MODELYJE IN VIVO TA IKYMAS INKSTŲ REGENERACIJAI EKSPERIMENTINIAME MEZENCHIMINIŲ KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ PAGRINDU EKSPERIMENTINIO FARMACINIO PREPARATO

FARMACIJOS FAKULTETAS MEDICINOS FAKULTETAS

FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS

AUŠRA KVIETKAUSKAITĖ

EKSPERIMENTINIO FARMACINIO PREPARATO

MEZENCHIMINIŲ KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ PAGRINDU

TAIKYMAS INKSTŲ REGENERACIJAI EKSPERIMENTINIAME

MODELYJE IN VIVO

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof. Romaldas Mačiulaitis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS MEDICINOS FAKULTETAS

FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis Data

EKSPERIMENTINIO FARMACINIO PREPARATO MEZENCHIMINIŲ KAMIENINIŲ LĄSTELIŲ PAGRINDU TAIKYMAS INKSTŲ REGENERACIJAI EKSPERIMENTINIAME

MODELYJE IN VIVO

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas Data

Darbo vadovas

Prof. Romaldas Mačiulaitis Data Darbą atliko Magistrantė Aušra Kvietkauskaitė Data KAUNAS, 2016

TURINYS

1.1. Ūmus inkstų paţeidimas ... 13

1.1.1. Ūmaus inkstų paţeidimo etiologija ir klinika ... 13

1.1.2. Epidemiologija ... 14

1.1.3. Ūminio inkstų paţeidimo modeliai in vivo ... 15

1.2. Kamieninės ląstelės ... 16

1.2.1. Kamieninių ląstelių klasifikacija ... 16

1.2.2. Mezenchiminės kamieninės ląstelės ... 20

1.2.3. Charakteristika ... 21

1.2.4. Mezenchiminių kamieninių ląstelių pritaikymas ūmaus inkstų paţeidimo gydymui ... 21

1.2.5. Mezenchiminių kamieninių ląstelių pritaikymas kitų ligų gydymui ... 23

1.2.6. Reikalavimai kamieninių ląstelių preparatams ... 24

2. Tyrimo metodika ... 25

2.1. Laboratoriniai gyvūnai ... 25

2.2. Mezenchiminių kamieninių ląstelių išskyrimas iš kaulų čiulpų ... 25

2.2.1. Ląstelių kultivavimas ... 27

2.2.2. Ląstelių charakterizavimas ... 28

2.2.3. Ląstelių skaičiavimas Neubaerio kamera ... 29

2.3. Pasiruošimas eksperimentui in vivo ... 30

2.3.1. Gentamicino dozės apskaičiavimas ... 32

2.3.2. Eksperimento modelis ir jo eiga ... 33

2.3.4. Biocheminių rodiklių vertinimas ... 35

2.3.5. Glomerulų filtracijos greičio vertinimas ... 35

2.4. Statistinė analizė ... 36

3. Rezultatai ir jų aptarimas ... 37

3.1. Laboratorinių gyvūnų imtis ... 37

3.2. Kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių proliferacija ... 37

3.3. Charakterizavimo duomenys ... 38

3.4. Reikalavimų mezenchiminių kamieninių ląstelių preparatams įvertinimas ... 39

3.5. Šlapimo kiekio duomenys ... 41

3.6. Biocheminiai šlapimo ir kraujo duomenys ... 42

3.7. Glomerulų filtracijos greičio duomenys ... 44

4. Praktinės rekomendacijos ... 46

5. Išvados ... 47

6. Literatūros sąrašas ... 48

SANTRAUKA

A. Kvietkauskaitės magistro baigiamasis darbas. Eksperimentinio farmacinio preparato mezenchiminių kamieninių ląstelių pagrindu taikymas inkstų regeneracijai eksperimentiniame modelyje in

vivo. Mokslinis vadovas prof. Romaldas Mačiulaitis. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos

akademija, Medicinos fakultetas, Fiziologijos ir farmakologijos institutas, Kaunas 2016.

Tyrimo tikslas. Įvertinti kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių terapinį poveikį ūmaus inkstų paţeidimo gydymui eksperimentiniame nefrotoksiškumo modelyje in vivo.

Tyrimo uţdaviniai. (1) Išskirti, kultivuoti ir charakterizuoti kaulų čiulpų mezenchimines kamienines ląsteles; (2) Apibūdinti mezenchiminių kamieninių ląstelių kultūrą kaip eksperimentinį farmacinį preparatą kamieninių ląstelių pagrindu; (3) Įvertinti tiriamojo farmacinio preparato mezenchiminių kamieninių ląstelių pagrindu terapinį poveikį eksperimentiniame ūmaus inkstų paţeidimo modelyje in vivo.

Metodika. Tyrimas atliktas LSMU Fiziologijos ir farmakologijos institute. Eksperimentus sudarė du etapai. Pirmas etapas – mezenchiminių kamieninių ląstelių išskyrimas iš kaulų čiulpų, jų kultivavimas, charakterizavimas, paruošimas injekcijai. Antras etapas – eksperimentinis nefrotoksiškumo modelis in

vivo. Jo metu Wistar linijos ţiurkių patelės buvo suskirstytos į 3 grupes: kontrolinė grupė (sveiki gyvūnai),

ūmaus inkstų paţeidimo (GM) grupė (gentamicino injekcijos 80 mg/kg/d i.p. 7 dienas iš eilės) ir BM-MSCs grupė (po inkstų paţeidimo taikyta kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių terapija). Vienkartinė BM-MSCs (1×106

ląstelių / 500 µl terpės be serumo; i.v.) injekcija skirta praėjus 24 val. po paskutinės gentamicino injekcijos. Fiziologiniai ir biocheminiai inkstų parametrai vertinti 0, 8, 14, 21 dienomis.

Tyrimo rezultatai. Sėkmingai išskirtos ir charakterizuotos ţiurkės kaulų čiulpų kamieninės ląstelės. Šios ląstelės pasiţymėjo teigiama CD90 ekspresija ir neigiama CD34, CD45 ir CD117 (c-kit) ekspresija. Eksperimentų in vivo metu nustatyta statistiškai reikšmingai sumaţėjusi kreatinino koncentracija kraujo serume ir padidėjusi kreatinino koncentracija šlapime, taip pat ţenkliai, tačiau statistiškai nereikšmingai, padidėjęs glomerulų filtracijos greitis kamieninių ląstelių terapijos grupėje, lyginant su gyvūnais, kuriems tokia terapija nebuvo taikoma.

Išvados: Kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės pasiţymi dideliu proliferacijos potencialu ir mezenchiminiais, bet ne hematopoetiniais, endoteliniais ar kamieniniais ląstelių paviršiaus

ţymenimis. Šių ląstelių terapija geba pagerinti funkcinį inkstų atsistatymą, todėl turėtų būti toliau tyrinėjama kaip inovatyvus ūmaus inkstų paţeidimo gydymo būdas.

SUMMARY

A. Kvietkauskaitė’s Master thesis: ‘Experimental pharmaceutical product based on mesenchymal stem cells application in kidney regeneration model in vivo’.

Supervisor Prof. Romaldas Mačiulaitis. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Medicine, Institute of Physiology and Pharmacology. Kaunas 2016.

The aim. To evaluate therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells for treating acute kidney injury in experimental nephrotoxicity model in vivo.

The tasks of the research. (1) To isolate, cultivate and characterize bone marrow mesenchymal stem cells; (2) To describe mesenchymal stem cell culture as a potential experimental pharmaceutical product based on stem cells; (3) To evaluate therapeutic effect of experimental pharmaceutical product based on bone marrow mesenchymal stem cells in acute kidney injury model in vivo.

Materials and methods. The experiment was performed in Lithuanian University of Health Sciences, Institute of Physiology and Pharmacology. It consisted of two main steps. First step was mesenchymal stem cells isolation from rat’s bone marrow, cultivation, characterization and preparation for injection. Second step was nephrotoxicity model in vivo applying cell therapy. During this experiment, animals were divided into three groups, each group containing 6 animals: control group (healthy animals), acute kidney injury (GM) group (just gentamicin injections 80 mg/kg/d i.p. for 7 consecutive days), GM group applied BM-MSCs cell therapy (gentamicin injections 80 mg/kg/d i.p. for 7 consecutive days). Single BM-MSCs (1×106 cells 500 µl; serum free i.v.) injection was given to the BM-MSCs group animals 24 hours after the last gentamicin injection. Physiological and biochemical parameters were evaluated on 0, 8, 14, 21 experiment days.

Results. Rat‘s bone marrow mesenchymal stem cells were successfully isolated and characterized. These cells expressed CD90 and did not expressed CD45, CD34 and CD117 (c-kit) surface markers. In vivo experiments showed a statistically significant reduction in serum creatinine levels and increased creatinine concentration in urine and statistically insignificantly increased glomerular filtration rate in rats that were submitted to stem cell therapy, comparing with those who were not treated with stem cell injection.

Conclusions. Bone marrow mesenchymal stem cells demonstrate high proliferation potency and express mesenchymal, but not hematopoietic, endothelial or stem cell growth factor receptor surface

markers. The cell therapy demonstrates capacity to improve kidney function recovery and should be explored more as a potential and innovative tool for acute kidney injury treatment.

PADĖKA

Dėkoju dėstytojai Eglei Pavydei uţ skirtą laiką, profesoriui Romaldui Mačiulaičiui ir docentui Arvydui Ūsui uţ pastabas rašant šį darbą.

SANTRUMPOS

BM-MSCs – kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės (angl. bone marrow mesenchymal

stem cells)

DAPI – 2-fenilindolo dihidrochlorido hidratas (angl. 2-phenylindole dihydrochloride hydrate) DMEM – Dulbecco’s modifikuota Eagle’s terpė (angl. Dulbecco‘s modified eagle medium) EMA – Europos vaistų agentūra (angl. European medicines agency)

ES – Europos Sąjunga

FBS – veršelio vaisiaus serumas (angl. fetal bovine serum) GFG – glomerulų filtracijos greitis

GM – gentamicinas

i. p. – į pilvo ertmę (angl. intraperitoneal) i. v. – intraveninė (angl. intravenous) KL – kamieninės ląstelės

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas MKL – mezenchiminės kamieninės ląstelės m – ţiurkės masė gramais

ml/min – mililitrai per minutę

mg/kg/d – miligramai kilogramui per dieną µmol/l – mikromoliai litre

ml/24val – mililitrai per parą

PBS – fosfatinis buferinis tirpalas (angl. phosphate buffered saline) SN – standartinis nuokrypis

ĮVADAS

Ūminis inkstų paţeidimas (ŪIP) yra polietiologinis klinikinis sindromas, kuriam būdingas staigus inkstų funkcijos pablogėjimas, dėl kurio susilaiko azotinių medţiagų apykaitos produktai ir sutrinka organizmo homeostazė [1, 2]. ŪIP yra daţna komplikacija išsivystanti 15-20 proc. visų hospitalizuotų pacientų ir net iki dviejų trečdalių pacientų, gydomų intensyvios terapijos skyriuose. Net ir pritaikius pakaitinės inkstų terapijos priemones, pacientų mirštamumas po ŪIP siekia apie 60 proc. Iš išgyvenusių, 15-20 proc. pacientų reikia atlikti nuolatines dializės procedūras [3, 4]. Dabartinį ŪIP gydymą apima pakaitinė inkstų terapija (hemodializė, hemofiltracija, palaikomasis gydymas ir inkstų transplantacija). Nepaisant šių gydymo būdų, per penkis metus po ŪIP pasireiškimo miršta apie 50 proc. pacientų [2]. Taip pat mokslininkai prognozuoja, kad dėl visuomenės senėjimo per ateinantį dešimtmetį ŪIP atvejų padvigubės, todėl yra labai svarbu ieškoti naujų, inovatyvių gydymo priemonių [5].

Vienas iš ŪIP gydymo metodų galėtų būti kamieninių ląstelių (KL) terapija. Šioje srityje plačiausiai tyrinėjamas ląstelių tipas yra kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės (angl. bone

marrow mesenchymal stem cells – BM-MSCs). Mezenchiminės kamieninės ląstelės (MKL) sulaukė

mokslininkų dėmesio dėl pakankamai lengvo jų išskyrimo, plataus pasiskirstymo organizme ir gebėjimo diferencijuotis į kitus ląstelių tipus, kurios galėtų pakeisti ar atkurti paţeistą audinį [6]. Yra įrodymų, kad atliekant tyrimus tiek in vitro, tiek eksperimentuojant su gyvūnais ŪIP modeliuose, MKL gali paskatinti regeneracinius procesus paţeistuose inkstuose, kas veda link audinių atkūrimo bei pagerėjusios inkstų funkcijos [7–10]. Šio darbo tikslas buvo įvertinti ar iš kaulų čiulpų išskirtos mezenchiminės kamieninės ląstelės turi terapinį poveikį eksperimentiniame nefrotoksiškumo modelyje in vivo ir ar gali tapti potencialia ŪIP terapijos priemone.

DARBO TIKSLAS

Įvertinti kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių terapinį poveikį ūmaus inkstų paţeidimo gydymui eksperimentiniame nefrotoksiškumo modelyje in vivo.

DARBO UŢDAVINIAI

1. Išskirti, kultivuoti ir charakterizuoti kaulų čiulpų mezenchimines kamienines ląsteles.

2. Apibūdinti mezenchiminių kamieninių ląstelių kultūrą kaip eksperimentinį farmacinį preparatą kamieninių ląstelių pagrindu.

3. Įvertinti tiriamojo farmacinio preparato mezenchiminių kamieninių ląstelių pagrindu terapinį poveikį eksperimentiniame ūmaus inkstų paţeidimo modelyje in vivo.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Ūmus inkstų paţeidimas

Ūminis inkstų paţeidimas – tai polietiologinis klinikinis sindromas, pasireiškiantis staigiu svarbiausių inkstų funkcijų sutrikimu, dėl kurio sutrinka organizmo homeostazė – susilaiko azotinės medţiagos, sutrinka vandens, elektrolitų, rūgščių ir šarmų pusiausvyra, pasireiškia oligurija bei ūminė ureminė intoksikacija. Ūminis inkstų paţeidimas diagnozuojamas, kai kreatinino koncentracija kraujyje staiga pasiekia 175 µmol/l ir daugiau, sumaţėja diurezė (6 val. diurezė esti <0,5 ml/kg/val) [11, 12].

1.1.1. Ūmaus inkstų paţeidimo etiologija ir klinika

ŪIP prieţasčių yra daugybė, todėl etiologiniai ūmaus inkstų paţeidimo veiksniai yra skirstomi į prereninius, reninius ir postreninius.

Prereninis ūminis inkstų paţeidimas daţniausiai įvyksta dėl sumaţėjusios inkstų kraujotakos – hipoperfuzijos, dehidratacijos, vėmimo, viduriavimo, kongestinio širdies nepakankamumo, šoko, nukraujavimo, sepsio, kepenų cirozės. Jį taip pat sukelia medikamentai – nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo, radiokontrastiniai preparatai. Pacientui pašalinus inkstų hipoperfuzijos prieţastį per 24-48 val., inkstų būklė greitai pagerėja, nes inksto struktūra dar nebūna pakitusi. Jeigu nėra pašalinama prieţastis, galimi tolimesni inkstų pakenkimai – prereninis ŪIP dėl inkstų perfuzijos sumaţėjimo ir to sąlygotos inkstų kanalėlių paţaidos, gali pereiti į reninį inkstų paţeidimą [13, 14].

Reninio ŪIP metu susilpnėja arba visiškai išnyksta inkstų funkcija, vyksta šių organų struktūros pokyčiai. Reninį ŪIP sukelia: išeminė ūminė kanalėlių nekrozė dėl toliau progresuojančio prereninio ŪIP, nefrotoksinė ūminė kanalėlių nekrozė, kurią sukelia cheminės medţiagos ir medikamentai (aminoglikozidai, radiokontrastinės medţiagos), glomerulonefritas, tubulointersticinės ligos [12–14].

Postreninis (obstrukcinis) ŪIP kyla dėl šlapimo takų obstrukcijos, kuri gali būti nuo inkstų kanalėlių iki šlaplės. Postreninio ŪIP prieţastys: inkstų akmenligė, gerybinė priešinės liaukos hiperplazija, maţojo dubens organų navikai, šlapimo pūslės disfunkcija, šlaplės susiaurėjimai.

ŪIP turi keturias stadijas:

1. Pradinė stadija: trunka iki 1-2 dienų, vyrauja inkstų paţeidimą sukėlusios ligos poţymiai (šokas, nukraujavimas, nudegimas), pradeda maţėti diurezė. Šiuo laikotarpiu pradėjus gydymą ligos eiga gerėja, tačiau gydymo nepradėjus, nepakankamumas progresuoja toliau.

2. Oligoanurinė stadija: trunka 10-14 dienų, sunkiais atvejais iki 1-2 mėnesių. Šiuo laikotarpiu sumaţėja diurezė (oligurija, anurija), ryškėja hipovolemija, pacientai dūsta, pabrinksta, organizme susilaiko įvairūs baltymų skilimo produktai.

3. Poliurijos stadija: tai laikas nuo diurezės normalizavimosi iki azotemijos išnykimo. Jei eiga gerybinė, šlapimo kiekis didėja iki kelių ar net keliolikos litrų per parą. Gerėja pacientų savijauta, maţėja azotemia.

4. Grįţtamoji stadija: ši stadija trunka ilgai, 6-12 mėnesių. Šiuo laikotarpiu normalizuojasi diurezė, inkstų funkcija, atsinaujina inkstų kanalėlių epitelis [15, 16].

1.1.2. Epidemiologija

Ūmus inkstų paţeidimas yra svarbi ir daţna problema su kuria susiduria nemaţa dalis ligoninėje besigydančių pacientų. Ligos pasireiškimo mastas skiriasi, tačiau maţdaug 15–20 proc. visų hospitalizuotų pacientų ir iki 67 proc. pacientų besigydančių intensyvios terapijos skyriuje susiduria su šiuo sindromu, todėl ŪIP yra viena daţniausiai pasitaikančių organų disfunkcijų tarp sunkiai sergančių pacientų [3, 4]. Deja, mirtingumas sukeltas šio sindromas daţnai viršija 60 proc. [17–19]. Taip pat, tai yra labai daţna komplikacija su kuria susiduria pacientai po širdies operacijų, kurių skaičius siekia iki 30 proc., bei pacientai susirgę sepsiu, iš kurių iki 50 proc. išsivysto ŪIP [20, 21]. Taip pat po patirto ŪIP didėja rizika susirgti kitomis chroniškomis inkstų ligomis, padidėja sveikatos prieţiūros įstaigų išlaidos, maţėja pacientų gyvenimo kokybė, todėl yra svarbu rasti efektyvų gydymą [22].

Lietuvoje ŪIP baigtys buvo tirtos Kauno medicinos universiteto klinikose 1995-2006 metais. Pagal surinktus duomenis, ŪIP atvejų skaičius su metais didėjo, palyginimui, 1995 m. ŪIP atvejų buvo 34, 2006 metais išaugo iki 311. Per 1995-2006 metų laikotarpį buvo ištirta 1620 pacientų su ŪIP, 47 proc. pacientų inkstų funkcija po gydymo dialize pagerėjo, 45 proc. pacientų mirė, o 7 proc. išliko negrįţtamas inkstų nepakankamumas [23]. Viena iš ŪIP komplikacijų yra lėtinis inkstų nepakankamumas, kada reikia taikyti hemodializę, o vėliau atlikti inkstų transplantaciją [13]. Pirmo paveikslėlio grafike pateikiami

duomenys iš Nacionalinio transplantacijos biuro, kiek ţmonių laukia inkstų transplantacijos Lietuvoje nuo 2002 iki 2015 metų.

1 pav. Pacientai, laukiantys inkstų transplantacijos Lietuvoje 2002-2015m.

1.1.3. Ūminio inkstų paţeidimo modeliai in vivo

Kadangi dabartinių ŪIP terapijos priemonių nepakanka, reikia ieškoti naujų, inovatyvių gydymo metodų. Norint sukurti naują terapijos priemonę, reikia atlikti pakankamai tyrimų, kurie įrodytų naujo preparato efektyvumą, todėl prieš taikant gydymą ţmonėms, reikia atlikti ikiklinikinius tyrimus su gyvūnais, kuriems būtų sukelti inkstų paţeidimai. Eksperimentiniuose modeliuose in vivo inkstų paţeidimai sukeliami nefrotoksinėmis medţiagomis. Kaip nefrotoksinę medţiagą įvairiuose gyvūnų modeliuose galima naudoti cisplatiną [24], gyvsidabrio chloridą [25], glicerolį [26]. Kaip inkstus toksiškai veikiančią medţiagą galima naudoti aminoglikozidų grupės antibiotiką – gentamiciną, kuris yra daţnai naudojamas sukelti ŪIP. Įvairių tyrėjų duomenimis, daţnai naudojama gentamicino dozė norint sukelti inkstų paţeidimus yra 80 mg/kg/d intraperitoninė injekcija [27–29]. Gentamicinas kaip nefrotoksinė medţiaga yra pranašesnė uţ kitas anksčiau minėtas medţiagas, nes ţalingas poveikis sukeliamas išskirtinai inkstų funkcijai, skirtingai nei cisplatinos bei gyvsidabrio chlorido medţiagos, kurios ţalingai veikia visą organizmą, todėl maţėja eksperimentinių gyvūnų išgyvenamumas. Aminoglikozidų sukeltos inkstų paţaidos metu labiausiai nukenčia proksimalinių kanalėlių epitelio ląstelės, sutrinka mitochondrijų funkcija [16].

1.2. Kamieninės ląstelės

Kamieninės ląstelės – tai grupė nespecializuotų ląstelių, kurios yra randamos visuose daugialąsčiuose organizmuose [30]. Šias ląsteles 1961 metais atsitiktinai atrado du mokslininkai James Till ir Ernest McCulloch pastebėję, kad intraveninė kaulų čiulpų injekcija prieš tai apšvitintoms pelėms sukėlė ląstelių proliferaciją gyvūnų bluţnyse [31]. Kamieninės ląstelės gali savarankiškai atsinaujinti, joms dalijantis susidaro daugiau tokios pačios rūšies ląstelių, jos gali diferencijuotis į įvairius ląstelių tipus, sudaryti audinius bei organus, kurie atlieka specifinę funkciją. Pritaikius KL savybes atnaujinti paţeistus audinius, šios ląstelės gali būti pritaikomos gydyti daugybę ligų. Dvidešimt pirmajame amţiuje šios ląstelės sulaukė didţiulio medicinos ir biologijos sričių mokslininkų dėmesio [32, 33].

1.2.1. Kamieninių ląstelių klasifikacija

Kamieninės ląstelės yra klasifikuojamos pagal jų diferenciacijos potencialą ir ląstelių kilmę. Ląstelės, kurios yra klasifikuojamos pagal diferenciacijos potencialą, skiriasi savo vystymosi galimybėmis ir pagal tai jos yra skirstomos į: totipotentines, pluripotentines, multipotentines ir unipotentines kamienines ląsteles.

Totipotentinės kamieninės ląstelės – iš šių ląstelių gali išsivystyti absoliučiai naujas organizmas, tik zigota turi tokias savybes. Šių ląstelių diferenciacijos potencialas labai platus, jos yra randamos ankstyvoje embriono vystymosi fazėje – morulėje.

Pluripotentinės kamieninės ląstelės – ketvirtą-penktą embriono vystymosi dieną, morulė virsta blastocista, jos vidinėje ląstelės masėje, kitaip vadinamoje embrioblastu, yra randamos pluripotentinės kamieninės ląstelės, iš kurių formuojasi trijų gemalinių lapelių ląstelės ir gali susidaryti viso organizmo audiniai: endoderma (sudaro vidaus organų gleivinę), mezoderma (duoda pradţią kaulų, raumenų ir kraujotakos vystymuisi), ektoderma (duoda pradţią nervų sistemos ir odos vystymuisi).

Multipotentinės kamieninės ląstelės – šios ląstelės randamos atitinkamuose audiniuose ir gali virsti į kelis kitus ląstelių tipus priklausomai nuo audinio iš kurio šios ląstelės išgautos. Šias ląsteles galima vadinti pluripotentinių ląstelių palikuonimis, nes jos tampa naujų ląstelių linijų pradininkėmis, tokių kaip kraujo, odos.

Unipotentinės kamieninės ląstelės – šios ląstelės randamos audiniuose ir gali virsti tik į vieną ląstelių tipą, tačiau išsaugo tam tikrą savybę atsinaujinti [30, 34, 35].

Kitas kamieninių ląstelių grupavimo būdas yra klasifikacija pagal jų kilmę į keturias pagrindines grupes: kamieninės ląstelės iš embriono, kamieninės ląstelės iš vaisiaus ir naujagimio (virkštelės kraujo), suaugusiųjų arba kitaip somatinės kamieninės ląstelės (2 pav.).

Embrioninės kamieninės ląstelės buvo izoliuotos 1981 metais. Ţmogaus embrionas, kai jis pasiekia blastocistos stadiją, būna sudarytas iš 150-200 ląstelių, tai įvyksta praėjus 4-5 dienoms po kiaušialąstės apvaisinimo. Embrioninės kamieninės ląstelės yra gaunamos iš blastocistos vidinės ląstelių masės (angl. inner cell mass). Šios ląstelės yra daugiagalės, su didţiausiu diferenciacijos potencialu. Tęsiantis embriono augimui, vidinė ląstelių masė toliau vystosi į du atskirus ląstelių sluoksnius – epiblastą ir hipoblastą. Iš hipoblasto formuojasi gemalo maišelis, kuris vėliau tampa nebereikalingas, tuo tarpu epiblastas diferencijuojasi į tris pirminius gemalinius sluoksnius: ektodermą, mezodermą, endodermą. Dėl šių ląstelių galimybės diferencijuotis į bet kokį ląstelių tipą yra didelis potencialas jas pritaikyti regeneracinėje medicinoje, gydant genetines ligas bei toksikologijoje. Tačiau dėl kylančių etinių problemų ir draudimų bei mokslininkų nesugrėbėjimo kontroliuoti šių ląstelių proliferaciją, embrioninių ląstelių panaudojimas medicininiais tikslais in vitro ir gyvūnų modeliuose yra ribotas [32, 36].

Vaisiaus kamieninės ląstelės yra randamos vaisiaus audiniuose ir gali diferencijuotis į du kamieninių ląstelių tipus: pluripotentines ir hematopoetines kamienines ląsteles. Šios ląstelės yra izoliuojamos iš vaisaus audinių, tokių kaip kraujas, kepenys, kaulų čiulpai, kasa, bluţnis, inkstai, placenta, virkštelės kraujas, taip pat iš vaisiaus po nėštumo nutraukimo. Hematopoetinės kamieninės ląstelės, randamos vaisiaus virkštelės kraujyje, medicinoje gana efektyviai naudojamos gydyti kraujo ligas, tokias kaip leukemija ar anemija. Medicinos įstaigos jau seniai taiko praktiką uţšaldyti naujagimio virkštelės kraują, kuris vėliau, jeigu iškils būtinybė, galės būti panaudotas gydyti paciento kraujo ligas [37–39].

Suaugusiųjų arba somatinės kamieninės ląstelės yra išskiriamos iš suaugusio organizmo audinių. Šios ląstelės yra riboto potencialo, palyginus su embrioninėmis ar vaisiaus kamieninėmis ląstelėmis, dauguma jų yra multipotentinės ir yra vadinamos pagal tai, iš kur jos yra išskirtos, pvz., riebalinės kilmės, endotelio, dantų pulpos kamieninės ląstelės. Šios ląstelės atlieka svarbų vaidmenį lokalių audinių atkūrime ir regeneracijoje. Somatinės kamieninės ląstelės aptinkamos daugelyje įvairių organų ir audinių, tokių kaip kepenys, kasa, virškinamojo trakto epitelis, nervinis audinys, kaulų čiulpai, periferinis kraujas, kraujagyslės, raumenys, oda, kiaušidţių epitelis, sėklidės. Šios kamieninės ląstelės ilgą laiką gali būti neaktyvios – ramybės būsenoje, jos pradeda dalintis tik tada, kai atsiranda poreikis, pavyzdţiui, iškilus audinio regeneracijos būtinybei, kai įvyksta audinio paţaida. Šios ląstelės ima dalintis ir tampa naujoms ląstelėms, kurios pasiţymi konkretaus audinio savybėmis. Somatinių kamieninių ląstelių panaudojimas moksliniuose tyrimuose bei ląstelių terapijoje nėra toks prieštaringas, kaip embrioninių kamieninių

ląstelių, nes pastarųjų išskyrimas nereikalauja embriono sunaikinimo. Pats pacientas gali būti šių ląstelių donoras, pavyzdţiui, vykdant autologinę kaulų čiulpų transplantaciją [32, 40].

1.2.2. Mezenchiminės kamieninės ląstelės

Mezenchiminės kamieninės ląstelės – tai verpstės formos multipotentinės kamieninės ląstelės. Pirmą kartą iš kaulų čiulpų išskirtos dvidešimto amţiaus antroje pusėje rusų mokslininko Aleksandro Friedensteino [41]. MKL yra plačiai paplitusios organizme ir jas galima izoliuoti iš: kaulų čiulpų, skeleto raumenų, riebalinio audinio, odos, kaulų ir kremzlės, sinovijinio skysčio, danties pulpos, periferinio kraujo. Taip pat kiekviena kūno kraujagyslė turi mezenchiminių ląstelių, kurios yra kraujagyslių išorinėje pusėje [10, 35, 42]. Daţniausiai MKL yra išskiriamos iš kaulų čiulpų ertmės. Iš kaulų čiulpų yra gaunamos dvi kamieninių ląstelių kultūros – hematopoetinės ir mezenchiminės [43]. Kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės yra ypač vertos dėmesio, nes dideli šių ląstelių kiekiai surenkami atliekant santykinai maţesnes invazines procedūras [44].

3 pav. Mezenchiminių kamieninių ląstelių geba diferencijuotis į audinius

Prieš pusę amţiaus buvo manoma, kad šios ląstelės yra fibroblastų prekursoriai esantys kaulų čiulpuose. Tik vėliau pastebėta jų potencija diferencijuotis į kitus ląstelių tipus, kaip osteocitai, adipocitai, chondrocitai, mioblastai, tenocitai ir vėliau virsti tam tikrais audiniais (3 pav.) [45]. Tyrinėjant šių ląstelių

veikimo mechanizmą, mokslininkai nustatė, kad mezenchiminės kamieninės ląstelės gali migruoti į paţeistą audinį ir jį atkurti parakrininiu būdu sekretuodamos specifinius faktorius, tokius kaip citokinai, chemokinai ir augimo faktoriai (prostaglandinai, interliaukinai), kurie slopina ląstelių apoptozę, maţina uţdegiminius ir randėjimo procesus [46, 47]. Taip pat dalis mezenchiminių kamieninių ląstelių yra pluripotentinės ir gali duoti pradţią ne tik mezodermos, bet ir endodermos audiniams [48].

1.2.3. Charakteristika

Augantis mokslininkų susidomėjimas MKL lėmė abejonių dėl jų lygiavertiškumo išskiriant jas iš skirtingų šaltinių. Taip pat iki šiol nėra atrastų specifinių MKL paviršiaus bioţymenų. Dėl šios prieţasties, 2006 metais Tarptautinė ląstelių terapijos draugija (angl. International Society of Cellular Therapy) įvardino minimalius kriterijus, kurie apibrėţtų mezenchimines kamienines ląsteles:

1) Ląstelės turi lipti prie plastiko standartinėmis kultivavimo sąlygomis;

2) Specifinių ląstelės paviršiaus ţymenų CD105, CD73, CD90 ekspresija ir paviršiaus ţymenų CD45, CD34, CD14 ar CD11b, CD79α ar CD19 nebuvimas bei ţmogaus leukocitų antigenų HLA-DR nebuvimas;

3) In vitro šios ląstelės turi demonstruoti gebėjimą diferencijuotis į adipocitus, osteoblastus, chondroblastus [49].

1.2.4. Mezenchiminių kamieninių ląstelių pritaikymas ūmaus inkstų paţeidimo

gydymui

Mezenchiminės kamieninės ląstelės sulaukė mokslininkų dėmesio dėl jų pakankamai lengvo išskyrimo, plataus pasiskirstymo organizme ir gebėjimo diferencijuotis į kitus ląstelių tipus, kurie galėtų pakeisti ar atkurti paţeistą audinį [6]. Yra įrodymų, kad eksperimentuojant su gyvūnais įvairiuose ŪIP modeliuose MKL gali paskatinti regeneracinius procesus paţeistuose inkstuose, kas veda link audinių atkūrimo bei pagerėjusios inkstų funkcijos [7, 50–53]. MKL poveikis inkstų funkcijai įvairiuose gyvūnų modeliuose pateikiamas 1 lentelėje.

Mezenchiminės kamieninės ląstelės jau kuris laikas yra mokslininkų susidomėjimo objektas dėl šių ląstelių potencialių regeneracinių, audinius atkuriančių funkcijų ir pasiţymėjimo šiomis savybėmis:

- Šias ląstelės yra pakankamai lengva išgauti iš įvairių audinių [54]. - Ląstelės greitai auga jas kultivuojant [55].

- Didţiąja dalimi šios ląstelės yra imunologiškai inertiškos, kas atveria kelią alogeninių ląstelių transplantacijai [56].

- Pasiţymi imunosupresinėmis savybėmis [57].

- Šios ląstelės išskiria tam tikrus faktorius, kurie moduliuoja uţdegiminius procesus bei apoptozę [58].

1 lentelė. Kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių panaudojimas inkstų regeneracijai Kamieninių ląstelių kilmė Eksperimentinis modelis Efektas

Pelė Glicerolio sukeltas ŪIP Diferenciacija į kanalėlių epitelio ląsteles [53]

Pelė Cisplatinos sukeltas ŪIP Diferenciacija į kanalėlių epitelio ląsteles [52]

Ţiurkė Išemijos sukeltas ŪIP Inkstų funkcijos atsistatymas,

ląstelės nesidiferencijavo į kanalėlių epitelio ląstelės [50] Ţmogus Cisplatinos sukeltas ŪIP Inkstų funkcijos atsistatymas,

pagerėjęs išgyvenamumas [51] Ţiurkė Gentamicino sukeltas ŪIP Inkstų funkcijos atsistatymas [7]

Nepaisant gerų rezultatų ikiklinikinuose tyrimuose taikant gyvūnų modelius, šiuo metu vyksta, arba jau yra uţbaigti, tik trys klinikiniai tyrimai, kurių metu ŪIP gydomas taikant mezenchiminių kamieninių ląstelių terapiją [59–61].

Nors pradţioje moksliniai tyrimai įrodė, kad kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės gali diferencijuotis į inkstų epitelio ląsteles [53] bei mezangines ląsteles (inkstų kūnelio ląstelės) [62], tačiau naujesni duomenys parodė, kad šių ląstelių geba diferencijuotis yra ribota. Šios ląstelės taip pat nesidiferencionuoja į inkstų parenchimos ląstelės in vivo [63]. Mokslininkai mano, kad kaulų čiulpų

mezenchiminių kamieninių ląstelių veikimo mechanizmas esant ūmiam inkstų paţeidimui yra slopinti ląstelių apoptozę [64] bei moduliuoti uţdegiminius procesus [58].

1.2.5. Mezenchiminių kamieninių ląstelių pritaikymas kitų ligų gydymui

Dėl palyginus paprasto MKL išgavimo ir gerų rezultatų klinikinėje praktikoje, šiuo metu yra atliekama daug tyrimų su šiomis ląstelėmis. MKL yra patraukli alternatyva širdies kraujagyslių atkūrime, nes šios ląstelės pasiţymi regeneracinėmis bei imunomoduliacinėmis savybėmis. MKL turi teigiamą poveikį širdies ir kraujagyslių ligomis sergantiems tiriamiesiems pacientams, dėl savybių regeneruoti kardiomiocitus, pagerinti širdies darbą, sumaţinti infarkto paţeistą širdies plotą [65, 66]. Dėl MKL savybių moduliuoti imuninį atsaką, šios ląstelės gali tapti potencialia terapijos priemone gydant autoimunines ligas, tokias kaip Krono liga, išsėtinė sklerozė, raudonoji vilkligė, reumatoidinis artritas [65]. Atliktame pirmos fazės klinikiniame tyrime su 5 Krono liga sergančiais pacientais, net 4 buvo stebimas būklės pagerėjimas ir fistulių gijimas po autologinės MKL injekcijos į fistulės vietą [67]. Izraelyje atliktame tyrime su 15 išsėtine skleroze sergančiais pacientais, kuriems buvo leidţiamos autologinės MKL, buvo stebimas jų būklės pagerėjimas vertinant pagal išplėstinės negalios vertinimo skalę bei nebuvo uţfiksuota svarbių nepageidaujamų reakcijų [68]. Mezenchiminės kamieninės ląstelės taip pat domina mokslininkus dėl pastarųjų, kaip imunosupresinio agento, pritaikymo inkstų transplantacijos srityje, taip išvengiant kitų imunosupresinių vaistų, kurie turi daug nepageidaujamų poveikių, naudojimo [69].

MKL įvairiuose gyvūnų stuburo smegenų paţeidimo modeliuose demonstruoja funkcinį pagerėjimą, įskaitant padidėjusį motorinį aktyvumą ir jutimą paralyţiuotose galūnėse [70, 71]. Klinikinių tyrimų metu buvo stebimas teigiamas MKL poveikis gydant osteoartritą ir kremzlės paţeidimus [72, 73]. MKL geba diferencijuotis į osteoblastus, tenocitus bei chondrocitus sulaukė mokslininkų dėmesio dėl šių ląstelių pritaikymo ortopedijos srityje. 2011 metais atliktame tyrime, kuriame dalyvavo 4 osteoartritu sergantys pacientai, buvo fiksuojamas ţymus skausmo sumaţėjimas po autologinių kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių injekcijų į kelio sąnarius [74].

MKL taip pat ėmė ryškėti kaip nešiklis vėţio genų terapijoje dėl šioms ląstelėms būdingų migracijos savybių link auglio vietos [75]. Tačiau, ar MKL turi priešvėţinį poveikį nėra iki galo aišku, nes kai kurie tyrimai rodo, kad nemodifikuotos MKL slopina naviko augimą bei angiogenezę [76], kol kiti mokslininkai teigia, kad MKL skatina tumorogenezę ir metastazes [77].

Mezenchiminės kamieninės ląstelės dėl savo regeneracinių ir priešuţdegiminių savybių gali tapti potencialia terapijos priemone gydyti kepenų ligas. Atliktame 1 fazės klinikiniame tyrime su 4 kepenų ciroze sergančiais pacientais, po autologinės MKL injekcijos buvo stebimas pacientų gyvenimo kokybės pagerėjimas bei neuţfiksuota jokių nepageidaujamų reakcijų [78].

1.2.6. Reikalavimai kamieninių ląstelių preparatams

Mezenchiminių kamieninių ląstelių pagrindu kuriami preparatai Europos Sąjungoje (ES) yra priskiriami prie paţangiosios terapijos vaistinių preparatų (angl. Advanced therapy medicinal products). Pasaulyje yra uţregistruota tik keletas preparatų mezenchiminių kamieninių ląstelių pagrindu. Visi MKL pagrindu kuriamų preparatų vystytojai ES turi vadovautis Europos vaistų agentūros (angl. European

medicines agency – EMA) publikuotomis gairėmis, kuriose yra iškelti reikalavimai medikamentams, tokių

ląstelių pagrindu. Kamieninių ląstelių pagrindu kuriamo produkto kokybės ir gamybos aspektus apima: (1) pradinės medţiagos, (2) gamybos procesas, (3) ląstelių charakteristika, kurią apimą ląstelių tapatybė, grynumas, priemaišos, dozės stiprumas, tumorogeniškumas, (4) kokybės kontrolė, kurią apima medţiagos atsipalaidavimo kriterijai, stabilumo testai, specialūs testai kombinuotiems produktams, (5) gamybos proceso validacija, (6) produkto kūrimas, (7) suderinamumas. Pradinės medţiagos, ląstelės, gali būti išskiriamos arba įsigyjamos iš ląstelių bankų. Pradinė preparato ţaliava daţnai būna su kitų ląstelių priemaišomis, kurios gali turėti didţiulį poveikį galutiniam kamieninių ląstelių pagrindu kuriamam produktui. Dėl šios prieţasties, ląstelių tapatybė turi būti tiksliai apibrėţta ir charakterizuota, jai nustatyti yra naudojami specialūs ląstelių paviršiaus ţymenys. Nepageidaujamų ląstelių kiekis galutiniame produkte turi būti apibrėţtas ir kontroliuojamas. Biologinio aktyvumo tyrimai turi būti vykdomi numatomam biologiniam poveikiui. Naudojant kamienines ląsteles gydymui, reikia atsiţvelgti ir į galimą navikų formavimosi riziką. Ikiklinikinį vystymą apima: (1) farmakologija ir (2) toksikologija. Ikiklinikinio vystymo tyrimų tikslas yra apibrėţti farmakologinį ir toksikologinį poveikį prognozuojant ţmogaus organizmo atsaką į preparatą, surinkti informaciją apie saugią preparato dozę, kuri bus naudojama klinikiniuose tyrimuose, saugų vartojimo būdą, daţnumą, vartojimo trukmę, nepageidaujamas reakcijas, nustatyti, kokius organus preparatas veikia toksiškai. Šie tyrimai turi būti atlikti su laboratoriniais gyvūnais. Klinikinius aspektus apima: (1) farmakodinamika, (2) farmakokinetika, (3) dozės nustatymo studijos, (4) preparato efektyvumas, (5) saugumas, (6) farmakologinis budrumas. Turi būti atlikti tyrimai, nustatantys ląstelių farmakokinetiką ir farmakodinamiką, identifikuota saugi ir veiksminga ląstelių dozė

taip pat ir minimali veiksminga dozė. Kuriant preparatus kamieninių ląstelių pagrindu yra svarbus jų saugumas, nes šios ląstelės turi padidintą navikų atsiradimo riziką, tačiau šiems preparatams kartu galioja tokie patys saugumo reikalavimai, kaip ir kitiems vaistams. Specifiniai preparatų saugumo iššūkiai, įskaitant preparato veiksmingumo stoką, turi būti stebimi ir fiksuojami ilgą laiko tarpą, tam ir yra farmakologinis budrumas Ląstelių pagrindu kuriami preparatai turi būti gaminami pagal ES geros gamybos praktikos reikalavimus [79, 80].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Laboratoriniai gyvūnai

Eksperimento metu buvo naudojami tiriamieji objektai – laboratoriniai gyvūnai, ţiurkės. Tyrimas su gyvūnais atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Fiziologijos ir farmakologijos institute. BM-MSCs ląstelių išskyrimui pasirinktas 2-3 savaičių Wistar ţiurkės patinėlis. Inkstų funkcijos paţeidimui sukelti pasirinktos 2-3 mėnesių amţiaus Wistar ţiurkių patelės. Eksperimentai su laboratoriniais gyvūnais, ţiurkėmis, atlikti vadovaujantis Lietuvos Respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymo 16 straipsnio 4 dalimi, mokslo ir mokymo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo, prieţiūros ir naudojimo reikalavimais, patvirtintais Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2012 10 31 įsakymu Nr. B1-866 „Dėl Mokslo ir mokymo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo, prieţiūros ir naudojimo reikalavimų patvirtinimo“. Remiantis Lietuvos bandomųjų gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2014 12 16 išvada Nr. 13 „Dėl leidimo atlikti bandymus su gyvūnais“ buvo leidţiama atlikti bandymus su gyvūnais. Leidimas pateikiamas skyriuje „Priedai“.

2.2. Mezenchiminių kamieninių ląstelių išskyrimas iš kaulų čiulpų

Pirmasis eksperimento etapas buvo mezenchiminių kamieninių ląstelių išskyrimas iš Wistar linijos ţiurkių patinėlio kaulų čiulpų.

Ląstelių proliferacijai buvo ruošiama 100 ml DMEM (angl. Dulbecco‘s modified eagle medium) proliferacinė terpė. Ji buvo ruošiama į sterilų indą supilant 84 ml DMEM su L-gliutaminu ir NaHCO3 (GIBCO), 15ml FBS (angl. Fetal bovine serum), (GIBCO), streptomicino/penicilino (100 U/ml) (Sigma). Proliferacinė terpė savo sudėtyje turi visas pagrindines medţiagas reikalingas BM-MSCs ląstelių kultūros proliferacijai. Ţiurkės patinėlio galūnių laikymui buvo gaminta DMEM terpė su penicilinu/streptomicinu.

Pirmiausiai buvo vykdoma ţiurkės patinėlio eutanazija, atliekant jam kaklo dislokaciją. Eksperimentinio gyvūno kūnas buvo plaunamas 70 proc. etanolio tirpalu, daromi skersiniai pjūviai abiejose galinėse kojose, tose vietose, kur galinės kojos ribojasi su gyvūno liemeniu ir ties kulkšnimis. Oda pašalinama ją tempiant nuo liemens pėdos link. Odos pašalinimas padėjo išvengti mikrobinės taršos, kuri gali atsirasti dėl kontakto su eksperimentinio gyvūno kailiu. Toliau, abi galinės kojos, šlaunikaulis kartu su blauzdikauliu, buvo atskiriamos nuo ţiurkės patinėlio liemens pjaunant išilgai stuburo smegenų. Kiekviena nupjauta galūnė tuojau pat talpinama į DMEM terpę su antibakterinėmis medţiagomis, penicilinu ir streptomicinu.

Tolimesnės procedūros buvo atliekamos ESCO LA2-4A1 laminare (Esco Technologies Inc, JAV). Galūnės perpjaunamos per kelio sąnarį ir taip atskiriamas šlaunikaulis nuo blauzdikaulio, pašalinami raumenys, sausgyslės. Blauzdikauliai ir šlaunikauliai talpinami į DMEM terpę su penicilinu ir streptomicinu.

Specialiomis steriliomis ţirklėmis nukerpami blauzdikaulio ir šlaunikaulio kaulų galai ties kaulų čiulpų ertmių prasidėjimo vietomis. Naudojama 27 dydţio adata ir 10 ml švirkštas, pripildytas 1 ml proliferacinės terpės. Švirkštas buvo įkišamas į vieną kaulo galą ir švirkščiama terpė, kuri išbėgo pro kitą kaulo ertmės galą. Procedūrą kartojome su visais kaulais. Stipri srovė yra svarbus veiksnys, norint išgauti mezenchimines ląsteles iš kaulų čiulpų.

Terpė su MKL buvo perfiltruojamos per 70 µm filtrą, kad būtų pašalinami raumenų, ląstelių gumulėlių, kaulų atplaišos. Kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių išskyrimo procedūra pavaizduota 4 paveikslėlyje.

4 pav. Kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių išskyrimo procedūra

2.2.1. Ląstelių kultivavimas

Kaulų čiulpų ląstelės toliau buvo kultivuojamos 25 cm2

flakonėlyje su proliferacine terpe. Ląstelės buvo laikomos ESCO 170B-8 CO2 inkubatoriuje (Esco Technologies Inc, JAV) 37˚C temperatūroje ir 5% CO2 atmosferoje 12 valandų. Po nepertraukiamo 12 valandų laikotarpio pakeičiant proliferacinę terpę buvo pašalinamos neprikibusios ląstelės, kurios akumuliavosi tirpalo paviršiuje. Likusios, prie plastiko prilipusios ląstelės buvo mezenchiminės kamieninės ląstelės. Atliekant terpės keitimą, labai svarbu tai daryti atsargiai, nes gali būti pašalintos ir prikibusios mezenchiminės ląstelės.

Dar po 8 valandų laikymo inkubatoriuje buvo keičiama proliferacinė terpė (1,5 ml). Vėliau, terpė buvo keičiama kas 8 valandas iki 72 valandų (1,5 ml).

Praėjus 72 valandoms, prikibusios ląstelės buvo plaunamos fosfato buferiu ir proliferacinė terpė keičiama kas 3-4 dienas (po 5 ml). Ląstelės buvo stebimos ir fotografuojamos fluorescenciniu mikroskopu (Olympus IX73, Japonija) kelių dienų intervalu. Ląstelių kultūrų nuotraukos buvo apdorojamos naudojant programines įrangas Capture Pro 7 (Qimaging, Kanada) ir CellSens Dimention (Olympus Corporation, Japonija).

Po dviejų savaičių nuo ląstelių išskyrimo, ląstelių kultūra buvo plaunama su PBS ir 2 minutes laikoma kambario temperatūroje (25°C) 0,5 ml 0,25% tripsino/1 mM etilendiamintetra acto rūgšties tirpale (Invitrogen). Tripsinas buvo neutralizuojamas pridėjus proliferacinės terpės. Ląstelės buvo centrifuguojamos Eppendorf 5702R centrifūga (Woodley Equipment Company Inc, JAV), 5 minutes (400

aps/min). Ląstelės buvo perkeliamos į 75 cm2 flakoną. Visos perkeltos ląstelės toliau buvo kultivuojamos flakone, neprilipusios ląstelės pašalinamos. Kad auginamų ląstelių kultūra būtų apsaugota nuo infekcijos, buvo dirbama steriliomis sąlygomis laminare, naudojami sterilūs įrankiai. Visa ląstelių išskyrimo ir kultivavimo eiga pavaizduota 5 paveikslėlyje [81]. Ląstelių morfologinis vaizdas ir proliferacijos eiga pateikiama rezultatuose.

5 pav. Ląstelių išskyrimo ir kultivavimo eiga

2.2.2. Ląstelių charakterizavimas

MKL buvo tiriamos dėl CD34, CD45, C90 bei CD117 (c-kit) ląstelių paviršiaus ţymenų buvimo imunofluorescenciniu daţymo metodu. Kamieninės ląstelės kultivuotos šešių šulinėlių lėkštelėje. Prieš ląstelių daţymą, ląstelės du kartus buvo plaunamos su PBS (Sigma-Aldrich) ir fiksuojamos su formaldehidu 2 proc. (Sigma-Aldrich) po 15 minučių. Prieš antikūnių inkubaciją ląstelės buvo inkubuojamos su 10% arklio serumu vienai valandai, kad būtų uţblokuotos nespecifinės baltymų sąveikos. Po to, ląstelės buvo inkubuojamos PBS tirpale su pirminiu antikūniu (Abcam) per naktį 4°C

temperatūroje, po ko sekė inkubacija PBS tirpale su antriniu antikūniu (Abcam) vienai valandai kambario temperatūroje. Vėliau, mėginiai buvo daţomi branduolių daţu DAPI 10 minučių. Po kiekvieno ţingsnio ląstelės tris kartus plaunamos su PBS tirpalu. Ląstelės buvo stebimos fluorescentiniu mikroskopu (Olympus lX73, Japonija) naudojant programinę įrangą QCapture Pro 7. CD34, CD45, C90 bei CD117 (c-kit) ląstelės paviršiaus ţymenų ekspresija pateikiama rezultatuose.

Procentinis ląstelės paviršiaus bioţymenų ekspresavimo dydis buvo vertinamas pagal formulę, skaičiuojant visus ląstelių branduolius, kurie fluorescavo mėlynai ir ląstelių membranas, kurios fluorescavo ţaliai:

×

2.2.3. Ląstelių skaičiavimas Neubaerio kamera

Mezenchiminės kamieninės ląstelės, pasiekus pakankamą proliferacijos lygį (60-70 proc.) buvo skaičiuojamos naudojant Neubauerio hemocitometrą (Celeromics Technologies, Italija). Ląstelių kultūra plaunama su PBS tirpalu, kelias minutes inkubuojama 0,5 ml 0,25 proc. tripsino/1 mM etilendiamintetra acto rūgšties tirpale, kad ląstelės atkibtų nuo plastiko, tripsinas neutralizuojamas pridėjus proliferacinės terpės, centrifūguojama 5 minutes (400 aps/min). Ląstelės praskiedţiamos su DMEM tirpalu. Hemocitometras buvo paruošiamas darbui prispaudţiant stiklelį prie kameros kol pradeda matytis Niutono ţiedai. Naudojantis pipete, buvo paimamas nedidelis kiekis terpės su ląstelėmis (10µl) ir uţlašinamas ant hemocitometro krašto, kur baigiasi stiklelis. Terpės lašas su ląstelėmis buvo paskirstomas Neubaerio kameroje. Joje per mikroskopą buvo skaičiuojamos ląstelės keturiuose kameros kvadratuose, paţymėtuose mėlyna spalva (6 pav.). Kvadratėlyje buvo skaičiuojamos tik tos ląstelės, kurios buvo ryškios ir gerai matomos, taip pat tos ląstelės, kurios buvo kvadratėlio viduje bei ant kairinės ir viršutinės kraštinės (7 pav.). Vėliau, eksperimentinio nefrotoksiškumo modelio in vivo metu GM+BM-MSCs grupės ţiurkių patelėms buvo suleista po vieną (1×106 _{ląstelių 500 µl be serumo; i.v) mezenchiminių kamieninių ląstelių} injekciją.

6 pav. Neubaerio kameros vaizdas, matomas per mikroskopą. Mėlyna spalva paţymėti kvadratai, kuriuose skaičiuojamos ląstelės

[82]

7 pav. Ląstelės skaičiuojamos ant viršutinės ir kairinės kraštinės [83]

Ląstelių koncentracijos apskaičiavimas:

2.3. Pasiruošimas eksperimentui in vivo

Laboratoriniai gyvūnai eksperimento metu buvo laikomi specialiuose metaboliniuose narvuose, kurie pritaikyti gyvūnų stebėjimui eksperimento metu (8 pav.). Patalpose, kuriose buvo laikomos ţiurkės buvo uţtikrinta pastovi temperatūra (21,0±2,5°C) bei santykinė oro drėgmė (50–55 proc.). Dienos ir nakties rėţimas buvo keičiamas kas 12 valandų. Šviesa įjungiama 8 val. ryto, išjungiama 20 val. Ţiurkių adaptacijos prie narvų laikotarpis truko 2 paras.

8 pav. Metabolinis narvas [84]

Metabolinio narvo konstrukcija pritaikyta ţiurkių gyvavimui stebėti eksperimento laikotarpiu: 1. Vandens gertuvė, talpa 250 ml, galima stebėti ţiurkių suvartotą vandens kiekį;

2. Graduotas šlapimo surinkimo indas, stebimas eksperimentinio gyvūno diurezės pokytis; 3. Narvas, kuriame būna gyvūnas, galima stebėti gyvūno elgseną;

4. Pašaro vieta.

Eksperimentiniai gyvūnai viso eksperimento metu buvo šeriami visaverčiu granuliuotu pašaru, skirtu pelėms ir ţiurkėms, girdomi geriamuoju vandeniu ad libitum. Pašaro sudėtis: sausumos gyvūnų produktai (30%), javų grūdai, javų produktai, aliejinių augalų sėklos, jų produktai, šakniavaisiai ir jų produktai (5%), vaisiai, jų produktai, mineralai. Technologiniai priedai: konservantas, antioksidantai. Jusliniai priedai: kvapusis junginys. Maistiniai priedai: vitaminai: A-12000 TV/kg (E672), D3-1200 TV/kg (E671), E-100 mg/kg, kiti vitaminai. Mikroelementų junginiai: Zn (cinko oksidas) 150 mg/kg (E6), J (kalcio jodido heksidratas) 2 mg/kg (E2), Cu (vario sulfato pentahidratas) 15 mg/kg (E4), Se (natrio selenitas) 0,4 mg/kg (E8), Mn (magnio oksidas) 8 mg/kg(E5), Fe (geleţies sulfato monohidratas) 200 mg/kg (E1). Amino rūgštys. Analitinės sudedamosios dalys: ţali baltymai 20,0 proc., neapdoroti aliejai ir riebalai 12,0 proc., ţalia ląsteliena – 3,0 proc., ţali pelenai 8,0 proc.

4

1

1

1

3

2

Kiekvienas eksperimentinis gyvūnas, prieš talpinant jį į metabolinį narvą, buvo pasveriamas analitinėmis PJL Kern 3500-2NM svarstyklėmis (Kern & Sohn GmbH, Vokietija), svoris uţrašomas ant metabolinio narvo. Masė taip pat reikalinga, norint apskaičiuoti gentamicino kiekį, kurį reikės suleisti eksperimentiniam gyvūnui, kad būtų sukeltas ūminis inkstų paţeidimas.

Ţiurkės eksperimento metu buvo laikomos metaboliniuose narvuose ant kurių markeriu buvo paţymėtas ţiurkės numeris, dozė, kiek reikės suleisti gentamicino ir svoris.

2.3.1. Gentamicino dozės apskaičiavimas

Gentamicino (GM) injekcijos dozė buvo apskaičiuojama individuliai kiekvienam eksperimentiniam gyvūnui pagal jo kūno svorį (kg), kuris buvo nustatomas prieš eksperimentą jį pasveriant laboratorinėmis svarstyklėmis. Toksinė gentamicino injekcinio tirpalo dozė 80 mg/d/kg parinkta remiantis moksline literatūra. Gentamicino dozė (ml), kurią reikėtų sušvirkšti buvo apskaičiuojama pagal proporciją.

Kadangi GM dozė yra 80 mg/d/kg, todėl 1000 g reikės suleisti 80 mg GM per dieną, tačiau ţiurkės svoris yra maţesnis nei kilogramas. Naudotas gentamicino injekcinis tirpalas, kurio dozė yra 40 mg/ml (Krka).

Pavyzdys: Ţiurkės svoris 200g (m0,200 kg). Gentamicino injekcinio tirpalo dozė 80 mg/d/kg. Gentamicino dozė, kurią reikės sušvirkšti gyvūnui:

1000 g – 80 mg GM 200 g – x mg GM

x = 16 mg GM

1ml – 40 mg GM

x ml – 16 mg GM

2.3.2. Eksperimento modelis ir jo eiga

Inkstų nefrotoksiškumo modelio eksperimentiniai gyvūnai buvo suskirstyti į tris grupes: kontrolinė grupė, sveiki gyvūnai, kuriems eksperimento metu nebuvo leidţiamas nei gentamicinas, nei kamieninės ląstelės, GM grupė, ţiurkės kurioms leistos tik gentamicino injekcijos 7 paras iš eilės, GM+BM-MSCs grupė, kurios ţiurkėms taikyta BM-MSCs terapija, šios grupės gyvūnams buvo leistas gentamicinas 7 paras iš eilės ir parą po paskutinės gentamicino injekcijos, į uodegos veną buvo suleista

viena BM-MSCs 1×106 ląstelių 500 µl injekcija. Kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės buvo išskirtos iš ţiurkės patinėlio šlaunikaulio kaulų čiulpų. Po kamieninių ląstelių suleidimo, sekė inkstų regeneracijos fazė, kuri truko 14 parų, kurios metu ţiurkės buvo laikomos įprastomis sąlygomis. Po šios fazės, 21 eksperimento parą, visoms ţiurkėms buvo vykdoma eutanazija – asfiksija CO2 dujomis. Ţiurkės eksperimento metu pavaizduotos 9 paveikslėlyje.

9 pav. Ţiurkės eksperimento in vivo metu

Eksperimento in vivo modelį sudarė šie etapai:

1. D0 – Gyvūnų adaptacijos fazė, truko dvi paras, kurios metu gyvūnai apsipranta su naujomis gyvenimo sąlygomis. Šlapimo ir kraujo mėginių ėmimas.

2. D1 – Pradedamas leisti gentamicinas septynias paras iš eilės. Šio etapo tikslas eksperimentiniams gyvūnams sukelti ūminį inkstų paţeidimą.

3. D7 – Baigiamas leisti gentamicinas.

4. D8 – GM+BM-MSCs grupės ţiurkėms į uodegos veną leidţiamos kaulų čiulpų mezenchiminės kamieninės ląstelės (1×106 _{ląstelių 500 µl be serumo). Po ląstelių} suleidimo sekė inkstų regeneracijos fazė. Šlapimo ir kraujo mėginių ėmimas. 5. D14 – Šlapimo ir kraujo mėginių ėmimas.

6. D21 –Šlapimo ir kraujo mėginių ėmimas. Eksperimentinių gyvūnų eutanazija. (10 pav.).

10 pav. In vivo eksperimento modelis.

2.3.3. Diurezės kiekio vertinimas

Visų trijų grupių ţiurkių paros šlapimas kiekis (ml/parą) buvo vertinamas parą prieš pirmą gentamicino injekciją (D0), praėjus parai po paskutinės gentamicino injekcijos (D8), inkstų regeneracijos fazės metu (D14) bei paskutinę eksperimento parą (D21). Šlapimo kiekis buvo vertinamas graduotu šlapimo surinkimo cilindru.

2.3.4. Biocheminių rodiklių vertinimas

Buvo vertinami surinkti šlapimo ir kraujo mėginių rodiklių duomenys. Tirti šie biocheminiai rodikliai:

- Kreatinino koncentracija šlapime (µmol/l) - Kreatinino koncentracija kraujo serume (µmol/l)

Šlapimo bei kraujo mėginiai buvo imami visų trijų grupių eksperimentiniams gyvūnams tomis pačiomis eksperimento paromis, kad būtų gauti tikslūs duomenys ir galima palyginti kiekvienos grupės būklę bei rodiklių kitimo eigą, kuri nusako inkstų funkciją.

Šlapimo ir kraujo mėginiai buvo imami parą prieš pirmą gentamicino injekciją (D0), kad būtų nustatytos normalios tiriamų fiziologinių rodiklių reikšmės. Vėliau mėginiai imti praėjus parai po paskutinės gentamicino injekcijos (D8), kad būtų matyti, kokią inkstų paţaidą sukėlė gentamicinas, bei kaip ši nefrotoksinė medţiaga paveikė inkstų funkciją bei biocheminius rodiklius. Vėliau mėginiai buvo imami inkstų regeneracijos fazės viduryje (D14) bei paskutinę eksperimento parą (D21).

Šlapimo mėginiai buvo renkami į vienkartinius sterilius plastiko mėgintuvėlius, kurie buvo suţymimi: ţymimas ţiurkės numeris, data, kada paimtas mėginys. Mėginiai buvo laikomi specialiame termose iki buvo pristatyti laboratoriniams tyrimams.

Kraujo mėginiai buvo imami iš uodegos venos, renkami į vienkartinius sterilius plastiko centrifūginius mėgintuvėlius. Iki pristatymo į laboratoriją kraujo mėginiai buvo laikomi -20°C temperatūros šaldiklyje.

Kraujo bei šlapimo mėginiai buvo tiriami LSMU Veterinarijos akademijos gyvūnų reprodukcijos skyriaus laboratorijoje, Kaune.

2.3.5. Glomerulų filtracijos greičio vertinimas

Glomerulų filtracijos greitis (GFG) yra vienas geriausių būdų įvertinti inkstų funkciją pagal pasaulinių ekspertų grupių K/DOQI (angl. Kidney Disease Outcome Quality Initiative) ir KDIGO((angl.

Kidney Disease Improving Global Outcomes) rekomendacijas [85]. Endogeninis 24 val. kreatinino

klirensas buvo apskaičiuotas renkant ţiurkių paros šlapimą. Glomerulų filtracijos greitis buvo apskaičiuojamas pagal kreatinino klirensą:

C

=

C

S

U

GFG buvo vertinamas parą prieš pirmą gentamicino injekciją (D0), praėjus parai po paskutinės gentamicino injekcijos (D8), inkstų regeneracijos fazės metu (D14) bei paskutinę eksperimento parą (D21).

2.4. Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė buvo atliekama statistiniu paketu SPSS Statistics 23.0 (IBM, Čikaga, JAV) ir MS Excel (Microsoft Corporation, JAV). Vertinant šlapimo išsiskyrimo kiekį, kreatinino koncentraciją šlapime, kreatinino koncentraciją kraujo serume bei glomerulų filtracijos greitį buvo apskaičiuotas kiekvieno rodiklio vidurkis, standartinis nuokrypis (SN) ir mediana. Kiekybinių kintamųjų vidurkiai grupėse vertinti pagal dispersinę analizę (Anova) ir Bonferroni post hoc testą. Rezultatai buvo laikomi statistiškai patikimais, kai jų patikimumo koeficientas p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Laboratorinių gyvūnų imtis

Vienu metu eksperimentas buvo atliekamas su aštuoniolika Wistar linijos ţiurkių patelių (2-3 mėnesių), po 6 ţiurkių pateles kiekvienoje grupėje. Mezenchiminių kamieninių ląstelių išskyrimas buvo atliekamas su Wistar linijos ţiurkių patinėliu (2-3 savaičių). Eksperimentas kartotas du kartus, statistiškai reikšmingų skirtumų tarp dviejų bandymų nebuvo pastebėta.

3.2. Kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių proliferacija

BM-MSCs proliferacijos eiga pavaizduota 11 paveikslėlyje. Po trijų dienų po ląstelių išskyrimo ląsteles stebint mikroskopu pradėjo ryškėti pavienės apvalios formos ląstelės (a), po 7 dienų po ląstelių išskyrimo buvo matoma daugiau pailgų bei verpstės formos ląstelių, kurios buvo susitelkusios į maţas grupeles, buvo matomi didesni ląstelių kiekiai (b). Po 2 savaičių po ląstelių išskyrimo, didţioji dalis (apie 70 proc.) flakono paviršiaus buvo padengta verpstės formos ląstelėmis, kurios buvo susitelkusios į didesnes grupelės (c).

11 pav. Tipinė mezenchiminių kamieninių ląstelių proliferacijos eiga in vitro (a – ląstelės po 3 dienų po išskyrimo, b – po 7 dienų po išskyrimo, c – po 2 savaičių po išskyrimo)

Stebint mezenchiminių kamieninių ląstelių proliferaciją buvo gaunami panašūs duomenys, kokius gauna kiti tyrėjai savo darbuose: pradţioje ląstelės būdavo pavienės, apvalios formos, vėliau jų

išryškėdavo daugiau, forma tapdavo pailgesnė, kol galiausiai susiformuodavo būdingos, verpstės formos, prie plastiko prilipusios ląstelės. Ląstelės savo augimo piką pasiekdavo per 2 savaites [81, 86].

3.3. Charakterizavimo duomenys

Imunofluorescencinio tyrimo metu buvo nustatinėjami šie ląstelių paviršiaus ţymenys: CD45, CD34, CD90, CD117 (c-kit). Buvo nustatyta, kad mezenchiminės kamieninės ląstelės neekspresuoja CD34, CD117 (c-kit) ir CD45 bioţymenų, (ekspresija <1%), tačiau gausiai ekspresuoja CD90 (ekspresija >98%). Pateikiami ekspresuotų bioţymenų duomenys, kurie įrodė, kad tiriamos ląstelės yra mezenchiminės. Kiti autoriai charakterizuodami BM-MSCs iš ţiurkių ir pelių taip pat daţnai naudoja tokius pačius ląstelių paviršiaus ţymenis ir gauna panašius duomenis: CD45, CD34 hematopoetinių ir endotelinių bioţymenų nebuvimą, CD117 (c-kit) kamieninių ląstelių augimo faktoriaus nebuvimą, mezenchiminių kamieninių ląstelių bioţymens CD90 aukštą ekspresijos dydį [87]. Bioţymenų ekspersijos mikroskopinis vaizdas pateikiamas 12 paveikslėlyje.

CD90 CD117 (c-kit)

12 pav. Tipinis bioţymenų mikroskopinis vaizdas. Raudonos rodyklės ţymi branduolius, geltonos rodyklės ţymi ląstelės membraną.

3.4. Reikalavimų mezenchiminių kamieninių ląstelių preparatams įvertinimas

Pagal Europos vaistų agentūros paţangiosios terapijos vaistiniams preparatams gaires, norit apibūdinti mezenchimines kamienines ląsteles kaip farmacinį preparatą, reikia įvykdyti jam keliamus reikalavimus. Darbe buvo aptarti keli reikalavimai, kurie apibūdintų šias ląstelės kaip farmacinį preparatą: eksperimentinio preparato pradinės medţiagos ir gamybos procesas, tai yra pačios ląstelės ir jų išskyrimo bei kultivavimo procedūra, paruošimas injekcijai. Ląstelių tapatybė ir grynumas įrodyti imunofluorescenciniu metodu, naudojant specifinius ląstelių paviršiaus ţymenis. Antroje lentelėje pateikiami Europos vaistų agentūros reikalavimų palyginimas su darbe aptartais reikalavimais.

2 lentelė. Europos vaistų agentūros reikalavimų palyginimas su darbe aptartais reikalavimais EMA keliami reikalavimai Darbe aptarti reikalavimai

Produkto kokybė ir gamyba o Pradinės medţiagos o Gamybos procesas o Ląstelių charakteristika - Ląstelių tapatumas - Grynumas - Priemaišos - Dozės stiprumas - Tumorogeniškumas o Kokybės kontrolė - Medžiagos atsipalaidavimas - Stabilumo testai

- Testai kombinuotiems produktams o Gamybos proceso validacija

o Produkto kūrimas o Suderinamumas Aptarta Aptarta Aptarta Aptarta Ikiklinikinis vystymas o Farmakologija o Toksikologija Klinikiniai aspektai o Farmakodinamika o Farmakokinetika

o Dozės nustatymo studijos o Preparato veiksmingumas o Saugumas

3.5. Šlapimo kiekio duomenys

Pirmas šlapimo kiekio vertinimas buvo atliekamas parą prieš pirmą gentamicino injekciją (D0). Visų trijų grupių šlapimo kiekių vidurkiai buvo panašūs ir reikšmingų skirtumų nebuvo fiksuojama. Aštuntą eksperimento parą buvo stebimas GM ir GM+BM-MSCs grupių šlapimo kiekio padidėjimas: GM grupės šlapimo vidurkis buvo 22 ml/24val (standartinis nuokrypis (SN)=5, mediana 22,0) GM+BM-MSCs grupės 26 ml/24val (SN=5,5, mediana 25). Keturioliktą eksperimento parą vis dar buvo stebimas GM ir GM+BM-MSCs grupių šlapimo kiekių padidėjimai: GM grupės 21,7 ml/24val (SN=5,2, mediana 20,0) GM+BM-MSCs grupės 23,3 ml/24val (SN=6,8, mediana 22,5). Paskutinę eksperimento parą (D21) GM ir GM+BM-MSCs grupių šlapimo kiekis, lyginant su kontroline grupe, vis dar buvo padidėjęs. GM ir GM+BM-MSCs grupių šlapimų kiekiai buvo panašūs: GM grupės 13,3 ml/24val (SN=4,1, mediana 12,5), GM+BM-MSCs grupės 13,0 ml/24val (SN=6,3, mediana 10,0) ir statistiškai reikšmingų pokyčių tarp šių grupių viso eksperimento metu nebuvo. Šlapimo kiekio kitimo grafikas pateikiamas 14 paveikslėlyje.

14 pav. Šlapimo kiekio (ml/24val) kitimo grafikas (* - p<0,05, Wistar ţiurkės n=6)

*

*

*

3.6. Biocheminiai šlapimo ir kraujo duomenys

Pirmas kreatinino koncentracijos šlapime kiekio vertinimas buvo vykdomas parą prieš pirmąją gentamicino injekciją (D0). Šiame taške visų trijų grupių kreatinino koncentracija buvo panaši, trijų grupių kreatinino vidurkis buvo 6576 µmol/l, (SN=967,17, mediana 6275) ir statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Praėjus parai po paskutinės gentamicino injekcijos (D8), kreatinino koncentracijos šlapime kiekis GM ir GM+BM-MSCs grupių mėginiuose buvo beveik dvigubai maţesnis nei kontrolinės grupės, palyginimui, kontrolinės grupės kreatinino koncentracijos šlapime kiekis buvo 6850 µmol/l (SN=983, mediana 6289) tuo tarpu GM grupės 3050 µmol/l (SN=1160, mediana 3000), GM+BM-MSCs grupės 2883 µmol/l (SN=1514, mediana 2975). 14 eksperimento parą GM+BM-MSCs grupės kreatinino koncentracijos šlapime kiekis buvo didesnis nei GM grupės, atitinkamai 3726,3 µmol/l (SN=1951, mediana 4100) ir 2950 µmol/l (SN=1867, mediana 2600), Paskutinę eksperimento parą (D21) GM+BM-MSCs grupės ţiurkių kreatinino koncentracijos šlapime kiekis buvo 4933 µmol/l (SN= 905, mediana 5173) ir artėjo link kontrolinės grupės: 7021 µmol/l (SN= 766, mediana 6289). GM grupės gyvūnų kreatinino koncentracijos vidurkis buvo maţiausias – 3333,8 µmol/l (SN=502, mediana 3202). Paskutinę eksperimento parą (D21) GM+BM-MSCs grupės gyvūnų kreatinino koncentracija šlapime statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo GM grupės (p=0,014). Kreatinino koncentracijos šlapime kitimas visose trijose tiriamosiose grupėse pavaizduotas 15 paveikslėlyje.

15 pav. Kreatinino koncentracijos šlapime kiekio (µmol/l) kitimo grafikas (* - p<0,05, Wistar ţiurkės n=6)

Kreatinino koncentracija tiriamųjų gyvūnų kraujo serume buvo nustatinėjama parą prieš pirmą gentamicino injekciją (D0) ir statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Visų trijų grupių duomenys buvo panašūs, trijų grupių vidurkis 49,9 µmol/l (SN=13,61, mediana 45,0). Praėjus parai po paskutinės gentamicino injekcijos (D8), stebimas GM ir GM+BM-MSCs grupių kreatinino koncentracijos padidėjimas: GM grupės 139 µmol/l (SN=27,8, mediana 129,5) GM+BM-MSCs grupės 124,5 µmol/l (SN=40,1, mediana 114,0). Statistiškai reikšmingai skyrėsi paskutinės eksperimento paros (D21) GM ir GM+BM-MSCs grupių duomenys (p=0,006), kai GM grupės kreatinino koncentracijos serume vidurkis buvo 79,5 µmol/l (SN=12,5, mediana 81,0) tuo tarpu GM+BM-MSCs grupės vidurkis buvo 51,2 µmol/l (SN=9,9, mediana 54,0). Kreatinino koncentracijos kitimas kraujo serume eksperimento metu pateikiamas 16 paveikslėlyje.

*

*

*

*

16 pav. Kreatinino koncentracijos kraujo serume kiekio (µmol/l) grafikas (* - p<0,05, Wistar ţiurkės n=6)

2013 metais atliktas eksperimentas, kurio metu buvo tiriamas BM-MSCs ląstelių poveikis ŪIP, kuris buvo sukeltas nefrotoksine medţiaga cisplatina. Šio eksperimento metu naudoti tokie patys tiriamieji gyvūnai – Wistar linijos ţiurkės, taikyta tokia pati BM-MSCs ląstelių terapija (1×106

ląstelių 500 µl i.v.) ir nustatinėjami tokie patys rodikliai: kreatinino koncentracija kraujo serume ir kreatinino koncentraciją šlapime. Gauti panašūs duomenys – padidėjusi kreatinino koncentraciją šlapime bei sumaţėjusi kreatinino koncentracija kraujo serume eksperimentiniams gyvūnams, kuriems buvo taikyta BM-MSCs ląstelių terapija, lyginant su gyvūnais, kuriems ši terapija netaikyta [64].

3.7. Glomerulų filtracijos greičio duomenys

Parą prieš pirmą gentamicino injekciją (D0), visų trijų grupių GFG buvo panašus ir statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Aštuntą eksperimento parą GM ir GM+BM-MSCs grupių GFG reikšmingai sumaţėjo, lyginant su kontroline grupe, kuomet GM grupės GFG vidurkis buvo 0,28 ml/min, (SN= 0,14, mediana 0,24), GM+BM-MSCs grupės vidurkis 0,33 ml/min (SN=0,21, mediana 0,23). Eksperimento pabaigoje (D21) GM+BM-MSCs grupės gyvūnų GFG vidurkis beveik susilygino su kontrolinės grupės

*

*

*

gyvūnų GFG, atitinkamai 0,62 ml/min kontrolinės grupės ir 0,61 ml/min GM+BM-MSCs grupės. Tendencingai, tačiau statistiškai nereikšmingai (p=0,089) skyrėsi GM ir GM+BM-MSCs duomenys: GM grupės vidurkis 0,40 ml/min (SN=0,13, mediana 0,41) GM+BM-MSCs grupės vidurkis 0,61 ml/min (SN=0,18, mediana 0,86). Glomerulų filtracijos greičio grafikas pateikiamas 17 paveikslėlyje.

17 pav. Glomerulų filtracijos greičio (ml/min) kitimo grafikas (* - p<0,05, Wistar ţiurkės n=6)

Tyrimo metu buvo stebima, ar BM-MSCs turi poveikį inkstų funkcijos atsistatymui po ŪIP, kurį sukėlė gentamicinas. Įvairiuose gyvūnų modeliuose ŪIP daţnai sukeliamas naudojant nefrotoksinę medţiagą gentamiciną, kurio dozė būna 80 mg/kg/d 7 paras iš eilės [27]. Kiti mokslininkai taip pat yra taikę kaulų čiulpų mezenchiminių kamieninių ląstelių terapiją ŪIP modeliuose, kuriuose kaip nefrotoksinė medţiaga naudotas gentamicinas [7, 88, 89], todėl negalima teigti, kad šis tyrimas unikalus. Tačiau kiti tyrėjai vertindavo kitokius rodiklius inkstų funkcijai stebėti nei šiame darbe: inkstų svorį, interliaukinų, ląstelių signalinius proteinų (citokinų) kiekį, interferonų kiekį kraujo plazmoje, tačiau jie visi gaudavo duomenis, kurie įrodydavo BM-MSCs teigiamą poveikį inkstų funkcijai po ŪIP.

*

*

4. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Nepaisant didelio skaičiaus tyrimų, iki galo nėra aiškus BM-MSCs ląstelių veikimo mechanizmas ŪIP gydyme bei šių ląstelių diferenciacijos geba. Vieni mokslininkai teigia, kad šios ląstelės geba diferencijuotis į inkstų kanalėlio ląsteles, kol kiti tvirtina, kad diferenciacijos geba ribota. Todėl reikia atlikti daugiau tyrimų, kad iki galo būtų išaiškintas šių ląstelių veikimo mechanizmas.

2. BM-MSCs ląstelių proverţį klinikinėje praktikoje stabdo klinikinių tyrimų su ţmonėmis stoka. Šiuo metu yra atliekami tik trys tokie klinikiniai tyrimai. Galbūt, kad įvyktų norimas proverţis, reikia atlikti daugiau ikiklinikinių tyrimų su įvairias gyvūnais, nes šiuo metu dauguma tyrimų yra atliekama su ţiurkėmis ir pelėmis.