MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
OVIDIJUS VYŠNIAUSKAS
AUGINAMO IR NATŪRALIAI AUGANČIO SIAURALAPIO
GAUROMEČIO (Chamerion angustifolium (L.) Holub) FLAVONOLIŲ
KIEKIO KITIMAI VAISTINĖJE AUGALINĖJE ŢALIAVOJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai:
prof. dr. (HP) O.Ragaţinskienė (Vytauto Didţiojo universiteto Kauno botanikos sodas),
prof. habil. dr. A.Maruška (Vytauto Didţiojo universitetas),
prof. dr. (HP) L.Ivanauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas)
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
2011-05-12
AUGINAMO IR NATŪRALIAI AUGANČIO SIAURALAPIO
GAUROMEČIO (Chamerion angustifolium (L.) Holub) FLAVONOLIŲ
KIEKIO KITIMAI VAISTINĖJE AUGALINĖJE ŢALIAVOJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai Ona Ragaţinskienė Audrius Maruška Liudas Ivanauskas 2011-05-12 Recenzentas Marija Sapragonienė 2011-05-12 Darbą atliko Magistrantas Ovidijus Vyšniauskas 2011-05-12
Kaunas, 2011
TURINYS
SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 91.1. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub): ... 9
1.1.1. Botaninė charakteristika ... 9
1.1.2. Paplitimas, dauginimas ir auginimo sąlygos ... 9
1.1.3. Anatominiai ir morfologiniai poţymiai ... 11
1.1.4. Biologiškai veikliosios medţiagos ... 11
1.1.5. Taikymas medicinoje ... 13
1.1.6. Kitos naudojimo sritys ... 14
1.1.7. Siauralapio gauromečio mokslinių tyrimų kryptys ir preparatai ... 15
1.2. Flavonoidų charakteristika, biologinės savybės, poveikis sveikatai ir panaudojimas ... 16
1.2.1. Flavonoidų charakteristika... 16
1.2.2. Flavonoidų biologinis aktyvumas ir poveikis sveikatai ... 17
1.2.3. Flavonoidų antioksidacinis aktyvumas ir poveikis sveikatai ... 18
1.2.4. Flavonoidų ekstrakcija ... 19
1.2.5. Flavonoidų analizės metodai ... 20
1.2.6. Fenolinių junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 22
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODIKA ... 26
2.1. Tyrimo objektas ... 26
2.2. Cheminės medţiagos ir tirpikliai ... 27
2.3. Tyrimo metodas ... 28
2.3.1. Metanolinių ekstraktų paruošimas ... 28
2.3.2. Kietafazė ekstrakcija ... 28
2.3.3. Spektrofotometrinis bendro fenolinių junginių kiekio įvertinimas ... 28
2.3.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos aparatūra ir analizės sąlygos ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Kietafazės ekstrakcijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodų optimizavimas ir įteisinimas . 30 3.1.1. Kietafazės ekstrakcijos optimizavimas ... 30
3.1.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo optimizavimas ir įteisinimo ţingsniai ... 31
3.2. Kokybinis flavonolių įvertinimas ... 34
3.2.1. Flavonolių identifikavimas siauralapių gauromečių vaistinėje augalinėje ţaliavoje ... 34
3.3. Kiekybinis flavonolių įvertinimas ... 35
3.3.1. Kiekybinis flavonolių pasiskirstymas skirtingose augalo dalyse ... 35
3.3.2. Kiekybinis flavonolių pasiskirstymas vaistinėje augalinėje ţaliavoje skirtingais vegetacijos tarpsniais ... 36
3.3.3. Kiekybinis flavonolių pasiskirstymas augaluose, augančiuose skirtingose natūraliose augavietėse .. 38
3.3.3. Flavonolių bendro kiekio palyginimas su augalų aukščiu ir antţeminės dalies santykiniu projekciniu plotu ... 39
3.4. Radikalų surišimo aktyvumas ... 40
3.5. Apibendrinimas ... 43
IŠVADOS ... 44
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45
MAGISTRO TEMA SKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 52
SANTRUMPOS
AF-ESC – atvirkščių fazių efektyvioji skysčių chromatografija; ATP – adenozintrifosfatas;
BMR – branduolių magnetinis rezonansas; DNR – deoksiribonukleorūgštis;
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; JAV – Jungtinės Amerikos valstijos; KE – kapiliarinė elektroforezė; KFE – kietafazė ekstrakcija; MS – masių spektrometrija; ODS – oktadecilsilanas; proc. – procentai; RNR – ribonukleorūgštis; TE – trolokso ekvivalentas; TFR – trifluoracto rūgštis; THF – tetrahidrofuranas;
UV-VIS – ultravioletinė ir matoma šviesa; VAŢ – vaistinė augalinė ţaliava;
VDU KBS – Vytauto Didţiojo universiteto Kauno botanikos sodas; ŢIV – ţmogaus imunodeficito virusas.
SANTRAUKA
O.Vyšniauskas. Auginamo ir natūraliai augančio siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) flavonolių kiekio kitimai vaistinėje augalinėje ţaliavoje. Magistro baigiamasis darbas/ moksliniai vadovai: prof. dr. (HP) O.Ragaţinskienė, prof. habil. dr. A.Maruška ir prof. dr. (HP) L.Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas, 2011.
Raktiniai ţodţiai: Chamerion angustifolium, siauralapis gaurometis, vaistinė augalinė
ţaliava, flavonoliai, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), radikalų surišimo aktyvumas.
Tyrimo objektas ir metodai: siauralapio gauromečio vaistinė augalinė ţaliava (ţolė, ţiedai,
lapai ir stiebai) surinkta 2008-2010 metais. Flavonolių analizė atlikta ESC metodu.
Darbo tikslas: ištirti auginamo ir natūraliai augančio siauralapio gauromečio flavonolių
kiekio pasiskirstymą vaistinėje augalinėje ţaliavoje (ţolėje, ţieduose, lapuose ir stiebuose), jo kitimą vegetacijos tarpsniais ir nustatyti radikalų surišimo aktyvumą, taikant ESC metodą.
Darbo uţdaviniai: Identifikuoti flavonolius siauralapių gauromečių vaistinėje augalinėje
ţaliavoje, įvertinti jų kiekybinę sudėtį ţolėje, ţieduose, lapuose, stiebuose; kiekio kitimą atskirais vegetacijos tarpsniais. Nustatyti natūraliai augančių augalų flavonolių bendro kiekio kitimą priklausomai nuo augalų aukščio ir antţeminės dalies santykinio projekcinio ploto. Įvertinti identifikuotų flavonolių radikalų surišimo aktyvumą.
Tyrimo rezultatai: Siauralapių gauromečių vaistinėje augalinėje ţaliavoje identifikuoti
flavonoliai: hiperozidas, miricetinas, kvercitrinas, kvercetinas ir kemferolis. Ţolėje vyrauja hiperozidas ir miricetinas, ţieduose – miricetinas, lapuose ir stiebuose – hiperozidas. Didţiausias flavonolių kiekis kaupiasi ţieduose (Fl3 12,57±0,31 mg/g), maţesnis ţolėje (H3 11,19±0,34 mg/g), lapuose (Fol3 6,27±0,24 mg/g), maţiausias stiebuose (St3 2,26±0,09 mg/g). Didţiausias flavonolių kiekis kaupiasi vaistinėje augalinėje ţaliavoje surinktoje masinio ţydėjimo tarpsnyje (H3 11,19±0,34 mg/g). Kituose vegetacijos tarpsniuose flavonolių kiekis pasiskirsto skirtingai, kinta nuo 3,39±0,13 mg/g (H1) iki 9,10±0,26 mg/g (H4). Augalo antţeminės dalies santykinis projekcinis plotas atvirkščiai proporcingas bendram flavonolių kiekiui (n=13, r=-0,687, p<0,01). Aukščiausi augalai (H22 185,5±11,8 cm) kaupia 4,83±0,16 mg/g flavonolių kiekį, o ţemiausi augalai (H9 84,4±22,8 cm) – 8,30±0,25 mg/g. Bendras flavonolių radikalų surišimo aktyvumas koreliuoja (n=34, r=0,990, p<0,01) su bendru identifikuotų flavonolių kiekiu. Didţiausiu radikalų surišimo aktyvumu pasiţyminti vaistinė augalinė ţaliava yra ţiedai (Fl3 9,82±0,40 mg/g), maţiausiu – stiebai (St14 0,58±0,01 mg/g). Ţolėje didţiausias radikalų surišimo aktyvumas nustatytas masinio ţydėjimo tarpsnyje (H3 8,71±0,29 mg/g). Natūraliai augančių siauralapių gauromečių radikalų surišimo aktyvumas kinta nuo 1,93±0,06 mg/g (H11) iki 6,62±0,24 mg/g (H9).
SUMMARY
O.Vyšniauskas. Amount of flavonols variation of cultivated and naturally growing willow herb (Chamerion angustifolium (L.) Holub) in medicinal plant material. Master thesis/ supervisors: prof. dr. (HP) O.Ragaţinskienė, prof. habil. dr. A.Maruška ir prof. dr. (HP) L.Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas, 2011.
Key words: Chamerion angustifolium, willow herb, medicinal plant material, flavonols,
High-performance liquid chromatography (HPLC), radical scavenging activity.
Object and methods: medicinal plant material of willow herb (herb, blooms, leaves and
stems) was collected in 2008-2010. Analysis of flavonols was performed using HPLC apparatus.
Aim: to investigate variations of flavonols amounts in cultivated and naturally growing
willow herb medicinal plant material (herb, blooms, leaves and stems), flavonols variations during different vegetation phases and determine radical scavenging activity, using HPLC apparatus.
Tasks of the work: to identify flavonols in willow herb medicinal plant material, evaluate
quantities of identified compounds in herb, blooms, leaves, stems; and variations of their amounts during different vegetation phases. To evaluate variation of total amount of flavonoids in naturally growing plant, depending on plant height and relative area of projection of overground part of the plant. To evaluate radical scavenging activity of identified flavonoids.
Results: Hyperoside, myricetin, quercitrin, quercetin and kaempferol were identified in
medicinal plant material of willow herb. Hyperoside and myricetin were determined in herb, myricetin was determined in blooms, hyperoside was determined in leaves and stems. The biggest amounts of flavonols accumulate in blooms (Fl3 12.57±0.31 mg/g), smaller amounts in herb (H3 11.19±0.34 mg/g) and leaves (Fol3 6.27±0.24 mg/g) and smallest amounts in stems (St3 2.26±0.09 mg/g). The biggest amounts of flavonols accumulate in medicinal plant material during the massive blooming phase (H3 11.19±0.34 mg/g). The amount of flavonols in different vegetation phases distribute differently, it varies from 3.39±0.13 mg/g (H1) to 9.10±0.26 mg/g (H4). Relative projection of plant area of overground part is inversely proportional to total amount of flavonols (n=13, r=-0.687, p<0.01). The highest plants (H22 185.5±11.8 cm) accumulate 4.83±0.16 mg/g amount of flavonols and the smallest plants (H9 84.4±22.8 cm) accumulate 8.30±0.25 mg/g. The total radical scavenging activity of flavonols correlate (n=34, r=0.990, p<0.01) with total amount of identified flavonoids. The biggest radical scavenging activity is characteristic for blooms (Fl3 9.82±0.40 mg/g), the smallest was determined for stems (St14 0.58±0.01 mg/g). The biggest radical scavenging activity in herb was determined during the massive blooming phase (H3 8.71±0.29 mg/g). Radical scavenging activity of naturally growing willow herb varied from 1.93±0.06 mg/g (H11) to 6.62±0.24 mg/g (H9).
ĮVADAS
Sprendţiant Pasaulio Sveikatos Organizacijos Europos sveikatos politikos dokumente „Sveikata visiems XXI amţiuje“ nurodytus du pagrindinius uţdavinius: saugoti ir stiprinti ţmogaus sveikatą; maţinti daţniausiai pasitaikančių ligų kartojimąsi – tyrinėjamas perspektyvus vaistinis, maistinis, medingas, pašarinis augalas – siauralapis gaurometis (Chamerion angustifolium (L.) Holub), kurio vaistinė augalinė ţaliava ir jos preparatai pasiţymi farmakologinio veikimo įvairove ir turi maţiau šalutinių poveikių ţmogaus organizmui negu cheminiai vaistai [100].
Siauralapis gaurometis – Chamerion angustifolium (L.) Holub (Onagraceae Juss.) auga visame šiaurės pusrutulio regione. Jo ţolėje yra daug polifenolinių junginių: kaip flavonolių-3-O-glikozidų [14, 34], triterpeninių rūgščių [32] ir elagotaninų [13]. Kvercetino glikozidai yra vyraujantys siauralapyje gaurometyje skirtingai nei kitose Epilobium rūšyse, kuriose pagrindiniai junginiai yra miricetino glikozidai [14].
Daugiau nei prieš šimtą metų siauralapis gaurometis buvo naudojamas tik kaip arbatos surogatas, nes buvo dar neištirtos šio augalo teigiamos gydomosios savybės bei poveikis ţmogaus organizmui. Falsifikuotos gauromečių arbatos pakuotės buvo atveţtos iš Rusijos į Vieną [27]. Prieš 50-60 metų Epilobium gentis pradėta vartoti liaudies medicinoje [90]. Prieš daugiau nei 20 metų atlikti pirmieji moksliniai tyrimai ir jo vartojimas, sutrikus prostatos funkcijai [31, 93, 102], auglių augimo slopinimui [67, 105]. Iki šiol vykdomi tyrimai dėl augalo pritaikymo gydant gerybinę prostatos hiperplaziją ar su šlapinimusi sijusias ligas [13, 30, 50, 51, 52, 94, 95, 96, 101]. Šį poveikį apsprendţia elagotaninai (Oenothein B), slopindami 5-α-reduktazę ir aromatazę, kurios sukelia gerybinį prostatos išvešėjimą, o flavonoliai sinergistiškai sustiprina elagotaninų poveikį. Atliekami tyrimai [79] nustatant įvairius augalo poveikius organizmui: analgetinį, antimikrobinį, antioksidacinį, priešuţdegiminį ir antihiperandrogeninį, kurie teigiamai įtakoja ir visą organizmo homeostazę, prostatos hiperplaziją. Lietuvos mokslininkai ištyrė priešvėţines siauralapio gauromečio savybes [105], nustatė fenolinių junginių kiekį vaistinėje augalinėje ţaliavoje [2].
Lietuvoje iki šiol neištirta augale vyraujančių polifenolinių junginių kiekiai, jų kitimas atskirais vegetacijos tarpsniais priklausomai nuo ekologinių augimo sąlygų, kurios įtakoja siauralapio gauromečio vaistinės augalinės ţaliavos tinkamumą ligų prevencijai ir profilaktikai.
Šiame darbe efektyviosios skysčių chromatografijos metodu analizuojami siauralapio gauromečio flavonoliai ir jų radikalų surišimo aktyvumas. Analizuota auginamo ir natūraliai augančio siauralapio gauromečio vaistinė augalinė ţaliava (ţolė, ţiedai, lapai ir stiebai).
Tyrimo objektas – siauralapis gaurometis, auginamas Vytauto Didţiojo universiteto Kauno
botanikos sodo vaistinių augalų mokslo sektoriaus vaistinių augalų kolekcijoje bei bandymo plotuose ir augantis natūraliose augavietėse.
Darbo tikslas: ištirti auginamo ir natūraliai augančio siauralapio gauromečio flavonolių
kiekio pasiskirstymą vaistinėje augalinėje ţaliavoje (ţolėje, ţieduose, lapuose ir stiebuose), jo kitimą vegetacijos tarpsniais ir nustatyti radikalų surišimo aktyvumą, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą.
Darbo uţdaviniai:
1. Įvertinti flavonolių kiekybinę sudėtį ţolėje, ţieduose, lapuose ir stiebuose. 2. Nustatyti flavonolių kiekio kitimą atskirais vegetacijos tarpsniais.
3. Nustatyti natūraliai augančių augalų flavonolių bendro kiekio kitimą priklausomai nuo augalų aukščio ir antţeminės dalies santykinio projekcinio ploto.
4. Įvertinti identifikuotų flavonolių radikalų surišimo aktyvumą.
Darbo naujumas, teorinė ir praktinė reikšmė. Pirmą kartą tiriama ir lyginama natūraliai
augančių ir auginamų Lietuvos klimatinėmis sąlygomis siauralapių gauromečių vaistinės augalinės ţaliavos (ţolės, ţiedų, lapų ir stiebų) flavonolių kiekybinė sudėtis, įvertintas identifikuotų flavonolių radikalų surišimo aktyvumas, flavonolių kiekio dinamika vegetacijos tarpsniais ir nustatytas tirtos vaistinės augalinės ţaliavos tinkamumas ligų prevencijai ir profilaktikai bei taikymui farmacijai.
Padėkos. Dėkoju darbo vadovams prof. dr. (HP) Onai Ragaţinskienei, prof. habil. dr. Audriui
Maruškai ir prof. dr. (HP) Liudui Ivanauskui uţ idėjas, pastabas, patarimus, konsultacijas, palaikymą, suteiktas ţinias bei puikias darbo sąlygas rašant magistro baigiamąjį darbą Vytauto Didţiojo universiteto, Gamtos mokslų fakulteto, Biochemijos ir biotechnologijų katedroje. Vytauto Didţiojo universiteto Kauno botanikos sodo darbuotojoms uţ auginamo siauralapio gauromečio vaistinę augalinę ţaliavą.
Magistrantams: Anai Frolovai, Justinai Zykevičiūtei, Simui Vaitkevičiui ir doktorantams: Vilmai Ratautaitei, Kristinai Bimbiraitei-Survilienei, Mantui Stankevičiui, Vilmai Armoškaitei, Tomui Drevinskui uţ pagalbą ir nuoširdţius patarimus.
Lietuvos jaunųjų gamtininkų centro Ekologijos ir gamtos apsaugos skyriaus metodininkui Almantui Kulbiui ir doc. dr. Taurui Antanui Mekui uţ vertingus literatūros šaltinius rašant magistro baigiamąjį darbą. Anykščių regioninio parko ekologei Rasai Rutkauskienei ir Anykščių rajono merui-gamtininkui Sigitui Obelevičiui uţ parodytas natūralias siauralapio gauromečio augavietes. Artimiesiems uţ palaikymą ir supratingumą.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub):
1.1.1. Botaninė charakteristika
Chamerion angustifolium (L.) Holub – siauralapis gaurometis (gr. chamai reiškia ţemas,
nerion – oleandras; (augalas panašus į ţemą oleandrą), angustifolium – siauralapis [24, 35]. Tai nakvišinių (Onagraceae Juss.) šeimos, mirtiečių (Myrtales Rchb) eilės, erškėčiaţiedţių (Rossidae Takht.) poklasio, magnolijainių (Magnoliopsida Bronan.) klasės, magnolijūnų (Magnoliophyta Cronquist, Takht. et W. Zimm. ex. Reveal) skyriaus augalas [43, 92].
Lotyniško vardo sinonimai: Chamaenerion angustifolium (L.) Scop. Chamerion spicatum
(Lam.) S.F. Gray, Epilobium angustifolium L.; Epilobium angustifolium var. intermedium (Lange) Fernald., E. difforme Gilib., nom. inval.; E. spicatum Lam. Epilobium gesneri Villain, E. persicifolium Vill., E. salicifolium Clairv., Lysimachia chamaenerion (L.) Scop. [24, 26].
Lietuviško vardo sinonimai: oţkaroţė, siauralapė oţkaroţė; garometis, kazokai [10]. Vardai kitomis kalbomis [18, 26, 43, 55, 81, 103] pateikiami 1 PRIEDE.
1.1.2. Paplitimas, dauginimas ir auginimo sąlygos
Siauralapis gaurometis priklauso holarktiniam floros elementui [61]. Augalo paplitimas pasaulyje [21, 103] pateikiamas 1 paveiksle.
Gauromečio arealas platus, galimi įvairūs dirvoţemiai, tačiau daţniausiai auga paţeistose ţemės vietose (iškirsti ar išdegę miškai; pelkės; nuošliauţų, upių vagų teritorijos; greitkelių bei geleţinkelių šalikelės; dirvonuojantys laukai). Jis gali augti šviesiuose miškuose, bet ne visiškame pavėsyje. Aptinkamas tiek jūrinio, tiek visiškai ţemyninio klimato juostose, su trumpomis karštomis vasaromis ir ilgomis šaltomis ţiemomis. Augavietės kasmetiniai krituliai svyruoja tarp 330 mm ir 3420 mm. Temperatūra – -50 iki +30ºC. Aukštis – 0 – 4700 metrų virš jūros lygio [103]. Gaurometis auga dirvoţemio, ploname paviršiniame dirvos sluoksnyje virš amţino įšalo subarktiniuose regionuose ar giliai derlingame dirvoţemyje. Auga smėlio, priemolio ir molio gero laidumo dirvoţemiuose. Dirvoţemio rūgštumas nuo 5,6 iki 8,5. Šiauriniai dirvoţemiai, kuriuose pasitaiko šis augalas, būna įšalę 4-5 mėnesius ar ilgiau [8, 17, 39].
Paplitimas Lietuvoje. Siauralapis gaurometis paplitęs visoje Lietuvoje, daţnas. Auga
pylimų, apleistuose karjeruose, rečiau smėlio kopose, drėgnuose, bet neįmirkusiuose dirvoţemiuose [23, 61]. Priklauso nitratinių augalų grupei, kur vyksta intensyvi dirvos nitrifikacija [61].
1 pav. Žalia spalva pažymėtos valstybės, kuriose natūraliai auga siauralapis gaurometis
Augalo dauginimasis (plitimas) ir auginimas. Siauralapis gaurometis platinasi sėklomis,
kurias su skristukais išnešioja vėjas. Daţniausiai dauginasi vegetatyviniu būdu – šakniastiebiais, suformuodamas populiacijas, ir generatyviniu – produkuodamas daug sėklų. Po paţeidimų gaurometis lengvai atţelia. Po 1980 metų ugnikalnio išsiverţimo Vašingtone, gaurometis buvo vienintelis augalas išlikęs šv. Elenos kalne. Ūgliai atsinaujina iš šakniastiebių, greitai auga ir po mėnesio pradeda ţydėti. Keturių metų augalo šakniastiebis su 56 pumpurais, ilgis apie 6 metrai. Šakniastiebio ilgis priklauso nuo dirvoţemio derlingumo ir nuo vegetacijos trukmės. Gaurometis tai savidulkis augalas arba apdulkinamas vabzdţių. Sėklos esant optimalioms dygimo sąlygoms (12-30°C, pilnas apšvietimas ir pakankama drėgmė) sudygsta per 10 dienų. Daugelis gauromečio sėklų praranda daigumą jau po 18-24 mėnesių. Gauromečio sėklų „plaukeliai“ reaguoja į drėgmę: kai drėgmė padidėja, „plaukeliai“ suplonėja, sėklos nebesiplatina, nusėda į dirvoţemį ir sudygsta. Sėklos pakyla virš 100 metrų aukščio, išplinta 100-300 kilometrų teritorijoje [39].
Auginimo sąlygos: Dauginamas subrendusiomis sėklomis, kurios sėjamos balandţio mėnesį į
nuolatinę augimo vietą ir šakniastiebiais, dalijant kerus, kurių 10-15 cm ilgio atkarpos sodinamos pavasarį arba anksti rudenį [3]. Daigai sodinami 60 cm tarpueiliais, 25 cm atstumais tarp augalų [69]. Augalas gerai auga drėgname, neįmirkusiame dirvoţemyje. Dirvą reikia purenti ir tręšti. Rekomenduojama tręšti mišiniu, sudarytu iš: 3 dalių azoto, 2 dalių fosforo ir 3 dalių kalio trąšų [7]. Derlingoje dirvoje augalai yra vešlesni su ilgesniais ţiedynais [11]. Toje pačioje vietoje gerai auga nuo 3 iki 10 metų. Augalas švesamėgis [7].
1.1.3. Anatominiai ir morfologiniai poţymiai
Sauralapis gaurometis – daugiametis, ţolinis augalas, ţydi birţelį-rugsėjį, sėklos subręsta
rugpjūtį-spalį [69].
AUGALO VEGETATYVINIŲ ORGANŲ POŢYMIAI: Stiebas 20-250 cm aukščio, stačias arba
kylantis, apvalus arba neţymiai briaunotas, paprastas, rečiau šakotas, plikas, be ruoţelių, raudono atspalvio; nuo pamato iki ţiedyno lapuotas [26, 61, 69, 103]. Lapai viršutinėje pusėje tamsiai ţali, apatinėje – melsvai ţali, su rusvomis gyslomis, vienoje lapalakščio pusėje 10-25 šoninių gyslų. Lapai bekočiai arba su trumpais koteliais (iki 7 mm), praţanginiai arba mentūriniai, pailgi arba linijiškai lancetiški, 2,5-23 cm ilgio ir 0,3-3,5 cm pločio, beveik lygiakraščiai arba su neţymiais liaukiniais danteliais pakraštyje [26, 61, 103]. Šakniastiebis – 10-18 mm storio, 1-2 m ilgio, šliauţiantis su daugeliu poţeminių ūglių, iš kurių išauga lapuoti antţeminiai stiebai [3, 72].
AUGALO GENERATYVINIŲ ORGANŲ POŢYMIAI: Ţiedai susitelkę viršūninėse daugiaţiedėse
kekėse. Ţiedai – hermafroditai (turi moteriškus ir vyriškus organus), apdulkinami bičių [17]. Ţiedpumpuriai – kiaušiniški, viršūnėje staigiai nusmailėję arba kiek pailgi, laipsniškai į viršų nusmailėjantys. Ţiedai stambūs, silpnai zigomorfiniai, išsidėstę viršūnėje iki 30 cm ilgio kekėje. Ţiedkočio ilgis 0,5-3 cm. Taurėlapiai 4, linijiškai lancetiški, 1,5-3 mm pločio, 6-19 mm ilgio, išorinėje pusėje rausvo atspalvio, plaukuoti, nesuaugę su taurele. Vainiklapiai 4, atvirkščiai kiaušiniški, viršūnėje apskriti ir lygiakraščiai arba su neţymiomis iškarpomis, pamate susiaurėję į trumpą nagelį, 9-25 mm ilgio ir 3-15 mm pločio, apatiniai maţesni uţ viršutinius, visi purpuriškai rausvi, šviesiai rausvi arba balti. Kuokeliai 8 ţemyn palinkę, jų koteliai pamate paplatėję. Piestelė viena: mezginė 0,6-2,5 cm su trumpais balkšvais plaukeliais; liemenėlis 8-16 mm lankiškai ţemyn išsilenkęs, pamate plaukuotas; purka keturskiltė, jos skiltys apie 2,5 mm ilgio [26, 61, 103]. Ţiedadulkės 77 μ ilgio ir 71 μ pločio, pilkšvai melsvos spalvos [22]. Vaisius – ankšties pavidalo keturbriaunė dėţutė, apaugusi trumpais, prigludusiais plaukeliais, rausva, 4-9,5 cm ilgio, atsidaro 4 sąvaromis [61, 103]. Sėklos pailgai ovališkos, į abu galus nusmailėjusios, lygios, 0,9-1,3 mm ilgio, 0,3-0,45 mm pločio ir storio, su ilgų, baltų plaukelių kuokšteliu-skristuku 1-1,7 cm. Viename sėklalizdyje subręsta 300-500 sėklų. Viename augale subręsta iki 80000 sėklų, kurias platina vėjas [20, 103].
1.1.4. Biologiškai veikliosios medţiagos
Gauromečių lapuose: Flavonoidai. Orasausėje vaistinėje augalinėje ţaliavoje (VAŢ) apie
1-2 proc. flavonoidų. Randami neţymūs kiekiai laisvų flavonolių aglikonų kemferolio, miricetino ir kvercetino, neţymūs kiekiai flavonolių glikozidų kemferolio-3-O-ramnozido, izomiricitrino (= miricetino-3-O-gliukozido), miricetino-3-O-gliukuronido, avikularino (=
kvercetino-3-O-arabinofuranosido), hiperozido (= kvercetino-3-O-galaktozido), didesni kiekiai miricitrino (= miricetino-3-O-ramnozido), izokvercitrino (= 3-O-gliukozido) ir kvercitrino (= ramnozido), pagrindinę flavonolių glikozidų mišinio dalį sudaro guajaverinas (= kvercetino-3-O-arabinopiranozidas) ir kvercetino-3-O-gliukuronidas [1, 26, 101].
Rauginės medžiagos. 4-14 proc. makrociklinių elagotaninų didţiausią dalį sudaro Oenothein B ir maţesnę dalį Oenothein A. Taip pat ir galo rūgšties dariniai
(2-O-galoil-3-O-valoneoildilaktono-4C
1-gliukozė) ir epilobamidas A [101].
Steroliai. Iš orasausės VAŢ išskirta β-sitosterolis, β-sitosterolio kapratas, β-sitosterolio kaproatas, sitosterolio kaprilatas, sitosterolio-D-gliukozidas, sitosterolio palmitatas, β-sitosterolio-6`-O-palmitoil-β-D-gliukozidas, β-sitosterolio propionatas ir sitosterolio-6`-O-stearil-D-gliukozidas. Bendras sitosterolio darinių kiekis sudaro 0,40 proc. orasausės VAŢ svorio. Ištirta β-sitosterolio darinių pasiskirstymas įvairiose augalo dalyse (lapuose, ţieduose, sėklose, stiebuose). Lapuose kaupiasi visi anksčiau išvardinti sitosterolio junginiai, ţieduose ir sėklose visi, išskyrus β-sitosterolio kaproatą ir propionatą. Stiebuose randamas tik β-sitosterolis, β- β-sitosterolio-β-D-gliukozidas ir abu β-sitosterolio-6`-O-acil-β-D-gliukozidai. Laisvas β-sitosterolis yra pagrindinis junginys visose augalo dalyse, didţiausia koncentracija – lapuose (kiekybinių duomenų nėra) [26, 101].
Triterpeninės rūgštys (triterpenai). Orasausiuose lapuose hidroksioleanolio rūgštis, 2-α-hidroksiursolio rūgštis, oleanolio rūgšties ir ursolio rūgšties mišinys, kurio išeiga apie 1,5 proc. [26]. Angliavandeniai: gleivės 15 proc., pektinas. Alkaloidai 0,1-1 proc.. Fenolkarboninės rūgštys hidrolizate: kavos, n-kumaro, elago [82].
Švieţiuose lapuose išskirta askorbo rūgšties išeiga apie 225 mg iš 100 gramų VAŢ.
Gauromečių stiebuose: Rauginių medžiagų 4-6 proc. [82].
Gauromečių ţieduose: Flavonoidai. Ţieduose tokie patys flavonoidai kaip ir lapuose, tačiau
nėra miricitrino ir miricetino-3-O-β-D-gliukuronido. Po švieţių ţiedų ir jaunų vaisių hidrolizės be kemferolio, miricetino ir kvercetino išskirta 8-metoksikemferolio (seksangularetino). Lektinai. Ţieduose randamas lektinas (augalinės kilmės baltymas). Leukoantocianai. Alkaloidų pėdsakai. Vitaminas C. Rauginės medžiagos. Aukštesniųjų riebiųjų rūgščių: linolio, palmitino.
Gauromečių šakniastiebiuose: Flavonoidai. Apie 0,35 proc. kemferolio, miricetino ir
kvercetino tipo flavonolių glikozidų, maţi kiekiai guajaverino, kvercetino-3-O-β-D-gliukuronido, hiperozido ir izokvercitrino taip pat kaţkiek daugiau kvercitrino. Rauginės medžiagos. Apie 7 proc. (3-20 proc.) rauginių medţiagų. Steroliai. Švieţiuose augaluose nustatyti tokie patys junginiai kaip ir orasausėse augalo dalyse. Šalia β-sitosterolio įrodyta viršutinėse augalo dalyse kaip sekančių aglikonų neţymūs kiekiai: kempesterolio ir stigmasterolio (nėra kiekybinių duomenų ir ţinių ar švieţios ar
orasausės VAŢ). Angliavandeniai: krakmolas, gleivės 15 proc., cukrus, pektinas. Alkaloidų 0,1 proc.. Fenolkarboninių rūgščių: galio rūgštis. Riebalinio aliejaus.
Gauromečių vaisiuose ir sėklose: Flavonoidai: seksangularetinas, kemferolis, kvercetinas,
miricetinas. 40-45 proc. riebalinio aliejaus [26, 82].
Gauromečių ţolėje nustatyta 16 amino rūgščių, kurių didţiausias kiekį sudaro asparagino
(1,29 proc.) ir gliutamino (1,77 proc.). Taip pat 24 elementai, iš jų 4 makroelementai ir 9 mikroelementai [65].
1.1.5. Taikymas medicinoje
Medicinoje naudojamos siauralapio gauromečio VAŢ aprašymai [16, 26] pateikiami 2 PRIEDE. Siauralapio gauromečio poveikis ţmogaus organizmui:
Priešuţdegiminis ir antioksidacinis. Šį poveikį apsprendţia kvercetino-3-O-gliukuronidas,
miricetino-3-O-ramnozidas ir miricetino-3-O-gliukuronidas, elagotaninai: Oenothein B ir Oenothein A, kurie slopina hialuronidazės, lipoksigenazės ir mieloperoksidazės aktyvumą. Miricetino-3-O-gliukuronido aktyvumas apie 10 kartų didesnis negu indometacino. Vandeninė VAŢ ištrauka slopina 10μg kalcio jonoforą A 23187, kuris skatina prostaglandinų PG D2, PG E2 ir PG I2 išsiskyrimą arba
susidarymą [26, 33, 53, 56, 83].
Antimikrobinis, priešgrybelinis ir priešvirusinis. Švieţių antţeminių augalo dalių 10
proc.-inė suspensija 15 proc. etanolyje stabdo 1:5 in vitro praskiedime Pseudomonas pyocyanea bakteriofagų dauginimąsi. Poveikis yra gana silpnas, tačiau – antibakterinis. Vištos kiaušinyje 1 valandą prieš viruso įleidimą 0,2 ml suspensijos stabdo influenza A-viruso dauginimąsi. Didţiausiu aktyvumu pasiţymi preparatai, pagaminti iš vaisių, maţesniu iš ţiedų ir lapų. Etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai pasiţymi antimikrobiniu poveikiu prieš Bacillus subtilis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis, Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus albus ir Staphylococcus aureus [4, 26, 45, 56, 99].
Analgetinis. Siauralapis gaurometis pasiţymi skausmą maţinančiomis savybėmis,
reikšmingas poveikis nustatomas esant 95 mg/kg dozei in vivo, kai dozė didesnė nei 190 mg/kg, pasireiškia panašus poveikis kaip vandenyje tirpios acetilsalicilo rūgšties ir parenteraliai skiriamo analgetiko (referentinė dozė 300mg/kg) [86].
Auglių susidarymą slopinantis. Jį apsprendţia Oenothein B ir Oenothein A, kuris slopina
5-α-reduktazę ir aromatazę. Šie fermentai turi labai didelę reikšmę steroidinių hormonų medţiagų apykaitai ir taip pat prostatos hiperplazijos vystymuisi. Flavonoidai sinergistiškai sustiprina Oenothein B poveikį. Naudojama liaudies medicinoje esant prostatos hiperplazijos pradţiai ir šlapinimosi
sutrikimams, gydant prostatos adenomą. Įvairios Epilobium rūšių vandeninio ekstrakto aktyvumo studijos in vitro parodė slopinantį poveikį 5-α-reduktazei ir aromatazei. Be to, studijose su laboratoriniais gyvūnėliais šis ekstraktas parodė jo antiandrogeninį poveikį. Antiproliferacinis aktyvumas prostatinio epitelio, prostatos vėţio, astrocitomos ir krūtų epitelio ląstelių linijai veikia taip pat puikiai kaip indukuotos neutralios endopeptidazes prostatos vėţio ir neuroblastomos ląstelių linijai. Chanerol ir Chanerozan, chemiškai ne tiksliai nustatytos, ekstraktų frakcijos parodė teigiamą reakciją slopinant pelių ir ţiurkių transplantuotus auglius. Auglius slopinantis poveikis išnyksta po keletos dienų nutraukus gydymą vaistais [5, 13, 26, 50, 51, 52, 56, 67, 87, 101].
Vartojimas liaudies medicinoje. Siauralapių gauromečių VAŢ (ţolė) ir preparatai plačiai
vartojami liaudies medicinoje įvairiems sveikatos sutrikimams gydyti: kaip sutraukiantis ir kraujavimą stabdantis esant virškinimo trakto ligoms: skrandţio ir ţarnyno ţaizdoms, uţdegimams; opoms, gastritams, gleivingiems kolitams, diarėjai, vidurių uţkietėjimui, dirgliosios ţarnos sindromui, rektaliniams kraujavimams stabdyti, esant apsinuodijimams, kaip antiemetikai, o taip pat esant trauminiams skrandţio ir ţarnų paţeidimams. Menstruacijų ciklo sutrikimams, menoralgijai (didelis kraujavimas mėnesinių metu), baltosioms (moterų lytinių organų išskyroms), šlapinimosi sutrikimui esant prostatos hiperplazijos pradţiai, I-II stadijoms. Ji veikia analgetiškai, esant galvos skausmams, migrenai, otitams, sumušimams, artralgijoms (sąnarių skausmams), kaip raminanti priemonė esant miego sutrikimams; hiperozidas stimuliuoja širdies veiklą. Kaip sutraukiantis, minkštinantis (švelninantis), aptraukiantis ir spartinantis ţaizdų gijimą esant odos ar gleivinių susirgimams, nudegimams, nušalimams. Ji pasiţymi antibakteriniu aktyvumu prieš gramneigiamas bakterijas, vartojamas spazmams atpalaiduoti, esant astmai, kokliušui ar ţagsėjimui. Ji skatina prakaitavimą, maţina karštį, esant skrofuliozei (vaikų eksudacinė diatezė, daţnai kartu su tuberkulioze), esant vitamino C avitaminozei, anemijai, skrofuliozei. Tibeto medicinoje gauromečių šakniastiebiai vartojami sergant sifiliu ir gonorėja, ţolė – raupais, o ţiedai nuo auglių susidarymo. Veterinarijoje – nuo arklių „dusulio“ [16, 23, 26, 30, 44, 69, 80, 81, 82].
Toksiškumas, nuodingumas, ţinoma rizika: Tiriant siauralapių gauromečių etanolinius
ekstraktus nebuvo nustatyta jokio citotoksiškumo ţiurkių: smegenims, pogumburio-hipofizio-antinksčių ašiai, kepenims, inkstams, bluţniai ir uţkrūčio liaukai. Taip pat jis nesukelia streso būsenos [76]. Kiti tyrimai in vivo parodė, kad siauralapio gauromečio sausojo ekstrakto LD50 yra 1,4±0,1 g/kg
[86].
1.1.6. Kitos naudojimo sritys
Bitininkystėje. Medingas augalas. Nustatyta, kad ţiedas išskiria 12-15 mg nektaro. Vakarop
600 kg nektaro. Daugiausia nektaro augalai išskiria pavėsyje, esant 23-26°C temperatūrai. Medus skaidrus, ţalsvo atspalvio, labai švelnaus skonio. Išsuktas netrukus kristalizuojasi gana stambiomis kruopelėmis. Kartais būna grietinėlės konsistencijos. Gauromečių medus yra labai saldus [3, 54, 80].
Maisto pramonėje. Maistinis augalas. Jauni ūgliai ir lapai vartojami salotoms.
Šakniastiebiai paplotėliams kepti. Lapuose vitamino C tris kartus daugiau negu apelsinų vaisiuose. Uţkaukazėje saldţius, krakmolingus šakniastiebius valgo ţalius arba virtus. Sausi šakniastiebiai malami ir dedami į duoną. Taip pat šakniastiebiai vartojami kaip rauginimo medţiaga. Sibire ir Rytų Azijos šalyse iš švieţių arba fermentuotų ir išdţiovintų siauralapių gauromečių lapų verdama kvapni ir malonaus skonio arbata („Kaporskii čai“), jų dedama į kitų arbatţolių mišinius. Lapai – mėsos patiekalų ar buljonų prieskonis. Iš sėklų išskirtas riebalinis aliejus tinkamas maistui [15, 23, 44, 62, 72, 80, 82].
Pašarams. Gaurometis yra pašaras gyvūnams (briedţiams, šiauriniams elniams, ondatroms ir
kiškiams). Miškingose vietovėse gaurometis yra šiaurinių elnių pašaras. Aliaskoje – maistas kalnų oţiams, burundukai ir kiti smulkūs ţinduoliai minta gauromečių sėklomis, kolibriams gaurometis – nektaro šaltinis [39, 44, 81, 82].
Dekoratyvinis augalas. Auginamos šviesiai purpuriniais ir baltais ţiedais dekoratyvinės
siauralapio gauromečio formos. [80].
Pluoštinis augalas. Stiebų pluoštas tinka maišų, audeklų ir virvių gamybai [82].
Kita. Iš sėklų skristukų pripildomi čiuţiniai ir pagalvės. Gauromečio sąţalynai sutvirtina
smėlynus ir eroduojamus šlaitus [80].
1.1.7. Siauralapio gauromečio mokslinių tyrimų kryptys ir preparatai
Mokslinių tyrimų kryptys. Pastaruoju metu viena svarbiausių krypčių yra Chamerion
angustifolium VAŢ tyrimai, siekiant ištirti ir nustatyti poveikį, prostatos ir su šlapinimusi susijusių ligų gydymui. Daţniausiai tyrinėjami etanoliniai ekstraktai, rečiau vandeninės ištraukos. Tyrinėjama antiproliferacinis poveikis prostatos epitelio ląstelėms [94-96], fermentų 5α-reduktazės ir aromatazės slopinantis poveikis [13], analgetinis poveikis [86], antihiperandrogeninis aktyvumas in vivo [30], imunomoduliacinis poveikis [77]. Metalopeptodazių [50] ir endopeptidazių aktyvumo [51, 52] poveikis prostatos ląstelėms.
Kita tyrimų sritis – augalo antioksidacinio ir priešuţdegiminio poveikio įvertinimas [46, 53, 73, 79, 83, 89].
Didelis mokslininkų susidomėjimas siauralapio gauromečio veikliųjų junginių kokybine ir kiekybine sudėtimi. Daugiausia tyrimų analizuoja bendrų grupių junginių kiekius [64, 68, 78, 89, 104], elagotaninus [5, 52, 53], flavonoidus [5, 14, 84, 87] ir β-sitosterolius [89].
Siauralapio gauromečio tyrimai vykdomi: Rusijoje, Lenkijoje, Austrijoje, Suomijoje, Italijoje, Kanadoje, Šveicarijoje, Vengrijoje, Vokietijoje, Estijoje, Jungtinėse Amerikos valstijose, Kroatijoje, Anglijoje, Ispanijoje, Rumunijoje, Serbijoje, Slovėnijoje.
Preparatai iš Epilobium genties augalų: etanoliniai ekstraktai: ProLobium [66], БАД
“экстракт кипрея узколистного” [106]; vandeninis ekstraktas Canadian Willowherb™ [81]; kremai: Frezyderm Rectanal aid [19], Ja Nene Time Defy Cleanser [40], Prepeel Light; Medium; Active. [107]; gelis Prepeel Acne [107]. Dabar pasaulyje gaminami tik maisto papildai ar kosmetikos priemonės, vaistinių preparatų negaminama. Lietuvoje gaminamų gauromečio preparatų nėra. Perspektyvus sausasis gauromečių ekstraktas. Įvertinus kritinius jo kokybę apibūdinančius parametrus ir kompleksinę įvairių technologinių faktorių įtaką, parinkus optimalias technologinio proceso sąlygas bei atlikus biologinio poveikio tyrimus gali būti tinkamas įvairių vaistų formų gamybai.
1.2. Flavonoidų charakteristika, biologinės savybės, poveikis sveikatai ir
panaudojimas
1.2.1. Flavonoidų charakteristika
Flavonoidai - tai biologiškai aktyvūs junginiai, kurių aglikono struktūros pagrindas –
flavonas (2-fenil-benzo-γ-pirono ţiedas), priklausomai nuo klasifikacijos metodo, flavonoidų grupės suskirstytos į keletą pagrindinių kategorijų: pagal flavonoidų branduolio hidroksilinimą; pagal cukraus prisijungimą [71]. Natūraliai jie egzistuoja kaip monoglikozidai (hiperozidas, viteksinas), diglikozidai (rutinas) arba kaip aglikonai (kvercetinas, kemferolis, miricetinas). Flavonoidai yra antriniai augalinės kilmės metabolitai, sudarantys vieną gausiausių gamtinių junginių grupių, aptinkamų beveik visuose induočiuose augaluose [74]. Flavonoidai – tai augalų antriniai metabolitai, ţinomi kaip natūralūs vaisių ir darţovių pigmentai, suteikiantys raudoną, geltoną, mėlyną spalvas.
Svarbiausios flavonoidų struktūros suskirstytos į šešias klases (3 PRIEDAS) [12, 29, 63, 71]. Flavonoidų kiekį VAŢ lemia įvairūs aplinkos ir genetiniai faktoriai: augavietė, sezoniškumas, gamtinės sąlygos. Įvairių polifenolinių darinių (tarp jų ir flavonoidų) susikaupimas atskiruose augalo organuose ar audiniuose priklauso nuo vidinių ir išorinių veiksnių, sąlygojančių fermentų aktyvumą, biosintezės prekursorių kiekį audinyje. Atskirų polifenolių kiekio įvairavimas audinyje priklauso nuo hidroksilinimo, metilinimo, kondensacijos ir glikozidinių grupių susidarymo aktyvumo [42].
Flavonoliai ir jų O-glikozidai yra labiausiai paplitę flavonoidų klasėje. Flavonai ir flavonoliai labiausiai paplitę astrinių (Asteraceae) ir notrelinių (Lamiaceae) šeimose. Tai augalų šeimos, kurių augaluose kaupiasi ir nemaţas kiekis eterinių aliejų. Izoflavonai, labiau ţinomi kaip fitoestrogenai,
labiausiai paplitę pupinių (Fabaceae) šeimos augaluose [71]. Šiuo metu flavonoidų nustatyta virš 5000 [12].
1.2.2. Flavonoidų biologinis aktyvumas ir poveikis sveikatai
Flavonoidai veikia ţmonių sveikatą, net jei jie nėra maistiniai junginiai [71]. Atsiţvelgiant į struktūrinę flavonoidų aglikonų ir glikozidų įvairovę jie turi skirtingą poveikį [57]. Farmakologiniais eksperimentas įrodyta: priešuţdegiminis – slopina uţdeginimo metabolitų, įskaitant prostaglandinų ir leukotrienų, susidarymą. Kvercetinas ir kiti flavonoidai yra efektyvūs histamino išskyrimo inhibitoriai. Jie slopina pagrindinius uţdegimo etapus, įskaitant granuliacinio audinio susidarymą esant lėtiniam artritui; priešalerginis; priešopinis; antihepatotoksinis; priešvėţinis; priešvirusinis; antimikrobinis; choleretinis; diuretinis; normalizuojantis kapiliarų pralaidumą (ligos susijusios su padidėjusiu kapiliarų pralaidumu, tokios kaip diabetas, lėtinis veninės kraujotakos nepakankamumas, hemarojus, skorbutas, varikozinė opa, kraujosrūvos); širdies vainikinių kraujagyslių išplečiantis ir spazmolitinis poveikiai [12, 57, 63, 85]. Flavonoidų biologinis prieinamumas yra maţas. Aglikonai, o ypač glikozidai, yra absorbuojami lėtai, jie lieka nepakitę [12].
Flavonoidai veikia įvairias fermentų sistemas. Flavonoidai yra priemonė gebanti
pakaitomis slopinti ar stimuliuoti tam tikras fermentų sistemas [63]. Aldozės reduktazė – diabetinės kataraktos prieţastis, ją slopina kvercetinas, liuteolinas, kemferolis. Ksantino oksidazė – hiperurikemijos prieţastis, dėl kurios atsiranda podagra ir inkstų akmenys. Laisvos hidroksilo grupės C5 ir C7 (2 pav.) yra reikšmingos ksantino oksidazės slopinimui. Tirozino proteinkinazė – svarbi piktybinių ląstelių susidarymo pradţiai. Lipooksigenazė ir ciklooksigenazė – susiję su uţdeginimių prostaglandinų gamyba, leukotrienai ir tromboksanai dvigubas slopintojas arachidono rūgšties junginius. Ciklinių nukleotidų fosfodiesterazė pagrindinis fermentas, skatinantis trombocitų agregaciją [12, 63]. Jie veikia ir kitų fermentų veikimą: kinazių, fosfolipazės A2, ATPazės, fosfolipazės C, adenilatciklazės, atvirkštinės transkriptazės, ŢIV-1 proteinazę ir integrazę, ornitino dekarboksilazę, topoizomerazę, gliutationo S-transferazę, aromatazę, monoamino oksidazę, epoksido hidrolazę, aldozės reduktazę, ksantino oksidazę, amilazę, malatdehidrogenazę, RNR ir DNR polimerazę, ţmogaus DNR ligazę I, ribonukleazę, citochromo P450 sistemą ir kt. [57].
Flavonoidai turi sinergistinį poveikį vartojant kartu su askorbo rūgštimi. Jų apsauginis poveikis pasireiškia dėl membranų stabilizavimo ir antioksidacinio poveikio [63].
Duomenys apie flavonoidų teigiamą poveikį įgalino staigiai didinti flavonoidų vartojimą dideliais kiekiais. Tačiau pernelyg didelis ir nekontroliuojamas flavonoidų vartojimas gali sukelti mutageninį ar pro-oksidacinį poveikį, be to gali nuslopinti fermentų aktyvumą hormonų metabolizmo apykaitai [71].
1.2.3. Flavonoidų antioksidacinis aktyvumas ir poveikis sveikatai
Antioksidantas yra medţiaga, kurios maţa koncentracija, lyginat su oksiduojamu substratu, ţymiai sulėtina arba sustabdo substrato oksidaciją. Nors pagal literatūros šaltinius augaliniai fenoliniai junginiai ne visada laikomi tikrais antioksidantais, tačiau daug tyrimų in vitro parodė fenolinių junginių antioksidantines savybes: tiesioginį antiradikalinį poveikį vandeninėje fazėje ir gebėjimą padidinti maţo tankio lipoproteinų atsparumą oksidacijai, kurie turi įtakos širdies koronarinės ligos patogenezei. Nustatyta, kad dalis antioksidantinių savybių yra daugelyje vaisių ir uogų, kurį jiems suteikia flavonoidai. Su maistu gaunami fenoliniai junginiai pasiţymi didesniu antioksidaciniu poveikiu, nei vitaminas C, vitaminas E, ir β-karotinas tame pačiame maiste. Pasirinktų junginių antioksidantinio aktyvumo skirtumai gali būti matuojami taikant daug įvairių metodų.
Pagal literatūros duomenis galima aprašyti bendrus flavonoidų struktūros-antioksidacinio aktyvumo ryšius. Lyginant kvercetiną, katechiną ir cianidiną tarpusavyje svarbus yra neprisotintas C ţiedas (2 paveikslas), atsiţvelgiant į elektronų lokalizaciją
visoje molekulėje, ariloksilo radikalo stabilizavimui. C ţiede prie 2,3-dvigubos jungties pridėjus 3-OH grupę, jo padėtis greta 4-karbonil, yra reikalinga uţtikrinant maksimalų antiradikalinio aktyvumo efektyvumą. Silpnesnį katechino antioksidacinį aktyvumą galima sustiprinti įterpiant 2,3-dvigubą jungtį ir 4-okso funkcinę grupę, prie 3-OH per esterinę jungtį prijungiant galo rūgštį, ir į B ţiedą įvedant
papildomą 5'-OH grupę. Gautas (-)-epigalokatechin-3-O-galatas yra vienas iš efektyviausių superoksido radikalų surišėjas.
Monofenolinis ţiedas nėra veiksmingas vandenilio donoras. Taigi antioksidacinis aktyvumas yra didţiausias, kai B ţiedas yra pakeistas dviem hidroksilo grupėmis, esančiomis orto padėtyje. Trečiosios OH grupės buvimas B ţiede nesustiprina antioksidacinio veiksmingumo vandeninėje fazėje, išskyrus katechinų atveju; A ţiede esančios hidroksilo grupės turi didţiausią įtaką antioksidaciniam aktyvumui, nes B ţiede nėra dihidroksi struktūros.
Daţniausiai hidroksilo pakeitimas atliekant O-metilinimą inaktyvuoja flavonoidų antioksidacinį aktyvumą. Taip pat antioksidacinį aktyvumą maţina flavonoidų 3-glikozilinimas, lyginant su atitinkamu aglikonu, tačiau glikozilinant 7-OH grupę su prisotintu heterocikliniu ţiedu ir B ţiede atskirta hidroksilo grupe, gautas junginys gali netgi turėti antioksidaciniam aktyvumui slopinančią įtaką.
2 pav. Branduolių numeravimas flavone (Dingermann et al., 2004)
Riebaluose, B ţiede 3',4'-ortodihidroksi konfigūracija ir C ţiede 4-karbonilo grupė ir 3-OH grupė, turi įtakos optimaliam antioksidaciniam aktyvumui. Skirtingai nei sąveika vandeninėje terpėje, 2,3-dviguba jungtis yra laikoma maţiau svarbia. Tai tik vienas rezultatas studijuojant hipotezes, kad flavonoidų antioksidaciniam aktyvumui turi įtakos jų struktūrinės ypatybės, tačiau taip pat įtakos turi ir jų išsidėstymas biologinėse membranose [71].
Lipidų peroksidacija ir polinesočiųjų riebiųjų rūgščių oksidacinis irimas yra susiję su gyventojų senėjimu, toksiniu poveikiu kepenims, hemolize, vėţiu, ateroskleroze, auglių susidarymo skatinimu ir uţdegimu. Parinkti flavonoidai suteikia apsauginį poveikį prieš lipidų peroksidacijos ir įvairių toksinų skatinamą ląstelių paţeidimą, nes junginiai pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis [57, 63].
Gerai ţinoma, kad dėl įvairių biologinių junginių ţalingos oksidacijos vėliau atsiranda daugybė ligų: vėţys, kepenų ligos, Alzheimerio liga, senėjimo procesas, artritas, uţdegimas, diabetas, Parkinsono liga, aterosklerozė ir AIDS. Daugelio ligų prevencijai ir gydymui buvo vartojami antioksidantai.
Puikiai ţinomi natūralūs antioksidantai, tokie kaip vitaminas E (α-tokoferolis), vitaminas C ir polifenoliai/flavonoidai, buvo tirti dėl jų galimo vartojimo siekiant uţkirsti kelią aukščiau aprašytoms ligoms. Pastaruoju metu, daug dėmesio mokslo srityje skiriama augaluose randamiems polifenoliams/flavonoidams, kaip naujiems natūraliems antioksidantams. Įvairiose mokslo srityse nuolat auga mokslinių tyrimų skaičius: maisto chemijoje, maisto biologijoje, natūralių augalų chemijoje, vaistinių augalų, ir biochemijos [59].
1.2.4. Flavonoidų ekstrakcija
Flavonoidai daţniausiai iš VAŢ ekstrahuojami metanoliu, etanoliu, vandeniu ar jų mišiniais, tačiau kai kuriais atvejais šie tirpikliai gali būti parūgštinami. Daţnai ekstraktai prieš efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) analizę yra paveikiami HCl N2 aplinkoje, tam, kad būtų hidrolizuoti
flavonoidų glikozidai iki aglikonų [60]. Bandiniai ruošiami naudojant įvairią metanolio koncentraciją: 50 proc. [5], 70 proc. [87], 75 proc. [70], 80 proc. [37], 90 proc. [75]. Pavyzdţiams ruošti taip pat pasirenkamas įvairios koncentracijos etanolis: 30 proc., 45 proc. [42], 50 proc. [48], 60 proc. [42], 70 proc. [75], 96 proc. [41]. Retais atvejais pavyzdţiams ruošti naudojami kiti ekstrahentai: 80 proc. [89] acetono vandeniniai tirpalai ir 50 proc. acetonitrilo vandeninis tirpalas [75], dichlormetano ir metanolio mišiniai [1]. Ekstrakcija atliekama Soksleto aparate [41], ultragarsinėje vonioje [89], orbitalinėje purtyklėje [28], atliekant maceraciją [48]. Ekstrahavimo trukmė daţniausiai svyruoja nuo 1 min iki 24 val. Ilgesnė ekstrakcija gali padidinti fenolinių junginių oksidacijos galimybę, nebent yra
naudojami papildoma reduktorių tirpiklių sistema [60]. VAŢ ir ekstrahento santykis įvairuoja nuo 1:2 iki 1:200 [42].
Flavonoidų kokybiniam ir kiekiniam nustatymui VAŢ ekstraktuose naudojami įvairūs atskyrimo metodai: ekstrakcija skirtingo polingumo skysčiais, kietų fazių ekstrakcija (KFE), nusodinimas, dializė, garinimo metodai [42]. Atliekant KFE naudojami oktadecilsilano sorbentai ir parūgštintas bandinys [75]. Analičių desorbcija atliekama metanoliu ar kitu polingesniu eliuentu, tirpinančiu analites. Tyrimą atliekant ESC ir KE metodais rekomenduotina iš tiriamo bandinio pašalinti mikrodaleles, filtruojant per 0,22 μm porų skersmens membraninius filtrus. Kartais, jei per didelė bandinio koncentracija, reikia skiesti ekstraktą, o jei tiriamajame bandinyje yra labai maţi kiekiai nustatomosios medţiagos, bandinį gali tekti koncentruoti. Daţnai bandiniai koncentruojami naudojant garinimą ar kietų fazių ekstrakciją [42].
1.2.5. Flavonoidų analizės metodai
Dėl didelės fenolinių junginių įvairovės, analizė yra labai sudėtinga [71]. Kita vertus, modernūs skirstymo ir nustatymo analizės metodai tinka polifenoliniams junginiams, pavyzdţiui efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) su masių spektrometrija (MS), ultravioletinės-matomos šviesos (UV/VIS), arba branduolinių magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopija [1].
Grupė selektyvių cheminių reakcijų, popieriaus chromatografija, dujų chromatografija buvo svarbūs metodai kokybinei fenolinių junginių analizei, tačiau tik po to, kai buvo nustatyta jų kilmė.
Plonasluoksnė chromatografija turi savo privalumų (pvz., greita ir pigi). Densitometrija ir vaizdo kameros nustatymo metodas dar labiau padidino metodo universalumą, kaip plačiai naudojamo analizės metodo fenoliniams junginiams nustatyti.
Natūralios kilmės fenolinės rūgštys yra silpnos, dėl fenolinių hidroksilo grupių. Flavonoidai ir taninai taip pat yra šiek tiek rūgštaus pobūdţio. Todėl jie yra jonizuojami šarminėje terpėje, tai lėmė sėkmingą kapiliarinės elektroforezės (KE) pritaikymą įvairių rūšių flavonoidų, taninų ir fenolinių rūgščių analizei [71].
Efektyvioji skysčių chromatografija. Nors skysčių chromatografija perduoda tikslų,
konkretų rezultatą, tačiau tai yra lėta bendrų fenolinių bandinių nustatymo procedūra, reikia brangios įrangos ir specialių įgūdţių. Be to, daugeliu atvejų, šiuo metodu pateikti duomenys (pvz. kiekvieno izomero santykinė koncentracija) nėra reikalingi [97]. Kai kurie iš šių teiginių vis dar galioja, padidinta skiriamoji geba ir automatizavimas lėmė, kad ESC tapo populiariausias analizės metodas augaliniams fenoliniams junginiams [71].
Natūralios kilmės fenoliniai junginiai tirpsta poliniuose tirpikliuose. Tai sudaro galimybes naudoti atvirkštinių fazių ESC (AF-ESC) sorbentus, pakankamas sulaikymas yra pasiektas naudojant
rūgštines sąlygas, siekiant išvengti jonizuotų bandinio formų susidarymo. Oktadecilsilanas (ODS, C18, AF-18) yra pati populiariausia nejudri fazė, tiek bendrai, tiek fenoliniams junginiams. Kitos AF medţiagos (pvz., C8) yra pasirenkamos labai retai. Tačiau, kondensuoti polimeriniai taninai negali būti analizuojami naudojant AF-ESC, dėl per stiprios sorbcijos. Todėl kondensuoti taninai turi būti analizuojami taikant normalių fazių ESC metodą, kuris nėra taip plačiai naudojamas, nes jis turi ţymiai prastesnę skiriamąją gebą lyginant su AF-ESC [71].
Fenolinių junginių AF-ESC analizei naudojami vandeniniai eliuentai su pakeistu pH (poliniais junginiais ar jų mišiniais) ir vandenyje tirpiais organiniais tirpikliais: metanolio (CH3OH), acetonitrilo
(CH3CN) arba tetrahidrofurano (THF). Nors THF turi savo privalumų dėl selektyvumo, tačiau jis nėra
labai daţnai naudojamas, nes pakankamai greitai skyla, ilgas pusiausvyros laikas, didelis toksiškumas ir UV fono absorbcija ţemiau 240 nm. Tačiau kai kurie metodai buvo paskelbti, kuriuose THF buvo pasirinktas kaip vienintelis organinis tirpiklis judriai fazei. 2-propanolis, n-butanolis arba kiti organiniai tirpikliai labai retai naudojami judriai fazei ir, jei naudojami, daugiausia dėl selektyvumo prieţasties. Tačiau, ir maţos koncentracijos organiniai tirpikliai taip pat gali turėti didelį poveikį fenolinių junginių sulaikymui. pH yra svarbus veiksnys, ypač jonizuojamų junginių, tokių kaip fenolinės rūgštys, atskyrimui. Daţniausiai fenoliams junginiams nustatyti AF-ESC metodu naudojamas pH tirpalas yra rūgštys: skruzdţių, acto, trifluoracto ir fosforo, taip pat fosfato buferis. Jais koreguojamas pH, kad būtų pasiekta fenolinių bandinių nejonizuota forma.
Kita teigiama fenolinių junginių savybė yra jų konjugacija C-C dvigubomis jungtimis, kurios veikia kaip chromoforai. Jų dėka fenolinių junginių bandiniams tirti AF-ESC ultravioletinės ir matomos šviesos (UV-VIS) detektorių derinys daţniausiai naudojamas ir kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti [71].
Tipiški flavonoidų UV-VIS spektrai apima dvi absorbcijos juostas. A juosta 310-350 nm diapazonas priklauso flavonams, o flavonoliams 350 ir 385 nm bangos ilgiai. B juosta priklauso 250-290 nm diapazonui, jis tinka visiems ankščiau paminėtiems flavonoidų pogrupiams. Flavanonų ir flavanonolių pagrindinės smailės yra: A juostoje, kuri daţnai yra šiek tiek sumaţinama iki 300-330 nm ir B juostoje 277-295 nm diapazone [6]. Dėl to šie du pogrupiai negali būti analizuojami paprasta UV-VIS analize. Flavanoliai duoda maksimalią absorbciją nespecifiniame bangos ilgių diapazone tarp 270 ir 290 nm, kuriame absorbciją rodo ir daug kitų fenolinių junginių [91]. 280 nm UV bangos ilgis yra tinkamas universaliam visos fenolinių junginių grupės nustatymui: nuo paprasčiausios hidroksibenzoinės rūgšties iki stambių taninų [71].
Pagal fenolinių junginių sugerties maksimumą, elago rūgštis ir p-hidroksibenzoinė rūgštis gali būti nustatoma esant 260 nm bangos ilgiui, galo rūgštis ir katechinai esant 280 nm bangos ilgiui, hidroksicinamono rūgšties dariniai esant 320 nm bangos ilgiui, flavonoliai esant 360 nm bangos ilgiui, antocianidinai esant 530 nm bangos ilgiui [71].
UV detektoriaus aptikimo ribos (apie 0,2 pg/flavonoidų/injekcijos) yra tinkamos įprastam analitiniam darbui su augalų mėginiais ar biologinių skysčių analizei farmakokinetiniams tyrimams. ESC metodas, naudojant UV detektorių neatitinka jautrumo ir specifiškumo reikalavimų analizuojant ţmogaus organizmo skysčius, kai favonoidai gaunami su įprastiniu maistu. Todėl buvo panaudotas flavonolių gebėjimas su metalų jonais sudaryti liuminescencinius chelatus. Aptikimo riba, kai flavonoliai taip redukuojami, sumaţinta iki 3 fg/injekcijos. Daugelyje mokslinių straipsnių aprašomi elektrocheminiai detektoriai, kurie buvo 10-25 kartus jautresni nei UV detektoriai [71]. Flavonoidų analizės ESC metodu salygų apţvalga pateikiama 1 lentelėje.
1.2.6. Fenolinių junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Pastaruoju metu natūralių antioksidantų moksliniai tyrimai vykdomi vis aktyviau. Todėl paskelbta daugybė straipsnių apie natūralius antioksidantus (polifenolius, flavonoidus, vitaminus ir lakiąsias chemines medţiagas). Siekiant nustatyti pasirinktų cheminių junginių antioksidacinį aktyvumą skirtinguose augaluose ir maisto sudedamosiose dalyse, labai svarbu pasirinkti tinkamą tyrimo metodą, nuo to priklausys rezultatų patikimumas.
Antioksidacinis aktyvumas gali būti nustomas instrumentinės analizės pagalba, naudojant, spektrofotometrą, dujų chromatografą, ir ESC, taip pat dujų chromatografo ir masės spektrometro (MS), ESC-MS derinius ir kitus prietaisus.
Sąlyginai išskiriami du pagrindiniai tyrimų tipai, naudojami įvairiems antioksidantų nustatymams [59]:
1. Analizė pagrįsta lipidų peroksidacija: a. Tiobarbitūro rūgšties analizė (TBR); b. Malondialdehido analizė;
c. β-karoteno blukinimo analizė; d. Konjuguoto dieno analizė.
2. Analizė pagrįsta elektronų oksidacijos-redukcijos ar radikalų surišimo aktyvumo nustatymu: a. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) analizė;
b. 2,2`-azinobis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfonrūgšties) (ABTS) analizė; c. Geleţies redukcijos antioksidacinės galios (FRAP) analizė;
d. Dvivalentės geleţies oksidacijos-ksilenolio oranţinio (FOX) analizė; e. Geleţies tiocianato (FTC) analizė;
f. Aldehido/karboksirūgšties (ACA) analizė;
Pastaruoju metu, analizuojant natūralius antioksidantus, DPPH radikalo panaudojimas analizei tapo gana populiarius. Viena iš prieţasčių yra tai, kad šis metodas yra paprastas ir labai jautrus. Ši analizė pagrįsta teorija, kad vandenilio donoras yra antioksidantas. 3 paveikslas parodo mechanizmą, pagal kurį DPPH• priima vandenilį iš antioksidanto. DPPH• yra vienas iš nedaugelio stabilių ir komerciškai priimtinų organinių azoto radikalų. Antioksidacinis efektas yra proporcingas DPPH• išnykimui bandiniuose. Galimi įvairūs DPPH• kiekio įvertinimo metodai antioksidantų nustatymo sistemose: elektronų sukinių rezonanso spektroskopijos (electron spin resonance spectroscopy) (ESR)/augalų milteliuose, NMR/katechinų, ir UV spektrofotometrija/polifenoliams. Dėl savo paprastumo ir tikslumo DPPH• įvertinimas naudojant UV spektrometrą tapo plačiausiai ir daţniausiai naudojamu metodu. DPPH• absorbcijos maksimumas yra esant 517 nm (violetinė spalva). Spalva pasikeičia iš violetinės į geltoną, po to, kai DPPH• absorbuoja vandenilį iš antioksidanto. Ši reakcija yra stechiometrinė atsiţvelgiant į absorbuojamų vandenilio atomų skaičių. Todėl, antioksidacinį poveikį galima lengvai įvertinti sumaţėjus UV absorbcijai esant 517 nm bangos ilgiui. Norint suvienodinti įvairių tyrimų rezultatus, naudojamas Trolokso ekvivalentas (TE). Troloksas yra komercinis, vandenyje tirpus vitaminas E. Bandinio antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas: Trolokso ekvivalentas mikromoliais šimte gramų mėginio (TE/100 g). Taip pat rezultatai gali būti išreiškiami EC50, tai yra antioksidanto kiekis, kurio reikia sumaţinti pradinę DPPH• koncentraciją 50 proc. [59].
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvas radikalas (DPPH•)
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH)
3 pav. Reakcija tarp DPPH• radikalo ir antioksidanto, kai susiformuoja DPPH (Moon & Shibamoto, 2009)
DPPH• nustatymo metodas buvo pristatytas kaip lengvas ir tikslus metodas naudojant vaisių ir darţovių sulčių ekstraktus. Todėl daugybė antioksidantų, esančių augaluose, nustatymų atliekami naudojant DPPH radikalą. Analizės atliktos: vaisiams ir darţovėms, vaistiniams augalams, grūdams ir pupoms, prieskoniams, arbatoms. Unikalios studijos naudojant DPPH radikalą nustatė antioksidacinį aktyvumą dumbliuose ir grybuose. Šiuo metu beveik 90 proc. antioksidacinio aktyvumo tyrimų atliekama naudojant DPPH radikalą kartu su kitais analizės metodais [59].
1 lentelė. Flavonoidų analizės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu sąlygos
Junginiai Bandinys Kolonėlė Tirpiklių sistema/ judri fazė Gradientas Tėkmės greitis Detekcija λ nm Literatūros šaltinis
Flavonoliai Epilobium rūšys Supelcosil C-18 (250×4,6 mm, 5 µm) A: CH3CN, B: H2O + 2,5 proc. CH3COOH. 0–20 min, 11–21 proc. A; 20–25 min, 21–41 proc. A; 25–28 min, 41–100 proc. A. 1,0 ml/min 260 nm; 340 nm [88] Flavonoliai; Oenothein B Epilobium rūšys Luna C-18 (250×4,6 mm, 5 µm) A: H2O + 2,5 proc. CH3COOH, B: CH3CN + 2,5 proc. CH3COOH. 0-30 min 7-20 proc. B, 30-60 min 20-40 proc. B. - 280 nm; 350 nm [53] Favonoliai Epilobium rūšys Novapak C18 (150x3,9 mm, 4µm) A: H2O + 0,05 proc. TFR B: CH3CN + 0,05 proc. TFR 0 min 10 proc. B; 4-12min 12 proc. B; 16 min 18 proc. B; 30 min 25 proc. B. 1,0 ml/min 350 nm [14] Favonoliai Epilobium
rūšys Hypersil ODS (250x4,6 mm, 5µm) A: CH3CN B: H2O + 0,05 proc. TFR Flavonolių glikozidams: 0-6min 11 proc. A; 7 min 13 proc. A; 20 min 100 proc. A. Flavonolių aglikonams: 0 min 15 proc. A; 20 min 15 proc. A; 30 min 100 proc. A. 1,0 ml/min 340 nm [87] Flavanoliai (epikatechinas), Flavanonai, Flavonai, Flavonoliai Įvairūs
augalai Alltech Prevail C-18 (150×4,6 mm) A: H2O + 0,05 proc. CH3COOH (v/v), B: 80 proc. CH3CN + 0.05 proc. CH3COOH + 20 proc. CH3OH. 0-2 min 5 proc. B;
2-48 min 5 proc.- 40 proc. B; 48-57 min 40 proc. B;
57-57,1 min 40 proc. – 5 proc. B; 51,1-65 min 5 proc. B. 0,8 ml/min 280 nm [37] Flavanonai, Flavonai, Flavonoliai Standartai Hypersil BDS C18 (250×4,6mm, 5µm). A: CH3CN B: H2O + 1 proc. C4H8O (THF) + H3PO4 pH 3. 0-8 min 30 proc. A; 8-12 min 100 proc. A; 12-16 min 100 proc. A. 1,2 ml/min 270 nm [98]
1 lentelė (tęsinys). Flavonoidų analizės efektyviosios skysčių chromatografijos metodu sąlygos Flavanonai, Flavonai, Flavonoliai vaisiai, darţovės, gėrimai Phenomenex RP C (250×4,6 mm, 5 µm) A: CH3OH: H2O (30:70 v/v) + 1 proc. CHOOH B: 100 proc. CH3OH 0 min 25 proc. B; 50 min 86 proc. B. 1,0 ml/min 220–450 nm [47] Izoflavonai; Flavanoliai; Fenolinės rūgštys Sojos pupelės Lichrophore 100 RP C18; TSKgel ODS-100Z; XTerraTM RP C8 (250×4,6 mm, 5 µm) A: H2O + 0,1 proc. CH3COOH, B: 100 proc. CH3CN; A: H2O + 10 mM KH2PO4 (pH 2,5), B: 100 proc. CH3OH; A: H2O + 0,5 proc. CH3COOH, B: 100 proc. CH3OH. 20 min 10 proc. B, 30 min 20 proc. B, 40 min 25 proc. B, 50 min 35 proc. B; 0 min 60 proc. B, 15 min 100 proc. B; 0 min 60 proc. B, 40 min 100 proc. B. 1,0 ml/min 259 nm; 270 nm; 280 nm [9] Dihidroflavonoliai, Flavanonai, Flavonai, Flavonoliai Origanum vulgare Hypersil C18 ODS (250x4,6 mm, 5µm) A: H2O + 0,2 proc. TFR B: CH3OH + 0,2 proc. TFR C: CH3CN + 0,2 proc. TFR
0 min 90 proc. A, 6 proc. B, 4 proc. C;
5 min 85 proc. A, 9 proc. B, 6 proc. C;
30 min 71 proc. A, 17.4 proc. B, 11.6 proc. C;
60 min 0 proc. A, 85 proc. B, 15 proc. C. 1,0 ml/min 280 nm [91] Flavanoliai, Flavonai, Flavonoliai Crataegus laevigata, Crataegus monogyna Phenomenex LunaTM C-18, (150×4,6mm, 5 µm) A: H2O + 0,1 proc. TFR, B: CH3CN + 0,1 proc. TFR. 0 min 5 proc.B; 30 min 100 proc. B. 1,0 ml/min 280 nm [49] Flavonai, Flavonoliai Phoenix dactylifera Phenomenex Prodigy ODS (250x2,0 mm, 5 µm) A: H2O + 5 proc. CH2OOH B: CH3OH + 5 proc. CH2OOH 0 min 0 proc. B; 30 min 17,6 proc. B; 45 min 30,7 proc. B; 50 min 87,8 proc. B. 0,2 ml/min 370 nm [36]
1 lentelėje matyti, kad daţniausiai yra naudojamos AF C18 kolonėles, parūgštinto vandens ir organinio tirpiklio mišiniai, gradientinis eliuavimas, tekmės greitis 0,2-1,0 ml/min detekcija atliekama esant 254-290 nm ir 300-370 nm bangos ilgiams.
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – siauralapis gaurometis (Chamerion angustifolium (L.) Holub) ir jo vaistinė augalinė ţaliava (VAŢ). VAŢ buvo renkama tarp 1100 ir 1600 valandos, 2008 metų geguţės - liepos mėnesiais, 2009 metų birţelio – liepos mėnesiais auginamų augalų Kaune, Vytauto Didţiojo universiteto (VDU) Kauno botanikos sodo (KBS) prieskoninių ir medingųjų augalų kolekcijoje ir natūraliai augančių skirtingose (Anykščių, Švenčionių ir Varėnos rajonų) augavietėse. 2010 metais Anykščių rajone surenkami siauralapių gauromečių lapai, fermentuotai arbatai gaminti. VAŢ dţiovinta gerai vėdinamoje patalpoje, vengiant tiesioginių saulės spindulių 20-25°C temperatūroje. Orasausė VAŢ laikoma sausoje patalpoje daugiasluoksniuose popieriniuose maišuose. Augalo augavietė, VAŢ surinkimo data, vegetacijos tarpsnis ir tiriamos augalo dalys nurodoma 2 lentelėje, VAŢ nuotraukos pateikiamos 4 PRIEDE.
Išdţiovinta VAŢ, rankiniu būdu suskirstyta į ţiedus, lapus ir stiebus. Orasausė VAŢ susmulkinta buitiniu smulkintuvu (BRAUN PowerPlus 1300, Vokietija). Dalelių dydis 0,1-0,3 cm. Susmulkinta VAŢ laikoma sausoje, tamsioje vietoje, kambario temperatūroje, polietileno maišeliuose.
2 lentelė. Analizuojama siauralapių gauromečių – Chamerion angustifolium (L.) Holub vaistinė augalinė žaliava (VAŽ): žolė (herba), žiedai (flores), lapai (folium), stiebai (stipes)
Nr. Augavietė Augavietės geografinės koordinatės VAŢ surinkimo data Augalo vegetacijos tarpsnis Ekstrakto indelio ţymuo (tiriama VAŢ) 2008 metai 1. Kaunas, VDU KBS 54º52.279S 23º54.968R 2008-05-21 Vegetacijos pradţia,
intensyvus augimas H1 (herba);
2. 2008-06-16 Butonizacija H2 (herba);
3. 2008-06-20 Masinis ţydėjimas
H3 (herba); Fl3 (flores); Fol3 (folium); St3 (stipes)
4. 2008-07-02 Vaisių (sėklų) branda H4 (herba);
5. 2008-07-09 Vegetacijos pabaiga H5 (herba);
6. Bičionių k. Anykščių raj.
55º31.568S
25º12.038R 2008-06-25 Masinis ţydėjimas H6 (herba); 7. Trakinių k. Anykščių raj. 25º08.358R 55º22.868S 2008-07-03 Masinis ţydėjimas H7 (herba);
8. Anykščiai 55º31.005S
25º07.631R 2008-07-06 Masinis ţydėjimas
H8 (herba); Fl8 (flores); Fol8 (folium); St8 (stipes)
9. Keblonių k. Anykščių raj.
55º30.698S
25º09.792R 2008-07-06 Masinis ţydėjimas H9 (herba); 10. Rubikių k. Anykščių raj. 25º18.062R 55º31.495S 2008-07-06 Masinis ţydėjimas H10 (herba); 11. Panaros k. Varėnos raj. Varėnos raj. (mišinys) iš 2008-**-** Masinis ţydėjimas H11 (herba);
2 lentelė (tęsinys). Analizuojama siauralapių gauromečių – Chamerion angustifolium (L.) Holub vaistinė augalinė žaliava (VAŽ): žolė (herba), žiedai (flores), lapai (folium), stiebai (stipes)
Nr. Augavietė Augavietės geografinės koordinatės VAŢ surinkimo data Augalo vegetacijos tarpsnis Ekstrakto indelio ţymuo (tiriama VAŢ) 2009 metai 12. Kaunas, VDU KBS 54º52.279S 23º54.968R 2009-06-02 Vegetacijos pradţia,
intensyvus augimas H12 (herba);
13. 2009-06-12 Butonizacija H13 (herba);
14. 2009-06-26 Masinis ţydėjimas
H14 (herba); Fl14 (flores); Fol14
(folium); St14 (stipes);
15. 2009-07-09 Vaisių (sėklų) branda H15 (herba);
16. 2009-07-17 Vegetacijos pabaiga H16 (herba);
17. Bičionių k. Anykščių raj.
55º31.257S
25º12.592R 2009-07-08 Masinis ţydėjimas H17 (herba); 18. Trakinių k. Anykščių raj. 25º08.358R 55º22.868S 2009-07-03 Masinis ţydėjimas H18 (herba); 19. Anykščiai 55º31.005S
25º07.631R 2009-07-08 Masinis ţydėjimas H19 (herba); 20. Keblonių k.
Anykščių raj.
55º30.698S
25º09.792R 2009-07-04 Masinis ţydėjimas H20 (herba); 21. Rubikių k. Anykščių raj. 25º18.062R 55º31.495S 2009-07-08 Masinis ţydėjimas H21 (herba); 22. Didţiakaimio k.
Anykščių raj.
55º23.198S
25º05.912R 2009-07-03 Masinis ţydėjimas H22 (herba); 23. Stanislavavo k.
Švenčionių raj.
55º11.175S
26º16.247R 2009-07-17 Masinis ţydėjimas H23 (herba); 24. Jasiūnų k. Švenčionių raj. 26º16.368R 55º11.035S 2009-07-17 Masinis ţydėjimas H24 (herba);
2010 metai
25. Fermentuota lapų arbata
(mišinys) iš
Anykščių raj. 2010-**-** Masinis ţydėjimas H25 (tea)
2.2. Cheminės medţiagos ir tirpikliai
3 lentelė. Cheminių medžiagų ir tirpiklių sąrašas
Pavadinimas Formulė Grynumas Gamykla Šalis
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas C18H12N5O6 95 proc. Sigma-Aldrich Vokietija
Acetonitrilas CH3CN 99,8 proc. Sigma-Aldrich Vokietija
Citrinų rūgštis, monohidratas C6H8O7 99,5 proc. Lachema Čekija
Folin-Ciocalteau fenolinis reagentas C6H6O 2,0 N Sigma, St. Louis JAV
Hiperozidas C21H20O12 97 proc. Sigma-Aldrich Vokietija
Kemferolis C15H10O6 96 proc. Fluka, Sigma-Aldrich Šveicarija
Kvercetino dihidratas C15H10O7 98 proc. Sigma-Aldrich Vokietija
Kvercitrinas C21H20O11 78 proc. Sigma-Aldrich Vokietija
Metanolis CH3OH 99,5 proc. Bárta a Cihlář Čekija
Miricetinas C15H10O8 95 proc. RotH Vokietija
Natrio hidroksidas NaOH 98,5 proc. Lachema Čekija
Natrio karbonatas Na2CO3 99,5 proc. Merck, Darmstadt Vokietija
Trifluoracto rūgštis C2HF3O2 98 proc. Merck-Schuchardt Vokietija
