adovė: Magistrinis darbas V Ų POVEIKIUI KEPENŲ TRANSLIACIJOS SISTEMAI ĮVERTINIMAS ESANT TOKSINIAM KADMIO JON CINKO JONŲ APSAUGINI O POVEIKIO Laura Šlapikaitė K M Farmacijos fakultetas

K

M

Farmacijos fakultetas

Laura Šlapikaitė

CINKO JONŲ APSAUGINIO POVEIKIO

KEPENŲ TRANSLIACIJOS SISTEMAI ĮVERTINIMAS ESANT

TOKSINIAM KADMIO JONŲ POVEIKIUI

Magistrinis darbas

Vadovė:

Darbas atliktas: 2007 – 2008 m. Kauno Medicinos Universitete, Biomedicininių tyrimų institute,

Patochemijos laboratorijoje.

Recenzentas: KMU BMTI Patochemijos laboratorijos mokslo darbuotojas, Biochemijos katedros lektorius dr. Arūnas Liekis

Darbas ginamas: viešame magistro darbų gynimo komisijos posėdyje 2008 metų birţelio 11 d.

Kauno Medicinos universitete.

Protokolo Nr. ...

darbo vykdytojo pavardė ir parašas:

mokslinio darbo vadovo (-ės) pavardė ir parašas:

laboratorijos, atsakingos už magistro darbo parengimą, pavadinimas, jos vedėjo pavardė ir parašas:

L.Šlapikaitė ...

KMU BMTI Patochemijos laboratorijos vyresnioji mokslo darbuotoja, Biochemijos katedros docentė dr. I.Sadauskienė

...

KMU BMTI Patochemijos laboratorijos vedėjas vyriausiasis mokslo darbuotojas, Biochemijos katedros lektorius habil. dr. Leonid Ivanov

...

TURINYS:

SANTRUMPOS ………..…………...4

ĮVADAS ………...5

II. LITERATŪROS APŢVALGA ………...……...7

2. 1. Sunkieji metalai ir jų poveikis organizmui ……...………...………...7

2. 1. 1. Kadmio jonų poveikis ląstelių metabolizmui ...8

2. 1. 2. Cinko jonų poveikis ląstelių metabolizmui ……..…...14

2. 2. Bendri transliacijos proceso principai ………...20

2. 2. 1. Ribosomos ………...20

2. 2. 2. Pernašos RNR ………...………...21

2. 2. 3. Aminoacil-tRNR-sintetazės ………...23

2. 2. 4. Baltymų biosintezės mechanizmas ………...24

2. 3. Metalotioneinai ...28

2. 4. Kadmio jonų poveikis transliacijos sistemai ………...32

III. TYRYMŲ MEDŢIAGA IR METODAI………...38

3.1. Tyrimų objektas ir pagrindiniai reagentai ………...…..…..38

3. 2. Baltymų biosintezės intensyvumo pelių organuose in vivo nustatymas ...39

3. 3. Suminių tRNR preparatų išskyrimas ...40

3. 4. Aminoacil-tRNR-sintetazių preparatų išskyrimas ………...…...40

3. 5. tRNRLeu akceptorinio aktyvumo nustatymas ...41

3. 6. Leucil-tRNR-sintetazės aktyvumo nustatymas ………...41

3. 7. Metalų jonų įtakos tRNRLeu ir leucil-tRNR-sintetazės aktyvumui tyrimas in vitro...42

3. 8. Statistinė analizė………...…...42

IV. REZULTATAI………...43

4. 1. Kadmio ir/arba cinko jonų poveikis baltymų biosintezės intensyvumui pelių kepenyse in vivo...43

4. 2. Kadmioir/arba cinko jonų poveikis tRNRLeu akceptoriniam aktyvumui in vivo ...45

4. 3. Kadmioir/arba cinko jonų poveikis leucil-tRNR-sintetazės akceptoriniam aktyvumui in vivo...46

4. 4. Kadmioir/arba cinko jonų poveikis tRNRLeu ir leucil-tRNR-sintetazių aktyvumui in vito...47

V. REZULTATŲ APTARIMAS………...49

VI. IŠVADOS………...52

SANTRUMPOS

AMP – adenozin-5 -monofosfatas ARSazė – aminoacil-tRNR sintetazė ATP – adenozin-5 -trifosfatas DNR – deoksiribonukleorūgštis

eEF – eukariotų transliacijos elongacijos faktorius eIF – eukariotų transliacijos iniciacijos faktorius eRF – eukariotų transliacijos terminacijos faktorius ET – endoplazminis tinklas

GDP – guanozin-5 -trifosfatas GSH – glutationas

GTP – guanozin-5 -trifosfatas HSPs – šiluminio šoko baltymai

IEGs – staigaus ankstyvo atsako genai (protoonkogenai) mRNR – informacinė ribonukleorūgštis

LD50 – pusė vidutinės mirtinos dozės

MDA – malondialdehidas MMR – DNR klaidų atitaisymas MT – metalotioneinas

RNR – ribonukleorūgštis

ROS – reaktyvinės deguonies formos rRNR – ribosominė ribonukleorūgštis SM – sunkieji metalai

-SH – sulfanido (merkapto) grupė SOD – superoksido dismutazės TF – transkripcijos faktorius tRNR – pernašos ribonukleorūgštis

I. ĮVADAS

Sparčiai vystantis pramonei ir intensyvėjant jos plėtrai, didėja aplinkos uţterštumas, todėl vis svarbesnis tampa sunkiųjų metalų, naudojamų pramonėje, įtakos gyviesiems organizmams tyrimas. Augant pramoninei gamybai, chemizuojant ţemės ūkį, didėja maisto produktų, vaisių, darţovių uţterštumas sunkiaisiais metalais, pesticidais, detergentais. Dėl cheminio aktyvumo sunkieji metalai iš ţemės dirvos patenka į augalinės bei gyvulinės kilmės maisto produktus, o su maisto produktais (pavyzdţiui, arbatmedţio lapeliais, kavos pupelėmis, saulėgrąţomis, konservuota mėsa) – į ţmogaus organizmą.

Sunkieji metalai yra vieni didţiausių ekologinių nuodų. Į šį sąrašą patenka daug elementų, kurie yra būtini normaliam organizmo vystymuisi – geleţis, kobaltas, cinkas, varis, manganas, molibdenas, selenis, chromas, kobaltas, magnis. Dalis jų vadinami mikroelementais. Viršijus būtiną mikroelementų patekimo į organizmą lygį, kalbama apie jų toksiškumą. Gamtoje sunkiųjų metalų priskaičiuojama 38, bet ne visi besąlygiškai priskiriami toksiniams. Toksiškais gali tapti bet kurie elementai, priklausomai nuo jų koncentracijos ir cheminio junginio formos.

Kadmis – labai toksiškas sunkusis metalas, sukeliantis neurotoksinius, hepatotoksinius bei nefrotoksinius efektus. Nors šis metalas labai nedideliais kiekiais randamas ţmogaus organizme ir dalyvauja organizmo metabolinuose procesuose, tačiau didelis patekusio ir susikaupusio kadmio kiekis sukelia kepenų, inkstų, smegenų, plaučių, širdies, sėklidţių ir CNS intoksikaciją. Kadmis siejamas su tokių ligų išsivystymu kaip prostatos, kasos, plaučių, inkstų vėţys, osteoporozė, maţakraujystė, eozinofilija, negrįţtami inkstų kanalėlių pakitimai, gali sumaţėti ar net visai išnykti uoslės pojūtis [1]. Pasaulinės sveikatos organizacijos Tarptautinė vėţio tyrimų agentūra (angl.- International Agency for Research on Cancer – IARC) pagal sukeliamą ţalingą poveikį ţmogaus sveikatai kadmį priskyrė pirmajai kategorijai, pagal kurią medţiagos yra pripaţintos kancerogeniškos ţmogui [2].

Kadmis iš kitų metalų išsiskiria savo įvairiapusiu toksiniu poveikiu: jo ilgas biologinis gyvavimo pusperiodis (ţmogaus organizme apie 20-30 metų), maţas šalinimo iš organizmo greitis (1-2 mg per dieną) bei ilgalaikis kaupimasis minkštuosiuose audiniuose, ypač kepenyse ir inkstuose [1, 2]. Viena kadmio nuodingumo savybių yra jo neigiama įtaka ląstelių metalofermentinėms sistemoms, ypač turinčioms –SH grupes, kurių aktyviuosiuose centruose kadmis pakeičia varį (Cu), kalcį (Ca), cinką (Zn) ir kitus metalus [3].

Cinko kaip mikroelemento svarba organizmui jau seniai pastebėta. Cinkas įeina daugiau kaip į 300 fermentų sudėtį, dalyvauja fermentinėse reakcijose, palaiko ląstelės homeostazę ir normalų funkcionavimą ir yra svarbus viso organizmo vystymuisi ir augimui. Šis

mikroelementas yra metabolinis kadmio antagonistas, todėl pastaraisiais dešimtmečiais plačiai pradėta tirti cinko apsauginis poveikis ląstelių metabolizmui.

Kadangi apsinuodijimų sunkiaisiais metalais daţnis tebėra didelis, prevencinės strategijos bei veiksmingo gydymo poreikis išlieka aktualūs. Savo eksperimentais mes siekėme įvertinti galimą apsauginį cinko jonų poveikį baltymų biosintezei esant toksiniam kadmio jonų poveikiui.

Tikslas: įvertinti apsauginį cinko jonų poveikį baltymų biosintezės sistemai bei svarbiausiems jos komponentams (tRNR ir aminoacil-tRNR-sintetazėms) esant slopinančiam kadmio jonų poveikiui.

Uţdaviniai:

1. Nustatyti kadmio ir/arba cinko jonų poveikį baltymų biosintezės intensyvumui pelių organuose in vivo.

2. Nustatyti kadmio ir/arba cinko jonų poveikį atskiriems transliacijos sistemos komponentams (tRNRLeu ir leucil-tRNR-sintetazės aktyvumui) in vivo ir in vitro.

3. Įvertinti apsauginį cinko jonų poveikį baltymų biosintezės sistemai ir pagrindiniams jos komponentams, esant toksiniam kadmio jonų poveikiui.

II. LITERATŪROS APŢVALGA

2. 1. Sunkieji metalai ir jų poveikis organizmui

Sunkieji metalai (SM) yra vieni iš toksiškiausių elementų, todėl uţima ypatingą vietą tarp gamtinės aplinkos cheminės kontrolės rodiklių. Daugelis sunkiųjų metalų kaip mikroelementai yra gyvybiškai būtini organizmų vystymuisi, tačiau esant didesnėms koncentracijoms jie veikia toksiškai. Viena iš pavojingiausių sunkiųjų metalų savybių yra ta, kad gyvuosiuose organizmuose jie kaupiasi netgi tada, kai jų koncentracijos aplinkoje esti maţos, todėl per ilgesnį laiką jų koncentracijos gali pasiekti pavojingą ribą.

Sunkiaisiais metalais vadinami tokie elementais, kurių 1 cm3 sveria daugiau negu 5 g. Biologinės klasifikacijos poţiūriu sunkiaisiais metalais teisingiau vadinti elementus, kurių atominė masė didesnė negu 40. Gamtoje SM priskaičiuojama 38, bet ne visi besąlygiškai priskiriami toksiškiems metalams. Toksiškais gali tapti bet kurie elementai, reikalingi normaliam ląstelių funkcionavimui, priklausomai nuo jų koncentracijos ir cheminio junginio formos. Pagal pavojingumą gyvajam organizmui sunkieji metalai yra išsidėstę taip: Hg, As, Cu, Cd, Zn, Cr, Mn, Fe, Ti, Pb. Priklausomai nuo koncentracijos ir cheminio junginio formos, toksiškais gali tapti bet kurie elementai. Skirtumas tarp gyvybiškai būtinų ir toksiškų koncentracijų kai kuriems elementams palyginti nedidelis, todėl jie vadinami potencialiai toksiškais [4].

Kai kurie sunkieji metalai neatlieka jokios svarbios biologinės funkcijos ir pasiţymi toksiniu poveikiu (pvz., kadmis ar arsenas), bet dauguma jų yra būtini gyvajam organizmui (17 iš 30 svarbiausiųjų organizmui elementų yra metalai). Tačiau ir būtinųjų metalų didelės koncentracijos gali pasiţymėti toksiniu poveikiu. Veikiant sunkiesiems metalams ţmonėms pasireiškia hipofosfatemija, širdies ligos, kepenų paţeidimai, urologiniai sutrikimai, centrinės nervų sistemos, reproduktyvinės funkcijos paţeidimai, vėţys, augimo ir vystymosi nukrypimai, imuniteto susilpnėjimas. Buvo nustatyta, kad sunkieji metalai sutrikdo lytinę funkciją, pagreitina aterosklerozę, piktybinių navikų atsiradimą, paţeidţia genetinį aparatą. Lytines ląsteles veikia kadmis, cinkas, chromas, nikelis, švinas arsenas, kobaltas ir kiti. Švinas paţeidţia nervų sistemą, stroncis sukelia kremzlinio ir kaulinio audinio distrofiją, selenas sutrikdo kepenų ir virškinimo trakto veiklą. Sunkieji metalai yra pavojingi organizmui, kadangi jų jonai veikia kaip katalizatoriai formuojantis įvairiems laisviesiems radikalams, sutrikdo DNR reparacijos bei replikacijos procesus ir indukuoja citogenetines paţaidas [5]. Sunkiųjų metalų jonai įeina į biologiškai svarbių molekulių sudėtį ir dalyvauja kaip katalitiniai centrai (pvz., kobaltas vitamino B ar geleţis hemoglobino, citochromų sudėtyje).

Daugelyje fermentų metalai atlieka kofaktorių vaidmenį. Pavyzdţiui, varis aptiktas katalazės, peroksidazės, citochromoksidazės ir kai kurių kitų fermentų aktyviajame redukuojančiame centre. Be to, jie reikalingi chromatino stabilizacijai (cinkas, magnis, varis). Vien tik cinkas yra būtinas daugiau nei 300 fermentų struktūrai ir veikimui [76]. Metalai gali tiesiogiai indukuoti genų raišką per metalų reguliuojamus transkripcijos faktorius, veikti per transdukcijos molekules [6].

Tiriant sunkiųjų metalų įtaką ţmogui, prieinami tik klinikiniai duomenys, anaiptol neatspindintys visų apsinuodijimo patogenezės grandţių. Tyrimo paţintines spragas tenka uţpildyti eksperimentais, kurių pagalba gaunama daugiau informacijos apie sunkiojo metalo toksiškumą.

2. 1. 1. Kadmio jonų poveikis ląstelių metabolizmui

Kadmis – periodinės elementų lentelės II B grupės elementas. Atominė masė – 112,41. Atomo numeris 48. Periodinėje lentelėje kadmis yra toje pačioje grupėje kaip ir cinkas (Zn) bei gyvsidabris (Hg). Kadmio pavadinimas yra kilęs iš lotyniško ţodţio cadmia ir graikiško ţodţio kadmeia, kuris reiškia kalaminą (cinko karbonatas ZnCO3). Pagrindinis kadmio

oksidacijos laipsnis yra(II) – Cd2+ [7].

Kadmis į aplinką patenka dviem būdais: natūralaus gamtoje vykstančio proceso metu ir pramoniniu būdu. Dėl pramoninių veiksnių kadmio kiekis aplinkoje ţymiai didesnis, lyginant su patenkančiu kiekiu natūralaus proceso metu. Tiek gamtinis, tiek antropogeninės kilmės kadmis yra vienodai toksiškas [8]. Tačiau svarbu paţymėti, jog antropogeninės kilmės kadmio į atmosferą patenka 3-10 kartų daugiau nei gamtinės kilmės [1].

Į aplinką kadmio patenka kartu su iškastinio kuro degimo produktais, fosforo trąšomis, pesticidais, tabako dūmais, automobilių padangų dulkėmis [9]. Kaip sudėtinė dalis kadmis daugiausia įeina i pakraunamas Ni-Cd baterijas, daţų pigmentus, naudojamas kaip plastikų stabilizatorius, antikorozinė priemonė [10].

Vanduo, maistas ir cigarečių dūmai taip pat yra kadmio šaltiniai. Ypač daug kadmio yra tabako lapuose. Daugiausia tabako gaminama iš Nicotiana tabacum L. augalų rūšies, kuri pasiţymi polinkiu kaupti dirvoje esantį kadmį. Viename grame sausų tabako lapų vidutiniškai kadmio randama 1–2 μg. Tai atitinka 0,5–1 μg kadmio vienoje cigaretėje. Degant cigaretei, susidaro gerai organizmo įsisavinamas CdO. Apie 10 proc. įkvėpto kadmio oksido nusėda plaučiuose, 30-40 proc. patenka į sisteminę kraujotaką. Nustatyta, jog rūkančių ţmonių kadmio koncentracija kraujyje ir inkstuose atitinkamai didesnė 4–5 ir 2–3 kartus negu nerūkančių ţmonių [8]. Nustatyta, jog su maistu Europos šalių gyventojai kadmio gauna nuo

10 iki 30 μg per dieną [11]. Vidutiniškai su maistu gaunama 2/3 augalinės kilmės maisto produktuose esančio kadmio ir 1/3 viso su maistu gaunamo kadmio kiekio patenka su gyvulinės kilmės maisto produktais [8]. Vadinasi, vegetarai kadmio gauna daugiau, nei mėsą vartojantys.

Patekęs į kraują, kadmis jungiasi su didelės molekulinės masės baltymais, ypatingai albuminais, sudaro junginius su metalotioneinais (MT) (angl.- metallothioneins) ir raudonaisiais kraujo kūneliais. Iki 75 proc. viso ţmogaus organizme susikaupusio kadmio randama kepenyse ir inkstuose [12, 13].

Kadmio molekuliniai taikiniai yra gerai ţinomi. Tai yra baltymų ir peptidų -SH grupės, nukleotidų ir nukleinorūgščių nukleobazės [14, 15]. Į ląstelę Cd2+

lengvai patenka per Ca2+ kanalus dėka panašaus molekulių dydţio ir krūvio [13]. Sferinis atitikmuo leidţia Cd2+

dalyvauti biologiniuose procesuose kaip ir Ca2+, todėl kadmis gali pakeisti Ca2+ jonus, aktyvuoti proteinkinazę C, kuri dalyvauja perduodant tarpląstelinius signalus, reguliuoja ląstelės diferenciaciją, genų raišką ir kaulų formavimąsi [13, 16, 17].

Kadmis slopina DNR atsinaujinimo (reparacijos) procesą. Patekęs į organizmą kadmis veikia daugelį organų taikinių, o sukeliami molekuliniai ir ląsteliniai paţeidimai priklauso nuo jo koncentracijos ir apsinuodijimo trukmės. Maţomis, nanomoliarinėmis ir mikromoliarinėmis koncentracijomis, kadmis sukelia laikinus transkripcijos faktorių aktyvavimo paţeidimus, DNR sintezės reguliavimo sutrikimus, skatina nukleorūgščių sintezę, sukelia chelatuotų baltymų ir peptidų gamybą. Kadmis taip pat sutrikdo ląstelinio Ca2+

ir Zn2+ homeostazę, aktyvuoja įvairius signalų perdavimo kelius bei normalų ląstelės augimą bei diferenciaciją. Didelėmis (milimoliarinėmis) koncentracijomis šis sunkusis metalas sukelia daugybę citotoksinių poveikių, tiesiogiai slopina DNR, RNR atsinaujinimo procesą, baltymų biosintezę, slopina įvairų fermentų aktyvumą [13], didina mitochondrijų membranos laidumą, gali netiesiogiai sukelti reaktingųjų deguonies formų (angl.- reactive oxygen species (ROS)): superoksidinių radikalų (O2•−), vandenilio peroksido (H2O2), hidroksilo radikalų (OH•)

gamybą [18, 19]. Kadmis sukelia oksidacinį poveikį baltymams, lipidams ir nukleorūgštims [13]. Lipidų peroksidai, susidarę oksiduojantis lipidams, gali toliau sąveikauti su kintamo valentingumo metalais ir sukelti mutageninius ir karcinogeninius DNR paţeidimus [2].

Ūmaus apsinuodijimo kadmiu metu, stipriai paţeidţiami kepenų, plaučių, sėklidţių audiniai. Kadangi kadmiui būdingas ilgas biologinio gyvavimo pusperiodis, šio metalo jonai labiausiai paţeidţia inkstus. Inkstų nepakankamumas (nefropatija) išsivysto, kadmio koncentracijai pasiekus 200 μg/g inkstų audinio masės. Sutrikusi aminorūgščių, gliukozės, fosfato medţiagų ir maţos molekulinės masės baltymų ekskrecija ir reabsorbcija rodo gretimų kanalėlių ląstelių paţeidimus. Širdies ir kraujagyslių ligos ir padidėjęs kraujospūdis taip pat

yra kadmio jonų sukeliami efektai, matyt, susiję su inkstų ir kartu antinksčių veiklos sutrikimu [12]. Vystosi ne tik inkstų, bet taip pat kvėpavimo, kraujotakos nepakankamumas, kepenų paţeidimai, sutrinka kaulų formavimasis, susilpnėja imunitetas [20]. Ilgalaikis maţos kadmio koncentracijos poveikis sukelia chronišką plaučių obstrukciją. Tada vystosi alveolinių makrofagų nekrozė ir išsilaisvinę proteo- ir lipoliziniai fermentai sukelia negrįţtamus alveolių pagrindo membranų paţeidimus, plaučiai išsipučia. Paveikus ţiurkes vienintele kancerogenine kadmio doze (30 μmol/kg), sėklidėse išsivysto stiprus kraujavimas (hemoragija), sėklidţių Leidigo ląstelėse randama vandenilio peroksido, padidėja glutationperoksidazės aktyvumas, sumaţėja katalazės ir glutationo reduktazės aktyvumas [12]. Tyrimuose su gyvūnais nustatytas bei imunotoksinis kadmio poveikis [21].

Tyrimais su gyvūnais in vivo ir in vitro nustatyta, jog kadmis sukelia apoptozę [2, 21] ir nekrozę [22, 23]. Apoptozė – tai programuota ląstelių ţūties forma, kurios paskirtis – nepageidaujamų ląstelių pašalinimas suaktyvinant iš anksto uţprogramuotus ląstelinius mechanizmus, kurių veikimą lemia tam tikrų ląstelės genų produktai [24].

Pagrindinis mechanizmas, kurio kadmis sukelia apoptozę, yra jo poveikis sukelti ROS gamybą. Nustatyta, jog susikaupę laisvieji radikalai paţeidţia mitochondrijos membraną. Tikėtina, kad jos disfunkcija gali būti apoptozės ir nekrozės prieţastis [25].

Tačiau kadmis gali sukelti apoptozę ne tik generuodamas ROS gamybą, bet taip pat veikdamas apoptozę sukeliančių genų raišką, slopindamas antioksidantinėse reakcijose dalyvaujančių fermentų veiklą, aktyvuodamas redukcijos procesui jautrius transkripscijos faktorius ir veikdamas glutationo metabolizmą [26, 27]. Yra nemaţai duomenų apie kadmio sukeliama apoptozę T ir B limfocituose ir kitose imuninio atsako ląstelėse [25, 28, 29, 30]. Apoptozės būdu ţūvančioje ląstelėje vyksta įvairūs biocheminiai ir morfologiniai pokyčiai, kinta ląstelių paviršiuje suţadinamų molekulių sudėtis. Ląstelė pradeda trauktis, atsiskiria nuo kaimyninių ląstelių. Branduolys traukiasi ir subyra į maţas daleles, chromatinas kondensuojasi ir išsidėsto šalia branduolio membranos. Endonukleazės skaldo DNR į atskirus fragmentus. Vykstant apoptozei, ląstelės organelės nepaţeidţiamos, o baltymų fragmentai ir organelės tampa membranomis apgaubtomis apoptozinėmis pūslelėmis, kurias lengvai sunaikina fagocitinės ląstelės, išskiriančios uţdegimą slopinančius citokinus [31].

Dėl nepakankamos apoptozės susergama autoimuninėmis, virusinėmis infekcinėmis, kai kuriomis onkologinėmis ligomis (folikuline limfoma, karcinoma su p53 mutacijomis, hormoninės kilmės augliais. Tuo tarpu pernelyg intensyvi apoptozė susijusi su išeminiais paţeidimais (miokardo infarktu, reperfuzija), AIDS ir neurodegeneracinėmis ligomis [31]. Oksidacinio streso sukeliami patologiniai procesai. Oksidacinį ląstelės stresą lemia antioksidacinės sistemos sutrikimai, taip pat nepalankios ląstelės aplinkos sąlygos,

sukeliančios nevaldomą aktyvių deguonies formų didėjimą. O2•- reakcijos su lipidais,

sacharidais ir nukleorūgštimis nėra labai pavojingos. Tačiau jis reaguoja su baltymais, turinčiais prostetines pereinamųjų metalų grupes – hemus ir FeS sankaupas. OH• yra vienas iš pačių stipriausių oksidatorių. Dėl jo poveikio peroksiduojami lipidai, inaktyvinami fermentai, mutuoja DNR, sutrinka organelių funkcijos. Vandenilio peroksidas H2O2 yra aktyvus

deguonies junginys, tačiau tai nėra radikalas. H2O2 gali oksiduoti daugelį biologinių

molekulių, ypač turinčių –SH grupes, FeS sankaupas, redukuotas hemo grupes, Cu2+

turinčias prostetines grupes. Tačiau daugiausia paţeidţiamas H2O2 poveikis siejamas su jo gebėjimu,

reaguojant su pereinamųjų metalų turinčiais fermentais, virsti OH•. Azoto monoksido NO•

ţalingas poveikis susijęs su gebėjimu sukelti lipidų peroksidaciją, oksiduoti baltymų cisteino ir metionino grupes, nitrolizinti membraninių baltymų tirozino −OH grupes [32].

Naujausi tyrimai rodo, jog oksidacinis stresas gali būti vienas svarbiausių kadmio toksiškumą sąlygojančių veiksnių [21]. Jo metu padidėja kepenų lipidų oksidacija, sumaţėja kepenų gliutationo kiekis, paţeidţiama kepenų branduolio DNR ir su šlapimu išsiskiria šlapimo apykaitos metabolitai, tokie kaip malondialdehidas, formaldehidas, acetaldehidas ir acetonas. Oksidacinis stresas sukeliamas atsiradus disbalansui tarp susidariusių laisvųjų radikalų ir antioksidantinės organizmo sistemos, kai padidėjęs laisvųjų radikalų kiekis siejamas su antioksidantinių fermentų slopinimu ar antioksidantinių molekulių išeikvojimu [2, 33]. Laisvųjų radikalų sukeliami ląstelės funkcinių sistemų pažeidimai pavaizduoti 1 pav.

Kadmio jonai tiesiogiai nesukelia laisvųjų radikalų susidarymo. Jis slopina antioksidacinėse reakcijose dalyvaujančių fermentų aktyvumą ir sukelia reaktingųjų deguonies formų kaupimąsi [34]. Susidaręs azoto oksidas, įvairūs superoksido, hidroksilo radikalai sukelia oksidacinį stresą [35]. Yra duomenų, jog kadmis gali sukelti oksidacinį stresą stipriai jungdamasis prie –SH grupių ir sutrikdydamas viduląstelinį oksidacinį/antioksidacinį balansą [36]. Kai kurie autoriai mano, jog kadmis išstumia geleţį ir varį iš citoplazmos bei membranos baltymų ir didina laisvos chelatuotos geleţies bei vario koncentraciją, kurie tiesiogiai dalyvauja oksidacinio streso susidarymo reakcijose- Fentono reakcijose [37].

1 pav. Laisvųjų radikalų sukeliami ląstelės funkcinių sistemų pažeidimai [12]

Susidarę laisvieji radikalai įvairiai modifikuoja DNR bazes [2], sukelia baltymų oksidacinius pokyčius, lemia aminorūgščių šoninių grandinių oksidaciją ir baltymų fragmentaciją, dėl to suyra svarbūs ląstelės fermentai. Laisvieji radikalai reaguoja su branduolio ir mitochondrijų DNR timinu, sukelia ląstelės DNR paţaidas bei jos vijos įtrūkius [24].Atsiradę DNR paţeidimai gali buti ląstelės mutacijų bei sutrikusios programuotos ląstelės mirties – apoptozės – prieţastimi [34]. Laisvieji radikalai, kurių didelis kiekis pasigamina oksidacinio streso metu, sukelia kancerogenzėje dalyvaujančių protoonkogenų, antionkogenų, apoptozės genų bei DNR reparacijos genų mutacijas [24].

Gausus laisvųjų radikalų kiekis išsekina ląstelės gynybines jėgas ir ţeidţia jos organoidų, citoplazmos membranas, trikdo normalias ląstelių funkcijas. Kinta membranų lipidų fizikinės-cheminės savybės: jose maţėja fosfolipidų, riebalų rūgščių. Kaupiantis lipidų peroksidams susidaro membranų struktūriniai defektai, susiformuoja transmembraniniai laidumo kanalai, pro kuriuos eina nekontroliuojamas katijonų ir kitų molekulių srautas į ląstelę ir iš jos. Ląstelėje kaupiasi Na+

, Ca2+, vanduo, ji brinksta, mitochondrijose sutrinka energijos gamyba, ląstelė gali ţūti

Agresyvūs OH• radikalai labiausiai paţeidţia ypatingai oksidacijos procesui jautrias fosfolipidų polinesočiųjų riebalų rūgščių liekanas ir susidaro lipidų peroksidai, kurie patys yra reaktyvūs, ir prasideda grandininė laisvųjų radikalų susidarymo reakcija. Kaip galinis lipidų peroksidacijos produktas susidaro malondialdehidas (angl.- malondialdehyde (MDA)), pasiţymintis mutageniniu poveikiu bakterijoms ir ţinduolių ląstelėms bei karcinogeniniu poveikiu ţiurkėms [38]. Tyrimais su albinosinėmis ţiurkėmis nustatyta, jog kadmis didina lipidų peroksidaciją, tuo pačiu didindamas ir malondialdehido kiekį. Eksperimentas parodė, jog antioksidantinio fermento – superoksido dismutazės kiekis buvo ţymiai sumaţėjęs. Glutationo (GSH) kiekis taip pat buvo nustatytas maţesnis lyginant su kontroline grupe [39]. [24].

Daugiausiai kadmis sukelia toksinius efektus išeikvodamas glutationą ir jungdamasis prie baltymų -SH grupių [2]. Glutationas yra vienas veiksmingiausių ir reikšmingiausių antioksidantų, sintetinamas ţinduolių ląstelėse. Jo apsauginis poveikis grindţiamas sugebėjimu „pagauti“ radikalus [40].

Tiek oksidacinis stresas, tiek sukelta ląstelių apoptozė gali būti svarbi neurodegeneracinių ligų kaip Parkinsono, Alzheimerio, amiotrofinės lateralinės sklerozės, AIDS demensijos patogenezei [24, 34, 41]. Daugelio neurodegeneracinių ligų patogenezės pamatą sudaro įvairių smegenų sričių neuronų ţūtis. Eksperimentais in vitro nustatyta, jog dėl oksidacinio streso neuronuose maţėja cistino, glutationo kiekis, o tai lemia neuronų ţūtį, vykstant apoptozei būdingiems morfologiniams ir biocheminiams pokyčiams [24].

Pastaruoju metu nustatyta, jog laisvieji radikalai tiesiogiai ar netiesiogiai yra susiję su lėtinėmis uţdegiminėmis ligomis, sepsiniu šoku, ateroskleroze, plaučių emfizema, nervų sistemos ligomis, navikiniais procesais, senėjimu, katarakta, išemijos-perfuzijos sindromu [24].

2. 1. 2. Cinko jonų poveikis ląstelių metabolizmui

Cinkas, be kalio ir magnio, yra labiausiai paplitęs viduląstelinis metalo jonas. Tai vienas svarbiausių organizmo mikroelementų, atliekančių fermentinę, struktūrinę ir reguliacinę funkcijas daugiau kaip 300 metalofermentų. Kaip kofaktorius cinkas įeina į daugelio fermentų ir transkripcijos faktorių sudėtį, dalyvauja imuninėse reakcijose, prostaglandinų gamyboje, atsake į oksidacinį stresą, apoptozės ir senėjimo procese. Cinkas yra svarbus normaliam ląstelių augimui ir diferenciacijai, baltymų metabolizmui, ląstelės membranų vientisumui, genų raiškai, kolageno sintezei, imuninei sistemai bei apsaugai nuo apoptozės ląsteliniame lygmenyje [42, 43]. Cinkas svarbus daugeliui gyvybinių funkcijų, įskaitant augimą, apetito reguliavimą, virškinimą, baltymų sintezę, ţaizdų gijimą. Cinkas stimuliuoja prostatos darbą, svarbus vyrų vaisingumui [44]. Tai yra būtinas gyviesiems organizmams metalas, tačiau didesnės jo dozės gali tapti toksiškomis ir sukelti paţeidimus.

Cinkas – cheminės periodinės elementų lentelės II B grupės elementas, atomo numeris 30. Atominė masė – 65,41. Cinko oksidacijos laipsnis +2. Tai pilkas, melsvo atspalvio, minkštas, chemiškai aktyvus metalas. Jo paviršius ore visada apsitraukia plona, tankia plėvele. Nuodingasis cinko junginys yra fosfidas - Zn3P2, kuris plačiai vartojamas ţiurkėms ir pelėms

nuodyti [7].

Kraujo plazmoje cinko koncentracija sudaro apie 15 μM [45]. Patekęs į kraujo plazmą apie 85-90 proc. cinko jungiasi su kraujo plazmos baltymais: dalis su globulinais ir dalis su albuminais. Likusioji dalis, apie 10-15 proc. jungiasi su maţos molekulinės masės baltymais ir tik nedidelė viduląstelinio cinko dalis (0,1-1 nM) lieka neprisijungusi ir tampa biologiškai aktyvi [46, 47].

Vidutiniškai suaugusio ţmogaus organizme cinko yra apie 2-4 g. Apie 60 proc. viso organizmo cinko yra raumenyse, 20-30 proc. – kauluose, 8 proc. – odoje ir plaukuose, iki 6 proc. – kepenyse, 2 proc. – ţarnyne ir kasoje, 1,6 proc. – centrinėje nervų sistemoje, 0,8 proc. – inkstuose, kraujyje, 0,1 proc. bluţnyje bei kraujo plazmoje [42].

Ţinduolių organizmuose cinką perneša specialūs cinko pernašos baltymai: ZnT (angl.- solute-linked carrier 30 (SLC30)) ir Zip (angl.- Zrt- and Irt-like proteins, solute-linked carrier 39 (SLC39)) baltymų šeima. Ţmonių organizme cinko pernašos baltymai ţymimi SLC30A1 ir SLC39A1. Esminis šių dviejų šeimų skirtumas yra tas, jog ZnT šeimos baltymai maţina viduląstelinį cinko kiekį pernešdami cinką iš ląstelių, kai tuo tarpu Zip pernašos baltymai, veikdami priešingai nei ZnT, didina viduląstelinį cinko kiekį ląstelėse [50]. Taigi cinko homeostazė yra reguliuojamas procesas ir priklauso nuo organizmo aprūpinimo ir cinko kiekio kraujyje.

Cinkas palaiko organizmo homeostazę, uţtikrina tinkamą ląstelių dalijimąsi, augimą ir funkcionavimą, dalyvauja baltymų biosintezėje bei nukleorūgščių apykaitoje. Cinkas gali veikti ląstelių augimą tiesiogiai kaip struktūrinis ląstelės baltymų elementas ir dalyvaudamas DNR sintezės ir ląstelės augimo procese arba netiesiogiai, veikdamas augimo hormonų ir faktorių apykaitą [51]. Cinkas katalizuoja daugybę fermentinių reakcijų ir kaip kofaktorius yra ypatingai būtinas fermentams, kontroliuojantiems svarbius ląstelinius procesus kaip DNR sintezę, normalų ląstelės augimą, smegenų vystymąsi, elgseną, reprodukciją, membranų stabilumą, kaulų formavimąsi ir ţaizdų gijimą [42]. Šie fermentai yra nuo DNR priklausanti DNR polimerazė, nuo DNR priklausanti RNR polimerazė, peroksidazė, steroidinių hormonų receptorius, įvairios proteazės ir kiti [12].

Cinko jonai susiję su kitų metalo elementų apykaita. Pavyzdţiui, varis yra labai svarbus biogeninis mikroelementas, įeinantis į daugybės svarbių baltymų, kaip albuminų, Cu/Zn superoksido dismutazės ir metalotioneinų sudėtį [52, 53]. Nesusijungęs su baltymais, varis yra labai toksiškas, gali kauptis kepenyse. Padidėjęs viduląstelinis cinko kiekis daţniausiai išstumia varį bei sumaţina jo toksinius poveikius [51].

Optimalus cinko kiekis organizme pasiţymi apoptozę slopinančiu poveikiu, tuo tarpu didesnė ar maţesnė cinko jonų koncentracija skatina programuotą ląstelių mirtį [54, 55] kepenų ląstelėse, inkstuose, sėklidėse ir T bei B limfocituose [56].

Cinko homeostazės palaikyme svarbų vaidmenį atlieka kepenys. Normaliai kraujo plazmoje cinko yra tik 0,1 proc. viso jo kieko. Viduląstelinis cinko kiekis yra reguliuojamas specialiais cinką pernešančiais baltymais. Nustatyta, jog trūkstant organizme cinko, kepenyse ir kraujo plazmoje cinko jonų koncentracija maţėja [51]. Iš organizmo cinkas šalinamas per inkstus ir virškinamąjį traktą, su prakaitu [57]. Greičiausiai cinkas metabolizuojamas kepenyse. Dėl sumaţėjusio cinko kiekio organizme, gali pablogėti kepenų ląstelių funkcija bei jų regeneracija [58].

Didelės cinko jonų koncentracijos, patekusios į organizmą, indukuoja baltymo metalotioneino sintezę (ţiūrėti 2. 3. skyrių). Iš kitos pusės, MT tiekia cinko jonus iš vienos ląstelės dalies į kitą (2 pav.).

2 pav. Metalotioneinų/ tioneinų funkcija ląstelėje palaikant cinko homeostazę.

Kai cinkas patenka į ląstelę, jis gali būti paimtas tioneinų (kurie tampa metalotioneinais) ir tiekiamas į kitą ląstelės dalį, kur gali būti atpalaiduojamas kitoms metalą turinčioms molekulėms, pavyzdţiui fermentams, antioksidantiniams faktoriams, Zn-pirštų baltymams ir transkripcijos faktoriams. Tokiu būdu tioneinai-metalotioneinai tampa pagrindiniu komponentu cinko signaline sistema ląstelėje. Ši sistema ypač svarbi smegenyse, taip pat reguliuojant vėţį slopinantį baltymą p53 [59].

Cinkas ir genų raiška. Cinko jonai dalyvauja genetinės informacijos realizavime, palaiko biomembranų ir chromatino sudėtį, dalyvauja signalinių molekulių – peptidinių hormonų – sintezėje. Literatūros duomenys nurodo, jog ląstelių branduolyje yra susikaupę apie 50 proc. viduląstelinio cinko [60]. Jis įeina ne tik į chromatino sudėtį, bet veikia įvairius transkripcijos faktorius, DNR ir RNR polimerazes, dalyvauja DNR replikacijoje ir RNR transkripcijoje, taip pat dalyvauja DNR atnaujinimo procese ir apoptozėje. Apie tai, jog cinkas įeina į chromatino sudėtį patvirtina atlikti eksperimentai su ţiurkių kepenimis in vivo ir in vitro [42].

Dėl savo fiziko-cheminių savybių, cinkas įeina į daugelio baltymų sudėtį, yra būtinas tinkamam metaloproteinų funkcionavimui [60]. Cinkas yra itin svarbus elementas baltymų biosintezės procesui, kadangi įeina į transkripcijos faktorių, kurie specifiškai jungiasi prie DNR ir reguliuoja transkripcijos procesą, „cinko pirštelių“ sudėtį. „Cinko piršteliai“ yra plačiai paplitęs universalus DNR prijungiantis baltymų motyvas. Klasikinės struktūros cinko piršteliai yra Cys2His2 motyvo (3 pav.).

Cys2His2 transkripcijos faktorių motyvas yra sudarytas iš 30 aminorūgščių sekos, turinčios 2 histidino (His) bei 2 cisteino (Cys) aminorūgštis (kitais atvejais 4 Cys aminorūgštys) ir hidrofobines liekanas. Visas domenas yra stabilizuojamas cinko jonų. Kai kuriuose cinko piršteliuose cinko jono prijungimui reikalinga trys Cys ir vienas His. Transkripcijos faktorių domenai yra tos pačios struktūros, tačiau skirtingų hidrofobinių liekanų, kurios sąlygoja jų įvairovę ir specifiškumą jungtis prie DNR [61].

3 pav. Klasikinės struktūros cinko pirštelių motyvas [73].

Pats cinkas su DNR nesąveikauja, tačiau jis stabilizuoja cinko pirštelių struktūrinį motyvą. Šis motyvas sudaro 3 proc. ţmogaus genomo sudėties ir daţniausiai įeina į TF sudėtį, todėl ir jų atliekamos funkcijos ląstelėse labai įvairios. Jie dalyvauja DNR atpaţinime, transkripcijos aktyvinime, apoptozės reguliavime, baltymų susilankstyme ir surinkime, lipidų prijungime [62]. Cinko piršteliai gali sąveikauti su nukleorūgštimis ir baltymais, sudarydami baltymas-baltymas sąveikas.

Yra ţinoma, jog cinko indukuojamų TF randama ne tik ţinduolių ir ţuvų organizmuose, bet taip pat grybuose ir augaluose, todėl galima teigti, jog genų raiškos reguliavimas yra visapusiškai svarbus. Ligi šiol yra ţinomi ir išskirti du cinko indukuojami transkripcijos faktoriai, reguliuojantys genų raišką. Tai iš S. cerevisiae išskirtas transkripcijos faktorius Zap1 ir ţinduolių metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys – 1(MTF-1) (angl.- metal transcriptional factor (MTF)), kurių aktyvumas reguliuojamas cinko jonais [63]. MTF-1 yra konservatyvus baltymas, kuris jungiasi prie metalui jautraus elemento – MRE (angl.- metal response elements). MTF-1 pirmiausia buvo atrastas kaip nuo cinko priklausomas MRE jungiantis veiksnys. Šis transkripcijos veiksnys reguliuoja 1 ir metalotioneino-2 bei ZnT-1 (plazminėje membranoje esantis Zn nešiklis) genų raišką [64]. Nustatyta, kad MTF-1 gebėjimas jungtis prie DNR priklauso nuo cinko pirštelių domeno [61]

Baltymo p53 aktyvumas priklauso nuo cinko atomo buvimo jame. Genas p53 koduoja 53-kDa branduolio fosfoproteiną, kuris jungiasi prie DNR ir veikia kaip transkripcijos veiksnys, kontroliuojantis ląstelės proliferacijos ir DNR reparacijos procesus. Nustatyta, jog trūkstant

cinko baltymas p53 negali jungtis prie DNR bei reguliuoti specifinių baltymų transkripcijos [65].

Cinko antioksidacinis poveikis. Cinkas biologinėse sistemose veikia kaip elektronų poros akceptorius ir pasiţymi svarbiomis antioksidantinėmis savybėmis [66]. Viena svarbiausiųjų antioksidacinių cinko savybių yra ta, jog cinkas geba apsaugoti baltymų -SH grupes nuo laisvųjų radikalų poveikio. Ilgalaikė cinko apsauga yra susijusi su metalotioneinų sinteze ir antioksidacinio fermento Cu/Zn superoksido dismutazės stabilizavimu [67].

Cinko jonai stabilizuoja membranų struktūrą, skatina ląstelių proliferaciją, saugo nuo apoptozės, slopina plazminės membranos fermentą NADPH oksidazę, katalizuojančią superoksido anijono susidarymą iš molekulinio deguonies, bei saugo nuo vitamino E trūkumo [51, 68]. Literatūros duomenys nurodo, jog papildomas cinko kiekis organizme gali apsaugoti kepenų ląsteles nuo ţalingo oksidacinio poveikio. Neseniai atliktais tyrimais nustatyta, jog cinkas sveikų ţmonių organizme maţina laisvųjų radikalų kiekį, atsiradusį oksiduojantis lipidams [67]. Taip pat nustatyta, kad cinko nepakankamumas sukelia vandenilio peroksido ištekėjimą iš NADPH − priklausomos citochromo P-450 fermentų sistemos, joje padidėja deguonies radikalų ir, esant labai stipriam cinko jonų nepakankamumui, citotochromo P-450 sistema mikrosomose paţeidţiama laisvųjų radikalų formavimosi mechanizmo; vyksta DNR fragmentacija [12].

Epidemiologiniai tyrimų duomenys rodo, jog cinko nepakankamumas gali būti susijęs su vėţio išsivystimu [69]. Cinko apsauginis vaidmuo gali būti ypatingai svarbus tiek atsirandant vėţiui, tiek jam progresuojant. Kadangi cinko jonai yra svarbūs funkciniam ir struktūriniam transkripcijos faktorių vientisumui, atsakui į oksidacinį stresą, DNR atsinaujinimo mechanizmui, dėl cinko nepakankamumo gali atsirasti DNR modifikacijos ir vystytis vėţys [70]. Taip pat vėţio vystymasis gali būti susijęs su imuniteto susilpnėjimu, ligų išsivystymu bei uţsitęsusiom uţdegiminėm reakcijom, dėl kurių padidėja laisvųjų radikalų kiekis, sukeliamas oksidacinis stresas, atsiranda DNR paţaidos, chromosomų mutacijos ir galiausiai vystosi vėţys [71]. Tikėtina, jog cinkas apsaugo nuo vėţio vystymosi maţindamas oksidacinį stresą ir gerindamas imuninės sistemos funkcijas, nors moksliniais eksperimentais dar neįrodytos cinko jonų antivėţinės savybės [69].

Cinkas ir imuninė sistema. Cinkas yra būtinas normaliam imuninės sistemos funkcionavimui. Uţ ląstelinį imuninį atsaką atsakingi T-limfocitai čiobrialiaukėje (angl.- thymus) tikslingai „ugdomi“ dalyvaujant hormonui timulinui (angl.- thymulin). Šis procesas vadinamas T ląstelių diferencijacija ir yra priklausomas nuo cinko. Nustatyta, kad tik cinko – timulino kompleksas yra fiziologiškai aktyvus. Todėl esant cinko nepakankamumui, sumaţėja T-„padėjėjų“ (angl.- T helper cells), T-„ţudikių“ (angl.- T-killer cells) ir natūralių ląstelių

ţudikių (NK) (angl.- natural killer) aktyvumas bei T-limfocitų proliferacija. Trūkstant cinko maţėja ir citokino interleukino-2 sekrecija iš T-limfocitų. Interleukinas- 2 per specialiuosius receptorius skatina T-ląstelių augimą ir aktyvina B-limfocitus bei natūraliąsias ląsteles ţudikes [73].

Imunologiniai parametrai esant cinko trūkumui:  Gleivinės atrofija ir epitelio paţaida;

 Timulino ir aktyvių cinko-timulino kompleksų koncentracijos sumaţėjimas;

 Sutrikusi T ląstelių diferenciacija; T-„padėjėjų“, T-„ţudikių“ ir kitų ląstelių ţudikių skaičiaus ir aktyvumo maţėjimas;

 Sumaţėjes granuliocitų fagocitozės aktyvumo sumaţėjimas;  Sumaţėjusi antikūnių ir interliaukino- 2 biosintezė;

Netgi neţymus cinko trūkumas ţmonių organizme pasiţymi imunitetą slopinančių poveikiu. Tyrimuose in vivo, cinko nepakankamamumas slopino NK aktyvumą, maţino granuliocitų skaičių ir makrofagų gebėjimą fagocituoti. NK ląstelės dalyvauja ankstyvoje organizmo apsaugoje nuo virusų ir navikinių ląstelių. NK ląstelių skaičius yra priklausomas nuo cinko koncentracijos kraujo plazmoje. Esant nepakankamam cinko jonų kiekiui, maţėja NK ląstelių aktyvumas [45].

2. 2. Bendrieji transliacijos proceso principai

Baltymo biosintezė yra sudėtingas procesas, susidedantis iš trijų pagrindinių etapų- iniciacijos, elongacijos ir terminacijos. Skirtingai nei DNR ir RNR biosintezė, baltymo sintezei būdingi dar du papildomi etapai – sintezės pirmtakų (aminorūgščių) aktyvinimas ir posintetinis polimero brendimas, lemiantis baltymo, kaip genų raiškos produkto, savybes ir funkcijas [74].

Baltymo biosintezės procesas vadinamas transliacija (angl. translation – vertimas), kadangi mRNR nukleotidų sekos „kalba“ yra transliuojama į 20 aminorūgščių sekos „kalbą“ baltymo molekulėje. Transliacijos proceso metu informacija, uţkoduota genetiniame kode, yra paverčiama į tam tikra aminorūgščių seką. Bet koks pokytis nukleorūgščių sekoje gali sąlygoti klaidingos aminorūgšties įterpimą į sintetinamą baltymo grandinę, nulemdamas ligų atsiradimą ar netgi organizmo ţūtį [75].

Baltymo biosintezės metu svarbiausios funkcijos tenka ribosomoms, pernašos (tRNR) ir aminoacil-tRNR-sintetazėms (ARSazėms) [74].

2. 2. 1. Ribosomos

Baltymų biosintezė vyksta ant didelių makromolekulinių kompleksų – ribosomų, sudarytų iš nevienodo dydţio subvienetų. Eukariotų ribosoma sudaryta iš 40S ir 60S subvienetų (S-sedimentacijs konstanta (Svedbergas), parodanti dalelės nusėdimo greitį ultracentrifuguojant). Į didţiojo subvieneto sudėtį įeina trys rRNR (5S rRNR, 5,8S rRNR ir 28S rRNR) ir apie 50 baltymų. Maţajame subvienete yra 8S rRNR ir apie 30 baltymų. Bakterijų ribosoma sudaryta iš 30S ir 50S subvienetų, kurie atitinkamai turi 16S rRNR ir apie 21 baltymą bei 5S rRNR, 23S rRNR ir apie 31 baltymą [75, 76].

Abiem subvienetams susiglaudus lieka plyšys, į kurį patenka informacinė RNR (mRNR). Didysis subvienetas katalizuoja peptidinės grandinės iš aminorūgščių formavimąsi, o maţasis subvienetas jungiasi prie mRNR ir yra atsakingas uţ tikslią mRNR kodono ir tRNR antikodono sąveiką [75]. Apytiksliai kiekviena ribosoma sudaryta iš trečdalio baltymų ir dviejų trečdalių rRNR [78]. Susisukusios į kompaktiškas tretinės struktūros molekules, ribosominės RNR suformuoja ribosomos šerdį ir lemia jos formą. rRNR molekulės paviršiuje esančius plyšius ir angas uţpildo ribosominiai baltymai, kurių pagrindinė funkcija yra stabilizuoti šerdies rRNR ir leisti kisti jos konformacijai baltymų biosintezės metu [77]. Ribosomų struktūrai palaikyti labai svarbūs Mg2+ jonai. Maţinant jų koncentraciją, ribosomos subvienetai atsiskiria ir gali savaime disocijuoti ir suskilti į rRNR. Daugybė ribosomų vienu metu gali transliuoti vieną ir tą pačią mRNR, sudarydamos poliribosomas [79]. Eukariotinės ląstelės turi unikalią savybę tuo pačiu metu skirtingose ląstelės vietose vykdyti baltymų biosintezę: mRNR, koduojanti citoplazminius baltymus, transliacijos procesą vykdo ant laisvų ribosomų, kai tuo tarpu kita mRNR biosintetina integralinės membranos ir sekrecinius baltymus ant endoplazminio tinklo (ET) ribosomų [80].

2. 2. 2. Pernašos RNR

Pernašos RNR perneša aminorūgštį į ribosomą ir baltymo sintezėje dalyvauja kaip adaptorius tarp aminorūgšties ir mRNR, nukleorūgščių kalbą transliuojantis į baltymo aminorūgščių kalbą. tRNR rūšių yra tiek, jog pakanka atpaţinti visoms aminorūgštims. Būtinos maţiausiai 32 tRNR, kad būtų atpaţinti visi aminorūgštis koduojantys mRNR kodonai (tam tikros tRNR gali atpaţint daugiau kaip vieną kodoną). Nustatyta, jog tRNR molekulės sudarytos iš vienos RNR grandinės, kurios antrinė struktūra susidaro dėl vandenilinių ryšių tarp komplementariųjų bazių ir panaši į dobilo lapo formą (5 pav.), o tretinė struktūra – į apverstą raidę „L“ (6 pav.) [79].

Antrinė tRNR molekulės struktūra turi tris kilpas (angl.- loop). Viena – timidino-pseudouridilo (T C) kilpa- dalyvauja aminoacil-tRNR susijungiant su ribosoma. Antroji – D kilpa dalyvauja aminoacil-tRNR sintetazei atpaţįstant tRNR. Trečiojoje – antikodono kilpoje yra antikodono zona, kurią sudaro septyni nukleotidai: kintamasis nukleotidas, modifikuotas purinas, antikodono tripletas (X, Y, Z) ir du pirimidinai. Ši zona atpaţįsta tripletinį kodoną, esantį mRNR. Pagrindinę adaptoriaus funkciją tRNR atlieka du stiebai: akceptorinis stiebas – prie jo 3‟ esančios sekos CCA adenozino 2‟-arba 3‟- OH esteriniu ryšiu jungiasi specifinės

aminorūgšties karboksi grupė. Antrasis – antikodono stiebas, uţsibaigiantis antikodono kilpa ir antikodonu [74, 79].

5 pav. Tipinės „dobilo lapo“ tRNR antrinė struktūra [81].

2. 2. 3. Aminoacil tRNR sintetazės

Tai fermentų grupė, kuri yra būtina aktyvinant aminorūgštis ir jas prijungiant prie atitinkamos tRNR. Kiekvienas šios grupės narys yra specifinis tam tikrai aminorūgščiai ir ją atitinkančiai vienai ar kelioms tRNR (viena aminorūgštis gali atitikti dvi ar daugiau tRNR) ir katalizuoja jų susijungimą. Aminoacil-tRNR sintetazės realizuoja genetinį kodą, kadangi veikia kaip molekulinis „ţodynas“, atpaţįstantis tRNR antikodono tripletą ir dvidešimt skirtingų aminorūgščių [75].

Visos ARSazės katalizuoja tRNR aminoacilinimo reakciją, tačiau skiriasi savo struktūriniais parametrais: subvienetų kiekiu, dydţiu ir jų pirmine struktūra, išskyrus trumpas konservatyvias sekas. ARSazių molekulės gali būti sudarytos iš vieno subvieneto ( tipo struktūra), dviejų vienodų subvienetų ( 2 tipo struktūra), keturių vienodų subvienetų ( 4 tipo

struktūra) ir dviejų skirtingų porinių subvienetų ( 2 2 tipo struktūra). Šių baltymų molekulinė

masė svyruoja nuo 37 kDa iki 108 kDa. ARSazės tarpusavyje arba su kitais baltymus sintezuojančios sistemos komponentais ar ląstelės struktūromis jungiasi į didelės molekulinės masės kompleksus, todėl kompleksų molekulinė masė labai didelė [83].

Remiantis struktūra ir reakcijos mechanizmu, aminoacil-tRNR sintetazės yra skirstomos į dvi klases. I klasės fermentai sudaryti iš vienos polipeptidinės grandinės, kiti- iš dviejų ar keturių. I klasės aminoacil-tRNR sintetazės pradţioje aminorūgštį prijungia prie tRNR galinio adenilato ribozės 2/ hidroksigrupės, vėliau aminorūgštis perkeliama ant 3/-OH. II klasės fermentai aminorūgštį prijungia prie OH. Baltymų biosintezės substratas yra tiktai 3/-aminoacil-tRNR [79]

Aminoacil-tRNR specifiškumas buvo ištirtas nagrinėjant Ile-tRNRIle sintetazę, kuri atskiria valiną ir leuciną, besiskiriančius viena metileno (-CH2-) grupe. Ileu-tRNRIle

sintetazė prijungia Ile prie tRNRIle 200 kartų specifiškiau, nei Val prie tRNRIle. Metileno grupės buvimas padidina Ile prisijungimą prie fermento. Tačiau valino įsijungimo polipeptidinėje grandinėje daţnis vietoje Ile yra 1 su 3000. Ile-tRNR sintetazė turi klaidų taisymo funkciją. Fermentas atrenka specifinį substratą dviem etapais. Pirmame fermentas aktyviame centre specifiškai prisijungia aminorūgštį ir ją aktyvuoja susidarant aminoaciladenilatui. Antrame etape, jeigu susidaro neteisingas valiladenilatas, tai jis patenka į skirtingą fermento aktyvų centrą, kuriame valiladenilatas hidrolizuojamas. Izoleuciladenilatas yra didesnis nei valiladenilatas ir negali susirišti su šiuo hidrolizės centru. Taigi valil-AMP hidrolizuojama į valiną ir AMP klaidų taisymo centre, todėl surišta su fermentu tRNRIle nėra aminoacilinama neteisinga aminorūgštimi [84].

Dauguma aminoacil-tRNR sintetazių hidrolizuoja esterinį ryšį tarp aminorūgšties ir tRNR. Ši hidrolizė pagreitėja, kai prisijungiama ne ta aminorūgštis ir tuo pačiu sumaţina klaidų skaičių. Klaidų skaičius (~1 klaida 104 įjungtų į baltymą aminorūgščių kiekiui) sintetinant baltymus yra maţesnis negu DNR biosintezės metu [77].

Aminoacil-tRNR sintetazės turi būti specifiška ne tiktai aminorūgščiai, bet ir atitinkamai tRNR. tRNR apie 20 proc. nukleotidų yra konservatyvūs visom tRNR, todėl jie negali būti atpaţinimo taškai aminoacil-tRNR sintetazei. Fermentas ir tRNR sąveikauja nukleotidais, kurie išsidėsto antikodoninėje kilpoje (taip pat ir į antikodono sudėtį įeinantys nukleotidai), aminorūgštį surišančioje srityje ir kitose molekulės vietose. 10 ar daugiau nukleotidų dalyvauja specifinės aminoacil-tRNR sintetazės atpaţinime [75, 76].

ARSazės atlieka labai svarbų vaidmenį baltymų biosintezėje. Manoma, kad jų aktyvumą reguliuoja viduląsteliniai faktoriai. Pavyzdţiui, tokiu faktoriumi gali būti tRNR-nukleotidiltransferazė, kuri atstato tRNR molekulės akceptorinį galą, tuo pačiu stimuliuodama aminoacilinimą. ARSazėms būdinga sudaryti kompleksus su poliribosomomis. Tai svarbu fermentų aktyvavimui ir baltymų biosintezės intensyvumo padidėjimui. Tai ypač būdinga eukariotų organizmams, pasiţymintiems sudėtingesniu baltymų biosintezės aparato organizavimu ir funkcinėmis sąveikomis tarp atskirų šio aparato komponentų [83].

Yra duomenų, rodančių, kad ARSazių stabilumui gali būti svarbūs dvivalenčių metalų jonai, tačiau apie galima sunkiųjų metalų jonų poveikį šiems fermentams ţinoma nedaug [83]. Zn2+ veikia kaip pirmos klasės aminoacil-tRNR sintetazių kofaktorius [85].

2. 2. 4. Baltymų biosintezės mechanizmas

Aminorūgščių aktyvinimas. Aminoacil-tRNR sintetazės katalizuoja aminorūgščių aktyvinimą dviem stadijom [79]:

ARSazė + aminorūgštis + ATP <---> ARSazė-(aminorūgštis-AMP) + PPi ARSazė-(aminorūgštis-AMP) + tRNR <---> aminorūgštis-tRNR+ ARSazė + AMP --- Aminorūgštis + ATP + tRNR <---> aminorūgštis-tRNR + AMP + PPi

Kiekviena aminoacil-tRNR sintetazės molekulė turi tris prijungimo centrus: aminorūgšties, tRNR ir ATP. Fermento aktyviajame centre yra histidinas, dėka savo imidazolo ţiedo prijungiantis ATP, dalyvaujant Mg2+

[1]. Pirmoje stadijoje, ATP reaguoja su aminorūgštimi ir susidaro aminoaciladenilatas, kuris lieka susirišęs su fermento aktyviuoju centru. Aminorūgšties karboksigrupės reaguoja su ATP a-fosforilo grupe ir susidaro

anhidritinis didţiaenergis ryšys. Antrame etape aminoacilo grupė yra pernešama nuo aminoaciladenilato ant atitinkamos specifinės tRNR. Ryšio tarp aminorūgšties ir tRNR hidrolizės energija lygi DG0/ = -29kJ/mol. Ši energija panaudojama peptidinio ryšio susidarymui. Reakcijos metu susidaręs pirofosfatas (PPi) yra hidrolizuojamas neorganinės pirofosfatazės ir reakcijos pusiausvyra pastumta į produkto susidarymo pusę [1, 43].

Aminoacilinant tRNR, išsprendţiami du uţdaviniai [79]:

1. Aktyvuojama aminorūgštis ir energija panaudojama peptidinio ryšio susidarymui;

2. Prie adaptorinės tRNR prijungiama aminorūgštis ir uţtikrinama teisinga aminorūgšties vieta augančioje polipeptidinėje grandinėje. Aminorūgšties prijungimo tikslumas nėra tikrinamas ribosomoje, todėl teisingas aminorūgšties prijungimas prie tRNR būtina sąlyga baltymų sintezės tikslumui.

Iniciacija. Eukariotinių ląstelių iniciacijos stadija yra sudėtingas procesas, kuriame dalyvauja maţiausiai devyni iniciacijos faktoriai, sutrumpintai ţymimi eIF, ribosomos subvienetai 40S ir 60S bei transliacijos iniciatorius met-tRNR, kurie uţtikrina tinkamą baltymų biosintezės procesą [86]. Iniciacijos faktorius eIF2 jungiasi su GTP, iniciuojančia aminoacil-tRNR ir dalyvaujant papildomiems iniciacijos faktoriams susidaręs kompleksas keliauja prie maţojo 40S ribosomos subvieneto [76]. Šis kompleksas skanuoja mRNR 5„→3„ kryptimi, kol pasiekiamas iniciacijos kodonas AUG, signalizuojantis apie transliacijos pradţią. Eukariotų ląstelėse polipeptido sintezė ant ribosomų daţniausiai prasideda nuo metionino (rečiau nuo formilinto metionino), kadangi specifinė iniciacijos tRNR, kurią atpaţįsta (5‟) AUG mRNR kodonas, yra Met-tRNRmet [77, 79]. Taigi Met-tRNRmet yra vienintelė inicijuojanti aminoacil-tRNR, kuri, dalyvaujant eIF2-GTP, sąveikauja su P-sritimi, prisijungiant 60S ribosomos subvienetui ir susidarant 80S iniciacijos kompleksui. Susiformavus 80S iniciacijos kompleksui, GTP yra hidrolizuojama ir atsipalaiduoja eIF2-GDP kompleksas. 80S iniciacijos kompleksas uţtikrina polipeptidinės grandinės augimą [75, 76].

Ant mitochondrijų ir chloroplastų polipeptido sintezė prasideda nuo formilinto metionino-N-formilmetionino [79].

Skirtingai nei prokariotų, eukariotų mRNR gale nėra Šeino-Delgarnos sekos, nurodančios polipeptido sintezės pradţią. 5‟ galas netransliuojamas tol, kol pasiekiamas pirmasis AUG iniciacijos kodonas [74].

Elongacijos etapas, kurio metu susidaro peptidinė jungtis, skirstomas į tris dalis: kitos aminoacil-tRNR prisijungimas prie 80S komplekso, peptidinio ryšio susidarymas ir translokacija [74].

Met-tRNRmet prisijungus prie P-srities, esančios mRNR 5‟ gale, A-sritis lieka laisva. Į šį centrą ateina antroji- atitinkanti mRNR kodoną- aminoacil-tRNR, sudariusi kompleksą su GTP ir elongacojos faktoriumi eEF-1 [75, 76]. Prisijungus aminoacil-tRNR- EF-1 - GTP prie A-srities, vyksta GTP hidrolizė, kurios metu atsipalaiduoja eEF-1 -GDP kompleksas. Peptidinis ryšys susidaro tarp prie savo tRNR prisijungusios (Asrityje) aminorūgšties -aminogrupės ir tarp prie savo tRNR prisijungusios (P-srityje) aminorūgšties karboksigrupės [79]. Peptidinio ryšio susidarymą katalizuoja peptidiltransferazė. Reakcijos produktas dipeptidil-tRNR, kuri judant ribosomai išilgai mRNR galiausiai iš A-srities per tris nukleotidus pasislenka į P-sritį. Eukariotų ribosomos neturi E-srities, todėl, laisva (deacilinta) tRNR pasišalina tiesiai iš P-srities. Šis pasislinkimo procesas vyksta dalyvaujant eEF-2 bei GTP hidrolizuojantis į GDP ir vadinamas translokacija [75, 76]. Dėka translokacijos kita aminoacil-tRNR gali jungtis A-srityje [76]. Eukariotinės ląstelės turi tuneliuojamąjį tRNR ciklą, kai tRNR tiesiogiai perduodami nuo aminoacil-tRNR sintetazių elongacijos faktoriui eEF-1 , nuo jo-ribosomai, o nuo ribosomos- vėl atgal aminoacil-tRNR sintetazėms [79]. Terminacijos proceso metu polipeptidinės grandinės sintezė nutraukiama, kai A-srityje atsiranda vienas iš terminacijo kodonų UAA, UAG ar UGA, nekoduojančių nei vienos aminorūgšties [77]. Šiem kodonams atpaţinti, reikalingi terminacijo faktoriai (angl.-release factors). Prokariotai turi tris terminacijos fartorius (RF1, RF2, RF3), tuo tarpu eukariotai turi tik vieną terminacijo faktorių- eRF, atpaţįstantį visus terminacijos kodonus [74]. Veikiant eRF, aktyvinama peptidiltransferazė, kuri hidrolizuoja peptidil-tRNR esterinę jungtį ir nuo ribosomos atskyla susintetintas polipeptidas. Ribosoma suskyla į subvienetus [75].

Baltymo biosintezei reikalinga energija. Kiekvienai aminoacil-tRNR sudaryti sunaudojamos dvi didţiaenerginės fosfatinės grupės. Viena GTP skyla į GDP ir Pi per pirmąjį elongacijos etapą, kita GTP sunaudojama translokacijos metu [77, 79].

Naujai susintetinta polipeptido grandinė, išėjusi iš ribosomos įgauna atitinkamą antrinę ar tretinę erdvinę struktūrą ir biologiškai aktyvią formą. Dauguma naujai susintetintų junginių yra modifikuojami (posttransliacinės modifikacijos), pašalinant signalines polipeptidinės grandinės sekas, modifikuojant aminorūgštis ar polipeptido N ir C galus, kovalentinėmis jungtimis sujungiant su kitomis cheminėmis grupėmis, susidarant disulfidiniams ryšiams [79]. Baltymo transliacijos etapai pavaizduoti 7 pav.

Kadmio jonai labai paţeidţia aminoacil-tRNR sintetazių funkcinį aktyvumą bei aminoacil-tRNR gebėjimą prisijungti prie ribosomų [87]. Todėl baltymų biosintezės procesas gali būti viena jautriausių kadmio poveikiui gyvosios ląstelės sistemų

2. 3. Metalotioneinai

Dėl evoliucijos gyvieji organizmai prisitaikė prie nepalankių sąlygų ir išmoko susidoroti su daugybe stresinių situacijų. Vienas paprasčiausių ląstelės apsaugos mechanizmų yra metalotioneinų (MT) indukcija sunkiaisiais metalais: kadmiu, cinku, variu.

Metalotioneinai pradėti tirti daugiau kaip prieš 40 metų. Pirmiausia jie buvo atrasti arklių inkstų ţieviniame sluoksnyje kaip kadmį jungiantys baltymai. Metalotioneinai yra daug cisteino (30 proc.) turintys [13], maţos molekulinės masės (6000−7000 Da pagal aminorūgščių sudėtį ir 15000 pagal gelchromatografiją), metalus surišantys baltymai [88]. Tai ilgos, viengrandės, daţniausiai atsitiktinės struktūros molekulės, neturinčios fermentinio aktyumo. Metalotioneinai turi santykinai daug serino ir glicino, tačiau neturi aromatinių aminorūgščių ir histidino. Dėl cisteino grupių liekanų molekulėje, Cys-X-Cys, Cys-XX-Cys, Cys-XXX-Cys (X= bet kuri aminorūgštis, išskyrus cisteiną), MT gali jungtis su Cd, Hg, Zn, Cu, Ag ir kt. sunkiaisiais metalais, tačiau labiausiai yra giminingi ir gerai jungiasi su variu, cinku ir kadmiu (Cd, Hg ir Zn atveju MT suriša iki 7, Cu atveju 12, o Ag atveju 18 atomų) [12, 13].

8 pav. Schematinis metalotioneinų vaizdas [13].

Ţinduolių metalotioneinai sudaryti iš daugiau kaip 60 aminorūgščių, kurių 23-33 molio proc. sudaro sulfanido (merkapto) grupes turintis cisteinas. BMR spektroskopija nustatyta, jog ţinduolių metalotioneinai turi du metalus surišančius centrus – klasterį ir klasterį . Keturi metalai su metalotioneinų karboksiliniame gale esančių klasteriu jungiasi šešiomis galinėmis aminorūgšties cisteino –SH grupėmis ir penkiais disulfidiniais tilteliais. Trys metalai su metalotioneinų grandinės NH2 gale esančiu klasteriu taip pat paprastai jungiasi

šešiomis galinėmis aminorūgšties cisteino sulfanido grupėmis, bet trimis disulfidiniais tilteliais. Šių klasterių giminingumas įvairiems metalų jonams yra selektyvus ir skirtingas;

klasteriai suriša metalus nepriklausomai vienas nuo kito. Pavyzdţiui, metalų surišimas klasteryje maţėja tokia tvarka Cu>Zn>Cd, o klasteryje – Cd>Zn>Cu. Manoma, kad įprastomis sąlygomis MT dalyvauja reguliuojant Cu ir Zn kiekį viduje ląstelių, kadangi šie metalai yra daugelio metabolinių fermentų sudedamosios dalys (kofaktoriai). Zn metabolizme MT gali būti kaip jo kaupimo ir saugojimo (depo) baltymai, pavyzdţiui, vykstant baltymų sintezei pateikti Zn ten, kur jo reikia [12, 20].

Nustatytos keturios MT izoformos, ţymimos MT-1, MT- 2, MT-3, MT-4, iš kurių svarbesnės yra MT-1 ir MT-2, randamos daugelyje ţinduolių audinių. Nors šias dvi izoformas galima atskirti anijonų chromatografijos būdu, tačiau tarpusavyje jos beveik nesiskiria ir turi labai menkus skirtumus aminorūgščių sekoje. Kitos dvi izoformos paprastai randamos tik tam tikrose, specializuotose ląstelėse, pavyzdţiui MT-3 randamas tik neuronuose, o epiteliniame sluoksnyje aptinkama MT-4 [12, 20]. MT-3 taip pat yra ţinomas kaip nervinių ląstelių augimą slopinantis faktorius (GIF) (angl.- neuronal growth inhibitory factor) [89]. Nuo kitų izoformų MT-4 skiriasi apytiksliai 24-27 aminorūgščių liekanom, o MT-3 turi papildomus aminorūgščių intarpus, tokius kaip vieną treoniną N-galinėje sekoje ir šešias liekanas C-galinėje sekoje [13]. Šios aminorūgštys, kurios skiriasi nuo kitų izoformų, yra neesminės metalų surišimo funkcijai. Šių skirtingų MT izoformų (MT-1 ir MT-2) santykis kinta organizmuose priklausomai nuo rūšies, audinio, fiziologinės būsenos ir metalų poveikio. [13, 88].

MT randama daugelyje audinių, tokių kaip kepenys, inkstai, kasa, širdis, placenta, raumenys, smegenys, ţarnynas, skrandis, bluţnis, plaučiai, uţkrūčio ir lytinės liaukos [90]. Subrendusių gyvūnų kepenyse, kasoje, ţarnyne ir inkstuose nustatoma didelė MT koncentracija dėl cinko ar kadmio buvimo. MT raiška daţnai koreliuoja su cinko pasiskirstymu audiniuose.

MT lygis skiriasi tarp įvairių organizmų rūšių ir net tarp tos pačios rūšies individų skirtingų organų ir audinių. Netgi audiniuose su ţymia MT raiška, jų pasiskirstymas skirtingų tipų ląstelėse gali būti ganėtinai heterogeninis. Pavyzdţiui, kepenyse MT yra randami hepatocituose, bet ne fibroblastuose ar Kupferio ląstelėse. Šią MT lygio įvairovę lemia daugelis faktorių, tokių kaip amţius, vystymosi stadija, maistas ir daugelis kitų neištirtų veiksnių [91].

MT kiekis organuose skiriasi kartu su rūšimi. Pavyzdţiui, MT lygis buvo nustatytas skirtingų rūšių kepenyse: šuo, katė ir oţka – 500-700 g MT/g kepenų; kiaulė ir ţmogus – 350-500 g MT/g kepenų, ţiurkėnas, ţiurkė, triušis ir Gvinėjos kiaulė – 5-25 g MT/g kepenų. Pelių MT lygis yra panašus su tų grauţikų MT lygiu, kurių ribos yra 5-10 g MT/g kepenų esant normaliom sąlygom. Šie duomenys parodo, kad daţniausiai naudojamos

laboratorinės grauţikų rūšys (ţiurkės, pelės, ţiurkėnai), nėra tinkami modeliai apibūdinant funkcinį MT vaidmenį ţmonėse dėl ryškių pagrindinės MT raiškos skirtumų [91].

MT jungiasi su metalais ir dalyvauja jų homeostazėje (Zn2+ ir Cu2+) ar detoksikacijos (Cd2+ ir Hg2+) procese. MT taip pat dalyvauja kituose ląsteliniuose procesuose, saugo ląsteles nuo ţalojančio oksidacinio poveikio ir radiacijos, turi įtakos ląstelių proliferacijai ir apoptozei [20]. Nors metalotioneinų veikimo mechanizmas ir poveikis iki galo neaiškus, tačiau nustatyta, jog MT veikia kaip neigiamas apoptozės reguliatorius [92]. MT funkcijos [90]: 1. Neutralizuoja ROS, slopina uţdegiminius citokinus, makrofagus ir T-limfocitus, slopina apoptozę (įskaitant citochromo c atpalaidavimą, p53 lygį, kaspazės aktyvumą)

2. Papildo CNS priešuţdegiminius ir neuro-apsauginius parametrus, didina apoptozę slopinančių genų ir augimo/mitybos faktorių kiekį, skatina funkcinį pasveikimą.

3. Kontroliuoja ir reguliuoja toksinius ir būtinus metalus, dalyvauja jų homeostazėje ar detoksikacijoje.

MT-1 ir MT-2 izoformų sintezė skatinama įvairiomis streso sąlygomis ir gali indukuoti daugelis veiksnių, kaip stresas, dvivalenčiai sunkieji metalai, endotoksinai, interferonai, hormonai, vitaminai, medikamentai, alkoholis, citokinai, interleukinai, toksinės organinės medţiagos bei reaktyviosios deguonies ir azoto formos. Tuo tarpu MT-3 ir MT-4 izoformos nejautrios šiems veiksniams.

Cinko ir kadmio jonai yra pagrindiniai MT-1 ir MT-2 izoformų induktoriai kepenyse. Inkstuose metalotioneinų sintezę labiausiai indukuoja gyvsidabris ir kadmis bei didelės cinko koncentracijos [13]. Pasiūlyta, jog kepenyse susidaręs kadmio-MT kompleksas patenka į inkstus, kur filtruojamas inkstų glomeruluose ir rebsorbuojamas proksimaliniuose inkstų kanalėliuose endocitozės būdu. Inkstų kanalėlių ląstelėse kadmio-MT kompleksas suardomas ir atsipalaiduoja kadmio jonai, naujai sukeldami MT sintezę inkstų kanalėliuose. Todėl MT šlapime (metalotioneinurija) gali būti kaip apsinuodijimo kadmiu ţymuo [93].

Esant normaliom sąlygom, didţiausios MT koncentracijos audiniuose pasitaiko padidinto cinko poreikio periodais, pavyzdţiui greito augimo periodas perinataliniuose gyvūnuose ar audinių regeneracijos periodu. Yra labai grieţtas mitybos poreikis cinkui normalių ląstelių dalijimosi metu ir yra manoma, kad MT parūpina cinko atsargas. Faktas, kad cinkas yra būtinas ląstelių dalijimuisi, įskaitant DNR, RNR ir baltymų sintezę, parodo neabejotiną poreikį šio mikroelemento greitos proliferacijos periodais. Padidėjęs cinko poreikis besidauginančiuose audiniuose gali būti atsakingas uţ MT aktyvaciją inkstuose, tuo tarpu kepenyse aktyvacija gali būti dėl padidėjusio cinko poreikio visame kūne [94].

Keletas tyrimų parodė, kad molekuliniame lygyje MT gali veikti kaip vario ar cinko donorai kitiems baltymams ląstelės viduje. Pavyzdţiui, keletas apofermentų, kuriems reikia

cinko ar vario kaip kofaktorių, tokie kaip anglies anhidrazė, šarminė fosfatazė ir superoksido dismutazė, buvo atgaivinti po MT cinko ar vario. Taip pat yra ţinoma, kad MT cinkas kepenyse aktyvuoja aminolevulino rūgšties dehidratazę (cinko reikalaujančiam fermentui, kuris dalyvauja hemo sintezėje) tiekiant cinką šiam fermentui [13].

Nustatyta, jog MT gali veiksmingai slopinti oksidacinį stresą in vivo, kur MT uţkerta kelią ROS-netiesioginiam toksiškumui kaip lipidų peroksidacija, NO formavimasis, kuris galiausiai veda prie neuroninės degeneracijos ir apoptotinės ląstelės mirties [13].

2. 4. Kadmio jonų poveikis transliacijos sistemai

Sunkiųjų metalų poveikis ląstelės genetinei sistemai yra vienas iš svarbiausių veiksnių, sukeliančių vėţio išsivystymą. Manoma, jog kadmio sukeliamo toksinio poveikio organizmui molekulinis mechanizmas gali būti susijęs su gyvybiškai svarbaus ląstelei DNR klaidų atitaisymo mechanizmo (angl.- mismatch repair (MMR)) slopinimu [95]. Tyrimais su ţmonių ląstelėmis nustatyta, jog kadmio sukeltos MMR sistemos nuslopinimas palieka apie 20–50 proc. neatitaisytų klaidų DNR grandinėje. Taip atsiranda DNR mutacijos, lemiančios netinkamą ląstelės augimą, dauginimąsi ir funkcionavimą [96].

Kancerogeninis kadmio poveikis priklauso nuo indukuojamų genų raiškos [2]. Kadmis gali veikti staigaus ankstyvo atsako genus (angl.- immediate early response genes (IEGs)), dar vadinamais protoonkogenais. Šie genai koduoja transkripcijos faktorius bei turi poveikį kai kurių genų raiškai, įskaitant tuos genus, kurie dalyvauja ląstelės augime ir dauginimesi. Augliuose šie genai daţnai nustatomi per daug išreikšti [97, 98, 99].

Kadmis aktyvina kai kuriuos streso atsako genus (angl.- stress response genes), kaip koduojančius metalotioneinų, glutationo sintezę, dalyvaujančius atsake i oksidacinį stresą, genus, kurie koduoja streso arba šilumos indukuojančius baltymus (angl.- heat shock proteins (HSPs)) [1, 2]. Šie baltymai kitaip vadinami molekuliniais šaperonais ir yra svarbūs streso sąlygom stabilizuojant ląstelių baltymus, palaikant normalią mikrofilamentų ir centrosomų struktūrą [100, 101]. Suardţius metalotioneiną koduojančius genus, organizmas tampa jautresnis kadmio toksiniam poveikiui. Redukuotas glutationas yra svarbiausias -SH grupių turintis ląstelės citoplazmos antioksidantas. Tyrimais su ţiurkėmis nustatyta, jog padidintas glutationo kiekis gali apsaugoti ląsteles nuo toksinio kadmio sukeliamo poveikio. Glutationas ne tik stipriai jungiasi su kadmio jonais, bet ir yra kofaktorius glutationo peroksidazei, kuri neutralizuoja vandenilio peroksidą ir susidariusius lipidų radikalus [1, 102]. Kadmio kancerogenezės schema pateikta 9 pav. [1].

Kadmio kancerogenezė gali būti susijusi su tiesioginiu genotoksiniu šio metalo poveikiu. Kadmio genotoksiškumas gali būti susijęs su cinko pakeitimu kadmiu genus reguliuojančių baltymų ar kitų receptorių „cinko pirštelių“ domene [103]. Tyrimais in vitro nustatyta, jog kadmis veikia kai kurių transkripcijos faktorių aktyvumą, ypatingai indukuoja protonkogenus c-fos ir c-jun, kurie laikomi ląstelės deformacijos ir auglio vystymosi prieţastimi [1, 104, 105]. Neseniai nustatytas kadmio sukeliamas poveikis genų raiškai, reguliuojančiai baltymo biosintezę ar transliaciją [1, 106]. Yra įrodymų, kad kadmis gali aktyvuoti tam tikrus iniciacijos ir elongacijos faktorius [107]. Šie duomenys leidţia manyti, kad iš dalies kadmis

sukelia ląstelės deformaciją ir auglio vystymąsi dėl padidėjusios transliacijos faktorių raiškos [2].

9 pav. Kadmio kancerogenezės schema [1].

Kadmio jonai, patekę į organizmą, veikia įvairias ląstelės metabolizmo grandis, tuo pačiu keisdami ir ţmogaus bei gyvūnų gyvybinę veiklą. Nors duomenų apie toksinį kadmio poveikį įvairioms organizmo biologinėms sistemoms yra daug, tačiau toksiškumo molekuliniai mechanizmai galutinai neišaiškinti. Literatūros duomenys rodo, kad viena iš sunkiųjų metalų veikimo vietų ląstelėse yra baltymų biosintezės sistema [108]. Kadmio jonų poveikis šios sistemos efektyvumui buvo įvertintas KMU BMTI Patochemijos laboratorijoje, panaudojus eksperimentinį modelį.

Iš pradţių buvo nustatyta CdCl2 koncentracija, atitinkanti pusę vidutinės mirtinos dozės

(LD50). Baltosioms laboratorinėms pelėms ji buvo lygi 3,2 mg Cd2+ vienam kg kūno masės.

Ţinoma, kad kadmis labiausiai kaupiasi kepenyse ir inkstuose, kuriuose susikaupia apie pusę šio metalo kiekio. Tikėtina, kad baltymų biosintezė šiuose organuose turėtų labiausiai keistis. Be to, kepenyse vyksta ir įvairių sekretuojamų baltymų biosintezė. Taigi, baltymų biosintezė šiame organe, gerokai intensyvesnė nei kituose, o transliacijos pokyčiai gali atsiliepti viso