Capitolo 4
Materiali e metodi
MATERIALI E METODI
Metodi cromatografici
Cromatografia su colonna
Cromatografia SPE
La cromatografia SPE (estrazione su fase solida) è una tecnica di separazione per piccole quantità di sostanza. La fase fissa è costituita da un supporto solido di Lichroprep® RP18 impaccato all’interno di una piccola
colonna di plastica a forma di siringa e delimitato da due setti porosi posti uno superiormente e l’altro inferiormente.
L’eluizione viene effettuata a gradiente di polarità decrescente, utilizzando una miscela costituita da metanolo e acqua, generando una pressione in testa alla colonna con appositi sistemi di compressione manuale a tenuta. Le dimensioni delle colonne e i volumi di eluizione vengono scelti in base alla quantità di campione da caricare. In questa tesi è stata impiegata per studiare la frazione RC-M/5 dell’estratto cloroformio-metanolico e la
frazione RB/4 dell’estratto n-butanolico.
Cromatografia ad esclusione molecolare
La cromatografia ad esclusione molecolare è stata utilizzata per cromatografare sia l’estratto n-butanolico, RB, (10.08 g) sia l’estratto
cloroformio-metanolico, RC-M, (9.723 g).
Come fase stazionaria è stato impiegato gel di Sephadex LH-20 (25-100 µm, Pharmacia Fine Chemicals), impaccato in una colonna di 100 x 5 cm. Come fase mobile è stato utilizzato metanolo.
La fase mobile è stata sottoposta all’azione di una pompa peristaltica Pharmacia Fine Chemicals P1, che
Cromatografia flash
La cromatografia flash è stata utilizzata per cromatografare l’estratto cloroformico, RC, (9.6 g).
Come fase stazionaria si è impiegato gel di silice 60 (230-410 mesh, Merck), impaccato in una colonna di 25 x 9 cm. Come fase mobile sono state impiegate miscele di solventi a polarità crescente, n-esano, cloroformio e metanolo, come illustrato in Tabella 3.a. Per ottenere un flusso costante di circa 20 ml/min è stata usata aria compressa.
HPLC
Le separazioni con HPLC (cromatografia liquida ad alta pressione), 20-100 bar, sono state effettuate con un apparecchio Shimadzu, costituito da: Pompa Shimadzu LC-8A
Rivelatore Shimadzu RID-10A
Cromatografia su strato sottile (TLC)
Le cromatografie su strato sottile sono state eseguite su lastre di gel di silice Kieselgel 60 F254 (Merck) di 0.25 mm di spessore, su supporto di
vetro o di alluminio.
Come fasi mobili sono state utilizzate molte miscele di solventi, scelte opportunamente a seconda del campione in esame. Le più comuni sono state le seguenti tre miscele:
BAW (n-butanolo-acido acetico-acqua, in proporzione 60:15:25)
CMW (cloroformio-metanolo-acqua, in proporzione 70:30:3)
CMW (cloroformio-metanolo-acqua, in proporzione 80:18:2)
La rivelazione delle macchie è stata effettuata sia con la luce UV a 254 e 366 nm, sia con i seguenti reattivi spray:
soluzione satura di solfato di cerio in acido solforico al 65%, seguita
da riscaldamento a 120°C per 15 minuti per rendere visibili le macchie. Il solfato di cerio è stato impiegato come rivelatore universale.
reattivo Naturstoffe (NTS), estere β-etilamminico dell’acido
difenilborico, soluzione metanolica all’1%, seguito da polietilenglicol
4000 (PEG), soluzione etanolica al 5%, per rendere visibili le
macchie. Il reattivo NTS è impiegato specificamente per la rivelazione dei flavonoidi.
Metodi chimico-fisici
Spettri di massa
Gli spettri di massa ESI-MS (modalità positiva e negativa) sono stati registrati con uno spettrometro Thermo Finningan LC-Q Advantage a trappola ionica equipaggiato con un software Xcalibur. I campioni sono stati sciolti in metanolo ed iniettati nella fonte ESI utilizzando una pompa a siringa. La velocità del flusso è stata di 250 µl/min.
Spettri di risonanza magnetica nucleare
Per gli spettri NMR è stato utilizzato uno spettrometro Bruker DRX-600 (software UXNMR) operante a 599.19 MHz per 1H e 150.86 MHz per 13C e
uno strumento Bruker AC-250 (software Topspin) operante a 250 MHz per
1H e 62.5 MHz per 13C.
Gli spettri mono e bidimensionali sono stati misurati in CD3OD o CDCl3.
Negli spettri 1H-NMR, per la misurazione in CD
3OD, è stato usato come
standard il segnale del solvente (CD3OD a 3.31 ppm e CDCl3 a 7.24 ppm).
I chemical shifts sono riportati in (ppm).
Negli spettri 13C-NMR è stato usato come riferimento il segnale del
solvente a 49.0 per il CD3OD e a 77.0 per il CDCl3.
L'esperimento di correlazione diretta omonucleare (DQF-COSY) è stato eseguito usando la convenzionale sequenza di impulsi.
L'esperimento di correlazione diretta eteronucleare 1H-13C (HSQC) è stato realizzato su una matrice 512 x 1024, usando una costante di accoppiamento C-H di 135 Hz ed un relaxation delay di 1.5 sec [Kay et al., 1992; Palmer et al., 1991].
L'esperimento di correlazione eteronucleare a lunga distanza (HMBC) è stato ottenuto utilizzando la sequenza di Bax² [Bax et al., 1986] ad una costante long range media di 6-8 Hz e una matrice 512 x 1024.
per i gruppi CH2. Il ritardo nel trasferimento di polarizzazione è stato corretto ad un accoppiamento medio C-H di 135 Hz.
Gli esperimenti 1D-TOCSY sono stati ottenuti usando un software UX-NMR. Sono stati eseguiti utilizzando un generatore di impulsi gaussiani e impiegando, durante il mixing time, la sequenza di impulsi di tipo MLEV-17 (mixing time 80-100 ms), secondo quanto riportato in letteratura [Davis
