LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Martynas Čepulis
Putliųjų ląstelių kiekis kalių pieno liaukos navikuose ir ryšys su angiogeneze
Mast cell count in canine mammary gland tumors and relation with
angioneogenesis
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc. dr. Nomeda Juodžiukynienė
2
TURINYS
Santrauka ... 4
Įvadas ... 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 7
1.1 Pieno liaukos anatomija ... 7
1.2Pieno liaukos navikų klasifikacija ... 8
1.3Pieno liaukos navikų aprašymai pagal naują klasifikaciją ... 11
1.4 Putliosios ląstelės ... 20 1.5 Imunohistocheminiai tyrimai ... 21 2. DARBO METODIKA ... 23 2.1 Imunohistocheminiai tyrimai ... 24 3. TYRIMO REZULTATAI ... 25 4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 31 IŠVADOS ... 32 PADĖKA ... 33 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 34
3
DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Putliųjų ląstelių kiekis kalių pieno liaukos navikuose ir ryšys su angiogeneze“
1. Yra atliktas mano paties;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
4
Santrauka
Putliųjų ląstelių kiekis kalių pieno liaukos navikuose ir ryšys su angiogeneze Martynas Čepulis
Magistro baigiamasis darbas
Pieno liaukos navikai tai vieni iš dažniausiai pasitaikančių šunų navikinių susirgimų. Pagrindinis faktorius įtakojantis navikinio audinio proliferaciją – angioneogenzė. Kuo labiau esti vaskuliarizuotas navikinis audinys tuo greitesnis jo augimas, bei didesnė metastazavimo tikimybė. Darbo tikslas buvo išsiaiškinti naujų kraujagyslių formavimosi ir putliųjų ląstelių ryšį kalių pieno liaukos navikuose. LSMU VA Dr. L. Kriaučeliūno klinikose ir X klinikoje Klaipėdoje operacijų (mastektomijų) metu buvo surinkti pieno liaukos navikų mėginiai. Iš surinktų mėginių LSMU VA Patologijos centre padaryti histologiniai preparatai. Imunohistocheminiai tyrimai naudojant žymenį CD31 atlikti LSMU MA Histologijos ir embriologijos katedroje. Preparatuose suskaičiuotos putliosios ląstelės bei kapiliarai. Buvo nustatyta jog daugumoje pieno liaukos navikų didėjant putliųjų ląstelių skaičiui didėja ir naujų kapiliarų skaičius. Suskaičiuotas koreliacijos koeficientas (0,7) rodo gana stiprią šių kintamųjų tarpusavio priklausomybę. Taip pat buvo surinkti gyvūnų sirgusių pieno liaukos navikais gyvenimo anamnezės duomenys. Buvo paskaičiuota susirgimų pieno liaukos navikais priklausomybė nuo: lyties, veislės ir amžiaus, paskaičiuotas tyrimų patikimumai. Duomenų skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais jei p<0,05, nereikšmingais kai p≥0,05.
5
Summary
Mast cell count in canine mammary gland tumors and relation with angioneogenesis
Martynas Čepulis Master‘s Thesis
Mammary gland tumors are one of the most common cannine tumors. The main factor affecting neoplasm proliferation is angioneogenesis. The more vasculiarised the toumor tissue is the faster it grows and the grater chance of metastasis to other organs. The purpouse of the study was to find the correlation between angioneogenesis and mast cell cout in cannine mammary gland tumors. Mammary gland tumour samples were taken during surgery at Dr. L. Kriaučeliūnas small animal clinic of Lithuanian University of Health Sciences and in small animal clinic in Klaipeda. From the taken samples histological specimens were made at the Centre of Pathology of Lithuanian University of Health Sciences. Immunohistochemical reactions using immunohistochemical marker CD31 were made at Department of Histology and Embryology of Lithuanian University of Health Sciences. In the prepared samples mast cells and new capillaries were counted. Correlation coefficient was calculated (0,7), witch shows a strong affinity between mast cell count and count newlly formed blood vessles in canine mammary gland tumors. Anamnesis vitae was colected and reacerch about:brees, sex, and age presisposition was made. The probobility of the differences between two supplied data sets was calculated. The differences were statisticly significent if p<0,05 and insignificent if p≥0,05.
6
Įvadas
Pieno liaukos navikai yra dažniausiai pasitaikantys šunų patelių navikiniai susirgimai.Jie sudaro pusę visų kalėms pasitaikančių navikinių susirgimų. Kalėms pieno liaukos navikai pasitaiko žymiai dažniau nei patinams, taip pat patinams pasitaikantys navikai dažniau būna gerybiniai. Pusė visų pasitaikančių pieno liaukos navikų būna piktybiniai ir pusė iš jų būna linkę metastazuoti.Vidutinis kalių sergančių pieno liaukos navikais amžius yra 8 metai. Tam tikrų veislių šunys yra linkę sirgti pieno liaukos navikais: nykštukiniai pudeliai, anglų springer spanieliai, anglų ir amerikiečių kokerspanieliai, anglų seteriai, vokiečių aviganiai. Yra nustatyta, jog lytinų hormonų poveikis stimuliuoja pieno liaukų navikų atsiradimą. Jei kalėms iki 2 metų amžiaus yra atliekama ovariohisterektomija tai smarkiai sumažina pieno liaukos navikinių susirgimų rizika. Jei ovariohisterektomija atliekama iki pirmos rujos tai rizika susirgti PL navikais mažesnė nei 0,5%, jei OHE atliekama iki antrosios rujos tai rizika sumažinama iki 8%. Veterinarijos gydytojui svarbu teisingai diagnozuoti pieno liaukos navikus.(1) Naudojant histologinius ir imunohistocheminius tyrimus galima tiksliai nustatyti naviko tipą, įvertinti jo metastazavimo galimybes. Tai galima padaryti įvertinant naujų kraujagyslių formavimosi intensyvumą navike, besidalijančių ląstelių kiekį. Pastaruoju metu atlikta nemažai tyrimų, kuriais siekiama išsiaiškinti putliųjų ląstelių vaidmenį naviko vystymęsi. Putliosios ląstelės – tai iš kaulų čiulpų kilusios ląstelės, dalyvaujančios organizmo uždegiminėse ir alerginėse reakcijose, pastaruoju metu remiantis daugeliu studijų – ir naviko augime, plitime. Šių ląstelių išskiriami vazoaktyvūs uždegimo mediatoriai veikia navikines ląsteles ir skatina naviko angioneogenezę – naujų kraujagyslių formavimąsi naviko audiniuose ir aplink jį, taip sudarant sąlygas gerai naviko mitybai ir plitimui.(2) Tiksli histologinė navikų klasifikacija ir naviko biologijos įvertinimas naudojant papildomus tyrimus (pvz., imunohistocheminius, histocheminius) gali padėti veterinarijos patologui geriau nustatyti prognozę ir baigtį, ir padėti veterinarijos gydytojui parinkti tinkamą gydymo būdą.(1)
Darbo tikslas: įvertinti naujų kraujagyslių formavimąsi ir jų ryšį su putliosiomis ląstelėmis kalių
pieno liaukų navikuose.
Darbo uždaviniai:
1. įvertinti naujų kraujagyslių formavimąsi kalių pieno liaukos navikuose naudojant imunohistocheminį žymenį CD31
2. įvertinti putliųjų ląstelių kiekį kalių pieno liaukos navikuose ir jų ryšį su naujų kraujagyslių kiekiu
7
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pieno liaukos anatomija
Pieno liauka (glandula mammaria) yra odos pridėtinė liauka. Jos vystymosi eiga panaši į prakaito liaukos. Pieno liaukos yra išsidėsčiusios dvejomis simetriškomis eilėmis gyvūno kūno ventralinėje pusėje, nuo krūtinės iki kirkšnies. Kiekviena pieno liauka baigiasi speneliu. Pieno liaukų, dažniausiai, yra 5 poros, 2 poros krūtininių, 2 poros pilvinių ir 1 pora kirkšnies. Pieno liauką sudaro epitelinis liaukinis audinys (lobuli glandulae mammariae) ir jungiamasis audinys, kuris dalija liaukinį audinį į skiltis ir skilteles. Kiekvieną skiltelę sudaro alveolės, alveoliniai pieno latakai bei tarp jų esantis purusis kologeninis audinys. Kiekvieną alveolė sudaryta iš pieno egzokrinocitų, žvaigždiškųjų ląstelių, mioepiteliocitų, pamatinės membranos ir tarpalveolinio puriojo kologeninio audinio. Liaukinis audinys būna išryškėjęs nėštumo, pseudonėštumo, laktacijos ir apie 40 dienų po jauniklių nujunkymo metu. Vėliau alveolės ir iš jų sudarytos skiltelės susitraukia iki mažų latakėlių. Alveoliniai latakėliai atsiveria į pieno antį. Pieno antis yra sudarytas iš liaukinės dalies ir speninės dalies. Pieno antis eina nuo pat spenio latako iki liaukos parenchimos. Pieno ančio gleivinę iškloja dvisluoksnis stulpiškasis epitelis. Kiekvieną antį nuo kitų skiria jungiamojo audinio pertvara. Iš pieno ančio išeina pieno latakėliai, kurių skaičius nevienodas. Jie atsiveria bukajame spenelio gale netaisyklinga tvarka. Kiekvienas spenelio latakėlis yra maždaug trečdalio spenelio ilgio, jį iškloja daugiasluoksnis plokščiasis ragėjantysis epitelis. Spenelio vidurinis sluoksnis yra sudarytas iš puraus kologeninio jungiamojo audinio, kuriame yra gausu neruožuotųjų miocitų ir kraujagyslių. Neruožuotųjų miocitų skaidulos yra išsidėsčiusios ratu ir supa spenio latakus. Ties spenio anga neruožuotųjų miocitų skaidulos sudaro spenio sutraukiamąjį raumenį. Oda aplink distalinį spenelio galą yra labai plona ir lygi. Odos epidermis gali būti pigmentuotas, tuomet pigmentas būna išsidėstęs germinatyviniame odos sluoksnyje. Spenelio pagrindą dengia smulkūs plaukai, taip pat randamos riebalinės liaukos. Pieno liauka pasižymi itin gera vaskuliarizacija. Kapiliarai yra apraizgę pieno alveoles ir ištekamuosius latakėlius. Taip pat kiekvienoje pieno liaukoje yra daug mažų limfagyslių kurios susijungia į didesnes ir užtikrina limfos nutekėjimą į limfinius mazgus.(3)
8
(Evans HE, Lahunta A. 2013)
1.2Pieno liaukos navikų klasifikacija
1999 m. buvo priimta pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) patvirtinta kalių pieno liaukos navikų histologinė klasifikacija. Ši klasifikacija buvo paremta navikų ląstelių diferenciacijos lygiu. Buvo nustatyta, jog ligos baigties prognozė yra priklausoma nuo naviko ląstelių diferenciacijos lygio. Kuo mažiau yra diferencijuotos navikinės ląstelės, tuo prastesnė būna ligos prognozė.(1) 2010metais buvo pasiūlyta nauja kalių pieno laikų navikų klasifikacija. Maždaug 40proc. kalių pieno liaukos navikų atsiranda ingvinalinėse pieno liaukose. Iš gerybinių pieno liaukos navikų dažniausiai pasitaiko: fibrodenomos (45,5proc.), paprastosios adenomos (5proc.), gerybiniai mezenchiminiai navikai (0,5proc.). 45,5proc. navikų būna karcinomos iš kurių dažniausiai pasitaiko: solidinės karcinomos (16,9proc.), tubulinės karcinomos (15,4proc.), papilinės karcinomos (8,6proc.), anaplastinės karcinomos (4,0proc.). Sarkomos ir piktybiniai mišraus tipo navikai sudaro 3,5proc. visų pasitaikančių navikų.(4)
Epiteliniai pieno laiukos piktybinai navikai:
1. Karcinoma in situ 2. Paprastoji karcinoma Tubulinė Tubuliopapilinė Cistinė – papilinė Kribriforminė
3. Mikropapilinė invazinė karcinoma 4. Solidinė karcinoma
Pažastinis
limfinis mazgas Ingvinalinės
(1pora) limfagyslės Kirkšnies limfinis mazgas Abdominalinės (2 poros) (2 poros) Torakalinės (2poros)
9
5. Komedokarcinoma 6. Anaplastinė karcinoma.
7. Karcinoma kilusi iš adenomos komplekso ar mišraus naviko – histologiniuose preparatuose dar nustatoma gerybino naviko elementų.
8. Karcinoma – kompleksinis tipas – epitelinis komponentas piktybinis, mioepitelinis – gerybinis.
9. Karcinoma ir piktybinė mioepitelioma – abu epitelinis ir mioepitelinis komponentai piktybiniai.
10. Karcinoma mišrus tipas – epitelinis komponentas piktybinis, mioepitelinis gerybinis ir kartu randamas mezenchiminis komponentas – kremzlinis ir kaulinis audiniai.
11. Latakinė karcinoma– epitelinis piktybinis komponentas kilęs iš latakinės adenomos.
12. Intralatakinė papilinė karcinoma epitelinis piktybinis komponentas kilęs iš intralatakinės papilinės adenomos.
Epitleliniai piktybiniai pieno liaukos navikai – specifiniai tipai:
1. Plokščialąstelinė karcinoma. 2. Adenoplokščialąstelinė karcinoma. 3. Mucinus gaminanti karcinoma. 4. Lipidų turinti karcinoma. 5. Šeivinių ląstelių karcinomos:
Piktybinė mioepitelioma.
Plokščialąstelinės karcinomos šeivinių ląstelių variantas.
Karcinoma – šeivinių ląstelių variantas. 6. Uždegiminė karcinoma.
Piktybiniai mezenchiminiai pieno liaukos navikai:
1. Osteosarkoma 2. Chondrosarkoma 3. Fribrosarkoma 4. Hemangiosarkoma 5. Kitos sarkomos
Piktybinis mišrus pieno liaukos navikas:
10
Gerybiniai pieno liaukos navikai:
1. Paprastoji adenoma
Intralatakinė papilinė adenoma (latakinė papiloma)
Latakinė adenoma (bazaloidinė adenoma)
Su plokščialąsteline diferencijacija (kerathialino granulės) 2. Fibroadenoma
3. Mioepitelioma
4. Adenomos komplekasas (adenomioepitelioma) 5. Gerybinis mišrus navikas
Pieno liaukos hiperplazija, displazija:
1. Latakų ektazija
2. Skilčių hiperplazija (adenozė) 3. Tolygi hiperplazija:
Aktyvi (sekretuojanti)
Fibrozinė ( tarpskiltelinis fibrozinis jungiamasis audinys) 4. Epiteliozė 5. Papilomatozė 6. Fibroadenominiai pakitimai 7. Ginekomastija Spenelio navikai: 1. Adenoma 2. Karcinoma
3. Karcinoma su epidermio infiltracija
Spenelio hiperplazija, displazija:
1. Spenelio odos melanozė (5)
Didžiausia problema su kuria yra susiduriama vertinant pieno liaukų navikus yra identifikuoti tuos navikus kurie yra tikrai piktybiniai. Dažnai radus ląstelių neaiškiomis ribomis, su išdidėjusiu branduoliu ir ryškiais branduolėliais padaroma skubota diagnozė – karcinoma. Svarbiausi kriterijai vertinant pieno liaukų navikų histologinius preparatus dažytus hematoksilinu eozinu yra:
11
- Ryškus branduolio ir citoplazmos pleomorfizmas - Mitotinis indeksas (kiek ląstelių esti mtitotinje būklėje) - Ar yra netvarkingai išsidėsčiusių nekrozės zonų
- Ar navikas yra prasiskverbęs į aplinkinius audinius - Ar yra metastazės regioniniuose limfiniuose mazguose
1.3Pieno liaukos navikų aprašymai pagal naują klasifikaciją
Karcinoma - in situ:
Tai navikinis audinys sudarytas iš gerai apibrėžtų ląstelių sankaupų kurios neprasiskverbė į aplinkinius audinius, ląstelės dažnai buna išsidėsčiusios mažais latakėliais. Ląstelės būna daugiakampės arba kubiškos ir gali turėti nedidelį kiekį eozinofilinės citoplazmos ir didelį branduolį. Branduolys gali būti hiperchromatiškas, susitelkęs centre, apvalus arba ovalus su susisukusiu chromatinu ir jo centre esančiu bazofilišku branduolėliu. Šalia navikinio audinio dažnai randama skiltelių hiperplazija. Gali būti sunku diferencijuoti karcinomą in situ nuo skiltelinės hiperplazijos su itin išreikšta atipija.
Paprastosios karcinomos:
Paprastąsias karcinomas sudaro tiktai vienas ląstelių tipas, primenantis arba latakėlių spindį išklojančioepitelio ląsteles arba mioepitelines ląsteles.(5) Šio tipo navikai pasižymi infiltruojančiu augimu ir gali metastazuoti, tačiau jei navikas nėra smarkiai išplitęs ir nėra metastazių chirurginis naviko pašalinimas duoda gana gerą prognozę.(1)
Tubulinė karcinoma:
Tubulinės karcinomos ląstelės išsidėsčiusios mažais latakėliais. Tubulinės karcinomos yra dažniausiai pasitaikantis pieno liaukų karcinomų tipas. Ląstelės dažnai turi eozinofilinę citoplazmą, ląstelių ribos dažniausiai būna gana aiškios.Mitotinis aktyvumas gali būti įvairus.Latakėlių formavimasis, ląstelių morfologija ir jų mitotinis aktyvumas yra pieno liaukų karcinomų klasifikacijos pagrindas. Tarp latakėlių esanti stroma yra sudaryta iš kraujagyslių ir fibroblastų, taip pat gali būti limfocitų ir makrofagų. Kai navikinės ląstelės infiltruoja aplinkinius pieno liaukos audinius jos gali iššaukti stromos reakciją ir intensyvią miofibroblastų proliferaciją. Navikinio audinio infiltracija su mitotiniu aktyvumu yra požymiai, kurie leidžia diferencijuoti adenomas ir karcinomas in situ nuo kitų karcinomos tipų.
12
Tubulio papilinė karcinioma:
Tubulio-papilinėje karcinomoje ląstelės išsidėsčiusios latakėliuose ir prisitvirtinusios plačiai arba tarsi ant kotelio suformuoja spenelius. Tubulio papilinė karcinoma nuo tubulinės skiriasi tuo jog iš ląstelių susiformavę speneliai įsiterpia į latakėlių spindį išklojantį epitelį. Spenelius prie prie pagrindo supa plona fibrovaskulinio audinio stroma.
Cistinė-papilinė karcinoma:
Ląstelės esti išsidėsčiusios panašiai kaip ir tubulio papilinės karcinomos atveju, bet cistinės-papilinės karcinomos tipas skiriasi nuo tubulinių tuo jog susidarę speneliai įsiskverbia į išsiplėtusį ir cistas sudarantį latakėlius išklojantį epitelį. Spenelius taip pat supa plona fibrovaskulinio audinio stroma, o išsiplėtusiame latakėlius sudarančiame epitelyje dažnai gali būti gausu degeneruojančių granuliocitų.
Kribriforminė karcinoma:
Kribrioforminės karcinomos tipas yra gana retas. Šiam tipui būdinga navikinių ląstelių proliferacija. Latakėlius sudarančio epitelio yra mažai jį supa navikinės ląstelės. Tarpląstelinio jungiamojo audinio yra labai nedaug. Navikinės ląstelės dažnai turi nedidelį kiekį homogeniškos eozinofilinės citoplazmos.
Mikropapiliarinė invazinė karcinoma:
Mikropapiliarinės invazinės karcinomos tipas tik neseniai aprašytas šunų pieno liaukos navikuose. Navikinės ląstelės proliferuoja latakėlių sienelėse ir infiltruoja latakėlius supančią stromą. Ląstelės yra pleomorfiškos ir turi nedidelį kiekį eozinofilinės citoplazmos. Ląstelių branduoliai ovalūs ir lokalizuoti ląstelės centre, su dideliu branduolėliu. Ląstelių mitotinis indeksas didelis. Tokio tipo navikai dažnai esti gerai vaskuliarizuoti ir linkę metastazuoti.
Solidinė karcinoma:
Šio tipo navikai pasitaiko rečiau nei tubulinio tipo karcinomos. Solidinės karcinomos ląstelės išsidėsčiusios solidžia mase, tarp jų nėra latakėlių. Tarp navikinių ląstelių skiltelių yra plonos fibrovaskulinio audinio stromos. Ląstelės dažnai yra daugiakampės formos, be aiškiai apibrėžtų ribų, su nedideliu kiekiu eozinofilinės arba bazofilinės membranos. Ląstelių branduoliai ovalūs, dažnai hiperchromatiški, su bazofilišku branduoliu. Navikinių ląstelių infiltracija į smulkias limfagysles gali būti stebima naviko pakraščiuose taip pat dažnas ankstyvas metastazavimas į regioninius limfinius mazgus.
13
Komedokarcinoma:
Komedokarcinomas charakterizuoja tai jog tarp navikinių ląstelių sankaupų, kurias, randama nekrozės zonų.Nekrozės zonose randama amorfinės eozinofilinės masės su ląstelių liekanomis, nekrotizuotais neutrofilais ir makrofagais. Glaudžiai išsidėsčiusių navikinių ląstelių sankaupas supa plona fibrovaskulinio audinio stroma. Navikinio audinio periferijoje randama infiltracija į limfagysles. Dažnai randamos metastazės į regioninius mazgus.
Anaplastinė karcinoma:
Anplastinė karcinoma labiausiai piktybinis naviko tipas iš visų pieno liaukos karcinomų. Navikinės ląstelės dažnai difuziškai infiltruoja pieno liaukos tarskiltelinį jungiamąjį audinį ir limfagysles. Naviko užuomazgas pieno liaukos audinyje dažnai būna sunku nustatyti. Navikinės ląstelės dažnai aptinkamos mažomis sankaupomis. Jos būna apvalios, ovalios arba daugiakampės,15 – 70 µm skersmens. Jose turi nemažą kiekį eozinofilinės citoplazmos. Branduoliai apvalūs arba ovalūs, su keliais (paprastai 2 arba 3) įvairaus dydžio branduolėliais. Pieno liauką infiltruojančios navikinio audinio ląstelės iššaukia desmoplastinę reakciją su miofibroblastų proliferacija ir galima limfocitų, putliųjų ląstelių ir pavienių neutrofilų, eozinofilų ir makrofagų infiltracija. Navikinės ląstelės arba pavienės arba sankaupomis gali būti randamos viduje limfagyslių. Tarplastelinis jungiamasis audinys randamas didelis kiekis išsiplėtusių limfocitų.(5) Dėl navikinių ląstelių infiltracijos į paviršines – poodines limfagysles pieno liaukos oda tampa edemiška, ir apžiūrint išoriškai pieno liauka atrodo apimta smarkaus uždegiminio proceso. Todėl kartais anaplastinė karcinoma pavadinama uždegimine adenokarcinoma.(1)Šio tipo navikai dažnai metastazuoja į regioninius limfinius mazgus ir į plaučius. Radiografinis plaučių tyrimas dažnai matomas kaip naviko plitimas per jungiamąjį audinį, o ne pavieniais mazgeliais.(5) Dėl šių naviko savybių prognozė visuomet esti itin prasta, net ir pritaikius radikalų chirurginį gydymą.(1)
Karcinoma kilusi iš adenomos komplekso ar mišraus naviko – histologiniuose preparatuose dar nustatoma gerybino naviko elementų:
Šio tipo naviko gerybinė dalis kyla iš adenomos komplekso arba mišraus naviko, taip pat tokio tipo navikuose galima aptikti labiau pleomorfiškų ląstelių su padidėjusiu mitotiniu indeksu (karcinominių ląstelių sankaupos).
Karcinoma – kompleksinis tipas:
Kompleksinio tipo karcinomos turi piktybinį epitelinį komponentą ir gerybinį mioepitelinį komponentą. Navikines ląsteles supa fibrovaskulinė stroma. Epitelinės ląstelės išsidėsčiusios netvarkingais latakėliais išklotais keliais sluoksniais kubiškojojo arba stulpiškojo epitelio ir turi
14
nedidelį kiekį eozinofilinės citoplazmos. Mitotinis indeksas gali būti įvairus. Taip pat gali būti randamos nekrozės vietos. Mioepitelinis komponentas sudarytas iš šeivinių ląstelių išsidėsčiusių netaisyklingomis sankaupomis. Šios ląstelės turi neaiškias ribas, nedidelį kiekį homogeniškos eozinofiliškos citoplazmos, apvalų arba ovalų branduolį, su nedideliu branduolėliu. Naviko periferijoje gali būti uždegimo vietų sudarytų iš limfocitų ir plazmocitų. Kompleksinio tipo karcinomos skiriasi nuo kompleksinių adenomų tuo, jog jose yra didesnė ląstelių gausa. Taip pat kompleksinių karcinomų epitelinio komponento ląstelės pasižymi didesniu pleomorfiškumu, dideliu mitotiniu indeksu, nekrozės zonomis ir infiltruojančiu augimu.
Karcinoma ir piktybinė mioepitelioma:
Tiek epitelinis tiek mioepitelinis naviko komponentai yra piktybiniai.Abiejų komponentų navikines ląsteles supa fibrininė stroma. Epitelinį komponentą sudaro kubiškosios arba stulpiškosios ląstelės išsidėsčiusios netvarkingais latakėliais arba sankaupomis. Aplinkui jas prie intersticinio jungiamojo audinio išsidėsčiusios mioepitelinio komponento ląstelės. Šios ląstelės dažniausiai yra šeivinės ir turi neaiškias ribas ir vidutinį kiekį homogeniškos eozinofilinės citoplazmos. Branduoliai apvalūs, su vienu branduolėliu. Tam jog nustatyti ar tikrai yra mioepitelinis ir epitelinis naviko komponentai yra reikalingi imunohistoheminiai tyrimai.
Karcinoma – mišrus tipas:
Šis tipas nėra dažnas, jį sudaro piktybinis epitelinis komponentas ir gerybinis mezenchiminis komponentas, taip pat randama intarpų kuriuos sudaro kremzlinis, kaulinis, arba abu šie audiniai. Trijų tipų navikines ląsteles, supa fibrovaskulinio audinio stroma. Epitelinės ląstelės išsidėsčiusios netaisyklingais latakėliais, mioepitelinės ląstelės esti šeivinės formos. Mišraus tipo karcinomų ląstelės pasižymi ryškiu epitelinio komponento pleomorfizmu, dideliu ląstelių mitotiniu indeksu, nekrozės vietomis ir infiltruojančiu augimu. Tuo jos skiriasi nuo mišraus tipo gerybinių navikų.
Latakinė karcinoma:
Latakinės karcinomos navikų ląstelės išsidėsčiusios dvejomis eilėmis ir sudaro latakėlius. Ląstelių mitotinis indeksas gali būti įvairus. Kai kurių ląstelių citoplazmoje aptinkamos keratohialino granulės. Šio tipo navikų morfologija identiška apokrininės latakinės odos karcinomos morfologijai.
Intralatakinė papilinė karcinoma:
Intralatakinėje papilinėje karcinomoje proliferuoja daugiasluoksnio epitelio ląstelės. Šios ląstelės yra pleomorfiškos, turi didelį mitotinį indeksą. Stromą sudaro jungiamasis audinys ir mioepitelinės ląstelės. Dažnai intralatakinė papilinė karcinoma randama kartu su intralatake papiline adenoma.
15
Epitleliniai piktybiniai pieno liaukos navikai – specifiniai tipai: Plokščialąstelinė karcinoma:
Plokščialąstelinę karcinomą sudaro tik plokščiasis epitelis. Šis navikas kyla iš plokščialąstelinio epitelio ląstelių išklojančių pieno liaukos spenelio latakus. Yra sudėtinga atskirti plokščialąstelines karcinomas kilusias pačioje pieno liaukoje nuo tų kurios kilo iš epidermio ląstelių ir augdamos infiltravo į pieno liauką. Histologiškai šis pieno liaukos karcinomos tipas yra identiškas plokščialąstelinėms odos karcinomoms.Epitelio ląstelių sankaupos matomos kartu su besiformuojančiais keratino perlais. Ląstelės esti išdidėjusios, jų branduoliai taip pat. Dažnai kartu su navikinėmis ląstelėmis matomas arba ūmus, arba lėtinis uždegimas – randamas uždegiminių ląstelių infiltratas.(5) Šio tipo navikai pasižymi ankstyvu metastazavimu į regioninius limfinius mazgus, dėl to prognozė būna bloga.(1)
Adenoplokščialąstelinė karcinoma:
Adenoplokščialąstelinės karcinomos tipo navikus sudaro bet kokio ankščiau aprašyto tipo karcinoma kartu su plokščialąstelinės karcinomos intarpais.
Mucinus gaminanti karcinoma:
Mucinus gaminančios karcinomos tipo navikai pasitaiko retai. Šis naviko tipas pasižymi tuo, jog jį sudarančios ląstelės produkuoja mucinus, todėl navike randamas nemažas kiekis neląstelinės į muciną panašios matricos.
Lipidų turinti karcinoma:
Dažniau nustatoma jaunoms nekastruotoms kalėms. Naviką sudaro ląstelių sankaupos apsuptos fibrovaskulinės stromos ir su nekrozės zonomis. Ląstelės esti apvalios arba ovalios, ryškiomis ribomis, nemažu kiekiu vakuolėtos citoplazmos. Branduoliai apvalūs arba ovalūs su vienu arba dviem branduolėliais. Mitotinis indeksas gali būti įvairus. Kai kuriais atvejais nustatoma naviko ląstelių infiltracija į limfagysles ir metastazės į regioninius limfinius mazgus.
Šeivinių ląstelių karcinomos: šio tipo navikų ląstelių morfologija gali būti nepakankamai išreikšta,
kad askirti juos vieną nuo kito. Todėl reikalinga atlikti imunohistocheminius tyrimus, kurie leidžia nustatyti tikslią diagnozę.
Piktybinė mioepitelioma:
Šio tipo navikų ląstelės būna ovalios arba šeivinės formos. Ovalinės ląstelės dažnai turi neaiškias ribas, nedidelį kiekį eozinofilinės arba bazofilinės citoplazmos su kartais pasitaikančiomis
16
skaidriomis vakuolėmis. Branduoliai – ląstelės centre, apvalūs su vienu branduolėliu. Mitotinis indeksas įvairus. Šeivinės ląstelės su tokios pačios formos branduoliais, su itin dideliu kiekiu ryškios eozinofilinės citoplazmos. Ląstelių ribos aiškios, mitotinis indeksas įvairus.
Plokščialąstelinė karcinoma – šeivinių ląstelių variantas
Šį naviko tipą sudaro ląstelės išsidėsčiusios juostomis ir salelėmis, jas supa plona fibrovaskulinė stroma. Ląstelės ir jų branduoliai šeivinės formos. Ląstelės produkuoja intraląstelinius keratino filamentus iš kurių susidaro tarpląstelinės jungtys. Kai kuriose naviko vietose randami plokščialąstelinio epitelio ląstelių intarpai.
Karcinoma –šeivinių ląstelių variantas:
Naviką sudaro tik šeivinių ląstelių sankaupos, kurias supa fibrovaskulinė stroma. Šalia dažnai galima rasti tubulinės karcinomos intarpų. Lstelių branduoliai taip pat šeivinės formos, dažnai ryškiu branduolėliu, citoplazma eozinofilinė. Mitotinis indeksas įvairus. Imunohistocheminiai tyrimai patvirtina epitelinę naviko kilmę.
Uždegiminė karcinoma:
Uždegiminė karcinoma pasižymi ryškia klinikine eiga: staigiu pasireiškimu, pieno liauka būna standi, paraudusi, karšta, edemiška. Ryškus uždegiminės karcinomos histologinis bruožas yra, navikinių ląstelių infiltracija į odos limfagysles. Navikinės ląstelės užkemša paviršines limfagysles ir sukelia naviko edemą.
Piktybiniai mezenchiminiai pieno liaukos navikai (sarkomos):
Tai retai pasitaikantys navikai. Nėra nustatyta tikslios sarkomų kilmės: šie navikai gali kilti tiek iš mioepitelinio audinio tiek iš tarpskiltelinio jungiamojo audinio.(5) Nėra aiškių įrodymų, kad sarkomos kyla iš jau esančių gerybinių mišraus tipo navikų.(6)
Osteosarkomos:
Tai dažniausiai pasitaikantys pieno liaukos mezenchiminiai navikai. Dažnai pastebima, jog kurį laiką buvęs nedidelis navikas pradeda greitai augti. Navike proliferuoja ovalios ir šeivinės ląstelės, šalia randamas kaulinio audinio formavimasis.Pieno liaukos osteosarkomos panašios į osteosarkomas atsiradusias kitose organizmo vietose.Metastazuoja kraujo keliu, dažniausiai į plaučius.
17
Chondrosarkoma:
Tai retas navikas sudarytas iš daugelio skiltelių. Skiltelių periferijoje ląstelės mažesnės, su apvaliais hiperchromatiškais branduoliais. Kartais pasitaiko dvibranduolių arba daugiabranduolių ląstelių. Branduolio ribos kartais neaiškios, branduolėliai ryškūs. Ląstelių mitotinis indeksas įvairus, didesnis mažiau diferencijuotose ląstelėse.
Fibrosarkoma:
Tai nėra dažnas naviko tipas, dažniau kyla iš jau esančio naviko arba iš tarpląstelinės pieno liaukos stromos. Proliferuoja šeivinės ląstelės, jos tarpusavyje esti persipynusios. Ląstelių ribos neryškios, jos turi nedidelį kiekį eozinofilinės membranos, ovalų arba pailgą branduolį. Nuo piktybinių mioepiteliomų ir šeivinių ląstelių karcinomų fibrosarkomos yra atskiriamos imunohistocheminių tyrimų pagalba.(5) Fibrosarkomų prognozė visada esti bloga, maždaug 75proc. fibrosarkomų metastazuoja, dažniausiai hematogeniniu keliu.(1)
Hemangiosarkoma:
Pirminės hemangiosarkomos kyla pieno liaukos audinyje (ne poodyje arba odoje). Jų histologiniai ypatumai identiški blužnies arba poodžio hemangiosarkomoms.
Piktybinis mišrus pieno liaukos navikas – karcinosarkoma:
Naviką sudaro epitelinis komponentas ir jungiamojo audinio komponentas, abu piktybiniai. Tai labai retas pieno liaukos naviko tipas. Epitelinio komponento ląstelės metastazuoja per limfagysles į regioninius limfinius mazgus, mezenchiminis – hematogeniniu keliu į plaučius.(5) Tai itin didelio piktybiškumo navikai pasižymintis infiltraciniu augimu ir ankstyvu metastazavimu.(1)
Gerybiniai pieno liaukos navikai: Paprastosios adenomos:
Paprastosios adenomos navikai yra aiškių ribų, pasižymi neinfiltruojančiu augimu. Ląstelės išsidėsčiusios latakėliais, kuriuos supa nedidelis kiekis fibrovaskulinės stromos. Latakėlių vidų iškloja vienas sluoksnis kubiškų arba stulpiškų ląstelių, su nedideliu kiekiu eozinofilinės citoplazmos. Branduoliai apvalūs su vienu branduolėliu. Ląstelių mitotinis indeksas itin mažas.
Intralatakė papilinė adenoma:
Intralatekės papiloma formuojasi jos ląstelėms formuojant spenelius, kuriuos supa plona fibrovaskulinio audinio stroma. Speneliai gali susidaryti vienoje vietoje arba keliose vietose, keliuose latakėliuose. Latakėlių spindį iškloja epitelinės ląstelės su ovaliu branduoliu ir nedideliu
18
kiekiu eozinofilinės citoplazmos. Po epiteliu yra gerai matomas mioepitelinių ląstelių sluoksnis. Stromoje randama fibroblastų, kolageno ir kraujagyslių. Vietomis galima hialinizacija su epitelinio audinio elementais – tai gali sudaryti klaidinantį vaizdą panašų į karcinomą.
Latakinė adenoma (bazaliodinė adenoma):
Latakinės adenomos, navikinės ląstelės randamos išsiplėtusiuose latakėliuose, jos dviemis eilėmis iškoja vidinį latakėlių spindį. Ląstelės kubiškosios arba stulpiškosios, su nedideliu eozinofilinės citopazmos kiekiu. Branduoliai apvalūs arba ovalūs, su ryškiu branduolėliu. Galimos ląstelių su plokščialąsteline diferencijacija sankaupos.
Fibroadenoma:
Fibroadenomos navikinės ląstelės esti kubiškosios arba stulpiškosios, jos išsidėsčiusios latakėliais. Latakėlius supa puriojo kologeninio audino stroma. Ilgiau esančiose navikuose randamas tankesnis jungiamasis audinys.
Mioepitelioma:
Mioepiteliomą sudaro šeivinės formos ląstelės išsidėsčiusios nedidelėmis snakaupomis kartu su tarpląsteline bazofinine mase. Ląstelių ribos neaiškios, mitotinis indeksas mažas. Mioepitelinės ląstelės nustatomos imunohistocheminiais tyrimais.
Adenomos kompleksas:
Šį naviką sudaro epitelinis ir mioepitelinis komponentai. Epitelino komponento ląstelės išsidėsčiusios latakėliais, jos yra kubiškosios arba stulpiškosios ir turi nedidelį kiekį eozinofilinės citoplazmos. Branduolys apvalus su vienu branduolėliu. Mioepitelinės ląstelės šeivinės formos, neaiškiomis ribomis, Branduoliai taip pat šeivinės formos su vienu branduolėliu. Kartu su mioepitelinėmis ląstelėmis esti didelis kiekis bazofilinės masės.
Gerybinis mišrus navikas:
Navikas sudarytas iš epitelinio, mioepitelinio komponentų ir randama kaulinio arba kremzlinio audinio intarpų. Epitelinį komponentą sudaro latakėliai iš kubiškųjų arba stulpiškųjų ląstelių. Mioepitelinio komponento ląstelės šeivinės formos, neaiškių ribų. Įvairiose naviko vietose randami kremzlinio arba kaulino audinio intarpai.
Kalių pieno liaukos navikai taip pat esti klasifikuojami ir kliniškai, remiantis jų histologine klasifikacija. Klinikinis navikų klasifikavimas leidžia veterinarijos gydytojui geriau prognozuoti
19
ligos baigtį. Dažniausiai kliniškai klasifikuojant navikus remiamasi Ellston ir Ellis meodu.(5) Šis metodas naudojamas žmonių medicinoje taikomas ir vertinant kalių pieno liaukos navikus, bei prognozuojant ligos baigtį (dviejų metų periodui). Žmonių medicinoje dažnai taikomas citologinis tyrimas, veterinarijoje beveik netaikomas.(7) Metodą yra modifikavę mokslininkai W. Misdorpir L. Pen˜a. Jų sudaryti navikų skirstymo metodai šiek tiek skiriasi, bet esmė yra panaši. Tai balų skyrimas už tam tikrus požymius kuriuos navikas atitinka, vėliau pagal tų surinktų balų kiekį navikas priskiriamas tam tikrai piktybiškumo grupei (stadijai). Kuo mažesnė ląstelių diferencijacija, bei didesnis balų skaičius tuo piktybiškesnis navikas. Kuo didesnis naviko piktybiškumo laipsnis tuo blogesnė ligos baigties prognozė. (5)
Taškai Latakėlių formavimasis Branduolio pleomorfizmas Mitotinis aktyvumas / hiperchromatizmas 1 L. Pena Latakėlių formavimasis daugiau nei 75proc.
mėginio Vienodi nedideli branduoliai su pavieniais branduolėliais 0-9 mitozės/ 10 matymo laukų
W. Misdorp Aiškus latakėlių formavimasis Nežymus branduolių pleomorfizmas Pavieniai hiperchromatiški branduoliai ar mitozės matymo lauke 2 L. Pena Latakėlių formavimasis 10 – 75proc. mėginio
Kai kurie iš branduolių nestandartinės formos ir
dydžio,
hiperchromatiški, gali būti nedaug ryškių
branduolėlių
10-19 mitozių/ 10 matymo laukų
W. Misdorp Vidutiniškas latakėlių formavimasis
Vidutiniškas branduolių pleomorfizmas
2-3 hiperchromatiški branduoliai arba mitozės matymo lauke
3
L. Pena Latakėlių mažiau nei 10proc. Mėgino
Daug branduolių nestandartinės frmos ir dydžio, hiperchromatiški, daug ryškių branduolėlių >20 mitozių/ 10 matymo laukų
W. Misdorp Pavieniai latakėliai arba jų visai nėra Ryškus branduolių pleomorfizmas
2-3 hiperchromatiški branduoliai arba mitozės matymo lauke
20 (Goldsmidt et. al 2011)
Faktoriai svarbūs nustatant kalių pieno liaukos navikų baigties prognozę - teigiami:
Mažų veislių šunys (literatūroje minima, jog navikai dažniau būna gerybiniai)
Patinai (literatūroje minima, jog navikai dažniau būna gerybiniai) Neigiami faktoriai:
Naviko skersmuo didesnis nei 3cm
Išopėjimas arba prisitvirtinimas prie aplinkinių audinių
Išplitimas į regioninius limfinius mazgus
Metastazės į toliau esančius organus
Histologinis tipas (solidinė, anaplastinė karcinoma, sarkoma, karcinosarkoma)
Infiltracija į kraujagysles ir limfagysles
Navikinių ląstelių proliferacijos indeksas(1)
1.4 Putliosios ląstelės
Putliosios ląstelės tai iš kaulų čiulpų kilusios ląstelės, savo išvaizda panašios į bazofilus. Jų nesubrendusios formos cirkuliuoja kraujyje, tada migruoja į gerai vaskuliarizuotus audinius. Ten galutinai subręsta veikiamos kamieninių ląstelių faktoriaus ir kitų citokinų kuriuos išskiria endotelio ląstelės ir fibroblastai. Putliųjų ląstelių galima rasti daugelyje organizmo audinių, daugiausiai jų būna tuose organizmo audiniuose, kurie turi kontaktą su aplinkos veiksniais. Tai yra: odoje, kvėpavimo takuose, virškinamajame trakte. Tose vietose jos atlieka pirminį į organizmą patekusių patogenų atpažinimo funkciją ir pirminį imuninį atsaką prieš juos. Putliųjų ląstelių aktyvacija vyksta per daugelio cheminių faktorių stimuliaciją. Per kelias sekundes nuo stimuliacijos putliosiose ląstelėse įvyksta degranuliacija–greitai paskleidžiami jau suformuoti mediatoriai esantys ląstelės citplazmos granulėse. Tai histaminas ir proteazės: triptazė ir chimazė, ir jau suformuotas auglių nekrozės faktorius alfa (TNF-α). Po degranuliacijos putliosios ląstelės gali produkuoti lipidų kilmės eikozanoidus: prostaglandiną D2 ir leukotirieną C4. Svarbiausia yra tai, kad bet kuris iš šitų mediatorių gali būti išskirtas atskirai arba visi kartu priklausomai nuo ląstelės degranuliaciją sukėlusio faktoriaus. Dėl savo lokacijos ir plastiškumo išskiriant mediatorius ir išskiriamų mediatorių gausos putliosios ląstelės yra svarbus pirminio imuninio atsako elementas. Putliųjų ląstelių aktyvacija vyksta per imunoglobulino E (IgE) receptorių FceRI. Putliosios ląstelės taip pat turi Fc receptorius kurie suriša imunoglobuliną G (IgG). Kaip ir kiti leukocitai putliosios ląstelės
Taškų skaičius Piktybiškumo laipsnis
3-5 I – mažas
6-7 II - vidutinis
21
gali būti aktyvuotos tiesioginio kontakto su patogenu metu. Tokia aktyvacija vyksta per sekos atpažinimo receptorius (PRPs). Putliųjų ląstelių išskiriamas histaminas ir kiti vazoaktyvūs mediatoriai padidina kraujagyslių pralaidumą ir skatiną vietinę kraujotaką. Alerginių reakcijų metu putliosios ląstelės dažnai yra laikomos kenksmingomis kaip lėtinio uždegimo sukelėjos.(8)Naviko augimą lemia navikinių ląstelių proliferacija ir navikinio audinio vaskuliarizacija. Kuo geriau esti vaskuliarizuotas navikinis audinys tuo greitesnis jo augimas ir tuo didesnis naviko piktybiškumas ir polinkis metastazuoti. Augdamas navikas sukelia organizmo imuninės sistemos atsaką. Histopatologiniais tyrimais esti įrodyta jog naviką dažnai supa uždegiminis infiltratas kuriame esti gausu putliųjų ląstelių. Kai kuriuose naviko tipuose putliosios ląstelės kaupiasi naviką supančioje stromoje (dažnai aptinkama pieno liaukos adenokarcinomose), kur išskiria įvairius uždegimo mediatorius.(9) Putliosios ląstelės į navikinį audinį patenka dėl chemoatraktantų sukeliamo chemotaksio. Kamieninių ląstelių faktorius (stem cell factor SCF), dar vadinamas c-Kit ligandu, yra hematopoetinis augimo faktorius skatinantis hematopoetinių ląstelių augimą ir diferenciaciją.(10) SCF yra svarbus putliųjų ląstelių ir jų pirmtakių ląstelių chemotaksio faktorius.(11) Jį produkuoja daugelis ląstelių tokių kaip fibroblastai ir endotelio ląstelės (taip pat ir navikinės ląstelės). SCF su putliosiomis ląstelėmis sąveikauja per c-Kit receptorius. Nedidelė SCF koncentracija sukelia putliųjų ląstelių chemotaksį, o didelė – jų aktyvaciją ko pasekoje putliosios ląstelės dengranulioja ir išskiria uždegimo mediatorius. Dėl putliųjų ląstelių išskiriamų mediatorių navikuose vyksta imunosupresija, sumažėja T-limfocitų ir ląstelių natūraliųjų žudikių.(12)Putliųjų ląstelių išskiriami mediatoriai gali skatinti navikų augimą, jų angioneogenezę ir metastazavimą. Heparinas, IL-8 (interliaukinas 8),VEGF (kraujagyslių endotelio augimo faktorius) skatina naujų kraujagyslių formavimasi. Taip pat heparinas dėl savo kraujo krešumą mažinančių savybių gali skatinti navikinių ląstelių metastazavimą. Histaminas pasižymi vazodilitacinėmis savybėmis, veikia imunosupresiškai.(13)
1.5Imunohistocheminiai tyrimai
Imunohistochemija –tai būdas lokalizuoti specifinius antigenus audinių pjūviuose (histologiniuose preparatuose) naudojant žymėtus antikūnus. Metodas yra pagrįstas antigenų ir antikūnų sąveika. Imuninės reakcijos pasekmės gali būti matomos naudojant specialius žymeklius: fluorescencinius dažus, fermentus. Imunohistochemijai naudojami audiniai turi būti fiksuojami. Fiksuojant audinius svarbu užtikrinti esamą audinio struktūrą ir ląstelių morfologiją, bet svarbiausia išsaugoti kaip įmanoma daugiau antigenų audinyje. Fiksuojant audinius reikia neperlaikyti jų fiksavimo skystyje, nes taip bus susilpninti arba visai sunaikinti antigenai ir neįvyks imunohistocheminė reakcija. Dažniausiai audinio fiksavimui naudojamas formalinas. Po fiksacijos antigenų aktyvieji centrai - epitopai dažnai būna sujungti, todėl reikia juos atlaisvinti, kad prie jų būtų galima prijungti
22
antikūnus. Antigenai atlaisvinami naudojant fermentus, karščiu arba kombinuojant abu metodus. Fermento (pvz. tripsinas, pepsinas.) koncentracija ir veikimo juo laikas priklauso nuo fiksavimo būdo. Kai kurios endogeninės kilmės (pvz. endogeninė peroksidazė, endogeninis biotinas) medžiagos gali turėti įtakos imunohistocheminiam preparatų dažymui. ir dėl to gali būti gauti klaidingai teigiami rezultatai. Kad tyrimo rezultatai būtų tikslūs šios medžiagos yra blokuojamos specialiais tirpalais.Imunohistocheminis dažymui naudojamas tiesioginis arba netiesioginis metodai. Tiesioginio metodo metu pridedami specialiais dažais žymėti pirminiai antikūnai. Tiesioginis metodas yra paprastesnis ir užima mažiau laiko tačiau yra ne taip gerai išryškinamos norimos audinių struktūros. Netiesioginio metodo metu pirmiausia pridedami pirminiai nežymėti antikūnai ir prie jų prijungiami antriniai žymėti antikūnai.(14) Tyrimams naudojami arba monokloniniai arba polikloniniai antikūnai. Monokloninai antikūnai jungiasi tik prie vieno antigeno epitopo, o polikloniniai – prie keleto to paties antigeno epitopų. Monokloniniai antikūnai yra labiau selektyvūs ir užtikrina, kad bus pažymėtas tik tai tam tikras antigenas, polikloniniai antikūnai nėra tokie selektyvūs ir yra didesnė galimybė, kad jie prisijungs ir prie kito – netinkamo antigeno.(15)
CD31 (PECAM-1) antigenas yra vienagrandis glikoproteinas, randamas ant tromblocitų, monocitų, granuliocitų ir B –limfocitų paviršiaus, taip pat ir endotelio ląstelėse. Šis baltymas dalyvauja susidarant endotelio ląstelių tarpusavio ryšiams ir palaiko jas susijungusias. Dėl šių jo savybių manoma jog CD31 baltymas turi įtakos trombų susidarymui, žaizdų gijimui ir angioneogenezei. Angioneogenezė yra vienas iš svarbiausių veiksnių įtakojantis naviko augimą ir tuo pačiu jo piktybiškumą.(9) Imunohistocheminių tyrimų metu histologiniuose preparatuoseprie šio antigeno prijungus žymėtus antikūnus yra išryškinamos endotelio ląstelės, o tai leidžia įvertinti naviko vaskuliarizaciją ir daryti išvadas apie naviko augimą ir jo piktybiškumą.
Polikloniniai antikūnai Monokloniniai antikūnai
23
2. DARBO METODIKA
Tyrimo duomenys buvo renkami Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos Dr. L. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikoje ir X klinikoje Klaipėdoje. Iš operacijų (mastektomijų) metu pašalintų navikų buvo paimti meginiai histologiniams tyrimams. Taip pat surinkta gyvūnų gyvenimo anamnezė: gyvūno rūšis, veislė, amžius, lytis. Iš paimtų mėginių LSMU VA Patologijos centre buvo atliktassuirnktųmėginiųhistopatologinistyrimas, o LSMU MA Histologijos ir embriologijos katedroje - imunohistocheminė reakcijaantigenui CD31. Paimti mėginiai fiksuoti 10 proc. buferiniu formalino tirpalu. Iš jų paruošti parafininiai blokai naudojant automatinį audinių procesorių „Shandon pathcentre“ ir įlieti „TES 99 Medite Medizintechnik“ įranga. Iš parafininių blokelių padaryti 4 mikronų storio pjūviai, naudojant pusiau automatinį rotacinį mikrototomą „Sakura ACCu-Cut SRM“. Pjūviai dažyti gimzos dažais. Nudažyti preparatai mikroskopuoti šviesiniu ir poliarizaciniu mikroskopu Olympus BX63. Histologinių preparatų dažymo technika: 1. Ksilenas I 5-6min. 2. Ksilenas II 5-6min. 3. Spiritas 96˚ I 2min. 4. Spiritas 96˚ II 2min. 5. Vanduo 2 - 3min.
6. Gimzos tirpalas (80ml išgryninto vandens, 20ml gimzos tirpalo) – 1val. 7. Vanduo ir keli (3 – 4) lašai ledinės acto rūgšties – kelios sekundės 8. Spiritas 96˚ I 2min.
9. Spiritas 96˚ II 2min. 10. Ksilenas I – 1min. 11. Ksilenas II – 1min. 12. Dengimas
Paruoštuose histologiniuose preparatuose mikroskopu x400 padidinimu buvo skaičiuotos putliosios ląstelės. Ląstelės skaičiuotos trijuose matymo laukuose ir išvestas vidurkis. Paruoštuose imunohistocheminiuose preparatuose skaičiuoti kapiliarai, (kraujagysles kurių skersmuo ne didesnis nei vieno arba dviejų eritrocitų dydžio. Kapiliarai taip pat skaičiuoti trijuose matymo laukuose ir išvestas vidurkis. Taip pat nustatytas navikų tipas.Preparatuose buvo stebimas kapiliarų skaičiaus kitimas priklausomai nuo putliųjų ląstelių skaičiaus.
24
2.1 Imunohistocheminiai tyrimai
Norint išryškinti CD31 baltymą buvo atliktas imunohistocheminis dažymas naudojant dviejų etapų, didelio jautrumo „DAKO En Vision“ dažymo sistemą. Sistemoje naudojamas fermentai ir antrinių antikūnų molekulės. Imunohistocheminiams tyrimams histologiniai pjūviai buvo uždėti ant elektrinį krūvį turinčių „Super frost“ stiklelių. Deparafinacija buvo vykdoma 56˚C temperatūroje. Antigenų aktyviųjų centrų atblokavimui nadotas kombinuotas metodas – veikiant pjūvius tirpalu „DAKO high pH“ ir veikiant juos karščiu. Pjūvių dažymui naudota „thermo Shandon coverplate“ sistema. Endogeninės kilmės peroksidazė blokuota naudojant peroksidazę blokuojantį tirpalą (DAKO HRP). Pridėti pirminiai antikūnai: (DAKO monokloniniai pelės, anti-žmogaus, CD31, endotelio ląstelių klonas JC70,anti CD31, skiedimas 1:40) Pridėti antriniai antikūnai (DAKO en Vision). Naudotas DAB chomogenas (chromogenas A praskiestas citrato buferiniu tirpalu). Tarp dažymų atlikti plovimai naudojant „Tween 20“ buferinį ploviklį.
25
3. TYRIMO REZULTATAI
Nuo 2011iki 2014metų LSMU VA patologijos centre ištirti 36 kalių pieno liaukos navikai.Visi prepatatai buvo paimti operacijų (mastektomijų) metu. Surinkta gyvūnų gyvenimo anamnezė: gyvūno rūšis, veislė, amžius, lytis. Visi preparatai paruošti iš pieno liaukos navikų surinktų iš kalių.Taip pat nustatytas navikų tipas. Statistinė duomenų analizė atlikta „Microsoft Office Excel 2007“programa.
(1 pav.Tirtų pieno liaukų navikų pasiskirstymas pagal šunų veislę.)
Daugiausiai ištirtų pieno liaukos navikų iš negrynaveislių (mišrūnų) šunų (19,44 proc., p<0,05), antroje vietoje viokiečių aviganiai (16,67 proc., p<0,05). Po vieną pieno liaukos naviką (sudaro po 2,78proc., p,<0,05) ištirta iš: labradoro retriverio, auksaspalvio retriverio, toiterjero, biglio, vakarų Sibiro laikos, boserono, takso, prancūzų buldogo, bei vakarų Škotijos baltojo terjero.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Vn t. Veislė
Tirtų kalių p. l. navikų suskirstymas pagal
veislę
26
(2 pav. Gyvūnų sirgusių pieno liaukos navikais pasiskirstymas pagal amžių.)
Dažniausiai pieno liaukos navikai buvo nustatyti gyvūnams nuo 7 iki 9 metų amžiaus. Tai sudarė 44,44 proc. (p<0,05). Šunų grupė virš 10 metų amžiaus sudarė 41,67proc. (p <0,05), likę 13,89proc. (p<0,05) sudarė šunys nuo 4 iki 6 metų amžiaus.
4 - 6 7 - 9 >10 0 5 10 15 20 A m ži u s Vnt.
Gyvūnų sirgusių pieno liaukos navikais
pasiskirstymas pagal amžių
27
(3 pav.Kapiliarų skaičius vidurkiai preparatuose ( skaičius vnt./matymo lauke))
Daugiausiai kapiliarų buvo suskaičiuota solidinės karcinomos tipo naviko preparatuose(6,33 vnt./matymo lauke, p>0,05) ir (6,00 vnt./matymo lauke, p>0,05) Nedidelis kapiliarų kiekis nustatytas intralatakinės karcinomos tipo navike (3,33 vnt./matymo lauke, p>0,05) Mažiausias kapiliarų skaičius nustatytas solidinės karcinomos komplekso tipo naviko preparate (2,67 vnt./matymo lauke, p>0,05). 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Vn t. Naviko tipas
Kapiliarų skaičius vidurkiai preparatuose
Kapiliarų skaičius matymo lauke
28
(4 pav. Putliųjų ląstelių skaičiaus vidurkiai preparatuose (vnt./matymo lauke))
Daugiausiai pultiųjų ląstelių suskaičiuota solidinės karcinomos tipo naviko preparatuose po (8,28 p>0,05). Mažiausiai putliųjų ląstelių suskaičiuota preparate kuriame nustatyta intralatakė karcinoma (4,46proc., p>0,05).
(5 pav. Solidinė karcinoma)
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Vn t. Naviko tipas
Putliųjų ląstelių skaičius matymo lauke
Putliųjų ląstelių skaičius matymo lauke
29
(6 pav. Intralatakinė karcinoma)
(7 pav. Kapiliarų skaičiaus priklausomybė nuo putliųjų ląstelių skaičiaus)
Paskaičiuotas koreliacijos koeficientas (0,7) tarp kapiliarų skaičiaus ir putliųjų ląstelių skaičiaus rodo vidutiniostiprumo šių kintamųjų tarpusavio priklausomybę.
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Vn t. Preparatai
Kapiliarų skaičiaus priklausomybė nuo putliųjų
ląstelių skaičiaus.
Kapiliarų skaičius matymo lauke Putliųjų ląstelių skaičius matymo lauke
30
(8 pav. imunohistocheminė reakcija su antigenu CD31)
(9 pav. Navikų pasiskirstymas pagal tipą)
Daugiausiai nustatyta solidinės karcinomos tipo navikų (25proc., p>0,05), antroje vietoje intralatakės karcinomos komplekso tipo navikai (19proc., p>0,05).
25% 7% 6% 19% 6% 6% 13% 6% 6% 6%
Navikų pasiskirstymas pagal tipą
Solidinė karcinoma Adenokarcinoma
Solidinės karcinomos kompleksas Intralatakinės karcinomos kompleksas Mikropapilinės karc. kompleksas su kaulinio aud. form.
Karcinoma ir cistinė hiperplazija Intralatakinė karcinoma Tubulinė karcinoma Lipidinė karcinoma
31
4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS
Tyrimų metu išanalizuota lyties, veislės ir amžiaus predispozicija sergamumui pieno liaukos navikais. Kaip ir minima literatūroje, kalės yra žymiai labiau linkusios sirgti pieno liaukos navikais nei patinai. Tai yra susiję su hormoniniais pokyčiais vykstančiais patelių organizme rujos metu.(16) Per 2011 – 2014 m. laikotarpį LSMU VA Patologijos centre netirtas ne vienas pieno liaukos naviko mėginys paimtas iš patino. Iš tirtų pieno liaukos navikų mėginių 19,44proc. (p<0,05) buvo paimti iš negrynaveislių (mišrūnų) šunų. Tačiau negalima teigti jog mišrūnai yra labiau linkę sirgti pieno liaukos navikais, nes dažniausiai nėra žinoma jų genetinė linija (jų protėviai galėjo būti grynaveisliai šunys turintys veislės predispoziciją pieno liaukos navikams), taip pat didelis kiekis žmonių laiko negrynaveislius šunis. Tyrimuose gauta, jog 16,67proc. (p<0,05) sudarė vokiečių aviganių veislės šunys. Literatūroje galima rastiduomenų jog pieno liaukos navikais labiau linkę sirgti didelių veislių šunys.(1) Taip pat literatūroje ši veislė yra priskirta prie turinčių predispozicija susirgti pieno liaukos navikais. Prie turinčių predispoziciją sirgti pieno liaukos navikais priskiriami ir Jorkšyro terjerų veislės šunys.(17) Jie sudarė 13,89 proc. (p<0,05), pastaruoju metu yra daug šios veislės šunis auginančių žmonių. Sugrupavus tirtus gyvūnus pagal amžių nustatyta jog didžiausias sergamumas pieno liaukos navikais pasireiškia 7 – 8 m. amžiaus gyvūnams, ši grupė sudarė 44,44 proc. (p<0,05) tirtų gyvūnų. Literatūroje aprašyta jog vidutinis amžius gyvūnų sergančių pieno liaukos navikais yra 8 metai(1). Padarytuose histologiniuose preparatuose buvo suskaičiuoti kapiliarai bei išvesti vidurkiai. Taip pat suskaičiuotos putliosios ląstelės bei išvesti vidurkiai. Buvo analizuojama kapiliarų skaičiaus priklausomybė nuo putliųjų ląstelių skaičiaus. Suskaičiuotas koreliacijos koeficientas (0,7) rodo stiprią šių kintamųjų tarpusavio priklausomybę. Palyginus grafikus nustatyta didelis putliųjų ląstelių skaičius rastas tuose preparatuose kuriuose nustatytas naviko tipas – solidinė karcinoma (1, 8 ir 11 preparatai), taip pat nemažas putliųjų ląstelių kiekis rastas intralatakinės karcinomos komplekso tipo navikuose (5 ir 7 preparatai). Daugiausiai kapiliarų nustatyta tuose preparatuose kur nustatytas naviko tipas – solidinė karcinoma (1 ir 11 preparatai). Nedidelis putliųjų ląstelių kiekis nustatytas tame preparate kur nustatytas naviko tipas intralatakinė karcinoma (12 ir 15 preparatai).
32
IŠVADOS
1. Iš tyrimų matyti, kad tarp naujų besiformuojančių kapiliarų ir putliųjų ląstelių yra vidutinio stiprumo tarpusavio koreliacijos koeficientas (0,7).
2. Didžiausi putliųjų ląstelių ir naujai suformuotų kapiliarų kiekiai nustatyti solidinės karcinomos tipo navikuose.
3. Mažiausiai putliųjų ląstelių ir naujų kapiliarų rasta intralatakinės karcinomos tipo navike.
33
PADĖKA
LSMU MA Histologijos ir embriologijos katedros. prof. A. Valančiūtei ir asistentei R. Mozūraitei už imunohistocheminę reakciją CD31 antigenui.
34
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Henrik E. Toumours of the mamary gland. In Dobson Jane M, Duncan B, Lascelles X. BSAVA manual of canine and feline oncology, third edition. Gloucester: british small animal asssociation; 2011. Chapter 16; p. 237-46.
2. Lavalle GE,Bertagnolli AC, Tavares WLF, Ferreira MA, Cassali GD. Mast cells and angiogenesis in canine mammary tumor. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 2010;62(6):1348-51 3. Evans HE, Lahunta A. Miller‘s anatomy of the dog. St. Louis: Elsevier sounders; 2013.
Chapter 9; p. 399-401.
4. Baba AI, Câtoi C. Comaparative Oncology. Bucharest: The Publishing House of the Romanian Academy; 2007. Chapter 11.
5. Goldschmidt M. et al.Classification and Grading of Canine Mammary Tumors. Veterinary Pathology 2011; 48(1):117-131.
6. Withrow S, Vail D, Page R. Withrow and MacEwen's Small Animal Clinical Oncology. St. Louis: Saunders Elsevier; 2007. Chapter 26; p. 621-622
7. Shafiee R. et. al. Diagnosis, classification and grading of canine mammary tumours as a model to study human breast cancer: an Clinico-Cytohistopathological study with environmental factors influencing public health and medicine. Cancer Cell Int. 2013; 13(79) 8. Urb M, Sheppard DC. The Role of Mast Cells in the Defence against Pathogens. PLoS
Pathogens. 2012; 8(4).
9. Conti P. et. al. Role of mast cells in toumor growth. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2007; 37(4)
10. Halova I, Draberova L, Draber P. Mast Cell Chemotaxis – Chemoattractants and Signaling Pathways. Front Immunol 2012; 3:119.
11. Okayama Y, Kawakami T. Development, Migration, and Survival of Mast Cells.Immunol Res. 2006; 34(2): 97–115.
12. Huang B. et. al.SCF-mediated mast cell infiltration and activation exacerbate the inflammation and immunosuppression in tumor microenvironment.Blood. 2008; 112(4):269–1279.
13. Theoharides TC, Conti P. Mast cells: the JEKYLL and HYDE of tumor growth. TRENDS in Immunology. 2004; 25(5)
14. Chen X, Cho DB, Yang PC. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2010;2(5)
15. Kumar GL, Ludbeck L. Education guide, immunohistochemical staining methods, fifth edition. 2009. Chapter 1; p. 3-6.
35
16. Morris. J, Dobson J. Small animal oncology. Blackwell science. 2001. Chapter 12; p 184 - 191
17. SleeckxN. et. al. Canine mammary tumors an owerview. Reprod Domest Anim. 2011; 46(6): 1112– 1131.
