Arnas Jasiūnas
5 kursas, 6 grupėSKIRTINGŲ KAULO PAKAITALŲ POVEIKIS AKTYVIŲ
DEGUONIES JUNGINIŲ SUSIDARYMUI
LEUKOCITUOSE IN VITRO
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Gintaras Janužis
1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
ODONTOLOGIJOS FAKULTETAS
VEIDO IR ŽANDIKAULIŲ CHIRURGIJOS KLINIKA
SKIRTINGŲ KAULO PAKAITALŲ POVEIKIS AKTYVIŲ DEGUONIES JUNGINIŲ SUSIDARYMUI LEUKOCITUOSE IN VITRO
Baigiamasis magistrinis darbas
Darbą atliko magistrantas ... Darbo vadovas ... (parašas) (parašas) ... ... (vardas pavardė, kursas, grupė) (mokslinis laipsnis, vardas pavardė) 20....m. ... 20....m. ...
(mėnuo, diena) (mėnuo, diena)
2
KLINIKINIO – EKSPERIMENTINIO BAIGIAMOJO MAGISTRINIO DARBO VERTINIMO LENTELĖ
Įvertinimas: ...
Recenzentas: ... (moksl. laipsnis, vardas pavardė)
Recenzavimo data: ...
Eil.
Nr. BMD dalys BMD vertinimo aspektai
BMD reikalavimų atitikimas ir įvertinimas Taip Iš dalies Ne 1
Santrauka (0,5 balo)
Ar santrauka informatyvi ir atitinka darbo
turinį bei reikalavimus? 0,2 0,1 0
2 Ar santrauka anglų kalba atitinka darbo turinį
bei reikalavimus? 0,2 0,1 0
3 Ar raktiniai žodžiai atitinka darbo esmę? 0,1 0 0
4 Įvadas,
tikslas, uždaviniai
(1 balas)
Ar darbo įvade pagrįstas temos naujumas,
aktualumas ir reikšmingumas? 0,4 0,2 0
5 Ar tinkamai ir aiškiai suformuluota problema,
hipotezė, tikslas ir uždaviniai? 0,4 0,2 0
6 Ar tikslas ir uždaviniai tarpusavyje susiję? 0,2 0,1 0 7
Literatūros apžvalga (1,5 balo)
Ar pakankamas autoriaus susipažinimas su kitų mokslininkų darbais Lietuvoje ir pasaulyje?
0,4 0,2 0
8
Ar tinkamai aptarti aktualiausi kitų
mokslininkų tyrimai, pateikti svarbiausi jų rezultatai ir išvados?
0,6 0,3 0
9
Ar apžvelgiama mokslinė literatūra yra pakankamai susijusi su darbe nagrinėjama problema?
0,2 0,1 0
10
Ar autoriaus sugebėjimas analizuoti ir sisteminti mokslinę literatūrą yra pakankamas? 0,3 0,1 0 11 Medžiaga ir metodai (2 balai)
Ar išsamiai paaiškinta darbo tyrimo metodika,
ar ji tinkama iškeltam tikslui pasiekti? 0,6 0,3 0 12
Ar tinkamai sudarytos ir aprašytos imtys, tiriamosios grupės; ar tinkami buvo atrankos kriterijai?
0,6 0,3 0
13
Ar tinkamai aprašytos kitos tyrimo medžiagos ir priemonės (anketos, vaistai, reagentai, įranga ir pan.)?
0,4 0,2 0
14
Ar tinkamai aprašytos statistinės programos, naudotos duomenų analizei, formulės, kriterijai, kuriais vadovautasi įvertinant statistinio patikimumo lygmenį?
3
15
Rezultatai (2 balai)
Ar tyrimų rezultatai išsamiai atsako į iškeltą
tikslą ir uždavinius? 0,4 0,2 0
16 Ar lentelių, paveikslų pateikimas atitinka
reikalavimus? 0,4 0,2 0
17 Ar lentelėse, paveiksluose ir tekste kartojasi
informacija? 0 0,2 0,4
18 Ar nurodytas duomenų statistinis
reikšmingumas? 0,4 0,2 0
19 Ar tinkamai atlikta duomenų statistinė analizė? 0,4 0,2 0 20
Rezultatų aptarimas (1,5 balo)
Ar tinkamai įvertinti gauti rezultatai (jų svarba, trūkumai) bei gautų duomenų patikimumas?
0,4 0,2 0
21 Ar tinkamai įvertintas gautų rezultatų santykis
su kitų tyrėjų naujausiais duomenimis? 0,4 0,2 0 22 Ar autorius pateikia rezultatų interpretaciją? 0,4 0,2 0 23
Ar kartojasi duomenys, kurie buvo pateikti kituose skyriuose (įvade, literatūros
apžvalgoje, rezultatuose)? 0 0,2 0,3
24
Išvados (0,5 balo)
Ar išvados atspindi baigiamojo darbo temą,
iškeltus tikslus ir uždavinius? 0,2 0,1 0
25 Ar išvados pagrįstos analizuojama medžiaga;
ar atitinka tyrimų rezultatus? 0,2 0,1 0
26 Ar išvados yra aiškios ir lakoniškos? 0,1 0,1 0
27
Literatūros sąrašas (1 balas)
Ar bibliografinis literatūros sąrašas sudarytas
pagal reikalavimus? 0,4 0,2 0
28
Ar literatūros sąrašo nuorodos į tekstą yra teisingos; ar teisingai ir tiksliai cituojami literatūros šaltiniai?
0,2 0,1 0
29 Ar literatūros sąrašo mokslinis lygmuo
tinkamas moksliniam darbui? 0,2 0,1 0
30
Ar cituojami šaltiniai, ne senesni nei 10 metų, sudaro ne mažiau nei 70% šaltinių, o ne senesni kaip 5 metų – ne mažiau kaip 40%?
0,2 0,1 0
Papildomi skyriai, kurie gali padidinti surinktą balų skaičių
31 Priedai Ar pateikti priedai padeda suprasti nagrinėjamą temą? +0,2 +0,1 0 32
Praktinės rekomendaci
jos
Ar yra pasiūlytos praktinės rekomendacijos ir
ar jos susiję su gautais rezultatai? +0,4 +0,2 0 Bendri reikalavimai, kurių nesilaikymas mažina balų skaičių
33
Bendri reikalavimai
Ar pakankama darbo apimtis (be priedų)?
15-20 psl. (-2 balai)
<15 psl. (-5balai)
34 Ar darbo apimtis dirbtinai padidinta? -2
balai -1 balas 35 Ar darbo struktūra atitinka baigiamojo darbo
rengimo reikalavimus? -1 balas -2 balai
36 Ar darbas parašytas taisyklinga kalba,
moksliškai, logiškai, lakoniškai? -0,5 balo -1 balas 37 Ar yra gramatinių, stiliaus, kompiuterinio -2 -1 balas
4
raštingumo klaidų? balai
38
Ar tekstui būdingas nuoseklumas, vientisumas, struktūrinių dalių apimties subalansuotumas?
-0,2 balo -0,5 balo
39 Plagiato kiekis darbe >20%
(nevert.) 40
Ar turinys (skyrių, poskyrių pavadinimai ir puslapių numeracija) atitinka darbo struktūrą ir yra tikslus?
-0,2 balo -0,5 balo
41
Ar darbo dalių pavadinimai atitinka tekstą; ar yra logiškai ir taisyklingai išskirti skyrių ir poskyrių pavadinimai?
-0,2 balo -0,5 balo 42 Ar buvo gautas (jei buvo reikalingas)
Bioetikos komiteto leidimas? -1 balas
43 Ar yra (jei reikalingi) svarbiausių terminų ir
santrumpų paaiškinimai? -0,2 balo -0,5 balo
44
Ar darbas apipavidalintas kokybiškai (spausdinimo, vaizdinės medžiagos, įrišimo kokybė)?
-0,2 balo -0,5 balo *Viso (maksimumas 10 balų):
*Pastaba: surinktų balų suma gali viršyti 10 balų.
Recenzento pastabos: ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _____________________________ ________________________________ Recenzento vardas, pavardė Recenzento parašas
5
TURINYS
SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 8 SANTRUMPOS ... 10 ĮVADAS ... 11 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 131.1 Kaulo pakaitalo, kaip biomedžiagos, integracija organizme ... 13
1.2 Leukocitų aktyvacija ir ROS susidarymas ... 15
1.3 Aktyvių deguonies junginių nustatymo metodikos ... 16
1.4 Kaulo pakaitalų fizikocheminių savybių įtaka uždegiminiam atsakui ... 16
2. MEDŽIAGA IR METODAI ... 18
2.1 Įranga ir medžiagos ... 18
2.2 Tiriamųjų atranka ... 18
2.3 Leukocitų išskyrimas ... 18
2.4 Leukocitų ląstelių kiekio standartizavimas ... 19
2.5 Eksperimentinė ir kontrolinė grupės ... 20
2.6 Aktyvių deguonies junginių susidarymo tyrimas fluorimetru in vitro ... 20
2.7 Duomenų statistinė analizė ... 22
3. REZULTATAI ... 23
3.1 Bendri tyrimo rezultatai ... 23
3.2 Skirtingos kaulo pakaitalų masės įtaka ROS susidarymui ... 25
3.3 ROS susidarymo priklausomybė nuo inkubavimo laiko ... 28
3.4 ROS susidarymo priklausomybė tarp lyčių ... 30
4. DISKUSIJA... 33 5. PADĖKA... 35 6. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 35 IŠVADOS ... 36 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 37 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 38 PRIEDAI ... 41 Priedas Nr. 1 ... 41 Priedas Nr. 2 ... 42 Priedas Nr. 3 ... 43
6
Skirtingų kaulo pakaitalų poveikis aktyvių deguonies junginių susidarymui leukocituose in vitro
SANTRAUKA
Problemos aktualumas: Kaulo augmentacija – kasdieninė procedūra chirurgijoje, kuriai nuolatos naudojami skirtingos prigimties kaulo transplantatai [1]. Kaulo pakaitalų poreikis vis didėja, su juo didėja ir poreikis įvertinti šių pakaitalų savybes, organizmo reakciją į juos [2,4]. Viena iš tokių reakcijų – aktyvių deguonies junginių susidarymas leukocitų ląstelėse.
Tyrimo tikslas: Nustatyti ir įvertinti aktyvių deguonies junginių susidarymą žmogaus leukocitų ląstelėse, panaudojant skirtingus kaulo pakaitalus.
Medžiaga ir metodai: Bandomajame tyrime dalyvavo 10 tiriamųjų, iš kurių buvo paimti veninio kraujo mėginiai. Iš mėginių išskirti leukocitai, jų kiekis kiekviename mėginyje standartizuotas. Sudaryta 60 eksperimentinių ir 20 kontrolinių mėginių. Eksperimentiniai mėginiai sudaryti su alogeninio, ksenogeninio, aloplastinio kaulo pakaitalais bei skirtingomis jų masėmis (12,5 ir 25 mg). Kontroliniai mėginiai – tai atskirti leukocitai, kurie buvo inkubuojami be kaulo pakaitalų. Kiekybiškas aktyvių deguonies junginių nustatymas atliktas fluorimetriniu metodu. Gautų duomenų statistinė analizė atlikta SPSS 23 programa.
Rezultatai: 12,5 ir 25 mg eksperimentinėse grupėse didžiausios aktyvių deguonies junginių vidutinės reikšmės gautos su alogeniniu kaulo pakaitalu, mažiausios – ksenogeniniu. Statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) tarp masių gautas su alogeniniu ir aloplastiniu kaulo pakaitalais. Vertinant aktyvių deguonies junginių susidarymo priklausomybę nuo inkubavimo laiko, stebima, kad tarp skirtingų kaulo pakaitalų vyrauja skirtingos šių junginių susidarymo tendencijos, tarp skirtingos masės grupių šis tendencingumas proporcingas. Lyginant skirtumus tarp lyčių, alogeninio, ksenogeninio kaulo pakaitalų grupėse daugiau aktyvių deguonies junginių susidarė vyrams, aloplastinėje – moterims.
Išvados: Alogeninis kaulo transplantatas daro didžiausią oksidacinį streso poveikį žmogaus leukocitų ląstelėse, o mažiausią – ksenogeninis kaulo transplantatas. Didesnė kaulo pakaitalo masė lemia ryškesnį leukocitų aktyvumą ir sukelia didesnį oksidacinį stresą leukocituose. Skirtingu inkubavimo laikotarpiu tarp kaulo pakaitalų vyrauja skirtingos aktyvių deguonies junginių susidarymo tendencijos. Vyrų leukocitų ląstelėse didžiausią įtaką oksidacinio streso susidarymui turi alogeninis, o mažiausią – ksenogeninis kaulo pakaitalas. Moterų leukocituose didžiausią oksidacinį stresą sukelia aloplastinis, o mažiausią – ksenogeninis kaulo transplantatas.
7
Raktiniai žodžiai: reactive oxygen species, oxidative stress, foreign body reaction, bone substitutes, synthetic bone graft, leukocytes.
8
The effect of different bone substitutes on reactive oxygen species in leukocytes in vitro
SUMMARY
Relevance of the problem: Bone augmentation is a daily procedure in oral surgery that uses bone grafts of different nature [1]. Demand for bone substitutes is increasing and there is a growing need to assess the properties of these substitutes and the body's reaction to them [2,4]. One of these reaction – is the formation of reactive oxygen species in leukocyte cells.
Aim of the study: To determine and evaluate the generation of active oxygen compounds in human leukocyte cells by integrating different bone substitutes.
Materials and methods: The pilot study involved 10 subjects from whom venous blood samples were taken. In the samples leukocytes were separated, their amount in each sample was standardized. 60 experimental and 20 control samples were formed. Experimental samples consisted of allogeneic, xenogeneic and aloplastic bone substitutes as well as their different weights (12.5 mg and 25 mg). Control samples consisted of isolated leukocytes that were incubated without bone substitutes. Quantitative determination of active oxygen compounds was performed by fluorimetric method. Statistical analysis of the obtained data was carried out using SPSS 23 software.
Results: In the experimental groups of 12.5 mg and 25 mg, the highest average values of reactive oxygen species were obtained with the allogeneic bone substitute, the lowest – xenogene substitute. A statistically significant difference (p<0.05) between masses was obtained with allogeneic and aloplastic bone substitutes. When evaluating the dependence of the generation of active oxygen compounds on the time of incubation, different tendencies of generation of these compounds prevail among different bone substitutes are observed. While this tendency is proportional among different mass groups. To compare the differences between gender, in the groups of allogeneic and xenogeneic bone substitutes, more active oxygen compounds were produced in men, and in the group of aloplastic bone substitues – in women.
Conclusions: Most oxidative stress is caused in allogeneic bone substitute samples, and least – in xenogeneic. Larger bone substitute mass results in more pronounced leukocyte activity and greater oxidative stress in leukocytes. Different tendencies in the formation of active oxygen compounds during different incubation times are dominant among different bone substitutes. Allogeneic bone substitutes has the greatest influence on the formation of oxidative stress in male
9
leukocyte cells, and least – xenogeneic. The highest oxidative stress is caused by the aloplastic bone graft in women leukocytes, and the lowest - by the xenogeneic bone graft.
Keywords: reactive oxygen species, oxidative stress, foreign body reaction, bone substitutes, synthetic bone graft, leukocytes.
10
SANTRUMPOS
Alog. – alogeninis kaulo pakaitalasKsen. – ksenogeninis kaulo pakaitalas Alopl. – aloplastinis kaulo pakaitalas K – kontrolė
PMN – polimorfonukleariniai leukocitai
NADPH – nikotinamido adenino dinukleotido fosfato redukuota forma
ROS – (angl. reactive oxygen species, active oxygen compounds) aktyvieji deguonies junginiai EDTA K3 – etilen-diamin-tetra acto rūgšties skysta forma
SGL – svetimkūnio gigantiškosios ląstelės IL – interleukinas
HA – hidroksiapatitas SN – standartinis nuokrypis
V(SN) – vidurkis ir jo standartinis nuokrypis
s.v. – aktyvių deguonies junginių sutartiniai vienetai
PDGF – (angl. platelet-derived growth factor) trombocitų kilmės augimo faktorius TGF-β – (angl. transforming growth factor beta) beta transformuojantis augimo faktorius β-TCP – beta trikalcio fosfatas
11
ĮVADAS
Burnos chirurgijoje kaulo augmentacija tapo kasdienine procedūra, kuriai nuolatos naudojami skirtingos prigimties kaulo transplantatai. Per pastaruosius du dešimtmečius, kaulo pakaitalų poreikis audinių atstatymui ir regeneracijai vis didėjo. Kaulo transplantacija naudojama susidariusiems kaulinio audinio defektams atstatyti po kaulų lūžių, navikų pašalinimo, infekcijų, įgimtų apsigimimų atvejais ar esant kaulo atrofijai [1,2]. Augmentacijos tikslas – anatomiškai atkurti kaulinio audinio kontūrus, užtikrinti kaulo ir minkštųjų audinių gijimą, sumažinti pooperacinės infekcijos galimybę, panaudojant to paties paciento donorinės srities kaulą (autogeninį), tos pačios rūšies, bet genetiškai skirtingo individo kaulą (alogeninį), sintetinį (aloplastinį), gyvūninės kilmės (ksenogeninį) kaulą ar šių kaulo pakaitalų kombinaciją [4].
Iki šiol vis dar dažniausiai naudojamas ir „auksiniu standartu“ laikomas autogeninis kaulo pakaitalas, pasižymintis gera osteointegracija, osteoindukcinėmis, osteokondukcinėmis ir osteogeninėmis savybėmis, turintis visas reikalingas sąlygas kaulo regeneracijai užtikrinti [4,24]. Autogeninio kaulo panaudojimas užtikrina mažesnę infekcijos tikimybę, tačiau jo kiekis yra santykinai ribotas ir reikalinga sudėtingesnė operacija, donorinė sritis iš klubakaulio keteros, blauzdikaulio, šeivikaulio, šonkaulių, kietojo gomurio, smakro ar apatinio žandikaulio šakos. Šviežias autogeninis kaulas iš donorinės srities dažniausiai perkeliamas kartu su antkauliu ir maitinamąja kraujagysle, kuri užtikrina tinkamą kraujo tiekimą transplantatui. Nepaisant teigiamų savybių, donorinės srities gijimas gali būti apsunkintas dėl sutrikusio aprūpinimo krauju, donorinės srities žaizdos komplikacijų ir dalinės nejautros, ilgalaikio skausmo ir pooperacinio diskomforto [1].
Alogeniniai, ksenogeniniai ir aloplastiniai kaulo pakaitalai naudojami vis dažniau ir tampa alternatyva autogeniniui kaului [1-3], tačiau šie pakaitalai susiję su didesne antrinės infekcijos ir neprigijimo rizika [2]. Atlikta nemažai tyrimų, siekiant sukurti biologiškai aktyvų ir su žmogaus organizmu suderinamą kaulo pakaitalą, tačiau net ir naujausi moksliniai pasiekimai, sparčiai tobulėjančios technologijos neužkerta kelio vis dar pasitaikančiam nesėkmingam kaulinių audinių defektų gydymui. Klinikinių tyrimų duomenimis, 5 – 10 metų laikotarpyje, kaulo pakaitalų panaudojimo sėkmingumas, kartu atliekant dantų implantaciją, siekia nuo 73,2 iki 100% [5-7,22]. Siekiant tinkamai atkurti kramtymo funkciją dantų implantais, kaulo augmentacijos procedūros yra reikalingos daugiau nei 50% visų atliekamų dantų implantacijos operacijų metu, o atliekant implantaciją priekiniame viršutinio žandikaulio segmente kaulo pakaitalų panaudojimas siekia daugiau nei 77% atvejų [20].
12
Patekus į organizmą kaulo pakaitalui, per kraujo – biomedžiagos sąveiką audiniuose gali vykti visa eilė reakcijų: ūminė ir lėtinė uždegiminė reakcija, imuninis atsakas į svetimkūnį, žaizdos gijimas ir fibrozinės kapsulės susidarymas [8,9,11]. Ūminė uždegiminė reakcija yra būtinas veiksnys, skatinantis tinkamą žaizdos gijimą ir audinių homeostazės atsistatymą [3,8,9]. Leukocitai – pagrindiniai uždegiminių ir imuninių reakcijų mediatoriai, kurių aktyvumui įtakos gali turėti tiek kaulo pakaitalų cheminės, tiek fizikinės savybės [8,9,11]. Pagrindinis leukocitų aktyvumo rodiklis – aktyvių deguonies junginių (angl. reactive oxygen species (ROS)) susidarymas [12]. Tai yra vieni iš svarbiausių faktorių ūmioje ir lėtinėje uždegiminėje reakcijoje. Normaliomis sąlygomis ROS atlieka genų ekspresijos, ląstelių migracijos, priešmikrobinę funkcijas ir yra svarbūs ląstelių metabolizmo produktai, tačiau per didelis šių radikalų kiekis organizme sukelia oksidacinį stresą, sukelia ląstelių funkcijos sutrikimus ir net apoptozę [11]. Tyrimų, kuriuose būtų tirtas skirtingų kaulo pakaitalų poveikis aktyvių deguonies junginių susidarymui žmogaus leukocituose, yra gana nedaug, taip pat, kaulo pakaitalų atmetimo mechanizmas, dalyvaujant ROS, nėra pakankamai aiškus. Iškėlėme hipotezę, kad skirtingi kaulo pakaitalai sukelia skirtingą oksidacinį stresą žmogaus leukocitų ląstelėse. Taigi dėl vis didėjančio kaulinio audinio augmentacijos poreikio ir pakankamai neaiškios organizmo individualios reakcijos į skirtingus kaulo pakaitalus, atliktas bandomasis in vitro tyrimas, kurio tikslas nustatyti ir įvertinti aktyvių deguonies junginių susidarymą žmogaus leukocitų ląstelėse, panaudojant skirtingus kaulo pakaitalus.
Tyrimo uždaviniai:
1. Atlikti bandomąjį in vitro tyrimą, siekiant kiekybiškai nustatyti aktyvių deguonies junginių susidarymą leukocituose, veikiant skirtingiems kaulų pakaitalams.
2. Įvertinti skirtingų kaulo pakaitalų skirtingos masės poveikį aktyvių deguonies junginių susidarymui leukocituose.
3. Įvertinti aktyvių deguonies junginių susidarymo priklausomybę nuo inkubavimo laiko, veikiant skirtingiems kaulų pakaitalams.
4. Įvertinti aktyvių deguonies junginių susidarymo priklausomybę tarp lyčių, veikiant skirtingiems kaulų pakaitalams.
13
1. LITERATŪROS APŽVALGA
Mokslinės literatūros apžvalga buvo atlikta naudojant PubMed, PLOS One, Cochrane Library, Willey online ir Science Direct elektronines duomenų bazes. Pasirinkti šie raktiniai žodžiai: reactive oxygen species, oxidative stress, foreign body reaction, bone substitutes, synthetic bone graft, leukocytes. Mokslinės literatūros, kurioje būtų tirtas skirtingų kaulo pakaitalų poveikis aktyvių deguonies junginių susidarymui žmogaus leukocituose, yra gana nedaug. Tokios tematikos mokslinių publikacijų Lietuvoje nėra atlikta.
1.1 Kaulo pakaitalo, kaip biomedžiagos, integracija organizme
Ūmus uždegimas, organizmo reakcija į svetimkūnį ir aplinkinių audinių pažeidimas, tarpininkaujant įgimtam įmunitetui, yra pirmasis organizmo atsakas į biomedžiagą [11]. Visų pirma, į organizmą patekus kaulo pakaitalui, organizmas reaguoja į sukeltą audinių pažeidimą, kurio metu kraujyje ir audinių skystyje esantys baltymai, tokie kaip fibrinogenas, vitronektinas, komplementas, fibronektinas, per kelias sekundes absorbuojasi kaulo pakaitalo paviršiuje ir suformuoja laikiną matricą [8], o absorbuoti baltymai per biocheminius signalus atpažįsta ir pritraukia imunines ląsteles, užtikrindami krešėjimą ir uždegiminių ląstelių adheziją transplantato paviršiuje [11,12].
Tuo pačiu metu, kaip ir baltymų absorbcija, biomedžiagos paviršiuje aktyvuojama koaguliacijos ir komplemento kaskada, kurių metu vyksta makrofagų bei kitų uždegiminių ląstelių aktyvacija ir adhezija prie biomedžiagos paviršiaus. Kraujo koaguliaciją biomedžiagos paviršiuje inicijuojama XII krešėjimo ir audinių faktoriaus. XII krešėjimo faktorius aktyvuojamas kontakto su neigiamą krūvį turinčia medžiaga metu ir yra svarbus tolimesnėse baltymų reakcijose susidarant trombinui. Krešėjimo kaskadoje susidaręs trombinas (serino proteazė) skaido tirpų fibrinogeną į netirpų, polimerizuotą fibriną. Tuo tarpu komplemento sistema atlieka svarbų vaidmenį pašalinant svetimkūnį jį lizuojant arba pažymint, jog būtų pašalintas kitų ląstelių. Tai vyksta vieno ar dviejų mechanizmų pagalba, t.y. klasikiniu arba alternatyviu keliu. Klasikiniam mechanizmui reikalingi antikūniai, tokie kaip IgG, absorbuojantys antigeną, kuris atpažįstamas ir sujungiamas su C1q komplemento sistemos baltymu, kad būtų sintetinamas C1 baltymas. Šis skaido C4 į C4b, kuris staiga tampa C3a, C5a bei C5b baltymu, suformuojančiu atpažinimo kompleksą svetimkūnio medžiagos paviršiuje. Alternatyvus metodas vyksta, kuomet C3 baltymas absorbuojasi svetimkūnio paviršiuje, vykstant C3 hidrolizei į C3a ir C3b. Kuomet komplemento sistemos C3a ir C5a baltymų kiekiai tampa dideli, aktyvuojama putliųjų ląstelių degranuliacija, padidėja kraujagyslių pralaidumas ir pritraukiamos leukocitų (monocitų ir granuliocitų) imuninės ląstelės [11,12].
14
Po pradinės kraujo – transplantato sąveikos iš karto inicijuojama ūminė uždegiminė reakcija, kurios metu suaktyvinami neutrofilai arba kitaip vadinami polimorfonukleariniai leukocitai (PMN), išskiriantys įvairius cheminius fermentus bei uždegiminius produktus – aktyvius deguonies junginius (ROS). Ūminės uždegiminės reakcijos metu taip pat aktyviai dalyvauja putliosios ląstelės, kurios aktyvina uždegimo mediatorius – citokinus ir histaminą, kurie sustiprina imuninę reakciją į svetimkūnį [8].
1 pav. Imuninis atsakas į biomedžiagą [11].
Koaguliacijos kaskados ir komplemento sistemos aktyvacijos produktai, transformuojantis augimo faktorius (angl. transforming growth factor beta (TGF-β)), interleukinas-1 (IL-1), trombocitų kilmės augimo faktorius (angl. platelet-derived growth factor (PDGF)), sukelia PMN leukocitų, makrofagų, ir kitų imuninių ląstelių migravimą prie baltymais padengto biomedžiagos paviršiaus (pav. 1). Toliau vyksta reakcija į svetimkūnį, kuomet makrofagai ir kitos uždegiminės ląstelės aktyvuoja biomedžiagos endocitozės skaidymo procesą [11]. Jei endocitozė nesėkminga, PMN leukocitai, stengdamiesi suardyti sintetinę medžiagą, tarpe tarp biomedžiagos ir imuninių ląstelių, išskiria proteolitinius fermentus ir ROS [8,11]. Tai bandymas suskaidyti biomedžiagą į nano- ir mikro- dydžio daleles, kurios galėtų būti fagocituojamos [11]. Be to, neutrofilai išskiria chemokinus, kurie aktyvina monocitus, o pastarieji diferencijuoja į makrofagus. PMN leukocitai greitai išsenka ir išnyksta transplantuotos biomedžiagos paviršiuje per pirmąsias dvi dienas [8,11].
Po ūmios uždegiminės reakcijos iš organizmo nepašalinus biomedžiagos, stimuliuojamas ilgalaikis uždegiminis atsakas – lėtinė uždegiminė reakcija, kurioje dalyvauja makrofagai, monocitai, limfocitai, formuojasi jungiamasis audinys ir kraujagyslės, tęsiasi imuninių ląstelių pritraukimas [11]. Pavieniai makrofagai geba fagocituoti iki 5 μm dydžio biomedžiagos daleles, tačiau esant didesnėms – susilieja, veikiant IL-4 ir IL-13, sudarydami svetimkūnio gigantiškąsias ląsteles (SGL) [8,11]. Šios ląstelės bando fagocituoti svetimkūnį, tačiau jei to padaryti nepavyksta, lieka prisitvirtinusios prie biomedžiagos paviršiaus stengdamosios suskaidyti ar (ir) izoliuoti jį nuo
15
aplinkinių audinių. SGL tarp ląstelių išorinės membranos ir biomedžiagos paviršiaus suformuoja uždarą kamerą, kurioje taip pat išskiria uždegiminius ROS, protonus, enzimus, kad biomedžiaga būtų suskaidyta. Kai kuriais atvejais uždaroje kameroje esantis pH gali siekti mažiau nei 4. Aktyvių deguonies junginių, proteolitinių fermentų ir mažesnio nei 4 pH kombinacija yra tinkama aplinka svetimkūnių skaidymui [11].
Imuninės ląstelės, susidariusios organizmo – biomedžiagos sąveikos metu, išskirdamos citokinus gali teigiamai reguliuoti osteogenezę ir lemti kaulo pakaitalo prigijimą arba atvirkščiai – slopinti osteogenezę ir skatinti uždegiminę reakciją. Palanki imuninė reakcija sukuria reikiamą mikroklimatą osteointegracijai, tačiau priešingu atveju, gali skatinti fibrozinės kapsulės susiformavimą aplink transplantatą. Fibrozinė kapsulė užkerta tiesioginį kelią kaulinėms ląstelėms kontaktuoti su biomedžiagos paviršiumi ir formuoti naują kaulinį audinį [8]. J. Lorenz ir kiti 2016 metų studijoje atliko transplantuoto sintetinio kaulo žmogaus sinuse histomorfologinę analizę. Biopsijos rezultatai po trijų metų parodė, kad implantacijos srityje naujai susiformavusio kaulinio audinio siekė tik 9%, likusio sintetinio kaulo 43%, o jungiamojo fibrozinio audinio siekė daugiau nei 48%. Taip pat nustatytas menkas vaskuliarizacijos laipsnis sintetinio kaulo srityje. [23]. Kai makrofagai ir SGL nepajėgia fagocituoti biomedžiagos, organizmas suformuoja fibrozinę kapsulę. Tai tankus jungiamasis audinys, kurį sintetina fibroblastai, sudarytas iš kolageno ir glikozaminoglikanų. Taip biomedžiaga izoliuojama nuo aplinkinių audinių ir yra sumažinamas jos funkcionalumas [11].
1.2 Leukocitų aktyvacija ir ROS susidarymas
Žmogaus kraujyje leukocitai sudaro tik 1% viso kraujo tūrio, o jų kiekis vyrauja nuo 4,3 iki 10 × 103 µl. Leukocitus sudaro granuliocitai, limfocitai, monocitai, dendritinės ląstelės bei NK (natūralios žudikės) ląstelės (angl. natural killer cells). Monocitų skaičius siekia 1–6% visų leukocitų, o neautrofiliniai granuliocitai yra gausiausios leukocitų ląstelės ir sudaro net 50–70% visų leukocitų. Šios imuninės ląstelės priklauso įgimtai imuninei sistemai ir gali būti staiga aktyvinamos į organizmą patekus svetimkūniui. Leukocitų aktyvacija veda prie oksidacinio kvėpavimo, kurio metu padidėja deguonies metabolizmas ir susidaro aktyvieji deguonies junginiai. ROS susidarymas yra vienas iš pagrindinių leukocitų aktyvacijos vertinimo parametrų [12].
Daugelis autorių ROS įvardija kaip įprastinius metabolizmo šalutinius produktus, tokius kaip superoksido anijonai (O2−), hidroksilo radikalai (HO•), vandenilio peroksidas (H2O2), kurie turi
svarbią reikšmę uždegiminės reakcijos iniciavime kaip signalinės ir efektorinės molekulės [11,12]. Pagrindinis imuninių ląstelių išskiriamų ROS šaltinis yra molekulinio deguonies (O2) redukcija,
16
susidaro laisvieji O2 radikalai, kaip šalutiniai metabolizmo produktai. H2O2 susidaro šalia
svetimkūnio paviršiaus ir veikia kaip chemoatraktantas kitoms imuninėms ląstelėms, o tuo tarpu superoksido anijonai O2− neutralizuoja svetimkūnį [11]. H2O2 dėl ilgaamžiškumo ir galimybės
praeiti ląstelių membranas, svarbus kaip antrinis pernešėjas, palaikant ląstelių homeostazę skirtingomis sąlygomis [14]. Kitose studijose aprašyta, jog pernelyg didelis ROS kiekis ląstelėse sukelia oksidacinį stresą ir gali lemti aplinkinių audinių pažeidimą ir sustiprinti imuninę reakciją į svetimkūnį [11, 16-19].
1.3 Aktyvių deguonies junginių nustatymo metodikos
Literatūroje aprašomas gana platus aktyvių deguonies junginių nustatymo metodikų pasirinkimas, pritaikant skirtingus metodikų parametrus: chemiluminescencinis, fluorescencinė tėkmės citometrija, fluorescencinė mikroskopija, mikrošulinėlių fluorescencija, citochromo c redukcija, dichlorodihidrofluoresceino fluorescencija ir dar daugelis kitų. Kiekviena metodika – savita, skirta tik vieno radikalo arba daugelio aktyvių deguonies radikalų kiekybiniam nustatymui. Vienos metodikos skirtos dideliems ROS kiekiams, kitos – ypatingai jautrios, skirtos mažiems ROS kiekiams nustatyti [25,26].
1.4 Kaulo pakaitalų fizikocheminių savybių įtaka uždegiminiam atsakui
Autorių įvardijamos kaulo pakaitalų fizikocheminės savybės, aktyvinančios imunines ląsteles ir darančios įtaką uždegiminei reakcijai bei ROS susidarymui, yra: kaulo pakaitalų paviršiaus ypatumai (hidrofobinis/hidrofilinis paviršius, paviršiaus krūvis ir šiurkštumas), dalelių dydis, porėtumas ir porų dydis, gebėjimas išskirti bioaktyvius jonus [8,9,11].
Hidrofobinis kaulo pakaitalų paviršius padidina monocitų adheziją, tuo tarpu hidrofilinis paviršius slopina makrofagų adheziją, tačiau padidina priešuždegiminių ląstelių citokinų ir chemokinų išsiskyrimą. Katijoninės dalelės labiau sukelia uždegimą nei anijoninį paviršių turinčios dalelės, o didesnis biomedžiagos paviršiaus šiurkštumas lemia spartesnę ir aktyvesnę imuninių ląstelių adheziją. Biologinis imuninių ląstelių elgesys kaulo pakaitalo paviršiuje daugiausia priklauso nuo paviršiaus mikrostruktūros [8]. Rastas ryšys tarp skirtingų HA dalelių dydžio ir imuninių baltymų absorbcijos biomedžiagos paviršiuje, kuomet didesnis HA kristalų dydis sąlygojo statistiškai reikšmingai didesnę baltymų koncentraciją biomedžiagos paviršiuje [21]. G. Mestres ir bendraautorių in vitro studijoje su pelių makrofagų ląstelėmis liuminescencinio vertinimo būdu tirtas ROS susidarymas, ląstelėms kontaktuojant su skirtingo dydžio HA dalelėmis. Tiek nanodalelių, tiek mikrodalelių HA mėginių eksperimentinės grupės po 1 val. inkubavimo su leukocitais neturėjo statistikai reikšmingų skirtumų [9]. Tuo tarpu S. Pujari-Palmer su
17
bendraautoriais atliko in vitro tyrimą, skirtą įvertinti skirtingos formos HA kristalų nanodalelių įtaką ROS susidarymui. Rezultatai parodė, kad PMN leukocitai išskiria net 45% daugiau ROS esant pluoštinei HA formai palyginus su kitomis HA grupėmis (taškine, lakštine, strypine forma) [13].
Didesnis transplantato porų dydis lemia sėkmingą angiogenezę ir natūralaus kaulinio audinio įaugimą, tuo tarpu mažos kaulo pakaitalų poros trikdo maistinių medžiagų ir deguonies difuziją, ypač kaulinio pakaitalo centre, kur susidaro vietinis hipoksinis mikroklimatas. Hipoksija gali sustiprinti vietinį uždegimą, ROS išsiskyrimą ir skatinti granuliomos susiformavimą, kuri pilnai užkemša poras ir sudaro barjerą kaulo regeneracijai. Nustatyta, kad 90 – 120 μm dydžio poros slopina vaskuliarizaciją, tuo tarpu 350 μm dydžio poros užtikrina audinių įaugimą kaulo pakaitale, padidina vaskuliarizaciją ir lemia didesnį deguonies aprūpinimą [8].
Įvertinus mokslinę literatūrą, galima teigti, jog mokslinės medžiagos apie skirtingų kaulo pakaitalų poveikį aktyvių deguonies junginių susidarymui žmogaus leukocitų ląstelėse nėra daug. Lietuvoje tokios tematikos darbų nėra atlikta, todėl atsiranda tokio mokslinio tyrimo poreikis.
18
2. MEDŽIAGA IR METODAI
Buvo gautas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas Nr. BE-2-15. Tyrimas buvo atliekamas 2019 metų vasario – kovo mėnesį, LSMUL Kauno klinikų Veido ir žandikaulių chirurgijos klinikoje, bedradarbiaujant su LSMU Laboratorinės medicinos klinika ir MA Biochemijos katedra.
2.1 Įranga ir medžiagos
Centrifugos (Eppendorf 5810 R, Vokietija; Han Lab CB 200 R, JAV), fluorimetras (Fluoroskan Ascent®, Thermo Scientific, JAV), svarstyklės (AnD HA-202M, JAV), mėgintuvėliai (pluriMate® unfilled, Vokietija), mažo tankio gradiento skystis (Leuko Spin Medium®, 1.077 g/ml, Vokietija), audinių auginimo ir inkubavimo terpė (RPMI 1640 Medium, GlutaMAX™, JAV), 9ml vakuuminiai mėgintuvėliai su EDTA K3 (Lind-VAC® technology, Estija), hematologinis analizatorius (Sysmex XE-5000, Japonija), kaulų pakaitalai (cerabone®, maxgraft®, maxresorb®, botiss dental, Vokietija), Amplex Red (Sigma-Aldrich, JAV), krienų peroksidazė (Sigma-Aldrich, JAV).
2.2 Tiriamųjų atranka
Tyrime dalyvavo 10 savanorių, kurie pasirašė informuoto asmens sutikimo formą ir buvo sukoduoti raidėmis. Viso tyrimo metu buvo išlaikytas tiriamųjų anonimiškumas. Tyrime dalyvavo 20 – 30 metų amžiaus, sveiki, nerūkantys, vaistų nevartojantys, lėtinėmis ligomis nesergantys tiriamieji. Viso tyrime dalyvavo 6 vyrai ir 4 moterys.
2.3 Leukocitų išskyrimas
Kraujo paėmimo procedūra buvo atliekama LSMU Laboratorinės medicinos klinikoje, rytais 8:00 – 10:00 val. Vieno tiriamojo kraujo paėmimo procesas užtrukdavo nuo 5 iki 10 minučių. Iš visų 10 tiriamųjų buvo paimti veninio kraujo mėginiai po 27 ml (3 mėgintuvėliai po 9 ml). Siekiant atraumatiškai atlikti kraujo paėmimą, sumažinti trombocitų bei krešėjimo kaskados aktyvavimą, naudotos 21 dydžio adatos [11]. Veninis kraujas surinktas į sterilius 9 ml talpos mėgintuvėlius su antikoaguliantu EDTA K3 (etilendiamintetraacto rūgštis), siekiant išvengti krešulio susiformavimo. Iš karto po kraujo paėmimo procedūros mėgintuvėliai buvo nešami į laboratoriją, esančią LSMU Laboratorinės medicinos klinikoje.
Leukocitų išskyrimas buvo atliekamas ne vėliau nei 30 minučių po kraujo surinkimo. Leukocitų išskyrimui buvo naudojami 50 ml centrifuginiai mėgintuvėliai su įmontuota akyta
19
kempinėle mėgintuvėlio apačioje (pluriMate® unfilled) ir mažo tankio gradientą turintis skystis (Leuko Spin Medium®, 1.077 g/ml). Su pipete į 50 ml mėgintuvėlį su kempinėle įpilta 22 ml mažo tankio gradiento skysčio. Mėgintuvėliai centrifuguojami (Eppendorf 5810 R) 1000 x g, 10 sek., 22°C temperatūroje. Virš kempinėlės susidaręs supernatantas pašalinamas. Į mėgintuvėlį supilamas 27 ml veninio kraujo mėginys ir mėgintuvėlis vėl centrifuguojamas 1000 x g, 30 minučių, 22°C temperatūroje be sustojimo. Kraujo mėginys ir mažo tankio gradiento skystis buvo laikomas kambario temperatūroje.
Atlikus centrifugavimą, pipete atsargiai pašalinamas viršutinis plazmos sluoksnis iki balto leukocitų ląstelių sankaupos sluoksnio (žr. Priedai Nr. 1). Tuomet į 7 ml talpos sterilius mėgintuvėlius siaura pipete, nesuardant raudonųjų kraujo kūnelių sluoksnio, perkeliamos atskirtos leukocitų ląstelės ir įpilta po 3 ml specialios ląstelių kultivavimo ir inkubavimo terpės (RPMI 1640 Medium, GlutaMAX™). Mėgintuvėliai 5 sekundes pamaišomi maišyklėje (Vortex-VIB), kad būtų sustabdyta ląstelių agregacija.
Vėliau atliekamas ląstelių plovimas, centrifuguojama be sustojimo (Han Lab CB 200 R) 300 x g, 10 min., atšaldytoje iki 4 °C temperatūros centrifugoje. Susidaręs supernatantas išpilamas, o prie leukocitų likęs skystis aspiracine pipete pašalinamas. Plovimo procedūra kartojama dar kartą, siekiant pašalinti mažo tankio gradiento skysčio likutį. Į praplautas leukocitų ląsteles įpilama RPMI terpės iki 2 ml ribos ir leukocitų ląstelės švelniai pipetuojant suspenduojamos (žr. Priedai Nr. 2) [9].
2.4 Leukocitų ląstelių kiekio standartizavimas
Leukocitų skaičius mėginiuose buvo apskaičiuojamas hematologiniu analizatoriumi Sysmex XE-5000 iškart po leukocitų išskyrimo procedūros, naudojant elektrinę varžą leukocitų ląstelių diferenciavimui. Kiekvieno tiriamojo mėginyje buvo apskaičiuotas ir nustatytas vienodas 20 × 106 leukocitų ląstelių kiekis 2 ml tūryje, pritaikius šias formules (n1 ir n2):
n1 = (20 mln. × 2 ml) / a);
n2 = 2 ml – n1;
n1 – tūris, kurį reikia paimti iš 2 ml tiriamojo mėgintuvėlio (ml);
n2 – reikalingas RPMI tūris (ml); 20 mln. – reikiamas ląstelių kiekis; 2 ml – reikalingas tūris;
20
2.5 Eksperimentinė ir kontrolinė grupės
Iš kiekvieno tiriamojo veninio kraujo mėginio buvo paruošti 3 eksperimentiniai ir 1 kontrolinis mėginys. Trys eksperimentiniai mėginiai buvo skirstomi pagal kaulo pakaitalus (alogeninis, ksenogeninis, aloplastinis). Kaulo pakaitalai buvo inkubuojami kartu su leukocitais ir RPMI ląstelių kultivavimo ir inkubavimo terpe. Kontrolinės grupės – tai atskirti leukocitai, kurie buvo inkubuojami be kaulo pakaitalų. Iš 10 – ties tiriamųjų sudaryta 60 eksperimentinių ir 20 kontrolinių mėginių.
2.6 Aktyvių deguonies junginių susidarymo tyrimas fluorimetru in vitro
Aktyvių deguonies junginių (ROS) kiekybiškas nustatymo tyrimas buvo atliktas fluorimetriniu metodu, panaudojant Fluoroskan Ascent® fluorimetrą (Thermo Scientific) ir Ascent Software 2.6 programinę įrangą, LSMU Farmacijos fakultete esančioje tyrimų laboratorijoje.
1 lentelėje aprašyti tyrimui pasirinkti trys skirtingi kaulų pakaitalai iš botiss biomaterials GmbH (Zosenas, Vokietija).
Lentelė Nr. 1. Tyrime pasirinkti kaulo pakaitalai ir jų savybės. Kaulo pakaitalas Cheminė sudėtis Dalelių dydis (µm)
Paviršius Apdirbimas Porėtumas
(%, µm) Rezorbcija Donoro (spongiozinis + kortikalinis) Alogeninio granulės (maxgraft®) 70% mineralinė ir 30% organinė dalis <2000 *Išlaikoma kolageno matrica Cheminis, gama spindulių terapija, liofilizacija išlaiko 5% drėgmę *Makro dydžio poros Greita Galvijų (spongiozinis) Ksenogeninio granulės (cerabone®) HA keramika (pentakalcio hidroksido fosfatas) ~500-1000 Šiurkštus, hidrofilinis Palaipsniui kaitinama iki 1200 °C, ~2val., gama spindulių terapija 65-80%, 600-900, 3-D porų tinklas Labai lėta Sintetinis Aloplastinio granulės (maxresorb®) 60% HA ir 40% (β-TCP) santykiu ~500-1000 Šiurkštus, hidrofilinis Sintetinis medžiagų paruošimas 80%, 200-800, 3-D porų tinklas HA labai lėta; β-TCP greita *Pastaba: gamintojas nenurodo tikslios informacijos.
Tyrime pasirinktos dvi skirtingos kaulo pakaitalų masės (12,5 mg ir 25 mg). Vieno tiriamojo įvertinimui šeši šulinėliai buvo užpildyti trimis skirtingais kaulų pakaitalais (aloplastiniu, alogeniniu ir ksenogeniniu kaulu) ir du šulinėliai palikti kaip kontroliniai mėginiai. Trijuose šulinėliuose atsverta ir įdėta po 12,5 mg, kituose trijuose po 25 mg kaulo pakaitalų (pav. 2). Tuomet
21
kiekvieno tiriamojo leukocitų mėginys su terpe išpilstytas į 200 µl tūrio 8 šulinėlius plokščiu dugnu po 2 mln. leukocitų ląstelių (žr. Priedai Nr. 3).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl B K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl C K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl D K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl E K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl
F K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl G K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl H K Alog Ksen Alopl K Alog Ksen Alopl
2 pav. Fluoroskan Ascent fluorimetro mėginių išdėstymas šulinėliuose. K – kontrolė, Alopl – aloplastinis kaulo pakaitalas, Alog – alogeninis kaulo pakaitalas, Ksen – ksenogeninis kaulo
pakaitalas. Žalia spalva pažymėtas 12,5 mg kaulo kiekis, ruda –25 mg.
Aktyvieji deguonies junginiai nustatomi fluorimetriškai, kuomet leukocitų ląstelės yra apšviečiamos UV spinduliais. Nustatytas fluorescencijos intensyvumas tiesiogiai proporcingas išsiskyrusios medžiagos koncentracijai. Šiame tyrime buvo naudojamas Amplex Red (10-acetil-3,7-dihidroksifenoksazinas) dažo reagentas, skirtas nustatyti vandenilio peroksido (H2O2) aktyvumui. Į
kiekvieną šulinėlį buvo įdėta Amplex Red dažo (5 µM) ir krienų peroksidazės (10 U/ml). Krienų peroksidazė katalizuoja vandenilio peroksido redukciją iki vandens. Tuo metu Amplex Red reaguoja su vandeniu santykiu 1:1 ir virsta raudonai fluorescuojančia medžiaga – resurofinu (pav. 3) [14].
3 pav. Fluorimetru fiksuojamas fluorescencijos intensyvumo pokytis, kuomet susidaro spalvotas junginys resurofinas.
Resurofino sužadinimo bangos ilgis 544 nm, o išspinduliavimas – 590 nm. H2O2 koncentracijos
pokytis buvo įvertinamas pagal kalibracinę H2O2 kreivę. Matavimai buvo atlikti kas 20, 40, 60, 80,
100 min. inkubuojant leukocitų ląsteles su kaulo pakaitalais šulinėliuose 37 °C temperatūroje. Iš vieno tiriamojo gauti aštuoni aktyvių deguonies junginių susidarymo grafikai. Gauti ROS
22
susidarymo duomenys suvesti į Microsoft Excel 2016 programą. Aktyvių deguonies junginių susidarymas išreiškiamas sutartiniais vienetais pokyčiu per minutę dviem milijonams ląstelių (s.v./min 2 mln. ląstelių).
2.7 Duomenų statistinė analizė
Tyrimo duomenis suvesti į Microsoft Excel 2016 programą ir atlikta statistinė analizė su SPSS 23 programa. Statistiniam vidurkių reikšmingumui nustatyti naudotas neparametrinis Kruskal-Wallis testas, neparametrinis Wilcoxon testas, daugkartiniam palyginimui taikytas Dunnett testas. Statistiškai patikimi rezultatai buvo laikomi, kai p<0,05. Panaudota aprašomoji ir lyginamoji duomenų statistika, grafinis duomenų atvaizdavimas.
23
3. REZULTATAI
3.1 Bendri tyrimo rezultataiTyrime dalyvavo 10 tiriamųjų, 6 vyrai (60%) ir 4 moterys (40%), iš kurių buvo sudaryta 60 eksperimentinių ir 20 kontrolinių mėginių (4 pav.). 2 lentelėje peteikti individualūs ir bendri aktyvių deguonies junginių susidarymo per minutę vidurkiai, nustatyti fluorimetru, panaudojant skirtingus kaulo pakaitalus ir skirtingas jų mases. 3 lentelėje pateiktas kiekvieno tiriamojo individualus aktyvių deguonies junginių pokytis per minutę bei bendros vidurinės reikšmės skirtingu inkubavimu laikotarpiu.
4 pav. Eksperimentinių ir kontrolinių mėginių pasiskirstymas tarp lyčių.
Lentelė Nr. 2. ROS susidarymo vidurkiai (s.v./min. 2 mln. ląstelių).
Tiriamojo Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 V(SN) Kontrolė 0,87 0,60 0,59 0,80 0,93 1,33 0,59 0,92 0,87 1,15 0,87(0,24) Kau lo p a k aitalai Alog. 12,5 m g 2,96 3,16 2,54 3,51 2,79 2,15 2,69 1,04 1,19 2,22 2,43(0,80) Ksen. 0,92 0,86 0,70 0,95 1,00 1,37 0,50 0,49 0,48 0,80 0,81(0,28) Alopl. 2,86 3,53 2,50 1,41 1,93 1,56 1,34 1,81 3,60 2,65 2,32(0,84) Alog. 25 m g 3,88 3,22 7,66 3,82 2,85 2,45 3,38 2,91 1,32 2,50 3,40(1,67) Ksen. 0,98 0,92 0,97 0,99 1,01 1,19 0,47 0,51 0,42 1,28 0,87(0,30) Alopl. 3,35 3,56 3,66 2,46 2,35 2,61 1,65 5,31 4,21 3,48 3,26(1,05) 36 12 24 8
24
Lentelė Nr. 3. Individualūs ir bendri ROS pokyčiai per minutę, atsižvelgiant į inkubavimo laiką (s.v./min. 2 mln. ląstelių).
Tiria mojo
Nr.
Kontrolė
Kaulo pakaitalai Inkuba
vimo laikas
(min)
Alog. Ksen. Alopl. Alog. Ksen. Alopl.
12,5 mg 25 mg 1 0,58 3,15 1,00 1,91 3,27 0,73 1,46 20-40 0,83 3,76 0,95 1,33 3,56 1,12 1,35 40-60 1,09 2,96 0,82 3,78 6,09 1,08 4,10 60-80 1,00 1,99 0,93 4,44 2,61 0,97 6,47 80-100 2 0,46 3,44 0,78 2,53 4,20 0,84 4,23 20-40 0,59 4,70 1,01 3,85 3,33 1,13 2,45 40-60 0,80 1,83 0,83 3,89 3,28 0,95 2,73 60-80 0,54 2,68 0,82 3,83 2,07 0,76 4,82 80-100 3 0,47 2,92 0,62 1,28 8,32 0,91 1,73 20-40 0,65 3,11 0,76 1,43 8,36 1,07 2,06 40-60 0,74 2,53 0,71 3,66 8,10 0,97 3,67 60-80 0,51 1,60 0,72 3,64 5,84 0,94 7,19 80-100 4 0,73 4,37 0,94 1,44 4,61 1,04 4,74 20-40 0,73 2,48 0,94 1,21 2,71 0,96 1,68 40-60 1,00 3,61 0,77 1,21 3,61 1,06 1,51 60-80 0,74 3,57 1,17 1,80 4,34 0,90 1,93 80-100 5 0,60 2,43 1,02 1,96 1,44 0,96 2,13 20-40 0,70 2,87 1,12 1,64 2,62 1,14 1,59 40-60 1,20 5,61 0,90 1,81 3,43 1,03 2,61 60-80 1,23 0,24 0,97 2,33 3,93 0,92 3,07 80-100 6 1,17 1,81 1,73 1,55 2,47 1,68 2,31 20-40 1,20 3,07 1,40 1,72 3,30 1,36 2,73 40-60 2,00 2,50 1,26 1,29 2,61 1,01 2,54 60-80 0,96 1,22 1,09 1,66 1,43 0,71 2,87 80-100 7 0,53 3,36 0,42 1,56 2,72 0,35 1,90 20-40 0,54 2,88 0,48 1,17 4,16 0,45 1,52 40-60 0,81 1,72 0,53 1,59 3,47 0,50 1,97 60-80 0,48 2,83 0,59 1,03 3,17 0,58 1,23 80-100 8 0,74 0,52 0,38 1,10 2,96 0,29 1,38 20-40 1,36 0,92 0,49 1,54 2,97 0,53 3,66 40-60 0,92 1,30 0,52 2,06 3,34 0,63 9,81 60-80 0,66 1,43 0,56 2,53 2,36 0,58 6,41 80-100 9 0,80 0,69 0,24 1,19 0,50 0,25 1,18 20-40 1,22 0,94 0,43 2,00 1,20 0,39 3,01 40-60 0,85 1,30 0,56 6,13 1,46 0,53 8,04 60-80 0,60 1,84 0,69 5,07 2,13 0,53 4,62 80-100 10 0,75 2,28 0,76 1,71 1,01 0,93 2,49 20-40 0,94 1,92 0,86 2,52 2,53 1,21 2,62 40-60 1,15 2,53 0,82 3,57 2,62 1,50 3,90 60-80 1,77 2,18 0,74 2,79 3,83 1,47 4,93 80-100 V(SN) 0,68(0,21) 2,50(1,22) 0,79(0,42) 1,62(0,40) 3,15(2,24) 0,80(0,43) 2,36(1,20) 20-40 0,88(0,29) 2,67(1,17) 0,84(0,31) 1,84(0,81) 3,47(1,89) 0,96(0,39) 2,27(0,75) 40-60 1,06(0,37) 2,59(1,29) 0,77(0,22) 2,90(1,57) 3,80(1,91) 0,93(0,30) 4,09(2,71) 60-80 0,85(0,41) 1,96(0,93) 0,83(0,21) 2,91(1,30) 3,17(1,32) 0,84(0,28) 4,35(2,02) 80-100
25
3.2 Skirtingos kaulo pakaitalų masės įtaka ROS susidarymui
Vertinant 12,5 mg eksperimentinės grupės ROS susidarymo per minutę vidurkius, didžiausia reikšmė gauta alogeninio kaulo pakaitalo grupėje V(SN) 2,43(0,80), mažiausia – ksenogeninio V(SN) 0,81(0,28) (pav. 5).
5 pav. 12,5 mg eksperimentinė grupė ir ROS vidurinės reikšmės.
Toks pat pasiskirstymas gautas ir vertinant 25 mg eksperimentinės grupės ROS susidarymo per minutę vidurkius (pav. 6)
6 pav. 25 mg eksperimentinė grupė ir ROS vidurinės reikšmės.
2.43 0.81 2.32 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Alogeninis Ksenogeninis Aloplastinis s.v./min. 2 mln. ląstelių Kau lo p ak aitalas 3.4 0.87 3.26 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Alogeninis Ksenogeninis Aloplastinis s.v./min. 2 mln. ląstelių Kau lo p ak aitalas
26 2.43 0.81 2.32 3.4 0.87 3.26 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Alogeninis Ksenogeninis Aloplastinis
s. v. /m in . 2 m ln . ląst elių Kaulo pakaitalai 12,5 mg 25 mg
Lyginant skirtingos masės grupes tarpusavyje, stebima, kad 25 mg grupėje ROS vidurinės reikšmės didesnės nei 12,5 mg, randama statistiškai reikšmingų skirtumų (p<0,05) tarp aloplastinio ir alogeninio kaulo pakaitalų grupių (pav. 7).
7 pav. 12,5 ir 25 mg eksperimentinių grupių ir ROS vidurinių reikšmių palyginimas.
Vertinant kontrolinę grupę su 12,5 mg ir 25 mg eksperimentinėmis grupėmis, gauti statistiškai reikšmingi rezultatai (p<0,01). 12,5 mg grupėje gauti reikšmingi rezultatai tarp kontrolės ir alogeninio bei aloplastinio kaulo pakaitalų. 25 mg grupėje taip pat gauti reikšmingi rezultatai tarp kontrolės ir alogeninio bei aloplastinio kaulo mėginių (pav. 8).
Lyginant skirtingų masių, skirtingus kaulo pakaitalus tarpusavyje, gauti statistiškai reikšmingi rezultatai (p<0,01) tarp ksenogeninio ir alogeninio pakaitalo, tarp ksenogeninio ir aloplastinio kaulo pakaitalo (pav. 8).
27
8 pav. Kaulo pakaitalų poveikio aktyvių deguonies junginių susidarymui stačiakampės diagramos, atsižvelgiant į 12,5 mg ir 25 mg pakaitalų mases (minimali reikšmė, pirmasis kvartilis, mediana, trečiasis kvartilis, maksimali reikšmė, reikšmė, nutolusi mažiau kaip ½ tarpkvartilinio skirtumo nuo
trečiojo kvartilio).
12,5 mg: χ2=27,626, lls=3, p<0,001, remiamtis neparametriniu Kruskal-Wallis testu, abcdp<0,01,
daugkartiniam palyginimui taikytas Dunnett testas.
25 mg: χ2=29,046, lls=3, p<0,001, remiamtis neparametriniu Kruskal-Wallis testu, a1b1c1d1p<0,01,
daugkartiniam palyginimui taikytas Dunnett testas.
28 0.68 0.88 1.06 0.85 2.5 2.67 2.59 1.96 0.79 0.84 0.77 0.83 1.62 1.84 2.9 2.91 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 20-40 40-60 60-80 80-100 s. v. /m in . 2 m ln . ląst elių
Inkubavimo laikas (min)
Kontrolė Alogeninis Ksenogeninis Aloplastinis
0.68 0.88 1.06 0.85 3.15 3.47 3.8 3.17 0.8 0.96 0.93 0.84 2.36 2.27 4.09 4.35 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 20-40 40-60 60-80 80-100 s. v. /m in 2 m ln . ląst elių
Inkubavimo laikas (min)
Kontrolė Alogeninis Ksenogeninis Aloplastinis
3.3 ROS susidarymo priklausomybė nuo inkubavimo laiko
Vertinant skirtingų kaulo pakaitalų aktyvių deguonies junginių susidarymo priklausomybę nuo inkubavimo laiko, stebima, kad tarp skirtingų kaulo pakaitalų vyrauja skirtingos ROS susidarymo tendencijos.
12,5 mg eksperimentinėse grupėse aktyvių deguonies junginių susidarymas per skirtingą inkubavimo laiką pateikiamas 9 paveiksle.
9 pav. 12,5 mg eksperimentinėse grupėse ROS susidarymo priklausomybė nuo inkubavimo laiko. 25 mg eksperimentinėse grupėse aktyvių deguonies junginių susidarymas per skirtingą inkubavimo laiką pateikiamas 10 paveiksle.
29
Nors tarp skirtingų kaulo pakaitalų yra skirtingos ROS susidarymo tendencijos, tarp skirtingos masės (12,5 ir 25 mg) grupių, lyginant 9 ir 10 paveikslus, tendencingumai yra proporcingi vienas kitam.
Vertinant kaulo pakaitalų 12,5 mg masės poveikį ROS susidarymui skirtingu inkubavimo laikotarpiu, gauti statistiškai reikšmingi rezultatai, kai p<0,05, aloplastinio kaulo pakaitalo grupėje (pav. 11).
pav. 11. ROS pokyčio per minutę stačiakampės diagramos, atsižvelgiant į skirtingą inkubavimo laiką. abcdep<0,05, remiantis neparametriniu Wilcoxon testu priklausomoms imtims (minimali
reikšmė, pirmasis kvartilis, mediana, trečiasis kvartilis, maksimali reikšmė, reikšmė, nutolusi mažiau kaip ½ tarpkvartilinio skirtumo nuo trečiojo kvartilio).
Vertinant kaulo pakaitalų 25 mg masės poveikį ROS susidarymui skirtingu inkubavimo laikotarpiu, gauti statistiškai reikšmingi rezultatai, kai p<0,001, aloplastinio ir ksenogeninio kaulo pakaitalo grupėse (pav. 12).
30
pav. 12. ROS pokyčio per minutę stačiakampės diagramos, atsižvelgiant į skirtingą inkubavimo laiką. abcdep<0,05, remiantis neparametriniu Wilcoxon testu priklausomoms imtims (minimali
reikšmė, pirmasis kvartilis, mediana, trečiasis kvartilis, maksimali reikšmė, reikšmė, nutolusi mažiau kaip ½ tarpkvartilinio skirtumo nuo trečiojo kvartilio ir reikšmė, nutolusi daugiau kaip ½
tarpkvartilinio skirtumo nuo trečiojo kvartilio).
3.4 ROS susidarymo priklausomybė tarp lyčių
Vertinant skirtingų kaulo pakaitalų poveikį ROS susidarymui tarp lyčių, stebima, kad alogeninio, ksenogeninio kaulo pakaitalų eksperimentinėse grupėse daugiau aktyvių deguonies junginių susidarė vyrams, aloplastinėje – moterims (pav. 13, 14).
12,5 mg eksperimentinės grupės aktyvių deguonies junginių susidarymas tarp lyčių pateikiamas 13 paveiksle.
31 0.73 4.14 0.89 2.84 1.07 2.3 0.85 3.9 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Kontrolė Alogeninis Ksenogeninis Aloplastinis
s. v. /m in 2 m ln . ląst elių Kaulo pakaitalai Vyrai Moterys 13 pav. 12,5 mg eksperimentinės grupės ROS susidarymo priklausomybė tarp lyčių.
25 mg eksperimentinės grupės aktyvių deguonies junginių susidarymas tarp lyčių pateikiamas 14 paveiksle.
14 pav. 25 mg eksperimentinės grupės ROS susidarymo priklausomybė tarp lyčių.
Lyginant skirtingų kaulo pakaitalų grupes tarpusavyje tarp lyčių, rasti reikšmingi rezultatai (aa1bb1p<0,001) tarp kontrolinės ir alogeninio 12,5 ir 25 mg grupių (pav. 15). Statistiškai reikšmingų
rezultatų ksenogeninėje ir aloplastinėje grupėje, atsižvelgiant į lytį, nenustatyta (p>0,05).
0.73 2.94 0.82 2.26 1.07 1.65 0.79 2.41 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Kontrolė Alogeninis Ksenogeninis Aloplastinis
s. v. /m in 2 m ln . ląst elių Kaulo pakaitalai Vyrai Moterys
32
15 pav. ROS pokyčio per minutę stačiakampės diagramos, atsižvelgiant į skirtingą lytį, kai p<0,05, remiantis neparametriniu Mann-Whitney testu dviem nepriklausomoms imtims (minimali reikšmė, pirmasis kvartilis, mediana, trečiasis kvartilis, maksimali reikšmė, reikšmė nutolusi daugiau kaip ½
tarpkvartilinio skirtumo nuo trečiojo kvartilio).
ab a
b
a1b1
33
4. DISKUSIJA
Šio bandomajo tyrimo metu buvo vertinama pasirinkta metodika, skirta pasiekti šio darbo tikslą – nustatyti ir įvertinti aktyvių deguonies junginių susidarymą žmogaus leukocitų ląstelėse, panaudojant skirtingus kaulo pakaitalus. Pagal pasirinktą metodiką (mikrošulinėlių fluorescencija), leukocitai šulinėliuose su kaulo pakaitalais kontaktavo tik tam tikrame ploto paviršiuje. Padidinti kontaktinį paviršių galėtų automatinės mėginių vartyklės, kurių dėka kaulo pakaitalas ir leukocitų ląstelės inkubacijos metu galėtų nuolatos kontaktuoti [13]. G. Maestres ir bendraautorių tyrime buvo pasiūlyta ir vertinta tiesioginė bei netiesioginė metodikos, skirtos uždegiminiam atsakui į HA ištirti, esant skirtingoms dalelių struktūroms. Tiesioginės metodikos metu leukocitų aktyvumas buvo vertinamas tiesioginio jų kontakto su biomedžiagos paviršiumi metu, o netiesioginės – kai biomedžiaga yra inkubuojama kurį laiką tam tikroje terpėje ir tik tada leukocitų ląstelės yra perkeliamos į terpę, kurioje buvo laikomi HA kristalai [9]. Leukocitų kontaktavimas su kaulo pakaitalais šulinėliuose tik tam tikrame plote taip pat priskiriamas tiesioginei metodikai, todėl tolimesniuose tyrimuose su didesne tiriamųjų imtimi reikėtų vertinti ne tik šią, bet ir netiesioginę metodiką, nes minėtame tyrime pastebėti makrofagų proliferacijos ir aktyvacijos skirtumai tarp tiesioginės ir netiesioginės metodikų [9]. Kai kurie individualūs aktyvių deguonies junginių (ROS) pokyčiai per minutę tendencingai kilo nuo 20 iki 100 inkubavimo minutės, todėl tolimesniuose tyrimuose gali būti indikuotinas ilgesnis inkubavimo laikas. S. Pujari-Palmer ir bendraautorių tyrime inkubavimo laikotarpis siekė 1-ą parą [13]. G. Maestres ir kitų tyrime kaulo pakaitalai su makrofagais buvo inkubuojami nuo 1 iki 14 dienų [9]. Atliekant tyrimą su ilgesniu inkubavimo laikotarpiu yra galimybė vertinti ne tik ūminę, bet ir lėtinę imuninę reakciją į skirtingus kaulo pakaitalus. Vertinant jau atliktus tyrimus ir atsižvelgiant į gautus šio bandomojo tyrimo rezultatus, pasirinkta šio tyrimo metodika yra patogi ir informatyvi. Planuojant tolimesnius tyrimus, reiktų atsižvelgti į keliamus tikslus ir suderinti metodinį protokolą, siekiant gauti norimus rezultatus, kurie padėtų ne tik mokslinėje veikloje, bet ir klinikinėje gydytojų praktikoje, parenkant tinkamiausią kaulo pakaitalą chirurginių intervencijų metu.
Vertinant šio atlikto bandomojo tyrimo metu susidariusių aktyvių deguonies junginių vidurines reikšmes, daugiausiai susidarė 25 mg masės alogeninio kaulo pakaitalo eksperimentiniuose mėginiuose (3,40 s.v./min). Tai yra beveik keturis kartus didesnė reikšmė nei kontrolinėje grupėje gauti rezultatai (0,87 s.v./min). Galima teigti, kad didžiausią oksidacinį stresą leukocitų ląstelėse sukelia alogeninis kaulo pakaitalas. Studijose buvo pastebėtos sąsajos tarp kaulo granulių dydžio ir leukocitų ląstelėse susidarančių aktyvių deguonies junginių. Kuo didesnės granulės – tuo didesnis oksidacinis stresas sukeliamas [8,11]. Todėl didžiausius rodiklius su alogeniniu kaulu galėjo lemti pakankamai didelis pakaitalo granulių dydis (<2 mm) ar šio kaulo
34
pakaitalo sudėtyje esanti išlikusi organinė dalis (30%). Mažiausiai aktyvių deguonies junginių susidarė su 12,5 mg ksenogeninio kaulo pakaitalo eksperimentiniais mėginiais, jų vidurkis buvo žemesnis už kontrolę (0,81 s.v./min). 25 mg masės mėginiuose ROS vidurinė reikšmė lygi kontrolei (0,87 s.v./min). Galima teigti, kad ksenogeninis kaulo pakaitalas nesukelia oksidacinio streso leukocitų ląstelėse. Šiam rezultatui taip pat galėjo turėti įtakos mažas granulių dydis (500 – 1000 µm), taip pat pakaitalo sudėties homogeniškumas – jį sudarė tik hidroksiapatito kristalai. Šiame bandomajame tyrime buvo naudoti gamintojų pateikiami kaulo pakaitalai, su skirtingomis granulių dalelėmis, siekiant įvertinti metodiką ir aktyvių deguonies junginių išsiskyrimo galimybę. Tolimesniuose tyrimuose galima vertinti suvienodintus granulių dydžius tarp skirtingų kaulo pakaitalų. Šiuo metu itin populiarėja tyrimai su nanodalelių dydžio biomedžiagomis [9,21,23], kurios taip pat gali būti įtrauktos į tolimesnius tyrimus.
Atliktame bandomajame tyrime visose 25 mg kaulo pakaitalų eksperimentinėse grupėse susidarė daugiau aktyvių deguonies junginių nei 12,5 mg grupėse, šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p<0,05) tarp alogeninės ir aloplastinės kilmės kaulo pakaitalų. Galima teigti, kad kuo didesnė alogeninio ir aloplastinio kaulo pakaitalo masė naudojama, tuo didesnis oksidacinis stresas sukeliamas.
Viena dažniausia kaulo pakaitalo panaudojimo priežastis odontologijoje – kaulo atrofija po danties netekimo ar jo pašalinimo, taip pat dėl tiltinių bei plokštelinių protezų, kai kaulas negauna pakankamo kramtymo krūvio ir pradeda nykti, bei dėl infekcijų [1,2]. Ypatingai svarbus švietimas, nes pacientai turi būti informuoti apie netektų dantų sukeliamus procesus kaule, siekiant išvengti papildomų ir sudėtingų operacijų, kurios ne tik prastina pacientų gyvenimo kokybę, bet ir, kaip parodė bandomasis tyrimas, didina komplikacijų riziką, nes naudojant didesnį kaulo tūrį, didėja ir aktyvių deguonies junginių išsiskyrimas.
Atlikus bandomąjį tyrimą, galima teigti, kad skirtingi kaulo pakaitalai daro įtaką aktyvių deguonies junginių susidarymui ir sukelia skirtingą oksidacinį stresą žmogaus leukocitų ląstelėse, todėl iškelta hipotezė pasitvirtina. Reikalingi tolimesni, didesnių imčių tyrimai, norint pagrįsti šio, bandomojo, tyrimo išvadas.
35
5. PADĖKA
Noriu padėkoti ir išreikšti nuoširdžiausią pagarbą prisidėjusiems prie šio darbo: Darbo vadovui doc. dr. Gintarui Janužiui,
Prof. Rasai Banienei konsultavusiai ir padėjusiai atlikti aktyvių deguonies junginių nustatymo tyrimą fluorimetru, LSMU Medicinos fakulteto Biochemijos katedrai už galimybę pasinaudoti fluorimetru,
LSMU Laboratorinės medicinos klinikai, už leidimą naudotis reikiama įranga ir pagalbą išskiriant leukocitų ląsteles,
Gyd. rezidentui Donatui Nomeikai,
Vyriausiajai statistikos specialistei Irenai Nedzelskienei, už pagalbą atliekant statistinę duomenų analizę,
Tyrime dalyvavusiems žmonėms.
6. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nėra.36
IŠVADOS
1. Alogeninis kaulo transplantatas daro didžiausią oksidacinį streso poveikį žmogaus leukocitų ląstelėse, o mažiausią – ksenogeninis kaulo transplantatas.
2. Didesnė kaulo pakaitalo masė lemia ryškesnį leukocitų aktyvumą ir sukelia didesnį oksidacinį stresą žmogaus leukocitų ląstelėse.
3. Skirtingu inkubavimo laikotarpiu tarp kaulo pakaitalų vyrauja skirtingos aktyvių deguonies junginių susidarymo tendencijos.
4. Vyrų leukocitų ląstelėse didžiausią įtaką oksidacinio streso susidarymui turi alogeninis, o mažiausią – ksenogeninis kaulo pakaitalas. Tuo tarpu moterų leukocituose didžiausią oksidacinį stresą sukelia aloplastinis, o mažiausią – ksenogeninis kaulo transplantatas.
37
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Bandomojo tyrimo metu pastebėtas ryšys tarp kaulo pakaitalų ir aktyvių deguonies junginių susidarymo leukocituose, kurių atitinkamas kiekis sukelia oksidacinį stresą. Tyrimų šia tema labai mažai, Lietuvoje jų nėra atlikta, todėl reikalingi tolimesni tyrimai su didesne tiriamųjų imtimi, kuri pagrįstų bandomojo tyrimo išvadas ir leistų prisidėti prie tyrimų, kurie padėtų išsiaiškinti labiausiai suderinamą kaulo pakaitalą su individualiu žmogaus organizmu, siekiant išvengti nepageidaujamų reakcijų.
2. Tolimesniems tyrimams rekomenduojamas ilgesnis inkubavimo laikas, kuris leistų įvertinti ne tik ūminę, bet ir lėtinę organizmo reakciją.
3. Tolimesniems tyrimams rekomenduojamas ne tik tiesioginės, bet ir netiesioginės metodikos panaudojimas ir palyginimas.
4. Tolimesniuose tyrimuose rekomenduojamas kaulo pakaitalo granulių dydžio standartizavimas ir palyginimas.
5. Tolimesniuose tyrimuose rekomenduojamas ne tik aktyvių deguonies junginių susidarymo, bet ir kitų imuninių reakcijų komponentų vertinimas.
38
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Neto A, Ferreira JM. Synthetic and Marine-Derived Porous Bone Graft Substitutes. 2018; 2. Zheng Z-W, Chen Y-H, Wu D-Y, Wang J-B, Lv M-M, Wang X-S, et al. Development of an
Accurate and Proactive Immunomodulatory Strategy to Improve Bone Substitute Material-Mediated Osteogenesis and Angiogenesis. Theranostics. 2018;8(19):5482–500.
3. Zimmermann G, Moghaddam A. Allograft bone matrix versus synthetic bone graft substitutes. Injury. 2011;42.
4. Kumar P, Fathima G, Vinitha B. Bone grafts in dentistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2013;5(5):125.
5. Kaing L, Grubor D, Chandu A. Assessment of bone grafts placed within an oral and maxillofacial training programme for implant rehabilitation. Australian Dental Journal. 2011;56(4):406–11.
6. Elakkiya S, Ramesh A, Prabhu K. Systematic analysis on the efficacy of bone enhancement methods used for success in dental implants. The Journal of Indian Prosthodontic Society. 2017;17(3):219.
7. Clementini M, Morlupi A, Agrestini C, Ottria L. Success rate of dental implants inserted in autologous bone graft regenerated areas: a systematic review. Oral Implantol (Rome). 2011 Jul;4(3-4):3-10.
8. Yin X, Zetao C, Jiang C, Chengtie W. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2016;4.
9. Mestres G, Espanol M, Xia W, Persson C, Ginebra M-P, Ott MK. Inflammatory Response to Nano- and Microstructured Hydroxyapatite. Plos One. 2015;10(4).
10. Dagur PK, Mccoy JP. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current Protocols in Cytometry. 2015;
11. Adjei IM, Plumton G, Sharma B. Oxidative Stress and Biomaterials. Oxidative Stress and Biomaterials. 2016;:89–115.
12. Weber M, Steinle H, Golombek S, Hann L, Schlensak C, Wendel HP, et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2018;6.
13. Pujari-Palmer S, Chen S, Rubino S, Weng H, Xia W, Engqvist H, et al. In vivo and in vitro evaluation of hydroxyapatite nanoparticle morphology on the acute inflammatory response. Biomaterials. 2016;90:1–11.
