Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparatų tyrimui

(1)

DARBAS ATLIKTAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparatų tyrimui“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

EGLĖ SKVARNAVIČIŪTĖ

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

EGLĖ SKVARNAVIČIŪTĖ

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

VALDAS JAKŠTAS

(2)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE) Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020 – 05 - 21 SONATA TRUMBECKAITĖ

(aprobacijos data) (katedros vedėjo (-os) ) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

EGLĖ SKVARNAVIČIŪTĖ

Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparatų tyrimui

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. V. Jakštas

KAUNAS, 2020

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas:

Prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data:

Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparatų tyrimui

Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas:

Prof. V. Jakštas Data:

Recenzentas:

Parašas Data:

Darbą atliko:

Magistrantė

Eglė Skvarnavičiūtė Data:

KAUNAS, 2020

(5)

TURINYS

SANTRAUKA ... 6

SUMMARY ... 7

SANTRUPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Sirupo formos fitopreparatų ypatybės ... 11

1.2 Kietafazės ekstrakcijos metodologiniai ypatumai ... 13

1.3 Sorbentų įvairovė ir jų taikymas ... 16

1.3.1 Kolonėlių su oktadecilsililsilikagelio sorbentu taikymas ... 17

1.3.2 Kolonėlių su cianoalkylsilikagelio sorbentu taikymas ... 19

1.3.3 Kolonėlių su fenilsilikagelio sorbentu taikymas ... 20

1.3.4 Kolonėlių su aminoalkilsilikagelio sorbentu taikymas ... 21

1.4 Naujovės kietafazės ekstrakcijos metodikoje ir jos taikyme ... 22

1.5 Fenoliniai junginiai ir jų ypatumai ... 25

TYRIMO METODIKA ... 27

2.1 Tyrimo objektas ... 27

2.2 Reagentai ... 27

2.3 Aparatūra ... 28

2.4 Kietafazės ekstrakcijos taikymas fenolinių junginių atskyrimui ... 28

2.5 Bendro fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu nustatymas ... 29

2.6 Statistinė analizė ... 30

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1 Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparato A tyrimui ... 31

3.2 Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparato B tyrimui ... 32

3.3 Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparato C tyrimui ... 33

3.4 Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparato D tyrimui ... 34

3.5 Kolonėlių daugkartinis naudojimas kietafazei ekstrakcijai ... 35

3.6 Sirupo formos fitopreparatų frakcionavimas skirtingų kocentracijų etanoliu ... 39

3.7 Fenolinių junginių atgavimo vertinimas ... 41

IŠVADOS ... 43

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44

(6)

SANTRAUKA

E. Skvarnavičiūtės magistro darbas „Kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparatų tyrimui”, mokslinis vadovas Prof. V. Jakštas, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – KAUNAS, 2020.

Raktiniai žodžiai: kietafazė ekstrakcija, sirupo formos fitopreparatai, UV spektrofotometrija, fenolininiai junginiai.

Tyrimo objektas: Keturiuose skirtinguose sirupuose (Pertusin, Pertusin Forte, Urinal, Prospan) esanti fenolinių junginių koncentracija.

Darbo tikslas: nustatyti ir įvertinti kietafazės ekstrakcijos analitinius veiksnius, reikšmingus sirupo formos fitopreparatų sudėtyje esančių fenolinių junginių nustatymui.

Darbo uždavinai: 1. Palyginti kietafazės ekstrakcijos analitinių veiksnių: ekstrakcijos tirpiklio, kietos fazės sorbento ir eliuento kompozicijos, poveikį kai kurių sirupo formos fitopreparatų mėginiuose esančių fenolinių junginių kiekybės rodikliams. 2. Ištirti pakartotinio naudojimo kietafazės ekstrakcijos kolonėlių naudojimo įtaką atskiriamų fenolinių junginių kiekybės rodikliams. 3. Ištirti kietafazės ekstrakcijos metodu gautų sirupo formos fitopreparatų tirpalų eliucinių frakcijų kiekybės rodiklius.

Tyrimo metodika: Sirupo formos fitopreparatai ekstrahuojami naudojant kietafazės ekstrakcijos metodą. Naudojamos keturios kolonėlės su skirtingais sorbentais (DSC-18LT, DSC-PH, DSC-CN, DSC-NH2). Sorbentai kondicionuojami išgrynintu vandeniu ir 96% etanoliniu tirpikliu, cukrinė dalis valoma išgrynintu vandeniu, tuomet sirupų mėginiai eliuojami pasirinktos koncentracijos etanoliu. Tiriama bendra fenolinių junginių koncentracija išreikšta galo rūgšties ekvivalentu naudojant UV spektrofotometriją.

Rezultatai ir išvados: Tinkamiausia kolonėlė eliuuoti fenolinius junginius iš sirupo formos fitopreparatu – DSC-PH (Pertusinas 1,476 mg/ml; Pertusinas Forte 2,436 mg/ml; Urinal 1,033 mg/ml;

Prospan 0,457 mg/ml). Nustatyta tinkamiausia eliuento koncentracija daugiau fenolinių junginių turintiems sirupams (Pertusin ir Pertusin Forte) - 96% etanolis, mažiau fenolių turintiems sirupams (Urinal ir Prospan) - 60% etanolis. Frakcionuojant skirtingų etanolio koncentracijų frakcijomis identifikuota, kad po 60% etanolio frakcijos kitos eliucinės frakcijos eliuuotos su didesnės koncentracijos etanoliniais tirpikliais fenolinių junginių nebeatskyrė. Nustatyta, kad eliuento koncentracija turi būti parenkama individualiai pasirinktai tyrimo metodikai. Taip pat nustatyta, kad daugkartinis kolonėlių naudojimas neturi didelės įtakos išskiriamų fenolių koncentracijos nustatymui.

Ištirta, kad pasirinkta kietafazės ekstrakcijos metodika yra tinkama, nes visų sirupo formos fitopreparatų atgavimo laipsnis didesnis nei 70%.

(7)

SUMMARY

E. Skvarnaviciutes master’s thesis „Application of solid phase extraction for the study of syrup form phytopreparations“, science manager Prof. V. Jakštas; Lithuanian University of Health Science, Medical Academy, Faculty of Farmacy, Department of Pharmacognosy – Kaunas, 2020

Keywords: solid phase extraction, syrup-shaped phytopreparations, UV spectrophotometry, phenols.

The object: The total amount of phenols in four syrups (Pertusin, Pertusin Forte, Urinal, Prospan).

The aim: to determine and evaluate analytical factors of solid phase extraction significant for the determination of phenolic compounds in the composition of syrup phytopreparations.

The tasks:

1. To compare the effect of analytical factors of solid phase extraction: extraction solvent, solid phase sorbent and eluent composition, on the content of phenolic compounds in samples of some phytopreparations in syrup form.

2. To investigate the influence of the use of reusable solid phase extraction cartridges on the amount of released phenolic compounds.

3. To investigate the quantitative parameters of elution fractions of solutions of syrup-shaped phytopreparations obtained by the method of solid phase extraction.

Methodology: Syrup-shaped phytopreparations are extracted using a solid-phase extraction method. Four cartridges with different sorbents (DSC-18LT, DSC-PH, DSC-CN, DSC-NH2) are used.

The sorbents are conditioned with purified water and 96% ethanol, the sugar part is purified with purified water and the syrup samples are eluted with the selected concentration of ethanol. The total amount of phenolic compounds expressed in gallic acid equivalent was determined using UV spectrophotometry.

Results of the study: The most suitable cartridge for isolating phenolic compounds from a syrup-shaped phytopreparation is DSC-PH (Pertusin 1.476 mg / ml; Pertusin Forte 2.436 mg / ml;

Urinal 1.033 mg / ml; Prospan 0.457 mg / ml). The most suitable eluent concentration was found to be 96% ethanol for more phenolic syrups (Pertusin and Pertusin Forte) and 60% ethanol for less phenolic syrups (Urinal and Prospan). Fractionation with fractions of different ethanol concentrations revealed that no more phenols were released after 60% of the ethanol fraction. It was determined that the eluent concentration should be selected individually for the selected test methodology. It was also revealed that repeated use of the columns did not significantly affect the amount of phenols released. The chosen KFE methodology was found to be appropriate, with a recovery rate of more than 70% for all syrup-shaped phytopreparations.

(8)

SANTRUPOS

DSC-18LT – kietafazės ekstrakcijos kolonėlė su oktadecilsililsilikagelio sorbentu;

DSC-CN – kietafazės ekstrakcijos kolonėlė su cianoalkylsilikagelio sorbentu;

DSC-PH – kietafazės ekstrakcijos kolonėlė su fenilsilikagelio sorbentu;

DSC-NH2 – kietafazės ekstrakcijos kolonėlė su aminoalkylsilikagelio sorbentu;

ESC – efektyvioji skysčių chromotografija;

IE-SPE – jonų mainų kietafazė ekstrakcija;

KFE - kietafazė ekstrakcija;

MBĮP – molekulinių būdu įspausti polimerai;

NP-SPE – normalios fazės kietafazė ekstrakcija;

RP- SPE – atvirkštinės fazės kietafazė ekstrakcija;

SC-MS – skysčių chromotografija su masių spektrofotometrija;

SSE – skystis-skystis ekstrakcija;

V/V – tirpalo tūrio koncentracija.

(9)

ĮVADAS

Kietafazės ekstrakcijos metodika naudojama įvairių junginių frakciniam atskyrimui ir gryninimui analitiniais ir preparatyviniais tikslais. Metodika taikoma bandinių ruošimui tiriant tokius daugiakomponenčius analitinius objektus kaip augalinės ar biologinės kilmės mėginiai, nustatant tiek bioaktyvius junginius, tiek įvairias priemaišas. Taipogi metodika gali būti pritaikoma tirti tokias vaistų formas, kurių terpė ar pagalbinės medžiagos gali trukdyti analitiniam įvertinimui.

Sirupai paprastai yra daugiakomponenčiai mišiniai turintys atsikosėjimą gerinančių ar kitų vaistinių medžiagų, kurių sudėtyje yra cukraus, sorbitolio, dažiklių, kvapiųjų medžiagų ar konservantų.

Dėl klampios terpės ir didelių saldiklių koncentracijų, analitinis tokios formos vaistų tyrimas yra komplikuotas. Norint įvertinti aktyviųjų junginių tapatumą, kiekybę ar stabilumą kompozicijoje reikia iš bandinio pašalinti kuo daugiau trukdančių pagalbinių medžiagų, kad aktyvūs komponentai ir jų skilimo produktai būtų tinkamai skiriami chromatografinėje sistemoje. Kuomet naudojami spektroskopiniai metodai be chromatografinio atskyrimo norint pašalinti trukdžius iš mėginio matricos gali būti naudojama ir tokia technika kaip skystis-skystis ekstrakcija, tačiau kietafazė ekstrakcija yra greitesnė alternatyva kuri taip pat gali būti naudojama valyti mėginio matricą, jei žinoma, kad pagalbinės medžiagos trikdo aptikti reikiamus junginius [9], [11], [24].

Sirupo vaistinės formos augalinių vaistinių preparatų preanalitinis mėginių ruošimas taikant kietafazę ekstrakcija galėtų būti panaudojamas kaip tikslingas analitinis sprendimas. Kadangi trūksta duomenų apie sirupų mėginių preanalitinio ruošimo ypatumus taikant kietafazę ekstrakciją, eksperimentinio magistrinio darbo apimtyje bus tyrinėjami sirupo formos fitopreparatų mėginiai ir juose esantys bioaktyvūs junginiai (fenoliniai junginiai), siekiant juos atskirti nuo klampios saldikliais praturtintos terpės kietafazės ekstrakcijos metodu.

(10)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: nustatyti ir įvertinti kietafazės ekstrakcijos analitinius veiksnius, reikšmingus sirupo formos fitopreparatų sudėtyje esančių fenolinių junginių nustatymui.

Darbo uždaviniai:

1. Palyginti kietafazės ekstrakcijos analitinių veiksnių: ekstrakcijos tirpiklio, kietos fazės sorbento ir eliuento kompozicijos, poveikį kai kurių sirupo formos fitopreparatų mėginiuose esančių fenolinių junginių kiekybės rodikliams.

2. Ištirti pakartotinio naudojimo kietafazės ekstrakcijos kolonėlių naudojimo įtaką atskiriamų fenolinių junginių kiekybės rodikliams.

3. Ištirti kietafazės ekstrakcijos metodu gautų sirupo formos fitopreparatų tirpalų eliucinių frakcijų kiekybės rodiklius.

(11)

LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Sirupo formos fitopreparatų ypatybės

Pastaraisiais metais auga susidomėjimas augalinių vaistų ir fitofarmacinių produktų vartojimu sveikatinimui. Išaugusio susidomėjimo priežastys yra kelios: baimė dėl galimo piktnaudžiavimo sintetiniais vaistais ar netinkamo jų vartojimo, šalutinių poveikių baimė, taip pat ne visiems gyventojams yra prieinamas gydymasis sintetiniais vaistais [14]. Sirupai vis dažniau naudojami, nes pasižymi įvairiomis naudingomis savybėmis ir gali būti išgaunami iš daugelio vaistinių augalų bei vaisių. Daugybė tyrimų patvirtino sirupo formos fitopreparatų veiksmingą poveikį įvairioms ligoms gydyti ar simptomams mažinti. Dėka tinkamų farmacinių savybių ir kai kurių terapinių savybių (geri detoksikatoriai, bendrai tonizuojantys ir imunostimuliuojantys) sirupo formos preparatai tampa vis populiaresni šiuolaikiniame pasaulyje. Augalų ir vaisių sirupai praturtinti vitaminais ir mineralais yra naturalūs produktai naudojami terapiniais ir prevenciniais tikslais, tačiau jie neturėtų būti naudojami kaip kasdienės mitybos šaltiniai. Sirupai pasižymi gydomosiomis savybėmis dėl bioaktyvių medžiagų (vitaminų, flavonoidų, taninų, gleivių, eterinių aliejų), kurios kaupiamos augaluose iš kurių gaminami sirupai [9]. Šiame darbe aprašomas kietafazės ekstrakcijos taikymas sirupo formos fitopreparatų mėginių tyrimui, kaip tiriamąjį objektą pasirinkus keturių skirtingos sudėties ar stiprumo sirupų mėginius, kurių sudėtyje yra fenolinių junginių ir kitų bioaktyvių junginių:

• Pertusinas - 1 ml sirupo yra 162,5 mg Thymus vulgaris L. ir/ar Thymus zygis L., herba (čiobrelių žolės) skystojo ekstrakto (1:1). Ekstrahentas: 30 % (V/V) etanolis. 1 ml sirupo yra 1025 mg sacharozės ir 62,5 mg 80 % etanolio. Tradicinis augalinis vaistinis preparatas, vartojamas peršalus, kaip atsikosėjimą lengvinanti priemonė. Vaistinis čiobrelis (Thymus vulgaris L.) yra Notrelinių (Lamiaceae) šeimos atstovas. Augalas yra puskrūmis kilęs iš Europos vakarinio Viduržemio jūros regiono, jis naudojamas jau labai ilgą laiko tarpą, todėl turi ilgą naudojimo istoriją. Vaistinis čiobrelis pasižymi antiseptiniu, antispazminiu, atsikosėjimą gerinančiu, antimikrobiniu, priešgrybeliniu, sedatyviniu, antivirusiniu poveikiu.

Farmakologinis aktyvumas siejamas su sudėtyje esančiu eteriniu aliejumi. Eterinis aliejus yra monoterpenų mišinys ir žaliavoje jo randama 1,0 – 2,5%. Pagrindiniai jo komponentai – natūralus terpenoidas timolis (25-50%) ir jo fenolio izomeras karvakrolis (3-10%) [3], [10], [35].

• Pertusinas Forte - 1 ml sirupo yra 307,5 mg Thymus vulgaris L. ir/ar Thymus zygis L., herba (čiobrelių žolės) skystojo ekstrakto (1:1). Ekstrahentas: 30 % (V/V) etanolis. 1 ml sirupo yra 919 mg sacharozės. Tradicinis augalinis vaistinis preparatas, vartojamas peršalus, kaip atsikosėjimą lengvinanti priemonė. Vaistinio čiobrelio veikimas yra kompleksinis – skatina

(12)

atsikosėjimą ir slopina spazmus. Taip pat pasižymi antiseptiniu, raminančiu, antigrybeliniu, antihelmintiniu, antivirusiniu, vidurių pūtimą mažinančiu veikimu [3], [36].

• Urinal – Stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon) sulčių milteliai. Mažiausiai 5 mg proantocianidinų 5 ml sirupo. Sudedamosios dalys: invertuoto cukraus sirupas, išgrynintas vanduo, džiovintų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon) sulčių milteliai, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga - citrinų rūgštis. Stambiauogės spanguolės (Vaccinium macrocarpon L.) priskiriamos erikinių šeimai (Ericaceae), šilauogių genčiai (Vaccinium), magnolijūnų skyriui (Magnoliophyta). Spanguolėse yra daug biologiškai aktyvių medžiagų.

Stambiauogė spanguolė kaupia kelių grupių fenolinius junginius: fenolines rūgštis, pvz., benzoinę rūgštį, elago rūgštį ir flavonoidus (flavonolius, flavan-3-olius (katechinus), antocianus, proantocianinus). Be polifenolinių junginių spanguolių produktuose nustatytos ir kitos organinės rūgštys, angliavandeniai, cukrai, vitaminai, pektinai, makro- ir mikroelementai.

Spanguolių kaupiami fenoliniai junginiai užkerta kelią infekcinėms ligoms, šapimo takų infekcijoms, skrandžio opų, dantų ėduonies susidarymui, vėžio išsivystymui. Spanguolės taip pat pasižymi antibakterinėmis, antimutageninėmis, antikancerogeninėmis, antioksidantinėmis savybėmis [6], [18], [22].

• Prospan - 1 ml sirupo yra 7 mg Hederae helicis L., folium (gebenių lapų) sausojo ekstrakto (5- 7,5:1). Ekstrahuojanti medžiaga: 30 % etanolis (m/m). 1 ml sirupo yra 550 mg skystojo sorbitolio (galinčio kristalizuotis) – atitinka 385 mg sorbitolio (E420). Prospan vartojamas ūminio bronchito sukelto kosulio lengvinimui, atsikosėjimo gerinimui. Gebenė lipikė (Hedera helix L.) - augalas priklauso aralijinių (Araliaceae) šeimai, gebenių (Hedera) genčiai.

Biologiškai aktyvūs junginiai, kurie siejami su farmakologiniu poveikiu gebenėse yra triterpeniniai saponinai, kurie sudaro apie 2,5-6% visų randamų medžiagų. Svarbiausi yra hederageninai: hederakosidas C (1,7-4,8%), hederakosidas D (0,4-0,8%), hederakosidas B (0,1- 0,2%) ir monodesmosidas α-hederinas (0,1-0,3%). Organizme dauguma iš hederakosidu yra verčiami į α - hederiną arba β – hederiną. Taip pat randama fenolinių rūgščių (galo rūgštis), flavonoidų (rutino, kvercetino), sterolių, kumarinų, lakiųjų aliejų, antocianų, steroidų, vitaminų, aminorūgščių, kofeino rūgšties darinių (chlorogeno rūgštis, rozmarino rūgštis), β- lektinų ir poliacetilenų. Gebenių lipikių farmakologinis poveikis literatūros šaltiniuose dažniausiai aprašomas, kaip atsikosėjimą lengvinantis, kai pasireiškia drėgnas kosulys. Taip pat gebenės lipikės gali būti vartojamos ir kitų kvėpavimo takų simptomams ar lėtinio bronchito atvejams gydyti [19], [28], [37].

(13)

Farmacinių produktų sudėtis yra nustatoma įvairiais metodais, tačiau nors farmacinės analizės metodai tampa efektyvesni, paprasti spektrofotometrijos metodai dažnai nepatenkina lūkeščių atliekant daugiakomponentinių mišinių analizę, nes jie pasižymi maža skiriamąja geba. Kita vertus išvestinė spektrofotometrija yra tinkama tiriant sudėtinius mišinius, nes išskiria didesnę analitinę informaciją. Taip pat šis metodas suteikia geresnį spektro vaizdą kuriame matomas skiriamųjų gebų atititikimas. [30]

Sirupai yra vandeniniai tirpalai, todėl gali būti tiesiogiai skiedžiami su vandeniu arba judančiąja faze. Atliekant skiedimą gali būti pridedama rūgšties, bazės arba organinio modifikatoriaus, siekiant pagerinti mėginio stabilumą ir išvengti nusodinimo. Pasirinktas skiediklis turi derėti su mėginiu ir vėliau naudojamu analizės metodu. Reikia ilgo ir stipraus maišymo, kad sirupas susimaišytų su skiedikliu ir gautųsi vientisas tirpalas, todėl dažnai naudojami tokie maišymo metodai, kaip mechaninis maišymas, mėginio veikimas ultragarsu [24].

Fenolinių junginių standartizavimas sirupo formos fitopreparatuose yra didelė problema, nes kiekybinės analizės procedūros Europos farmakopėjoje turi trūkumų [17]. Kietafazė ekstrakcija (KFE) yra taikoma sukoncentruoti skirtingų rūšių mėginius (biologinius skysčius, užterštą vandenį, maistą ir t.t), tačiau šis metodas taip pat yra labai naudingas šalinant junginius kurie trukdo sudėtingų matricų tyrimui. Sirupai yra daugiakomponenčiai, dažniausiai turintys platų pagalbinių medžiagų spektrą.

Išankstinis kompozicijos apdorojimas KFE metodu leidžia gauti mėginius santykinai be komponentų kurie trukdo dominančios analitės ekstrakcijai. Tokiu mėginius galima lengviau analizuoti ESC ar UV spektrofotometrijos metodais. Atsižvelgiant į tokius KFE pranašumus kaip: beveik 100% vieno žingsnio analitės atstatymas, nedideli panaudojamo tirpiklio kiekiai ir didelė sorbentų įvairovė, šis metodas gali būti pritaikytas selektyviai ekstrahuoti junginius tokius kaip, sirupo formos fitopreparatai [12].

1.2 Kietafazės ekstrakcijos metodologiniai ypatumai

Kietafazė ekstrakcija yra vis dažniau naudojama analizės laboratorijose, siekiant pašalinti kai kuriuos skystis-skystis ekstrakcijos trūkumus. KFE tiriamosios medžiagos pasiskirsto tarp kietosios ir skystosios fazės (kartais vadinamos ekstrakcija iš skysčio-kietos), todėl jos sulaikymo mechanizmai yra analogiški chromatografijai. Mėginiai yra veikiami adsorbento faze, kad galėtų sukoncentruoti dominančią analitę arba pašalinti matricos trukdžius. KFE galima atlikti atvirkštinės fazės (RP-SPE), normaliosios fazės (NP-SPE) arba jonų mainų (IE-SPE) režimu (1 pav). Kiekviena KFE procedūra gali

(14)

būti vykdoma skirtingai. Ekstrakcijos metu gali būti naudojamas kolonėles, pipetės antgaliai, diskai ir mikroekstrakcija švirkšte [25]. Kietafazė ekstrakcija, skirta išankstiniam mėginių paruošimui, pastaraisiais metais sulaukė dėmesio dėl savo paprastumo ir aktyvaus dalyvavimo atskyrimo procesuose. Galimi įvairių tipų KFE sorbentai, pavyzdžiui, molekuliniu būdu įspausta polimerizacija, yra vienas iš geriausių ir perspektyviausių būdų, kaip sintetinti didelio selektyvumo sorbentus [21].

Nepaisant šiais laikais pastebimos didžiulės pažangos analitinės chemijos metodų taikyme, mėginių paruošimo etapas tebėra būtinybė ir yra didelis išūkis visose analizinėse procedūrose, nesvarbu ar procedūra skirta kiekybinei ar kokybinei analizei. Mėginio paruošimo etapo tikslas yra sumažinti matricos trukdžius, perkelti analitę į fazę, kuri galėtų būti įvesta į analizės procedūrą arba kartais perversti analitę į kitą formą, kurią būtų galima lengvai analizuoti [23].

Kietafazė ekstrakcija yra plačiai naudojamas ekstrakcijos metodas, kuris naudojamas išvalymui, tirpiklių keitimui, koncentravimui ir daugėlio mėginių organinių junginių frakcionavimui.

Ši procedūra labai naudinga baltymų ir cukraus mėginių šalinimui. Tačiau KFE procedūros yra vis dar prastai išvystytos, mažai atkreipiamas dėmesys į fizikos procesus vykstančius KFE metu ir jos apibūdinamos, kaip empiriniai, daug laiko ir darbo reikalaujantys bandymai ir jų klaidų taisymai, kurie neturi sistemos.

KFE yra dažniausiai naudojama aplinkos teršalų, klinikinių, biologinių, maisto ir gėrimų mėginių valymui, ekstrahavimui, klasifikavimui ir išankstiniam koncentravimui. KFE taip pat naudinga išskirti mikro teršalus iš aplinkos mėginių, valyti baltymų ir cukraus turinčius mėginius, dėl savo paprastumo ir riboto organinių tirpiklių naudojimo. Kiti kietafazės ekstrakcijos naudojimai yra:

pigmentų koncentravimas, tirpiklių keitimas. Dažniausiai KFE procedūrą sudaro: tirpalo užnešimas ant kietos fazės (įprastai kolonėlės kurioje yra sorbentas), gebėjimas išlaikyti reikiamą analitę, išplauti nepageidaujamus komponentus ir eliuuoti norimą analitę kitu tirpikliu į surinkimo mėgintuvėlį [4].

KFE metodiką galima susikirstyti į keturis etapus:

1. Kolonėlės paruošimas: adsorbento fazė kondicionuojama su tirpikliu ar tirpiklio mišiniu, kuris yra panašaus poliškumo į mėginio tirpalą. Rekomenduojama 2-4 kartus praleisti tirpiklį pro kolonėlę norint užtikrinti patikimą kondicionavimą. Tokia procedūra visiškai sumažina trukdžius galimus dėl paties adsorbeto ir sumažina jo poveikį laboratorinėms sąlygoms. Taip pat padidina efektyvumą atskiriant adsorbentą, tačiau tai nebėra taip svarbu naujos kartos kolonėlėms.

2. Mėginio užnešimas;

3. Kolonėlės plovimas: naudojamas nepageidaujamų medžiagų pašalinimui. Išplovus nereikalingus junginius analitės sulaikomos ant sorbento;

(15)

4. Mėginio eliuavimas: mėginys eliuojamas pasirinktu tirpikliu, kuris pasižymi savybėmis reikalingomis atskirti analitę nuo sorbento. Mėginys surenkamas į surinkimo mėgintuvėlį [7].

Nustatyta, kad kietafazė ekstrakcija turi pranašumų prieš kitus metodus, tokius kaip skystis- skystis ekstrakcija. Vienas iš pagrindinių kietafazės ekstrakcijos pranašumų yra tai, kad adsorbuojant analites kolonėlėse, kasetėse ar diskuose yra užkertamas kelias skilimui ir tokiu būdu analitė išlieka be jokių koncentracijos pakitimų. Be to, KFE kolonėlių, kasečių transportavimas yra patogesnis nei didelės stiklo taros pervežimas. Kai kurie mokslininkai teigė, kad KFE yra greitesnė ir reikalauja mažiau darbo jėgos nei skystis-skystis ekstrakcija (SSE). Taip pat KFE reikalingi mažesni reagentų kiekiai nei SSE, sukuriantys mažiau toksiškų atliekų ir geresnį analitės koncentravimą (KFE pagalba galima 500 kartų didesnė kai kurių mėginių koncentracija). Kitas svarbus KFE pranašumas, lyginant su tradicine SSE, yra tas, kad ji gali būti naudojama įvairių organinių analičių išskyrimui (iš ne polinės arba labai polinės analitės) iš daugybės mėginių. KFE gali išskirti didelę įvairovę organinių junginių iš biologinių, aplinkos ir maisto mėginių tokių kaip: vaistai, asmeninės priežiūros produktai, ksenoestrogenai ir kiti endokrininę sistemą ardantys junginiai, steroidai, metil-tret-butilo eteris ir giminingi junginiai, sulfofenilkarboksilatai, aktyviosios paviršiaus medžiagos ir jų metabolitai, benzino priedai, brominuoti antipirenai, perfluoroktananinė rūgštis ir perfluoroktanansulfatas, pramoniniai priedai, pesticidai (įskaitant fungicidus) ir jų skilimo produktai bei kitos cheminės medžiagos, tokios kaip kofeinas ar cholesterolis, policikliniai aromatiniai angliavandeniliai (PAH) ir jų nitro dariniai [34], [5], [25].

Tačiau KFE taip pat turi trūkumų kurių neturi toks metodas kaip skystis- skystis ekstrakcija.

KFE metodas užima nemažai laiko ir yra sudėtingas, dažnai reikalauja kelių žingsnių prieš gaunant koncentruotą ekstraktą tinkamą instrumentinei analizei. KFE procedūros automatizavimas sumažina paruošimo etapų skaičių ir leidžia kurti greitesnius metodus vis didinant mėginio pralaidumą, tačiau KFE procedūros automatizavimas netinka visų rūšių mėginiams, o kasečių keitimas ar daugkartinis kondicionavimas ne visada yra lengvas. Be to, automatizuotų KFE metodikų dideliems mėginių kiekiams vis dar labai trūksta. Taip pat KFE nesudaro emulsijų kurias gali sudaryti SSE [5], [25].

(16)

1 pav. Kietafazės ekstrakcijos adsorbentų pasirinkimo schema (sudaryta pagal Nickerson B, Colón I. Liquid–Liquid and Solid-Phase Extraction Techniques. Sample Prep Pharm Dos Forms. 2011)

1.3 Sorbentų įvairovė ir jų taikymas

Šiais laikais prekyboje galima rasti didelį pasirinkimą KFE naudojamų medžiagų ir formų kurios apima platų analičių spektrą ir gali būti pritaikytos skirtingiems tikslams. Kietafazės ekstrakcijos sorbentų kūrimas tapo aktualus įvairių sričių tokių kaip nanotechnologija, polimerų sintezė, medžiagų mokslas ir analizinė chemija, tyrimų metodų tobulinimui. Šių sričių moksliniais tyrimais paprastai siekiama sukurti naujas medžiagas, pasižyminčias padidintu selektyvumu, geresne sorbcine/adsorbcine geba, padidintu šiluminiu, cheminiu ar mechaniniu stabilumu ir ilgesniu galiojimo laiku [4].

Kietafazė ekstrakcija dažniausiai atliekama naudojant silicio dioksido arba polimero pagrindu Analitės savybės:

pKa tirpumas, hidrofobiškumas

Vandeninė/Polinė Mėginio matrica

C8 C18 Fenil- Polimerin

Vandeninė ar organinė Mėginio matrica

Silicio Amino CN

Magnio silikatas

Organinė/Nepolinė Mėginio matrica

Jonų mainų Amino modiiiktuota

(17)

pagamintus sorbentus. Šie sorbentai dažniausiai naudojami nepolinėms ar vidutinio poliškumo analitėms. Silikacijos pagrindu sudaryti sorbentai yra sudaryti su tokiomis grupėmis kaip C1, C2, C8, C18, CH, PH arba CN. Populiariausių silicio dioksido sorbentų trūkumas yra likusi silanolo grupė. Kai vandeninis organinis mišinys liečiasi su nejudančia faze, organinių tirpiklių molekulės adsorbuojamos ant sujungtų funkcinių grupių, dėl hidrofobinės sąveikos, o vanduo gali adsorbuotis likusiuose silanoliuose, dėl stipraus vandenilio jungimosi su silanolio grupe. Be to, likusių silanolių buvimas gali turėti neigiamos įtakos polinių analitų, ypač bazinių junginių ar biopolimerų, atskyrimui. Dėl to į silicio dioksido sorbento paviršių pridedama tokios polinės funkcinės grupės kaip ciano, amino, diolio ir tokiu būdu gaunami normalios fazės sorbentai, kurie hidrofilinės sąveikos metu iš polinės terpės išskiria polinę analitę [7].

1.3.1 Kolonėlių su oktadecilsililsilikagelio sorbentu taikymas

Kolonėlės su oktadecilsililsilikagelio sorbentu skyrimo mechanizmas yra atvirkštinė fazė.

Dažniausiai ji naudojama vandeniniams tirpalams (biologiniams skysčiams, vandeniui). Kolonėlės sorbentas yra monomeriškai surištas oktadecilas (11% C). Ši kolonėlė pasižymi padidintu vidutinio poliškumo hidrofobinių molekulių sulaikymu ir yra naudojama labai didelėms hidrofobinėms molekulėms eliuuoti su silpnesniais organiniais tirpikliais ir mažesniais jų kiekiais nei kitos rūšies kolonėlės. Bioanalizės metu ši kolonėlė gali būti naudojama atskirti vaistų metabolitus [29].

Literatūroje yra aprašomas tyrimas (Kumari et al., 2018) atliktas naudojant kietafazę ekstrakciją su C18 kolonėle. Tiriamas jogurtas, kuris kaip ir sirupas yra daugiakomponentis mišinys.

Tyrime aprašomas aspartamo ir neotamo stabilumas, jis stebimas jogurte jo gamybos, fermentacijos ir laikymo metu. Kietafazės ekstrakcijos metodas pasirinktas norint pagerinti aspartamo ir neotamo atskyrimą iš sudėtinio mišinio – jogurto. Kietafazė ekstrakcija buvo atlikta kaip preanalitinis 2 pav. Monomeriškai surištas oktadecilas (11% C)

(18)

gryninimas naudojant C18 kolonėlę. Aspartamo ekstrakcijos metu kolonėlė buvo kondicionuojama su 3 ml metanolio ir 20 ml išgryninto vandens, nes kvapiosios medžiagos ir riebalai negalėjo būti atskirti naudojant Carrez tirpalus (ištirpinama 3,6 g kalio ferociadino 100 ml vandens arba 7,2 g cinko sulfato 100 ml vandens) pagrindinės ekstrakcijos metu. Po to buvo užnešami 2 ml filtrato (po Carrez ekstrakcijos) į jau kondicionuotą kolonėlę, kuri buvo išplauta 10 ml judriosios fazės A (0,02 M fosfato buferio: acetonitrilas (97:3), pH 5) ir 10 ml judriosios fazės B (0,02 M fosfato buferio: acetonitrilas (80:20), pH 3,5). Ekstrahuojant neotamą kolonėlė taip pat buvo kondicionuojama 3 ml metanolio ir 20 ml išgryninto vandens ir užnešama 2 ml filtrato. Mėginio tekėjimo pro kolonėlę greitis buvo mažesnis nei 1 ml/min. Tuomet buvo atliekamas išvalymas su 10 ml ESC vandens, kuris leido panaikinti priemaišas. Kolonėlė su adsorbuotu neotamu buvo išplaunama 3 ml metanolio. Vėliau tirpalai buvo tiriami efektyviąją skysčių chromotografija. Atlikus tyrimą buvo padarytos išvados, kad KFE su C18 kolonėle yra efektyvus metodas padedantis tirti aspartamą ir neotamą jogurte. Kietafazė ekstrakcija palengvino tolimesnį tyrimą naudojant ESC metodą, kuris tapo jautresnis, paprastesnis ir tikslesnis tiriant daugiakomponentį mišinį, nei tiriant jį be kietafazės ekstrakcijos [16].

Taip pat literatūroje yra aprašomas kiekybinis difenhidramino nustatymas sirupe pritaikant kietafazės ekstrakcijos metodą (Hurtado M, Medina JR, 2017). Tyrime naudojami dviejų rūšių difenhidramino hidrochlorido sirupai kartu su lidokaino hidrochlorido tirpalu, kaip standartu. Sirupo tūris lygus 7,5 mg difenhidramino buvo praskiestas 3 ml lidokaino hidrochlorido vandeninio standarto.

Kolonėlės buvo kondicionuojamos 3 ml acetonitrilo ir 7 ml distiliuoto vandens, po to užnešami mėginiai. Jie buvo valomi 5 ml distiliuoto vandens ir 7 ml acetonitrilo: vandens (50:50) mišinio, tuomet sorbentas išdžiovinamas vakuume ir mėginys išplaunamas 4 ml 5% amoniako acetonitrilu.

Šiame straipsnyje buvo pasiektas selektyvus bazinių junginių atskyrimas nuo pagalbinių medžiagų.

Lidokaino hidrochloridas (standartas) pasižymėjo tinkamu atgavimu. Be to, buvo įvertintas dekstrometorfano hidrobromido tirpalų atsistatymas, nes šis junginys dažnai laikomas susijęs su difenhidraminu ir nustatytas puikus atsistatymas. Kai junginiai buvo atskirti nuo pagalbinių medžiagų buvo matomas puikus tiriamųjų junginių chromotografinis vaizdas [12].

Mokslininkai taip pat atliko tyrimą (M. da Silva L, Salgado H, 2012) - septynių tetraciklinų (metaciklino, minociklino, tetraciklino, oksitetraciklino, demeciklociklino, chlortetraciklino ir doksiciklino) kiekio nustatymas klampioje terpėje - piene naudojant ESC. Analitės iš matricos buvo ekstrahuotos naudojant oksalato buferį (pH 4,0) su 20% trichloracto rūgštimi, kaip baltymų nusodinimo agentą, o po to atliekama paprasta KFE procedūra, naudojant kolonėlę su C18 sorbentu.

Kondicionavimo etape į kolonėlę buvo pilami 2 ml metanolio ir 2 ml vandens. Tuomet kolonėlė buvo užpildoma pieno tetraciklinų ekstraktu. Mėginio eliuavimui buvo pasirinktas metanolio:acetonitrilo 0,01 M oksalo rūgšties (30:30:40) mišinys. Toks mėginio paruošimas naudojant KFE su C18 kolonėlė

(19)

padėjo nustatyti tikslesnį tetraciklinų kiekį piene naudojant ESC [20].

1.3.2 Kolonėlių su cianoalkilsilikagelio sorbentu taikymas

Kolonėlės su cianoalkilsilikagelio sorbentu skyrimo mechanizmas yra atvirkštinė arba normali fazė. Atvirkštinė fazė yra naudojama vandeniniams tirpalams (biologiniai skysčiai, vanduo), o normali fazė naudojama organiniems tirpikliams, aliejams, lipidams. Kolonėlės sorbentas yra monomeriškai sujungtas cianopropilas (7% C) ir ši kolonėlė idealiai tinka labai hidrofobinėms analitėms, kurios gali būti nevisiškai sulaikomos ant hidrofobinių sorbentų. Taip pat ji leidžia negrįžtamai išlaisvinti labai polines molekules [29].

Literatūroje aprašomas tyrimas (Mancilha et al., 2013) naudojant kietafazę ekstrakciją su cianoalkylsilikagelio kolonėlė. Tyrimo metu buvo nustatomas sitagliptino kiekis šlapime po KFE naudojant spektrofluorimetriją. Kolonėlė buvo kondicionuojama 3 ml vandens ir 2 ml sieros rūgšties.

Tuomet vakuumo pagalba ant sorbento buvo užnešama 20 ml alikvatinio šlapimo mėginys. Mėginys nuo pašalinių medžiagų buvo valomas 3 ml išgryninto vandens. Galiausiai jis buvo eliuojamas 20 ml 0,1 mol/l sieros rūgšties. Be kietafazės ekstrakcijos, dėl spektrinių trukdžių, kurie trukdė matyti analitės analizės signalą, sitagliptino nustatyti šlapime nebuvo įmanoma. Net naudojamas sinchroninės fluorasencijos spektroskopijos metodas neleido pamatyti sitagliptino fluorasencijos smailės. Šiam spektriniam trikdžiui ir buvo sukurta KFE procedūra. Tyrime buvo naudojamos trys skirtingos kolonėlės Strata-X, C8 ir cianoalkilsilikagelio kolonė. Nustatyta, kad tinkamiausios sąlygos ekstrahuojant analitę iš vandeninės terpės yra naudojant cianoalkilsilikagelio kolonėlę. Sitagliptino fosfatas yra labai hidrofilinis junginys, todėl jis dera su eliuavime naudota 0,1 mol/l sieros rūgštimi.

Dėl šios priežasties C8 ir Strata-X kolonėlės neturėjo reikšmės sorbcijai. Taip pat mažesnio poliškumo tirpikliai nedarė jokio poveikio eliuavimo etapui, todėl rūgšties tirpalas desorbavo tol, kol sumažino 3 pav. Monomeriškai sujungtas cianopropilas (7% C)

(20)

sorbento fazės ir analitės sąveiką. KFE metodas buvo įvertintas, kaip efektyvus atliekant atgavimo ir pakartojimo bandymus. Taip pat rasta tinkama aptikimo ir kiekybinio įvertinimo riba, todėl ši metodika gali būti naudojama kokybės kontrolei [26].

1.3.3 Kolonėlių su fenilsilikagelio sorbentu taikymas

Kolonėlės su fenilsilikagelio sorbentu skyrimo mechanizmas yra atvirkštinė fazė. Ji dažniausiai naudojama vandeniniams tirpalams (biologiniams skysčiams, vandeniui). Kolonėlės sorbentas yra monomeriškai sujungtas fenilas (7% C), šios kolonėlės poliškumas panašus į C18 kolonėlės monomeriškai surištą oktadecilą (11% C), tačiau aromatinis žiedas fenilsilikagelio kolonėlėje pasižymi unikaliu selektyvumu ir sulaikymu. Kolonėlės su fenilsilikagelio sorbentu naudojamos pašalinti labai dideles hidrofobines molekules, kurių nepašalina tokios kolonėlės kaip C18, taip pat ji geriau sulaiko mėginius, kurie alifatinėse funkcinėse grupėse turi konjuguotus žiedus [29].

Literatūroje aprašomi keli tyrimai, kurių metu naudojama kietafazė ekstrakcija su fenilsilikagelio kolonėle. Moksliniame straipsnyje aprašomas (Ahmed et al., 2013) tyrimas kurio metu buvo nustatomas azitromicino ir klaritromicino kiekis žmogaus plazmoje naudojant skysčių chromotografijos ir masių spektrofotometrijos (SC-MS) metodą prieš naudojimą sukoncentruojant mėginį KFE pagalba. Kietafazės ekstrakcijos metu buvo naudojama kolonėlė su fenilsilikagelio sorbentu. Ji buvo kondicionuojama 5 ml metanolio ir 5 ml išgryninto vandens, tuomet užnešamas žmogaus serumas kuriame yra azitromicinas. Tada mėginys plaunamas 5 ml metanolio. Eliuentas džiovinamas azotu 40 laipsnių temperatūroje. Pabaigoje išdžiovintas ekstraktas naudojamas SC-MS.

Ta pati metodika buvo taikoma ir klaritromicinui. Ekstrahavimo metu azitromicino regeneracija nustatyta trimis skirtingomis koncentracijomis (0,5, 5,0 ir 50,0 ng/ml). Nustatyta, kad KFE metodika buvo pasirinkta tinkama, nes vidutinis azitromicino atgavimas 98,11%, o klaritromicino - 94,0%. KFE su fenilosilikagelio kolonėle naudojant metanolį ir vandenį pasitvirtino kaip paprastas ir efektyvus metodas ekstrahuojant azitromiciną ir klaritromiciną. Šis metodas palengvino skysčių 4 pav. Monomeriškai sujungtas fenilas (7% C)

(21)

chromotografijos ir masių spektrofotometrijos tolimesnę analizę [1].

Kiti mokslininkai (M. da Silva L, Salgado H, 2012) savo moksliniame darbe nustatinėjo tetraciklinų kiekį meduje taikant ESC, prieštai panaudojant kietafazę ekstrakciją mėginio paruošimui.

KFE buvo atliekama su fenilsilikagelio kolonėle. Pirmiausia ji buvo aktyvuota 5 ml acetonitrilo ir 5 ml 10 mM oksalo rūgšties tirpalo (pH 3), tada kondicionuojama 5 ml prisotinto Na2EDTA tirpalo.

Tuomet užneštas medaus mėginys, kuris buvo plaunamas 10 ml išgryninto vandens, tada 5 min.

džiovinamas ir eliuojamas 5 ml etilo acetato tirpalu. Pabaigoje mėginys buvo tiriamas efektyviąją skysčių chromotografija. Toks medaus mėginio preanalitinis perdirbimas naudojant KFE padėjo lengviau taikyti ESC ir išsiaiškinti tikslesnį tetraciklinų kiekį meduje [20].

1.3.4 Kolonėlių su aminoalkilsilikagelio sorbentu taikymas

Kolonėlės su aminoalkilsilikagelio sorbentu skyrimo mechanizmas yra normali arba jonų mainų fazė ir naudojama organiniams arba vandeniniams tirpalams. Kolonėlės sorbentas monomeriškai sujungtas aminopropilas kuris gali būti naudojama normalia ir jonų mainų faze. Ši kolonėlė leidžia greitai atpalaiduoti labai stiprius anijonus, pvz., sulfoninę rūgštį, kurią stiprus anijonas galėtų sulaikyti nepakankamai. Taip pat ją galima naudoti kai kuriose atvirkštinės fazės programose (dėl etilo tarpiklio), tačiau dažniausiai ji dėl savo poliškumo yra naudojama kaip jonų mainų arba normalios fazės sorbentas [29].

Moksliniame straipsnyje (Sakchai et al., 2017) aprašomas nitrofuranų tyrimas gyvūnų maiste naudojant ESC. Prieš atliekant efektyviąją skysčių chromotografiją mėginys buvo perdirbamas KFE su aminoalkilsilikagelio kolonėle. Pirmiausia buvo ruošiamas mėginys kietafazei ekstrakcijai: į 5 g kruopščiai sumalto pašaro buvo įpilama 20 ml amonio acetato (79 mmol L-1 tirpalo, pH 4,6) ir praskiedžiama amoniako tirpalu, kad pH būtų 8. Mišinys paliekamas pastovėti 15 min. ir pridedama 30 ml etilo acetato, tuomet jis maišomas 20 min. laboratorinėje centrifugoje ir centrifuguojamas 10 min.

esant 3000 aps./min. Surenkamas organinis sluoksnis, kuris išgarinamas rotaciniame vakuuminiame 5 pav. Monomeriškai sujuntas aminopropilas

(22)

garintuve, gautas ekstraktas ištirpinamas 2 ml acetono: metanolio (8:2). KFE užtaisas („Sep-Pak®

NH2 Vac“, 6cc, 1g, Waters, USA) kondicionuojamas 5 ml acetono: metanolio (8:2). Paruoštas ekstraktas supilamas į užtaisą, o nitrofuranai išplaunami 5 ml acetono: metanolio (8:2). Eliuatas išgarinamas iki sausumo, o liekana ištirpinama 5 ml judančiosios fazės tirpalo. Gautas tirpalas filtruojamas per 0,45 µm membraninio švirkšto filtrą prieš jį suleidžiant į ESC sistemą. Po kietafazės ekstrakcijos ESC chromatogramos turėjo aiškias bazines linijas, neturinčias įtakos analitės smailėms.

Taigi buvo galima daryti išvadą, kad visos pagalbinės medžiagos neturi jokio rimto poveikio nustatant nitrofuranus, net jei pagalbinių medžiagų yra 10–1000 kartų daugiau nei nitrofuranų [31].

Kitas tyrimas (Traversier et al., 2018) atliktas bandant atskirti polinius lipidus nuo kitų junginių kosmetikos produktuose, kurie pasižymi daugiakomponente matrica. Išskirti polinių lipidų klasei iš kitų klasių dažniausiai naudojama KFE aminopropilo kolonėlė. Pirmiausia norint atskirti lipidų klasę kolonėlė išplaunama chloroformo-propan-2-olio (2:1) mišiniu – gaunama neautrali lipidų frakcija. Tada kolonėlė eliuojama dietileteriu, kuriame yra 2% acto rūgšties, o po to metanoliu, kad būtų išplaunamos laisvosios riebalų rūgštys ir neutralūs fosfolipidai. Galiausiai rūgštiniai fosfolipidai buvo išplaunami heksanu/propan-2-oliu/etanoliu 0,1 M amonio acetatu vandens skruzdžių rūgštyje, kurioje yra 5% fosforo rūgšties, kad būtų iki galo išplauti visi poliniai lipidai. Ši KFE metodika buvo pasirinkta vietoj skystis-skystis ekstrakcijos, dėl sugebėjimo pagerinti atskyrimo efektyvumą sutaupant lėšų ir laiko. Buvo padaryta išvada, kad KFE sistema, naudojant aminopropilo silicio kolonėles, leidžia lengviau atskirti pagrindines lipidų klases, įskaitant triacilglicerolius, skirtingus fosfolipidus (pasirinktą klasę) ir cholesterolio esterius [33].

1.4 Naujovės kietafazės ekstrakcijos metodikoje ir jos taikyme

• 96 kolonėlių plokštelė: Siekiant pagerinti greitos ekstrakcijos metodą, dėl didelio poreikio, atsirado daugiau KFE pritaikymų. KFE patobulėjo nuo stulpelių ir kolonėlių naudojimo iki didelio pralaidumo 96 kolonėlių plokštelės. Šiuo metodu naudojami pavieniai blokai ar plokštelės su 96 kolonėlėmis, kuriose yra diskai ar supakuotos sorbento dalelės išdėstytos 8 eilučių 12 stulpelių stačiakampėje matricoje. Viename tyrime (Altun et al., 2010) buvo naudotas monolitinio metakrilato polimerinis sluoksnis 96 antgaliuose. Tokia tyrimo metodika buvo įvertnta kaip galingas įrankis bioanalitiniuose tyrimuose. Šis metodas turi keletą neįtikėtinai reikšmingų pranašumų, pavyzdžiui, 96 mėginius galima paruošti per 2–4 min. taip sumažinant mėginio paruošimo laiką, tačiau išlaikant tikslumą. Tai yra ateities perspektyva biologiškai aktyvių junginių ir metabolitų bioanalizės ir farmacijos pramonės srityse [2].

(23)

• Imunosorbentai: Šiais laikais sintetinami nauji ekstrahavimo sorbentai apimantys grįžtamąją ir selektyviąją antigeno-antikūno sąveiką, kad būtų galima sulaikyti struktūriškai panašius junginius, tokius kaip šeimininko - svečio komplementinis kompleksas. Tokių junginių sulaikymas priklauso nuo analitės dydžio ir formos. Pasirinktas sorbentas turi aprūpinti funkcines grupes tinkamu sukibimu reikiamose vietose, antikūnų skaičiumi ir atitinkamu hidrofiliškumu, kad užkirsti kelią nespecifinėm reakcijom su tyrinėjamais komponentais ar matricomis. Šie reikalavimai buvo nustatyti darant bandymus su kolonėlėmis, kurios buvo pagamintos su diolio ir aldehido aktyvuotu silicio dioksido sorbentu. Sorbente parinkti antikūnai buvo prijungti prie aminorūgščių, naudojant Schiffo bazių metodą. Daugkartinis antigeno-antikūno sąveikos mechanizmas apima – jonų pritraukimą, vandenilinius ryšius ir hidrofobinę trauką, taip pat van der Waals jėgas. Imunosorbentai turi keletą nepaprastai svarbių pranašumų, tokių kaip matricos trikdžių sumažinimas ir dominančios analitės ištraukimas, todėl galima efektyviai išvalyti sudėtingus biologinius ir aplinkos mėginius. Imunoafinitetinių sorbentų paruošimas KFE buvo aprašytas (Stevenson, 2000). Nepaisant to, šis metodas nebuvo pradėtas dažnai taikyti, nes šio tipo sorbentų su tinkamu stabilumu ir būdingu diapazonu sukūrimas yra gana brangus ir užimą ilgą laiką. Kaip minėta šie sorbentai yra ypač brangūs ir tik keli iš jų yra parduodami rinkoje. Tačiau randama vis daugiau straipsnių, kuriuose aptariami imunosorbentų privalumai kaip unikalių ir galingų biologinių priemonių, kurios leidžia vienu etapu selektyviai išgauti fiksuotą matricą [7], [27].

• Molekuliniu būdu įspausti polimerai: Molekulinis įspaudimas yra metodas, naudojamas sintetiniams polimerams gaminti su iškarto nustatytomis molekulių atpažinimo savybėmis.

Molekulinio įspaudimo technologija pagrįsta komplekso susidarymu tarp analitės ir funkcinio monomero. Didelė paviršinio sujungimo medžiaga yra reikalinga sudaryti trimatį polimerų tinklą. Šablonas po polimerizacijos yra pašalinamas iš polimero paliekant specifines atpažinimo vietas jas papildant dydžiu, forma ir cheminiu funkcionalumu šabloninei molekulei.

Dažniausiai tarp šablono molekulių vyksta tarpmolekulinės sąveikos tokios kaip dipolis- dipolis, joninės ir vandenilio ryšių sąveikos. Šios sąveikos, taip pat ir funkcinės grupės esančios polimero matricoje stumia molekulę jos atpažinimo link. Taigi susidaręs polimeras atpažįsta ir selektyviai jungiasi tik su šablono molekulėmis. Pastaruoju metu šis metodas sulaukia didelio susidomėjimo daugelyje mokslo sričių, ypač dėl to, kad molekuliniu būdu atspausdinti polimerai turi didelį potencialą kietafazėje ekstrakcijoje ir chromotografiniame atskiryme. Molekuliniu būdu įspausti polimerai (MBĮP) yra elementai, galintys imituoti natūralaus atpažinimo elementus, tokius kaip antikūnai ir biologiniai receptoriai, todėl yra

(24)

naudingi atskiriant ir analizuojant tokias sudėtines medžiagas kaip biologinius skysčius ir aplinkos mėginius. MBĮP turi daug pranašumų, tačiau svarbiausi KFE yra jų didelis selektyvumas ir panašumas reikiamai molekulei naudotai įspaudimo procedūroje. MBĮP lyginant su biologinėmis sistemomis, įskaitant nukleorūgštis ir baltymus, pasižymi didesniu fiziniu tvirtumu, atsparumu padidėjusiam slėgiui ir temperatūrai, stiprumu ir inertiškumu bazių, rūgščių, organinių tirpiklių ir metalų jonams. Be to, MBĮP sintetinimas yra pigus, o polimerų laikymo trukmė gali būti labai ilga ir atpažinimo pajėgumas nepasikeisti net kelerius metus laikant kambario temperatūroje. Buvo atliktas tyrimas (Chen FF, Wang R, Shi YP, 2012) nustatant kirenolio kiekį Siegesbeckia pubesccens žolelių ekstrakte. Buvo panaudota KFE su molekulių įspaustu polimeru. Kiekviena kolonėlė buvo kondicionuojama su 5 ml metanolio ir 5 ml acetonitrilo, tuomet buvo užnešamas 1,5 ml kirenolio ir acetonitrilo mišinio. Kolonėlė buvo plaunama 5 ml acetonitrilio, kad būtų pašalintos nereikalingos medžiagos. Pabaigoje analitė buvo eliuojama su 5 ml metanolio ir acto rūgšties tirpalu (9:1). Buvo įvertintas MBĮP įspaudimo efektas ir selektyvumas, gauti polimerai pasižymėjo geru selektyvumu ir adsorbcijos geba. Tokia KFE metodika buvo naudinga augalų ekstraktų valymo priemonė, kuri parodė puikų šablono atgavimą (80,9%) ir buvo įvertinta, kaip tinkama diterpenoidų ekstrakcijai iš S.

pubescens žolelių [8], [27].

• Anglies nanopluoštai, nanodiskai: Anglies nanopluoštai ir nanodiskai greitai vystosi kaip sorbuojančios medžiagos ir (pseudo) nejudančios fazės šiuolaikiniuose atskyrimo metoduose dėl didelio chemiškai aktyvaus paviršiaus ir jų unikalių mechaninių ir fizikocheminių savybių.

Atsižvelgiant į minėtų anglies nanostruktūrų pritaikymą, nanopluoštai yra dažnai naudojami kaip KFE sorbentai. Pavyzdžiui grafinas, dėl nepagrįsto slėgio kritimo ir pablogėjusio sulaikymo efektyvumo, linkęs agreguotis ir ši savybė trukdo jo taikymui. Dėl to, kad anglies nanopluošto matmenys yra žymiai didesni nei grafino, jis gali pašalinti šį trūkumą be papildomo dengimo, funkcionalizavimo, apdailos. Tyrimo metu (Ifegwu et al., 2014) buvo atliekamas hidroksipireno kiekybinis nustatymas naudojant ESC. Mėginys buvo apdirbtas KFE su nanopluoštu norint pašalinti nereikalingas medžiagas. Nanopluošto kolonėlės ir diskai buvo kondicionuojami 0,2 ml metanolio ir 0,2 ml vandens. Į mini diskus ir mikro kolonėles buvo įpilta 0,3 ml skirtingos koncentracijos homogenizuoto tirpalo. Mišinys iš kolonėlės buvo išstumtas oro slėgiu 5 ml mikropipete, o disko mišinio išstumimui reikėjo vakuumo pompos pagalbos. Srautas buvo atsargiai kontroliuojamas lašinant labai lėtai. Po užnešimo mėginiui buvo leidžiama išdžiūti. Tada jis buvo išvalomas su 0,2 ml vandens ir eliuojamas 0,2 ml metanolio. Rezultatai parodė, kad mini diskai ir kolonėlės buvo veiksmingi ekstrahuojant hidroksipirolą kūno skysčiuose. Manoma, kad nanopluoštų naudojimas gali pakeisti C18

(25)

kolonėlę, nes turi tokių pranašumų kaip – supaprasintas mėginių paruošimas, sumažintos analizės ir laiko sąnaudos išlaikant kolonėlių ir diskų patikimumą ir jautrumą [13], [27].

1.5 Fenoliniai junginiai ir jų ypatumai

Augalai yra turtingi fenolinių junginių veikiančių kaip antioksidantai širdies ligų prevencijai, mažinančių uždegimą, padedančių mažinti vėžio ir diabeto dažnį, taip pat sumažinti mutagenezės greitį žmogaus ląstelėse. Fenoliniai junginiai pasižymi antialerginiu, antimikrobiniu, priešuždegiminiu, antitromboziniu, antioksidaciniu, kardiovaskulinę sistemą saugančiu ir kraujagysles plečiančiu poveikiu.

Organizmo apsauga, kurią teikia augaliniai produktai, tokie kaip vaisiai, daržovės ir ankštiniai, dažniausiai siejama su fenolinių junginių buvimu. Fenoliniai junginiai yra sintetinami augaluose iš dalies kaip atsakas į ekologinį ir fiziologinį spaudimą, pavyzdžiui, patogenų ir vabzdžių užpuolimą, UV spinduliuotę ar žaizdas.

Fenoliniai junginiai yra gerai žinomi fitochemikalai, randami visuose augaluose. Jie susideda iš paprastų fenolių, benzoinės ir cinaminės rūgšties, kumarinų, taninų, ligninų, lignanų ir flavonoidų.

Pagrindinis fenolinių junginių struktūrinis bruožas yra aromatinis žiedas, turintis vieną ar daugiau hidroksilo grupių. Per pastaruosius 25 metus buvo vykdoma daug svarbių tyrimų, susijusių su fenolinių junginių, kaip vaistinių ar dietinių molekulių, ekstrakcija, identifikavimu, kiekybiškumu.

Organinių tirpiklių ekstrahavimas yra pagrindinis metodas naudojamas fenolių ekstrakcijai. Norint identifikuoti fenolinių junginių buvimą naudojamos cheminės procedūros, tačiau norint nustatyti ir kiekybiškai įvertinti atskirus fenolinius junginius naudojami spektrofotometriniai ir chromotografiniai metodai.

Fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui naudojama UV, IR spektrofotometrija, masių spektrofotometrija, branduolių magnetinio rezonanso spektrofotometrija, efektyvioji skysčių chromatografija su ultravioletinės ir diodų matricos detektoriais, plonasluoksnė chromatografija ir kai kurie rečiau taikomi metodai, kaip rentgeno spindulių difrakcija.

Visiškas fenolinių junginių ekstrahavimas yra kritinis žingsnis po mėginio paruošimo.

Dažniausiai fenolių ekstrakcijai naudojami organiniai arba neorganiniai tirpikliai. Keletas parametrų gali turėti įtakos fenolinių junginių išeigai, įskaitant ekstrahavimo laiką, temperatūrą, tirpiklio ir mėginio santykį, pakartotinių mėginio ekstrakcijų skaičių ir tirpiklio tipą. Be to, optimalus fenolių atkūrimas kiekviename mėginyje skiriasi ir priklauso nuo augalo rūšies bei jo aktyviųjų junginių.

(26)

Ekstrahentų, tokių kaip vanduo, acetonas, etilo acetatas, alkoholiai (metanolis, etanolis ir propanolis) ir jų mišinių pasirinkimas turi didelę įtaką ekstrahuotų fenolių išeigai. Mėginio matrica ir dalelių dydis taip pat daro didelę įtaką fenolinių junginių ekstrakcijai iš augalinių medžiagų. Fenoliai gali jungtis su kitais mėginio elementais, tokiais kaip angliavandeniai ir baltymai. Šie ryšiai gali būti hidrolizuojami pridedant fermentų, tokiu būdu skatinant surištų fenolių išsiskyrimą. Fenolių išskyrimui taip pat gali būti nadojama kietafazė ekstrakcija [15].

Buvo atliktas tyrimas (Sun et al., 2016) kurio metu buvo identifikuojami fenoliniai junginiai meduje ESC metodu, skirtingų KFE kolonėlių pagalba. 30 g medaus mėginio buvo sumaišyta su 120 ml ypač gryno vandens, tirpalas sureguliuotas iki atitinkamo pH skirtingai kolonėlei. Mėginiai buvo centrifuguojami 10 minučių, kad būtų pašalintos kietosios dalelės. Mėginiai buvo supilti į anksčiau paruoštus užtaisus tokiomis sąlygomis: 3 ml metanolio (pH sulyginta taip: 3 ml parūgštinto ypač gryno vandens (pH = 2) RP-KFE kolonėlėms arba 3 ml ypač gryno vandens (pH = 7) RP-AE KFE kolonėlėms). Po užnešimo kolonėlės buvo valomos 4 ml parūgštinto ypač gryno vandens (pH = 2) RP- KFE kolonėlėms, kad pašalintų cukrų ir kitus medaus polinius junginius, kurie nebuvo adsorbuoti sorbentuose arba buvo nuplauti 4 ml ypač gryno vandens (RP-AE KFE kolonėlių pH = 7). Vėliau užtaisuose esantys fenoliniai junginiai buvo išplaunami 5 ml skruzdžių rūgšties: metanolio (1: 9) mišiniu. Rezultatai parodė, kad RP–AE KFE kolonėlės yra pranašesnės už RP-KFE medaus fenolinių junginių išankstiniam sukoncentravime, ypač fenolinių rūgščių. RP-AE kolonėlės, ypač „Strata-X-A“, gali būti naudojamos mažai fenolinių junginių turinčių daugiakomponenčių maisto produktų matricų, pavyzdžiui, pieno produktų, vaisių sulčių gėrimo, vyno ar acto, fenolinių junginių koncentracijai [32].

(27)

TYRIMO METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – sirupo formos fitopreparatai ir kietafazės ekstrakcijos kolonėlės ir tirpikliai.

Tyrimui buvo atrinkti šie fitopreparatai:

1. Sirupas A: rinkodaros teisių turėtojo nurodytas pavadinimas „Pertusinas”, vaistinė medžiaga – čiobrelių skystasis ekstraktas;

2. Sirupas B: rinkodaros teisių turėtojo nurodytas pavadinimas „Pertusinas Forte”, vaistinė medžiaga – čiobrelių skystasis ekstraktas;

3. Sirupas C: rinkodaros teisių turėtojo nurodytas pavadinimas „Urinal”, vaistinė medžiaga – džiovintų stambiauogių spanguolių sulčių milteliai;

4. Sirupas D: rinkodaros teisių turėtojo nurodytas pavadinimas „Prospan”, vaistinė medžiaga – gebenių lapų sausasis ekstraktas.

Sirupai buvo laikomi kambario temperatūroje, spintoje.

Tyrimui buvo atrinkti šie kietafazės ekstrakcijos metadologiniai veiksniai:

Kolonėlės:

1. DSC-18LT – kolonėlė su oktadecilsililsilikagelio sorbentu;

2. DSC-PH – kolonėlė su fenilsilikagelio sorbentu;

3. DSC-CN – kolonėlė su cianoalkylsilikagelio sorbentu;

4. DSC-NH2 – kolonėlė su aminoalkilsilikagelio sorbentu.

Tirpikliai:

1. Išgrynintas vanduo;

2. 96%, 80%, 60%, 40%, 20% etanolio tirpalai.

2.2 Reagentai

Folin-Ciocalteu reagentas (Merck, Vokietija);

Natrio karbonatas (bevandenis, CHEMPUR, Lenkija);