LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Elvinas Noreika
LABORATORINIS
KALCIO APYKAITOS SUTRIKIMŲ
VERTINIMAS HIPERPARATIROZE SERGANTIEMS ASMENIMS
Baigiamasis magistro darbasDarbo vadovas Doc. dr. Daiva Urbonienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3 ABSTRACT ... 5 PADĖKA ... 7 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 7BIOETIKOS CENTRO PRITARIMAS TYRIMUI ... 7
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Kalcio funkcijos organizme ... 13
1.2. Kalcio pasiskirstymas organizme ... 13
1.2.1. Kalcio balansas ir homeostazė ...14
1.3. Hiperkalcemijos samprata ir aktualumas ... 16
1.4. Hiperkalcemijos etiologija ir patogenezė ... 18
1.4.1. Parathormono sąlygota hiperkalcemija ...19
1.4.2. Nuo parathormono nepriklausoma hiperkalcemija ...23
1.5. Hiperkalcemijos epidemiologija ir mirtingumas ... 26
1.6. Laboratorinė hiperkalcemijos diagnostika ... 27
2. TYRIMO METODIKA ... 29
2.1. Tiriamieji asmenys ir tyrimo eiga ... 29
2.2. Tyrimo metodai ... 30
2.2.1. Kalcio koncentracijos kraujo serume nustatymas ...30
2.2.2 Intaktinio parathormono koncentracijos kraujo serume nustatymas ...32
2.2.3. Bendro baltymo koncentracijos kraujo serume nustatymas ...34
2.2.4. Albumino koncentracijos serume nustatymas ...36
2.2.5. Fosforo koncentracijos kraujo serume nustatymas ...37
2.2.6. Kiti biocheminiai tyrimai ...39
2.2.7. Duomenų statistinės analizės metodai ...40
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 41
IŠVADOS ... 56
LITERATŪRA ... 57
3
SANTRAUKA
Magistro darbo autorius. Elvinas Noreika
Magistro darbo pavadinimas. Laboratorinis kalcio apykaitos sutrikimų vertinimas hiperparatiroze sergantiems asmenims.
Tyrimo tikslas. Įvertinti kalcio apykaitos sutrikimų priežastis hiperparatiroze sergantiems asmenims, remiantis prieskydinių liaukų hormono ir kitų rodiklių laboratoriniais tyrimais.
Tyrimo uždaviniai:
1. Įvertinti pirminės, antrinės ir kitos/tretinės hiperparatirozės rūšių dažnį bei tiriamųjų asmenų pasiskirstymą pagal lytį ir amžių skirtingose hiperparatirozės grupėse.
2. Įvertinti kalcio apykaitos sutrikimus, jų dažnį ir hiperkalcemijos sunkumo (laipsnio) pasireiškimą pacientams, atsižvelgiant į hiperparatirozės rūšį.
3. Įvertinti parathormono ir kalcio koncentracijas, jų tarpusavio ryšį ir ryšį su kitais demografiniais ir biocheminiais rodikliais pacientams su skirtinga hiperparatirozės rūšimi.
Tyrimo objektas ir metodai. Į tyrimą įtraukti pacientai, kuriems LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje nuo 2017-01-01 iki 2019-08-31 buvo atlikti parathormono (PTH), kalcio ir kiti laboratoriniai tyrimai kalcio apykaitos sutrikimams diagnozuoti. Tyrimas retrospektyvinis, analizuoti hiperparatiroze sergančių asmenų laboratorinių tyrimų rezultatai ir ligos istorijų duomenys. Intaktinio prieskydinių liaukų hormono (iPTH) koncentracijos kraujo serume tyrimai buvo atlikti naudojantis automatiniu TOSOH BIOSCIENCE AIA-360 (Tosoh Corporation, Japonija) analizatoriumi. Kalcio koncentracijos serume ir kiti biocheminiai tyrimai buvo atlikti naudojantis automatine SYNCHRON LX® sistema, UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV) sistema.
Rezultatai. Tiriamųjų grupę sudarė 93 suaugę pacientai: 60 moterų ir 33 vyrai. Tiriamieji pagal ligos diagnozes buvo suskirstyti į 3 grupes: pirminės, antrinės ir kitos/tretinės hiperparatirozės. Daugiau nei pusė (54,8 proc.) pacientų sirgo antrine, 30,1 proc. – pirmine, o kitos/tretinės hiperparatirozės dažnis buvo mažiausias – 15,1 proc. Kalcio apykaitos sutrikimai buvo nustatyti 63,4 proc. tiriamųjų: hiperkalcemija – 28,0 proc., hipokalcemija – 35,4 proc. Įvertinus hiperkalcemijos sunkumą nustatyta, kad didžiajai daliai pacientų (69,2 proc.) su hiperkalcemija pasireiškė lengva, o vidutinio sunkumo ir sunkios hiperkalcemijos dažnis buvo mažesnis, atitinkamai 23,1 proc. ir 7,7 proc.
Išvados.
1. Hiperparatiroze sergančių tiriamųjų grupėje vyravo sergantieji antrine hiperparatiroze, o mažiausią dalį sudarė kita/tretine hiperparatiroze sergantys asmenys. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amžių ir lytį hiperparatirozės grupėse statistiškai reikšmingai nesiskyrė.
4 2. Kalcio apykaitos sutrikimų dažnis pacientams su skirtinga hiperparatirozės rūšimi statistiškai
reikšmingai skyrėsi. Sergant pirmine hiperparatiroze dominavo hiperkalcemija.
Skirtingos hiperparatirozės grupėse hiperkalcemijos sunkumo (laipsnių) pasireiškimo skirtumų nenustatyta.
3. Parathormono ir kalcio koncentracija tarp pirmine, antrine ir kita/tretine hiperparatiroze sergančių tiriamųjų statistiškai reikšmingai skyrėsi. Mažiausios parathormono ir didžiausios kalcio koncentracijos buvo nustatytos pirmine hiperparatiroze sergantiems asmenims.
Nustatytas statistiškai reikšmingas koreliacinis ryšys tarp parathormono ir fosforo, kreatinino, šlapalo koncentracijų antrine ir kita/tretine hiperparatiroze sergantiems asmenims.
5
ABSTRACT
Author of Master Thesis. Elvinas Noreika
Title of Master's thesis. Laboratory Evaluation of Calcium Metabolism Disorders in Patients With Hyperparathyroidism.
The aim. To evaluate the causes of calcium metabolism in patients with hyperparathyroidism, leaning on laboratory test results of parathyroid gland hormone and other indicators.
Objectives.
1. To evaluate the occurrence of primary, secondary and other/tertiary hyperparathyroidism and the distribution of patients by gender, age in different groups of hyperparathyroidism.
2. To evaluate the disorders of calcium metabolism, their occurrence and levels of severity in patients, considering different types of hyperparathyroidism.
3. To evaluate the blood levels of parathormone and calcium, their interconnection and correlation with other demographic indicators in patients with different type of hyperparathyroidism.
Materials and methods. Patients involved in the research were tested in Lithuanian University of Health Sciences Kaunas Clinics from 01 January 2017 to 31 August 2019 parathormone, calcium and other laboratory tests were performed to diagnose the disorders of calcium metabolism. The research was retrospective, the laboratory test results and case histories were analyzed. Intact parathyroid hormone (iPTH) concentration in serum analysis was performed using TOSOH BIOSCIENCE AIA-360 (Tosoh Corporation, Japan) analyzer. Calcium concentration and other biochemical analyses were performed using the SYNCHRON LX® system UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, USA) system.
Results. The study group consisted of 93 adult patients: 60 women and 33 men. Subjects were divided into 3 groups according to their diagnosis: primary, secondary, and other/tertiary hyperparathyroidism. More than half (54,8 %) were diagnosed with secondary hyperparathyroidism, respectively 30,1 % with primary and 15,1 % with other/tertiary hyperparathyroidism. Disorders of calcium metabolism were observed in 63,4 % of patients: hypercalcemia in 28,0 % of patients and hypocalcemia in 35,4 % of patients. The majority of patients (69,2 %) were diagnosed with light hypercalcemia, medium, and high-level hypercalcemia was observed in 23,1 % and 7,7 % of patients respectively.
Conclusions.
1. Among patients with hyperparathyroidism dominated patients with secondary hyperparathyroidism, the smallest part consisted of patients with other/tertiary hyperparathyroidism. The distribution by age and gender was not statistically significant.
6
2. The occurrence of calcium metabolism disorders in patients with different type of hyperparathyroidism differed and was statistically significant. Hypercalcemia was the dominant type of calcium metabolism disorders in primary hyperparathyroidism.
The difference of hypercalcemia severity levels was not observed in different groups of hyperparathyroidism.
3. The difference of blood levels of parathormone and calcium was not statistically significant among primary, secondary and other/tertiary type of hyperparathyroidism. The lowest blood levels of parathormone and highest blood levels of calcium were observed in patients with primary hyperparathyroidism.
A statistically significant correlation between blood levels of parathormone and blood levels of phosphorus, creatinine and urea was observed in patients with secondary and other/tertiary hyperparathyroidism.
7
P
ADĖKA
Dėkoju savo baigiamojo magistro darbo vadovei doc. dr. Daivai Urbonienei už skirtą laiką, naudingus patarimus, pagalbą ir kantrybę ruošiant baigiamąjį darbą.
I
NTERESŲ KONFLIKTAS
Atliekant šį darbą autoriui interesų konflikto nebuvo.
BIOETIKOS CENTRO PRITARIMAS TYRIMUI
Tyrimui atlikti ir archyvo duomenims naudoti gautas LSMU Bioetikos centro pritarimas 2019 – 02 – 21 Nr. BEC–LMB(M) – 301 (žr. 1 priedas).
8
SANTRUMPOS
BCP – (angl. bromocresol purple) bromkrezolio purpurinis
Ca – kalcis
cAMP – (angl. cyclic adenosine monophosphate) ciklinis adenozino mono fosfatas
CaSR – (angl. calcium-sensing receptor) kalciui jautrūs receptoriai
CRB – C-reaktyvusis baltymas
ºC – Celsijaus laipsnis
ECF – (angl. extracellular fluid) ekstraląstelinis skystis
FGF-23 – (angl. fibroblast growing factor-23) fibroblastų augimo faktorius-23
FGFR1 – (angl. fibroblast growth factor receptor 1) fibroblastų augimo faktoriaus receptorius 1
g – (angl. relative centrifuge force expressed in units of gravity) – išcentrinė jėga
GSK-3 – (angl. glycogen synthase kinase) glikogeno sintazės kinazė-3
IL-6 – interleukinas 6
IMPazė – (angl. inositol monophosphatase) inozitolio monofosfatazė iPTH – intaktinis prieskydinių liaukų hormonas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos
KMI – kūno masės indeksas
LIL – lėtinė inkstų liga
LIS – ligoninės informacinė sistema
ll – laisvės laipsniai
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Md – imties mediana
pH – vandenilio jonų koncentracija PHPT – pirminė hiperparatirozė
proc. – procentas
PTH – parathormonas, paratiroidinas, paratirinas (prieskydinių liaukų hormonas)
PTH1R – (angl. parathyroid hormone 1 receptor) parathormono 1 receptorius
9 PTHrP – (angl. parathyroid hormone-related peptide) parathormono
peptidas
r – Spearman koreliacijos koeficientas
RANKL – (angl. receptor activator of nuclear factor kappa - В ligand) receptorius, aktyvuojantis branduolio faktorius kappa-B VDR – (angl. vitamin D receptor) vitamino D receptorius Q1, Q3 – pirmasis ir trečiasis kvartiliai
χ2 – Chi kvadrato kriterijus
1,25(OH)2D3 – 1,25-dihidroksicholekalciferolis/kalcitriolis 1α(OH) – (angl. 1-alpha-hydroxylase) 1-alfa-hirdoksilazė 24,25(OH)2D3 – 24,25-dihidroksicholekalciferolis
25(OH)D – 25-hidroksicholekalciferolis, 25-hidroksivitaminas D
4MPU – (angl. 4-Methylumbelliferyl phosphate) 4-metilumbeliferilo fosfatas
10
ĮVADAS
Kalcis yra vienas svarbiausių dvivalenčių katijonų, kuris yra ne tik gausiausias kauluose esantis elementas, padedantis palaikyti kūno formą, bet ir viena iš svarbiausių signalinių molekulių, kurios koncentracija ląstelėje ir už jos ribų yra palaikoma griežtose ribose (1). Kalcio apykaitos sutrikimai – dažna problema, su kuria susiduriama kasdienėje klinikinėje praktikoje, tačiau duomenų apie kalcio apykaitos sutrikimų epidemiologiją vis dar trūksta.
Hiperkalcemija yra apibūdinama kaip klinikinė būklė, kai kalcio koncentracija kraujo serume yra neįprastai didelė (2). Hiperkalcemija nėra savaime kylanti būklė, tai – kitų ligų ar būklių nulemta komplikacija, kuriai būdingi nespecifiniai požymiai ir simptomai, susiję su kalcio koncentracijos serume padidėjimu, padidėjimo greičiu ir pagrindine liga, sukeliančia hiperkalcemiją (3). Hiperkalcemija pavojinga tuo, kad gali sukelti gyvybei pavojingas komplikacijas, todėl neretai pacientams su sunkia hiperkalcemija yra reikalinga skubi pagalba ir gydymas siekiant išvengti sunkaus organų pažeidimo ar mirties (4, 5). O ir mirštamumo rizika tarp sergančiųjų hiperkalcemija yra didesnė lyginant su pacientais, kuriems pasireiškia hipokalcemija (6). Epidemiologiniai hiperkalcemijos duomenys kontraversiški ir tai labiausiai priklauso nuo tiriamojoje populiacijoje vyraujančios pagrindinės, hiperkalcemiją lemiančios ligos. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad bendroje populiacijoje hiperkalcemija pasireiškia iki 3- 4 proc. žmonių (2, 7, 8), kituose šaltiniuose nurodomas mažesnis hiperkalcemijos dažnis, siekiantis 1- 2 proc. (9). Dažniausiai hiperkalcemija diagnozuojama atsitiktinai: pirminės sveikatos priežiūros įstaigose, skubios pagalbos skyriuose ar hospitalizuotiems pacientams (10). Nors hiperkalcemija ir yra rimta problema, sukelianti gyvybei pavojingas komplikacijas, tačiau dar ir šiomis dienomis profilaktiniai kalcio koncentracijos tyrimai rutininėje medicinos praktikoje nėra atliekami, o kalcio koncentracijos sutrikimai aptinkami tik tada, kai klinikinė simptomatika būna ryški.
Hiperkalcemija yra susijusi su daugybe ligų, tačiau pirminė hiperparatirozė ir kai kurie piktybiniai navikai sudaro daugiau kaip 90 proc. visų hiperkalcemijos atvejų, o hiperkalcemijos nustatymas galėtų būti kliniškai naudingas kaip diagnostinis ar prognostinis šių ligų žymuo (2, 11). Tarp rečiau pasitaikančių hiperkalcemijos priežasčių yra su vitaminu D susijusios ligos, kitos endokrininės sistemos patologijos, tam tikrų vaistų vartojimas ir kitos priežastys, tokios kaip imobilizacija (12). Pirminei hiperparatirozei būdinga padidėjusi parathormono koncentracija ir dažniausiai lengva hiperkalcemija. Šalyse, kuriose kalcio koncentracijos serume matavimai atliekami profilaktinės patikros tikslais, pirminės hiperparatirozės simptomatikos pasireiškimo dažnai nebūna. Priešingai – tose pasaulio vietose, kur kalcio koncentracija nėra reguliariai matuojama, hiperkalcemija dažniausiai būna simptominė, su skeleto ar inkstų komplikacijomis (13). Dėl nespecifinių pirminės hiperparatirozės nulemtos hiperkalcemijos simptomų diagnostika dažniausiai neatliekama tol, kol pacientams
11 nepasireiškia ūminė liga. Atlikti tyrimai rodo, kad iki 20 proc. skubios pagalbos skyriaus pacientų, kuriems nustatyta hiperkalcemija, galiausiai diagnozuojama hiperparatirozė (14).
Laboratorinė hiperkalcemijos diagnostika yra pagrindinis įrankis šios būklės identifikavimui, diferencinei priežasčių diagnostikai, prognozės nustatymui (8). Hiperkalcemijos diferencinė diagnostika apima gana platų etiologinių priežasčių spektrą, tačiau daugiausia dėmesio skiriama pirminei hiperparatirozei ir piktybinių navikų sąlygotai hiperkalcemijai, atsižvelgiant į tai, kad šios etiologijos yra labiausiai paplitusios (10, 15). Ne mažiau reikšmingas ir hiperkalcemijos laipsnio įvertinimas. Tolimesniam ištyrimui, gydymo strategijos parinkimui ar tinkamam hiperkalcemijos valdymui svarbu atskirti žmones, sergančius lengva hiperkalcemija, nuo sunkia forma sergančių. Simptomų pasireiškimas tarp sergančiųjų hiperkalcemija dažniausiai lemia sunkią ligos eigą ir priešingai – simptomų nebuvimas dažniausiai siejamas su lengvos formos hiperkalcemija (10). Svarbu tai, kad progresuojant lengvai hiperkalcemijai gali išsivystyti sunki hiperkalcemija, todėl fiziologinių normokalcemijos ir patofiziolognių hiperkalcemijos mechanizmų supratimas yra būtinas norint laiku atpažinti, diagnozuoti ir skubiai pradėti taikyti esamai etiologijai būdingą terapiją (5).
12
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Įvertinti kalcio apykaitos sutrikimų priežastis hiperparatiroze sergantiems asmenims, remiantis prieskydinių liaukų hormono ir kitų rodiklių laboratoriniais tyrimais.
Uždaviniai:
1. Įvertinti pirminės, antrinės ir kitos/tretinės hiperparatirozės rūšių dažnį bei tiriamųjų asmenų pasiskirstymą pagal lytį ir amžių skirtingose hiperparatirozės grupėse.
2. Įvertinti kalcio apykaitos sutrikimus, jų dažnį ir hiperkalcemijos sunkumo (laipsnio) pasireiškimą pacientams, atsižvelgiant į hiperparatirozės rūšį.
3. Įvertinti parathormono ir kalcio koncentracijas, jų tarpusavio ryšį ir ryšį su kitais demografiniais ir biocheminiais rodikliais pacientams su skirtinga hiperparatirozės rūšimi.
13
1. LITE
RATŪROS APŽVALGA
1.1. Kalcio funkcijos organizme
Pagal koncentraciją organizme kalcis yra penktas elementas – katijonas, atliekantis svarbų vaidmenį įvairiose biologinėse, biocheminėse organizmo reakcijose. Vienas pagrindinių vaidmenų – dalyvavimas skeleto mineralizacijoje tiek suteikiant skeletui tvirtumą, tiek sukuriant kalcio rezervą, kurio dėka palaikomas pastovus kalcio kiekis organizme (16). Kalcis taip pat dalyvauja:
• raumenų kontrakcijoje; • kraujo krešėjime; • hormonų sekrecijoje; • nervinių signalų perdavime;
• fermentų aktyvinime, ląstelių dalijimesi; • palaikant ląstelių membranos stabilumą;
• kalcis taip pat yra svarbus genetiškai nulemtai ląstelių žūčiai – apoptozei, nes dalyvauja laisvųjų radikalų gamyboje, citokinų išsiskyrime, proteazių aktyvacijoje (17, 18).
1.2. Kalcio pasiskirstymas organizme
Suaugusio žmogaus organizme (1 pav.) yra 1000-1300 g kalcio. Beveik visas jis (98-99 proc.) susitelkęs kauluose, dantyse ir yra saugomas hidroksiapatito (Ca10(PO4)6(OH)2) pavidalu. Likusi dalis (1-2 proc.) – lengvai prieinamas kalcis, pasiskirsto tarp minkštųjų audinių ląstelių ir ekstraląstelinio skysčio (ECF) – intersticinio skysčio ir kraujo plazmos (15). Įprastinėmis fiziologinėmis sąlygomis kalcio koncentracija ECF ir visame organizme yra daugiau ar mažiau fiksuota, tačiau patologinėmis sąlygomis kalcio koncentracijos pusiausvyra pakinta, todėl turi būti koreguojama. Nuolat palaikoma kalcio koncentracijos pusiausvyra ląstelėse ir už jos ribų svarbi funkciniam ląstelės gyvavimui, todėl reguliacinių mechanizmų dėka palaikomas pastovus gradientas (10000:1) tarp ECF ir intraląstelinio kalcio jonų (19).
Kraujo plazmoje cirkuliuoja tik 8,7 mmol (350 mg) kalcio, kurio koncentracija svyruoja maždaug tarp 2,15-2,5 mmol/l. Kalcis serume yra trijų formų: 35-40 proc. yra susijungęs su plazmos baltymais, daugiausia albuminu, 10 proc. yra komplekse su įvairiais anijonais (bikarbonatu, laktatu, fosfatu, citratu ir kt.), likę 50-55 proc. cirkuliuoja kaip „laisvas“ jonizuotas kalcis (Ca2+), kurio koncentracija yra maždaug 1,25 mmol/l (20). Kalcio prisijungimas prie albumino priklauso nuo vandenilio jonų koncentracijos (pH). Esant mažesnei pH reikšmei, albuminas turi mažiau kalcio jungimosi vietų, todėl padidėja laisvojo kalcio koncentracija. Taigi kuo pH reikšmė yra didesnė, tuo laisvojo kalcio koncentracija yra mažesnė (20).
14
1 pav. Kalcio pasiskirstymas organizme (modifikuota pagal (22))
1.2.1. Kalcio balansas ir homeostazė
Homeostaziniai mechanizmai organizme užtikrina, kad kalcio koncentracija nuolat būtų išlaikyta daugiau ar mažiau pastoviose, griežtai apibrėžtose ribose, kadangi kalcio koncentracijos pokyčiai organizme gali turėti neigiamą poveikį.
Pastovus kalcio kiekis organizme priklauso nuo kelių pagrindinių veiksnių: bendros kaulų būklės – pagrindinio kalcio rezervo organizme, su maistu gaunamo kalcio kiekio, absorbcijos žarnyne ir jo reabsorbcijos ir ekskrecijos per inkstus (16). Visgi svarbiausią vaidmenį palaikant kalcio balansą (2 pav.), t.y. užtikrinant pastovų kalcio kiekį organizme, atlieka su maistu gaunamas kalcis ir efektyvi jo absorbcija žarnyne (20). Nustatyta, kad iš 1 g kalcio, gaunamo su maistu, maždaug 400 mg absorbuojama žarnyne, o su išmatomis prarandama maždaug 200 mg per dieną, todėl grynoji kalcio absorbcija taip pat yra maždaug 200 mg per dieną (20 proc.). Maždaug 80 proc. viso paros kalcio išsiskiria su išmatomis, o likę 20 proc. išsiskiria su šlapimu (22).
Bendras kalcio kiekis organizme 1000-1300 g
Kalcio kiekis kauluose 98-99 proc.
Kalcio kiekis organizmo skysčuose 1-2 proc. Ektraląsteliniame skystyje 0,1 proc. Kraujo plazmoje ≈ 2,5 mmol/l 8 proc. susijungę su globulinu (0,2 mmol) 10 proc. sudaro kompleksus su anijonais (0,25 mmol) 32 proc. susijungę su albuminu (konc. 0,8 mmol/l) 50 proc. jonizuotoje formoje (konc. 1,25 mmol/l) Interscitinis skystis Intraląsteliniame skystyje 0,99 proc.
15
2 pav. Kalcio balansas sveikame organizme (modifikuota pagal (1, 20))
Kalcio koncentracijos pusiausvyra (3 pav.) organizmo ekstraląsteliniame skystyje yra reguliuojama homeostazinių mechanizmų pagalba, kurių dėka kalcio koncentracija in vivo išlaikoma gana siaurame intervale (6, 23). Žemesnė negu 0,555 mmol/l kalcio koncentracija aktyvina kalcio koncentracijos pokyčiams jautrias prieskydinių liaukų ląsteles, skatinama parathormono (PTH) sekrecija. PTH, veikdamas skirtingais mechanizmais, skatina kalcio koncentracijos didėjimą. Kitas svarbus veiksnys kalcio apykaitoje yra vitaminas D. Vitamino D, arba cholekalciferolio, šaltiniai
organizme yra jo sintezė odoje ir maisto, turtingo vitaminu D, vartojimas. Inkstuose 25-dihidroksicholekalciferolis, konvertuotas į 1,25-dihidroksicholekalciferolį, padidina kalcio ir fosfato
absorbciją virškinimo trakte, sumažina kalcio išsiskyrimą per inkstus (24). PTH veikia tiek kaulus, tiek ir inkstus per 1 tipo PTH receptorius (PTH1R). Kai PTH prisijungia prie PTH1R inkstuose ir kauluose, stimuliuojama adenililciklazė, didindama ciklinio AMP-adenozino monofosfato (cAMP) koncentracija ir aktyvuojama fosfolipazė C (1, 20). PTH aktyvina 1-alfa-hidroksilazę (1α(OH)), esančią inkstų proksimaliniuose kanalėliuose, kuri savo ruožtu paverčia 25-hidroksivitaminą D (25(OH)D) aktyvesniu 1,25-dihidroksivitaminu D (1,25(OH)2D3). Antra, PTH stimuliuoja kalcio reabsorbciją distalinėje nefrono dalyje ir fosforo išsiskyrimą per inkstus su šlapimu. Trečia, PTH skatina kalcio mobilizaciją iš kaulų veikiant kartu su 1,25-dihidroksivitaminu D. Laisvo kalcio koncentracija fiksuojama kalciui
800 mg 200 mg 9800 mg 10000 mg 200 mg 400 mg 500 mg 500 mg
16 jautriais receptoriais (CaSR), esančiais prieskydinių liaukų ląstelių paviršiuje ir inkstuose – Henle kilpoje. Padidėjęs laisvo kalcio kiekis aktyvina CaSR receptorius. Neigiamojo grįžtamojo ryšio principu slopinama tiek PTH sekrecija, tiek prieskydinių ląstelių proliferacija, taip pat slopinama kalcio reabsorbcija inkstų kanalėliuose. Atvirkščiai, laisvo kalcio koncentracijos sumažėjimas deaktyvina CaSR receptorius, tokiu būdu PTH sintezė ir sekrecija prieskydinėse liaukose ir kalcio reabsorbcija inkstų kanalėliuose yra skatinama (25).
3 pav. Kalcio homeostazė (modifikuota pagal 18)
Santrumpos: Ca – kalcis; PTH – parathormonas; PO4 – fosfatas
1.3. Hiperkalcemijos samprata ir aktualumas
Kadangi jonizuoto/laisvo kalcio koncentracija yra griežtai reguliuojama dviejų pagrindinių hormonų ir jų receptorių: PTH ir PTHR bei 1,25(OH)2D3 ir VDR (vitamino D receptorius), suprantama, kad įvairios patologinės būklės, kurios sukelia PTH ir 1,25(OH)2D3 koncentracijos padidėjimą, gali sukelti kaulinio audinio rezorbciją, kalcio atsipalaidavimą, didinti absorbciją žarnyne ir reabsorbciją inkstuose. Tiesioginis šio patogenezinio mechanizmo rezultatas – kalcio koncentracijos padidėjimas, viršijantis normalius fiziologinius kalcio koncentracijos lygius, dėl kurių atsiranda būklė, vadinama hiperkalcemija (5). Hiperkalcemija yra apibrėžiama kaip pavojinga klinikinė būklė, kai laboratorinių tyrimų dinamikoje bendro kalcio koncentracija serume (koreguota albumino atžvilgiu) yra didesnė negu 2,5 mmol/l (26). Hiperkalcemija yra diagnozuojama, kai kalcio koncentracija mažiausiai dviejuose mėginiuose per vieną savaitę trijų mėnesių laikotarpiu yra dviem standartiniais nuokrypiais aukštesnė už koncentracijas, nustatytas referentinėse laboratorijose (7, 10). Atsižvelgiant į bendrą kalcio kiekį
Ca Prieskydinės liaukos Neigiamas grįžtamasis ryšys PTH Kalcio ir fosforo rezorbcija 1 α – hidroksilazė Ca reabsorbcija PO4 ekskrecija PO4 Ca Maistas Vit D Sintezė odoje Silpnas slopinimas 25(OH)D 1,25(OH)2 D Kalcio ir fosforo absorbcija 25 - hidroksilazė
17 serume, hiperkalcemiją sąlyginai galima suskirstyti į tris kategorijas: lengvą, vidutinio sunkumo ir sunkią hiperkalcemiją (1 lentelė). Pacientams su lengva hiperkalcemija klinikiniai simptomai pasireiškia retai (27). Klinikinė hiperkalcemijos raiška yra įvairi, nespecifinė ir dažniausiai nesusijusi su konkrečia etiologine priežastimi. Simptomatika yra glaudžiai susijusi ne tik su absoliučiu kalcio kiekio padidėjimu kraujo serume, bet ir jo padidėjimo greičiu (28, 29). Todėl vidutinio sunkumo hiperkalcemija, atsirandanti per keletą mėnesių, gali būti gerai toleruojama, nesukelianti žymios simptomatikos. Priešingai, panašus hiperkalcemijos lygis, atsirandantis per kelias savaites, gali nulemti ryškios simptomatikos pasireiškimą. Sunki hiperkalcemija beveik visada pasižymi ryškia simptomatika tiek dėl absoliutaus kalcio kiekio padidėjimo serume per kelias savaites ar mėnesius, tiek dėl to, kad tokia hiperkalcemija dažnai siejama su piktybine liga (30). Ši hiperkalcemijos forma reikalauja skubios kalcio koncentracijos serume korekcijos, ypač dėl didelės širdies ritmo sutrikimų ar net komos tikimybės (27).
Klinikinė simptomatika gali pasireikšti daugelyje organizmo sistemų: širdies ir kraujagyslių, ypač piktybinių navikų sukelta hiperkalcemija gali paveikti ir virškinamąjį traktą, kyla šlapimo organų sistemos pažeidimų. Klinikiniai neurologiniai ir raumenų sistemos požymiai dažnai būna daug ryškesni esant vidutinio sunkumo ar sunkiam hiperkalcemijos lygiui (9). Visų minėtų sistemų pažeidimų simptomai ir požymiai, kurie kyla dėl hiperkalcemijos, ypač sąlygotos pirminės hiperparatirozės, paskatino mnemoninės priemonės (angl. stones, bones, (abdominal) moans, and (psychic) groans) atsiradimą (31). „Stones“ terminas apima šlapimo šalinimo sistemos pažeidimų simptomus, tokius kaip nefrolitiazė, poliurija, nefrogeninės kilmės necukrinio diabeto sąlygota polidipsija, dehidratacija. „Bones“ – su vykstančiais procesais kauluose susiję požymiai akivaizdūs pacientams, sergantiems pirmine hiperparatiroze, sukeliančia padidėjusią kaulų rezorbciją, dėl to atsiranda osteoporozė ar fibrozinis cistinis osteitas. „Moans“ apima simptomus, susijusius su virškinimo sistema. Paprastai pacientai varginami pykinimo, vėmimo, pilvo skausmo. Pacientams sergantiems sunkia hiperkalcemija, taip pat gali susiformuoti pepsinės opos ir/ar pankreatitas dėl padidėjusios skrandžio rūgšties ir kasos fermentų sekrecijos. „Groans“ – simptomai, kuriuos sukelia psichinis ir neuromuskulinis hiperkalcemijos poveikis. Pacientai dažnai skundžiasi nuovargiu, atminties bei aktyvumo praradimu, depresija ir raumenų silpnumu (32).
18
1 lentelė. Hiperkalcemijos laipsniai ir klinikinė raiška (modifikuota pagal (30, 32))
1.4. Hiperkalcemijos etiologija ir patogenezė
Tarp hiperkalcemijos priežasčių (2 lentelė) pirminė hiperparatirozė (PHPT) ir piktybinės ligos yra pačios dažniausios, apimančios 80-90 proc. visų hiperkalcemijos atvejų (27, 28). Pagal kilmės mechanizmus hiperkalcemijos priežastys sąlyginai gali būti skirstomos į parathormono sąlygotas ir nuo parathormono nepriklausomas (10). PHPT yra pagrindinė hiperkalcemijos priežastis (60 proc.) tarp ambulatorinių pacientų, tuo tarpu sąlygota piktybinių navikų – pagrindinė hospitalizuotų pacientų hiperkalcemijos priežastis (54-65 proc.). Kitos hiperkalcemiją sukeliančios priežastys pasitaiko, palyginti, retai. Tai su vitaminu D susijusi, medikamentų poveikio sukelta, kitų endokrininių ir genetinių ligų bei kitų priežasčių nulemta hiperkalcemija (26).
Hiperkalcemijos lygis (koreguota albumino atžvilgiu bendro kalcio koncentracija) Lengva (>2,65-3 mmol/l) Vidutinė (>3-3,5 mmol/l) Sunki (>3,5 mmol/l) O rgan ų s iste ma Širdies ir kraujagyslių sistema • Sutrumpėjęs QT intervalas • ST segmento pokyčiai • Pailgėję PER ir QRS intervalai • Sutrumpėjęs QT intervalas • ST segmento pokyčiai • Pailgėję PER ir QRS intervalai • Aritmija • Tachikardija • Širdies sustojimas Virškinimo sistema • Anoreksija • Vidurių užkietėjimas • Pykinimas • Vėmimas • Lėtinis svorio netekimas • Pankreatitas • Skrandžio opos Šlapimo šalinimo sistema • Poliurija • Dehidratacija • Ūminis inkstų pažeidimas • Lėtinė inkstų liga Nervinė sistema • Nuovargis • Nerimas • Depresija • Psichinės būklės pokyčiai • Hiporefleksija • Letargija • Sumišimas • Stuporas • Koma Raumenų – skeleto sistema - • Silpnumas • Silpnumas
19
2 lentelė Hiperkalcemijos priežastys (modifikuota pagal (3, 4, 36))
1.4.1. Parathormono sąlygota hiperkalcemija Pirminės hiperparatirozės sąlygota hiperkalcemija
Klasikinė pirminė hiperparatirozė (PHPT) sukelianti hiperkalcemiją, pasižymi padidėjusia PTH koncentracija dėl suintensyvėjusios PTH sintezės vienoje ar keliose prieskydinėse liaukose (35, 36). Pirminė hiperparatirozė gali kilti tiek sporadiškai, tiek pasireikšti kaip šeiminė liga. Dažniausiai – 80 proc. atvejų PHPT priežastis – vienos iš keturių prieskydinių liaukų adenoma, kurios metu dėl somatinių CaSR mutacijų ir rezistentiškumo ekstraląsteliniam kalciui prieskydinių liaukų ląstelėse pakinta jautrumo riba kalciui – pakyla aukščiau normalaus lygio (34). Visų keturių prieskydinių liaukų hiperplazijos ir adenomos sukeltas PHPT pasitaiko rečiau – 15- 20 proc. atvejų. Prieskydinių liaukų karcinoma, kaip PHPT priežastis, sudaro tik 1 proc. visų ligos atvejų (13, 21). Anksčiau PHPT pacientams būdavo nustatomas tik esant sunkiai hiperkalcemijai su ryškiomis skeleto bei inkstų komplikacijomis. Per pastaruosius dešimtmečius šalyse, kuriose tampa įprasta profilaktiškai atlikti laboratorinius kraujo tyrimus, klinikinės PHPT fenotipas pasikeitė. Skeleto ir inkstų komplikacijos
Parathormono sąlygota hiperkalcemija Pirminė hiperparatirozės sąlygota Tretinės hiperparatirozės sąlygota Šeiminė hipokalciurinė hiperkalcemija Ličio preparatų sąlygota • Adenoma; • Hiperplazija; • Karcinoma (retai).
Nuo parathormono nepriklausoma hiperkalcemija
Piktybiniai navikai: Vitamino D sąlygota: Endokrininės ligos Medikamentai • Parathormono peptido sąlygota; • Perteklinė 1, 25 dihidroksivitamino D produkcija; • Vietinė osteolizė ir kt. • Granulomos (tuberkuliozė, sarkoidozė, histoplazmozė ir kt.); • Intoksikacija vitaminu D (papildai, metabolitai, analogai). • Tirotoksikozė; • Antinksčių nepakankamumas; • Feochromacitoma; • VIPoma (Verner-Morrison sindromas). • Tiazidai; • Vitaminas A; • Milk-alkali sindromas; • PTH preparatai. Kitos priežastys ir būklės (lėtinė inkstų liga, imobilizacija, genetinis polinkis, ūminis inkstų nepakankamumas ir kt.)
20 nebėra tipiškos PHPT sąlygotos hiperkalcemijos komplikacijos. Ankstyvos diagnostikos dėka, tokios patologinės būklės, kaip PHPT, diagnozuojamos ir gydymas pradedamas anksčiau (13).
Antrinės ir tretinės hiperparatirozės sąlygota hiperkalcemija
Antrinė ir tretinė hiperparatirozė tarpusavyje glaudžiai susijusios. Antrinė hiperparatirozė išsivysto dėl difuzinės prieskydinių liaukų hiperplazijos ir yra siejama su sudėtingais mineralinių medžiagų metabolizmo sutrikimais, kurie dažniausiai atsiranda kaip tiesioginė lėtinės inkstų ligos komplikacija ar dėl kitų, retai pasireiškiančių priežasčių (pvz. vitamino D stokos) (37, 38). Tuo tarpu tretinė hiperparatirozė – antrinės hiperparatirozės virtimas hiperkalcemine būsena – atspindi autonominę PTH hipersekreciją, sąlygotą adenomos, ar retais atvejais PTH hipersekreciją sukeliančią karcinomą, kurių susiformavimą hiperplazijos fone sukelia ilgai trunkanti, negydoma antrinė hiperparatirozė (39). Hiperparatirozė, tiek antrinė, tiek tretinė, yra dažna komplikacija, kurios paplitimas siekia 30-49 proc. tarp pacientų, sergančių galutinės stadijos lėtine inkstų liga (40).
Lėtinės inkstų ligos sąlygota antrinė hiperparatirozė
Lėtinė inkstų liga yra charakterizuojama kaip laipsniškas, progresuojantis inkstų funkcijos sutrikimas su didele galutinės inkstų ligos stadijos rizika, nepriklausomai nuo to, ar nepakankamumą inicijuojantis priežastinis veiksnys regresuoja ar yra išlikęs. Lėtinės inkstų ligos rizika su amžiumi didėja, maždaug pusė sergančiųjų ≥ 3 stadijos lėtine inkstų liga yra vyresni nei 70 metų asmenys (41). Per pastaruosius du dešimtmečius pagyvenusių pacientų, sergančių galutinės stadijos lėtine inkstų liga, smarkiai padaugėjo: vyresni nei 65 metų amžiaus asmenys sudaro didžiausią galutinės inkstų ligos stadijos grupę. Nors sergamumo lėtine inkstų liga didėjimas (nuo 10,3 proc. iki 13,1 proc. gyventojų) stebimas visoje populiacijoje, tačiau sparčiausiai sergamumas lėtine inkstų liga didėja minėtoje vyresnių asmenų populiacijoje (nuo 37 proc. iki 47 proc.) (42). Lėtinę inkstų ligą lydinti antrinė hiperparatirozė sukelia kalcio nusėdimą minkštuosiuose audiniuose, pažeidžiama širdies ir kraujagyslių sistema, dėl ko didėja sergančiųjų mirštamumo rizika. Didžioji dalis pakitimų yra negrįžtami, todėl ypatingas dėmesys skiriamas ankstyvam kalcio ir fosforo apykaitos sutrikimų ir antrinės hiperparatirozės optimizavimui (38, 43) .
Antrinė hiperparatirozė pasireiškia pažengusios stadijos lėtinėmis inkstų ligomis sergantiems asmenims, kai sumažėjęs aktyvaus vitamino D susidarymas inkstuose ir kiti veiksniai sukelia hipokalcemiją ir lėtinę PTH sekrecijos stimuliaciją. Progresuojant lėtinei inkstų ligai prisideda ir hiperfosfatemija (43, 44). Silpstant inkstų funkcijai sutrinka kalcio ir fosforo homeostazės bioreguliavimo mechanizmas. Mažiau fosforo išskiriama per instus, kas sukelia padidėjusį fosforo kiekį serume – hiperfosfatemiją. Padidėja fibroblastų augimo faktoriaus 23 (FGF-23) kiekis ir sumažėja
21 kalcitriolio sintezė. FGF-23 yra hormonas, kurio gamybą osteocituose ir osteoblastuose stimuliuoja padidėjęs fosforo ir kalcitriolio kiekis. FGF-23 jungiasi ir aktyvina fibroblastų augimo faktoriaus receptorius (FGFR1), kurie veikia tik tuo atveju, jei kartu ekspresuojamas ir klotho transmembraninis baltymas. Proksimaliniame inkstų kanalėlyje FGF-23 sumažina fosforo reabsorbciją sumažindamas II tipo natrio fosfato kotransporterių ekspresiją (44). Nustatyta, kad antrinė hiperparatirozė galutinės stadijos lėtine inkstų liga sergantiems pacientams pasireiškia nuo 54,1 proc. iki 77.9 proc. (Ispanijoje) (45), kitose Europos šalyse 30-49 proc., Amerikoje (JAV, Kanada) 54 proc. (46). Nustačius hiperparatirozę gali pasireikšti tiek normokalcemija, tiek hipokalcemija, tačiau progresuojant antrinei hiperparatirozei kalcio koncentracija gali smarkiai padidėti ir pasireiškia hiperkalcemija – tokia būklė laikoma tretine hiperparatiroze (47, 48).
Nuolatinis prieskydinių liaukų stimuliavimas padidėjusia fosforo koncentracija, sumažėjęs tarpląstelinio jonizuoto kalcio kiekis ir pastebimai mažas kalcitriolio kiekis serume padidina PTH sintezę ir išsiskyrimą. Padidėjusi FGF-23 ekspresija sumažina 25(OH)-1-hidroksilazės aktyvumą ir veikia kaip papildomas antrinės hiperparatirozės progresavimą skatinantis veiksnys. Jau ankstyvose hiperparatirozės vystymosi stadijose šiuos pokyčius apsunkina kintamas kalciui jautrių receptorių kiekis ir nepakankama vitamino D receptorių ekspresija, todėl prieskydinės liaukos ląstelės nesugeba tinkamai reaguoti į kalcį ir/arba kalcitriolį. Dėl to padidėjęs prieskydinių liaukų proliferacinis aktyvumas ilgainiui sukelia prieskydinių liaukų hiperplaziją (43, 48) (4 pav.). Dėl užsitęsusios prieskydinių liaukų stimuliacijos inicijuojama difuzinė polikloninė hiperplazija. Antrinei hiperparatirozei pažengus stebima intensyvi monokloninė prieskydinių liaukų ląstelių proliferacija. Ląstelių klonai užima didžiąją dalį liaukos ir sudaro vieną didelį mazgelį, kaip pavaizduota 5 paveiksle. Hiperplazijai progresuojant tiek klotho, tiek FGFR1 ekspresija sumažėja ir neigiamai koreliuoja su hiperplastinio prieskydinio audinio tūriu (38). Tyrimai rodo, kad signalo perdavimas per CaSR yra vienas svarbiausių prieskydinių liaukų ląstelių proliferaciją ir prieskydinių liaukų hiperplaziją skatinantis veiksnys. Modelių pagalba nustatyta, kad, be minėtų CaSR, proliferaciją sukelia ir VDR receptorių ekspresijos sumažėjimas. Sumažėjusi VDR ir CaSR raiška lemia mazginę hiperplaziją. Priešingas efektas – minėtų receptorių padidėjimas ir proliferacinio aktyvumo sumažėjimas stebimas papildomai vartojant kalcimimetikus bei kalcitriolį. Dėl pažengusios antrinės hiperparatirozės mazginės transformacijos sumažėja VDR ir CaSR raiška, todėl sumažėja PTH sekreciją slopinantis kalcitriolio ir kalcio poveikis. Dėl sunkios hiperparatirozės gali kilti hiperkalcemija ir hiperfosfatemija, kurią lemia kalcio ir fosforo ekskrecija iš skeleto (48). Kyla tretinė hiperparatirozė, kai pakitęs CaSR jautrumo taškas kalciui sukelia PTH sekreciją net ir tada, kai laisvo kalcio koncentraciją serume yra padidėjusi (49).
22 Šeiminė hipokalciurinė hiperkalcemija
Nuo PTH priklausomos genetinės formos pavyzdžiu galima laikyti šeiminę hipokalciurinę hiperkalcemiją, dar žinomą kaip gerybinę hiperkalcemiją. Ši hiperkalcemijos forma pasireiškia dėl pakitusių kalciui jautrių receptorių funkcijos ir sumažėjusio jautrumo ekstraląstelinio kalcio padidėjimui. Tai autosominis dominantinis sutrikimas, sukeliantis lengvas, neretai besimptomes hiperkalcemijas (50). Šios hiperkalcemijos susiformavimo mechanizmas susijęs su CaSR receptorių geno mutacijomis. Kadangi CaSR receptoriai yra atsakingi už bendrą audinių jautrumą kalcio koncentracijai organizme, todėl suprantama, kad šio geno mutacija paveikia svarbias kalcio homeostazės dalis. Genas, būdamas atsakingas už CaSR jautrumą kalciui, svarbus prieskydinių liaukų išskiriamo parathormono sintezės reguliacijoje bei kalcio ekskrecijoje per inkstus. Dėl nevisavertės CaSR receptorių funkcijos PTH sekrecija vyksta ir toliau, taip pat nėra slopinama ir nuolatinė kalcio reabsorbcija inkstų kanalėliuose – pasireiškia hipokalciurija (35). Minėto geno mutacija kliniškai pasireiškia kalcio kiekio serume padidėjimu bei mažu kalcio – kreatinino koncentracijos santykiu šlapime (51). Be to, mutacijos raiška priklauso ir nuo paveldėjimo tipo. Heterozigotiniams individams ši mutacija, dažniausiai nesukelia pastebimų klinikinių reiškinių, tačiau homozigotinius alelius paveldėjusiems asmenims, ypač kūdikiams, pasireiškia sunki hiperparatirozė (50). Svarbu diferencijuoti retą (1 iš 78000 žmonių) šeiminę hipokalciurinę hiperkalcemiją, nuo tokių būklių kaip pirminė hiperparatirozė, siekiant išvengti nereikalingos paratiroidektomijos. Šeiminės hipokalciurinės hiperkalcemijos atveju chirurginis gydymas nėra efektyvus, nepadeda sumažinti kalcio koncentracijos serume, išskyrus totalinį prieskydinių liaukų pašalinimą, kuris lemtų hipokalcemijos išsivystymą (50, 52).
Ličio preparatų sąlygota hiperkalcemija
Ličio sukeltą hiperkalcemiją taip pat galima laikyti nuo parathormono priklausoma hiperkalcemijos forma. Litis skatina parathormono hipersekreciją ir padidina kalcio reabsorbciją inkstuose (10, 24). Manoma, kad ličio jonai yra ypač svarbūs signalo perdavimo keliuose. Išskiriami du pagrindiniai ličio veikimo būdai, kurie gali būti susiję ir su ličio vaidmeniu hiperkalcemijos susiformavime: inozitolio mono-fosfatazės (IMPazės), svarbios ląstelių reguliavimo funkcijoms, tokioms kaip ląstelių augimas ir apoptozė, slopinimas ir glikogeno sintazės kinazės-3 (GSK-3), svarbios apoptozei, slopinimas. Ličio poveikyje sukeltas IMPazės slopinimas prieskydinių liaukų ląstelėse lemia tarpląstelinio kalcio koncentracijos pokyčius bei didina PTH sekreciją. Kaip viena iš galimų ličio poveikio teorijų yra ta, kad litis sąveikauja su kalciui jautriais receptoriais, juos stimuliuodamas, o tai lemia ne tik kalcio koncentracijos, bet ir PTH padidėjimą, kadangi ląstelės, kurių paviršiuje yra lokalizuoti CaSR, receptoriai reaguoja taip, lyg kalcio koncentracija organizme būtų sumažėjusi (53, 54).
23
4 pav. Antrinės hiperparatirozės patogenezinis mechanizmas (modifikuota pagal (52))
Santrumpos: VDR – vitamino D receptorius; CaSR – kalciui jautrūs receptoriai; PTH – parathormonas; FGFR – fibroblastų augimo faktoriaus receptorius; FGF-23 – fibroblastų augimo faktorius-23
5 pav. Prieskydinės liaukos hiperplazavimas progresuojant antrinei hiperparatirozei
(modifikuota pagal (47, 52))
Santrumpos: VDR – vitamino D receptorius; CaSR – kalciui jautrūs receproriai
1.4.2. Nuo parathormono nepriklausoma hiperkalcemija
Kitų (ne prieskydinių liaukų) piktybinių navikų sąlygota hiperkalcemija
Piktybinių navikų sukeltą hiperkalcemiją galima suskirstyti į keletą tipų, priklausomai nuo to, kokiu mechanizmu yra veikiama mineralinių medžiagų apykaita (55). Pirmoji ir labiausiai paplitusi (apie 80 proc.) – humoralinė, piktybinių navikų sąlygota hiperkalcemija. Jos kilmės mechanizmas susijęs su paraneoplastiniu sindromu – naviko produkuojamu, nereguliuojamu parathormono peptido (PTHrP) kiekiu, kuris organizme veikia panašiai kaip paratiroidinis hormonas. PTHrP sekrecijos poveikyje didėja osteoklastų aktyvumas ir kalcio rezorbcija iš kaulų, todėl kalcio koncentracija kraujo serume didėja. Visa tai vyksta veikiant antriniam mechanizmui, kuriame PTHrP aktyvuoja osteoblastus
Normali liauka Difuzinė hiperplazija Besiformuojantis mazgas Mazginė hiperplazija Liauka sudaryta iš vieno mazgo
Difuzinė hiperplazija Polikloninė mazginė hiperplazija Monokloninė mazginė hiperplazija VDR ↓ CaSR ↓ CaSR ↓↓↓ VDR ↓↓↓ VDR ↓ CaSR ↓
24 gaminti branduolinio faktoriaus кB ligando receptoriaus aktyvatorius (RANKL) (56). Nustatyta, kad dažnai PTHrP produkcija pasižymi krūties vėžys, T ląstelių leukemija/limfoma, plaučių vėžys, ne Hodžkino limfoma, kiek mažiau PTHrP sekrecija būdinga inkstų, kepenų, kasos navikams, tačiau PTHrP gali produkuoti ir kitų rūšių neoplazmos (57). Antroji pagal dažnumą (apie 20 proc.), su piktybiniais navikais susijusi hiperkalcemijos priežastis – vietinė osteolizė, kurią sukelia navikinių ląstelių metastazės kauluose. Navikinės ląstelės stimuliuoja vietinius uždegiminius mechanizmus, kurie didina osteoklastų aktyvumą. Šio tipo hiperkalcemija dažnai pastebima metastazuoti į kaulus linkusių piktybinių navikų, tokių kaip krūties vėžys ir dauginė mieloma (15, 58). Likusios rūšys pasitaiko retai ir sudaro mažiau nei 1 proc. hiperkalcemijų, susijusių su vėžiu, atvejų. Piktybinių procesų (Hodžkino ar ne Hodžkino limfomų) ar granulominių ligų metu produkuotas vitaminas D taip pat gali sukelti hiperkalcemiją (59). 1-α-hidroksilazės hipersekreciją didina kalcitonino konversiją į aktyvią vitamino D – kalcitriolio formą, todėl padidėja kalcio absorbcija virškinamajame trakte, reabsorbcija inkstuose (10). Vitamino D sąlygota hiperkalcemija
Vitamino D sąlygota hiperkalcemija dažniausiai pasitaiko dėl granulominių ligų, vitamino D, jo metabolitų perdozavimo ar net dėl nesaikingo deginimosi saulėje. Patogenezinį granulominių ligų sąlygotos hiperkalcemijos mechanizmą galima apibūdinti kaip granulominio audinio ląstelių gebėjimą aktyvinti vitaminą D, todėl kalcio kiekis kraujyje didėja. Tiek infekcinės (tuberkuliozė, kandidozė, raupsai, histoplazmozė, kokcidomikozė ir kt.), tiek ir neinfekcinės (sarkoidozė, granulomatozė, Vegenerio granulomatozė ir kt.) ligos, kurioms yra būdingas granulomų formavimasis, gali sąlygoti hiperkalcemijos atsiradimą (60). Net pusei sergančiųjų sarkoidoze gali pasireikšti hiperkalciurija, o dešimtadaliui – įvairaus sunkumo hiperkalcemija. Esant aktyviai sarkoidozei, net ir nedideli kalcitriolio substrato – kalcitonino kiekiai gali sukelti hiperkalcemiją. Vieno pagrindinių granulomų elemento – makrofagų išskiriama 1-α-hidroksilazė pasižymi panašiu veikimu kaip ir išskiriama inkstuose, tačiau priešingai nei inkstuose sekretuojama 1-α-hidroksilazės, jos koncentracija nėra reguliuoja prieskydinių
liaukų išskiriamo PTH. Tai lemia nekontroliuojamą 25-hidroksivitamino D konversiją į 1,25-dihidroksivitaminą D. Kalcitriolio poveikyje PTH slopinamas ir prarandamas jo reguliacinis
poveikis inkstuose reabsorbuoti kalcį, todėl atsiranda hiperkalciurija (59, 61). Apsinuodijimas vitaminu D ar jo metabolitais taip pat gali sukelti tiek hiperkalciuriją, tiek ir hiperkalcemiją, didinant kalcio absorbciją žarnyne ir kaulinio audinio rezorbciją. Nustatyta, kad intoksikacijos vitaminu D sąlygota hiperkalcemija pasireiškia po pernelyg didelio vitamino D suvartojimo, kuris gali kryžmiškai reaguoti su vitamino D receptoriais (62). Ne tik pastarąja, bet ir kitų tyrėjų keliamomis hipotezėmis bandoma paaiškinti vitamino D toksiškumo mechanizmą, kuriam veikiant gali išsivystyti hiperkalcemija: tai nuslopintas 24-hidroksilazės aktyvumas, dėl kurio taip pat padidėja aktyvios formos vitamino D –
25 1,25(OH)2D3 koncentracija, padidėjęs vitamino D receptorių skaičius, vitaminą D surišančio baltymo įsotinimas ar jau minėtas padidėjęs 1-α-hidroksilazės aktyvumas ir kt. (60).
Endokrininių ligų sąlygota hiperkalcemija
Endokrininių susirgimų indukuota hiperkalcemija yra gana dažna pacientams, sergantiems tirotoksikoze, kuri pasireiškia skydliaukės hormonų sintezės ir sekrecijos aktyvumo padidėjimu. Tiroksino hipersekrecijos poveikyje daugėja RANKL, sukeliančio kaulinio audinio rezorbciją. Hiperkalcemija gali pasireikšti pacientams su pirmine hiperparatiroze sergant 2 tipo dauginės neoplazijos sąlygota feochromocitoma. Kai kurios feochromocitomos geba sekretuoti parathormono peptidą arba tiesiogiai stimuliuoti kaulų rezorbciją. Adisono ligos atveju hiperkalcemija nėra plačiai paplitusi, tačiau gali būti susijusi su gretutinėmis būklėmis, tokiomis kaip ekstraląstelinio skysčio tūrio sumažėjimas, susijęs su hiperalbuminemija, ir kt. (10, 63).
Medikamentų poveikio sąlygota hiperkalcemija
Kalcio koncentracijos kraujo serume padidėjimo priežastimi gali tapti ir tam tikrų medikamentų vartojimas. Pastebimu poveikiu kalcio apykaitai ypač pasižymi diuretikai – tiazidai. Skirtingos diuretikų klasės kalcio išsiskyrimą su šlapimu veikia skirtingai. Būtent tiazidiniai diuretikai slopina kalcio išsiskyrimą su šlapimu ir dažnai vartojami gydant nefrolitiazę. Tokio diuretikų veikimo mechanizmo rezultatas – hipokalciurija ir kalcio koncentracijos serume padidėjimas – hiperkalcemija (3). Kita diuretikų klasė pasižymi priešingu veikimu – kilpiniai diuretikai – skatina kalcio išsiskyrimą su šlapimu ir naudojami gydant hiperkalcemiją. Diagnozuojant tiazidų poveikio sukeltą hiperkalcemiją svarbu įvertinti ir kitas galimai hiperkalcemiją lemiančias priežastis. Atliktų tyrimų rezultatai rodo, kad nutraukus tiazidų vartojimą kalcio koncentracija normalizuojasi ne visiems vartojusiems vaistą asmenims. Dažnai to priežastis yra jau esanti pirminė hiperparatirozė, kuri hiperkalcemijos lygį veikiant tiazidams dar labiau padidina (64).
Kitų būklių sąlygota hiperkalcemija
Imobilizacijos sukelta hiperkalcemija diagnozuojama, palyginti, retai. Tai būklė, susijusi su padidėjusį kaulų remodeliavimąsi sukeliančiais sutrikimais, taip pat sąlygomis, kai asmens judėjimas tampa ribotas (stuburo pažeidimai, kaulų lūžiai ir kt.). Esant minėtoms būklėms ar imobilizacijai, hiperkalcemijos pasireiškimo trukmė gali būti įvairi – nuo kelių savaičių iki mėnesių (65). Esant kasdieniniam, įprastiniam fiziniam krūviui, skeleto sistema daugiau ar mažiau veikiama įtampos, hormonų ar mitybos veiksnių. Būtent šie veiksniai padeda palaikyti pusiausvyrą tarp kaulinio audinio formavimosi ir destrukcijos, todėl nejudrumo atveju pusiausvyra sutrinka ir irimo procesai pradeda viršyti formavimosi. Kalcis pradeda skirtis į ekstraląstelinį skystį, o jo perteklius išsiskiria per inkstus.
26 Kai inkstai nesugeba išskirti padidėjusio kalcio kiekio taip greitai, kaip jis susidaro, pasireiškia hiperkalcemija. Neatmetama, kad imoblizacijos sąlygota hiperkalcemija gali pasireikšti ir dėl sutrikusio kalcio nusėdimo kauluose (66).
Retai, tačiau tarp hiperkalcemijos priežasčių sutinkamas ir genetinis polinkis. Hiperkalcemija atsiranda dėl hiperparatirozės esant paveldimoms dauginėms endokrininėms neoplazijoms (MENI/MENII) (34). MEN1 yra autosominis dominantinis naviko sindromas, kuriam būdingas navikų atsiradimas keliuose endokrininiuose audiniuose, pvz. prieskydinėse liaukose (95 proc.), kasos ir (arba) neuroendokrininėje sistemoje (50 proc.) ar priekinėje hipofizės dalyje. (40 proc.) Svarbu hiperparatirozę įvertinti ne tik kaip izoliuotą patologinę būklę, bet ir kaip galimų paveldimų pokyčių išraišką, kuri gali paveikti kasą (I tipas), priekinę hipofizės dalį (I, IV tipai), antinksčius ir skydliaukę (II tipas). Dažniausiai hiperkalcemiją galintis sukelti I tipas nustatomas paaugliams, kiti tipai jauname amžiuje nustatomi retai (21, 34).
Kitas genas, tiksliau jo mutacija, sąlygojanti hiperkalcemiją, mutacija CYP24A1 gene. CYP4A1 genas koduoja mitochondrijų CYP fermentą – 24-hidroksilazę, kuri katalizuoja hidroksilinimo kelią nuo 1,25(OH)2D3 iki kalcitroinės rūgšties, taip pat nuo 25(OH)D iki 24,25(OH)2D3. Geno mutacija lemia 24-hidroksilazės funkcijos defektą ir sukelia aukštą serumo aktyvaus vitamino D – 1,25(OH)2D3 kiekį, kuris lemia hiperkalcemiją. Pacientams, turintiems mutaciją CYP4A1 gene, lyginant su šeimine hipokalciurine hiperkalcemija, išsivysto ir hiperkalciurija (34, 67).
1.5. Hiperkalcemijos epidemiologija ir mirtingumas
Hiperkalcemijos paplitimas kaip atskiras tyrimų objektas nėra plačiai ištirtas. Skirtingų tyrimų duomenimis nustatyta, kad bendroje populiacijoje hiperkalcemijos paplitimas svyruoja maždaug 0,2-4 proc. (61) ir, kaip minėjau anksčiau, sąlygotas dviejų dažniausių hiperkalcemiją sukeliančių priežasčių: pirminės hiperparatirozės ir piktybinių navikų. Hiperkalcemijos paplitimas tarp sergančiųjų piktybiniais navikais, įvairių tyrimų duomenimis, svyruoja gana plačiame intervale, o tokius rezultatus dažniausiai lemia ne tik skirtingos vėžio rūšys, bet ir ligos stadija. Vieni šaltiniai nurodo, kad hiperkalcemija pasireiškia nuo 10 proc. iki 30 proc. tarp visų vėžiu sergančių asmenų (30, 68, 69), kitos studijos nurodo, kad tik apie 2-2,8 proc. visų vėžio atvejų yra tiesiogiai susiję su hiperkalcemija (70). Stebint retrospektyviai išanalizuotus duomenis galima matyti, kad ir tarp vyrų, ir tarp moterų hiperkalcemijos atvejų skaičius su amžiumi didėja (71). Piktybinių navikų sukeltos hiperkalcemijos išgyvenamumo prognozės yra prastos, priklausomai nuo piktybinio proceso, neretai išgyvenamumas siekia 2-3 mėnesius (72). Iki 80 proc. sergančiųjų piktybinių navikų sukelta hiperkalcemija gali išgyventi iki vienerių metų. Visgi mirtingumas priklauso nuo hiperkalcemijos sunkumo laipsnio: lengvos formos su mirtimi nesiejamos, o lemia tokias būkles kaip dehidratacija, pykinimas, nuovargis ir kt. Sunkesniais atvejais galima dezorientacija, koma ar net mirtis. (73).
27 1.6. Laboratorinė hiperkalcemijos diagnostika
Kadangi pirminė hiperparatirozė ir piktybiniai navikai lemia daugiau kaip 90 proc. hiperkalcemijos atvejų, šios sąlygos turi būti diferencijuotos kiek įmanoma anksčiau, kad pacientui būtų užtikrintas tinkamas gydymas ir nustatyta galima prognozė. Humoralinė piktybinių navikų sąlygota hiperkalcemija nulemia labai ribotą gyvenimo trukmę, dažnai – tik kelias savaites. Kita vertus, pirminės hiperparatirozės sąlygota dažniausiai turi teigimas išeitis. Paciento, sergančio hiperkalcemija, įvertinimas turi būti paremtas kruopščia istorinių duomenų ir medicininių tyrimų analize, kurioje daugiausia dėmesio skiriama klinikinei hiperkalcemijos raiškai, piktybinių navikų susiformavimo rizikos veiksniams, galimo medikamentų poveikio, šeiminės anamnezės ir hiperkalcemijai išsivystyti palankioms sąlygoms įvertinti (pvz. inkstų ligoms) (26). Nors hiperkalcemijos požymiai ir simptomai yra panašūs, nepaisant etiologijos, yra keletas klinikinio vertinimo požymių, kurie gali padėti diferencijuoti hiperkalcemijos etiologiją. Klinikiniai duomenys, leidžiantys įtarti pirminės hiperparatirozės diagnozę: klinikinės simptomatikos nebuvimas, chroniškas kalcio koncentracijos serume didėjimas, nenustatyti pokyčiai medicininės apžiūros metu, nėra nustatyti buvę hiperparatirozės atvejai šeiminėje anamnezėje, nėra piktybinių navikų ar kitų hiperkalcemijos išsivystymą indukuojančių rizikos veiksnių. Piktybinių navikų sąlygota hiperkalcemija dažniausiai pasižymi žymiai aukštesnėmis kalcio koncentracijomis paciento serume, be to, kalcio kiekis serume padidėja, palyginti, per trumpą laiką, būdingi išreikšti klinikiniai simptomai (74). Laboratorinis hiperkalcemijos įvertinimas (6 pav.) prasideda patvirtinus padidėjusią kalcio koncentraciją serume. Svarbu atskirti tikrąją hiperkalcemiją nuo padidėjusio bendro kalcio kiekio, sąlygoto padidėjusio kalcio jungimosi su baltymais. Kadangi dauguma kalcio jonų yra sujungti su albuminu, plazmos baltymų koncentracija yra labai svarbus veiksnys tiriant kalcio jonų koncentraciją. Pavyzdžiui, hiperkalcemiją gali imituoti stipri dehidratacija, kuri savo ruožtu sukelia hiperalbuminemiją, dėl to ir padidėja kalcio surišimas (75). Bendra kalcio koncentracija serume pacientams, kurių albumino kiekis yra pakitęs: padidėjęs ar sumažėjęs, gali neatspindėti fiziologiškai aktyvaus jonizuoto kalcio kiekio (serumo albuminui sumažėjus 1,0 g/l, kalcio kiekis serume sumažėja 0,0444 mmol/l), todėl labai svarbu nustatyti jonizuoto kalcio koncentraciją serume metodais, kuriuose naudojami jonams specifiniai elektrodai (10, 76). Nesant galimybės tiesiogiai išmatuoti jonizuoto kalcio koncentracijos būtina koreguoti kalcio kiekį serume albumino atžvilgiu (19).
𝐾𝐾𝐾𝐾𝐾𝐾𝐾𝐾𝐾𝐾. 𝐶𝐶𝐶𝐶 (𝑚𝑚𝑚𝑚𝐾𝐾𝑚𝑚/𝑚𝑚) = Ca (mmol/l) + 0,02 × (40 − Albuminas (g/l)
Svarbu paminėti, jog spektrofotometriniai tyrimo metodai turėtų būti naudojami kaip pirmojo pasirinkimo metodai atliekant bendro kalcio koncentracijos matavimus kraujo serume (77). Tolesnė laboratorinė analizė vykdoma atliekant iPTH – intaktinio parathormono tyrimą. Aukštos iPTH reikšmės dažniausiai sąlygojamos pirminės hiperparatirozės, tačiau reikia įvertinti ir galimą šeiminę
28 hipokalciurinę hiperkalcemiją. Žemos reikšmės dažniausiai nurodo į nuo parathormono nepriklausomą procesą, todėl tolesnis vertinimas turi būti atliekamas pagal galimas piktybinių procesų, vitamino D pertekliaus ar paraproteinemijos diagnozes (26, 68).
6 pav. Hiperkalcemijos diagnostikos algoritmas (modifikuota pagal (11, 75))
29
2. TYRIMO METODIKA
Darbas atliktas LSMU Laboratorinės medicinos klinikoje. Tyrimo atlikimui ir archyvo duomenų naudojimui gautas LSMU Bioetikos centro pritarimas 2019-02-21 Nr. BEC-LMB(M)-301.
2.1. Tiriamieji asmenys ir tyrimo eiga
Tiriamųjų atranka ir tyrimo būdas: retrospektyviai analizuoti demografiniai, laboratorinių tyrimų ir klinikiniai duomenys nuo 2017-01-01 iki 2019-08-31. Tyrime dalyvavo pacientai, kuriems LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje buvo atlikti parathormono, kalcio ir kiti laboratoriniai tyrimai, svarbūs kalcio apykaitos sutrikimų diagnostikai. Duomenų analizei atrinkti 133 pacientai: iš archyvo gauta 106 pacientų ligos istorijos, kitų 27 pacientų ligos istorijos buvo analizuotos naudojantis ligoninės informacine sistema (LIS). Pasikartojantys pacientų duomenys, atvejai, kai kalcio koncentracijja pacientams nebuvo nustatyta, į tyrimą įtraukiami nebuvo. Tyrimui duomenų analizė buvo atliekama naudojantis 93 tiriamųjų duomenimis. Tiriamųjų asmenų atrankos eiga pateikta 7 paveiksle. Ligos istorijose buvo įvertinti demografiniai ir laboratorinių tyrimų duomenys:
• amžius; • lytis;
• kūno masės indeksas;
• pagrindinė ir gretutinės ligos; • laboratorinių tyrimų duomenys:
o parathormono koncentracija serume;
o bendro ir jonizuoto kalcio koncentracija serume; o bendro baltymo ir albumino koncentracija serume; o fosforo, šlapalo, kreatinino koncentracija serume; o C-reaktyviojo baltymo koncentracija serume.
Planuodami tyrimą siekėme įvertinti ir kitų laboratorinių rodiklių: vitamino D, gliukozės, šarminės fosfatazės, magnio, glomerulų filtracijos greičio pokyčius tarp sergančiųjų hiperparatiroze, tačiau dėl retrospektyvinio tyrimo dizaino trūkstant duomenų rodiklių įvertinimas nebuvo atliekamas, todėl tyrimo eigoje pradinį tyrimo planą teko koreguoti.
30
7 pav. Tiriamųjų asmenų atrankos eiga
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1. Kalcio koncentracijos kraujo serume nustatymas
Kalcio koncentracijos serume tyrimai buvo atlikti naudojant automatinę SYNCHRON LX®, UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV) sistemą.
Reikalavimai ėminių paėmimui, mėginių ruošimui ir saugojimui
Veninis kraujas buvo imamas į mėgintuvėlius be priedų naudojant vakuuminę sistemą įprastu būdu, laikantis standartinių kraujo paėmimo reikalavimų, taikomų visiems klinikiniams laboratoriniams tyrimams. Analizei tinkamiausi šviežiai paimti ėminiai.
Po paėmimo ėminiai buvo laikomi uždaryti, vertikalioje padėtyje. Susiformavus krešuliui buvo centrifuguojami 10 minučių esant 2000 xg. Serumas nuo ląstelių fiziškai atskirtas per dvi valandas nuo ėminio surinkimo.
31 Serumas buvo laikomas kambario temperatūroje ne ilgiau nei 8 valandas. Jei tyrimai per 8 valandas nebuvo atlikti, mėginiai buvo patalpinami į šaldytuvą ir laikomi nuo +2 °C iki +8 °C temperatūroje ne ilgiau nei 48 valandas. Ilgesniam nei 48 valandų saugojimui mėginiai buvo užšaldyti ir saugomi nuo -15°C iki -20°C temperatūros sąlygomis. Siekiant išvengti analičių savybių pokyčių, užšaldyti mėginiai buvo atitirpinti tik vieną kartą.
Tyrimo metodologija
Bendro kalcio koncentracija serume buvo nustatoma potenciometrinio titravimo metodu, sistemai matuojant kalcio jono atrankiojo elektrodo potencialą prieš natrio lyginamąjį elektrodą. Bendras kalcis apskaičiuojamas pagal laisvo kalcio vertę, kai molinis santykis tarp laisvo ir bendro kalcio koncentracijų yra konstanta. Šis molinis santykis gaunamas iš buferinio tirpalo, kurio sudėtyje yra stiprių kalcio kompleksų agentų.
Naudoti reagentai
Kiekvieno CALC (Beckman Coulter, Airija) reagentų rinkinio sudėtyje yra paruošti naudojimui reagentai (papildomas paruošimas nereikalingas). Rinkinio sudėtis:
• ISE elektrolitų buferio reagentas 2x2l. (TRIS 230 mmol/l);
• ISE elektrolitų etaloninis reagentas 2x2l. (natris 7 mmol/l; kalis 0,2 mmol/l; chloridas 5 mmol/l; anglies dioksidas 1,5 mmol/l; kalcis 0,1 mmol/l).
Tiek ISE elektrolitų etaloninis, tiek buferio reagentas buvo saugomi neatidaryti kambario temperatūroje iki tinkamumo datos, pažymėtos butelio etiketėje. Pakuotę atidarius, reagentas kambario temperatūroje išlieka stabilus 30 dienų, jei tinkamumo terminas tebegalioja. Prieš naudojimą reagentai buvo gerai homogenizuojami suvartant butelius bent 20 kartų. Reagentų priimtinumas buvo užtikrinamas sėkmingai atlikus kalibravimą ir užtikrinus, kad kokybės kontrolės tyrimų rezultatai atitinka laboratorijos priimtinumo kriterijus. Naudotos medžiagos nepateiktos su reagentų rinkiniu:
• SYNCHRON® sistemų AQUA CAL 1 ir 2 (Beckman Coulter, Airija) kalibratoriai; • Dviejų lygių kontrolinės medžiagos (Beckman Coulter, Airija).
Darbo eiga
Prieš atliekant mėginių ištyrimą analizatorius buvo paruošiamas pagal analizatoriaus priežiūros procedūrų nurodymus, pateiktus SYNCHRON LX® Eksplotacijos vadove arba UniCel® DxC 800 sistemos Naudojimo instrukcijų vadove, įvestos galiojančios kalibracijos vertės. Kalibracija buvo atlikta naudojant SYNCHRON® sistemų AQUA CAL 1 ir 2 kalibratorius. Neatidaryti kalibratoriai buvo laikomi nuo +2 °C iki +8 °C temperatūroje iki galiojimo termino, nurodyto ant kalibratoriaus buteliuko, pabaigos. Pakuotę atidarius kalibratoriai kambario temperatūroje išlieka stabilūs 30 dienų. Įprastinėmis sąlygomis kalibracija buvo atliekama kas 24 valandas arba kaskart pradedant naują reagento butelį,
32 atliekant tam tikrų dalių pakeitimo ar priežiūros procedūras. Atlikus kalibraciją buvo analizuojama dviejų lygių kontrolinės medžiagos, kuriomis įvertinama kalibracija. Be to, kontroliniai mėginiai buvo tiriami kiekvieną kartą naudojant naują reagento butelį ir po tam tikrų techninės priežiūros ar gedimo šalinimo veiksmų.
Tikslus mėginio tūris (40 μl) buvo sumaišomas su buferiniu tirpalu. Naudojamas vienos mėginio dalies ir 33 buferinio tirpalo dalių santykis. Kai mėginio buferinis mišinys susiliečia su elektrodu, kalcio jonams reaguojant su jonoforu įvyksta elektrodo potencialo pokyčiai. Šie potencialo pokyčiai lyginami su natrio lyginamuoju elektrodu. Gautas lyginamasis potencialas pritaikius Nernsto lygtį leidžia apskaičiuoti kalcio koncentraciją. Siekiant tikslesnių matavimo rezultatų, po mėginio ciklo į pratekamąją kamerą įpilama etaloninio reagento, kurio sudėtyje yra kalcio jonų, ir įvyksta tokios pačios schemos reakcija. Skaičiuojant remiamasi potencialo skirtumu (įtampa) tarp mėginio ir etaloninio reagento ciklų. Analitinis SYNCHRON® sistemos diapazonas kalcio koncentracijai serumo mėginyje 0,5-5 mmol/l.
Rezultatų vertinimas
Kalcio koncentracijos tyrimų rezultatai buvo vertinti remiantis laboratorijoje priimtais pamatiniais biologinių verčių intervalais. Sveikų asmenų populiacijoje nepriklausomai nuo lyties pamatinis kalcio biologinių verčių intervalas suaugusiems: 2,2-2,65 mmol/l.
Jonizuoto kalcio koncentracijos nustatymas
Jonizuoto kalcio (Ca2+) koncentracijos serume (mmol/l) nustatymui buvo taikoma apskaičiavimo metodologija. Apskaičiavimui buvo naudojamos bendro baltymo (g/l) ir kalcio (mmol/l) koncentracijų kraujo serume reikšmės, gautos išmatavus minėtųjų medžiagų kiekį tiriamojo asmens serumo mėginyje automatiniu analizatoriumi. Po apskaičiavimo jonizuoto kalcio koncentracijos rezultatai buvo vertinami remiantis laboratorijoje priimtais pamatiniais biologinių verčių intervalais. Sveikų asmenų populiacijoje nepriklausomai nuo lyties pamatinis jonizuoto kalcio biologinių verčių intervalas suaugusiems 1,2-1,43 mmol/l. Apskaičiavimai buvo atliekami naudojantis formule:
𝐶𝐶𝐶𝐶2+= �𝐶𝐶𝐶𝐶 × 24 − 𝐵𝐵𝐾𝐾𝐵𝐵𝐵𝐵𝐾𝐾𝐶𝐶𝐵𝐵 𝑏𝑏𝐶𝐶𝑚𝑚𝑏𝑏𝑏𝑏𝑚𝑚𝐶𝐶𝐵𝐵30 𝐵𝐵𝐾𝐾𝐵𝐵𝐵𝐵𝐾𝐾𝐶𝐶𝐵𝐵 𝑏𝑏𝐶𝐶𝑚𝑚𝑏𝑏𝑏𝑏𝑚𝑚𝐶𝐶𝐵𝐵
10 + 6
� × 0,25
2.2.2 Intaktinio parathormono koncentracijos kraujo serume nustatymas
Intaktinio prieskydinių liaukų hormono (iPTH) koncentracijos tyrimai buvo atlikti naudojantis automatiniu TOSOH BIOSCIENCE AIA-360 (Tosoh Corporation, Japonija) analizatoriumi.
33 Reikalavimai ėminių paėmimui, mėginių ruošimui ir saugojimui
Veninis kraujas buvo imamas į mėgintuvėlius be priedų naudojant vakuuminę sistemą įprastu būdu, laikantis standartinių kraujo paėmimo reikalavimų, taikomų visiems klinikiniams laboratoriniams tyrimams. Tyrimui buvo naudojamas serumas. Analizei tinkamiausi šviežiai paimti ėminiai.
Po paėmimo ėminiai buvo laikomi uždaryti, vertikalioje padėtyje. Susiformavus krešuliui buvo centrifuguojami 10 minučių esant 2000 xg. Serumas nuo ląstelių fiziškai atskirtas per dvi valandas nuo ėminio surinkimo.
Serumas buvo tiriamas iš karto po mėginio paruošimo. Jei tyrimai tuoj pat nebuvo atlikti, mėginiai buvo patalpinami į šaldytuvą ir laikomi nuo +2 °C iki +8 °C temperatūroje iki 24 valandų. Ilgesniam nei 48 valandų saugojimui, mėginiai buvo užšaldyti ir saugomi -20°C temperatūros sąlygomis. Siekiant išvengti iPTH koncentracijos sumažėjimo, užšaldyti mėginiai buvo atitirpinti tik vieną kartą.
Tyrimo metodologija
iPTH koncentracija serume nustatoma imunofermentinės analizės metodu. Reakcija vykdoma ST AIA-PACK iPTH (Tosoh Bioscience N.V., Belgija) reagentų plokštelės šulinėliuose, kai mėginyje esantis PTH susijungia su monokloniniais antikūnais adsorbuotais ant magnetinių dalelių (kietos fazės) bei fermentu žymėtais monokloniniais antikūnais. Magnetiniai rutuliukai nuplaunami, siekant pašalinti neprisijungusius fermentu žymėtus monokloninius antikūnus, ir inkubuojami su fluorogeniniu substratu 4-metilumbeliferil fosfatu (4MPU). Su magnetinėmis dalelėmis susijungiusių, fermentu žymėtų monokloninių antikūnų kiekis tiesiogiai proporcingas iPTH koncentracijai tiriamajame mėginyje. Pagal standartinę kreivę apskaičiuojama analitės koncentracija mėginyje.
Naudoti reagentai
Tyrimas buvo atliekamas su ST AIA-PACK iPTH (Tosoh Bioscience N.V., Belgija) reagentų rinkiniu, kurį sudaro paruošti naudojimui reagentai (papildomas paruošimas nereikalingas). Plastikiniuose testo šulinėliuose įdėti magnetiniai rutuliukai su jų paviršiuje adsorbuotais anti-PTH avies monokloniniais antikūnais. Testo indelyje taip pat įdėti ir ant-PTH monokloniniai antikūnai sujungti su šarmine fosfataze. Tyrimo atlikimui taip pat reikalingos, į testo rinkinį neįeinančios medžiagos:
• ST AIA-PACK iPTH (Tosoh Bioscience N.V., Belgija) kalibratorių rinkinys; • ST AIA-PACK iPTH (Tosoh Bioscience N.V., Belgija) mėginio skiedimo tirpalas; • ST AIA-PACK iPTH (Tosoh Bioscience N.V., Belgija) kontrolės rinkinys;
• Substrato rinkinys II (Tosoh Bioscience N.V., Belgija).
ST AIA-PACK iPTH tyrimo rinkinio plokštelės buvo laikomos kambario temperatūroje (nuo +18 °C iki +25 °C) ne ilgiau nei vieną dieną. Kalibratoriai sandariai uždaryti buvo laikomi šaldytuve +2 °C iki +8 °C temperatūroje, po atidarymo sunaudoti per 24 valandas. Mėginio skiedimo tirpalas po atidarymo sunaudotas per 90 dienų, iš karto po panaudojimo patalpinamas šaldytuve. Praskiestas
34 substratas stabilus 3 dienas laikant kambario temperatūroje arba 7 dienas, laikant šaldytuve. Prieš naudojimą reagentai buvo sušildomi 30 minučių kambario temperatūroje.
Darbo eiga
Prieš atliekant mėginių ištyrimą analizatorius buvo paruošiamas pagal analizatoriaus priežiūros procedūrų nurodymus, pateiktus AIA sistemos vartotojo vadove, kalibravimas buvo atliekamas pagal nurodytą grafiką. Kalibracijai buvo naudojamas 6 kalibratorių rinkinys su skirtinga iPTH koncentracija. Kalibratorius (1) savo sudėtyje iPTH neturi ir gamintojo buvo pateiktas skystos formos. Likusieji kalibratoriai (2-6) savo sudėtyje turėjo skirtingas iPTH koncentracijas, atitinkamai: 15 pg/ml; 50 pg/ml; 200 pg/ml; 800 pg/ml; 2,400 pg/ml ir gamintojo buvo pateikti liofilizuotos formos. Prieš naudojimą kalibratoriai buvo sušildomi iki kambario temperatūros (nuo +18 °C iki +25 °C) ir praskiedžiami iki 1ml tūrio. Leidus liofilizuotai medžiagai visiškai ištirpti, kalibratoriai prieš atliekant kalibraciją buvo švelniai ir gerai sumaišyti. Atlikus kalibraciją analizatoriuje buvo automatiškai nubraižoma kalibracinė kreivė. Kalibracijos stabilumas įvertinamas kasdieninės kokybės kontrolės įvykdymu.
Mėginių analizės metu AIA sistemoje išmatuotas fluorescencijos dažnis buvo konvertuojamas į iPTH koncentraciją, išreikštą pg/ml. Analizinis diapazonas iPTH koncentracijai serumo mėginyje 1,0-2,400 pg/ml. Gauta iPTH koncentracijos tiriamąjame mėginyje reikšmė buvo pateikiama SI sistemos vienetais – pmol/l.
Rezultatų vertinimas
iPTH koncentracijos tyrimų rezultatai buvo vertinti remiantis laboratorijoje priimtais pamatiniais biologinių verčių intervalais. Sveikų asmenų populiacijoje nepriklausomai nuo lyties pamatinis iPTH biologinių verčių intervalas 1,26-6,74 pmol/l.
2.2.3. Bendro baltymo koncentracijos kraujo serume nustatymas
Bendro baltymo koncentracijos serume tyrimai buvo atlikti naudojant automatinę SYNCHRON LX®, UniCel® DxC 800 (Beckman Coulter, JAV) sistemą.
Reikalavimai ėminių paėmimui, mėginių ruošimui ir saugojimui
Kiekybiniam bendro baltymo koncentracijos nustatymui ėminių ėmimo ir mėginių ruošimo rekomendacijos yra tokios pat kaip ir kalcio koncentracijos serume nustatymo atveju (žr. 2.2.1. „Reikalavimai ėminių paėmimui, mėginių ruošimui ir saugojimui“).
Tyrimo metodologija
