.Naudotos akceptorinės terpės – 0,9proc. natrio chloridas su 0,005proc. konservantu natrio azidu, cirkuliavimo greitis – 0,6ml/min, difuzijos plotas celėse – 0,64 cm2.Cirkuliavimas po odos mėginiais užtikrintas pasitelkiant Masterflex L/S peristaltinį siurblį su daugiakanale siurblio galva (Cole - Parmer Instrument Co.).

9. Lentelė. Flavonoidų skvarbos į odą tyrimas.

Membrana Etanolinis flavonoidų

standartų tirpalas

Etanolinė propolio ištrauka (Širvintų rajonas)

Sveika oda flavonoidai flavonoidai

Oda su pašalintu raginiu sluoksniu

flavonoidai -

Oda su pašalintais raginio sluoksnio riebaliniais

komponentais

flavonoidai -

Sveika oda paveikta oleino rūgštimi

flavonoidai flavonoidai

Sveika oda paveikta D-limonenu - flavonoidai

Membranos paruošimas:

 Atšildyta žmogaus oda įvertinama vizualiniu būdu, įsitikinama, jog nėra pažeidimų, pašalinami poodinio sluoksnio riebalai, nukarpomi odos plaukeliai;

 Oda supjaustoma/sukarpoma iki tinkamo dydžio ir dedama į difuzines celes;

 Ekvilibracijos metu po oda cirkuliuoja 0,9 proc. natrio chlorido su 0,005 proc. natrio azido (konservanto) tirpalo mišinys;

 Visas ekvilibracijos procesas trunka 30min.

Vandeninė propolio ištrauka

Atlikus ekvilibraciją, ant odos mėginių, difuzinėse celėse,talpinamas mėginys su teorine begaline donorinės fazės doze: 500 μl vandeninės propolio ištraukos. Propolio skvarbos į odą ex vivo tyrimų trukmė 24val.

Odos mėginių paruošimas analizei:

 Vandeninė propolio ištrauka nuimama nuo odos mėginių difuzinėse celėse;

 Odos paviršius nuplaunamas 5 kartus 96 proc. etanoliu ir 5 kartus 0,9 proc. natrio chlorido tirpalu, nusausinamas;

 Iškerpami 0,64 cm2

ploto odos gabalėliai;

 Epidermio sluoksnis atskiriamas nuo dermos, naudojant „sauso karščio“ metodą (odos gabalėliai 1-2 sekundėms priglaudžiami prie įkaitintos metalinės mentelės (apie 60 °C), epidermis nuo dermos atskiriamas pincetu);

Atskirti odos sluoksniai ekstrahuoti 1 ml grynu metanoliu, naudojant Bandelin Sonorex Digitec ultragarso vonelę. Ekstrakcija vyksta 30min.

Vandeninėpropolio ištrauka kartu su 96 etanolio nuoplovomis, kurios perkeltos nuo odos paviršiaus difuzinėse celėse į 10ml matavimo kolbą, skiedžiami 96 proc. etanoliu. Mėginiai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Etanolinė propolio ištrauka ir etanolinis propolio flavonoidų standartų mišinys

Atlikus ekvilibraciją, ant odos mėginių, difuzinėse celėse,talpinamas mėginys su teorine begaline donorinės fazės doze: 500 μl etanolinės propolio ištraukos/etanolinio propolio flavonoidų standartų mišinio.

1. Etanolinis flavonoidų standartų mišinys;

2. Etanolinis flavonoidų standartų mišinys, kartu su oleino rūgštimi; 3. Etanolinės propolio ištraukos mėginys;

4. Etanolinė propolio ištrauka, kartu su oleino rūgštimi; 5. Etanolinė propolio ištrauka, kartu su D-limonenu. Propolio skvarbos į odą ex vivo tyrimų trukmė 24val.

Odos mėginių paruošimas analizei:

 Etanolinės propolio ištraukos bei etanolinis propolio flavonoidų standartų mišinys, nuimami nuo odos mėginių difuzinėse celėse;

 Odos paviršius nuplaunamas 5 kartus 96 proc. etanoliu ir 5 kartus 0,9 proc. natrio chlorido tirpalu, nusausinamas;

 Iškerpami 0,64 cm2

 Epidermio sluoksnis atskiriamas nuo dermos, naudojant „sauso karščio“ metodą (odos gabalėliai 1-2 sekundėms priglaudžiami prie įkaitintos metalinės mentelės (apie 60 °C), epidermis nuo dermos atskiriamas pincetu);

 Atskirti odos sluoksniai ekstrahuoti 1 ml grynu metanoliu, naudojant Bandelin Sonorex Digitec ultragarso vonelę. Ekstrakcija vyksta 30min.

Etanolinė propolio ištrauka bei etanolinis propolio flavonoidų standartų mišinys, kartu su 96 etanolio nuoplovomis, kurios perkeltos nuo odos paviršiaus difuzinėse celėse į 10ml matavimo kolbą, skiedžiami 96proc. etanoliu. Mėginiai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Flavonoidų ekstrakcijos išgava iš odos:

 Po epidermio ir dermos sluoksnių atskyrimo, taikant „sausojo karščio“ metodą, ant kiekvieno odos sluoksnio užpilama po 1ml metanolinio tirpalo ir laikoma 1val. kambario temperatūroje;

 Po 1val. metanolinis tirpalas nuimamas, odos sluoksniai nusausinami;

 Atliekama epidermio ir dermos sluoksnių ekstrakcija, naudojant 1 ml gryno metanolio bei ultragarso vonelę. Ekstrakcija vykdoma 30min.

 Metanolinis tirpalas ir ekstraktai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Siekiant patvirtinti odos raginio sluoksnio barjerinę funkciją ir poveikį flavonoidų skvarbai į gilesnius odos sluoksnius, atliktas tyrimas ir su pašalintu raginiu odos sluoksniu. Odos gabaliukai priglaudžiami prie lipnių juostelių 25 kartus ir taip pašalinamas raginis odos sluoksnis.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Flavonoidų analizė chromatografiniais metodais.

Atlikus propolio flavonoidų analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ir įvertinus gautus rezultatus, didžiausias flavonoidų kiekis buvo rastas Vilniaus apskrityje, Širvintų rajone – 100 mg/g, po jo sekė Marijampolė – 100,08 mg/g, Mažeikiai – 98,75 mg/g, Skuodas – 93,01 mg/g, Pasvalys – 92,45 mg/g, Molėtai – 86,93 mg/g, Biržai – 84,15 mg/g, Alytus – 82,22 mg/g, Ignalina – 78,62 mg/g, Varėna 74,85 mg/g, Klaipėda 74,78 mg/g, Vilnius – 74,47 mg/g, Kupiškis – 65,67 mg/g, Šakiai – 61,05 mg/g, Anykščiai – 59,70 mg/g, mažiausias flavonoidų kiekis rastas Marijampolės apskrityje, Vilkaviškio rajone – 38,99 mg/g (10 Lentelė).

10 Lentelė. Suminis flavonoidų kiekis skirtingų Lietuvos regionų propolio pavyzdžiuose.

Miestas Flavonoidų kiekis mg/g Flavonoidų kiekis procentais*

Širvintai 100,82 ± 19,59 127% Marijampolė 100,08 ± 14,80 126% Mažeikiai 98,75 ± 7,84 125% Skuodas 93,01 ± 7,64 117% Pasvalys 92,45 ± 6,28 117% Molėtai 86,93 ± 3,71 110% Biržai 84,15 ± 11,40 106% Alytus 82,22 ± 4,13 104% Ignalina 78,62 ± 14,70 99% Varėna 74,85 ± 3,77 95% Klaipėda 74,78 ± 6,70 94% Vilnius 74,47 ± 6,34 94% Kupiškis 65,67 ± 1,50 83% Šakiai 61,05 ± 4,64 77% Anykščiai 59,7 ± 0,97 75% Vilkaviškis 38,99 ± 0,49 49% Vidutinis kiekis 79,16 100%

*flavonoidų kiekis procentais, atsižvelgiant į Lietuvos regionųvidutinį kiekį

Apibendrinus gautus rezultatus, nustatyta, jog flavonoidų (apigenino, kamferolio, chrizino, pinocembrino, galangino) bendro, visų aukščiau išvardintų regionų, suminio kiekio vidurkis yra 79,16 mg/g, o standartinio nuokrypio vidurkis 7,16 (10 Lentelė). Įvertinus lentelėje pateiktus duomenis, propolio ištraukų flavonoidų kiekis iš Alytaus, Biržų, Molėtų, Pasvalio, Skuodo, Mažeikių, Marijampolės bei Širvintų viršijo Lietuvos vidurkį. Propolio flavonoidų ištraukoje iš Alytaus miesto, flavonoidų buvo nustatyta 4 proc. daugiau nei vidutinis flavonoidų kiekis Lietuvoje, iš Biržų – 6 proc. daugiau, iš Molėtų – 10 proc. daugiau, iš Pasvalio bei Skuodo – 17 proc. daugiau, iš Mažeikių – 25

proc. daugiau, iš Marijampolės 26 proc. daugiau ir iš Širvintų – 27 proc. daugiau, nei vidutinis flavonoidų kiekis Lietuvoje.

Tuo tarpu propolio flavonoidų ištraukose iš Ignalinos, Varėnos, Klaipėdos, Vilniaus, Kupiškio, Šakių, Anykščių bei Vilkaviškio, suminis flavonoidų kiekis buvo mažesnis nei Lietuvos vidurkis. Ištraukose iš Ignalinos, flavonoidų kiekis buvo 1 proc. mažesnis nei Lietuvos vidurkis, iš Varėnos – 5 proc., iš Klaipėdos bei Vilniaus – 6 proc., iš Kupiškio – 17 proc., iš Šakių – 23 proc., iš Anykščių – 25 proc., iš Vilkaviškio – 51 proc.

11 Lentelė. Suminis flavonoidų kiekis skirtingų Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose.

Apskritis Miestas Flavonoidų

kiekis mg/g Flavonoidų kiekio vidurkis mg/g Flavonoidų kiekis procentais

Klaipėdos apskritis Klaipėda 74,78 ± 6,70 83,90 103%

Skuodas 93,01 ± 7,64

Telšių apskritis Mažeikiai 98,75 ± 7,84 98,75 121%

Panevėžio apskritis Kupiškis 65,67 ± 1,50 80,76 99% Biržai 84,15 ± 11,40 Pasvalys 92,45 ± 6,28 Utenos apskritis Ignalina 78,62 ± 14,70 75,08 92% Anykščiai 59,7 ± 0,97 Molėtai 86,93 ± 3,71

Vilniaus apskritis Vilnius 74,47 ± 6,34 87,65 107%

Širvintai 100,82 ± 19,59 Marijampolės apskritis Vilkaviškis 38,99 ± 0,49 66,71 82% Šakiai 61,05 ± 4,64 Marijampolė 100,08 ± 14,80

Alytaus apskritis Varėna 74,85 ± 3,77 78,54 96%

Alytus 82,22 ± 4,13

Vidutinis kiekis - - 81,62 100%

*flavonoidų kiekis procentais, atsižvelgiant į Lietuvos apskričių vidutinę reikšmę

Įvertinus lentelėje pateiktus duomenis, flavonoidų kiekis svyravo skirtingose apskrityse (11 Lentelė). Klaipėdos, Telšių bei Vilniaus apskrityse, flavonoidų kiekis buvo didesnis nei nacionalinis vidurkis, o Panevėžio, Utenos, Marijampolės bei Alytaus apskrityse – mažesnis, nei nacionalinis vidurkis. Išanalizavus apskritis, kuriose flavonoidų kiekis buvo didesnis nei Lietuvos vidurkis, įvertinta, jog Telšių apskrityje flavonoidų vidurkis viršijo nacionalinį vidurkį 21 proc., Vilniaus apskrityje – 7 proc., o Klaipėdos apskrityje – 3 proc. Kitose apskrityse, flavonoidų kiekis buvo mažesnis, nei nacionalinis vidurkis. Panevėžio apskrityje flavonoidų kiekis buvo 1 proc. mažesnis, nei Lietuvos vidurkis, Alytaus apskrityje – 4 proc., Utenos apskrityje – 8 proc., Marijampolės apskrityje – 18 proc.

Flavonoidų skvarbos į odą tyrimui pasirinkti penki flavonoidai, kurie dažnai aptinkami vidutinėse platumose, Europoje. Tai apigeninas, kamferolis, chrizinas, pinocembrinas, galanginas. Bulgarijos mokslininkė Bankova, savo straipsnyje rašė apie 7 identifikuotus flavonoidus propolyje iš Bulgarijos –Kamferolį, Chriziną, Tektochriziną, Kvercetiną, Pinocembriną, Galanginą, Izoramnetiną [63].Lenkijos mokslininkai, atlikę propolio, surinkto pietų Lenkijoje, masių spektrofotometrijos analizę, identifikavodevynis flavonoidus - Tektochriziną, Pinocembriną, Chriziną, Galanginą, Genkvaniną, Apigeniną, Kamferolį [64] ir kt.

12. Lentelė. Skirtingų flavonoidų kiekis Lietuvos apskričių pavyzdžiuose.

Apskritis Flavonoidas Min nustatytas kiekis mg/g Max nustatytas kiekis mg/g Vidutinis kiekis SN Klaipėdos apskritis Apigeninas 0,89 1,16 1,03 0,19 Kamferolis 2,84 4,71 3,78 1,32 Chrizinas 2,55 3,68 3,12 0,80 Pinocembrinas 61,27 76,03 68,65 10,44 Galanginas 7,22 7,43 7,33 0,15 Telšių apskritis Apigeninas 0,95 0,95 0,95 0,00 Kamferolis 2,99 2,99 2,99 0,00 Chrizinas 2,98 2,98 2,98 0,00 Pinocembrinas 80,39 80,39 80,39 0,00 Galanginas 11,44 11,44 11,44 0,00 Panevėžio apskritis Apigeninas 0,50 0,85 0,68 0,25 Kamferolis 3,15 3,68 3,42 0,37 Chrizinas 0,91 3,67 2,29 1,95 Pinocembrinas 52,56 76,65 64,61 17,03 Galanginas 6,06 8,72 7,39 1,88 Utenos apskritis Apigeninas 0,83 1,16 1,00 0,23 Kamferolis 2,95 4,35 3,65 0,99 Chrizinas 2,13 5,52 3,83 2,40 Pinocembrinas 48,13 71,01 59,57 16,18 Galanginas 5,29 6,7 6,00 1,00 Vilniaus apskritis Apigeninas 0,70 0,81 0,76 0,08 Kamferolis 3,26 4,29 3,78 0,73 Chrizinas 3,25 7,3 5,28 2,86 Pinocembrinas 60,20 78,43 69,32 12,89 Galanginas 6,03 11,02 8,53 3,53

Apskritis Flavonoidas Min nustatytas kiekis mg/g Max nustatytas kiekis mg/g Vidutinis kiekis SN Marijampolės apskritis Apigeninas 0,58 1,02 0,80 0,31 Kamferolis 2,55 4,27 3,41 1,22 Chrizinas 2,24 7,82 5,03 3,95 Pinocembrinas 25,73 80,38 53,06 38,64 Galanginas 3,45 7,44 5,45 2,82 Alytaus apskritis Apigeninas 1,03 2,42 1,73 0,98 Kamferolis 2,83 8,78 5,81 4,21 Chrizinas 5,16 5,2 5,18 0,03 Pinocembrinas 54,16 65,22 59,69 7,82 Galanginas 4,29 7,97 6,13 2,60

Remiantis lentelėje pateiktais duomenimis, nustatytos konkrečių flavonoidų kiekio svyravimo ribos, vidutinis flavonoidų kiekis bei standartinis nuokrypis (12 Lentelė).

Flavonoido apigenino didžiausias kiekis buvo aptiktas propolio pavyzdžiuose iš Alytaus apskrities – 1,16 mg/g, mažiausias kiekis aptiktas Panevėžio apskrityje – 0,50 mg/g. Didžiausias apigenino kiekio standartinis nuokrypis gautas vertinant propolio pavyzdžius iš Alytaus apskrities – 0,98, o mažiausias – Telšių apskrities.

Vertinant flavonoido kamferolio rezultatus, matyti, jog daugiausia šio flavonoido aptikta propolio pavyzdžiuose iš Alytaus apskrities – 8,78 mg/g, mažiausi šio flavonoido kiekiai aptikti propolio pavyzdžiuose iš Marijampolės apskrities – 2,55 mg/g. Vertinant didžiausią kamferiolio kiekio standartinį nuokrypį skirtingose apskrityse, gauti rezultatai rodo, jog jis buvo didžiausias Alytaus apskrityje – 4,21.

Chrizino didžiausias kiekis aptiktas propolio pavyzdžiuose iš Marijampolės apskrities – 7,82 mg/g, mažiausias kiekis – Panevėžio apskrityje – 0,91 mg/g. Didžiausi kiekio rezultatų nuokrypiai, gauti Marijampolės apskrityje, SN – 3,95.

Vertinant flavonoido pinocembrino kiekį propolio pavyzdžiuose, daugiausiai jo gauta iš pavyzdžių, surinktų Telšių apskrityje – 80,39 mg/g, mažiausiai – Marijampolės apskrityje – 25,73 mg/g. Šio flavonoido kiekių svyravimo ribos buvo didžiausios Marijampolės apskrityje, SN – 38,64.

Didžiausi flavonoido galangino kiekiai propolio pavyzdžiuose, gauti iš Telšių apskrities propolio pavyzdžių – 11,44 mg/g, o mažiausi iš Marijampolės apskrities propolio pavyzdžių – 3,45 mg/g. Vertinant standartinį nuokrypį, jis buvo didžiausias Vilniaus apskrities propolio pavyzdžių, galangino kiekio rezultatuose – 3,53.

13. Diagrama. Flavonoido apigenino kiekio svyravimas skirtingų Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose.

Remiantis diagramoje pavaizduotais duomenimis (13 Diagrama), flavonoido apigenino kiekio svyravimas daugelyje apskričių buvo nežymus, išskyrus Alytaus apskritį, kur skirtumas tarp minimalaus ir maksimalaus aptikto apigenino kiekio buvo didesnis nei 2 kartus (minimalus kiekis – 1,03 mg/g, o maksimalus kiekis – 2,42 mg/g). Vertinant gautus duomenis, galima teigti, jog flavonoido apigenino pasiskirstymas daugelyje Lietuvos apskričių (Klaipėdos, Telšių, Panevėžio, Utenos, Vilniaus, Marijampolės apskritys) yra panašus, kiekio svyravimai tarp minimalaus ir maksimalaus apskrityje aptikto apigenino kiekio buvo nežymūs, todėl galima teigti, jog flavonoidas apigeninas yra būdingas flavonoidas propolio mėginiuose iš įvairių Lietuvos apskričių.

14. Diagrama. Flavonoido kamferolio kiekio svyravimas skirtingų Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Apigeninas Apigeninas Apigeninas Apigeninas Apigeninas Apigeninas Apigeninas

Klaipėdos apskritis

Telšių apskritis Panevėžio apskritis Utenos apskritis Vilniaus apskritis Marijampolės apskritis Alytaus apskritis

Apigenino kiekio skirtumai įvairių Lietuvos

apskričių propolio pavyzdžiuose

Min nustatytas kiekis mg/g Max nustatytas kiekis mg/g

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Kamferolis Kamferolis Kamferolis Kamferolis Kamferolis Kamferolis Kamferolis

Klaipėdos apskritis

Telšių apskritis Panevėžio

apskritis

Utenos apskritis Vilniaus apskritis Marijampolės apskritis

Alytaus apskritis

Kamferolio kiekio skirtumai įvairių Lietuvos

apskričių propolio pavyzdžiuose

Vertinant diagramoje pavaizduotus duomenis (14 Diagrama), flavonoido kamferolio kiekio svyravimas daugelyje apskričių buvo nežymus, išskyrus Alytaus apskritį, kur skirtumas tarp minimalaus ir maksimalaus aptikto kamferolio kiekio buvo didesnis nei 3 kartus (minimalus kiekis – 2,83 mg/g, o maksimalus kiekis – 8,78 mg/g). Remiantis gautais duomenimis, galima teigti, jog flavonoido kamferolio pasiskirstymas daugelyje Lietuvos apskričių (Klaipėdos, Telšių, Panevėžio, Utenos, Vilniaus, Marijampolės apskritys) yra panašus, kiekio svyravimai tarp minimalaus ir maksimalaus apskrityje aptikto kamferolio kiekio buvo nežymūs, todėl galima teigti, jog flavonoidas kamferolis yra būdingas flavonoidas Lietuviškame propolyje.

15. Diagrama. Flavonoido chrizino kiekio svyravimas skirtingų Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose.

Remiantis diagramoje pavaizduotais duomenimis (15 Diagrama), flavonoido chrizino kiekio svyravimas Telšių ir Alytaus apskrityse buvo nežymus (Telšių apskrityje minimalus bei maksimalus chrizino kiekis propolio pavyzdžiuose buvo 2,98 mg/g, o Alytaus apskrityje – minimalus kiekis siekė 5,16 mg/g, maksimalus – 5,20 mg/g). Klaipėdos apskrityje didelių svyravimų taip pat neaptikta, minimalus chrizino kiekis propolio pavyzdžiuose buvo 2,55 mg/g, o maksimalus – 3,68 mg/g. Kitose apskrityse, kurių propolio pavyzdžiai buvo analizuojami, chrizino kiekiai pastebimai svyravo. Panevėžio apskrityje, chrizino kiekis tarp minimalaus ir maksimalaus aptikto kiekio, skyrėsi daugiau nei 4 kartus (minimalus chrizino kiekis – 0,91 mg/g, o maksimalus – 3,67 mg/g). Utenos apskrityje chrizino kiekiai taip pat pastebimai svyravo, skirtumas tarp minimalaus ir maksimalaus kiekio buvo didesnis nei 2 kartai (minimalus aptiktas chrizino kiekis buvo 2,13 mg/g, o maksimalus - 5,52 mg/g).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Chrizinas Chrizinas Chrizinas Chrizinas Chrizinas Chrizinas Chrizinas

Klaipėdos apskritis

Telšių apskritis Panevėžio

apskritis

Utenos apskritis Vilniaus apskritis Marijampolės apskritis

Alytaus apskritis

Chrizino kiekio skirtumai įvairių Lietuvos apskričių

propolio pavyzdžiuose

Vilniaus apskrities propolio pavyzdžiuose chrizino kiekis svyravo tarp 3,25 mg/g ir 7,3 mg/g (skirtumas didesnis nei 2 kartai). Marijampolės apskrities propolio pavyzdžiuose chrizino kiekis svyravo daugiau nei 3 kartus (minimalus chrizino kiekis – 2,24 mg/g, o maksimalus – 7,82 mg/g). Vertinant chrizino kiekio svyravimus skirtingose Lietuvos apskrityse, galima daryti prielaidą, jog chrizinas yra aptinkamas vakarų Lietuvos propolio pavyzdžiuose.

16. Diagrama. Flavonoido pinocembrino kiekio svyravimas skirtingų Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose.

Vertinant diagramoje pavaizduotus duomenis (16 Diagrama), flavonoido pinocembrino mažiausias kiekio svyravimas pastebėtas Klaipėdos, Telšių ir Alytaus apskrityse. Klaipėdos apskrityje minimalus aptiktas pinocembrino kiekis buvo 61,27 mg/g, o maksimalus – 76,03 mg/g (skirtumas 1,24 kartai). Propolio pavyzdžiuose iš Telšių apskrities, minimalus ir maksimalus aptiktas pinocembrino kiekis nesiskyrė – 80,39 mg/g. Alytaus apskrityje pinocembrino kiekis svyravo 1,20 kartų (minimalus aptiktas pinocembrino kiekis buvo 54,16 mg/g, o maksimalus – 65,22 mg/g). Kitų apskričių propolio pavyzdžiuose, pinocembrino kiekis pastebimai svyravo. Panevėžio apskrityje, pinocembrino kiekis skyrėsi beveik 1,5 karto (minimalus pinocembrinio kiekis – 52,56 mg/g, maksimalus - 76,65 mg/g). Utenos apskrities propolio pavyzdžiuose, pinocembrino minimalus kiekis buvo 48,13 mg/g, o maksimalus – 71,01 mg/g (skirtumas beveik 1,5 karto). Vilniaus apskrityje flavonoido pinocembrino kiekis propolio pavyzdžiuose skyrėsi 1,3 karto (minimalus aptiktas pinocembrino kiekis siekė – 60,20 mg/g, o maksimalus – 78,43 mg/g). Pinocembrino kiekis Marijampolės apskrityje skyrėsi daugiau kaip

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Pinocembrinas Pinocembrinas Pinocembrinas Pinocembrinas Pinocembrinas Pinocembrinas Pinocembrinas

Klaipėdos apskritis

Telšių apskritis Panevėžio

apskritis

Utenos apskritis Vilniaus apskritis Marijampolės apskritis

Alytaus apskritis

Pinocembrino kiekio skirtumai įvairių Lietuvos

apskričių propolio pavyzdžiuose

3 kartus (minimalus kiekis siekė – 25,73 mg/g, o maksimalus – 80,38 mg/g). Vertinant rezultatus, galima teigti, jog propoliui iš vakarų Lietuvos apskričių, būdingoje sudėtyje yra pinocembrino.

17. Diagrama. Flavonoido galangino kiekio svyravimas skirtingų Lietuvos apskričių propolio pavyzdžiuose.

Remiantis diagramoje pavaizduotais duomenimis (17 Diagrama), flavonoido galangino kiekio svyravimas Telšių ir Klaipėdos apskrityse buvo nežymus (Telšių apskrityje minimalus bei maksimalus galangino kiekis propolio pavyzdžiuose buvo 11,44 mg/g, o Klaipėdos apskrityje – minimalus kiekis siekė 7,22 mg/g, maksimalus – 7,43 mg/g). Kitose apskrityse, kurių propolio pavyzdžiai buvo analizuojami, galangino kiekiai pastebimai svyravo. Panevėžio apskrityje, galangino kiekis tarp minimalaus ir maksimalaus aptikto kiekio, skyrėsi beveik 1,5 karto (minimalus galangino kiekis – 6,06 mg/g, o maksimalus – 8,72 mg/g). Utenos apskrityje galangino kiekiai taip pat pastebimai svyravo, skirtumas tarp minimalaus ir maksimalaus kiekio buvo apie 1,27 kartai (minimalus aptiktas galangino kiekis buvo 5,29 mg/g, o maksimalus – 6,70 mg/g). Vilniaus apskrities propolio pavyzdžiuose galangino kiekis svyravo tarp 6,03 mg/g ir 11,02 mg/g (skirtumas beveik 2 kartai). Marijampolės apskrities propolio pavyzdžiuose galangino kiekis svyravo daugiau nei 3 kartus (minimalus galangino kiekis – 3,45 mg/g, o maksimalus –7,44 mg/g). Alytaus apskrityje minimalus ir maksimalus galangino kiekis skyrėsi beveik 2 kartus (minimalus galangino kiekis – 4,29 mg/g, maksimalus – 7,97 mg/g). Vertinant galangino kiekio svyravimus skirtingose Lietuvos apskrityse, galima daryti prielaidą, jog galanginas yra aptinkamas vakarų Lietuvos propolio pavyzdžiuose.

0 2 4 6 8 10 12 14

Galanginas Galanginas Galanginas Galanginas Galanginas Galanginas Galanginas

Klaipėdos apskritis

Telšių apskritis Panevėžio

apskritis

Utenos apskritis Vilniaus apskritis Marijampolės apskritis

Alytaus apskritis

Galangino

kiekio skirtumai įvairių Lietuvos apskričių

propolio pavyzdžiuose