LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
GINTARĖ ŽILVYTĖ
CELIULIOZINIŲ HIDROGELIŲ SU VANDENINE PROPOLIO IŠTRAUKA
MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Modestas Žilius
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
CELIULIOZINIŲ HIDROGELIŲ SU VANDENINE PROPOLIO IŠTRAUKA
MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Lekt. dr. Modestas Žilius Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Gintarė Žilvytė Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Gelių charakteristika ... 12
1.2. Hidrogelių charakteristika ... 14
1.3. Celiuliozinių hidrogelių charakteristika ... 16
1.4. Celiuliozinius hidrogelius sudarančių medžiagų charakteristika ... 18
1.5. Propolio charakteristika ir modeliuojamos pusiau kietos sistemos su juo ... 22
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1. Tyrimų medžiagos ir įranga ... 24
2.1.1. Naudotos medžiagos ... 24
2.1.2. Naudota įranga ... 24
2.2. Tyrimų metodai ... 25
2.2.1. Vandeninės propolio ištraukos gamyba ... 25
2.2.2. Propolio vandeninės ištraukos analizė efektyviąja skysčių chromatografija ... 25
2.2.3. Fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumo tyrimas ... 26
2.2.4. Eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių gamyba ... 26
2.2.5. Eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių fizikinių savybių vertinimas ... 27
2.2.6. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių tyrimas in vitro ... 27
2.2.7. Statistinis duomenų vertinimas ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Propolio vandeninės ištraukos kokybinės ir kiekybinės sudėties vertinimas ... 29
3.2. Fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumo vertinimas vandeniniuose 1,2 – propandiolio tirpaluose 29 3.3. Celiuliozinių hidrogelių klampos ir pH vertinimas ... 30
3.4. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių tyrimo in vitro vertinimas ... 33
3.5. Celiuliozinių hidrogelių su vandenine propolio ištrauka optimizavimas ... 41
3.6. Celiuliozinių hidrogelių tyrimų in vitro apibendrinimas ... 46
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 50
SANTRAUKA
CELIULIOZINIŲ HIDROGELIŲ SU VANDENINE PROPOLIO IŠTRAUKA
MODELIAVIMAS IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS
G. Žilvytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas lekt. dr. Modestas Žilius; Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos Katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: Sumodeliuoti celiuliozinius hidrogelius su vandenine propolio ištrauka,
eksperimentinius hidrogelius optimizuoti ir pagrįsti jų kokybę biofarmaciniais tyrimais.
Darbo uždaviniai: Pagaminti vandeninį propolio ekstraktą ir įvertinti jo kokybinę ir kiekybinę sudėtį;
pagaminti celiuliozinius hidrogelius su vandenine propolio ištrauka ir įvertinti jų kokybę, nustatant dinaminės klampos, pH reikšmes, fenolinių junginių atpalaidavimą in vitro; optimizuoti celiuliozinius hidrogelius su vandenine propolio ištrauka ir įvertinti optimalios sudėties kokybę, nustatant dinaminės klampos, pH reikšmes, fenolinių junginių atpalaidavimą in vitro.
Metodai: Propolio fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui naudotas validuotas ESC
metodas. Hidrogelių dinaminė klampa matuota kambario temperatūroje, naudojant vibracinį viskozimetrą, pH reikšmei nustatyti naudotas pH–metras. Atpalaidavimo tyrimai in vitro atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes.
Rezultatai: Sumodeliuotų celiuliozinių hidrogelių su vandenine propolio ištrauka pH reikšmės buvo
intervale 4,2±0,04–6,07±0,01. Dinaminės klampos reikšmės varijavo nuo 0,14±0,02 Pa·s iki > 11 Pa·s. Standžios konsistencijos hidrogeliai gauti naudojant tokias gelifikuojančių medžiagų koncentracijas: 5 proc. KMC–Na, 11 proc. HEC, 13 proc. HPMC, 17 proc. MC. Daugiausiai fenolinių junginių atpalaidavo 11 proc. HEC hidrogelis (56,43 µg/cm2), lyginant su standžios konsistencijos hidrogeliais su viena gelifikuojančia medžiaga. Iš skystos konsistencijos hidrogelių – daugiausiai fenolinių junginių atpalaidavo 7 proc. HPMC ir 6 proc. HEC hidrogeliai, atitinkamai 85,14 µg/cm2 ir 81,98 µg/cm2. Iš
optimalios sudėties celiuliozinio hidrogelio fenolinių junginių atsipalaidavo 72,12±2,71 µg/cm2 t. y.
148–162 proc. daugiau, lyginant su standžios konsistencijos atskirų optimalios sudėties komponentų hidrogeliais: 5 proc. KMC–Na ir 13 proc. HPMC.
Išvados: Sumodeliuoti celiulioziniai hidrogeliai su vandenine propolio ištrauka yra tinkami užnešti ant
odos. Daugiausiai fenolinių junginių atpalaiduoja skystos konsistencijos hidrogeliai. Iš optimalios sudėties hidrogelio atsipalaidavo daugiau fenolinių junginių, lyginant su atskirų sudėties komponentų hidrogeliais. Iš standžios konsistencijos hidrogelių, daugiausiai fenolinių junginių atsipalaidavo iš optimalios sudėties celiuliozinio hidrogelio.
SUMMARY
THE MODELLING AND BIOPHARMACEUTICAL EVALUATION
OF CELLULOSE–BASED HYDROGELS WITH AN AQUEOUS
PROPOLIS EXTRACT
G. Žilvytė’s final thesis for masters’s degree/ scientific supervisor lect. dr. Modestas Žilius; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
The aim of work: To model cellulose–based hydrogels with an aqueous propolis extract, to optimize
the experimental hydrogels and to justify their quality in biopharmaceutical researches.
Main tasks: To make an aqueous propolis extract and to estimate its qualitative and quantitative
compositions; to make a cellulose–based hydrogels with an aqueous propolis extract and to evaluate their quality, by determining its viscosity, pH and in vitro release; to optimize cellulose–based hydrogels with an aqueous propolis extract and to evaluate the optimal composition quality, by determining its viscosity, pH and in vitro release.
Methods: The validated HPLC method was used to identify and to quantify propolis compounds.
Viscosity of cellulose–based hydrogels was measured in room temperature by vibro viscosimeter and pH was measured by pH–meter. In vitro release studies were performed using the modified Franz type diffusion cells.
Results: Modelled cellulose–based hydrogels with an aqueous propolis extract pH values were in the
range of 4,2±0,04–6,07±0,01. The viscosity varies from 0,14±0,02 Pa·s to more than 11 Pa·s. Tight consistency hydrogels were obtained by using 5 percents of KMC–sodium, 11 percents of HEC, 13 percents of HPMC and 17 percents of MC. The maximum amount of released phenolic compounds was obtained from 11 percents HEC hydrogel (56,43 µg/cm2), compared with others tight consistency hydrogels which were made from one type of cellulose. From liquid consistency hydrogels, the highest amount of released phenolic compounds showed 7 percents HPMC and 6 percents HEC hydrogels: 85,14 µg/cm2 and 81,98 µg/cm2, respectively. From the optimal composition cellulose–based hydrogel released 72,12±2,71 µg/cm2 phenolic compounds. It is 148–162 percents more than tight consistency,
individual components of the optimal composition hydrogels: 5 percents KMC–sodium and 13 percents HPMC.
Conclusions: Cellulose–based hydrogels with an aqueous propolis extract were suitable to carry them
on the skin. The most released phenolic compounds were determined from liquid consistency hydrogels, compared with all cellulose–based hydrogels. The optimal hydrogel composition released more phenolic compounds, compared with the individual components hydrogels. The optimal
cellulose–based hydrogel composition released the highest amount of phenolic compounds, compared with the others tight consistency cellulose–based hydrogels.
PADĖKA
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, materialinę bazę ir pagalbą rengiant mokslinį tiriamąjį darbą „Celiuliozinių hidrogelių su vandenine propolio ištrauka modeliavimas ir biofarmacinis vertinimas“ dėkoju darbo vadovui lekt. dr. Modestui Žiliui, katedros vedėjui prof. dr. Vitaliui Briedžiui ir visam klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
SANTRUMPOS
HEC – hidroksietilceliuliozėHPMC – hidroksipropilmetilceliuliozė MC – metilceliuliozė
KMC–Na –karboksimetilceliuliozės natrio druska VPI – vandeninė propolio ištrauka
ĮVADAS
Propolis yra natūralus, dervingas bičių produktas, kurio įvairiapusį poveikį apsprendžia plati cheminė sudėtis: fenolinės rūgštys ir jų esteriai, flavonoidai, aromatiniai aldehidai ir alkoholiai, β– steroidai, terpenai, seksviterpenai, stilbeno terpenai [1, 2]. Lietuvoje surinktame propolyje aptinkamos galo, vanilo, kavos, chlorogeno, rozmarino, cinamono, ferulo, p–kumaro fenolinės rūgštys, fenolinis aldehidas – vanilinas. Propolis ir jo produktai gali būti standartizuojami pagal p–kumaro ir ferulo fenolines rūgštis [3, 4].
Hidrogeliai susidaro dėl tinklinės struktūros susiformavimo vandenyje tirpiems polimerams išbrinkus vandeninėje fazėje [5, 6]. Tinklinę struktūrą formuojančios medžiagos būna natūralios, pusiau sintetinės ar sintetinės kilmės [7]. Pusiau sintetinių celiuliozės darinių populiarumas hidrogelių gamyboje vis auga, nes jie pasižymi teigiamomis savybėmis: yra hidrofiliški, netoksiški, derinasi su daugeliu medžiagų [8]. Hidrogeliai yra vaisto forma, kuri dėl savo savybių užtikrina efektyvų vaistinės medžiagos tiekimą. Kaip vaisto tiekimo sistemos, hidrogelių privalumai yra: panašumas biologiniams audiniams ir galimybė prailginti vaistinės medžiagos atpalaidavimą iš jų, ilgą laiką palaikant didelę veikliosios medžiagos koncentraciją veikimo vietoje [6, 7]. Veikliųjų medžiagų įterpimas į hidrogelius, kaip vaisto tiekimo sistemas, yra ribojamas dėl būtino šių medžiagų hidrofiliškumo [6].
Literatūroje paskelbta mažiau tyrimų su geliais, lyginant su kremais ar tepalais. Taip pat yra daugiau duomenų apie lipofilinių gelių atpalaidavimo tyrimus in vitro, lyginant su hidrofiliniais hidrogeliais, todėl tirti pasirinkta viena iš hidrogelių rūšių – celiulioziniai hidrogeliai. Išanalizavus literatūros duomenis, nustatyta, kad akceptorine terpe naudojant išgrynintą vandenį, iš hidrogelių atsipalaiduoja beveik 100 proc. veikliųjų junginių ir tai siejama su stipriu akceptorinės terpės poveikiu hidrogeliui, dėl kurio prasideda jo tirpimas [9, 10], todėl, svarbu parinkti tokią akceptorinę terpę, kuri
in vitro atpalaidavimo tyrimo metu kuo mažiau veiktų patį hidrogelį. Taigi, yra aktualu kaupti žinias
apie hidrogelių atpalaidavimo tyrimus in vitro. Šio darbo tikslas yra sumodeliuoti celiuliozinius hidrogelius su vandenine propolio ištrauka, eksperimentinius hidrogelius optimizuoti ir pagrįsti jų kokybę biofarmaciniais tyrimais.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: eksperimentiniai celiulioziniai hidrogeliai, kurių modeliavimui pasirinktos
keturios gelifikuojančios medžiagos (hidroksietilceliuliozė, hidroksipropilmetilceliuliozė, metilceliuliozė, karboksimetilceliuliozės natrio druska (vidutinės klampos)), į kuriuos įterpta vandeninė propolio ištrauka.
Darbo tikslas: sumodeliuoti celiuliozinius hidrogelius su vandenine propolio ištrauka,
eksperimentinius hidrogelius optimizuoti ir pagrįsti jų kokybę biofarmaciniais tyrimais.
Darbo uždaviniai:
1. Pagaminti vandeninį propolio ekstraktą ir įvertinti jo kokybinę ir kiekybinę sudėtį;
2. Pagaminti celiuliozinius hidrogelius su vandenine propolio ištrauka ir įvertinti jų kokybę, nustatant
dinaminės klampos, pH reikšmes, fenolinių junginių atpalaidavimą in vitro;
3. Optimizuoti celiuliozinius hidrogelius su vandenine propolio ištrauka ir įvertinti optimalios sudėties
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Gelių charakteristika
Geliai – pusiau kietos formos preparatai, kurie sudaryti iš gelifikuojančių medžiagų, išbrinkusių skystoje terpėje [11, 12]. Geliai apibūdinami kaip pusiau standžios sistemos, kurių skystos terpės klampa padidėja dėl išbrinkusių makromolekulių tinklinės struktūros susiformavimo [13]. Nuo gelifikuojančios medžiagos savybių priklauso tinklinės truktūros ryšių susidarymo pobūdis ir gelio savybės [14, 15].
Gelių gamyboje naudojamos įvairios gelifikuojančios medžiagos: neorganinės medžiagos ir organinės kilmės molekulės – polimerai, kurios nurodytos 1 lentelėje [13, 16, 17].
1 lentelė. Gelius formuojančių (gelifikuojančių) medžiagų klasifikacija
Medžiagų grupė Pavyzdžiai
Natūralūs polimerai Baltymai: želatina, kolagenas;
Polisacharidai: alginatai, agaras, tragakantas, natrio ar kalio karagenanai, pektinas, gelano guma, ksantanas, guaro guma; Pusiau sintetiniai polimerai Celiuliozės dariniai: hidroksietilceliuliozė, metilceliuliozė,
hidroksipropilmetilceliuliozė, karboksimetilceliuliozė; Sintetiniai polimerai Karbomerai: karbopolis 941, karbopolis 940, karbopolis 934;
Poloksamerai; Polivinilo alkoholis; Poliakrilamidas;
Polietilenas ir jo kopolimerai; Neorganinės medžiagos Aliuminio hidroksidas;
Bentonitas;
Mikrokristalinis silicio dioksidas;
Surfaktantai Brij-96;
Cetosterilo alkoholis.
Disperguota ar išbrinkinta gelifikuojanti medžiaga turi padidinti skystos terpės klampą, būti inertiška – nesąveikauti su terpę sudarančiomis, įterptomis veikliosiomis ar pagalbinėmis medžiagomis, turi būti atspari mikrobiologiniam poveikiui ir jos savybės turi nepakisti gamybos ir
laikymo metu [6]. Pageidautina, kad skylant gelifikuojančiai medžiagai, susidarę produktai būtų netoksiški [18].
Gelių privalumai:
Lyginant su kremais ir tepalais – gelių gamybos technologija yra paprastesnė [6]; Geliai yra stabilesnė vaisto forma nei tepalai ir kremai [14, 16];
Vaistinė medžiaga iš gelių atpalaiduojama greičiau nei iš kitų pusiau kietų preparatų formų [19];
Veikliųjų junginių atpalaidavimas lengviau kontroliuojamas iš gelių, nei iš kitų pusiau kietų preparatų formų [16];
Lyginant su tepalais – geliai yra mažiau lipnūs [14];
Geliai padidina veikliųjų medžiagų absorbciją, taigi ir biologinį pasisavinimą [16].
Geliai būna fizikiniai ir cheminiai, priklausomai nuo to, kokiomis sąveikomis, susidarant tinklinei struktūrai, jungiasi gelifikuojančios medžiagos. Cheminėms sąveikoms priskiriamos ilgalaikės kovalentinės jungtys, o fizikinėms – silpnesnės tarpmolekulinės jungtys: vandeniliniai ryšiai, elektrostatinė, dipolio, hidrofobinė sąveikos ar Van der Valso jėga [5, 15, 16]. Geliai gali būti vienfaziai arba dvifaziai. Vienfaziai geliai sudaryti iš organinių makromolekulių, kurios, tolygiai pasiskirsčiusios skystojoje fazėje, sudaro tankią tinklinę struktūrą. Jei disperguotos fazės molekulės sudaro dribsnių pavidalo sankaupas, gaunami dvifaziai geliai, kurie yra nestabilūs: jų struktūra gali būti suardoma purtant [13, 16].
Geliai, priklausomai nuo skystos terpės, skirstomi į lipofilinius (oleogelius) ir hidrofilinius (hidrogelius). Oleogelių pagrindą dažniausiai sudaro riebaliniai aliejai ar skystas parafinas su polietilenu, gelifikuoti koloidiniu silicio dioksidu, aliuminio ar cinko muilais, o hidrogelių – vanduo, propilenglikolis ar glicerolis, gelifikuoti tragakantu, krakmolu, celiuliozės dariniais, magnio – aliuminio silikatais [11, 16, 20]. Oleogelius sudarančios medžiagos dažniausiai yra santykinai mažos molekulinės masės, lyginant su hidrogelius sudarančiomis, kurios dažniausiai būna didelės molekulinės masės polimerai. Oleogelius formuojančios medžiagos gali jungtis ir cheminėmis ir fizikinėmis sąveikomis [15]. Taip pat jos klasifikuojamos pagal gebėjimą sudaryti vandenilinius ryšius: nesudarančios vandenilinių ryšių (antraceno, antrachinono, steroidų dariniai) ir sudarančios vandenilinius ryšius (amino rūgščių, amido, šlapalo, angliavandenių dariniai) [21]. Oleogelių vartojimas vis auga, nes jie pagreitina prasiskverbimo į odą procesą, yra mikrobiologiškai atsparūs, jų tinkamumo vartoti laikas yra ilgas. Kaip veiklieji junginiai, į oleogelius gali būti įterptos tiek hidrofilinės, tiek hidrofobinės medžiagos [15, 22]. Oleogeliai turi trūkumų: jie yra jautrūs temperatūros pokyčiams, ilgai stovint vyksta sinerezės procesas – iš gelio išsiskiria skystoji fazė, jei atsiranda priemaišų – gelifikacijos procesas nevyksta ir gelis nesusiformuoja. Oleogeliai plačiai vartojami farmacijos pramonėje: kaip vaistinių
medžiagų tiekimo sistema vietiškai vartojamose formose, transdermaliniuose, parenteraliniuose preparatuose. Mikrobiologijoje agaro ir želatinos geliai vartojami kaip terpė mikroorganizmų kultivavimui. Kosmetikos pramonėje vartojami gaminant burnos, odos, plaukų priežiūros priemones [15].
1.2. Hidrogelių charakteristika
Hidrogeliai susidaro dėl vandenyje tirpių hidrofilinių organinių polimerų gebėjimo išbrinkti vandeninėje fazėje ir suformuoti tinklinę struktūrą, arba dėl neorganinių medžiagų klampą didinančių savybių [5, 6]. Gelifikuojančios medžiagos vandeninėje fazėje yra disperguojamos arba išbrinkinamos [6]. Sudarydamos tinklinę struktūrą, gelifikuojančios medžiagos gali jungtis ir cheminėmis, ir fizikinėmis jungtimis. Jei jos jungiasi fizikinėmis sąveikomis – gaunami hidrogeliai, kurių struktūra pakinta keičiant temperatūrą, tačiau grįžta į pradinę padėtį, kai temperatūra atstatoma; jei jungiasi cheminėmis jungtimis – hidrogelių struktūra veikiant temperatūrai pakinta negrįžtamai [15]. Tinklinę struktūrą formuojančios medžiagos gali sugerti nuo 10–20 proc. iki kelių tūkstančių kartų daugiau vandens nei pačios sveria, ir gali būti natūralios, pusiau sintetinės ar sintetinės kilmės [7]. Natūralios medžiagos, formuojančios hidrogelius, yra kolagenas, želatina, krakmolas, alginatai, agarozė, celiuliozė, pusiau sintetinės – celiuliozės dariniai: hidroksietilceliuliozė, metilceliuliozė, hidroksipropilmetilceliuliozė, tuo tarpu sintetinės medžiagos gaunamos cheminės polimerizacijos būdu, pvz.: poliakrilinė rūgštis, polivinilalkoholis, polivinilpirolidonas, polietilenglikolis, poliakrilamidas [8, 18, 23]. Šie polimerai ir jų dariniai dažniausiai vartojami gaminant hidrogelius, nes yra netoksiški, hidrofiliški, dera su daugeliu medžiagų [8, 23]. Iš sintetinių medžiagų pagamintų hidrogelių yra ilgesnis tinkamumo vartoti laikas, sintetinės medžiagos geba sugerti didesnį kiekį vandeninės fazės ir suformuoja tvirtesnį gelį. Tokie geliai yra atsparesni temperatūrų pokyčiams [18].
Hidrogelių sistemos gali būti skaidrios arba drumstos, priklausomai nuo to, ar dalelės iki galo disperguojasi, ar susiformuoja agregatai, kurie prailgina dispergavimo laiką [24]. Hidrogelio fizinės struktūros išlaikymas priklauso nuo gelifikuojančios medžiagos kilmės, koncentracijos ir molekulinio svorio, taip pat tinkamo pH ir temperatūros [6, 25]. Dažniausiai didelės molekulinės masės polimerai esant didesnėms koncentracijoms formuoja tirštesnius hidrogelius [6].
Hidrogelių fizikinės savybės gali pakisti veikiant fizikiniams, cheminiams ir biologiniams veiksniams. Fizikiniams dirgikliams priskiriama temperatūra, elektrinis ar magnetinis laukai, šviesa, slėgis; cheminiams – pH, joninė jėga, tirpiklio sudėtis; biologiniams – fermentai, antikūnai ir
organizmo gliukozė [6, 26, 27]. Ši hidrogelių savybė panaudojama kuriant išoriniam stimului jautrius hidrogelius [26, 27].
Kaip vaistinių medžiagų tiekimo sistemą, hidrogelius galima vartoti dėl jų teigiamų savybių. Dėl didelio kiekio sudėtyje esančio vandens, hidrogeliai yra biologiškai panašūs tarpląsteliniam skysčiui, o dėl tinklinės struktūros porų – biologiniams audiniams [6]. Taip pat į tinklinės struktūros suformuojamas poras patenka veiklioji medžiaga. Dėl didelio porų tankio galimas prailgintas vaistinės medžiagos atpalaidavimas ir veikimo vietoje ilgą laiką palaikoma didelė veikliosios medžiagos koncentracija [7]. Dėl šių savybių, hidrogeliai yra vaisto forma, kuri užtikrina efektyvų vaistinės medžiagos tiekimą.
Vaistinės medžiagos atpalaidavimas iš hidrogelių gali vykti keliais būdais:
Difuzijos kontroliuojamas atpalaidavimas. Veiklioji medžiaga iš centre esančios matricos, kurioje yra didžiausia jos koncentracija, lėtai difunduoja per hidrogelio poras, užpildytas vandenine faze. Toks procesas vyksta, kai hidrogelis naudojamas kaip plėvelę formuojanti medžiaga, pvz.: kapsulių gamyboje. Taip pat difuzijos kontroliuojamas atpalaidavimas vyksta, kai vaistinė medžiaga yra tolygiai disperguota arba ištirpinta hidrogelyje. Šiuo atveju veiklioji medžiaga taip pat difunduoja per vandenine faze užpildytas hidrogelio poras [23]; Brinkimo reguliuojamas atpalaidavimas. Šiuo atveju, veiklioji medžiaga yra disperguota
hidrogelio matricoje. Kai gelifikuojanti medžiaga liečiasi su biologiniais skysčiais, ji pradeda brinkti, padidėja poros ir veiklioji medžiaga per jas difunduoja į organizmo terpę [23];
Vaistinės medžiagos atpalaidavimas, pakitus aplinkos sąlygoms. Išoriniam stimului jautrių hidrogelių tinklinė struktūra pakinta veikiant aplinkos veiksniams. Organizme dažniausiai gali pasitaikyti pH, temperatūros pokyčių. Esant žemesnei temperatūrai, tinklinės struktūros hidrofilinės funkcinės grupės daugiausiai jungiasi vandenilinėmis sąveikomis viena su kita ar su vandens molekulėmis, todėl gelifikuojančios medžiagos tirpumas vandenyje padidėja, poros būna didesnio dydžio ir lengviau vyksta veikliosios medžiagos difuzija. Temperatūrai pakilus, hidrofobinės sąveikos tarp tinklinės struktūros hidrofobinių funkcinių grupių sustiprėja, o vandeniliniai ryšiai susilpnėja. To rezultatas – tinklinė struktūra pradeda irti ir veikliosios medžiagos atpalaidavimas yra sulėtinamas. Temperatūrai jautrių hidrogelių gamyboje kaip gelifikuojančios medžiagos dažniausiai naudojamos poli(N-izopropilakrilamidas), poli(N,N-dietilakrilamidas). pH pokyčiams jautrių hidrogelių gamyboje kaip jungiančiosios molekulės naudojami polielektrolitai. Tokie hidrogeliai dažniausiai modeliuojami per os vartojamoms vaisto formoms patobulinti, pvz.: polikatijoninių hidrogelių brinkimas neutraliame pH yra minimalus, todėl lėtėja vaistinės medžiagos atpalaidavimas. Ši savybė panaudojama norint išvengti blogo skonio vaistinės medžiagos atsipalaidavimo burnoje, prieš jai patenkant į veikimo vietą, pvz.: skrandį, kur
rūgščioje terpėje polielektrolitas jonizuojasi, pagerėja brinkimas ir greitėja veikliosios medžiagos atpalaidavimas [27].
Didžiausias hidrogelių, kaip vaistinių medžiagų tiekimo sistemos, trūkumas yra tas, kad ribojamas veikliųjų medžiagų pasirinkimas, t.y. į hidrogelius negalima įterpti lipofilinių medžiagų [6].
Medicinoje hidrogeliai vartojami įvairiose srityse: audinių inžinerija ir regeneracija, diagnostika, žaizdų gydymas, kontaktinių lęšių gamyba, vaistinių medžiagų tiekimo sistema [7, 23, 26]. Išoriniam stimului jautrūs hidrogeliai gali būti naudojami per os vartojamų formų plėvelių gamyboje. Šie hidrogeliai apsaugo veikliąją medžiagą nuo skrandžio rūgščių, fermentų poveikio, taip užtikrindami veikliosios medžiagos patekimą į reikiamą vietą [23, 27]. Išoriniam stimului jautrūs hidrogeliai plačiai tyrinėjami, kuriant savireguliuojančias insulino pernašos ir atsipalaidavimo sistemas [26, 27].
1.3. Celiuliozinių hidrogelių charakteristika
Celiuliozė – polisacharidas, susidedantis iš kelių tūkstančių D – gliukozės vienetų, susijungusių 1,4 – β – glikozidiniais ryšiais, kurie suteikia celiuliozės grandinei linijinę struktūrą [6, 28]. Celiuliozė pasižymi tokiomis savybėmis: beskonė, bekvapė, netirpi vandenyje ir daugelyje organinių tirpiklių [29, 30]. Struktūroje esančios hidroksilo grupės gali jungtis viena su kita, susidarant vandenilinėms jungtims, arba sudaryti esterines ar eterines jungtis celiuliozės dariniuose, kurios turi įtakos naujai susidariusių polimerų fizikinėms savybėms [6, 8].
Susidomėjimas celiuliozės dariniais hidrogelių gamyboje vis auga, nes jie yra hidrofiliški, netoksiški, derinasi su daugeliu medžiagų [8]. Hidrogelių gamyboje gali būti naudojama natūrali celiuliozė arba jos pusiau sintetiniai dariniai. Kaip gelifikuojančią medžiagą naudojant natūralią celiuliozę gaunami fizikiniai hidrogeliai, kadangi tinklinė struktūra suformuojama hidroksilinėms grupėms jungiantis vandeniliniais ryšiais. Natūrali celiuliozė dėl labai stipraus vandenilinių ryšių tinklo, sunkiai tirpsta įprastuose tirpikliuose, taigi gaminant hidrogelius iš natūralios celiuliozės pagrindinė problema tampa vandeninių tirpiklių, kuriuose celiuliozė ištirptų, trūkumas. Siekiant pagerinti hidrogelių gamybą naudojant natūralią celiuliozę, buvo sukurtos įvairios vandeninių tirpiklių sistemos: ličio chlorido/dimetilacetamido, N-metilmorfolino–N–oksido, šarmo/šlapalo, hidrofilinės joninių tirpiklių sistemos (pvz.: 1–butyl–3–metilimidazolo chloridas) [8, 31].
Metilceliuliozė, hidroksipropilmetilceliuliozė, karboksimetilceliuliozės natrio druska, hidroksietilceliuliozė dažnai naudojamos hidrogelių gamyboje [8, 32]. Celiulioziniai hidrogeliai su celiuliozės dariniais gali būti fizikiniai arba cheminiai [8, 29]. Fizikinių hidrogelių tinklinė struktūra
susidaro dėl joninių, vandenilinių jungčių pobūdžio pasikeitimo tarp polimero ir terpės molekulių: dėl substituotų hidroksilinių grupių, susidaro mažiau vandenilinių jungčių tarp polimero funkcinių grupių, ir padidėja celiuliozės darinių tirpumas vandenyje [6, 8, 30]. Cheminių hidrogelių gamyboje, naudojant mažas molekules kaip jungiančiąsias medžiagas (pvz.: epichlorhidrinas, divinilsulfonas), suformuojami stabilesni hidrogeliai [8, 29, 30, 31]. Jungiančiosios medžiagos kovalentinėmis jungtimis sujungia skirtingas polimero molekules į tinklinę struktūrą. Naudojant toksiškas jungiančiąsias medžiagas, jas reikia pašalinti iš hidrogelių [8]. Sparčiai auga netoksiškų jungiančiųjų medžiagų, tokių kaip citrinos rūgštis, panaudojimas [33, 34]. Cheminiai celiulioziniai hidrogeliai gali būti gaunami ir veikiant UV spinduliais. Šio gamybos būdo privalumas – nėra naudojamos toksiškos medžiagos, taigi nereikalingas hidrogelių gryninimas [8, 31]. Celiulioziniai hidrogeliai gali būti gaunami kaip gelifikuojančias medžiagas naudojant natūralios celiuliozės ar jos darinių mišinius su natūraliais polimerais, tokiais kaip chitinas, chitozanas, krakmolas, alginatai, hialurono rūgštis [8]. Hidrogeliai gali būti gaunami kaip gelifikuojančias medžiagas naudojant celiuliozinių darinių junginius su neorganinėmis medžiagomis. Fellah ir kt. [35] nustatė, kad kalcio fosfatas, sumaišytas su silicio – hidroksipropilmetilceliuliozės hidrogeliu gali būti naudojamas kaip kaulinio audinio pakaitalas, ar kaulo defektų užpildas, kai jis vartojamas kaip injekcija, ir veikimo vietoje išsilaiko 8 savaites. Šios kombinacijos praplečia celiuliozinių hidrogelių pritaikymo galimybes.
Celiuliozės ir jos darinių pritaikymo galimybės [30]: Pakavimo plėvelių gamyba;
Celiuliozinių membranų gamyba; Celiuliozinių pluoštų gamyba; Celiuliozinių hidrogelių gamyba; Neaustų audinių gamyba.
Celiuliozinių hidrogelių pritaikymo galimybės:
Audinių inžinerijoje gali būti vartojami hidrogeliai, gelifikuoti celiuliozės dariniais ir alginatais [8];
Vaistinių medžiagų tiekimo sistema [8, 31];
Celiuliozės dariniais ir chitozanu gelifikuoti hidrogeliai vartojami kaip sorbentai, siekiant pašalinti sunkiuosius metalus iš kraujo;
Celiuliozės dariniais ir krakmolu gelifikuoti hidrogeliai – maisto pramonėje; Agrokultūra – kaip vandens rezervuarai [8].
Geliai yra vis labiau populiarėjanti vaisto forma, kurios vartojimo galimybės sparčiai plečiasi. Šiandien geliai pritaikomi ne tik kaip ant odos vartojama vietiškai veikianti sistema, bet ir kaip
implantai, audinių inžinerijoje. Šias pritaikymo galimybes padėjo atrasti vis didesnis susidomėjimas gelių savybėmis, galimomis jų modifikacijomis, reakcijomis su kitomis medžiagomis, ar organizmo audiniais. Tolimesnis domėjimasis ir tyrimai gali padėti atrasti naujų, neištirtų savybių, kurios dar labiau praplėstų gelių pritaikymo galimybes įvairiausiose pramonės, farmacijos ir medicinos srityse. Dėl augančio gelių populiarumo svarbu susipažinti su jų savybėmis, kurios yra svarbios parenkant tinkamiausius kriterijus jų kokybei įvertinti.
1.4. Celiuliozinius hidrogelius sudarančių medžiagų charakteristika
Hidroksietilceliuliozė (Hydroxyethylcellulosum, HEC) – celiuliozės 2–hidroksietileteris. Jos
cheminė struktūra pavaizduota 1 paveiksle [36].
1 pav. Hidroksietilceliuliozės cheminė struktūra: R gali būti H ar [—CH2CH2O—]mH
Hidroksietilceliuliozė yra balti, geltonai – balti ar pilkšvai – balti bekvapiai ir beskoniai higroskopiniai milteliai. Tirpūs karštame ir šaltame vandenyje, praktiškai netirpsta acetone, etanolyje (96 proc.), eteryje ir toluene. 1 proc. vandeninio tirpalo pH varijuoja nuo 5,5 iki 8,5. Vandeniniai tirpalai yra mažiau stabilūs, kai pH mažiau 5, dėl hidroksietilceliuliozės hidrolizės. Kai pH stipriai šarminis – galima oksidacija. Klampumas – 2–20000 mPa·s 2 proc. vandeniniame tirpale ir priklauso nuo molekulinio svorio [6, 36]. Keliant temperatūrą vandeninių tirpalų dinaminė klampa mažėja, bet sugrįžta į normos ribas kambario temperatūroje [36]. Hidroksietilceliuliozė yra hidrofiliška, stabili, skyla susidarant netoksiškiems produktams, yra suderinama su daugeliu medžiagų [32]. Maleki ir kiti [37] nustatė, kad modeliuojant hidroksietilceliuliozinius hidrogelius, gelifikacijos procesas pagreitėja, didinant jungiančiosios medžiagos – divinilsulfono – koncentraciją.
Hidroksietilceliuliozė plačiai taikoma farmacijos pramonėje: kaip tirštiklis akių lašų preparatuose, vietinio poveikio sistemose, rišiklis ir plėvelę formuojanti medžiaga tablečių gamyboje,
įeina į drėkinančių akis ir burnos ertmę preparatų, kontaktinių lęšių priežiūros priemonių sudėtį. Hidroksietilceliuliozė plačiai naudojama kosmetologijoje [36].
Hidroksipropilmetilceliuliozė (Hydroxypropylmethylcellulose, Hypromelose, HPMC) –
celiuliozės hidroksipropilmetileteris. Hidroksipropilmetilceliuliozės cheminė struktūra pavaizduota 2 paveiksle [36].
2 pav. Hidroksipropilmetilceliuliozės cheminė struktūra: R gali būti H, CH3, CH3CH(OH)CH2
Hidroksipropilmetilceliuliozė yra balti ar geltonai – balti bekvapiai ir beskoniai pluoštiniai milteliai ar granulės. Tirpsta šaltame vandenyje formuodami klampų koloidinį tirpalą. Praktiškai netirpsta chloroforme, etanolyje (95 proc.), eteryje. 1 proc. vandeninio tirpalo pH – 5,5–8,0. Vandeniniai tirpalai stabilūs plačiame pH intervale: 3–11. Molekulinis svoris 10000–1500000 Da. Dispersijos dinaminė klampa priklauso nuo daugelio veiksnių: hidroksipropilmetilceliuliozės koncentracijos ir molekulinio svorio, tirpiklio sudėties, konservantų buvimo. Sistemos dinaminė klampa mažėja keliant temperatūrą [36]. Klampūs geliai gaunami naudojant didelio molekulinio svorio hidroksipropilmetilceliuliozės dideles koncentracijas [6]. Hidroksipropilmetilceliuliozė yra hidrofiliška, netoksiška, geba išbrinkti vandeniniame tirpale. Davaran ir kt. [38] atlikdami atpalaidavimo tyrimą in vitro su hidroksipropilmetilceliuliozės – polietilenglikolio hidrogeliais, kaip akceptorinę terpę naudojant fosfatinį buferį, nustatė, kad iš šios sudėties hidrogelio atsipalaidavo daugiau nei 98 proc. veikliųjų junginių. Tai paaiškinama vandeninės fazės difuzija į hidrogelio struktūrą, tuo pat metu pagerinant veikliosios medžiagos difuziją į akceptorinę terpę.
Hidroksipropilmetilceliuliozė plačiai vartojama farmacijoje: kaip rišiklis ir plėvelę formuojanti medžiaga tablečių gamyboje, tirštiklis vietiškai ar ant akių vartojamose farmacinėse formose, kapsulių, elastinių pleistrų gamyboje. Ji plačiai vartojama kosmetikos ir maisto pramonėje [36].
Metilceliuliozė (Methylcellulose, MC) – celiuliozės metilo eteris. Metilceliuliozės cheminė
3 pav. Metilceliuliozės cheminė struktūra
Metilceliuliozė yra bekvapiai ir beskoniai balti pluoštiniai milteliai ar granulės. Tirpsta ledinėje acto rūgštyje. Šaltame vandenyje metilceliuliozė išbrinksta sudarydama skaidrią ar opalescuojančią, klampią koloidinę sistemą. Praktiškai netirpsta acetone, metanolyje, chloroforme, etanolyje (95 proc.), eteryje, toluene ir karštame vandenyje. 1 proc. vandeninio tirpalo pH – 5,5–8,0. Tirpalai stabilūs plačiame pH intervale – 3–11. Jei pH mažiau už 3 – galima rūgščių katalizuojama gliukozės jungčių hidrolizė. Molekulinis svoris priklauso nuo polimerizacijos laipsnio ir gali būti 10000–220000 Da. Klampumas – 5–75000 mPa·s 2 proc. vandeniniame tirpale. Keliant temperatūrą, metilceliuliozės tirpalų dinaminė klampa sumažėja, tačiau esant temperatūrai 50–60°C ji vėl padidėja [36]. Šis reiškinys remiasi tuo, kad esant žemai temperatūrai metilceliuliozės molekulės nesąveikauja tarpusavyje, nes yra hidratuotos. Keliant temperatūrą, dinaminė klampa sumažėja dėl to, kad molekulės sugeria energiją ir atpalaiduoja vandenį. Toliau keliant temperatūrą polimerai pradeda sąveikauti tarpusavyje, sudaro tinklinę struktūrą, todėl tirpalai susidrumsčia ir padidėja klampa [39]. Metilceliuliozė yra hidrofiliška, netoksiška, derinti su daugeliu medžiagų, ir pasižymi ypatingomis savybėmis didinant temperatūrą [40].
Metilceliuliozės pritaikymo galimybės: formuojant tabletes mažos ar vidutinės klampos metilceliuliozė naudojama kaip rišančioji medžiaga, didelės klampos – skatinanti suirimą. Metilceliuliozės gali būti dedama į tabletes, siekiant prailginti veikimo laiką, paruošti tabletes apipurškimui cukraus danga norint užmaskuoti blogą skonį. Mažos klampos metilceliuliozė vartojama kaip emulsiklis, tirštiklis per os vartojamuose skysčiuose. Didelės klampos – vietiškai vartojamoms vaistų formoms sutirštinti. Didelio polimerizacijos laipsnio ir didelės klampos metilceliuliozė naudojama kaip akių lašų pagrindas [36].
Karboksimetilceliuliozės natrio druska (Carboxymethylcellulose sodium, KMC–Na) –
celiuliozės karboksimetileterio natrio druska. Karboskimetilceliuliozės natrio druskos cheminė struktūra pavaizduota 4 paveiksle [36].
4 pav. Karboksimetilceliuliozės natrio druskos cheminė struktūra
Karboksimetilceliuliozės natrio druska yra baltos bekvapės granulės. Tirpsta vandenyje bet kokioje temperatūroje, formuodama koloidinį tirpalą. Praktiškai netirpsta acetone, etanolyje (95 proc.), toluene, eteryje. 1 proc. vandeninio tirpalo pH – 6,0–8,0. Vandeniniai tirpalai yra stabilūs, kai pH 2– 10. Kai pH < 2 – susidaro nuosėdos, o kai pH > 10 staigiai sumažėja klampa. Bendrai, tirpalai yra stabiliausi ir didžiausios klampos, kai pH 7–9. Molekulinis svoris svyruoja nuo 90000 iki 700000 Da. Galimos 1 proc. vandeninio tirpalo dinaminių klampų reikšmės pateiktos 2 lentelėje [36].
2 lentelė. 1 % vandeninių karboksimetilceliuliozės natrio druskos tirpalų dinaminių klampų reikšmės (25 °C temperatūroje) (Rowe RC et al, 2006)
Klampos reikšmė (mPa·s)
Mažos klampos 10–15
Vidutinės klampos 1500–2500
Didelės klampos 8000–12000
Padidinus celiuliozės koncentraciją – padidėja dinaminė klampa. Ilgai veikiant aukšta temperatūra vyksta depolimerizacija ir staigiai sumažėja klampa [36].
Vienintelė karboksimetilceliuliozė, sintezuojama kaip natrio druska, yra polielektrolitas ir yra jautri pH ir joninės jėgos pokyčiams. Ji pasižymi geromis brinkimo savybėmis [34]. Karboksimetilceliuliozės natrio druska biologiškai dera su daugeliu medžiagų, skyla susidarant netoksiškiems produktams, nepasižymi imunogeniškumu [41].
Kulkarni ir kt. [42] atliko atpalaidavimo tyrimus in vitro su pH pokyčiams jautriu karboksimetilceliuliozės natrio durskos hidrogeliu, kaip jungiančiąją medžiagą naudojant poliakrilamidą kartu su ksantanu. Atpalaidavimo tyrimas in vitro buvo atliekamas dviejų pH reikšmių akceptorinėse terpėse: 1,2 ir 7,4, 37±0,5°C temperatūroje. Esant mažesnei pH reikšmei, vaistinės medžiagos atsipalaidavo mažiau. Tai paaiškinama geresniu celiuliozės brinkimu aukštesniame pH. Taip pat
didesnis atsipalaidavusių junginių kiekis buvo geliuose, kuriuose naudotos didesnės jungiančiųjų medžiagų koncentracijos. Atsipalaidavusių veikliųjų junginių kiekis svyravo nuo 70 iki 90 proc. iš skirtingų koncentracijų gelių.
Karboksimetilceliuliozės natrio druskos pritaikymo galimybės: klampūs karboskimetilceliuliozės natrio druskos tirpalai plačiai taikomi vietinio poveikio, per os vartojamų ar parenteraliai vartojamų vaistų formų gamyboje. Kaip rišančioji medžiaga tablečių gamyboje, emulsijas stabilizuojanti medžiaga. 3–6 proc. vidutinės klampos karboksimetilceliuliozės natrio druska taikoma gelių gamyboje, taip pat žaizdų gydymui dėl gebėjimo absorbuoti žaizdų eksudatą [36, 41]. Taip pat ji plačiai taikoma kosmetikos, maisto pramonėje [41].
1.5. Propolio charakteristika ir modeliuojamos pusiau kietos sistemos su juo
Propolis – dervingas, natūralus bičių (Apis mellifera) produktas. Jo sudėtyje nustatyta įvairių cheminių junginių: fenolinių rūgščių ir jų esterių, flavonoidų (flavonų, flavanonų, flavonolių, chalkonų, dihidroflavonolių), aromatinių aldehidų ir alkoholių, β–steroidų, terpenų, seksviterpenų, stilbeno terpenų [1, 2]. Remiantis literatūros duomenimis, didžiausią kiekį fenolinių junginių ištirpina 70 proc. etanolis [9, 43, 44].
Propolio sudėtis priklauso nuo klimato sąlygų ir augalijos tipo, todėl skirtingų geografinių zonų propolis turi skirtingą cheminę sudėtį [45]. Ramanauskienė [3], Ivanauskas ir kt. [4] nustatė, kad Lietuvoje surinktame propolyje aptinkamos galo, vanilo, kavos, chlorogeno, rozmarino, cinamono, ferulo, p–kumaro fenolinės rūgštys, fenolinis aldehidas – vanilinas. Taip pat paskelbė, kad Lietuvoje rinktas propolis ir jo produkai gali būti standartizuojami pagal p–kumaro ir ferulo fenolines rūgštis. Propoliui būdingas antioksidacinis, priešbakterinis, antiradikalinis, priešgrybelinis, priešvirusinis, priešuždegiminis, priešvėžinis poveikiai [46, 47, 48].
Dėl plačių propolio pritaikymo galimybių, yra modeliuojamos įvairios pusiau kietos sistemos su juo. Žilius [9] nustatė, kad daugiausiai veikliųjų junginių atsipalaidavo iš KMC–Na ir poloksamero 407 hidrogelio (~100 proc.), lyginant su tepalu (~5 proc.) ir vanduo–aliejus tipo kremu (~22 proc.), naudojant išgrynintą vandenį kaip akceptorinę terpę. Bruschi ir kt. [49] sumodeliavo gelį su poloksameru 407, karbopoliu 934P ir etanoliniu propolio ekstraktu, skirtą gydyti periodonto ligas. Jų atlikto in vitro atpalaidavimo tyrimo metu, veikliųjų junginių atsipalaidavo ~80 proc., kaip akceptorinę terpę naudojant dirbtines seiles. Pereira ir kt. [10] taip pat modeliavo hidrogelį su poloksameru 407, karbopoliu 934P ir etanoliniu propolio ekstraktu, skirtu gydyti vulvovaginalinę kandidozę. Atlikdami atpalaidavimo tyrimą in vitro, kaip akceptorinę terpę naudojo išgrynintą vandenį, ir nustatė, kad
priklausomai nuo gelifikuojančių medžiagų koncentracijos, veikliųjų junginių atsipalaidavo nuo 71,96 proc. iki 93,92 proc.
Propoliui būdingas įvairus poveikis, todėl jo pritaikymo galimybės vis labiau plečiasi įvairiose srityse. Lietuvos rinkoje galima rasti įvairiausių produktų su propoliu: pradedant nuo purškalų, tablečių, ekstraktų, tepalų, baigiant kojų purškalu su propolio vandeniniu ekstraktu. Dėl propolio augančio populiarumo, visame pasaulyje yra atliekama vis daugiau mokslinių tyrimų, kuriais remiantis yra gilinamos ir plečiamos sukauptos žinios apie šią žaliavą, ir jos naudojimą farmacinių preparatų kūrime.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimų medžiagos ir įranga
2.1.1. Naudotos medžiagos
Standartizuota propolio žaliava (UAB „Medicata Filia“ Vilnius, Lietuva) 1,2–propandiolis ≥ 99,5 proc. (Carl Roth GmbH+Co, Vokietija)
Hidroksietilceliuliozė (Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija)
Hidroksipropilmetilceliuliozė (Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija) Metilceliuliozė (Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija)
Karboksimetilceliuliozės natrio druska (vidutinės klampos) (Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija)
Etanolis 96 proc. (AB „Stumbras”, Kaunas, Lietuva)
2.1.2. Naudota įranga
Kapiliarinis skysčių chromatografas (Agilent 1260 Infinity Capillary LC–DAD, Agilent technologies Inc., Santa Clara, JAV)
Svarstyklės (Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)
Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi (IKA–Werke GmbH & Co.KG, Staufenas, Vokietija)
Vibracinis viskozimetras (Vibro viscometer SV–10, A&D Company ltd, Japonija)
pH–metras (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, (Knick Elektronische Messgerate GmbH and Co, Vokietija))
2.2. Tyrimų metodai
2.2.1. Vandeninės propolio ištraukos gamyba
Vandeninė propolio ištrauka gaminta ant magnetinės maišyklės IKAMAG® C–MAG HS7 70°C temperatūroje naudojant propolio žaliavą ir išgrynintą vandenį, santykiu 1:50. Fenolinių junginių ekstrakcija vykdyta dviem etapais: pirma propolio žaliavos porcija (santykiu 1:50) laikyta 1 val., po to išimta. Antra porcija propolio žaliavos (santykiu 1:50) dėta į pagamintą pirminę propolio ištrauką ir laikyta 30 min. Maišymo greitis – 750 aps./min. Pagaminta propolio ištrauka filtruota naudojant vakuuminę filtravimo sistemą.
2.2.2. Propolio vandeninės ištraukos analizė efektyviąja skysčių chromatografija
Vandeninė propolio ištrauka analizuota naudojant Agilent 1260 Infinity kapiliarinį skysčių chromatografą (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) su diodų matricos detektoriumi. Chromatografinės analizės sąlygos nurodytos 3 lentelėje [9].
3 lentelė. Cromatografinės analizės sąlygos
Parametras Sąlygos
Kolonėlė C18 (150 × 0,5 mm, 5 µm dydžio dalelėmis)
Judrios fazės sudėtis Eliuentas A: 0,5 proc. vandeninis acto rūgšties tirpalas Eliuentas B: acetonitrilas
Linijinio gradiento kitimas Eliuentas B nuo 1 iki 21 proc. eliuente A 25 min. Injekcijos tūris 0,2 µl
Tėkmės greitis 20 µl/min.
Kolonėlės temperatūra 25 °C
Detekcija 290 nm
Fenolinių rūgščių: vanilo, kavos, p–kumaro, ferulo ir fenolinio aldehido vanilino tapatybė identifikuota lyginant jų spektrus su standartų spektrais 210–600 nm bangos ilgio intervale.
2.2.3. Fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumo tyrimas
Fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumas vertintas vandeniniuose 1,2–propandiolio 5 proc., 10 proc. ir 20 proc. koncentracijų tirpaluose. Į pagamintus tirpalus dėta standartizuotos propolio žaliavos, santykiu 1:50. Mišiniai 24 val. laikyti 37°C temperatūroje, inkubacinėje purtyklėje. Purtymo greitis – 100 k./min. Gauti tirpalai analizuoti ESC metodu.
2.2.4. Eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių gamyba
Celiulioziniai hidrogeliai gaminti su vandenine propolio ištrauka (VPI) arba išgrynintu vandeniu, abiejuose hidrogelių tipuose atitinkamai naudojant vienodas gelifikuojančių medžiagų koncentracijas.
Celiuliozinių hidrogelių, su vandenine propolio ištrauka (VPI) arba išgrynintu vandeniu sudėtys pateiktos 4 lentelėje.
4 lentelė. Celiuliozinių hidrogelių sudėtys
Eil. Nr. Komponentai (proc.) Hidroksietil-celiuliozė Hidroksipropil-metilceliuliozė Metilceliuliozė Karboksimetil-celiuliozės natrio druska VPI/H2O 1 5 - - - 95 2 10 - - - 90 3 11 - - - 89 4 12 - - - 88 5 - 5 - - 95 6 - 10 - - 90 7 - 12 - - 88 8 - 13 - - 87 9 - 14 - - 86 10 - - 5 - 95 11 - - 10 - 90 12 - - 15 - 85 13 - - 16 - 84
4 lentelė, tęsinys Eil. Nr. Komponentai (proc.) Hidroksietil– celiuliozė Hidroksipropil– metilceliuliozė Metilceliuliozė Karboksimetil– celiuliozės natrio druska VPI/H2O 14 - - 17 - 83 15 - - 18 - 82 16 - - - 4 96 17 - - - 5 95 18 - - - 6 94
Gaminant celiuliozinius hidrogelius buvo atsvertas atitinkamas propolio vandeninės ištraukos arba išgryninto vandens kiekis, ir pridėtas atitinkamas kiekis celiuliozės darinių. Ant magnetinės maišyklės (IKA–Werke GmbH & Co.KG, Staufenas, Vokietija) maišyta 15 min. kambario temperatūroje; maišymo greitis – 250 aps./min. Toliau laikyta +4°C temperatūroje, kol išbrinks.
2.2.5. Eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių fizikinių savybių vertinimas
Eksperimentinių hidrogelių pH reikšmė vertinta naudojant pH–metrą (pH–meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Messgerate GmbH and Co, Vokietija), o dinaminė klampa nustatyta vibraciniu viskozimetru (Vibro viscometer SV–10, A&D Company ltd, Japonija). Po to pagaminti celiulioziniai hidrogeliai su vandenine propolio ištrauka, ir vertintos jų pH ir dinaminės klampos reikšmės. Matavimai atlikti kambario temperatūroje.
2.2.6. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo iš eksperimentinių
celiuliozinių hidrogelių tyrimas in vitro
Eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių su vandenine propolio ištrauka atpalaidavimo in
vitro tyrimai atlikti naudojant Franz tipo modifikuotas difuzines celes. Difuzijos plotas – 1,77 cm2. Į celę su regeneruotos celiuliozės dializės membrana Cuprophan® (Medicell International Ltd., Londonas, Didžioji Britanija) buvo dedama donorinės fazės begalinė dozė (1±0,01 g). Membranos
prieš eksperimentą laikytos išgrynintame vandenyje (~30°C), kad išbrinktų. Pasirinktas terpės tūris užtikrino fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumą ir tirpimą, vykstant difuzijos procesui. Akceptorinė terpė maišyta naudojant magnetinę maišyklę IKAMAG® C–MAG HS7 su kaitinamuoju paviršiumi (IKA–Werke GmbH & Co.KG, Staufenas, Vokietija) palaikant 37±0,5°C temperatūrą. Akceptorinės terpės mėginiai imti po 0,25, 0,5, 1, 2, 4 val., įpilant tokį patį tūrį šviežios akceptorinės terpės. Mėginiai analizuoti ESC metodu.
2.2.7. Statistinis duomenų vertinimas
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2007 ir SPSS 19.0 statistinius duomenų analizės paketus. Skaičiuoti gautų rezultatų vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, taikytas Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas, vieno faktoriaus dispersinės analizės modelis (One–Way ANOVA), naudojant LSD (angl. Least Significant Difference) kriterijų. Eksperimentinis optimizavimas atliktas naudojant Design–Expert 6.0 paketą ir taikant optimalaus mišinio modelį (angl. D–optimal mixture design).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Propolio vandeninės ištraukos kokybinės ir kiekybinės sudėties vertinimas
Propolio vandeninė ištrauka gaminta iš Lietuvoje surinktos propolio žaliavos dviem etapais, kurių metu naudotas žaliavos ekstrahento santykis 1:50. Įvertinus ištraukos kokybinę sudėtį, joje nustatyti šie junginiai: fenolinės rūgštys: vanilo, kavos, p–kumaro, ferulo, ir fenolinis aldehidas vanilinas, kurių suminis kiekis buvo 264,72±19,10 µg/ml. Didžiausia koncentracija vandeninėje propolio ištraukoje, nustatyta p–kumaro rūgšties: ji sudarė 35,16±1,81 proc. visų nustatytų fenolinių rūgščių ir aldehidų. Taip pat nustatyta 27,30±2,37 proc. vanilino ir 18,28±1,36 proc. ferulo rūgšties. Vanilo rūgšties ir kavos rūgšties vandeninėje propolio ištraukoje nustatyta atitinkamai 16,95±1,52 proc. ir 2,31±0,26 proc.
Gauti duomenys patvirtina, kad iš Lietuvoje surinktos propolio žaliavos daugiausiai išekstrahuojama p–kumaro, ferulo rūgščių ir vanilino [3,9]. Taip pat nustatyta, kad naudojant mažesnį žaliavos–ekstrahento santykį (2x1:50), išekstrahuotų fenolinių junginių koncentracija yra didesnė, tačiau procentinės fenolinių junginių dalys ištraukoje išlieka panašios, lyginant su ištrauka, kurios gamyboje naudotas didesnis žaliavos–ekstrahento santykis (1:100) [9].
3.2. Fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumo vertinimas vandeniniuose 1,2 –
propandiolio tirpaluose
Remiantis literatūros duomenimis, atliekant veikliųjų junginių iš hidrogelių atpalaidavimo tyrimus in vitro ir naudojant vandeninę akceptorinę terpę, veikliųjų junginių atsipalaiduoja iki 100 proc. [9, 10]. Tai siejama su galimu hidrogelio tirpimu vandeninei akceptorinei terpei prasiskverbiant pro pusiau pralaidžią membraną tyrimo metu [9, 49]. Norint išvengti tokio poveikio hidrogeliui, buvo ieškoma akceptorinės terpės, kuri mažiau jį paveiktų. Buvo vertinamas fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumas vandeniniuose 1,2–propandiolio 5 proc., 10 proc. ir 20 proc. tirpaluose.
Vandeninių 1,2–propandiolio tirpalų koncentracijos įtaka propolio fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumui pateikta 5 lentelėje.
5 lentelė. 1,2 – propandiolio vandeninio tirpalo koncentracijos įtaka fenolinių rūgščių ir vanilino tirpumui 1,2– propandiolio tirpalo koncentracijos, proc.
Fenolinių junginių koncentracija, (µg/ml)
Vanilo rūgštis Kavos
rūgštis Vanilinas p-Kumaro rūgštis Ferulo rūgštis 5 41,45±2,69 5,80±0,49 74,45±2,12 93,83±5,62 48,55±4,53 10 56,28±1,80 8,00±0,14 96,28±4,00 126,90±5,23 64,43±2,79 20 44,68±0,11 6,68±0,95 80,08±5,76 97,15±5,94 53,68±2,02
Didžiausias bendras ištirpusių fenolinių rūgščių ir vanilino kiekis nustatytas 10 proc. vandeniniame 1,2–propandiolio tirpale – 353,88±13,97 µg/ml. Tai yra 125–134 proc. daugiau nei atitinkamai 20 proc. ir 5 proc. 1,2–propandiolio vandeniniuose tirpaluose. Vertinant ištirpusį atskirų fenolinių rūgščių ir aldehidų kiekį, 10 proc. vandeninis 1,2–propandiolio tirpalas ištirpino nuo 120 proc. iki 138 proc. daugiau šių junginių, nei 20 proc. ir 5 proc. 1,2–propandiolio vandeniniai tirpalai.
1,2–propandiolis yra tirpiklis, kuris pagerina fenolinių junginių tirpumą, lyginant su vandeniu, ir yra tinkamas fenolinių junginių ekstrakcijai [50]. Taip pat grynas 1,2–propandiolis yra klampus skystis, taigi didesnės koncentracijos vandeniniai 1,2–propandiolio tirpalai taip pat yra klampesni, nei mažesnės koncentracijos tirpalai. Šios 1,2–propandiolio savybės gali būti siejamos su didesniu ištirpusių fenolinių rūgščių ir aldehidų kiekiu 10 proc. 1,2–propandiolio tirpale, lyginant su 5 proc. 20 proc. tirpalais. 10 proc. vandeninis tirpalas fenolinius junginius tirpina geriau nei 5 proc. dėl didesnės 1,2–propandiolio koncentracijos, tuo tarpu 20 proc. tirpalas yra klampesnis nei 10 proc. ir jame ištirpsta mažiau fenolinių junginių. Remiantis gautais duomenimis, atpalaidavimo tyrimui in vitro kaip akceptorinė terpė pasirinktas vandeninis 1,2–propandiolio 10 proc. tirpalas.
3.3. Celiuliozinių hidrogelių klampos ir pH vertinimas
Celiulioziniai hidrogeliai buvo gaminami naudojant įvairias gelifikuojančių medžiagų koncentracijas, įvertinant jų dinaminės klampos ir pH reikšmes. Atpalaidavimo tyrimui in vitro buvo pasirinkti standžios konsistencijos celiulioziniai hidrogeliai su vandenine propolio ištrauka, nes skystesnė hidrogelio matrica galėjo būti stipriau paveikta akceptorinės terpės. Taip pat pagaminti hidrogeliai, naudojant didesnes ir mažesnes gelifikuojančios medžiagos koncentracijas už pasirinktas,
kad būtų įsitikinta, jog pasirinktas hidrogelis yra tinkamiausias, pagal anksčiau įvardintą kriterijų, atpalaidavimo tyrimams in vitro atlikti.
Celiuliozinių hidrogelių su išgrynintu vandeniu ir vandenine propolio ištrauka dinaminių klampų reikšmės pateiktos 6 lentelėje.
6 lentelė. Celiuliozinių hidrogelių su išgrynintu vandeniu ir vandenine propolio ištrauka dinaminių klampų reikšmės, Pa·s
Gelifikuojan-čios medžiagos koncentracija, % Gelifikuojanti medžiaga HEC HPMC MC KMC - Na
vanduo VPI vanduo VPI vanduo VPI vanduo VPI
4 - - - 1,21±0,01 1,39±0,04 5 1,1±0,01 1,24±0,01 0,70±0,01 0,80±0,01 0,12±0,04 0,14±0,02 2,28±0,03 2,34±0,01 6 - 2,22±0,01 - - - - 4,32±0,03 4,71±0,02 7 - - - 2,42±0,02 - - - - 10 6,27±0,04 7,00±0,06 5,79±0,01 6,29±0,02 2,10±0,01 2,21±0,01 - - 11 8,32±0,03 9,20±0,04 - - - - 12 > 11 > 11 10,28±0,01 11,71±0,02 - - - - 13 - - 11,28±0,04 > 11 - - - - 14 - - > 11 > 11 - - - - 15 - - - - 8,56±0,05 9,18±0,03 - - 16 - - - - 11,08±0,01 11,25±0,06 - - 17 - - - - > 11 > 11 - - 18 - - - - > 11 > 11 - -
Nepriklausomai nuo celiuliozės tipo, į celiuliozinius hidrogelius įterpus vandeninę propolio ištrauką, gelių dinaminė klampa padidėjo 101–117 proc., lyginant su atitinkamos koncentracijos celiulioziniais hidrogeliais su išgrynintu vandeniu. KMC–Na hidrogelių atveju, didinant gelifikuojančios medžiagos koncentraciją nuo 4 proc. iki 6 proc., dinaminė klampa padidėjo 3,4–3,6 karto priklausomai nuo vandeninės fazės. 5 proc. KMC–Na hidrogelio su VPI konsistencija buvo standi. Mažesnės nei 5 proc. kocentracijos KMC–Na hidrogelių konsistencija buvo skysta, o naudojant didesnes nei 5 proc. KMC–Na koncentracijas hidrogelių konsistencija standėja, kol gaunami drebučiai, ir gelis nebesusiformuoja.
Didinant HEC koncentraciją nuo 5 proc. iki 10 proc., hidrogelių dinaminė klampa padidėja 5,6–5,7 karto, priklausomai nuo vandeninės fazes. Padidinus HEC koncentraciją iki 12 proc. – dinaminė klampa padidėja iki > 11 Pa·s, ir jos su naudota aparatūra išmatuoti nepavyko. Esant HEC koncentracijai 11 proc., gautas standžios konsistencijos hidrogelis su VPI. Kai HEC koncentracija hidrogeliuose yra ≤ 10 proc., gaunami skystos – tirštos konsistencijos hidrogeliai, o naudojant didesnes
nei 12 proc. HEC koncentracijas, hidrogelis nesusiformuoja ir gaunami drebučiai. Padidinus HPMC koncentraciją nuo 5 proc. iki 10 proc., dinaminė klampa padidėja 7,2–8,3 karto priklausomai nuo vandeninės fazės. Toliau didinant HPMC koncentraciją iki 13 proc., dinaminė klampa celiuliozinio hidrogelio su VPI padidėja iki > 11 Pa·s, ir jos išmatuoti nepavyko. Esant HPMC koncentracijai 13 proc., gautas standžios konsistencijos hidrogelis su VPI. Kai HPMC koncentracija hidrogelyje buvo ≤ 12 proc., gauti skystos – tirštos konsistencijos hidrogeliai, o naudojant didesnes nei 14 proc. HPMC koncentracijas susidaro drebučiai. Padidinus MC koncentraciją hidrogeliuose nuo 5 proc. iki 15 proc., dinaminės klampos reikšmė padidėja 66–71,3 kartus priklausomai nuo vandeninės fazes. Standžios konsistencijos celiuliozinis hidrogelis su VPI buvo gautas naudojant 17 proc. MC koncentraciją. Hidrogelių gamyboje naudojant ≤ 16 proc. MC koncentracijas, gaunami skystos – tirštos konsistencijos hidrogeliai, o kai koncentracija > 18 proc. gelis nesusiformuoja – susidaro drebučiai.
Remiantis gautais duomenimis, in vitro atpalaidavimo tyrimams atlikti pasirinkti standžios konsistencijos hidrogeliai su VPI, kuriuose buvo tokios gelifikuojančių medžiagų koncentracijos: HEC 11 proc., HPMC 13 proc., MC 17 proc., KMC–Na 5 proc. Kai gelifikuojančios medžiagos koncentracijos yra mažesnės už nurodytas, gaunamos skystos – tirštos sistemos. Esant didesnėms nei nurodyta gelifikuojančių medžiagų koncentracijoms, hidrogeliai nebesusiformuoja, o susidaro drebučiai, nes gelifikuojančios medžiagos nebeišbrinksta esančiame skysčio kiekyje.
Celiuliozinių hidrogelių su išgrynintu vandeniu ir vandenine propolio ištrauka pH reikšmės pateiktos 7 lentelėje.
7 lentelė. Celiuliozinių hidrogelių su išgrynintu vandeniu ir vandenine propolio ištrauka pH reikšmės
Konc, %
Gelifikuojanti medžiaga
HEC HPMC MC KMC - Na
vanduo VPI vanduo VPI vanduo VPI vanduo VPI
4 - - - 6,73±0,03 5,86±0,03 5 5,95±0,02 5,40±0,01 6,62±0,02 4,2±0,04 7,45±0,02 4,29±0,01 6,77±0,02 5,96±0,02 6 - 5,57±0,01 - - - - 6,98±0,03 5,97±0,02 7 - - - 4,30±0,02 - - - 10 6,03±0,01 5,78±0,01 6,96±0,02 4,39±0,03 7,65±0,03 4,71±0,02 - - 11 6,07±0,01 6,05±0,01 - - - - 12 6,11±0,03 6,07±0,01 6,99±0,02 4,63±0,02 - - - 13 - - 7,00±0,01 4,69±0,01 - - - 14 - - 7,04±0,04 4,70±0,02 - - - 15 - - - - 7,75±0,03 5,10±0,03 - - 16 - - - - 7,79±0,01 5,47±0,04 - - 17 - - - - 7,79±0,01 5,51±0,03 - -
7 lentelė, tęsinys
Konc, %
Gelifikuojanti medžiaga
HEC HPMC MC KMC - Na
vanduo VPI vanduo VPI vanduo VPI vanduo VPI
18 - - - - 7,79±0,01 5,53±0,01 - -
Eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių su VPI pH reikšmės nustatytos intervale 4,2±0,04– 6,07±0,01, o su išgrynintu vandeniu – 5,95±0,02–7,79±0,01. HEC hidrogelių su VPI ir KMC–Na hidrogelių su VPI pH reikšmės sumažėjo atitinkamai 0,5–9 proc. ir 12–14 proc. lyginant su atitinkamos koncentracijos celiuliozinių hidrogelių su išgrynintu vandeniu pH reikšmėmis. HPMC ir MC hidrogelių su VPI atveju, pH reikšmės sumažėjo atitinkamai 33–37 proc. ir 29–42 proc., lyginant su atitinkamos koncentracijos celiulioziniais hidrogeliais su išgrynintu vandeniu.
Remiantis literatūros duomenimis, odos paviršiaus pH yra rūgštinis, intervale 4–6 [51, 52]. Visų celiuliozinių hidrogelių su VPI pH reikšmės (4,2±0,04–6,07±0,01) yra artimos odos pH, ir jie visi yra tinkami užnešti ant odos.
3.4. Fenolinių rūgščių ir vanilino atpalaidavimo iš eksperimentinių
celiuliozinių hidrogelių tyrimo in vitro vertinimas
Norint parinkti tinkamiausią akceptorinę terpę in vitro atpalaidavimo tyrimui, kuri kuo mažiau veiktų hidrogelį, buvo atlikti eksperimentiniai tyrimai, kaip akceptorinę terpę naudojant 5 proc. ir 30 proc. etanolio vandeninius tirpalus. Šie tirpalai buvo atmesti, nes pastebėta, kad tyrimo pabaigoje akceptorinės terpės buvo sumažėję ~15 proc. pradinio tūrio, dėl galimo etanolio nugaravimo ar akceptorinės terpės difuzijos pro celiuliozinę membraną.
Suminio fenolinių junginių kiekio, atpalaiduoto iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių su vandenine propolio ištrauka, kinetika pavaizduota 5 paveiksle. Šių puskiečių formų in vitro atpalaidavimo tyrimo duomenys atitinka Higuchi matematinį modelį (R² = 0,9653–0,9985).
In vitro atpalaidavimo tyrimo duomenys parodė, kad didžiausias suminis fenolinių junginių
kiekis atpalaiduotas iš celiuliozinių hidrogelių su VPI per pirmą tyrimo valandą. Toliau kas valandą suminis atpalaiduotų fenolinių junginių kiekis iš HEC ir HPMC hidrogelių pradėjo mažėti tolygiai, o iš KMC–Na ir MC hidrogelių jis mažėjo netolygiai. Nustatyta, kad per 4 val. iš HEC, KMC–Na, HPMC, ir MC hidrogelių atsipalaidavo atitinkamai 56,43±1,84 µg/cm2, 48,81±3,09 µg/cm2, 44,59±6,94
µg/cm2 ir 39,27±2,72 µg/cm2 fenolinių junginių. Šie rezultatai parodė, kad per 4 valandas iš HEC
5 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio, atpalaiduoto iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių su vandenine propolio ištrauka, kinetika
Statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05) nustatytas tarp iš HEC hidrogelio atsipalaidavusių fenolinių junginių kiekio ir iš likusių hidrogelių atsipalaidavusių fenolinių junginių kiekio. Įvertintas atskirų tirtų fenolinių junginių atpalaidavimas in vitro iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių. p–Kumaro rūgšties atpalaidavimas iš celiuliozinių hidrogelių pateiktas 6 paveiksle.
Nustatyta, kad daugiausiai p–kumaro rūgšties iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių atsipalaidavo per pirmą tyrimo valandą. Toliau atpalaiduotas p–kumaro rūgšties kiekis iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių pradėjo mažėti. Antrą tyrimo valandą didžiausias atpalaiduotas p–kumaro rūgšties kiekis nustatytas iš KMC–Na hidrogelio: 114–196 proc. didesnis nei iš likusių hidrogelių. Per tolimesnes tyrimo valandas (2–4 val.) nustatyta, kad iš šio hidrogelio p– kumaro rūgšties atpalaidavimas sulėtėjo, o iš likusių hidrogelių šios rūgšties atpalaidavimas pagreitėjo, lyginant su antros valandos tyrimo duomenimis. Po 4 val. didžiausias atpalaiduotas p–kumaro rūgšties kiekis nustatytas iš HEC hidrogelio: 120–200 proc. daugiau nei iš likusių hidrogelių.
Vanilino atpalaidavimas iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių pateiktas 7 paveiksle. Daugiausiai vanilino iš šių hidrogelių atsipalaidavo per pirmą tyrimo valandą, ir toliau atpalaiduotas vanilino kiekis iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių pradėjo mažėti. Antrą tyrimo valandą daugiausiai vanilino atpalaidavo KMC–Na hidrogelis, 107–156 proc. daugiau lyginant su kitais tirtais hidrogeliais. Nustatyta, kad per antrą–ketvirtą tyrimo valandas KMC–Na ir MC hidrogelių atpalaiduotas šio aldehido kiekis sumažėjo, o HEC ir HPMC – padidėjo, lyginant su tyrimo antros valandos duomenimis. Po 4 val. didžiausias atpalaiduoto vanilino kiekis nustatytas iš HEC hidrogelio: 106–162 proc. daugiau nei iš likusių tirtų eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių.
7 pav. Vanilino atpalaidavimas iš celiuliozinių hidrogelių
Ferulo rūgšties atpalaidavimas iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių pateiktas 8 paveiksle.
8 pav. Ferulo rūgšties atpalaidavimas iš celiuliozinių hidrogelių
Daugiausiai ferulo rūgšties iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių atsipalaidavo per pirmą tyrimo valandą. Toliau atpalaiduotas ferulo rūgšties kiekis mažėjo. Antrą tyrimo valandą jos daugiausiai nustatyta atpalaiduotos iš KMC–Na hidrogelio: 1,4–2,6 karto daugiau nei iš kitų tirtų celiuliozinių hidrogelių. Nustatyta, kad antrą–ketvirtą tyrimo valandas atpalaiduotas iš KMC–Na ir MC hidrogelių ferulo rūgšties kiekis sumažėjo, o iš likusių dviejų hidrogelių – padidėjo, lyginant su in
vitro tyrimo antros valandos duomenimis. Po 4 val. daugiausiai ferulo rūgšties atpalaidavo HEC
hidrogelis: 122–260 proc. daugiau nei likę celiulioziniai hidrogeliai.
Vanilo rūgšties atpalaidavimas iš eksperimentinių celiuliozinių hidrogelių pateiktas 9 paveiksle.
Didžiausias vanilo rūgšties kiekis iš celiuliozinių hidrogelių buvo atpalaiduotas per pirmą tyrimo valandą, ir toliau jis mažėjo. Nustatyta, kad antrą–ketvirtą tyrimo valandas atpalaiduotas vanilo rūgšties kiekis iš KMC–Na hidrogelio sumažėjo, o iš kitų hidrogelių – padidėjo, lyginant su in vitro tyrimo antros valandos duomenimis. 108–139 proc. daugiau šios rūgšties po 4 val. atpalaidavo MC hidrogelis, nei likę eksperimentiniai hidrogeliai.
Veikliųjų junginių atpalaidavimui iš gelių turi įtakos gelifikuojančios medžiagos tipas, jos koncentracija, veikliųjų junginių tiekimo sistemos klampa, veikliųjų junginių fizikinės savybės [53]. Iš HEC hidrogelio su VPI didžiausias atpalaiduotų fenolinių junginių kiekis gali būti siejamas su stipriausiu akceptorinės terpės poveikiu šiam hidrogeliui. Veikiant akceptorinei terpei, vandeninė gelio matrica hidratuojasi, padidėja tarpai tarp polimero molekulių, sumažėja dinaminė klampa ir akceptorinė terpė lengviau patenka į hidrogelio struktūrą ir pradeda jį tirpinti, taip sudarydama sąlygas greitesnei veikliųjų junginių difuzijai į akceptorinę terpę [53]. Iš pateiktų duomenų matyti, kad didžiausios klampos hidrogeliai (17 proc. MC ir 13 proc. HPMC hidrogeliai, kurių klampa didesnė nei 11 Pa·s), atpalaidavo mažiau fenolinių junginių, nei mažesnės klampos hidrogeliai (11 proc. HEC ir 5 proc. KMC–Na hidrogeliai, kurių klampa atitinkamai 9,20±0,04 Pa·s ir 2,34±0,01 Pa·s). KMC–Na hidrogelio dinaminė klampa mažesnė už HEC hidrogelio dinaminę klampą (2,34 < 9,20 Pa·s), tačiau daugiau fenolinių junginių atpalaidavo HEC hidrogelis, dėl stipresnio anksčiau aprašyto akceptorinės terpės poveikio šiam hidrogeliui. Mažiausias atsipalaidavusių fenolinių junginių kiekis iš MC, kuriame buvo didžiausia gelifikuojančios medžiagos koncentracija, gali būti paaiškintas tuo, kad didėjant gelifikuojančios medžiagos koncentracijai, yra apsunkinamas veikliųjų junginių judėjimas gelio matrica, taigi jų difuzija į akceptorinę terpę sulėtėja [54]. Mažesnės molekulinės masės fenolinių junginių (p–kumaro rūgštis, vanilinas, vanilo rūgštis) iš gelių atsipalaidavo daugiau, nei didesnės molekulinės masės junginių (ferulo rūgštis). Molekulinių masių skirtumu gali būti paaiškintas didesnis atsipalaidavusios vanilo, lyginant su ferulo rūgštimi, kiekis, nors pastarosios vandeninėje propolio ištraukoje išekstrahuota daugiau. Kavos rūgšties, kurios vandeninėje propolio ištraukoje buvo mažas kiekis, šio in vitro tyrimo metu nenustatyta atsipalaidavusios iš jokio hidrogelio.
Siekiant įvertinti gelifikuojančios medžiagos įtaką fenolinių junginių atpalaidavimui in vitro, šis tyrimas atliktas su celiulioziniais hidrogeliais, kurių klampa buvo 2,21±0,01–2,42±0,02 Pa·s. Eksperimentiniai hidrogeliai gaminti panašios klampos į KMC–Na 5 proc. hidrogelio klampą (±10 proc.), kadangi naudojant mažiausiais šios gelifikuojančios medžiagos koncentracijas, lyginant su kitais tirtais celiuliozės dariniais, gaunami standžios konsistencijos hidrogeliai. Naudojant didesnes KMC–Na koncentracijas, susidaro drebučiai. Pagaminti celiulioziniai hidrogeliai, kurių gelifikuojančios medžiagos koncentracijos buvo: 5 proc. KMC–Na, 6 proc. HEC, 7 proc. HPMC, 10 proc. MC. 6 proc. HEC, 7 proc. HPMC ir 10 proc. MC hidrogeliai buvo skystos konstistencijos, o 5
