Paratuberkuliozės paplitimo analizė galvijų populiacijoje

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Žydrūnė Gustauskienė

Paratuberkuliozės paplitimo analizė galvijų populiacijoje

Analysis of Paratuberculosis Prevalence in Cattle

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Paratuberkuliozės paplitimo analizė galvijų populiacijoje“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO ... ... ...

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

TURINYS

1.4 Pataloginiai anatominiai pokyčiai...12

1.5 Epidemiologija...12 1.6 Ligos diagnozavimas ...14 1.6.1 MAP identifikacija ...14 1.7 Kontrolė ...16 1.9 Gydymas ...18 2. MEDŽIAGOS IR METODAI ...19 2.1 Tyrimo principas...20

2.1.1 Apžvalginis IFA metodas...20

2.1.2 Patvirtinamasis IFA metodas ...21

3. TYRIMO REZULTATAI ...24

3.1 Serologinių tyrimų analizė skirtinguose ūkiuose...32

4. REZULTATŲ APTARIMAS ...36

IŠVADOS...38

SANTRUMPOS

IFA – Imunofermentinė analizė;

IDAG – Imunodifuzijos reakcija agaro gelyje; PTB – Paratuberkuliozė;

MAP – Mycobacterium avium paratuberculosis; JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos;

ZN – Zylio Nilseno dažymo metodas; HEYM – Herolld‘s Egg Yolk agar; PGR – Polimerazinė grandininė reakcija; SNP – Single nucleotide polymorphism; OT – Optinis tankis;

NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas; LI – Limuzinai;

LJ – Lietuvos juodmargiai; DJ – Danijos juodmargiai; H – Holšteinai;

GJ – senojo genotipo Lietuvos juodmargiai; LŽ – Lietuvos žalieji;

DŽ – Danijos žalieji; AA – Angusai; AB – Aubrakai.

SANTRAUKA

Paratuberkuliozės paplitimo analizė galvijų populiacijoje Žydrūnė Gustauskienė

Magistro baigiamasis darbas

Darbo apimtis: 43 puslapiai, 13 paveikslų, 6 lentelės.

Darbo tikslas išanalizuoti ir įvertinti paratuberkuliozės sukėlėjo išplitimą galvijų populiacijoje 2008 – 2014 metais.

Paratuberkuliozė yra viena iš galvijų infekcinių ligų, paplitusi visame pasaulyje. Informacija apie paratuberkuliozės paplitimą Lietuvos galvijų ūkiuose, leistų tinkamai įvertinti esamą situaciją ir imtis tam tikrų veiksmų siekiant sumažinti ekonominius nuostolius.

Darbe analizuojami 2008 – 2014 metais atlikti tyrimai paratuberkuliozės atžvilgiu. Per šį laikotarpį ištirta 14861 kraujo serumo mėginių. Mėginiai tirti imunofermentinės analizės (IFA) metodu, naudojant akredituotus IDEXX diagnostinius rinkinius. Serologiškai ištyrus kraujo serumo mėginius antikūnai prieš paratuberkuliozės sukėlėją buvo nustatyti 223 galvijams, tai sudaro 1,5 proc. visų tirtų galvijų nuo 2008 iki 2014 metų. Galvijų kraujo serumo mėginiai (n= 14861) surinkti iš 44 Lietuvos rajonų priklausančių 10 Lietuvos apskričių. Taip pat, mėginiai buvo siunčiami iš Latvijos. Ištyrus kraujo serumo mėginius iš 10 Lietuvos apskričių tik iš Telšių apskrities siųstuose mėginiuose nebuvo rasta antikūnų prieš paratuberkuliozės sukėlėją. Mėginiuose iš Alytaus rajono aptikta didžiausias seroteigiamų mėginių skaičius iš viso 137 mėginiai. Taip pat pastebima tendencija, jog paratuberkuliozė labiausiai paplitusi pas suaugusius galvijus, kurių amžius svyruoja nuo 2 iki 10 metų amžiaus.

SUMMARY

Analysis of Paratuberculosis Prevalence in Cattle Žydrūnė Gustauskienė

Master‘s Thesis

Volume of work: 43 pages, 13 pictures, 6 tables.

Paratuberculosis is one of the bovine infectious disease prevalent worldwide. Information about the prevalence of paratuberculosis in Lithuanian cattle farms would allow a proper assessment of the situation and take appropriate actions in order to reduce economic losses. The purpose of study is analyze and estmate the spread of bovine paratuberculosis pathogen in population on 2008 - 2014 years.

The study analyzes research of paratuberculosis in 2008 - 2014 years. During this period were examined 14861 blood serum samples. They were investigated with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using accredited IDEXX diagnostic kits. The seroprevalence study of blood serum samples for antibodies to the agent of paratuberculosis were ascertain in 223 cattles, 1.5 percent of all animals tested from 2008 to 2014. Bovine serum samples (n = 14861) collected from 44 districts belonging to 10 regions of Lithuania. Furthermore the samples were sent from Latvia. Examination of blood serum samples from 10 regions of Lithuania shown that only in region of Telsiai has not been found antibodies against paratuberculosis agent. In Alytus district were found the highest number of seropositive samples, total 137 samples. There is also a trend that Paratuberculosis most prevalent in adult animals, whose age range from 2 to 10 years old.

ĮVADAS

Paratuberkuliozė dar kitaip vadinama Džono liga (JD) yra chroniška, progresuojanti atrajotojų žarnyno liga, kuriai būdingas lėtinis infekcinis enteritas (1–9). Ligos sukėlėjas Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis (MAP) (10).

Liga pirmą kartą buvo pastebėta 1800 m. pradžioje, tačiau tik 1895m. Henrikas Albertas Džonas ir Frotingmanas įrodė mikobakterijų buvimą užsikrėtusiuose galvijuose. Iki 1900 m. pradžios liga buvo pasireiškusi keliose Europos valstybėse ir Jungtinėse Amerikos Valstijose. Nuo tada ji išplito visame pasaulyje ir egzistuoja iki dabar (11). Liga pripažinta turinti didelę reikšmę gyvūnų sveikatai ir padaranti didelius ekonominius nuostolius visame pasaulyje (12).

Remiantis Pasaulinės gyvūnų sveikatos organizacijos duomenimis (PGSO) paratuberkuliozės paplitimas užregistruotas daugiau nei 70 pasaulio šalių, iš kurių nuo 25 iki 40 yra Europos žemyno šalys (13). Vien JAV paratuberkuliozė pasireiškia 68,1% visų pieninių galvijų bandose. Suskaičiuota, jog kiekvienais metais dėl šios ligos JAV patiria nuo 200 – 250 milijonų dolerių nuostolių (14).

Pagrindiniai ligos simptomai yra viduriavimas, mažėjantis svoris bei sumažėjusi pieno produkcija, išliesėjimas ir silpnumas (15, 16).

MAP šeimininkai yra naminiai ir laukiniai atrajotojai, įskaitant mėsinius ir pieninius galvijus, ožkas, avis, elnius ir kupranugarius. Tačiau kiti laukiniai gyvūnai ne atrajotojai tokie kaip lapės, žebenkštis, varnos, žiurkės, pelės, triušiai, barsukai taip pat gali būti nešiotojais (17, 18). Didžiausia tikimybė užsikrėsti fermose yra veršeliams, o dažniausias užsikrėtimo šaltinis – naminių atrajotojų išmatos (17).

Didžiausias paplitimas lyginant su kitais atrajotojais ir pastebėtas pas pieninius galvijus (19). Daliai galvijų apie 10 proc. lėtinė infekcija išsivysto į mirtinai progresuojančią ligos formą, kuri tęsiasi visą gyvenimą. Paratuberkuliozei yra būdingas ilgas inkubacinis periodas apie 1,5–2 metus, kurio metu infekcija platinama ir kitiems fermos gyvūnams (20). Liga sukelia didelius ekonominius nuostolius dėl sumažėjusios produkcijos ir išankstinio skerdimo (21) taip pat dėl prastų reprodukcinių savybių, bei sumenkusios skerdenos vertės (22). Kyla daug diskusijų ar MAP susijusi su žmonių Krono liga (23).

Darbo tikslas: išanalizuoti ir įvertinti paratuberkuliozės sukėlėjo išplitimą galvijų populiacijoje 2008 – 2014 metais.

Darbo uždaviniai:

1. Išanalizuoti serologinių tyrimų dinamiką paratuberkuliozės atžvilgiu Lietuvoje ir nustatyti ligos paplitimą pagal apskritis ir tyrimo tikslą.

2. Išnagrinėti paratuberkuliozės paplitimą galvijų populiacijoje pagal gyvūnų amžių, lytį ir veislę.

3. Išanalizuoti sezoniškumo įtaką PTB pasireiškimui.

4. Išnagrinėti pasirinktus tris galvijų ūkius ir išanalizuoti galvijų amžiaus įtaką PTB pasireiškimui šiuose ūkiuose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.MAP bakterija

MAP yra silpnai gram teigiama, lazdelės formos, dalinai rūgščiai atspari, aerobinė bakterija (24). Jos dydis siekia 0,5–1,5 μm, ji atspari įprastoms dezinfekavimo priemonėms (25). MAP yra viena iš lėčiausiai augančių mikobakterijų ir jas, kaip ir kitas patogeniškas bakterijas sunku aptikti ir gydyti (26).

Kaip ir kitos Mycobacteriaceae genties bakterijos, ji turi unikalią sienelės struktūrą, kurioje gausu kompleksinių lipidų. Stora ir chemiškai savita ląstelės sienelė yra pagrindas, kodėl mikobakterijos yra tokios atsparios aplinkos sąlygoms ir šeimininkų imuninėms ląstelėms. Bakterijos patogeniškumas yra susijęs su jų augimo tempu. Paradoksalu, bet lėtai augančios mikobakterijos yra labiau virulentiškos, už greitai augančias (27). Nustatyta, kad in vitro auga apie 8 – 16sav (28).

Išskirti 2 MAP tipai: galvijų tipas C, ir avių tipas S. Paratuberkuliozę galvijams, ožkoms, elniams ir kupranugariams sukelia tipas C, ir tik avims tipas S. Tačiau, galvijų tipas gali užkrėsti avis ir atvirkščiai (17). MAP negali augti ir daugintis aplinkoje, kadangi, ji pati negali savarankiškai gaminti baltymo mikobaktino. MAP gali daugintis tik šeimininko makrofaguose, panaudodama geležį. Nors MAP daugintis reikia šeimininko makrofagų, tačiau ji gali išgyventi išmatose, vandenyje ar šlapime iki 250 dienų, tai priklauso nuo išmatų kosistencijos ir temperatūros (29,30).

1.2 Patogenezė

MAP bakterija patekusi į organizmą pro virškinamąjį traktą, skverbiasi į žarnų sienelę pro plonųjų žarnų gleivinę. Pirmiausia, bakterijos patenka į klubinės žarnos sritį pro M ląsteles (specializuotas absorbuojančias gleivinės ląsteles), esančias ant Pejerio plokštelių. Šiame etape bakterijos atsparios viduląsteliniam naikinimui, todėl galiausiai yra fagocituojamos poepitelinių makrofagų. Tuo metu, kai bakterijos yra gleivinėje ir poepiteliniuose makrofaguose, organizmo reakcija į infekciją yra maža arba jos visiškai nėra. Toks užsitęsęs humoralinės imuninės sistemos atsakas yra priežastis, lemianti serologinių MAP testų mažą jautrumą (17).

Ilgainiui, užkrėsti makrofagai vietinėmis limfagyslėmis patenka į regioninius limfinius mazgus. Juose organizmas geba stimuliuoti uždegimines reakcijas ir imuninį atsaką. Daugelis gyvūnų, ląstelinį imuninį atsaką sukelia pasitelkdami įvairias ląsteles, iš kurių svarbiausi T limfocitai. T helperių išskiriami citokinai, ypač gama interferonas, taip pat padeda sukurti apsauginį atsaką į mikobakterinę infekciją. Nustatyta, jog šio citokino gamyba yra pagrindinis žingsnis link atsparumo mikobakterinėms ligoms, ir gali padėti nustatyti užsikrėtimą, ligos pradžioje. Tyrimais įrodyta, kad kai kurių karvių ląstelinis imuninis atsakas gali kontroliuoti infekciją, ir tokiems gyvūnams nepasireiškia klinikiniai požymiai, tačiau jie lieka slapti nešiotojai visą gyvenimą (17).

Įprastai MAP lėtai dauginasi klubinės žarnos gleivinėje ir regioniniuose limfiniuose mazguose. Tačiau prasta mityba, stresas transportuojant, laktacija, nėštumas ir imunosupresiniai veiksniai (pvz. galvijų virusinės diarėjos virusas) pagreitina klinikinę paratuberkuliozės eigą. Visų pirma, makroskopiniai pokyčiai yra pastebimi klubinėje žarnoje, vėliau patenka į žarnų pasaito limfinius mazgus. Žarnų sienelė yra edemiška ir plona, su daugybe skersinių raukšlių, dėl kurių ji tampa panaši į gofruotą kartoną. Serozinės ir žarnų pasaito limfagyslės yra suplonėjusios ir išsiplėtusios. Vėliau dalyvaujant citokinams prasideda raumenų atrofija, išsekimas, alopecija, inkstų pažeidimai, anemija ir leukopenija (17).

1.3 Klinikiniai požymiai

MAP sukeliama galvijų paratuberkuliozė yra skirstoma į 4 etapus, kurie priklauso nuo klinikinių simptomų pasireiškimo, nešiotojų paplitimo aplinkoje ir gyvūnų atsparumo infekcijoms (17,32).

Šis etapas dažniausiai apima galvijus, iki 2 metų amžiaus. Jis vadinamas tyliuoju, nes šiame periode nepasireiškia klinikiniai simptomai, nėra žymaus skirtumo skiriančio pirmąjį ir antrąjį ligos periodus, ir galiausiai šiame etape nėra efektyvaus diagnostinio testo, galinčio tiksliai nustatyti užsikrėtimą. Tačiau, užsikrėtę gyvūnai šiame etape platina ligos sukėlėją tvartuose ir aplinkoje, taigi, yra infekcijos nešiotojai (17).

Slaptasis periodas

Šiame periode užsikrėtusiems gyvūnams vis dar nėra pasireiškę klinikinių ligos požymių. Tačiau, jau yra galimybė nustatyti ligos sukėlėją. Vienas iš būdų aptikti sukėlėją tai paimti išmatų mėginį. Nors viduriavimas yra vienas iš pagrindinių ligos simptomų, tačiau nėra tikslus identifikuojant MAP išmatų kultūrose. Taip yra todėl, kad kai kurių gyvūnų išmatose yra labai mažas MAP kiekis ir testai nėra tikslūs, tačiau šie gyvūnai vis tiek yra MAP nešiotojai ir platintojai. Atliekant serologinius ir histopatologinius testus tik nedaugeliui gyvūnų šiame etape galima aptikti paratuberkuliozės sukėlėją organizme (17).

Klinikinis periodas

Pirmasis akivaizdus požymis yra viduriavimas, laipsniškai netenkant svorio turint normalų apetitą. Nuo 3 iki 6 mėnesių svoris krenta, o išmatų konsistencija tampa vis skystesnė. Viduriavimas gali būti pastovus arba besikeičiantis. Po truputį ima mažėti pieno produkcija. Apetitas, temperatūra, kvėpavimo dažnis, širdies plakimas yra normos ribose. Šiame periode daugumai užsikrėtusių gyvūnų kraujo serume padidėjęs antikūnų kiekis. Paskaičiuota, kad tik nuo 10 iki 15 proc. užsikrėtusių gyvūnų pasiekia šį ligos etapą, kadangi, dažniausiai yra išbrokuojami dėl sumažėjusio produktyvumo (17).

Pažangesnis klinikinis periodas

Tik nedidelė dalis apie 10 proc. užsikrėtusių galvijų pasiekia mirtiną formą (33). Kliniškai užsikrėtęs gyvūnas, jeigu nebūna išbrokuotas tuomet tampa letargišku, silpnu ir išsekusiu. Vandeningas viduriavimas, hipoproteinemija ir edema būdinga šiam periodui. Taip pat galvijams būdinga anemija ir vis didėjantis silpnumas. Daugiausia gyvūnų brokuojami dėl nuolatinio arba su pertraukomis viduriavimo, sumažėjusios pieno produkcijos ir svorio (17).

1.4 Patologiniai anatominiai pokyčiai

Skrodimo metu skerdena gali būti itin sulysusi ir išsekusi. Ant gleivinės nepastebima opų. Žarnų pasaito ir kiti limfiniai mazgai dažniausiai būna padidėję ir išbrinkę (34).

Galvijams virškinamajame trakte pažeidimai dažniausiai prasideda nuo dvylikapirštės žarnos ir tęsiasi iki tiesiosios žarnos (35). Bendriniai organizmo pažeidimai gali būti subtilūs, tačiau žarnynas visada susiraukšlėja ir pastorėja, dažniausiai plonosios žarnos distalinė dalis. Užsikrėtusių gyvūnų žarnyno gleivinė produkuoja geltonai oranžinį pigmentą. Dažnai kaip antriniai pakitimai yra poodinė edema, skysčių susikaupimas kūno ertmėse, bei riebalų atrofija. Generalizuoti pažeidimai apibūdinami kaip enteritas, hiperemija kartais fibrozė, difuzinės granuliomos su epitelioidinių makrofagų ir gigantiškųjų ląstelių susikaupimu ant žarnyno gleivinės (11).

Žarnyno gaurelių gleivinei plonėjant mažėja paviršiaus plotas ir sutrinka absorbcija. Ant jungiamojo audinio ir žarnyno gleivinės infiltruojasi įvairūs makrofagai (11,34).

1.5 Epidemiologija

Paratuberkuliozės sukėlėjas į organizmą patenka per užterštą pašarą, vandenį ar atsivedimo metu per nešvarias darbuotojų rankas, instrumentus. Taip pat gali būti perduodama veisimo metu. Apie 30 proc. veršelių infekcija perduodama atsivedimo metu. Veršeliai gali užsikrėsti per motinos priešpienį, taigi, švari aplinka labai svarbi norint kontroliuoti ligos plitimą. Paratuberkuliozės sukėlėjas taip pat gali daugintis gimdoje, pieno liaukose, ar užsikrėtusių gyvūnų sėklidėse (36).

MAP dažniausiai patenka veršeliams oraliniu būdu per užkrėstą dirvožemį, išmatas (15,37,38). Yra žinoma, kad per išmatas platinamas bakterijų skaičius gali pasiekti iki 108 kolonijas sudarančių vienetų viename grame (39).

Įrodyta, kad daugiau kaip 35 proc. kliniškai sergančių karvių ir 11,6 proc. besimptomių nešiotojų paratuberkuliozės sukėlėją platina su pienu (39). MAP taip pat gali būti perduodama per kūno skysčius: seiles, gimdos ištakas ar su sperma. Naujausiais tyrimais įrodyta, kad MAP gali būti perduodama ir oro lašeliniu būdu. Vertikalus MAP perdavimas labiausiai paplitęs, tačiau horizontalus perdavimas – veršelis veršeliui ar veršelis laukiniam gyvūnui ir atvirkščiai, įskaitant vabzdžius, taip pat yra

įmanomas. Galvijų atsparumui paratuberkuliozės sukėlėjui svarbu yra amžius. Veršeliai labiausiai pažeidžiami per pirmuosius mėnesius (15, 40).

MAP bakterija labai atspari aplinkos sąlygoms. Ganyklose ji gali išgyventi ilgiau nei metus, šlapime gyvybingos išlieka daugiau kaip savaitę laiko, o išmatose išgyvena nuo 8 iki 11 mėn. (34). Tiksli informacija apie paratuberkuliozės sukėlėjo perdavimo kelius yra svarbi, norint ateityje turėti veiksmingesnę ligos kontrolę (21).

2 pav. Paratuberkuliozės paplitimas pasaulyje 2014 metų birželio – gruodžio mėnesiais.(41)

1.6 Ligos diagnozavimas

Diagnostiniai MAP testai skirstomi į tuos, kurie identifikuoja bakteriją ir tuos, kurie nustato organizmo reakciją į infekciją. Šių testų rezultatai nulemia du veiksnius: gebėjimą išskirti užsikrėtusius (Se) ir sveikus (Sp) gyvūnus. Taip vadinamas auksinio standarto metodas, atskiriantis užkrėstus ir neužkrėstus gyvūnus. Tačiau tikslius Se ir Sp rezultatus lemia diagnostinio testo tinkamas pasirinkimas bei tiriamų gyvūnų fiziologinė būklė (17).

Laikas nuo užsikrėtimo iki išmatuojamo imuninės sistemos atsako ir infekcijos platinimo gali svyruoti nuo 2 iki 10 metų. MAP audinių kultūra yra laikoma idealiu auksinio standarto testu, nes gali užfiksuoti mikobakterijų augimą įvairiuose organuose, įskaitant žarnų gleivinę, pogleivinę, bei

regioninius limfinius mazgus, iki imuninio atsako ir bakterijų platinimo per išmatas. Vis dėl to, iš išmatų mėginių išaugintos kultūros yra dažniau naudojamas testas, nes audinių kultūrų surinkimas sudėtingesnis (17).

Ūkių aplinkoje, kur jau buvo anksčiau nustatyta paratuberkuliozė, randama didesnis kiekis bakterijų ir pasireiškia dažnesnis jaunų veršelių užsikrėtimas, nei ūkiuose, kuriuose nebuvo nustatyta klinikinė ligos forma (17).

1.6.1 MAP identifikacija

1.6.1.1 Skrodimas

Diagnozuojant paratuberkuliozę jos negalima nustatyti tik paviršutiniškai apžiūrėjus žarnyną. Žarnynas turėtų būti apžiūrimas nuo dvylikapirštės iki tiesiosios žarnų apžiūrint jų gleivines. Ne visada pastebima sąsaja tarp klinikinių požymių pasireiškimo ir žarnyno generalizuotų pakitimų. Gleivinės hiperemija, erozijos ir patechijos dažniausiai pasitaiko skrodžiant užsikrėtusius elnius. Dažnai pasitaiko sustorėję ir sukietėję limfiniai mazgai. Mezenteriniai mazgai padidėję ir edemiški. Kalcifikuoti pažeidimai limfiniuose mazguose būdingi ožkoms ir avims. Diagnozei patvirtinti mėginiai imami nuo žarnų sienelės ir limfinių mazgų, konservuojami 10 proc. formalino tirpalu ir siunčiami histopatologiniam tyrimui (42).

1.6.1.2 Bakteriologinis tyrimas ( mikroskopija)

Tepinėlis imamas iš išmatų arba žarnyno gleivinės. Ir dažomas Zylio Nilseno būdu. Gali būti pastebimas MAP susitelkimas į grupeles po tris ir daugiau, taip pat žinoma, jog šios bakterijos yra dalinai atsparios rūgštims. Pastarasis nustatymo būdas nėra tikslus, kadangi, neleidžia diferencijuoti vienų mikobakterijų nuo kitų (42).

1.6.1.3 Bakteriologinė kultūra

Standartinei kultūros kultivavimo procedūrai naudojama Heroldo kiaušinio trynio terpė (HEYM). Tačiau kultivavimo laikas dažnai siekia 16 savaičių iki pirmojo pastebimo mikobakterijų augimo (17).

Pastebimos kolonijos yra labai mažos, pusrutulio formos, negleivingos, iš pradžių bespalvės ir permatomos. Kolonijų dydis siekia apie 0,25 – 1mm (42).

1.6.1.4 PGR išmatose

Nuo tada, kai buvo atrasta IS900 seka, bandoma atlikti PGR tiesiogiai mėginyje. Dauginant šią genetinės medžiagos sritį, polimerazės grandinės reakciją galima atlikti per 4 dienas. Tai daug greitesnis metodas lyginant su kultūros išskyrimu. Tačiau, PGR yra mažiau jautrus nei pastarasis metodas. Taip pat, manoma, kad IS900 gali būti nespecifinė MAP bakterijai. PGR tyrimas naudojamas patvirtinti infekciją, atlikus kultūros testą. Jeigu PGR metodas būtų atliekamas be kitų diagnostinių testų, tuomet galimi klaidingi rezultatai (17).

1.6.1.5 Serologiniai testai

Dažniausiai yra naudojami IFA ir IDAG serologiniai testai (42). Imunofermentinė analizė (IFA) -vienas pagrindinių imunologinių testų, kuris plačiai taikomas nustatant paratuberkuliozės sukėlėją. IFA yra priimtinas tyrimo metodas, nes jis greitas, atliekamas per savaitę, ekonomiškai nebrangus. Tačiau, turi būti vertinamas gana kritiškai. Tiriant subklinikine forma sergančius galvijus, IFA metodu užsikrėtusių gyvūnų skaičius buvo mažesnis, nei išskiriant bakterijas iš išmatų. Taip yra todėl, jog antikūninis atsakas iššaukiamas vėliau, nei gyvūnas tampa nešiotoju (42).

Siekiant tiksliai įvertinti gautus rezultatus svarbu tinkamai interpretuoti užsikrėtimo laipsnį. Tam, kad atskirti sveikus nuo sergančių gyvūnų reikia žinoti, kad užsikrėtimo tikimybė yra didesnė pas tuos galvijus, kurių rezultatai parodė aukštą optinį tankį, ypač, jeigu tose bandose jau buvo sergančių paratuberkulioze. Todėl, laboratorijos dažniausiai naudoja 3 lygių sistemą (teigiamas, abejotinas, neigiamas) arba 4 lygių sistemą ( neigiamas, abejotinas, silpnai teigiamas, stipriai teigiamas). Toks vertinimas paremtas optinio tankio interpretacija. Yra žinoma, kad IFA diagnostinio testo jautrumas vertinamas apie 30proc. (42, 43).

Imunodifuzijos reakcija agaro gelyje (IDAG) – tai kitas imunologinis testas. Jis buvo sukurtas kaip greitas testas gyvūnams, kurie serga klinikine paratuberkuliozės forma. Kai kuriuose straipsniuose teigiama, kad jei IDAG rezultatai yra teigiami tai yra 95 proc. tikimybė, jog tie galvijai sergantys. Tačiau, šio tyrimo gebėjimas nustatyti subklinikinę formą yra mažas – 18,9 proc. Todėl, IDAG naudojamas tik paratuberkuliozės klinikinius požymius turintiems galvijams ligos patvirtinimui (42).

1.7 Kontrolė

1.7.1 Jaunų galvijų kontrolė

Veršeliai skirti skerdimui, komerciniuose ūkiuose turi būti auginami laikantis higienos normų ir perkami tik iš patikrintų ir neužkrėstų bandų. Vengti mėšlo, pašarinių javų, šiaudų, įrankių, kurie galėjo kontaktuoti su mėšlu ar dirva iš nežinomo statuso ūkių. Taikyti bioapsaugos priemones visiems be išimties lankytojams ir šeimos nariams, kurie galėjo lankytis kituose ūkiuose (44).

1.7.2 Užkrėstų bandų kontrolė

Paratuberkulioze užkrėstų bandų kontrolei taikomi veiksmai priklauso nuo siekiamo tikslo. Galima sumažinti infekcijos plitimą arba siekti likviduoti paratuberkuliozę iš ūkio. Kita priežastis kontrolei – sumažinti gyvybingų MAP bakterijų kiekį pieno ir mėsos produktuose (44).

Užkrėstų bandų kontrolės terminas ilgas (10 metų ir daugiau), todėl reikalauja nuolatinės veterinaro stebėsenos. Įrodyta, kad ilgalaikės valdymo programos sėkmingai padeda kontroliuoti paratuberkuliozę. Kadangi, bandoje jautriausi naujagimiai ir jauni veršeliai, todėl vienas iš pagrindinių kontrolės tikslų turėtų būti šių amžiaus grupių apsauga nuo infekcijos. Kuo jaunesni užsikrečia, tuo anksčiau pradeda platinti MAP (44).

Taip pat galimas užsikrėtimas gimdoje. Mažai žinoma apie užsikrėtimo gimdoje tolimesnę ligos pasireiškimo eigą. Tyrimais neįrodyta ar esant lėtinei ligos formai gimdoje užsikrėtę gyvūnai gali susirgti klinikine ligos forma ir pradėti platinti bakterijas. Ūkiuose, kuriuose atliekama paratuberkuliozės kontrolė, patariama brokuoti veršelius, kuriuos atsivedė klinikinių ligos simptomų turinčios karvės (44).

1.7.3 Specialūs reikalavimai pieniniams galvijams

Svarbu palaikyti švarą patalpose, suteikiant daugiau erdvės karvėms, bei daugiau švaraus kraiko. Veršingos karvės turi būti švarios, stengtis, kad išmatų nepatektų ant tešmens, spenių, šonų ir kojų. Atskirti gimusius veršelius nuo karvių per 10 minučių nuo apsiveršiavimo arba tuomet, kai jauniklis bando stotis. Ši saugos priemonė apriboja naujagimio kontaktą su srutomis veršiavimosi patalpoje (44).

Jauniklius šerti pieno pakaitalu arba pasterizuotu pienu (65,5 temp. 30 min. arba 72 temp. 15 sekundžių). Šėrimas pasterizuotu pienu ar pieno pakaitalu sumažina, bet nesunaikina tikimybės užsikrėsti paratuberkulioze. Pastebėta, jog atlikus pasterizaciją, vis tiek galimas pieno užkrėtimas MAP bakterijomis. Taip pat svarbu saugoti veršelių pašarus ir vandenį nuo sąlyčio su srutomis, atitinkamai vengti suagusiųjų išmatų patekimo į veršelių auginimo patalpas per darbuotojų rankas, batus, aprangą, įrankius, vėžimėlius ir transporto priemones (44).

1.7.5 Atsparumo paratuberkuliozei didinimas

Vakcinacija. Skiepai pripažinti tinkama priemone kontroliuoti paratuberkuliozę galvijų ir smulkių atrajotojų bandose. Keliose pietų Europos šalyse, taip pat ir Australijoje, skiepai efektyviai naudoti paratuberkuliozei kontroliuoti avių ir ožkų tarpe. Daugelyje valstybių, galvijų vakcinacija yra reta kontrolės priemonė, nes galima kryžminė reakcija galvijus tiriant dėl tuberkuliozės. Jungtinėse valstijose žinoma vienintelė vakcina, sudaryta iš negyvų mikobakterijų ir aliejaus pagrindo adjuvanto. Tačiau neteisingai vakcinuojant galimi neigiami reiškiniai. Skiepai nėra veiksmingesni už tinkamą bandos kontrolės planą. Vakcina efektyviau veikia avis: 90 proc. vakcinuotų bandų sumažino infekcijos paplitimą bandos viduje (44).

1.7.6 Genetinė atranka

Genetinė atranka paratuberkuliozei kontroliuoti yra nauja sritis. Tyrimais nustatyta, kad olandų pieniniams galvijams būdingas genetinis MAP perdavimas. Paveldimumas svyruoja nuo 1 iki 18 proc., kai daugumos galvijų jis siekia nuo 9 iki 12 proc. Genetinis poveikis geriausiai nustatomas buliams reproduktoriams, naudojant dukterų fenotipus. Panašus paveldimumas pastebėtas ir tarp avių. Siekiant didinti atsparumą MAP pasitelkiant genetinę įvairovę tiriami atskiri genai, kurie gali turėti biologinės reikšmės, taip pat visas genomas (pvz. naudojant vieno nukleotido polimorfizmo SNP rinkinį) naudojami atrasti ir išskirti genus susijusius su organizmo atsparumu MAP. Genetinė selekcija galėtų padėti sumažinti jautrių galvijų skaičių paratuberkuliozės sukėlėjui, tačiau šiai sričiai būtina plėtotis ir tobulėti (44).

1.7 Gydymas

Gydymas paratuberkuliozei nerekomenduojamas, kadangi, pasireiškę klinikiniai požymiai yra akivaizdūs paskutinės ligos stadijos signalas. Trumpam viduriavimo sumažinimui gali būti naudojamas septynių dienų streptomicino kursas. Jei dehidratacija yra akivaizdi tai intraveninė skysčių terapija gali būti naudojama gyvūnams, kurie bus skirti žmonių vartojimui. Nėra veiksmingo paratuberkuliozės gydymo. Teoriškai, kai kurių antibiotikų terapija gali būti sėkminga. Tačiau, ilgas gydymas bus nenaudingas finansiškai. Be to, Mycobacterium Avium subsp. paratuberculosis yra jautri tik nedaugeliui vaistų, taigi, tikimybė pasveikti yra maža (34).

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

Galvijų paratuberkuliozės specifinių antikūnų tyrimams buvo panaudoti kraujo serumo mėginiai, kurie 2008 – 2014 metais surinkti iš 44 Lietuvos rajonų ir Latvijos. Per analizuojąmąjį laikotarpį, paratuberkuliozės atžvilgiu ištirti 14861 galvijų kraujo serumo mėginiai. Mėginiai, buvo siunčiami iš įvairių Lietuvos ūkių ir iš pavienių gyventojų. Daugiausia kraujo serumo mėginių buvo ištirti kontrolei ir eksportui į kitas užsienio šalis. Tyrimams buvo imami jaunų telyčių, buliukų, pieninių galvijų kraujo serumo mėginiai.

Gauti duomenys buvo apdorojami pasitelkus Microsoft Excel kompiuterinę programą. Šios programos pagalba, baigiamojo darbo rezultatuose buvo skaičiuojami patikimumų rodikliai. Rezultatai tarpusavyje lyginami tokiu principu: jeigu gauti duomenys <0,05 tai laikome, kad duomenys patikimi ir yra statistiškai reikšmingi, jeigu duomenys >0,05 laikome, kad duomenys statistiškai nepatikimi. Turimi duomenų rezultatai grupuojami ir analizuojami pagal amžių, lytį, apskritis, veislę, tikslą, bei tiriamuosius metus.

Surinkti kraujo serumo mėginiai buvo tiriami Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute, Serologijos skyriuje. Gautuose mėginiuose nurodyta tiksli informacija apie gyvūno amžių, lytį, veislę, rajoną, ūkį, ir kokiam tikslui norima atlikti serologinius tyrimus (45).

Paratuberkuliozės specifinių antikūnų nustatymui buvo naudota netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) rinkinys: „Serological diagnosis of Paratuberculosis by ELISA in serum, plazma and milk” Institut POURQUIER IDEXX MAP Ab test. Tyrimai atliekami pagal IFA diagnostinių rinkinių gamintojų metodines rekomendacijas. Tyrimai atlikti laikantis 1997-11-06 Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo Nr. 8-500 („Valstybės žinios“, Nr. 108) bei poįstatyminių aktų (45).

Iš serologinių metodų M. paratuberculosis nustatymui naudojome IFA. IFA paratuberkuliozės tyrimai skirstomi į apžvalginį ir patvirtinąmąjį, pastarasis naudojamas dėl galimų kryžminių reakcijų. Jie yra labiau jautrūs ir labiau specifiniai. Laboratorijoje naudojami IFA diagnostinis ir apžvalginis rinkinys tinkamas nustatyti paratuberkuliozės antikūnus galvijams, avims, ožkoms iš serumo ir plazmos taip pat iš karvių pieno (45).

Atvežti kraujo mėginiai centrifuguojami. Gautas kraujo serumas laikomas +2 – +8°C temperatūroje iki penkių dienų, o ilgesniam laikui -20°C temperatūroje. Mėginiai su teigiamais ir abejotinais rezultatais laikomi iki 1 mėnesio. Prieš tyrimą reagentai laikomi kambario temperatūroje (18–20ºC) po naudojimo grąžinami į 2–8ºC (45).

2.1 Tyrimo principas

Polistirolo mikroplokštelės šulinėliai padengti Mycobacterium paratuberculosis antigenu. Metodo pagrindas yra Mycobacterium paratuberculosis antikūnio - antigeno reakcija. Kad išvengti kryžminės reakcijos tiriamieji mėginiai skiedžiami skiedimo buferiu, kuriame yra Mycobacterium

phlei ekstrakto ir inkubuojami. Po inkubacijos mėginiai perkeliami į rinkinio mikroplokštelę. Kai

tiriamąjame mėginyje yra antikūnų, reakcijos metu susidaro antikūno - antigeno kompleksas, kuris lieka surištas šulinėliuose. Nesurištos medžiagos išplaunamos. Pilamas konjugatas, kuris reaguoja su pririštu antigenu. Po plovimo pilamas substratas, kuris sąveikoje su konjugatu keičia mėlyną spalvą į geltoną. Spalvos intensyvumas yra proporcingas antikūnų koncentracijai serumo mėginyje. Mikroplokštelės matavimas atliekamas spektofotometru 450 nm bangos ilgiu (45).

2.1.1 Apžvalginis IFA metodas

Kraujo serumą ir plazmą skiesti 1/20 skiedimo buferiu. Sukratyti ir inkubuoti 15 min. +210C (±50 C) temperatūroje. Tada mėginiai perkeliami į rinkinio mikroplokštelę: (45)

Pernešti (3 pav.) –

 100 µl skiestos neigiamos kontrolės į A1 baseiną;

 100 µl skiestos teigiamos kontrolės į B1 ir C1 baseinus;

 100 µl kiekvieną skiestą mėginį (serumo, plazmos ar pieno) po 1 į baseiną. Plokštelė švelniai pakratoma taip hemogenizuojant šulinėlių turinį. Uždengiama mikroplokštelė (dangteliu, aliuminio folija ar lipnia juosta) ir inkubuojama val. (±5min.)210C (±30C) temperatūroje (45).

3 pav. Kontrolių ir tiriamųjų mėginių išpilstymas mikroplokšelėje.

Plokštelės šulinėliai pripildomi paruoštu plovimo tirpalu, plokštelė švelniai kratoma ir tirpalas pašalinamas taip plovimas vėl kartojamas. Taip atliekami 3 plovimai. Po paskutinio plovimo tirpalą mikroplokštelės energingai iškratyti į sugeriamąjį popierių, kad pasišalintų visi likę likučiai (45).

Konjugato išpilstymas priklauso nuo pasirinkto serumo inkubacijos laiko, gali būti trumpas inkubacijos laikas, kuris trunka (45 min. +21C,  5C) tuomet konjugatas skiedžiamas 1/100 specialiu skiedimo buferiu ir skiestas išpilstomas po 100l į kiekvieną baseiną. Arba kita būdas tai inkubacija per naktį (1 naktis +5C,  3C). Konjugatas skiedžiamas 1/200 specialiu skiedimo buferiu ir skiestas išpilstomas po 100l į kiekvieną baseiną. Plokštelė uždengiama dangteliu, aliuminine folija arba lipnia juosta. Plokštelė inkubuojama 30 min ( 3 min) prie +21C, ( 5C) temperatūroje. Toliau plokštelė plaunama ir stebimi rezultatai. Substrato tirpalas išpilstomas po 100 l į kiekvieną baseiną. Inkubavimas tamsoje 10 min., +210C (± 50C) temperatūroje. Reakcija stabdoma pilant po 100 l ”STOP tirpalo” į kiekvieną baseiną (45).

Švelniai supurtoma plokštelė, kad nusispalvinęs tirpalas homogenizuosis. Atsargiai nuvalomas plokštelės dugnas. Ir galiausiai išmatuojamas mikroplokštelės optinis tankis spektrofotometru 450 nm (OT.450) šviesos bangos ilgiu ir duomenys išspausdinami (45).

2.1.2 Patvirtinamasis IFA metodas

Rinkinys naudojamas serologinės diagnozės patvirtinimui ar paneigimui. Metodo tinkamumas nurodytas OIE žinyne (45).

A N 6 B T 7 C T .. D 1 .. E 2 F 3 G 4 H 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N– Neigiama kontrolė T - Teigiama kontrolė 1 - Mėginys Nr.1 2 - Mėginys Nr.2 3 - ...

Procedūros eiga identiška IFA apžvalginiam metodui, tačiau skiriasi kontrolių ir mėginių išpilstymas mikroplokštelėje (45).

4 pav. Kontrolių ir tiriamųjų mėginių išpilstymas mikroplokšelėje (45)

Rezultatų apskaičiavimas:

Apskaičiuoti procentinį santykį koreguoto tiriamo mėginio M/T (M-mėginys, T-Teigiamas kontrolė):

M/T = 100x

koreguoto mėginio OT450 reikšmė

koreguoto teigiamos kontrolės vidurkio OT450 reikšmė

5 pav. Rezultatų apskaičiavimas (45)

Kai formulė įvesta į spektrofotometrą, tiriamųjų mėginių duomenys išskaičiuojami matuojant mikroplokštelės optinį tankį (OT450), inhibicijos procentą ir rezultato interpretavimą (45).

Neigiamas Abejotinas Teigiamas

M/T ≤ 45 % M/T > 45 % - <55 % M/T ≥ 55 %

6 pav. Rezultatų vertinimas iš serumo ir plazmos galvijams, avims ir ožkoms (45)

Kai mėginio M/T santykis yra lygus arba žemesnis 45%, vertinama, kad gyvūnai nėra užsikrėtę

Mycobacterium paratuberculiosis (Neigiamas).

A N N B T T C T T D 1 1 E 2 2 F 3 3 G 4 4 H 5 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N– Neigiama kontrolė T - Teigiama kontrolė 1 - Mėginys Nr.1 2 - Mėginys Nr.2 3 - ...

Kai mėginio M/T santykis yra tarp 45% ir 55%, vertinama, kad mėginiai neaiškūs (Abejotinas). Tyrimą kartoti dėl statuso.

Kai mėginio M/T santykis yra lygus arba didesnis 55%, vertinama, kad gyvūnai yra užsikrėtę

3. TYRIMO REZULTATAI

Serologinių tyrimų rezultatų paratuberkuliozės atžvilgiu analizė atlikta nuo 2008 iki 2014 metų. Ūkiai skirstomi į mažus <100 galvijų ir didelius >100 galvijų. Gautų mėginių analizė rodo, kad daugiausiai mėginių buvo siunčiami galvijų kontrolės - 7638vnt. ir eksporto - 6956 tikslams. Ištyrus 14861 galvijų kraujo serumo mėginius imunofermentiniu metodu ( IFA) nustatyta, kad 1,5 proc. galvijų yra Mycobacterium avium subp. paratuberculosis (MAP) nešiotojai su pasireiškusiais arba nepasireiškusiais klinikiniais požymiais. Apžvelgus visus atliktus tyrimus pasirinktame metų intervale matome, jog daugiausiai serologiškai teigiamų galvijų paratuberkuliozės atžvilgiu nustatyta 2014 metais ir tai sudarė 4,9 proc., o mažiausias procentas buvo 2010 metais 0,18 proc. 2011 ir 2012 metais serologiškai teigiamai reagavusių galvijų procentas tarpusavyje panašus ir jis siekia 0,7 proc., o visiškai specifinių antikūnų prieš PTB nebuvo rasta 2008 metais (1 lentelė). Palyginus metų intervalą nuo 2008 iki 2014 metų gautų rezultatų skirtumas yra statistiškai patikimas ( p<0,05).

1 lentelė. Serologiniai tyrimai paratubekuliozės atžvilgiu galvijų populiacijoje 2008–2014 m.

Metai Ištirtas galvijų skaičius Rasta teigiamų %

2008 451 0 0 2009 67 2 2,99 2010 1131 2 0,18 2011 3697 26 0,7 2012 6103 41 0,67 2013 2026 83 4,1 2014 1386 69 4,9 Iš viso 14861 223 1,5

Analizuojant serologinių tyrimų rezultatus nuo 2008 iki 2014 metų, daugiausia galvijų kraujo serumo mėginių buvo ištirta 2012 metais iš viso 6103vnt., iš kurių serologiškai teigiamai reagavusių 41

mėginys, o mažiausias kraujo serumo mėginių skaičius buvo ištirtas 2009 metais – 67 galvijų kraujo mėginiai, ir iš jų serologiškai teigiamai reagavusių rasti 2 galvijai, tam įtakos galėjo turėti, per mažas paimtas mėginių skaičius (1 lentelė).

Galime pastebėti, kad analizuojant duomenis nuo 2012 metų išryškėja tendencija, kad galvijų, turinčių specifinius PTB antikūnus procentas didėja, nors mėginių buvo ištiriama mažiau (7 pav.). 2014 metais galvijų kraujo serumo mėginių IFA metodu ištirta tik 1386, tačiau seroteigiamų mėginių kiekis, išreikštas procentais yra didesnis ne tik už 2013 metų duomenis, bet ir apskritai per visus tiriamuosius metus ir siekia 4,9 proc. (7 pav.)

7 pav. Galvijų kraujo serumo mėginių IFA tyrimų rezultatai 2008-2014 metai.

Tam, kad išsiaiškintumėme paratuberkuliozės paplitimą Lietuvos galvijų populiacijoje, toliau analizavome šios ligos pasiskirstymą Lietuvos apskričių galvijininkystės ūkiuose (2 lentelė). Per mūsų tiriamuosius metus nuo 2008 iki 2014 metų galvijų kraujo serumo mėginiai buvo siunčiami ištirti dėl paratuberkuliozės net iš 44 Lietuvos rajonų, kurie priklauso 10 Lietuvos apskričių. Mėginiai tyrimams taip pat buvo siunčiami ir iš Latvijos (2 lentelė).

PTB teigiamų mėginių buvo rasta 9 apskrityse iš 10 ir tik Telšių apskrityje teigiamų atvejų nenustatyta. Kitose Lietuvos apskrityse teigiamų mėginių kiekis svyravo nuo 61,4 proc. iki 0,45 proc. ( p < 0,05) tai reiškia, kad gauti duomenys yra statiškai patikimi ir paratuberkuliozės paplitimas Lietuvos apskrityse pasiskirstęs netolygiai.

0 2000 4000 6000 8000 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 451 ₆₇ 1131 3697 6103 2026 ₁₃₈₆ 0% 2,99% 0,18% 0,7% 0,67% 4,1% 4,9%

2 lentelė. Seroteigiamai reagavusių atvejų PTB paplitimas Lietuvos apskrityse nuo 2008 – 2014 m Apskritys Metai Viso % 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Alytaus 0 2 0 17 18 75 25 137 61,4 Kauno 0 0 0 1 0 1 2 4 1,8 Klaipėdos 0 0 1 2 7 0 8 18 8 Marijampolės 0 0 0 1 4 3 4 12 5,4 Panevėžio 0 0 0 0 0 0 29 29 13 Šiaulių 0 0 1 4 10 0 1 16 7,2 Tauragės 0 0 0 1 0 0 0 1 0,45 Telšių 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Utenos 0 0 0 0 0 1 0 1 0,45 Vilniaus 0 0 0 0 2 0 0 2 1 Latvija 0 0 0 0 0 3 0 3 1,3

Alytaus apskrityje serologiškai teigiamų atvejų daugiausia buvo rasta 2013 metais. Iš viso 75 kraujo serumo mėginiuose aptiktas specifinių antikūnų prieš PTB atsakas, tačiau 2008 ir 2010 metais teigiamų atvejų šioje apskrityje nebuvo. Kauno apskrityje teigiamų atvejų nebuvo nuo 2008 iki 2010 taip pat ir 2012 metais. Klaipėdos apskrityje teigiamų atvejų nebuvo 2008–2009 ir 2013 metais, o daugiausia PTB seroteigiamų testų atlikta 2014 metais (2 lentelė). Marijampolės apskrityje teigiamų atvejų nebuvo 2008–2010 metais, o daugiausia jų buvo 2012 ir 2014 metais, po 4 atvejus. Panevėžio apskrityje 29 teigiami atvejai aptikti 2014 metais, o visais kitais metais mėginiai nebuvo parodę teigiamai reagavusių galvijų. Šiaulių apskrityje teigiamų atvejų daugiausia užfiksuota 2012 metais - 10 atvejų, o 2008 – 2009 ir 2013 metais tyrimų metu specifinių antikūnų prieš PTB kraujo serume neaptikta. Tauragės apskrityje tiriamaisiais metais rastas tik 1 teigiamai reagavęs kraujo serumo mėginys ir 2011 metais, Utenos apskrityje taip pat nustatytas tik 1 atvejis 2013 metais. Vilniaus apskrityje per analizuojamus metus tik 2012 rasti 2 teigiami atvejai. Taip pat į Nacionalinį maisto ir rizikos vertinimo institutą 2013 metais buvo atsiųsti galvijų kraujo serumo mėginiai iš Latvijos iš kurių, trijuose mėginiuose aptikti specifiniai PTB antikūnai. Tokie rezultatai galėjo būti nulemti dėl mažo ištirto mėginių skaičiaus. Galime teigti, kad per visą septynerių metų laikotarpį Alytaus apskrityje esančiuose ūkiuose buvo aptikta daugiausia užsikrėtusių galvijų. Iš viso, net 137 mėginiai turėjo specifinius antikūnus prieš PTB, ir tai sudarė didžiausią procentinę teigiamų mėginių dalį 61,4 proc.

Mažiausiai teigiamų mėginių nustatyta Utenos ir Tauragės apskrityse ir tai sudarė po 0,45 proc. (2 lentelė).

Norint išsiaiškinti paratuberkuliozės paplitimo dinamiką, toliau analizavome atliktų serologinių testų rezultatus pagal tyrimo tikslą. Mūsų analizuojamu laikotarpiu (2008– 2014 m.) tyrimai buvo atliekami 8 tikslais, iš kurių daugiausiai serologiškai teigiamą rezultatą parodė tiriamieji gyvūnai kontrolės tikslu (3 lentelė). Iš sekančios lentelės (3 lentelė) pateiktų duomenų matome, kad 2012 metais ištirtų galvijų mėginių skaičius dėl eksporto į kitas užsienio šalis yra didžiausias – 3421 mėginys, o mažiausiai tirta 2009 metais – 1 kraujo serumo mėginys. Galvijų kontrolei dėl PTB daugiausia atlikta testų 2012 metais 2672 mėginys, o mažiausiai 2008 metais tik 43 mėginiai. Siekiant

parduoti galvijus ir patikrinti ar jie nėra užsikrėtę galvijų infekcine liga – paratuberkulioze, daugiausia tyrimų atlikta 2011 metais, o visai netirta 2009 metais ir laikotarpyje nuo 2012 iki 2014 metų. Toliau iš lentelės (3 lentelė) pastebime, kad per analizuojamus metus, mažiausiai buvo tirta bandos statusui nustatyti ir importo tikslais, po 1 kraujo mėginį. Esant neaiškumams ir siekiant pakartoti tyrimus dėl PTB tokie testai buvo atlikti 2011 ir 2012 metais, kitu laikotarpiu šiuo tikslu tyrimai nebuvo atlikti. Statistiniai duomenys yra tarpusavyje patikimi, nes p<0,01. Taigi, apibendrintai galime teigti, kad daugiausia mėginių buvo ištirta eksportui ir kontrolei. (3 lentelė).

3 lentelė. Ištirtų mėginių skaičius pagal tyrimo tikslą (2008-2014 m.).

Tyrimo tikslas Metai Viso 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Eksportas 386 1 742 2390 3421 7 9 6956 Kontrolinis 43 66 301 1170 2672 2019 1367 7638 Pardavimas 20 0 87 124 0 0 0 231 Veislei 2 0 0 1 0 0 0 3 Bandos st. 0 0 1 0 0 0 0 1 Importas 0 0 0 1 0 0 0 1 Kartoti 0 0 0 11 4 0 0 15 Įtarus ligą 0 0 1 0 6 0 9 16

Toliau matome, kaip pasiskirsto seroteigiamai reagavusių galvijų rezultatai išreiškus procentais (8 pav.) Galime pastebėti, kad iš mūsų 223 užsikrėtusių galvijų, net 183 buvo aptikti atliekant ūkiuose kontrolę, tačiau per tiriamuosius metus tai sudarė tik 2,4 proc. Tokius rezultatus galėjo nulemti didelis

ištirtas kraujo serumo mėginių skaičius. Didžiausią procentinę dalį sudarė įtarimų dėl ligos patvirtinamieji testai, kurie siekė 25 proc., o mažiausią, siekiant galvijus eksportuoti į kitas užsienio šalis tik 0,5 proc. (8 pav.)

8 pav. Ištirtų galvijų skaičius procentais pagal tyrimo tikslą (2008 – 2014 m.)

Analizuojant mūsų gautus tyrimų rezultatus ir siekiant atsakyti į išsikeltą tikslą, toliau nagrinėsime užsikrėtimą paratuberkulioze skirtingose galvijų amžiaus grupėse. Visi tiriamieji galvijai buvo suskirstyti į tris amžiaus grupes. Pirmoji, tai veršeliai ir telyčios iki 2 metų, antroji, tai suaugusios karvės ir buliai iki 10 metų ir trečioji, tai suaugę galvijai nuo 10 ir daugiau metų amžiaus. Mūsų tiriamaisiais metais pastebima aiški tendencija, kad nuo 2008 iki 2014 metų daugiausia serologiškai teigiamai reagavusių galvijų buvo antroje amžiaus grupėje, nuo 2 iki 10 metų suaugusių galvijų. Iš 9 pav. matome, jog tai buvo 185 galvijai ir tai sudarė 83 proc. iš visų galvijų, kuriuose buvo aptiktas specifinių antikūnų prieš PTB. Užsikrėtusių jaunų veršelių ir telyčių, bei vyresnių nei 10 metų galvijų, procentinė dalis yra gerokai mažesnė ir atitinkamai svyruoja nuo 11,2 iki 5,8 proc. Taigi, apibendrintai galime sakyti, jog didžiausias paratuberkuliozės paplitimas pastebėtas suaugusių galvijų nuo 2 iki 10 metų tarpe, o mažiausias vyresnių nei 10 metų galvijų tarpe (9 pav.). Gautų rezultatų skirtumas yra tarpusavyje yra statistiškai patikimas. (p<0,05)

0 50 100 150 200 Eksportas Kontrolinis Pardavimas Veislei Bandos st. Importas Kartoti Įtarus ligą 34 183 0 0 0 0 2 4 0,5% 2,4% 0% 0% 0% 0% 13,3% 25% Galvijų skaičius T y ri m o p a sk ir ti s Teigiami atvejai Teig.proc.

9 pav. Paratuberkuliozės sukėlėjo paplitimas galvijų populiacijoje pagal amžiaus grupes

Išanalizavus galvijus pagal amžiaus grupes, toliau būtų tikslinga pasiaiškinti ir apžvelgti serologiškai teigiamai reagavusių galvijų pasiskirstymą pagal lytį. Iš 10 pav. matome, kad didžioji dauguma mūsų serologiškai teigiamai reagavusių galvijų yra suaugusios karvės ir telyčios tai sudaro 90,6 proc. ir gerokai mažiau specifinių antikūnų prieš PTB pastebėtas suaugusių bulių ir buliukų tarpe ir tai sudarė – 9,4 proc. (10 pav.) Taigi, matome, kad paratuberkuliozė labiau paplitusi tarp suaugusių karvių ir telyčių (p<0,05). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 iki 2 2 iki 10 >10 25 185 13 11,2% 83% 5,8% S a k ič iu s Amžius Galvijų skaičius Teig.proc.

10 pav. Serologiškai teigiamai reagavusių galvijų pasiskirstymas pagal lytį

Iš mūsų gautų tyrimų duomenų, matome, kad nagrinėjant testų rezultatus pagal galvijų veislę pastarieji pasiskirsto netolygiai. Per tiriamuosius metus nuo 2008 iki 2014 iš viso buvo ištirta 9 identifikuotos galvijų veislės: Limuzinai ( LI), Lietuvos juodmargiai ( LJ), Danijos juodmargiai (DJ), Holšteinai (H), Senojo genotipo Lietuvos juodmargiai (GJ), Lietuvos žalieji (LŽ), Danijos žalieji (DŽ), Angusai (AA), Aubrakai ( AB). Toliau galime pastebėti, kad iš tirtų veislių, daugiausia užsikrėtusių galvijų buvo Holšteinų veislės galvijai ir tai sudarė atitinkamai 38,6 proc. Taip pat nemažai užsikrėtusių buvo Lietuvos juodmargių( LJ) ir limuzinų (LI) veislės galvijų ir tai sudarė atitinkamai 17,5 ir 11,7 proc. ( 11 pav.) Mažiausiai serologiškai teigiamų atvejų per tiriamuosius metus sudarė senojo genotipo Lietuvos juodmargiai (GJ), Danijos žalieji (DŽ), Angusai ( AA) ir Aubrakų (AB) veislės galvijai - po 1 seroteigiamą galviją ir tai atitinkamai sudarė 0,45 proc.(11 pav.). Matome, kad iš mūsų išvardintų tiriamų veislių didžiąją dalį sudaro pieninių veislių galvijai (11 pav.). Duomenys yra statistiškai patikimi, nes p<0,05. Taigi, galime manyti, jog rezultatai yra tarpusavyje reikšmingi. Taip pat yra žinoma, kad iš visų serologiškai teigiamus rezultatus parodžiusių gyvūnų 21 proc. nebuvo identifikuoti ir jų veislė yra nežinoma.

90,6% 9,4%

Suaugusios karvės ir telyčios

11 pav. Paratuberkuliozės sukėlėjo nešiotojai pagal galvijų veislę

Siekiant tinkamai išanalizuoti atliktus PTB serologinius tyrimus Lietuvoje galime pastebėti, jog tyrimams siunčiami mėginiai skirtingai pasiskirsto įvairiais metų laikais. Panagrinėjus žemiau esančią lentelę (4 lentelė) išsamiau, pastebime, kaip pasiskirsto tyrimų dinamika skirtingais metų laikais. Rudenį ištirta daugiausia galvijų kraujo serumo mėginių ( n=5249), o mažiausiai gyvūnų kraujo dėl PTB buvo ištirta žiemos metu (n = 2562). Atitinkamai galime pastebėti, kad per mūsų tiriamuosius metus procentinė išraiška svyruoja tarp 0,45 proc. ir 3 proc. Galime teigti, kad žiemos metu buvo daugiausia serologiškai teigiamą rezultatą parodžiusių galvijų kraujo serumo mėginių 77 ir tai siekė 3 proc. taip pat panaši tendencija pastebėta pavasarį 76 mėginiai ir tai sudarė 1,9 proc. Duomenys tarpusavyje yra statistiškai patikimi, nes p<0,05. Tokius rezultatus galėjo lemti mažas ištirtas kraujo serumo mėginių skaičius mūsų tiriamaisiais metais (4 lentelė).

4 lentelė. Seroteigiamų mėginių skaičius pagal sezoniškumą.

Sezonas Metai

2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Rasta teigiamų Iš viso %

Pavasaris 0 0 0 22 5 15 34 76 4026 1,9 Vasara 0 0 0 2 7 2 2 13 3024 0,45 Ruduo 0 0 0 1 21 30 5 57 5249 1,1 Žiema 0 2 2 1 8 36 28 77 2562 3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 11,7% 17,5% 4% 38,6% 21% 0,45% 5,4% 0,45% 0,45% 0,45% G a lv ij ų sk a ič iu s

3.1 Serologinių tyrimų analizė skirtinguose ūkiuose

Ūkių aprašymas. Tyrimui buvo pasirinktinai išsirinkti 3 Lietuvoje esantys ūkiai, kurie jau anksčiau buvo įtraukti į aptartus rezultatus, tačiau dabar panagrinėsime ligos paplitimą tik tarp šių pasirinktų ūkių. Pirmasis ūkis yra Alytaus rajone, antrasis Lazdijų, o trečiasis Joniškio rajone.

Pirmajame ūkyje laikoma 700 galvijų, iš jų melžiamų karvių 430, auginami ir mėsiniai, ir pieniniai galvijai. Veršeliai laikomi vienviečiuose aptvaruose, vėliau suvaromi į bendrus aptvarus. Antrajame ūkyje laikomų galvijų skaičius siekia apie 1000 galvijų, o trečiajame 107 galvijai.

5 lentelė. Seroteigiamai reagavę galvijai pasirinktuose ūkiuose

Metai

Ūkio numeris

1 2 3

Tirta Teigiami Tirta Teigiami Tirta Teigiami

2008 0 0 0 0 0 0 2009 67 2 0 0 0 0 2010 0 0 0 0 15 1 2011 357 17 0 0 11 0 2012 502 8 170 9 18 1 2013 95 4 468 50 0 0 2014 123 6 429 36 65 8 Iš viso 1144 37 1067 95 109 10

Nors iš tiriamų trijų ūkių, ūkis Nr. 2 yra didžiausias ( n = 1000) galvijų, tačiau tyrimų dėl paratuberkuliozės daugiausia atlikta ūkyje Nr.1. Iš viso serologiškai ištirta 1144 kraujo serumo mėginių. 2012 metais šiame ūkyje per visus tiriamuosius metus daugiausia ištirta mėginių dėl PTB -502 mėginiai, tačiau specifinių antikūnų turėjusių galvijų prieš PTB daugiausia rasta 2011 metais (n=17) (p<0,05). Antrajame ūkyje daugiausia tyrimų atlikta 2013 metais 468 ir tais pačiais metais nustatytas didžiausias paratuberkuliozės sukėlėjo nešiotojų skaičius šiame ūkyje. O trečiajame ūkyje daugiausia tirta buvo 2014 metais 65 mėginiai ir užkrėstų mėginių šiais metais skaičius taip pat buvo

didžiausias – 8 serologiškai teigiamai reagavę mėginiai.( 5 lentelė). Taip pat, galime pastebėti, jog ūkiai nuo tada kai pirmą kartą buvo pradėta atlikti serologinius testus dėl paratuberkuliozės yra tiriami kiekvienais metais ir juose aptinkama serologiškai teigiamų galvijų.

Toliau siekiant panagrinėti paratuberkuliozės paplitimą skirtinguose Lietuvos ūkiuose nurodėme užsikrėtimą procentine išraiška (12 pav.). Matome, kad per mūsų tiriamuosius metus nuo 2008 iki 2014 iš mūsų tirtų ūkių antrajame ir trečiajame ūkiuose paratuberkuliozės sukėlėjo paplitimas vyrauja atitinkamai 9 ir 9,2 proc. Tai, kad 3 ūkyje paratuberkuliozės užsikrėtimo procentinė išraiška didžiausia, galėjo nulemti tai, jog šiame ūkyje yra laikoma mažiausiai galvijų (n=107). ( 5 lentelė), o pirmajame ūkyje atvirkščiai, procentinė išraiška per tiriamuosius metus siekia tik 3,2 proc. (12 pav.) iš 5 lentelės matome, kad šiame ūkyje buvo ištirta daugiausia galvijų. Taigi, apibendrintai galime sakyti, kad antrajame ir trečiajame ūkyje paplitimas yra didžiausias (12 pav.). Duomenys tarpusavje statistiškai reikšmingi. (p<0,05)

12 pav. Paratuberkuliozės sukėlėjo nešiotojų procentinė išraiška ūkiuose

Sekančioje lentelėje (6 lentelė) siekėme palyginti, bendrąjį paratuberkuliozės sukėlėjo paplitimą Lietuvoje ir paplitimą mūsų pasirinktuose ūkiuose tiriamaisiais metais nuo 2008 iki 2014 metų. Iš lentelės ( 6 lentelė) galime pastebėti, kad metų intervale nuo 2008 iki 2014 pasirinktų ūkių užsikrėtimas sudaro didžiausią užsikrėtusių galvijų dalį visoje Lietuvoje. Matome, kad iš visų rastų

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ūkis nr.1 Ūkis nr.2 Ūkis nr.3 3,2% 9% 9,2% P ro ce n ta i

serologiškai teigiamai reaguvių galvijų kurių buvo 223 net 142 galvijai buvo rasti mūsų pasirinktuose ūkiuose ir tai sudarė 64 proc. (6 lentelė). Taigi, galime manyti, jog didžiausią užsikrėtusių galvijų paratuberkulioze dalį sudarė galvijai, tirti mūsų pasirinktuose ūkiuose. Duomenys tarpusavyje statistiškai patikimi p<0,05.

6 lentelė. Serologiškai tirtų galvijų rezultatų palyginamasis įvertinimas.

Metai

Iš viso serologiškai teigiami Lietuvoje

Serologiškai teigiami ūkiuose

(1, 2, 3) Proc. 2008 0 0 0 2009 2 2 100 2010 2 1 50 2011 26 17 65 2012 41 18 44 2013 83 54 65 2014 69 50 72,5 Iš viso 223 142 64

Tam, kad detaliau panagrinėtume užsikrėtimą ūkiuose, ir išsamiai atsakytume į savo išsikeltą tiriamojo darbo tikslą, vertinga išanalizuoti ligos paplitimą tarp skirtingų amžiaus grupių ūkiuose Nr.1 ,Nr.2 ir Nr.3. Apžvelgus visus tris ūkius galime pastebėti tendenciją, kad juose vyrauja didžiausias paratuberkuliozės sukėlėjo paplitimas amžiaus grupėje nuo 2 iki 10 metų amžiaus (13 pav.). Užsikrėtusių galvijų skaičius svyruoja nuo 9 galvijų trečiajame iki 86 galvijų antrajame ūkiuose. Galime pastebėti, kad jaunų galvijų iki 2 metų ir vyresnių nei 10 metų tirtuose ūkiuose yra gerokai mažiau, tačiau lyginant ūkius tarpusavyje antrajame ūkyje iki 2 metų užsikrėtusių daugiausia – 5 galvijai, o daugiau nei 10 metų – 4 serologiškai teigiamai reagavę galvijai. Taigi, apibendrintai galime sakyti, kad paratuberkuliozės sukėlėjo paplitimas labiausiai pasireiškęs tarp suaugusių galvijų nuo 2 iki 10 metų amžiaus. Gauti duomenys tarpusavyje statistiškai patikimi, p<0,05.

13 pav. Paratuberkuliozės sukėlėjo nešiotojai ūkiuose pagal amžiaus grupes (2008-2014 m.) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 iki 2 2-10 >10 1 36 0 5 86 4 0 9 1 Galvijų skaičius A m ži u s 3 ūkis 2 ūkis 1 ūkis

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Laikotarpyje nuo 2008 m. iki 2014 metų pagal serologinių tyrimų duomenis, nustatyta, kad paratuberkuliozės sukėlėjo nešiotojų išplitimas šalyje siekė nuo 0,18 proc. iki 4,9 proc. Panašūs serologinių tyrimų rezultatai tais pačiais metais nustatyti Pakistane. Tarp galvijų paratuberkuliozės paplitimas siekia 6,67 proc., o tarp buivolų 12,5 proc. (46).

Analizuojant mūsų tyrimo rezultatus trijuose Lietuvos ūkiuose matome, jog MAP bakterija paplitusi visuose 3 tirtuose ūkiuose. Nuo 2008 iki 2014 metų atitinkamai rasta teigiamų galvijų 3,2 proc., 9 proc. ir 9,2 proc. Tokius rezultatus galėjo lemti per mažas ištirtas kraujo serumo mėginių kiekis. Lyginant su kitų autorių duomenimis yra žinoma, kad Jungtinėse Amerikos Valstijose, užkrėstumas bandoje siekia 91,1 proc., o Čilėje nuo 28 iki 100 proc. (46) kai kuriuose šiaurės rytiniuose Lenkijos rajonuose paplitimas tarp bandų siekia iki 6 proc. (47).

Pasaulyje yra vietų, kur ši liga nėra plačiai paplitusi, tai Rytų Australijos regionuose, Suomijoje, Švedijoje, Norvegijoje ir Islandijoje. Švedijoje nuo 1993 metų iki dabar serologiškai teigiamai reagavusių galvijų rasta tik 50 atvejų. Danijoje kitaip nei kitose Skandinavijos šalyse tarp pieninių galvijų bandų paplitimas siekia 47 proc., o Vokietijoje 80 proc. (47).

Iš visų serologiškai teigiamai reagavusių galvijų didžiąją dalį sudarė suaugusios karvės 90,6 proc. ir tik 9,4 proc. buliai ir buliukai. Tokius rezultatus galėjo lemti tai, kad mūsų tiriamuosiuose ūkiuose buvo daugiau laikoma suaugusių karvių dėl pieno produkcijos, kuri mūsų šalyje ypač populiari.

Pasak, kai kurių šaltinių, yra žinoma, kad dažnausiai paratuberkuliozė pasireiškia 3 – 5 metų galvijų amžiaus grupėse (42). Mūsų tyrimo rezultatai parodė, kad iš visų teigiamai reagavusių galvijų daugiausiai užsikrėtusių tiriamuoju laikotarpiu buvo nuo 2 iki 10 metų amžiaus tai sudarė 83 proc. visų serologiškai teigiamai reagavusių galvijų. Tarp galvijų, kurių amžius nežinomas teigiamai reagavusių nebuvo. Galime manyti, kad toki tyrimo rezultatai yra dėl ilgo ligos inkubacinio periodo. Pas jaunus galvijus iki 2 metų imuninis atsakas nėra pakankamai susiformavęs ir efektyviai nereaguoja į infekciją, o vyresni galvijai yra paskerdžiami dėl sumažėjusios produkcijos ir išsekimo. Airijoje paratuberkuliozės paplitimas galvijų tarpe 2009 metais, kuriems yra >2 metai siekė 3,30 proc.(48).

Vienas iš mūsų darbo uždavinių buvo ištirti ar sezoniškumas turi įtakos MAP paplitimui tiriamųjų galvijų tarpe. Mūsų gautuose rezultatuose didžiausią procentinę dalį sudarė mėginiai tirti pavasarį ir žiemą. Atitinkamai tai sudarė 34 proc. ir 34,5 proc. Pasak kai kurių autorių (49) išmatų mėginiai renkami pavasarį, sudaro didesnę tikimybę aptikti MAP negu mėginiai rinkti žiemos metu. Tai parodo, jog metų laikas gali turėti reikšmės palankiai MAP terpei, kadangi skirtinga temperatūra ir drėgmė svarbi MAP gyvybingumui aplinkoje. Tačiau ši hipotezė yra prieštaringa. Neseniai atlikus laboratorinius bandymus ir ilgai laikant MAP prie -20 C, patebėta kad šaltis neturi įtakos MAP gyvybingumui, o atlikus kitą eksperimentą kuomet buvo temperatūra keičiama: trumpai atšaldžius iki -20C ir vėl atšildžius parodė, jog šaltis paveikia MAP gyvybingumą (49).

Taip pat galime pastebėti, kad tarp visų Lietuvos rajonų būtent Alytaus rajone buvo daugiausia serologiškai teigiamai reagavusių galvijų 61,4 proc. Tokius rezultatus galėjo lemti tai, jog šis rajonas vienas iš nedaugelio Lietuvos rajonų intensyviai užsiimančių galvijininkyste ir taip pat jis priskiriamas prie rajonų, kuriuose yra pieninių karvių laikytojų (50).

Ištyrus paratuberkuliozės paplitimą pagal galvijų veislę, paaiškėjo tendencija, jog daugiausia serologiškai teigiamų galvijų buvo Holšteinų ir Lietuvos juodmargių veislių tarpe. Yra žinoma, kad mūsų tiriamaisiais metais Lietuvoje laikomų pieninių juodmargių veislės galvijų procentas siekė iki 72 proc. – 2011 metais (49). Taigi, galime manyti, jog tai, kad Lietuvoje daugiausia laikoma juodmargių veislės karvių, galėjo turėti įtakos mūsų gautiems tyrimo rezultatams.

IŠVADOS

1. Atlikus serologinių tyrimų analizę nustatyta, kad Lietuvos galvijų ūkiuose (2008 – 2014), specifinius antikūnus prieš paratubekuliozės sukėlėją turėjo 1,5 proc. tirtų galvijų.

Daugiausia specifinių PTB antikūnų turėjo galvijai 2014 metais tai sudarė 4,9 proc. o mažiausiai buvo aptikta 2010 metais 0,18 proc.

2. Pagal apskritis nuo 2008 iki 2014 metų daugiausia užsikrėtusių gyvūnų rasta Alytaus apskrityje – 61,4 proc.

3. Lietuvoje galvijų tyrimai PTB atžvilgiu (2008 – 2014) buvo atliekami įvairiais tikslais. Daugiausiai serologiškai teigiamai reagavusių nustatyta atliekant kontrolinius tyrimus. 4. Nustatyta, kad specifinius PTB antikūnus turėjo 223 galvijai ir iš jų 83 proc. buvo nuo 2 iki

10 metų amžiaus.

5. Pagal veislę išsiskyrė Lietuvos juodmargių ir Holšteinų veislės karvės, atitinkamai sudariusios 17,5 ir 38,6 proc. visų seroteigiamų galvijų.

6. Nustatėme, kad 90,6 proc. užsikrėtusių paratuberkulioze galvijų buvo karvės ir telyčios, o buliai ir buliukai sudarė tik 9,4 proc.

7. Pagal tyrimų specifiką daugiausia tirta rudenį ir pavasarį, tačiau specifinių PTB antikūnų daugiausia aptikta žiemą ir pavasarį tai sudarė atitinkamai 34,5 ir 34 proc.

8. Palyginus trijų Lietuvos ūkių tyrimų rezultatus visuose aptikta seroteigiamų galvijų PTB atžvilgiu. Taip pat pastebėjome, kad daugiausiai užsikrėtusių galvijų yra nuo 2 iki 10 metų.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. G. Beaunée, E. Vergu, P. Ezanno. Modelling of paratuberculosis spread between dairy cattle farms at a regional scale; 2015, Veterinary Research 46: 111.

2. M. Martcheva , S. Lenhart, S. Eda , D. Klinkenberg, E. Momotani , J. Stabel. An immuno-epidemiological model for Johne’s disease in cattle; 2015, Veterinary Research 46:69.

3. Y. H. Schukken, Robert H. Whitlock, D. Wolfgang, Y. Grohn, A. Beaver, J. VanKessel et al. Longitudinal data collection of Mycobacterium avium subspecies Paratuberculosis infections in dairy herds: the value of precise field data; 2015, Veterinary Research 46:65.

4. Karen Stevenson. Genetic diversity of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and the influence of strain type on infection and pathogenesis: a review; 2015 Veterinary Research 46: 64. 5. J.David, H. W. Barkema, L. L.Guan, J. De Buck. Gene-expression profiling of calves 6 and

9 months after inoculation with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis; 2014,

Veterinary Research, 45:96.

6. K. Dohmann, B. Strommenger, K. Stevenson, L. D. Juan, J. Stratmann, V. Kapur et al. Characterization of genetic differences between Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis type I and type II isolates; 2003 Journal of Clinical Microbiology

5215- 5223 p., 41:11.

7. M. Fernández , J. Benavides , I. A Sevilla , M. Fuertes , P. Castaño , L. Delgado et al. Experimental infection of lambs with C and S-type strains of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis: immunological and pathological findings; 2014, Veterinary Research, 45:5.

8. J.R Martadinata. Kejadian paratuberkulosis (Johne’s disease) pada ruminansia di indonesia perlu diwaspadai; 2007, Balai Besar Penelitian Veteriner, No. 30, Bogor 16114.

9. D. Patel, L. Danelishvili, Y. Yamazaki, M. Alonso, M. L. Paustian, J. P. Bannantine, L. Et al. The Ability of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis To Enter Bovine Epithelial Cells Is Influenced by Preexposure to a Hyperosmolar Environment and Intracellular Passage in Bovine Mammary Epithelial Cells; 2006, Infection and Immunity 2849-2855 p., 74:5.

10. J. Szteyn, A. Wiszniewska-Łaszczych, A. Smolińska. Evaluation of methods for Mycobacterium

aviumssp. paratuberculosis detection in milk samples from the cattle herd showing low

11. National Research Council (US) Committee on Diagnosis and Control of Johne's Disease. Diagnosis and Control of Johne's Disease; 2003, ISBN-10: 0-309-08611-6, p. 244p.

12. A. K. Pradhan, R. M. Mitchell, A. J. Kramer, M. J. Zurakowski, Terry L. Fyock, Robert H. et al. Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in a Longitudinal Study of Three Dairy Herds; 2011, Journal of Clinical Microbiology, 49:3, 893-901 p.

13. A. Wiszniewska-łaszczych, J. Szteyn, A.Ruszczyńska. A case study of the clinical form of Johne’s disease in a heifer; 2010, Journal of Veterinary Animal Sciences, 34:1, 95-99 p.

14. J. Robins, S. Bogen, A. Francis, A. Westhoek, A. Kanarek, S. Lenhart, Shigetoshi Eda et al. Agent-based model for Johne’s disease dynamics in a dairy herd; 2015, Veterinary Research 46:68. 15. R. J Arsenault , P. Maattanen , J. Daigle, A. Potter , P. Griebel, and S. Napper. From mouth to macrophage: mechanisms of innate immune subversion by Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis; 2014, Veterinary Research 45:54.

16. Good M. , Clegg T. , Sheridan H. , Yearsely D. , O’Brien T. , Egan J. and Mullowney P. Prevalence and distribution of paratuberculosis (Johne’s disease) in cattle herds in Ireland; 2009,

Irish Veterinary Journal, 62:9 p. 597-606.

17. A. Tiwari, J. A. VanLeeuwen, S. L.B. McKenna, G. P. Keefe, H. W. Barkema. Johne’s disease in Canada Part I: Clinical symptoms, pathophysiology, diagnosis, and prevalence in dairy herds; 2006,Canadian Veterinary Journal, 47, 874-882 p.

18. A. S. Motiwala, A. Amonsin, M. Strother, E. J. B. Manning, V. Kapur, and S.Sreevatsan. Molecular Epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Isolates Recovered from Wild Animal Species; 2004, 42:4, 1703-1712 p.

19. http://www.merckvetmanual.com/mvm/generalized_conditions/paratuberculosis/overview_of_parat uberculosis.html. Žiūrėta 2015m. lapkričio 4d.

20. Ad. P. Koets, S. Eda, S. Sreevatsan. The within host dynamics of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis infection in cattle: where time and place matter; 2015, Veterinary Research, 46:61. 21. R. Wolf , K. Orsel, J. De Buck, H. Wildrik Barkema. Calves shedding Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis are common on infected dairy farms; 2015, Veterinary Research 46:71. 22. John. P. Bannantine and Judith R. Stabel. Killing of Mycobacterium avium subspecies

paratuberculosis within macrophages; 2002, BMC Microbiology 2:2.

23. National Research Council (US) Committee on Diagnosis and Control of Johne's Disease. Diagnosis and Control of Johne's Disease; 2003 ISBN-10: 0-309-08611-6, 244 p.