Darbo vadovas

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

GIEDRĖ GAUBAITĖ

BUSPIRONO IR FLUOKSETINO EKSTRAKCIJOS IŠ KRAUJO PLAZMOS

TINKAMIAUSIŲ SĄLYGŲ NUSTATYMAS, MEDŢIAGŲ KONCENTRACIJĄ

ĮVERTINANT EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

doc. dr. Daiva Kazlauskienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Data

(metai, mėnuo, diena)

BUSPIRONO IR FLUOKSETINO EKSTRAKCIJOS IŠ KRAUJO PLAZMOS TINKAMIAUSIŲ SĄLYGŲ NUSTATYMAS, MEDŢIAGŲ KONCENTRACIJĄ ĮVERTINANT EFEKTYVIOSIOS

SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Darbą atliko

doc. dr. Daiva Kazlauskienė Giedrė Gaubaitė

Data Data

Recenzentas

Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9

1 LITERATŪROS APŢVALGA... 10

1.1 Buspirono hidrochloridas ... 10

1.2 Fluoksetino hidrochloridas ... 10

1.3 Paroksetino hidrochloridas ... 11

1.4 Buspirono ir fluoksetino absorbcija bei pasiskirstymas ... 12

1.5 Buspirono ir fluoksetino metabolizmas bei eliminacija ... 13

1.6 Buspirono ir fluoksetino terapinis poveikis ... 14

1.7 Buspirono ir fluoksetino gydomosios dozės ... 14

1.8 Buspirono ir fluoksetino toksiškumas ... 15

1.9 Buspirono ir fluoksetino sąveika ... 15

1.10 Vaistinių medţiagų nustatymo biologinėse terpėse metodai ... 16

1.11 Mėginio paruošimas prieš ekstrakciją ... 16

1.12 Skysčių – skysčių ekstrakcija ... 17

1.12.1 Ekstrakcijai naudojami tirpikliai ... 18

1.13 Kietos fazės ekstrakcija ... 19

1.13.1 Sorbentai ... 19

1.13.2 Tirpikliai ... 20

1.14 Kietafazė mikroekstrakcija (KFME) ... 22

1.15 Vaistų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 23

1.16 Analizės metodo įteisinimas ... 24

2 TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA ... 25

2.1 Tyrimo objektas ... 25

2.2 Reagentai ... 25

2.3 Standartinių tirpalų ruošimas ... 26

2.4 Tiriamojo tirpalo paruošimas ... 26

2.5 Efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygos ... 26

2.6 Skysčių – skysčių ekstrakcija ... 26

2.8 Duomenų apdorojimas ... 27

3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ... 28

3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 29

3.2.1 Specifiškumas ... 30

3.2.2 Rezultatų glaudumas ... 32

3.2.3 Tiesiškumas ... 32

3.2.4 Aptikimo ir nustatymo ribos ... 34

3.3 Skysčių – skysčių ekstrakcija ... 34

3.4 Kietafazė ekstrakcija ... 35

3.5 Kietafazės ekstrakcijos optimizavimas ... 36

3.5.1 KFE optimaliausio eliuento nustatymas ... 36

3.5.2 Terpės įtaka metanolio eliucinei jėgai ... 38

3.5.3 Optimalios metanolio koncentracijos nustatymas ... 39

3.5.4 Optimaliausio tirpiklių mišinio nustatymas ... 40

3.5.5 Tinkamiausių eliuentų palyginimas ... 42

3.5.6 Optimalaus eliuento kiekio nustatymas ... 43

4 IŠVADOS ... 45

5 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 46

SANTRAUKA

G. Gaubaitės magistro baigiamasis darbas „Buspirono ir fluoksetino ekstrakcijos iš kraujo plazmos tinkamiausių sąlygų nustatymas, medţiagų koncentraciją įvertinant efektyviosios skysčių chromatografijos metodu“/ mokslinė vadovė doc. dr. D. Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Tyrimo objektas – kraujo plazma su vaistinių medţiagų mišiniu (buspirono hidrochloridu ir fluoksetino hidrochloridu). Šio tyrimo tikslas – nustatyti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas, reikalingas vaistų mišinio (buspirono ir fluoksetino) išskyrimui iš kraujo plazmos bei pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką vaistų mišinio veikliųjų junginių identifikavimui ir kiekio nustatymui. Darbo uţdaviniai buvo pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką; išskirti buspirono ir fluoksetino vaistų mišinį iš kraujo plazmos skysčių – skysčių (SSE) ir kietafazės ekstrakcijos (KFE) metodais; optimizuoti geriausią ekstrakcijos metodą.

Tyrimo metu buvo pritaikyta ESC metodika buspirono ir fluoksetino identifikavimui ir kiekio nustatymui. Atlikta ESC metodikos validacija: įrodytas specifiškumas, rezultatų glaudumas, remiantis koreliacijos koeficientu (R2) įvertintas metodikos teisiškumas, buspirono ir fluoksetino koreliacijos koeficientai atitinkamai lygūs 0,9997 ir 0,9998. Nustatytos aptikimo ribos (buspironui 0,4 µg/ml, fluoksetinui 0,75 µg/ml) ir nustatymo ribos (buspironui 0,75 µg/ml, fluoksetinui 1 µg/ml). Vaistinių medţiagų mišinys išskirtas iš kraujo plazmos SSE ir KFE metodais. Nustatyta, kad KFE yra greitesnis ir tikslesnis metodas lyginant su SSE, todėl KFE pasirinkta tolesniam metodo optimizavimui. Eksperimentai atlikti su 6 organiniais tirpikliais (metanoliu, etanoliu, propanoliu, trichlormetanu, dichlormetanu ir acetonitrilu). Tolesniam metodo optimizavimui pasirinktas metanolis. Eksperimentiškai įrodyta, kad metanolio eliucinę jėgą padidina rūgštinė terpė, o optimali metanolio koncentracija yra 80 proc. Nustatyti ir palyginti du geriausi eliuentai (2 proc. etano rūgštis : metanolis (2:8) ir trichlormetanas : propanolis(1:1)). Įrodyta, kad minėtų eliuentų ekstrakcijos išgava yra panaši bei nėra statistiškai reikšmingo (p>0,05) skirtumo. Todėl jie gali būti taikomi vaistų mišinio (buspirono ir fluoksetino) ekstrakcijai iš kraujo plazmos. Nustatytas optimalus tirpiklio tūris 1ml, vaistinių medţiagų desorbcijai naudojant minėtus du eliuentus.

SUMMARY

G. Gaubaitė. The determination of conditions of extraction buspirone and fluoxetine from human plasma, measuring drug quantity by high performance liquid chromatography. Scientific supervisor doc. dr. D. Kazlauskienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological chemistry. – Kaunas.

The object of study – human plasma with the mix of two drugs (buspirone hydrochloride and fluoxetine hydrochloride). The aim of this study was to determine extraction conditions for buspirone and fluoxetine isolation from human plasma and to apply high-performance liquid chromatography (HPLC) method for quantitative analysis of the drugs after extraction. The objective was to apply and validate HPLC procedure; to extract buspirone and fluoxetine from human plasma by liquid-liquid extraction (LLE) and solid phase extraction (SPE); to optimize efectiveness extraction method.

The HPLC method for identification and quantitative analysis of drugs was optimized. The mobile phase was 0,1 per cent of trifluoroacetic acid and acetonitrile.Validation of the HPLC method was carried out. The specificity, precision, linearity, limits of detection (buspirone 0,4 µg/ml, fluoxetine 0,75 µg/ml) and quantification (buspirone 0,75 µg/ml, fluoxetine 1 µg/ml) were determined. Validate HPLC method was applied for analysis of buspirone and fluoxetine after extraction. Drugs were extracted from human plasma by LLE and SPE methods. The best recovery of analites gave SPE methods. The recoveries of the drugs using six different organic solvents (methanol, propanol, ethanol, trichloromethane, dichloromethane, acetonitrile) were examined. Selected the most appropriate environment (acidify) for methanol and the methanol percentage of the elution solvent (80 per cent). Selected two of the most appropriate elution solvent (2 per cent acetic acid : methanol (2:8) and trichloromethane : propanol). Described, that this two elution solvents gave the same extraction recovery and not statistically significant (p>0.05) difference. Two elution solvents were applied for extraction of the drugs. Optimal volume of elution solvent (1 ml) was determined.

SANTRUMPOS

GASRA – Gama amino sviesto rūgštis

5-HT1A – 5-hidroksitriptamino 1A receptorius

CNS – Centrinė nervų sistema

ESC – Efektyvioji skysčių chromatografija SSE – Skysčių-skysčių ekstrakcija

KFE – Kietafazė ekstrakcija KFME – Kietafazė mikroekstrakcija DC – Dujų chromatografija

DC-MS – Dujų chromatografija su masių spektrometrija

ESC-MS – Efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija UV – Ultravioletinė spinduliuotė

IR – Infraraudonoji spinduliuotė SN – Standartinis nuokrypis

SSN – Santykinis standartinis nuokrypis

ĮVADAS

Kasmet didėjant sergamumui psichikos ligomis, auga skaičius pacientų, vartojančių vaistus depresijai ir nerimui gydyti. Pagal vaistų suvartojimą Lietuvoje, nervų sistemą veikiantys medikamentai sudaro net 14 proc. visų vartojamų vaistų. [6] Remiantis vaistų suvartojimo Baltijos šalyse 2010 – 2012 m. atlikta analize, fluoksetino vartojimas Lietuvoje padidėjo 6 proc., o Estijoje 5 proc. Buspirono suvartojimas Lietuvoje nepakito, o Latvijoje išaugo 7 proc. [10] Daugelis pacientų gydymui vartoja keletą preparatų vienu metu, todėl daugėja apsinuodijimų kelių rūšių vaistais ir tai sudaro 4,1 proc. visų atvejų. [5] Nerimu, depresija sergantys pacientai yra linkę piktnaudţiauti vaistiniais preparatais. Teritorinių visuomenės sveikatos prieţiūros įstaigų atlikto tyrimo duomenimis, 2011 m. Lietuvoje uţfiksuoti apsinuodijimai psichotropiniais preparatais (18,8 proc.), vaistais, veikiančiais autoimuninę nervų sistemą (14 proc.), raminamaisiais ir antiepileptiniais medikamentais (5,2 proc.). [5] Didţiosios Britanijos statistikos centro duomenimis 2011 metais daugiausiai mirtinų apsinuodijimų sukėlė tricikliniai antidepresantai, tačiau vis daţniau gydymui skiriant selektyvius seratonino inhibitorius, sparčiai daugėja apsinuodijimų ir šios grupės preparatais. [15]

Apsinuodijus medikamentais, svarbu skubiai ir tiksliai identifikuoti toksinį poveikį sukėlusias chemines medţiagas. Vaistų identifikavimui reikia pasirinkti jautrius, selektyvius ir efektyvius instrumentinės analizės metodus, kurie leistų nustatyti skirtingas apsinuodijimą sukėlusias vaistinių medţiagų koncentracijas. Vienas iš tokių metodų yra efektyvioji skysčių chromatografija. Buspironas ir fluoksetinas daţniausiai nustatomi kraujyje, serume ar kraujo plazmoje. [7] Norint išvengti matricos efekto, svarbu pasirinkti tinkamą ekstrakcijos metodą. Vaistai gali būti išskiriami skysčių – skysčių ekstrakcija, tačiau vis daţniau naudojama kietafazė ekstrakcija, kuri apibūdinama kaip patogesnis, jautresnis ir greitesnis metodas lyginant su skysčių ekstrakcija. Norint gauti kuo tikslesnius analizės rezultatus, svarbu optimizuoti metodiką, parenkant tinkamiausią ekstrakcijos kolonėlę, pH ir organinius tirpiklius.

Susisteminus literatūros šaltinių duomenis, pastebėta, kad nėra metodikos, kuri būtų taikoma vaistų mišinio (buspirono ir fluoksetino) išskyrimui ir identifikavimui. Šiuo magistriniu darbu siekiama nustatyti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas, reikalingas vaistų mišinio (buspirono ir fluoksetino) išskyrimui iš kraujo plazmos bei pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką vaistų mišinio veikliųjų junginių identifikavimui ir kiekio nustatymui.

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas:

Nustatyti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas, reikalingas vaistų mišinio (buspirono ir fluoksetino) išskyrimui iš kraujo plazmos bei pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką vaistų mišinio veikliųjų junginių identifikavimui ir kiekio nustatymui.

Uţdaviniai:

1. Apţvelgti mokslinius literatūros šaltinius ir įvertinti vaistų mišinio (buspirono ir fluoksetino) chemines ir fizikines savybes, terapinį poveikį bei identifikavimui ir išskyrimui iš kraujo plazmos naudojamus analizės metodus.

2. Pritaikyti ir validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką vaistų mišinio veikliųjų junginių (buspirono ir fluoksetino) identifikavimui bei jų kiekio nustatymui po ekstrakcijos. 3. Vaistinių medţiagų mišinį išskirti iš kraujo plazmos skysčių – skysčių ekstrakcijos metodu. 4. Išskirti vaistinių medţiagų mišinį iš kraujo plazmos kietafazės ekstrakcijos metodu.

5. Optimizuoti geriausią ekstrakcijos metodą, skirtą buspirono ir fluoksetino išskyrimui iš kraujo plazmos.

1 LITERATŪROS APŢVALGA

1.1 Buspirono hidrochloridas

1 pav. Buspirono hidrochloridas

Anksiolitikas, daţniausiai vartojamas kaip nerimą šalinantis vaistas. Struktūroje turi piperazino ţiedą, kuris turi anksiolitinį aktyvumą, serotonerginį poveikį ir dopamino receptoriaus savybių. Pirimidinilpiperizino fragmentas yra svarbus ir lemia anksiolitinį poveikį bei pasiţymi lipofilinėmis savybėmis, jungiasi su dopamino receptoriais. [37] Buspirono molekulinė masė 385,5. Pavadinimas pagal IUPAC nomenklatūrą 8-[4-[4-(2-pirimidinil)-1-piperazinil]butil]-8-azaspiro[4,5]dekan-7,9-dionas. Vartojamas kaip buspirono hidrochlorido druska (molekulinė masė 422,0). (1pav.) [7] Fizikinės – cheminės savybės: balta kristalinė bekvapė pudra, gerai tirpsta vandenyje, ribotai – etanolyje ir acetonitrile, silpnai tirpsta etilo acetate, laisvai – metanolyje ir metileno chloride, praktiškai netirpus heksanuose. [7; 19] Alkoholyje tirpsta santykiu 1:50, vandenyje – 1:1. Pasiskirstymo koeficientas oktanolis/ vanduo – 14,9. Buspirono hidrochlorido pKa yra 7,32. [18] Laikomas orui nepralaidţiose

talpose, 15 – 30 ºC temperatūroje, apsaugotoje nuo šviesos vietoje. Galioja 36 mėnesius nuo pagaminimo datos. [37; 50]

Daţniausiai minimi firminiai vaistų pavadinimai: Ansial, Buspar, Bespar. [7] Lietuvoje registruotas vaistinis preparatas Spitomin (5 ir 10 mg tabletės). [2]

1.2 Fluoksetino hidrochloridas

Antidepresantas, priklausantis selektyviems serotonino reabsorbcijos inhibitoriams (SSRI), vartojamas depresijai, obsesiniam – kompulsiniam sutrikimui, nervinei bulimijai gydyti. [2] Pavadinimas pagal IUPAC nomenklatūrą N-metil-3-fenil-3-[4-(trifluormetil)fenoksi] propan-1-aminas. Molekulinė masė 309,3. Vartojamas kaip druska (hidrochloridas), kurios molekulinė masė 345,8. (2 pav.) [7] Fluoksetino hidrochloridas yra fenilpropilamino darinys, savo struktūra ir farmakologiniu veikimu nepanašus į kitus antidepresantus. Struktūroje turi p – trifluormetilo grupę, kuri lemia fluoksetino selektyvumą ir seratonino reabsorbcijos blokavimą bei lipofiliškumą. Vaistiniai preparatai yra racematai, sudaryti iš dviejų optiškai aktyvių izomerų. Atliktų tyrimų duomenimis, abiejų izomerų farmakologinis poveikis yra panašus. [37]

Fizikinės – cheminės savybės: balti ar balkšvi kristaliniai milteliai. Tirpsta metanolyje, etanolyje, acetonitrile, chloroforme ir acetone, lengvai tirpsta etilo acetate, dichlormetane ir vandenyje ( iki 14 g/l arba santykiu 1:71). Visiškai netirpsta toluene, cikloheksane ir heksane. Pasiskirstymo koeficientas oktanolis/ vanduo 4,1. [7; 18] 1 proc. vandeninio tirpalo pH 4,5-6,5. [50] Fluoksetino hidrochlorido kapsulės ir tirpalas turi būti laikomi sandariose, nuo šviesos apsaugotose talpyklėse, 15 – 30 ºC temperatūroje. [37]

Firminiai vaisto pavadinimai: Adofen, Erocap, Fluctin, Fluoxeren, Fontex, Foxetin, Lovan,

Mutan, Prozac, Prozyn, Sanzur, Zactin. [7] Lietuvoje registruoti vaistiniai preparatai: Fluoxetine Lannacher, Fluval, Flux, Fluxemed, Magrilan, Nycoflox 20 mg, Portal capsules 20 mg. [2]

1.3 Paroksetino hidrochloridas

3 pav. Paroksetino hidrochloridas

Vidinis standartas paroksetino hidrochloridas – antidepresantas, veikia kaip selektyvus serotonino reabsorbcijos inhibitorius. (3 pav.) Daţniausiai vartojamas kaip hidrochlorido druska. Molekulinė masė

365,8. Cheminės savybės – balta ar beveik balta, higroskopinė, kristalinė pudra. Lengvai tirpsta vandenyje, metanolyje, silpnai tirpsta gryname etanolyje ir metileno chloride. [7]

1.4 Buspirono ir fluoksetino absorbcija bei pasiskirstymas

Buspirono hidrochloridas, vartojant per burną, pasiţymi greita ir visiška absorbcija iš skrandţio.

Biopasisavinimas yra ţemas tik apie 4 proc. (nuo 1,5 iki 13 proc.), nes pirmo prasiskverbimo metu yra metabolizuojamas. [7] Santykinis buspirono hidrochlorido tablečių biopraeinamumas per os yra maţdaug 90 proc., maţiausias santykinis biologinis praeinamumas – 65 proc. Maistas gali įtakoti buspirono hidrochlorido absorbciją iš virškinamojo trakto, nes sumaţina vaisto ikisisteminio klirenso dydį ir padidina nepakitusio vaisto sisteminę cirkuliaciją. [37] Suvartojus 20 mg vienkartinę dozę sveikiems pacientams, aukščiausia vaisto koncentracija plazmoje pasiekiama per 40 – 90 min. ir ji yra 1 – 6 ng/ml. [14] Terapinė vaisto koncentracija plazmoje pateikta 1 lentelėje. Atliktos studijos parodė, kad buspirono farmakokinetika – nelinijinė. [7] Nėra tikslių duomenų apie buspirono hidrochlorido pasiskirstymą ţmogaus organizme. Tačiau atlikus tyrimą su pelėmis nustatyta, kad vaistas plačiai pasiskirsto organizme. Didţiausia jo koncentracija randama plaučiuose, inkstuose ir riebaliniame sluoksnyje. Maţiausia – skeleto raumenyse, širdyje, kepenyse, plaučiuose, plazmoje. [37] Pasiskirstymas - 5,3 L/kg po 20 mg dozės į veną. Gerai jungiasi su kraujo plazmos baltymais 86 – 95 proc., daugiausia su albuminais, šiek tiek maţiaus su α1 – glikoproteinais. Nėra tikslių duomenų ar vaistas patenka į motinos pieną. Pusperiodis –

plazmoje nuo 2 iki 11 valandų, vidurkis 2,4 valandos. Pastebėta, kad eliminacijos pusperiodis yra ilgesnis moterims, nei vyrams, tačiau kliniškai tai yra nesvarbu. Esant inkstų nepakankamumui, eliminacijos pusperiodis pailgėja iki 5,7 ar 6,1 valandos. [7; 37]

Fluoksetino hidrochloridas iš virškinamojo trakto yra lengvai absorbuojamas. Vaisto

biopasisavinimas nėra aukštas, nes absorbuojama maţdaug 60 – 80 proc. medţiagos. [30] Maistas neįtakoja sisteminio vaisto biopasisavinimo. [50] Terapinė fluoksetino koncentracija serume 0,15 – 0,5 mg/l ir 0,1 – 0,5 mg/l norfluoksetino (pagrindinio fluoksetino metabolito) (1 lentelė) [7]. Literatūroje rasti duomenys apie atliktą tyrimą, norint nustatyti vaisto koncentracijos kraujo plazmoje priklausomybę nuo suvartotos preparato dozės. 12 pacientų gavo fluoksetino hidrochlorido nuo 20 iki 80 mg per dieną. Gauti tokie rezultatai: plazmos koncentracija 48,7; 142; 199,2; 208,7 µg/l atitinka suvartotas vaisto dozes 20, 40, 60 ir 80 mg. [16] 2007 metais Oklahomoje buvo atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta, kokiuose organuose ir organizmo skysčiuose daugiausiai kaupiasi fluoksetinas ir jo metabolitas. Buvo ištirti pomirtiniai organai ir organizmo skysčiai dešimties ţmonių, kurie reguliariai vartojo fluoksetino preparatus terapinėmis dozėmis. Gauti rezultatai: daugiausiai antidepresanto nustatyta plaučiuose

(pasiskirstymo koeficientas 60 ±17), kepenyse (38 ± 10), bluţnyje (20 ± 5), smegenyse (15 ± 3), širdyje (10 ± 2), inkstuose (9 ± 3). Maţiausiai nustatyta šlapime (0,9 ± 0,4), stiklakūnyje (0,1 ± 0,03). Kraujyje nustatyta fluoksetino koncentracija nuo 21 iki 1480 ng/ ml. [28] Nustatyta, kad fluoksetinas ir jo metabolitas patenka į motinos pieną, aptinkama nuo 20 iki 30 proc. plazmos koncentracijos. Preparatas jungiasi su plazmos baltymais (94,5 proc.), daugiausiai albuminais ir plazmos proteinais. [30]

1 lentelė. Vaistų terapinės, toksinės ir mirtinos dozės kraujo plazmoje Preparatas

Vaisto koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) _Pusperiodis

(val.) Šaltinis Terapinė Toksinė Mirtina

Buspironas 0,005 – 0,01 neţinoma neţinoma 2 – 3 [43] Fluoksetinas

0,16 – 0,5 1 1,3 – 6,8 96 - 144 [43; 51]

1.5 Buspirono ir fluoksetino metabolizmas bei eliminacija

Buspirono hidrochloridas yra metabolizuojamas kepenyse. Greičiausiai metabolizmą katalizuoja

kepenų fermento citochromo CYP450 3A4 izoforma. Daugelis metabolitų yra neaktyvūs, išskyrus oksidacinio dealkilinimo produktą 1-(2-pirimidinil)-piperaziną. Jis pasiţymi anksiolitiniu poveikiu ir turi maţdaug nuo 20 iki 25 proc. pirminio vaisto aktyvumo. Pusperiodis panašus į buspirono – apie 2 valandas. Svarbesnis metabolitas yra 5- hidroksibuspironas, kuris gali būti oksiduojamas į daug kitų metabolitų bei konjugatų su gliukurono rūgštimi. Buspironas ir jo metabolitai šalinami daugiausiai su šlapimu (29 – 63 proc.) ir išmatomis (18 – 38 proc.). Nepakitusio vaisto yra šalinama maţiau nei 1 proc. Negalima pašalinti hemodializės būdu. [7; 18]

Fluoksetino hidrochloridas greitai metabolizuojamas kepenyse, pirminis ir pagrindinis jo

metabolitas – norfluoksetinas, gaunamas N-demetilinimo reakcijos metu. Preparatą metabolizuoja citochromo P450 fermentai CYP2D6, manoma, kad metabolizmui įtakos turi šie fermentai: CYP2C19 ir CYP2C9. [34] Toliau vykstant O – dealkilinimui, gaunami metabolitai p – trifluorometilfenolis ir hipūro rūgštis, kurie yra šalinami iš organizmo. Daugiausia – net 80 proc. - metabolitų yra šalinama su šlapimu ir tik 15 proc. su išmatomis. Nepakitusio vaisto šalinama maţiau nei 10 proc. Fluoksetino pusperiodis 4 – 6 dienos, norfloksetino nuo 4 iki 16 dienų. Kitų autorių duomenimis fluoksetino 2 – 3 dienos, norfluoksetino

7 – 9 dienos. Dėl ilgo pusperiodţio preparatas yra linkęs kauptis organizme ir gali sukelti apsinuodijimus ar mirtį. [7; 37]

1.6 Buspirono ir fluoksetino terapinis poveikis

Buspirono hidrochlorido tikslus veikimo mechanizmas nėra ţinomas. Buspironas yra dalinis

serotonino presinapsinių ir postsinapsinių receptorių (5-HT1A) agonistas. Taip pat gali jungtis prie D2

-dopamino receptorių. Nustatyta, kad preparatas atrankiai blokuoja presinapsinės membranos -dopamino receptorius. Lyginant su kitais anksiolitikais (pvz., benzodiazepinais), buspironas nesijungia prie gama-aminosviesto rūgšties (GASRA) receptorių ir neturi traukulius slopinančio bei raumenis atpalaiduojančio

poveikio. Buspirono preparatais gydomas nerimas ir su nerimu susijusi depresija. [4; 14]

Fluoksetino hidrochloridas priklauso selektyvių serotonino reabsorbcijos inhitorių (SSRI) grupei.

SSRI sukelia selektyvų poveikį atgaliniam serotonino įsiurbimui, tokiu būdu padidinama serotonino koncentracija sinapsiniame plyšyje bei grįţtamuoju ryšiu aktyvina presinapsinius serotonino receptorius. Fluoksetinas neveikia muskarino, dopamino, histamino ir adrenerginių receptorių. Tai sąlygoja maţiau šalutinių poveikių, lyginant su tricikliais antidepresantais (CNS aktyvinimas, mieguistumas, kardiotoksiškumas). Fluoksetinas vartojamas didţiosios depresijos epizodui ir jo profilaktikai gydyti bei kitiems sutrikimams (pvz. obsesinis – kompulsinis sutrikimas). Taip pat skiriamas nervinei bulimijai gydyti, nes padeda maţinti kūno svorį. [30]

1.7 Buspirono ir fluoksetino gydomosios dozės

Optimali buspirono hidrochlorido dozė yra 15 – 30 mg per dieną. Dienos dozė neturėtų viršyti 45 mg. Gydymas pradedamas nuo 5 mg tris kartus per dieną. Jei nepasiekiamas anksiolitinis poveikis, dozė yra didinama. [18] Senyvo amţiaus pacientams terapinė dozė turėtų neviršyti 15 mg per parą. Esant inkstų ir kepenų funkcijos nepakankamumui, dozę reikia maţinti. [2]

Fluoksetino hidrochloridas vartojamas per os. Pradinė vaisto dozė depresijai ir obsesiniam –

kompulsiniam sutrikimui gydyti yra 20 mg per parą, prireikus dozė gali būti didinama iki 80 mg per parą (didţiausia paros dozė). Nervinei bulimijai gydyti skiriama 20 mg per parą, jei reikia, didinama iki 60 mg per parą. Senyviems pacientams, sergant inkstų ir kepenų funkcijos nepakankamumu, preparato dozę reikia maţinti arba neskirti. [2]

1.8 Buspirono ir fluoksetino toksiškumas

Buspirono hidrochlorido letalinė dozė ţmogaus organizmui yra neţinoma. Buspirono LD50 dozė

pelėms 196 mg/kg, šunims 586 mg/kg, beţdţionėms 356 mg/kg. Literatūroje yra aprašyti perdozavimo buspironu atvejai, daţniausiai pacientai visiškai pasveikdavo, mirties atvejų nėra uţfiksuota. Klinikinių studijų metu su sveikais pacientais pastebėti šie negalavimai: pykinimas, vėmimas, galvos svaigimas, mieguistumas, miozė, virškinamojo trakto negalavimai, pavartojus 375 mg buspirono hidrochlorido per parą. Apsinuodijus daţniausiai plaunamas skrandis ir taikomos kitos priemonės simptomams lengvinti. [37]

Tiksli mirtina fluoksetino hidrochlorido dozė yra neţinoma. Nustatyta, kad per os pavartoto vaisto LD50 pelėms yra 452 mg/kg. Manoma, kad mirtina fluoksetino hidrochlorido koncentracija kraujyje

yra nuo 1,3 iki 6,8 mg/l, norfluoksetino – 0,9 – 5,0 mg/l. Pagrindinės fluoksetino hidrochlorido toksinio poveikio prieţastys: ilgas pusperiodis, genetinis citochromo P450 izofermento CYP2D6 trūkumas. [37] Buvo atliktas tyrimas ir nustatyta izofermento CYP2D6 trūkumo įtaka fluoksetino farmakokinetikai. Įrodyta, kad pacientams, kurių izofermento CYP2D6 aktyvumas yra maţesnis, 46 proc. padidėja plazmos koncentracija ir 113 proc. padidėja eliminacijos pusperiodis. [34] Tai reiškia, kad pailgėja farmakokinetikos laikas ir padidėja pacientų apsinuodijimo tikimybė.

Daţniausiai pastebimi šalutiniai fluoksetino poveikiai susiję su virškinamojo trakto negalavimais: pykinimas (pasireiškia 20 – 30 proc. pacientų), diarėja (11 – 18 proc. vaistą vartojusių pacientų). Taip pat daţni širdies ir kraujagyslių funkcijų sutrikimai (besimptomė aritmija arba net širdies sustojimas), kvėpavimo funkcijos sutrikimai, CNS dirginimo poţymiai (susijaudinimas). Ūminis vaisto perdozavimas pasireiškia: nistagmu, mieguistumu, koma, dilgėline, savaiminiu vėmimu ir ST-segmento sumaţėjimu kardiogramoje. Pykinimas ir vėmimas daţniausiai pasireiškia, kai suvartojama didelė vienkartinė vaisto dozė. [20; 30; 37] Nėra specifinio priešnuodţio, netaikoma diurezė, dializė, kraujo perpylimas. Gydoma bendrosiomis simptominėmis priemonėmis. [20]

1.9 Buspirono ir fluoksetino sąveika

Fluoksetinas yra SSRI, todėl vartojant su kitais vaistais, didinančiais serotonino kiekį (pvz. buspironas, tricikliai antidepresantai, MAO inhibitoriai) gali pasireikšti serotoninis sindromas. Serotoninis sindromas – tai nepageidaujamos reakcijos, atsirandančios dėl vaistų tarpusavio sąveikos, kuri padidina serotonino kiekį. Daţniausiai pasireiškia tokiais simptomais: raumenų rigidiškumu, hipertermija, midriaze, prakaitavimu, traukuliais (toniniais, miokloniniais), širdies ir kraujagyslių sistemos nestabilumu

(tachikardija), stipriu CNS sistemos aktyvinimu, koordinacijos praradimu. Būklė pavojinga gyvybei ir gali būti mirtina. [12] Serotonino sindromas gydomas ligoninėje, naudojami preparatai: benzodiazepinai (kontroliuoti raumenų hiperaktyvumą), propranololis, ciproheptadinas. [11] Kitų autorių duomenimis, galima gydyti mirtazepinu. [25]

Literatūroje minimi klinikiniai atvejai, kai fluoksetino sąveika su kitais preparatais sukelia serotoninerginį sindromą. 50 metų vyras kreipėsi į ligoninę dėl staiga atsiradusių simptomų: prakaitavimas, pykinimas, vėmimas, diarėja. Vienas iš vartojamų vaistų – fluoksetinas, kurio dozė buvo padidinta. Nustatytas serotoninis sindromas. [11] Kalifornijos medicinos universiteto greitosios pagalbos skyriuje uţfiksuotas buspirono ir fluoksetino sąveikos atvejis. Atveţta praradusi sąmonę pacientė, nustatyta tachikardija, padidėjusi kūno temperatūra, pulsas. Pagrindinis vartojamas vaistas – buspironas ir išgerta 70 kapsulių fluoksetino po 20 mg (iš viso 1400 mg). Diagnozuotas stiprus apsinuodijimas ir medikamentų tarpusavio sąveika. [49]

1.10 Vaistinių medţiagų nustatymo biologinėse terpėse metodai

Įtarus apsinuodijimą medikamentais, svarbu skubiai ir tiksliai nustatyti toksinį poveikį sukėlusias medţiagas. Toksikologinėje ir teismo medicinoje tiriamos įvairios biologinės terpės (kraujas, plazma, šlapimas) ir organai (kepenys, smegenys, inkstai). Apsinuodijus buspironu, daţniausiai analizuojama kraujo plazma, serumas ir šlapimas. Fluoksetinas gali būti nustatomas kraujyje, plazmoje, serume, šlapime, tulţyje, piene, skrandţio turinyje, smegenyse, plaukuose, inkstuose, kepenyse, plaučiuose ir raumenyse. Pirmas toksinės medţiagos nustatymo etapas – analitės išskyrimas iš biologinių terpių, pasirinktu ekstrakcijos metodu. Ekstrakcijos metu mėginys išvalomas ir sukoncentruojamas. Tokiu būdu padidėja analizės jautrumas ir efektyvumas. [7] Straipsnių analizė rodo, kad antidepresantų ekstrakcijai daţniausiai naudojama skysčių – skysčių ekstrakcijai (SSE), [17] kietafazė ekstrakcija (KFE) [8; 22; 23; 29] ir kietafazė mikroekstrakcija (KFME) [46]. Buspirono ir fluoksetino analizei gali būti taikomi plonasluoksnės chromatografijos, skysčių arba dujų chromatografijos metodai su masių ar ultravioletinės (UV) spektrometrijos detektoriais.

1.11 Mėginio paruošimas prieš ekstrakciją

Biologiniai mėginiai (pvz. kraujas ar kraujo plazma) turi daug baltymų, kurie neigiamai įtakoja ekstrakcijos išgavą. Naudojant kietos fazės ekstrakciją, kraujo plazmos baltymai gali sumaţinti metodo atrankumą, nes didelės baltymų molekulės įsiskverbia į sorbento poras ir jas uţkemša. [52] Taip pat

susiformuoja emulsijos, kurios sumaţina skysčių-skysčių ekstrakcijos efektyvumą. Todėl svarbu nusodinti kraujo baltymus prieš mėginio ekstrakciją. [21]

Baltymų nusodinimui naudojami poliniai tirpikliai: acetonitrilas, metanolis arba acetonas. [33] Organinis tirpiklis pasirenkamas pagal tai, koks analizės metodas toliau bus naudojamas. Jei medţiagos bus analizuojamos dujų chromatografijos metodu, baltymai nusodinami metanoliu arba acetonu, jei analizei bus naudojama efektyvioji skysčių chromatografija, tai labiausiai tinka acetonitrilas. [7] Baltymų nusodinimą galima atlikti naudojant rūgštis ir neorganines druskas. Daţniausiai literatūroje minimos rūgštys: vandenilio chlorido, fosforo, perchlorato, trichloretano, metano rūgštis ir druskos: amonio sulfatas, natrio sulfatas, cinko sulfatas ar vario sulfatas. Biologinis mėginys sumaišomas, centrifuguojamas ir atskiriamas nuo nusodintų baltymų. Tačiau išlieka rizika, kad analitės kiekis gali sumaţėti dėl adsorbcijos. [7; 21; 33]

Mėginio paruošimui galima taikyti ir fermentinį baltymų suskaidymą, naudojant pepsiną, tripsiną, enterokinazę, lipazę arba β – gliukuronidazę bei mechaninį nusodinimą ultragarsu ir temperatūra. [7]

Atliktas tyrimas, kurio tikslas nustatyti metodą, geriausiai tinkantį nusodinti baltymus kraujo plazmos mėginyje. Palyginti šie metodai: mechaninis nusodinimas ultragarsu, organiniai tirpikliai (metanolis ir acetonitrilas), glicino hidrochlorido buferis, fosforo rūgštis ir mėginio praskiedimas. Gauti rezultatai rodo, kad geriausiai baltymus nusodina glicino hidrochlorido buferinis tirpalas ir fosforo rūgštis. [52] Lenkijos mokslininkai atliko tyrimą, kurio tikslas nustatyti geriausią baltymų nusodinimo metodą, prieš atliekant mėginio kietafazę ekstrakciją. Palygintos penkios kraujo baltymų nusodinimo metodikos:

1. Praskiedţiama distiliuotu vandeniu (1:1, v/v);

2. Įpilama 2 ml distiliuoto vandens ir 1,0 ml 1 M NaHCO3;

3. Rūgštinama su 20,0 l 85 proc. H3PO4;

4. Maišoma ultragarsu 15 min., tuomet dedama 6 ml fosfatinio buferio pH 6,0 ir centrifuguojama; 5. Baltymai nusodinami su 2 ml acetonitrilo, centrifuguojama, gautas supernatantas nugarinamas azoto srove 40 ºC temperatūroje, sausi likučiai tirpinami 6 ml fosfatinio buferio pH 6.

Pastebėta, kad geriausi rezultatai ir švariausi ekstraktai gauti, naudojant baltymų nusodinimą acetonitrilu arba parūgštinimą fosfato rūgštimi. [35]

1.12 Skysčių – skysčių ekstrakcija

Skysčių – skysčių (SSE) ekstrakcijos metodas gali būti taikomas neturintiems baltymų (pvz. šlapimas) ar turintiems nedaug baltymų, tokiems kaip kraujo plazma, serumas, mėginiams ekstrahuoti.

Ekstrakcijos metu analitės pasiskirsto tarp dviejų tarpusavyje nesimaišančių skysčių. Tai daţniausiai yra vanduo ir organinis tirpiklis, kuriame gerai tirpsta analitės. [39] Analičių tirpumas priklauso nuo terpės pH, kuri keičiama, atsiţvelgiant į tiriamosios medţiagos pKa reikšmę. Norint padidinti ekstrakcijos efektyvumą, dalomasis piltuvas yra purtomas, o ekstrakcija atliekama kelis kartus iš eilės, maţomis tirpiklio porcijomis. [7] Skysčių ekstrakcija apibūdinamas kaip nebrangus, greitas metodas, tačiau sunaudojami dideli tirpiklių kiekiai, susiformuoja emulsijos, kurios pablogina ekstrakcijos išgavą.

1.12.1 Ekstrakcijai naudojami tirpikliai

Norint, kad ekstrakcija būtų efektyvi, svarbu parinkti tinkamą organinį tirpiklį. Reikia atsiţvelgti į tirpiklių tirpumą, maišumą ir tankį. Visos analitės turi lengvai tirpti tirpikliuose, pvz., hidrochloridai geriausiai tirpsta trichlormetane, dichlormetane ir chlorbutane. Taip pat ekstrahentas turi būti saugus ir netoksiškas. Toksikologinėje analizėje daţniausiai naudojami ir literatūroje minimi tirpikliai: chlorbutanas, etilacetatas, heksanas, dichlormetanas, chloroformas, eteris. [7] Grupė mokslininkų skirtingose laboratorijose nustatinėjo skysčių – skysčių ekstrakcijos iš biologinių terpių su 1 – chlorbutanu efektyvumą. SSE atlikta su 333 įvairių rūšių vaistais, kurie daţniausiai pasitaiko klinikinėje ar teismo medicinoje. Nustatyta, kad 228 vaistų (68 proc.) ekstrakcijos 1 – chlorbutanu išgava yra didesnė nei 80 proc. Buspirono ekstrakcijos išgava 95 proc., o fluoksetino – 80 proc. [17]

Švedijoje atlikto tyrimo metu buvo optimizuotos skysčių ekstrakcijos sąlygos, lyginant trijų rūšių organinius tirpiklius (butilacetatas, toluenas, metil-t-butileteris). Atlikta septynių antipsichotinių vaistų ekstrakcija iš kraujo plazmos (vienas iš jų – buspironas). Gauti rezultatai rodo, kad SSE geriausia su metil-t-butileteriu, išgava siekia 60 – 111 proc. [42]

2009 m. atliktas tyrimas, kurio metu buvo lyginamas skysčių – skysčių ekstrakcijos ir kietafazės ekstrakcijos (KFE) metodai. Ekstrakcijos efektyvumas įvertintas pagal junginių aptikimo ribą biologiniame mėginyje. Ekstrakcija atlikta 122 skirtingiems vaistams (antidepresantams paroksetinui, fluoksetinui). SSE ekstrahentu naudotas chlorbutanas. KFE atlikta naudojant Clean Screen DAU ekstrakcijos kolonėlę. Rūgštiniai ir neutralūs vaistai eliuuojami 3 ml heksano – etilo acetato mišiniu (50:50), o bazinių savybių vaistai – švieţiai pagamintu metileno chlorido-izopropanolio-amonio hidroksido mišiniu (78:20:2). Remiantis tyrimo duomenimis galima teigti, kad 41 preparatui taikytini abu ekstrakcijos metodai. Iš jų net 16 vaistinių medţiagų (39 proc.) ţemiausia aptikimo riba nustatoma KFE metodu. Taip pat pastebėta, kad KFE yra patogesnis ir greitesnis metodas, tačiau sunaudojama daugiau medţiagų, kurios yra brangesnės. [29] Apibendrinus rezultatus, galima teigti, kad KFE yra jautresnis metodas, lyginant su tradicine skysčių – skysčių ekstrakcija.

1.13 Kietos fazės ekstrakcija

Tai metodas, pagrįstas analitės pasiskirstymu tarp skystos fazės (pvz. biologinio mėginio) ir kietos fazės (sorbento). Absorbuota analitė yra išplaunama (desorbuojama) pasirinktu tirpikliu (eliuentu). Pagrindiniai kietafazės ekstrakcijos etapai: sorbento kondicionavimas (aktyvavimas), biologinio mėginio su analitėmis įleidimas, nepageidaujamų matricos komponentų (pvz. baltymų) išplovimas, analitės desorbcija pasirinktu eliuentu. KFE efektyvumas priklauso nuo tinkamo sorbento ir eliuento pasirinkimo. [7; 33; 48; 53]

1.13.1 Sorbentai

Tinkamas sorbentas uţtikrina tikslius ir patikimus kietafazės ekstrakcijos rezultatus. Populiariausi ir daţniausiai naudojami sorbentai yra modifikuoto silikagelio. Kovalentiniais ryšiais prijungus nepolinius ligandus prie silikagelio silanolinių grupių, gaunami hidrofobinių savybių atvirkštinių fazių sorbentai (C8, C18). Šie sorbentai sąveikauja su poliniu mėginiu (matrica), analitės sulaikomos, veikiant van der Valso jėgoms. O prie silanolinių grupių prijungus jonines grupes (ketvirtiniai aminai, sulfo rūgštys, karboksirūgštys) gaunami jonų mainų sorbentai. [24] Atvirkštinių fazių sorbentai yra stabilūs ribotame pH intervale (1 – 8,5), tai sumaţina pritaikymo galimybes. Taip pat turi laisvas silanolines grupes, kurios gali adsorbuoti jonizuotis linkusias analites ir tokiu būdu sumaţinti ekstrakcijos išgavą. [47]

Biologinių mėginių ekstrakcijai daţnai naudojami nauji lipofiliniai – hidrofiliniai sorbentai (pvz. Oasis HLB). [24; 22; 41] Jie veikia kaip atvirkštinių fazių kolonėlės, tačiau turi polimerinių grupių. Šie sorbentai apibūdinami kaip universalūs, tinkantys šarminių, rūgštinių ir neutralių analičių ekstrakcijai. Pagrindiniai privalumai: platus pH intervalas (1 – 14), neturi laisvų silanolinių grupių ir dţiovinimo laikas neįtakoja ekstrakcijos išgavos. [22; 37]

Pasirenkant sorbentą, atsiţvelgiama į analitės savybes, mėginio prigimtį (biologinė terpė ar vandeninis tirpalas), priemaišas ir analizės metodą, kuris bus naudojamas po ekstrakcijos. [31] Straipsnių analizė rodo, kad vaistų ekstrakcijai iš biologinių terpių daţniausiai naudojami atvirkštinių fazių (Oasis HLB; Bond Elut C18), jonų mainų ir maišytų metodų sorbentai (Bond Elut Certify; Strata XC). (3 lentelė)

[41; 48; 52] Jei kiekybinė ir kokybinė medţiagų sudėtis įvertinama ESC metodu, tai ekstrakcijai pasirenkamas atvirkštinių fazių sorbentas. [53] Atlikto tyrimo duomenimis, šis sorbentas sugeria daugiau vandens, todėl DC netinka. Dujų chromatografijai daţniau naudojami jonų mainų sorbentai. [52]

Antidepresantų KFE naudojami sorbentai, kurių masė yra nuo 30 iki 500 mg, o įleidţiamo mėginio tūris atitinkamai didėja nuo 0,5 ml iki 4 ml. [48] Ekstrakcijos išgava priklauso ir nuo tirpalo

tekėjimo greičio. Jis turi būti optimalus, kad medţiagos spėtų adsorbuotis. Įvairių autorių duomenimis, ekstrakcijos tėkmės greitis gali būti 1 – 2 ml/min. [23; 44] Bakali ir bendraautoriai nustatė optimaliausią ekstrakto tekėjimo greitį, išskiriant antidepresantų mišinį iš kraujo plazmos. Gauti rezultatai rodo, kad esktrakcijos išgava beveik nekinta, kai tirpalo tekėjimo greitis yra 0,5 – 1 ml/min. Jei tekėjimo greitis didinamas nuo 1 iki 2 ml/min, ekstrakcijos išgava pradeda maţėti. Optimaliu skysčio tekėjimo greičiu pasirinktas 1 ml/min, kuris buvo naudojamas tolesniam metodo optimizavimui. [9]

1.13.2 Tirpikliai

Pirmas ekstrakcijos etapas yra sorbento aktyvavimas (kondicionavimas). Tirpiklis parenkamas pagal analites, esančias biologiniame mėginyje. Naudojami tirpikliai, kurie poliškumu atitinka vaistines medţiagas. Atvirkštinių fazių ir jonų mainų sorbentai daţniausiai sudrėkinami 1 ml metanolio ir 1 ml vandens. [33; 48]

Ekstrakto išgryninimui (pašalinių medţiagų ir baltymų išplovimui iš sorbento) svarbu parinkti tinkamą praplovimo tirpalą. Atvirkštinių fazių sorbentui tinka 5 – 50 proc. koncentracijos organinis tirpiklis. Daţniausiai naudojamas praskiestas 5 - 10 proc. metanolio tirpalas, tačiau tinka ir kiti poliniai organiniai tirpikliai. Jonų mainų sorbentas plaunamas nedidelės joninės jėgos buferiniais tirpalais (pvz. kalio fosfato). [33; 48]

Svarbiausias etapas yra analitės desorbcija iš sorbento, todėl reikia pasirinkti tinkamą eliuentą. Pagrindinės organinių tirpiklių savybės, kurios gali įtakoti eliucijos efektyvumą: poliškumas, eliucijos stiprumas ir klampumas (2 lentelė).

Tirpiklis turi ištirpinti kuo daugiau tiriamųjų vaistinių ir kuo maţiau pašalinių medţiagų, kad būtų pasiekta maksimali ekstrakcijos išgava. [39] Gali būti naudojamas grynas organinis tirpiklis, praskiestas su vandeniu, parūgštintas arba pašarmintas. [48] Grupė mokslininkų optimizavo 5 antidepresantų mišinio (trazodonas, doksepinas, desipraminas, maprotilinas, imipraminas) KFE sąlygas. Nustatyta optimaliausia eliuento (metanolio) koncentracija (70 proc.) šių vaistų desorbcijai iš sorbento. Prasčiausia ekstrakcijos išgava gauta, eliuuojant 30 proc. metanoliniu tirpalu, todėl jis vėliau naudotas kaip praplovimo tirpiklis. [9]

Sumaišius tirpiklius, galima padidinti ekstrakcijos išgavą. Lenkijos mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu nustatinėjo optimaliausias KFE sąlygas triciklinių antidepresantų mišinio (amitriptilinas, nortriptilinas, doksepinas, nordoksepinas, imipraminas, despraminas) išskyrimui iš biologinių skysčių. Pasirinkti 5 skirtingi eliuentai : 0,6 proc. dietileteris metanolyje, metanolis, chloroformo : 2-propanolio (9:1,v/v) mišinys, 2 proc. amoniakinio etilo acetato. Palyginus gautus rezultatus nustatyta, kad geresnė

ekstrakcijos išgava gaunama naudojant chloroformo : 2-propanolio (9:1,v/v) mišinį, lyginant su grynu metanoliu. [35] Grupė mokslinikų pritaikė organinių tirpiklių mišinį (dichlormetanas : izopropanolis : amonio hidroksidas (78 : 14 : 8) antidepresantų mišinio (fluvoksaminas, mianserinas, doksepinas, citalopramas, paroksetinas, etoperidonas) ekstrakcijai iš kraujo. [36]

2 lentelė. Dažniausiai KFE naudojamų organinių tirpiklių savybės, šaltinis [39;48] Organinis tirpiklis Poliškumo indeksas Eliucijos stiprumas (Ɛ0)

Klampumas Santykinė eliucijos jėga (sorbentas – atvirkštinių fazių) Santykinė eliucijos jėga (sorbentas – normalių fazių) Heksanas Heptanas Cikloheksanas Toluenas Benzenas Chloroformas Dichlormetanas Dietileteris Dioksanas Acetonas Etilacetatas Acetonitrilas Izopropanolis Etanolis Metanolis Vanduo 0,06 0,2 0,0 2,4 3,0 4,4 3,4 2,9 - 5,4 4,3 6,2 4,3 - 6,6 10,2 0,0 0,0 0,03 0,22 0,27 0,31 0,32 0,38 0,49 0,43 0,45 0,5 0,73 0,7 0,73 >0,73 0,33 - 1,0 0,59 0,65 0,57 0,44 0,23 1,54 0,32 0,45 0,37 2,3 1,2 0,6 1,0

Eliuento pasirinkimą įtakoja analitės tirpumas jame ir pasirinkta KFE kolonėlė. Dirbant su atvirkštinių fazių sorbentu, naudojami poliniai organiniai tirpikliai: metanolis, propanolis, acetonitrilas, trifluoracto rūgštis, acetonas ar etilo acetatas bei nepoliniai – heksanas ir dichlormetanas. [48] Laisvos silanolinės grupės gali adsorbuoti polines analites ir sumaţinti ekstrakcijos efektyvumą. Dėl šios prieţasties siūloma desorbuoti parūgštintu arba pašarmintu organiniu tirpikliu, tokiu būdu padidinant ekstrakcijos išgavą. [9]

Remiantis literatūros analize, buvo atlikta KFE metodikų, taikomų buspirono ir fluoksetino išskyrimui iš kraujo plazmos, apţvalga (3 lentelė).

3 lentelė. Buspironui ir fluoksetinui taikytų KFE metodikų apžvalga KFE

sorbentas Eliuentas Analizės metodas

Antidepresantai

Išgava ± SSN proc. Šaltinis

Bond Elut C18 Acetonitrilas : 25 proc. NH4OH (99:1) ESC Buspironas 89,3 ± 4 [8] Oasis HLB

2 proc. etano rūgštis : metanolis (1:9) ESC – MS Fluoksetinas 87,1 [23] Oasis HLB

Metanolis ESC – MS Fluoksetinas

91,6 ± 4,9 [22] Clean Screen DAU Dichlormetanas: izopropanolis: amonio hidroksidas (78:20:2) DC - MS Fluoksetinas – [29]

1.14 Kietafazė mikroekstrakcija (KFME)

Vienas iš naujesnių metodų, taikomų antidepresantų ekstrakcijai, yra kietafazė mikroekstrakcija (KFME). Ekstrakcija pagrįsta analičių pasiskirstymu tarp silicio vamzdelio, padengto poliakrilu ar polidimetilsiloksanu, ir mėginio su vaistinėmis medţiagomis. Ekstrakcija gali būti taikoma lakiems ir nelakiems junginiams bei derinama su dujų chromatografija. Efektyvumą labiausiai įtakoja temperatūra, terpės pH ir ekstrakcijos trukmė. [47] Silva ir bendraautoriai optimizavo 5 antidepresantų (mirtazapino, citalopramo, paroksetino, fluoksetino ir sertralino) KFME sąlygas iš kraujo plazmos. Apibendrinus rezultatus matyti, kad ekstrakcija efektyviausia, kai mėginio pH 9. Visų antidepresantų ekstrakcijos efektyvumas didėjo, ilgėjant trukmei nuo 15 iki 60 min., išskyrus citalopramo, kurio ekstrakcija blogėjo po 45 minutės. Analitės geriausiai ekstrahavosi 60 ºC temperatūroje, o prasčiausiai 15 ºC temperatūroje. Analizuotų antidepresantų nustatymo riba yra 25 – 50 ng/ml, o variacijos koeficientas maţesnis nei 5 proc. [46] Remiantis autorių duomenimis, KFME yra jautrus metodas, leidţiantis nustatyti terapines ir toksines vaisto dozes kraujo plazmoje.

1.15 Vaistų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) – tai fiziko-cheminis analizės metodas, kurio metu mėginio komponentai pasiskirsto tarp judriosios ir nejudriosios fazės. Gali būti taikoma kokybiniam ir kiekybiniam vaistinių medţiagų nustatymui biologinėse terpėse. ESC privalumai: atrankus ir jautrus junginių nustatymas, galimybė išvalyti ir sukoncentruoti mėginį. Chromatografinės sistemos ir detektoriai turi būti parenkami taip, kad kuo labiau sutrumpėtų analizės laikas. Jei vaisto koncentracija labai maţa (pvz., terapinės vaisto dozės nustatymas), reikalingi jautrūs ir specifiški detektoriai (UV absorbcijos ir fluorescencijos). Vaistinių medţiagų analizei daţniausiai naudojamos atvirkščių fazių kolonėlės, kuriose silikagelis yra chemiškai sujungtas su ligandais. Judriosios fazės sudėtis parenkama tokia, kad galėtų atskirti kuo daugiau skirtingų organinių medţiagų. Daţniausiai naudojamas buferinio tirpalo ir acetonitrilo mišinys. Eliuento sudėtis ir santykis gali būti keičiamas chromatografavimo metu, tokiu būdu pagerinant junginių atskyrimą. [3; 7]

Remiantis literatūros šaltiniais, buvo atlikta ESC metodikų, taikomų buspirono ir fluoksetino identifikavimui ir kiekio nustatymui, apţvalga (4 lentelė).

4 lentelė. Buspironui ir fluoksetinui taikytų ESC metodų apžvalga

Preparatas Kolonėlė Judrioji fazė Tėkmės

greitis Detektorius Kiekybinio nustatymo riba Šaltinis Buspironas Ultrasphere C18

Kalio fosfato buferis : acetonitrilo ir metanolio mišinys (13:17) 1,4 nl/min UV λ=244 λ=210 2,5 ng/µl [31] Fluoksetinas Chiralced OD-R Natrio fosfatas : acetonitrilas (75 : 25) 1 ml/min Fluorescencijos (λex=230 nm, λem = 290 nm) 10 µg/l [45] Fluoksetinas LiChrosphe re 60 RP 0,05 mol/l fosfatinis buferis : acetonitrilas (57 : 43) 1 ml/min UV λ=230 nm 25 µg/l [13] Fluoksetinas Symmetry C18 Amonio skruzdţių rūgšties druska (pH 4) : acetonitrilas (70:30) 1,2 ml/min UV λ=230 - [32]

1.16 Analizės metodo įteisinimas

Analizės metodo įteisinimas (validacija) – tai metodo patvirtinimo procesas, kurio metu nustatoma, ar parametrai pasirinkti teisingai, ar metodas yra tinkamas tiriamosios medţiagos analizei atlikti. Pagrindinis metodo įteisinimo tikslas yra gauti patikimus, nuoseklius ir tikslius rezultatus. Rezultatai, kurie gaunami metodikos įteisinimo metu, gali būti naudojami, įvertinant tiriamųjų medţiagų kokybę, patikimumą. Analizės metodika privalo būti validuojama, patikrinama arba revaliduojama, kai: sukuriama nauja metodika, perkeliama į kitą laboratoriją arba kai pakeičiami analizės metodo parametrai. [27; 38] Daţniausiai įvertinami validacijos parametrai:

 Analitės nustatymo tikslumas (angl. Accuracy) – tai gautų rezultatų artumas tarp nustatytosios ir tikrosios vertės.

 Metodikos rezultatų glaudumas (angl. Precision) – tai rezultatų artumas, kuris gaunamas kelis kartus analizuojant tą patį tiriamąjį mėginį vienodomis sąlygomis. Glaudumas gali būti įvertinamas 3 lygiais: pakartojamumu (angl. Repeatability), tarpiniu preciziškumu (angl. Intermediate Precision), atkuriamumu (angl. Reproducibility). Analitinių procedūrų glaudumas daţniausiai išreiškiamas dispersija, standartiniu nuokrypiu arba variacijos koeficientu (SSN proc.), kuris turi neviršyti 5 proc. Pakartojamumui įvertinti eksperimentai atliekami tą pačią dieną, maţiausiai 6 kartus iš eilės, nekeičiant analizės sąlygų. Tarpinis preciziškumas įvertinamas tiriamąją analitę analizuojant skirtingomis dienomis. SSN turi neviršyti 10 proc. ribos. Atkuriamumas nustato metodo tikslumą tarp laboratorijų, įvertinant nuokrypį nuo tikrosios vertės.

 Metodikos specifiškumas (angl. Specificity) – tai yra gebėjimas vienareikšmiškai įvertinti analitės buvimą. Specifiškumas įrodo, kad kiekviena chromatogramoje esanti smailė atitinka po vieną analitę. Įvertinamas priemaišų buvimas, matrica, tirpikliai.

 Tiesiškumas (angl. Linearity) – tai gebėjimas gauti eksperimento rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi tiriamosios medţiagos koncentracijai mėginyje. Daţniausiai įvertinama kalibracinės kreivės metodu, pagaminant 5 skirtingų koncentracijų tirpalus.

 Ribos (angl. Range) – tai intervalas tarp maţiausios ir didţiausios analitės koncentracijos mėginyje, įskaitant ir koncentracijas, kurioms buvo nustatinėjamas tiesiškumas, tikslumas, glaudumas.

 Aptikimo riba (angl. Limit of detection) – tai maţiausias anlitės kiekis, kuris gali būti aptinkamas mėginyje, tačiau kiekybiškai nenustatomas.

 Kiekybinio nustatymo riba (angl. Limit of quantitation) – tai maţiausia analitės koncentracija mėginyje, kuri gali būti nustatoma kiekybiškai. [26; 27]

2

TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – kraujo plazma su vaistinių medţiagų mišiniu (buspirono hidrochloridas ir fluoksetino hidrochloridas).

Kraujo mėginiai gauti iš LSMU klinikų Kraujo centro (tyrimui atlikti gautas LSMU Bioetikos centro leidimas Nr. BEC-FF-164 (1 priedas).

2.2

Reagentai

Tyrimui naudoti chemiškai švarūs ir standartinius reikalavimus atitinkantys reagentai:

 Metanolis 99,9 proc. (Sigma – Aldrich, Vokietija),

 Etanolis 96,9 proc. (Stumbras, Kaunas),

 2- propanolis 99,7 proc. (Sigma – Aldrich, Vokietija),

 Trichlormetanas 99,4 (Sigma – Aldrich,Vokietija),

 Dichlormetanas 99,5 proc. (Sigma – Aldrich, Vokietija),

 Etiloacetatas 99,5 proc. (Sigma – Aldrich, Vokietija),

 Acetonitrilas 99,9 proc. (Sigma – Aldrich, Vokietija),

 Amonio hidroksidas 25 proc. (Merck, Vokietija),

 Oksalo rūgštis (Sigma – Aldrich, Vokietija),

 Fosfato rūgštis 85 proc. (Merck, Vokietija).

Efektyviajai skysčių chromatografijai naudoti ESC grynumo eliuentai :

 Trifluoracto rūgštis 98 proc. (Sigma – Aldrich, Šveicarija),

 Acetonitrilas 99,9 proc. (Sigma – Aldrich, Vokietija). Tyrimui naudoti vaistinių medţiagų standartai:

 Buspirono hidrochloridas (Sigma – Aldrich, Kinija),

 Fluoksetino hidrochloridas (Gedeon Richter, Vengrija),

 Vidinis standartas – paroksetino hidrochloridas (Sigma – Aldrich, JAV).

Tyrimui naudotas dejonizuotas vanduo, kuris išgrynintas Millipore vandens ruošimo sistema (Millipore, Bedford, JAV).

2.3 Standartinių tirpalų ruošimas

Ruošti 0,1 mg/ml koncentracijos buspirono hidrochlorido ir fluoksetino hidrochlorido standartų tirpalai. Vaistinės medţiagos ištirpintos 10 ml išgryninto vandens. Vidinio standarto paroksetino hidrochlorido tirpalas gamintas 0,2 mg/ml koncentracijos.

2.4 Tiriamojo tirpalo paruošimas

Ţmogaus kraujo mėginiai centrifuguojami 15 min 4000 rpm ir atskiriama kraujo plazma. Kraujo plazmoje tirpinami tiriamųjų vaistinių medţiagų ir vidinio standarto tirpalai. Buspirono hidrochlorido ir fluoksetino hidrochlorido koncentracija gautame tirpale 0,025 mg/ml, vidinio standarto: paroksetino hidrochlorido – 0,05 mg/ml. Kraujo plazma su ištirpintais preparatais 30 min sonifikuojama ultragarso vonelėje 30 ºC temperatūroje.

2.5 Efektyviosios skysčių chromatografijos sąlygos

Kiekybiniam vaistinių medţiagų nustatymui kraujo plazmoje naudotas skysčių chromatografas „Waters 2690“ bei fotodiodų matricos detektorius „Waters 996 PDA“. Analizė atlikta su ACE C18 kolonėle, kurios ilgis – 250 mm, vidinis diametras – 4,6 mm, sorbento dalelių dydis – 5 µm. Judriosios fazės sudėtis : 0,1 proc. trifluoracto rūgštis ir acetonitrilas. Eliuavimo būdas – gradientinis. Gradiento kitimas pateiktas 5 lentelėje. Judriosios fazės tekėjimo greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris – 10µl. Tiriamųjų junginių detekcija atlikta prie 230 nm bangos ilgio.

5 lentelė. Chromatografijai naudoto eliuento gradiento kitimas Laikas

(min.)

0,1 proc. trifluoracto rūgštis (proc.) Acetonitrilas (proc.) 20 12 88 21 10 90 28 10 90 29 95 5

2.6 Skysčių – skysčių ekstrakcija

3 ml plazmos su tiriamosiomis vaistinėmis medţiagomis perkeliama į dalomąjį piltuvą, rūgštinama 10 proc. oksalo rūgštimi iki rūgštinės terpės. Į dalomąjį piltuvą pilama 5 ml organinio tirpiklio

(trichlormetano arba dichlormetano) ir ekstrahuojama 10 min, lėtai vartant. Atsiskyrus fazėms organinis sluoksnis surenkamas į mėgintuvėlį, o vandeninis paliekamas. Ekstrakcija kartojama 2 kartus, tomis pačiomis sąlygomis. Vandeninė fazė yra šarminama 10 proc. amonio hidroksido tirpalu iki šarminės terpės. Pilami 5 ml to paties organinio tirpiklio (trichlormetano arba dichlormetano) ir ekstrakcija kartojama 2 kartus, tomis pačiomis sąlygomis. Surinkti ekstraktai yra dţiovinami azoto srove 40 ºC temperatūroje. Sausi likučiai vibracinės maišyklės pagalba tirpinami 1 ml acetonitrilo ir mėginiai filtruojami pro filtrą (Roth PVDF, porų dydis 0,22 µm, skersmuo 13 mm) prieš injekuojant į chromatografą.

2.7 Kietos fazės ekstrakcija

Kietos fazės ekstrakcija atlikta su 1 cm3 30 mg Oasis HLB atvirkščių fazių ekstrakcijos kolonėlėmis (Waters, JAV). Kolonėlė kondicionuojama 1 ml metanolio ir 1 ml vandens. Kraujo plazmos baltymai nusodinami rūgštinant fosforo rūgštimi (1 ml mėginio 20 µl fosforo rūgšties). Įleidţiamas 1 ml plazmos mėginio su vaistinėmis medţiagomis. Kolonėlė plaunama 1 ml 5 proc. metanolio tirpalu ir mėginys desorbuojamas pasirinktu organiniu tirpikliu (eliuentu). Tekėjimo greitis 1 lašas per 5 sekundes, vakuuminis slėgis 20 mmHg. Surinktas ekstraktas dţiovinamas azoto srove 40 ºC temperatūroje. Sausi likučiai vibracinės maišyklės pagalba tirpinami 1 ml acetonitrilo ir injekuojami į chromatografą.

2.8 Duomenų apdorojimas

ESC duomenys fiksuoti ir apdoroti naudojant Empower 2 chromatography system programą (Waters Corporation, Milford, JAV). Statistinis duomenų įvertinimas atliktas naudojant IBM SPSS 20 programą. Įvertintas išekstrahuotos medţiagos kiekio vidurkis, paklaida, standartinis nuokrypis ir santykinis standartinis nuokrypis (SSN). Atlikta statistinė dispersinė analizė (ANOVA), išekstrahuotų vaistinių medţiagų kiekių palyginimui, taikytas Turkey kriterijus. Reikšmingumo lygmuo pasirinktas α=0,05, o skirtumas tarp tirpiklių laikytas statistiškai nereikšmingu kai p>0,05. Gautų rezultatų grafiniam vaizdavimui naudota Microsoft Office Excel 2010 programa.

3

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika pasirinkta remiantis anksčiau atliktais mokslininkų tyrimais [1]. Judriosios fazės sudėtis: 0,1 proc. trifluoracto rūgštis ir acetonitrilas, gradiento kitimas pateiktas 6 lentelėje. Tekėjimo greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris – 10 µl, detekcija atlikta prie 230 nm bangos ilgio.

6 lentelė. Chromatografijai naudoto eliuento gradiento kitimas Laikas (min.) 0,1 proc. trifluoracto rūgštis (proc.) Acetonitrilas (proc.) 0 95 5 20 45 55

Chromatogramoje (4 pav.) matome, kad smailės fiksuojamos chromatografinės analizės pabaigoje, kartu su išplautomis balastinėmis medţiagomis, tai trukdo tiksliam tiriamųjų medţiagų identifikavimui. Dėl šios prieţasties ESC sąlygas reikia koreguoti.

4 pav. Vaistų mišinio standartinių tirpalų ESC chromatograma.Skaičiais pažymėtos šių vaistų smailės: 1 – buspirono hidrochloridas, 2 – paroksetino hidrochloridas (vidinis standartas), 3 – fluoksetino

hidrochloridas

Kad analitės chromatogramoje optimaliai atsiskirtų, sudarytas naujas eliuento gradiento kitimas (7 lentelė), judriosios fazės sudėtis paliekama ta pati: 0,1 proc. trifluoracto rūgštis ir acetonitrilas.

7 lentelė. Judriosios fazės kiekybinės sudėties kitimas Laikas (min.) 0,1 proc. trifluoracto rūgštis (proc.) Acetonitrilas (proc.) 20 12 88 21 10 90 28 10 90 29 95 5

Chromatogramoje (5 pav.) matome, kad koreguota ESC metodika geba atskirti tris analites ir jas identifikuoti. Buspirono, fluoksetino ir paroksetino standartų mišinio smailių skiriamoji geba yra didesnė negu 1,5 reikšmė. Buspirono sulaikymo laikas Rt = 12,46, fluoksetino Rt = 15,78, vidinio standarto

paroksetino Rt = 14,62. Ši metodika bus taikoma buspirono ir fluoksetino vaistų mišinio nustatymui po

išskyrimo iš kraujo plazmos.

5 pav. Vaistų mišinio (buspirono ir fluoksetino) standartinių tirpalų ESC chromatograma, pakeitus eliuavimo gradientą. Skaičiais pažymėtos šių vaistų smailės: 1 – buspirono hidrochloridas, 2 –

paroksetino hidrochloridas (vidinis standartas), 3 – fluoksetino hidrochloridas

3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija

Norint ESC metodiką taikyti kiekybiniam tiriamųjų medţiagų (buspirono ir venlafaksino) nustatymui kraujo plazmoje, būtina įrodyti metodikos tinkamumą. Remiantis ICH (International Conference on Harmonisation) analitinių procedūrų validacijos gairėmis [27] buvo pasirinkti ir įvertinti šie parametrai:

1. specifiškumas (angl. Specificity),

2. metodikos rezultatų glaudumas (angl. Precision), kuris įvertintas:

 tarpiniu preciziškumu (angl. Intermediate Precision), 3. tiesiškumas (angl. Linearity),

4. ribos (angl. Range):

 aptikimo (angl. Limit of detection),

 nustatymo (angl. Limit of quantitation).

3.2.1 Specifiškumas

Metodo specifiškumas yra gebėjimas vienareikšmiškai nustatyti analitės buvimą. Norint įrodyti, kad kiekviena chromatogramoje esanti smailė atitinka po vieną analitę, registruojami UV absorbcijos spektrai penkiose smailės vietose. ESC metodikos specifiškumas įrodytas palyginant vaistinių medţiagų standartų mišinio (6 pav. A) ir tiriamojo mėginio (atlikus kietafazę ekstrakciją) (6 pav. B) chromatogramas. Norint įsitikinti, kad tirpiklis ir išsiekstrahavusios balastinės medţiagos netrukdo vaistinių medţiagų nustatymui, atlikta „tuščio“ mėginio (6 pav. D) ir kraujo plazmos ekstrakto (6 pav. C) chromatografijos.

A

6 pav. Standartų mišinio (A), tiriamojo mėginio (B), kraujo plazmos ekstrakcijos (C), „tuščio“ mėginio (D) chromatogramos. Skaičiais pažymėtos šių vaistų smailės: 1 – buspirono hidrochloridas, 2 –

paroksetino hidrochloridas (vidinis standartas), 3 – fluoksetino hidrochloridas

8 lentelė. Buspirono, fluoksetino ir paroksetino standartų mišinio ir tiriamojo mėginio komponentų smailių sulaikymo laikas (min)

Chromatograma Buspironas (min) Fluoksetinas (min) Paroksetinas vidinis standartas (min)

Standartų mišinio (6 pav. A) 12,46 15,78 14,62

Tiriamojo mėginio (6 pav. B) 12,43 15,75 14,60

Lyginant standartų mišinio ir tiriamojo mėginio analičių smailes pagal sulaikymo laikus (8 lentelė) bei spektrinius sutapimus matyti, kad jos sutampa. Iš pateiktos chromatogramos (6 pav. D) matyti, kad tirpiklis, kuris naudojamas kaip gradientinė eliuentų sistema, netrukdo vaistinių medţiagų nustatymui. O atlikus kraujo plazmos ekstrakto chromatografiją (6 pav. C) nustatyta, jog nėra smailių, kurios galėtų trukdyti vaistinių medţiagų analizei (nėra matricos efekto). Galima daryti išvadą, kad pasirinktos ESC metodikos specifiškumas tenkina visus reikalavimus.

C

3.2.2 Rezultatų glaudumas

Analitinės metodikos rezultatų glaudumas – rezultatų artumas, kuris gaunamas atlikus matavimų seriją, naudojant tą patį mėginį, vienodomis sąlygomis. Glaudumas įvertintas: pakartojamumu ir tarpiniu preciziškumu. Pakartojamumas apskaičiuotas tą pačią dieną viena po kitos atlikus 7 injekcijas, naudojant tą patį vaistinių medţiagų standartų mišinį, tomis pačiomis analizės sąlygomis. Apskaičiuotas variacijos koeficientas, kitaip vadinamas santykinis standartinis nuokrypis, smailės plotui ir sulaikymo laikui. Jis turi būti ne didesnis kaip 5 proc. (9 lentelė).

Tarpinis preciziškumas įvertintas tiriamąją analitę analizuojant 3 dienas iš eilės, atliekant po 7 injekcijas, ankščiau aprašytomis sąlygomis. Iš gautų duomenų apskaičiuoti santykiniai standartiniai nuokrypiai smailės plotui ir sulaikymo trukmei (9 lentelė).

9 lentelė. Metodikos rezultatų glaudumo įvertinimas

Vaistinis preparatas

Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) Buspironas 0,2 0,1 0,3 0,1 Fluoksetinas 0,1 0,1 0,6 0,1

Analičių pakartojamumo SSN smailės plotui skiriasi neţymiai, buspirono 0,2 proc., fluoksetino 0,1 proc. Tarpinio preciziškumo SSN smailės plotui yra didesni (buspironui 0,3 proc., fluoksetinui 0,6 proc.), tačiau neviršija leistinos 10 proc. ribos. Vaistinių medţiagų pakartojamumo ir tarpinio preciziškumo SSN sulaikymo laikui nesiskiria (0,1 proc.).

Apibendrinus gautus rezultatus matyti, kad rezultatų glaudumas atitinka reikalavimus.

3.2.3 Tiesiškumas

Tiesiškumas nusako smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo analitės kiekinės koncentracijos (nustatytose ribose). Tiesiškumas įvertintas kalibravimo kreivės metodu (7 ir 8 pav). Buspirono ir fluoksetino kalibraciniai grafikai nubrėţti 0,1 – 0,003125 mg/ml ribose. Nustatytas išbarstymas, kuris išreikštas koreliacijos koeficientu (10 lentelė). Jis turi būti artimas 1. [27]

10 lentelė. Buspirono ir fluoksetino kalibravimo kreivių charakteristikos Preparatas Sulaikymo laikas

Rt

Koreliacijos

koeficientas R2 Regresijos lygtis

Buspironas 12,46 0,9997 y = 2,16∙107x – 1,76∙103

Fluoksetinas 15,78 0,9998 y = 2,01∙107x – 6,20∙103

7 pav. Buspirono kalibracinė kreivė. Regresijos lygtis y = 2,16∙107x – 1,76∙103

Nubraiţyti buspirono hidrochlorido ir fluoksetino hidrochlorido kalibraciniai grafikai (7 ir 8 pav.) įrodo, kad analizuotame koncentracijų intervale, smailės ploto priklausomybė nuo kiekinės medţiagos koncentracijos yra tiesiška. Vaistinių medţiagų koreliacijos koeficiento reikšmės yra artimos 1 (buspirono 0,9997; fluoksetino 0,9998). Galima daryti išvadą, kad ESC metodikos tiesiškumas atitinka visus keliamus reikalavimus.

3.2.4 Aptikimo ir nustatymo ribos

Buspirono ir fluoksetino aptikimo ir nustatymo ribos įvertintos lyginant analitės smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Tiriamųjų medţiagų aptikimo riba nustatyta, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis yra 3:1, o nustatymo riba įvertinta, kai smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis – 10:1. Buspirono aptikimo riba yra 0,4 µg/ml, o fluoksetino 0,75 µg/ml. Vaistinių medţiagų nustatymo ribos atitinkamai lygios 0,75 µg/ml ir 1 µg/ml.

Remiantis gautais rezultatais ir įvertinus pasirinktas validacijos charakteristikas, galima daryti išvadą, jog ESC metodika gali būti naudojama vaistinių medţiagų (buspirono hidrochlorido ir fluoksetino hidrochlorido) mišinio identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui po išskyrimo iš kraujo plazmos. Įteisinta ESC metodika toliau bus taikoma vaistinių medţiagų ekstrakcijos iš kraujo plazmos geriausio metodo nustatymui ir jo optimizavimui.

3.3 Skysčių – skysčių ekstrakcija

Skysčių – skysčių ekstrakcija atlikta su dviem organiniais tirpikliais (trichlormetanu ir dichlormetanu). Remiantis mokslinės literatūros analize, buspirono ir fluoksetino pKa reikšmės yra

skirtingos, atitinkamai 7,32 ir 9,8. [7] Dėl šios prieţasties analičių ekstrakcija atlikta iš rūgštinės ir bazinės terpės.

Atlikus tiriamųjų vaistinių medţiagų (buspirono hidrochlorido ir fluoksetino hidrochlorido) skysčių – skysčių ekstrakciją iš kraujo plazmos bei įvertinus išekstrahuotus jų kiekius validuota ESC metodika matoma, kad preparatų ekstrakcijos išgava didesnė kai ekstrahavimui naudojamas trichlormetanas (11 ir 12 lentelės). Dichlormetanas vaistų mišinio išskyrimui yra netinkamas, nes ekstrakcijos išgava yra maţesnė nei 30 proc. Taip pat pastebėta, kad buspirono tirpumas ekstrahente pagerėja, kai terpė yra rūgštinė, o fluoksetinas geriau ekstrahuojasi, kai tirpalo terpė yra šarminė. Tačiau