1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Rita Kupčinskaitė-Noreikienė
GENŲ, SUSIJUSIŲ SU APOPTOZE IR DNR
PAŽAIDŲ ATITAISYMU, METILINIMO
YPATUMAI SKRANDŽIO ONKOGENEZĖS
PAKOPINIAME PROCESE
Daktaro disertacijaBiomedicinos mokslai, medicina (06B)
2
Disertacija rengta 2008–2012 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Mokslinė vadovė
Prof. dr. Elona Juozaitytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medi-cinos akademija, biomediMedi-cinos mokslai, medicina – 06B)
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 7
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS ... 11
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
3.1. Skrandžio vėžio paplitimas ... 13
3.2. Skrandžio vėžio rizikos veiksniai ... 14
3.3. Lėtinis atrofinis gastritas ... 15
3.4. Skrandžio vėžio morfologijos ypatumai ... 17
3.5. Epigenetiniai pokyčiai: jų svarba skrandžio onkogenezei ... 17
3.5.1. Epigenetiniai pokyčiai ... 17
3.5.2. DNR metilinimo reikšmė onkogenezei ... 18
3.5.3. DNR metilinimo tyrimo metodai ... 20
3.5.4. Histonų modifikacijos reikšmė ... 21
3.5.5. Mikro-RNR vaidmuo onkogenezėje ... 22
3.5.6. Epigenetinės navikų terapijos galimybės ... 23
3.6. Epigenetinių poveikių įtaka skrandžio onkogenezei ... 24
3.6.1. DNR metilinimas ir skrandžio onkogenezė ... 24
3.6.2. Histonų modifikavimas ir skrandžio onkogenezė ... 26
3.6.3. Mikro-RNR ir skrandžio onkogenezė ... 26
3.7. hMLH1, MGMT, DAPK, CASP8 genų funkcijos apžvalga ... 27
4. MEDŽIAGA IR TYRIMO METODAI ... 32
4.1. Etikos komiteto leidimas atlikti biomedicininį tyrimą ... 32
4.2. Tiriamųjų kontingentas ... 32
4.3. Tyrimo metodai ... 34
4.3.1. DNR išskyrimas iš audinio ... 36
4.3.2. Išskirtos DNR modifikavimas natrio bisulfitu ... 37
4.3.3. Metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija ... 38
4.3.4. PGR reakcijos produktų atskyrimas ir vizualizavimas ... 41
4.4. Matematinė - statistinė duomenų analizė ... 42
5. REZULTATAI ... 44
5.1. Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo ypatumai lėtinio atrofinio gastrito audinyje ... 44
5.2. Geno hMLH1 promotoriaus metilinimo ypatumai sergančiųjų skrandžio vėžiu aplinkiniame nenavikiniame audinyje ... 46
4
5.4. Geno hMLH1 metilinimo ypatumų palyginimas atrofinio gastrito, aplinkinio
nenavikinio ir skrandžio vėžio audinyje ... 55
5.5. Geno MGMT promotoriaus metilinimo skrandžio vėžiu sergančiųjų navikiniame ir aplinkiniame nenavikiniame audiniuose ypatumų tyrimas ... 58
5.6. Su apoptoze susijusių genų CASP8, DAPK-1 promotorių metilinimo ypatumų skrandžio vėžio ir aplinkiniame nenavikiniame audinyje tyrimas ... 65
5.7. hMLH1, MGMT, CASP8, DAPK-1 genų metilinimo tarpusavio ryšių ypatumų tyrimas ... 72
6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 76
6.1. hMLH1 geno promotoriaus metilinimo ypatumai lėtinio atrofinio gastrito, skrandžio vėžio ir aplinkiniame nenavikiniame audiniuose ... 76
6.2. MGMT geno promotoriaus metilinimo ypatumai skrandžio vėžio ir aplinkiniame nenavikiniame audiniuose ... 82
6.3. Genų, susijusių su apoptoze (CASP 8, DAPK-1), promotoriaus metilinimo ypatumai skrandžio vėžio ir aplinkiniame nenavikiniame audiniuose ... 85
6.4. Genų hMLH1, MGMT, CASP8, DAPK-1 metilinimo sąsajų ir derinių ypatumai skrandžio vėžio ir aplinkiniame nenavikiniame audiniuose ... 87
IŠVADOS ... 90
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 91
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 92
PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ... 102
5
SANTRUMPOS
Alu – trumpos genomo kartotinės sekos (lot. Arthrobacter luteus).
APAF-1 – genas, koduojantis citoplazminius baltymus, kurie svarbūs apoptozės reguliavimo procesui (angl. Apoptotic protease activating factor 1).
APC – genas, priskiriamas naviką slopinančių genų grupei (angl.
Adeno-matous Polyposis Coli).
ARC – genas, dalyvaujantis ląstelės struktūros formavime (angl.
Activity-Regulated Cytoskeleton).
Bp – bazių pora.
BRCA1 – genas, koduojantis branduolio baltymą, reguliuojantį genomo stabilumą ir priklauso naviką slopinančių genų grupei (angl. breast
cancer 1 gene).
C – citozinas.
cagA – Helicobacter pylori bakterijos genas, koduojantis virulentinį baltymą
(angl. cytotoxin associated gene).
CASP8 – genas, koduojantis kaspazių šeimai priklausantį baltymą, kuris daly-vauja apoptozės procese (angl. cysteine aspartyl-specific protease 8).
CDH1 – epitelinio kadherino (angl. E-cadherin) genas.
CDH13 – genas, koduojantis vieną iš kadherino šeimos baltymų (angl. Cadherin
13).
CNS – centrinė nervų sistema.
COBRA – kiekybinis tyrimo metodas DNR metilinimui nustatyti (angl.
Combi-ned Bisulfite Restriction Analysis).
CpG – citozino ir guanino dinukleotidas.
DAPK-1 – genas, koduojantis kalcio kalmodulino reguliuojamą serino-treonino proteinkinazę, dalyvaujantis apoptozės procese (angl. death associated
protein kinase).
DISC – baltymų kompleksas, dalyvaujantis apoptozės procese (angl.
death-inducing signaling complex).
DNMT – DNR metiltransferazė. DNR – dezoksiribonukleorūgštis. dNTP – dezoksiribonukleotidų mišinys.
EGFR – epidermio augimo faktoriaus receptoriai (angl. epidermal growth
factor receptor).
FADD – baltymas, dalyvaujantis apoptozės procese (angl. Fas-Associated
protein with Death Domain).
G – guaninas.
GS – galimybių santykis.
GSTP1 – genas, koduojantis baltymą, dalyvaujantį ląstelės metabolizmo procese (angl. Glutathione S-Transferase protein1).
H. pylori – Helicobacter pylori.
HAND1 – genas, koduoja baltymą, dalyvaujantį diferenciacijos procese (angl.
Heart And Neural Crest Derivatives Expressed 1).
HAT – histonų acetiltransferazės. HDAC – histonų deacetilazės. HDM – histonų demetilazės.
6
hMLH1 – genas, dalyvaujantis DNR pažaidų atitaisymo procese (angl. mutL
homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)).
HMT – histonų metiltransferazės.
IAP – genas, koduojantis baltymą, reguliuojantį apoptozės procesą (angl.
inhibitor of apoptosis).
L – DNR fragmentų žymuo. LAG – lėtinis atrofinis gastritas.
LAMB3 – genas, reguliuojantis ląstelės migracijos ir organizacijos procesus (angl. Laminin, Beta 3).
LAMC2 – genas, reguliuojantis ląstelės migracijos ir organizacijos procesus (angl. Laminin, Gamma 2).
LINE – genomo kartotinė seka (angl. long interspersed elements).
LOX – naviką slopinantis genas (angl. Lysyl Oxidase gene).
MGMT – genas, dalyvaujantis DNR pažaidų atitaisymo procese (angl. O6
-Methylguanine-DNA-methyltransferase).
Mikro-RNR – baltymo nekoduojančios trumpos (sudarytos iš 21-23 nukleotidų) RNR sekos.
p – paklaidos tikimybė, reikšmingumo lygmuo. pav. – paveikslas.
proc. – procentai.
p14 – naviką slopinantis genas.
p15 – naviką slopinantis genas.
p16 – naviką slopinantis genas.
p53 – naviką slopinantis genas. PGR – polimerazės grandininė reakcija. PSO – Pasaulio sveikatos organizacija.
PTGS2 – prostaglandinų endoperoksidazės sintetazės genas (angl.
Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2 gene).
RNR – ribonukleorūgštis.
RUNX3 – naviką slopinantis genas (angl. Runt-Related Transcription Factor 3).
SINE – genomo kartotinė seka (angl. short interspersed elements). sk. – skaičius.
TPEF/HPP1 – genas, koduojantis transmembraninį baltymą; žmogaus hiperplastinių polipų baltymo genas (angl. transmembrane protein containing
epidermal growth factor and follistatin domains/hyperplastic polyposis protein).
vacA – Helicobacter pylori bakterijos genas, koduojantis virulentinį baltymą
7
ĮVADAS
Šiuolaikinis onkologijos mokslo proveržis per pastaruosius kelis de-šimtmečius labiausiai susijęs su molekulinių patogenezinių grandžių, dalyvaujančių vėžio vystymosi ir progresavimo procese, nustatymu. Mole-kuliniai tyrimai svarbūs ne tik siekiant suprasti onkogenezės proceso priežastis, bet ir yra pagrindas klinikinei praktikai: molekulinių žymenų, kaip prognozinių ir predikcinių veiksnių, identifikavimui, taikinių terapijos sukūrimui.
Žmogaus genomo integralumas yra palaikomas dviejų pagrindinių grandžių: DNR pažaidų atitaisymo ir apoptozės. Sutrikus šiems procesams, ląstelė išgyvena nepaisant susikaupusių DNR pažaidų – taip sudaromas pagrindas tolesnei transformacijai skrandžio ir kitų navikų onkogenezės procese.
Skrandžio vėžys – aktuali sveikatos problema. Dėl slaptos klinikinės eigos, dažniausiai liga diagnozuojama vėlyvose stadijose, o tai lemia blogą pacientų prognozę, nepaisant pastaruoju metu atsirandančių naujų gydymo galimybių. Skrandžio vėžys yra trečioji mirties priežastis (po plaučių ir krūties vėžio) onkologinių ligų struktūroje [1]. 2008 metais pasaulyje mirtingumo rodiklis nuo šios ligos siekė 10,3 atvejo 100 000 gyventojų [1]. Lietuvos vėžio registro duomenimis, mirtingumas nuo šios ligos 2009 metais buvo 25,9 vyro 100 000 gyventojų, o moterų siekė 15,8 atvejo 100 000 gyventojų [2].
Skrandžio vėžio išsivystymui, skirtingai nei kitų lokalizacijų navikų, svarbesnę reikšmę turi epigenetiniai (aplinkos) veiksniai, palyginti su genetiniais veiksniais. Viena svarbiausių priežasčių skrandžio vėžiui išsi-vystyti yra H. pylori infekcija, kuri 1994 m. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) pripažinta pirmos klasės kancerogenu [3]. Dešimtmečiais persistuo-dama gram-neigiama bakterija skrandyje sukelia lėtinį atrofinį gastritą (LAG), multižidininę atrofiją, intestinalinę metaplaziją ir intraepitelinę neoplaziją [4]. Yra žinoma, kad atrofiniu gastritu sergantiems asmenims skrandžio vėžio rizika yra 16 kartų didesnė, lyginant su bendra populiacija [5, 6].
Epigenetinis procesas – CpG salų, esančių genų promotoriaus srityje, metilinimas lemia DNR struktūros pokyčius, keičiančius genų ekspresiją
[7]. DNR metilinimas vyksta, kuomet prie 5 pozicijoje esančio citozino kovalentine jungtimi prisijungia metilo grupė (–CH3) [8].
Vienas iš onkogenezės apibrėžimų yra nekontroliuojama ląstelių proliferacija. Šis procesas yra ženkliai pagreitinamas, kai sutrinka svarbių genų, reguliuojančių ląstelės ciklą, funkcija. Mokslininkai įvardijo
pagrin-8
dines genų grupes, reguliuojančias šiuos mechanizmus: su DNR pažaidų atitaisymu susijusių genų, kurie užtikrina mutacijų ir kitų DNR pažaidų atitaisymą prieš tolimesnį ląstelės dalijimąsi, funkcija ir naviką slopinantys genai, kurie indukuoja natūralią ląstelės mirtį – apotozę, jei nustatomas sunkus genominis defektas [9].
Moksliniu tyrimu bandėme išsamiau pažvelgti į šių onkogenezei svar-bių procesų (DNR pažaidų atitaisymas ir apoptozė) epigenetinio reguliavi-mo – DNR metilinireguliavi-mo ypatumus skrandžio vėžio formavireguliavi-mosi procese.
DAPK-1 (angl. death associated protein kinase) genas – vienas iš trijų DAPK šeimos genų, kuris koduoja kalcio kalmodulino reguliuojamą
serino-treonino proteinkinazę. Šiuo metu yra žinoma, kad DAPK-1 baltymo funkcija glaudžiai siejasi su įvairiomis apoptozės grandimis. DAPK-1 geno hipermetilinimas patvirtintas įvairių solidinių ir hematologinių navikų atvejais.
Skrandžio vėžys nėra išimtis. Geno promotoriaus metilinimas būdingas ir šiai naviko lokalizacijai. Tačiau skirtingų autorių duomenimis, epigene-tinio proceso dažnis įvairiuose regionuose skiriasi [10-17]. Literatūroje pažymima, kad DAPK-1 genas susijęs su p53 baltymo ir kitų grandžių funkcija, ir atvirkščiai koreliuoja su mikrosatelitų nestabilumu [18]. Tačiau nėra duomenų apie DAPK-1 metilinimo sąsajas su vienu iš svarbiausių genų, lemiančių mikrosatelitų nestabilumą, hMLH1 metilinimu.
Kitas mūsų pasirinktas tirti genas savo funkcija netiesiogiai, per tarpinius baltymus, susijęs su DAPK-1, tai – CASP8 (angl. cysteine
aspartyl-specific proteases) genas, priklausantis kaspazių šeimai. Literatūroje trūksta
duomenų apie šio geno svarbą skrandžio onkogenezei. Radome keletą straipsnių iš Rytų Azijos regiono, kuriuose nagrinėjama geno metilinimo svarba skrandžio vėžio atveju. Juose nurodomas metilinimo dažnis siekia keliolika procentų [19, 20]. Nėra duomenų apie geno metilinimo dažnio skirtumus tarp geografinių regionų, ar yra metilinimo sąsajos su kitais genais. Neaiški epigenetinio pokyčio svarba klinikiniams ir morfologiniams rodikliams.
MGMT (angl. O6-Methylguanine-DNA-methyltransferase) geno
koduo-jamo baltymo funkcija yra pašalinti alkilo grupę iš guanino O6 pozicijos
[21]. Sutrikusi MGMT baltymo funkcija lemia galimą mutacijų atsiradimą. Mokslinės publikacijos rodo, kad skrandžio vėžio atveju MGMT geno promotoriaus metilinimas yra viena iš patogenetinių grandžių. Geno metilinimas siejamas su pažengusia ligos stadija [22]. Molekulinis epigenetinis pokytis literatūroje siejamas ir su blogesne ligos prognoze [23]. Literatūroje nėra duomenų apie šio geno ir kitų genų galimas metilinimo sąsajas, metilinimo derinių įtaką klinikiniams, morfologiniams veiksniams, ligos prognozei. Taipogi mokslinė periodika neatsako į klausimą, ar MGMT
9
metilinimas yra vienodas prognostinis veiksnys skirtingų morfologinių tipų skrandžio navikams.
Su DNR pažaidų atitaisymo funkcija siejamas ir genas hMLH1 (angl.
mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)), lokalizuotas
3p21.3 chromosomoje. Geno koduojamas baltymas fiksuoja DNR klaidas, atsiradusias po replikacijos. Minėtas baltymas jungiasi su PMS2 baltymu, taip sudarydamas aktyvų kompleksą, koordinuojantį kitų baltymų, atitaisan-čių DNR pažaidą, funkciją. Geno hMLH1 promotoriaus hipermetilinimas, o ne mutacijų lemtas geno funkcijos kitimas, yra mikrosatelitų nestabilumo priežastis skrandžio vėžio atveju [24]. Literatūroje neaptikome duomenų apie geno metilinimo nenavikiniame aplinkiniame audinyje sąsajas su pacientų amžiumi. Planuojant ir rengiant tyrimą, nebuvo duomenų apie skrandžio vėžio anatominės lokalizacijos sąsajas su geno metilinimu.
Siekant visapusiškai įvertinti metilinimo vaidmenį onkogenezės proce-se, tyrėme vieno iš DNR pažaidų atitaisymo procesą reguliuojančio geno
hMLH1 metilinimo ypatumus atrofinio gastrito audinyje. Būtent šio geno
epigenetinio poveikio tyrimams mus paskatino kelios priežastys. Pirmoji priežastis yra ta, kad atrofinis gastritas susijęs su intestinalinės skrandžio vė-žio formos išsivystymu ir yra priskiriamas ikivėžinėms būklėms. Antroji – literatūros duomenimis, geno hMLH1 metilinimas sietinas su intestinaline skrandžio vėžio forma bei ankstyva ligos stadija [18, 25–28]. Todėl moleku-linio žymens ištyrimas ikivėžinės būklės pažeistame audinyje ir galimų są-sajų su klinikiniais ypatumais ir morfologiniais atrofinio gastrito kriterijais nustatymas yra svarbus.
Molekuliniu tyrimu siekėme įvertinti epigenetinio proceso – genų meti-linimo ypatumus pakopiniame skrandžio onkogenezės procese, lyginant proceso pasireiškimo dažnį skrandžio navikiniame, aplinkiniame nenaviki-niame, atrofinio gastrito pažeistame audiniuose. Vertinome molekulinių žymenų galimas sąsajas su klinikiniais ir morfologiniais onkologinio ir ikivėžinio susirgimo (lėtinio atrofinio gastrito) kriterijais bei jų, kaip skran-džio vėžio prognozinių veiksnių, galimą vertę.
10
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Nustatyti su apoptoze ir DNR pažaidų atitaisymu susijusių genų metilinimo ypatumus skrandžio onkogenezės procese.
Darbo uždaviniai
1. Įvertinti su DNR pažaidų atitaisymu susijusio hMLH1 geno promotoriaus metilinimo ypatumus lėtinio atrofinio gastrito, skrandžio vėžio ir aplinkiniame nenavikiniame audiniuose.
2. Išanalizuoti hMLH1 geno promotoriaus metilinimo priklausomybę nuo lėtinio atrofinio gastrito ir naviko lokalizacijos skrandyje. 3. Išanalizuoti MGMT geno promotoriaus metilinimo ypatumus
skran-džio vėžiu sergantiems pacientams.
4. Nustatyti su apoptoze (DAPK-1, CASP8) susijusių genų promotorių metilinimo ypatumus sergančių skrandžio adenokarcinoma naviki-niame ir aplinkinaviki-niame nenavikinaviki-niame audiniuose.
5. Įvertinti tirtų su apoptoze ir DNR pažaidų atitaisymu susijusių genų derinių metilinimo ryšį su skrandžio vėžio klinikiniais, morfolo-giniais ypatumais ir ligos prognoze.
Mokslinės hipotezės
• Nagrinėjant skrandžio onkogenezės procesą, siekta patikrinti hipo-tezę, kad geno hMLH1 promotoriaus metilinimo dažnis didėja, progresuojant atrofiniam gastritui ir palaipsniui pereinant iki naviko, o aplinkinis nenavikinis audinys yra tarpinė molekulinių pokyčių grandis.
• Skrandžio vėžio etiopatogenezėje įrodytas ryškus H. pylori vaidmuo. Žinant, kad šios infekcijos sąlygoto lėtinio atrofinio gastrito vysty-masis prasideda skrandžio urvo srityje, siekta aptikti molekulinių pokyčių skirtumus tarp skrandžio anatominių sričių.
• Iškelta hipotezė, kad galbūt skrandžio vėžio aplinkinio nenavikinio audinio molekuliniai pokyčiai gali tapti svarbiais skrandžio vėžio prognoziniais žymenimis.
• Epigenetiniai pokyčiai gali būti susiję su klinikiniais, morfologiniais skrandžio vėžio ypatumais ir ligos prognoze.
11
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS
Fundamentinio onkologijos mokslo tikslas yra naujų molekulinių žyme-nų paieška, kurie ateityje galėtų būti pritaikyti klinikinėje praktikoje kaip prognoziniai ir predikciniai skrandžio vėžio veiksniai arba padėtų nustatyti onkologinio susirgimo išsivystymo riziką ikivėžinių susirgimų metu. Skrandžio vėžys pasižymi agresyvia ligos eiga ir bloga prognoze. Todėl ypač svarbu rasti molekulinius žymenis, kurie galėtų padėti įvertinti riziką transformuotis ikivėžiniams ląstelių pokyčiams (lėtinio atrofinio gastrito atveju) į navikinę ląstelę. Molekuliniai žymenys galėtų padėti nustatyti skrandžio adenokarcinomą ankstyvose stadijose, įvertinti ligos prognozę ir pasirinkti optimalų gydymą.
Analizuodami pakopinės skrandžio onkogenezės etapus, atskleidėme genų, susijusių su apoptoze ir DNR pažaidų atitaisymu, metilinimo ypatu-mus, kurių nėra aprašyta mokslinėje literatūroje.
Šio mokslinio tyrimo metu pirmą kartą buvo nustatytas skirtingas
hMLH1 geno metilinimo dažnis skrandžio antruminėje ir kūno anatominėse
dalyse atrofiniu pangastritu sergančiųjų audinyje. Žinant, kad šio geno metilinimas siejamas su distalinio skrandžio vėžio anatomine lokalizacija, mūsų gauti rezultatai dar labiau papildys sudėtingos distalinio skrandžio vėžio onkogenezės grandinės tyrimus. Pirmieji nustatėme, kad hMLH1 geno metilinimas sergančiųjų skrandžio vėžiu aplinkiniame nenavikiniame audi-nyje sietinas su jaunesniu nei 60 metų pacientų amžiumi. Onkologijos moksle ir praktikoje yra žinoma, kad jaunesnio amžiaus pacientams išsi-vystę navikai savo eiga yra agresyvesni. Geno hMLH1 metilinimo sąsajos aplinkiniame nenavikiniame audinyje su jaunesnio amžiaus pacientais priežastis sietume su galimai aktyvesniu pakopiniu onkogenezės procesu, o epigenetinis pokytis galimai atspindi ikinavikinius pokyčius gleivinėje.
Tyrimo metu nustatėme mokslinėje periodikoje neaprašytų genų metilinimo derinių sąsajų su klinikiniais ir morfologiniais skrandžio vėžio ypatumais. Vienas jų – genų DAPK-1 ir hMLH1 metilinimo derinys – reikšmingai dažnesnis skrandžio vėžiu sergantiems vyrams, o hMLH1 ir
MGMT genų epigenetinio pokyčio derinys susijęs su mažesniu lokaliu
skrandžio vėžio išplitimu.
Mokslinėje periodikoje nėra duomenų apie genų DAPK-1 ir MGMT metilinimo derinio įtaką ligos prognozei. Pirmieji nustatėme, kad abiejų genų metilinimas yra blogesnės prognozės rodiklis lyginant su pacientais, kurių navikiniame audinyje buvo nustatytas tik vieno iš šių genų metilini-mas. Publikacijose nurodoma, kad MGMT geno metilinimas skrandžio navikiniame audinyje siejamas su blogesne ligos prognoze [23]. Tačiau jose
12
nenagrinėtas molekulinio žymens vaidmuo atskirų skrandžio vėžio morfolo-ginių tipų navikams, kurie savo klinikine eiga ženkliai skiriasi. Mūsų tyrimo tarpinės išgyvenamumo analizės rezultatai parodė, kad MGMT geno metili-nimas agresyvios skrandžio vėžio histologinės formos atveju yra geresnės prognozės rodiklis. Juolab, kad šis molekulinis žymuo kito, blogai diferenci-juoto naviko – glioblastomos, atveju irgi lemia geresnę ligos prognozę [29]. Žvelgiant į skrandžio onkogenezės procesus išlieka daugybė neatsakytų klausimų, tačiau jau dabar galime teigti, kad ikivėžinių ligų detalesnis supratimas ir tyrinėjimai gali nulemti ankstyvesnę onkologinių ligų diagnos-tiką ir pacientų išgyvenamumą.
Šio mokslinio tyrimo rezultatai papildys sudėtingą skrandžio onkogene-zės mozaiką.
13
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Skrandžio vėžio paplitimas
2008 metais pasaulyje buvo diagnozuota apie 990 000 naujų skrandžio vėžio atvejų, ir tai sudaro 8 proc. visų onkologinių susirgimų; kasmet nuo šios ligos miršta apie 740 000 žmonių [1]. Vyrai skrandžio vėžiu serga dvigubai dažniau nei moterys (santykis 2,2:1) [2]. Sergamumas skrandžio vėžiu skirtinguose geografiniuose regioniuose skiriasi: didžiausias yra Rytų Azijoje, Centrinėje ir Rytų Europoje, Pietų Amerikoje, o mažiausias – Pietų ir Šiaurės Afrikoje, Vakarų Šiaurės Europos dalyse, Šiaurės Amerikoje [1]. Vyrų ir moterų sergamumo skrandžio vėžiu rodiklių (atvejų skaičius 100 000 gyventojų per metus) pasiskirstymas pagal geografinius regionus pateiktas 3.1.1 lentelėje [1].
3.1.1 lentelė. Vyrų ir moterų sergamumo skrandžio vėžiu rodiklių (atvejų
skaičius 100 000 gyventojų per metus) pasiskirstymas pagal geografinius regionus.
Pasaulio regionas Vyrai Moterys
Rytų Azija 42,4 18,3
Centrinė ir Rytų Europa 21,9 9,7
Pietų Amerika 17,3 8,4 Pietų Europa 13,9 6,8 Centrinė Amerika 12,7 9,3 Vakarų Azija 12,6 6,7 Vakarų Europa 9,0 4,4 Šiaurės Europa 8,5 4,0
Australija ir Naujoji Zelandija 7,4 3,4
Pietų ir Centrinė Azija 6,7 3,9
Šiaurės Amerika 5,8 2,8 Rytų Afrika 5,6 4,0 Vidurio Afrika 5,3 4,7 Vakarų Afrika 4,5 3,3 Pietų Afrika 4,1 2,2 Šiaurės Afrika 3,9 2,4
Vakarų šalyse sergamumas skrandžio vėžiu mažėja. Šio reiškinio prie-žastys nėra aiškios, bet manoma, kad vietoje sūdytų ar konservuotų maisto produktų daugiau vartojama šviežių vaisių ir daržovių. Taip pat dėl
page-14
rėjusios higienos ir antibiotikų naudojimo mažėja infekuotumas H. Pylori
[30]. Nors šiame geografiniame regione yra stebimos sergamumo mažėjimo tendencijos, atkreiptas dėmesys į tai, kad padidėjo proksimalinės skrandžio dalies skrandžio vėžio. Manoma, kad tam įtakos turi nutukimas ir gastroezo-faginis refliuksas [30].
Lietuvos vėžio registro duomenimis, 2011 metais Lietuvoje sergamumo skrandžio vėžiu rodiklis buvo 26,9 – 100 000 gyventojų vyrams ir 21 – 100 000 gyventojų moterims. Mirtingumas nuo šios ligos 2009 metais buvo 25,9 – 100 000 gyventojų vyrams, o moterų siekė 15,8 – 100 000 gyventojų [2]. Skirtingai nuo kitų lokalizacijų navikų, kuomet pagerėjusi ankstyva diagnostika, lokalaus ir sisteminio gydymo galimybės lemia mirtingumo rodiklių sumažėjimą, Lietuvoje mirtingumas skrandžio vėžiu per dešimtmetį nepakito. 2001 metais mirtingumas dėl šios ligos buvo vyrams 26,9 – 100 000, moterims 19,6 – 100 000 [2]. Šiuo metu ir sergamumas išlieka panašus kaip ir 2001 metais (vyrams 35,3 – 100 000, moterims 23 – 100 000) [2].
3.2. Skrandžio vėžio rizikos veiksniai
Žinomi rizikos veiksniai, darantys įtaką skrandžio adenokarcinomos išsivystymui, yra Helicobacter pylori (H. pylori) infekcija [3], Epstein-Barr virusas [31], dietos ypatumai (gausus druskos, nitratų vartojimas, vaisių ir daržovių stoka mitybos racione), rūkymas, nutukimas, kuris sietinas su skrandžio proksimalinės dalies adenokarcinoma [30].
Atskirai paminėtina tarp rizikos veiksnių – H. pylori infekcija. Ši infekcija 1994 metais PSO pripažinta pirmos klasės kancerogenu skrandžio vėžiui išsivystyti [3]. Dešimtmečiais persistuodama gram-neigiama bakterija skrandyje sukelia lėtinį gastritą, multižidininę atrofiją, intestinalinę metaplaziją ir intraepitelinę neoplaziją [4]. Pasaulyje gyventojų infekuo-tumas H. pylori siekia iki 50 proc., didesnis jis yra besivystančiose šalyse.
H. pylori patogenetinis mechanizmas nėra visiškai aiškus. Jis
skirsto-mas į susijusį su pačios bakterijos produktais, bendru lėtiniu uždegiminiu atsaku ir organizmo genetine predispozicija. Dėl gastrito ir atrofijos keičiasi skrandžio sulčių pH, įsigalint skrandyje anaerobinei florai. Minėtos bakte-rijos produkuoja aktyvias medžiagas reduktazes, transformuojančias maiste esančius nitratus į nitritus; pastarieji, susijungę su aminų, amidų ir urea molekulėmis, sudaro N-nitrozamino junginius [32]. Taipogi yra žinoma, kad dėl H. pylori nulemto gastrito mažėja pepsino sekrecija, tuo pačiu ir intra-gastrinė askorbininės rūgšties koncentracija, kuri apsaugo nuo oksidacinio DNR pažeidimo [32].
15
H. pylori pasižymi skirtingu virulentiškumu. Ištyrus šių bakterijų
genomą, pastebėta, kad bakterijos su aktyviais cagA (angl. cytotoxin
asso-ciated gene), vacAs1m1 (angl. vacuolating cytotoxin A) genais sukelia
inten-syvesnį uždegiminį atsaką, todėl siejamos su didesne skrandžio vėžio išsivystymo rizika [33].
Rizikos veiksnių tyrinėjimai atveria naujas galimybes ligos kontrolei, o molekulinės biologijos atradimai sudaro sąlygas vėžio patogenezės samp-ratai.
3.3. Lėtinis atrofinis gastritas
Lėtinis atrofinis gastritas yra ilgalaikis skrandžio gleivinės uždegimas. Dėl šio uždegimo nyksta skrandžio gleivinės liaukinis epitelis, jis yra keičiamas žarniniu epiteliu ar jungiamuoju audiniu. H. pylori infekcija yra viena svarbiausių priežasčių, dėl kurių susidaro skrandžio gleivinės atrofija [34]. Lėtinis atrofinis gastritas (LAG) yra esminis veiksnys skrandžio žarninei adenokarcinomai išsivystyti ir yra laikomas ikivėžine būkle [30]. Pakopinio skrandžio vėžio vystymosi etapai grafiškai pavaizduoti 3.3.1 pav. [35].
16
Yra žinoma, kad atrofiniu gastritu sergantiems asmenims skrandžio vėžio rizika yra 16 kartų didesnė, lyginant su bendra populiacija [5, 6]. Rizika dar labiau išauga, progresuojant atrofinio gastrito ir metaplazijos laipsniui; esant sunkios formos multižidininiam tiek skrandžio urvo, tiek kūno gleivinės pažeidimui, ši rizika padidėja iki 90 kartų [34].
Atsižvelgiant į tai, kad atrofinio gastrito išsivystymas siejamas su ilgalaikiu (dešimtmečiais trunkančiu) H. pylori infekcijos persistavimu skrandžio gleivinėje, nenuostabu, kad liga dažniausiai nustatoma vyres-niems nei 50 metų amžiaus pacientams. Lėtinio atrofinio gastrito paplitimas skirtinguose regionuose, kaip ir skrandžio vėžio, skiriasi ir pasižymi tomis pačiomis tendencijomis. Populiacinių tyrimų, atliktų 2008–2011 metais, duomenimis, susirgimų atrofiniu gastritu dažnis Vakarų ir Šiaurės Europos šalyse (Vokietijoje, Suomijoje, Švedijoje) siekė 3,5–6 proc., o Rytų Azijos šalyse (Kinijoje ir Japonijoje) – 55–64 proc. [36].
Lietuvos sveikatos mokslų universito Gastroenterologijos klinikos atlik-tų ir 2007 metais publikuoatlik-tų tyrimų duomenimis, skrandžio gleivinės atrofijos dažnis viršijo 65 proc. tarp vyresnių nei 55 metų pacientų, besikrei-pusiųjų į gydymo įstaigą dėl dispepsijos [37].
Pastebėta, kad pirmiausia atrofinio gastrito požymiai atsiranda antrumi-nėje skrandžio dalyje, o vėliau, progresuojant ligai, apima visą skrandžio gleivinę.
Atrofinis gastritas nepasižymi specifine simptomatika. Diagnostika re-miasi morfologiniu tyrimu. Jo metu nustatoma padidėjusi lamina propria limfocitų (lėtinio uždegimo rodiklis), plazmos ląstelių, histiocitų, neutrofilų (uždegimo aktyvumo rodiklis) infiltracija. Ligai progresuojant, gleivinėje randami limfiniai folikulai, nustatomas skrandžio liaukinio epitelio nyki-mas – atrofija. Uždegiminis komponentas gali persistuoti viso daugiapa-kopio proceso metu, tačiau dažniau pastebima tendencija, kad išplitus pro-cesui, uždegimo intensyvumas mažėja [38]. Atrofiniam gastritui progresuo-jant dar labiau, vystosi žarninės metaplazijos židiniai.
Atrofinio gastrito diagnozė gali būti nustatoma ir neinvaziniais tyrimo metodais. Pepsinogeno I ir pepsinogeno II santykio nustatymas kraujo serume yra pakankamai jautrus ir specifiškas tyrimas skrandžio atrofijai įvertinti [35].
Lėtinio atrofinio gastrito gydymas, remiantis Mastrichto III konsensuso kriterijais, yra H. pylori eradikacija [39]. Tačiau išlieka neaišku, ar, išsivys-čius žarninei metaplazijai ir eradikavus H. pylori infekciją, onkogenezės procesas gali būti grįžtamas.
17
3.4. Skrandžio vėžio morfologijos ypatumai
Apie 90 proc. skrandžio vėžio atvejų sudaro adenokarcinomos [30]. Skrandžio adenokarcinomoms klasifikuoti jau daugiau nei 50 metų naudo-jama Lauren histologinė klasifikacija [40]. Pagal šią klasifikaciją navikai skirstomi į dvi pagrindines grupes – intestinalinę ir difuzinę, taip pat rečiau pasitaikančią, mišrią formą [40]. Nustatyta, kad apie 54 proc. adenokarci-nomų sudaro intestinalinė forma, 32 proc. – difuzinė, apie 15 proc. – mišri forma [41]. Intestinalinė skrandžio vėžio forma yra daugiapakopio proceso pasekmė, kai normali skrandžio gleivinė transformuojasi į ūmų, vėliau – lėtinį gastritą, atrofiją, intestinalinę metaplaziją ir displaziją [42]. Difuzinės adenokarcinomos išsivystymas nepriklauso nuo atrofinio gastrito ar metaplazijos proceso [43]. 2010 metais paskelbta PSO klasifikacija, pagal kurią skrandžio navikai skirstomi į keturias pagrindines histologines grupes: tubulinė, papilinė, mucininė, blogai adhezuojanti (įskaitant ir žiedinių ląstelių karcinomą); išskiriami kiti reti histologiniai ligos variantai [44].
Šiuolaikinė skrandžio vėžio adenokarcinomos patologinė diagnostika neapsiriboja naviko tipo ir išplitimo įvertinimu. Molekulinių tyrimų poreikis vis didėja. Šiuo metu žmogaus epidermio augimo veiksnio HER2 recepto-riaus baltymo nustatymas tampa standartu suformuluojant patologinę skrandžio adenokarcinomos diagnozę. HER2 receptorius priklauso epider-mio augimo veiksnių receptorių šeimai (EGFR), reguliuoja ląstelės signalo perdavimą, proliferaciją, diferenciaciją ir išlikimą [45, 46]. Tyrimai rodo, kad padidėjusi HER2 receptoriaus raiška pasireiškia nuo 12 proc. iki 22,1 proc. skrandžio adenokarcinomų atvejų [46-49]. Nustatyta, kad padidėjusi HER2 baltymo raiška dažnesnė žarninės formos pagal Lauren navikuose, lokalizuotuose skrandžio proksimalinėje dalyje [50, 51]. Padidėjusi HER2 baltymo raiška siejama su agresyvesne ligos eiga ir blogesne pacientų prognoze [51]. 2010 metais publikuoti III fazės klinikinio tyrimo TOGA rezultatai, pagrindžiantys monokloninio antikūnio prieš HER2 receptorių trastuzumabo derinyje su chemoterapija naudą, kai navikiniame audinyje yra padidėjusi HER2 baltymo raiška, pacientams su lokaliai ar sistemiškai išplitusia liga [49].
3.5. Epigenetiniai pokyčiai: jų svarba skrandžio onkogenezei 3.5.1. Epigenetiniai pokyčiai
Epigenetikos terminas pirmą kartą paminėtas mokslininko Conrad Hal Waddington 1942 metais, siekiant apibrėžti priežastinį ryšį tarp chromatino struktūros ir genų funkcijos vystymosi procesų [52]. Šiuo metu epigenetikos
18
terminas yra platesnis ir apibrėžiamas kaip mokslas apie paveldimus genų raiškos skirtumus, kurie nesusiję su DNR sekų pokyčiais. Epigenetiniai mechanizmai yra klasifikuojami į šias pagrindines grupes [53]:
• DNR metilinimą; • Histonų modifikacijas;
• Nekoduojančių RNR funkciją.
Dėl epigenetinių pokyčių yra keičiamas genų ekspresijos profilis ir fenotipas, didinant arba mažinant kai kurių faktorių prieinamumą prie ląstelės genetinės medžiagos [54]. Fiziologinis šio proceso pavyzdys yra moterų x chromosomos deaktyvavimas. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad tokie veiksniai, kaip dieta, tabakas, alkoholio vartojimas, fizinis aktyvumas, stresas, cheminių ar infekcinių kancerogenų ekspozicija daro įtaką epige-nomui [55-57]. Sutrikęs epigenetinis genų ekspresijos reguliavimas yra patogenezinė grandis daugelio ligų išsivystyme, tarp jų ir navikinių susirgimų [58]. Virškinamojo trakto navikai nėra išimtis – šiuo metu sutelktos gausios mokslinių grupių pajėgos suteikia vis daugiau informa-cijos apie epigenetinių pokyčių svarbą virškinamojo trakto navikų vysty-muisi ir progresijai, o dabar jau yra siūlomi perspektyvūs biožymenys ankstyvajai diagnostikai, ligos prognozei ir gydymo predikcijai nustatyti. Mokslininkų entuziazmą dar labiau didina faktas, kad epigenetiniai pokyčiai yra potencialiai grįžtami, todėl ši sritis yra perspektyvi, kuriant ir išbandant naujus onkologinių ligų gydymo metodus [54].
3.5.2. DNR metilinimo reikšmė onkogenezei
Epigenetinis procesas – CpG salų, esančių genų promotoriaus srityje, metilinimas lemia DNR struktūros pokyčius, keičiančius genų ekspresiją
[7]. CpG salos – tai DNR regionai, pasižymintys dideliu citozino-guanino nukleotidų kiekiu; dažniausiai jie yra genų 5’ reguliaciniame gale. Žinoma, kad 50-70 proc. genų promotorių yra išsidėstę tarp CpG salų [60]. DNR metilinimas vyksta, kuomet prie 5 pozicijoje esančio citozino kovalentine jungtimi prisijungia metilo grupė (–CH3) [8].
Citozino metilinimo reakcija yra katalizuojama fermentų, vadinamų DNR metiltransferazėmis. Šiuo metu yra žinomos penkios DNR metiltransferazės: DNR metiltransferazė 1, 2, 3a, 3b ir 3L [8]. Dėl DNR metiltransferazių metilo grupė nuo S-adenozilmetionino perkeliama cito-zinui, o pastarasis virsta S-adenozilhomocisteinu. Citozino metilinimo procesas pavaizduotas 3.5.2 pav.
19
3.5.2 pav. Citozino metilinimo procesas (mCpG – metilintos salos;
CpG – nemetilintos geno promotoriaus salos, A-citozino, esančio 5 pozicijoje metilinimas, katalizuojamas DNMT-DNR metiltransferazės).
DNR metiltransferazė 1 atsakinga už metilinimo palaikymą (angl.
maintenance methylation), vykstant ląstelės dalijimuisi. S fazės metu
fermentas išskirtinai veikia pusiau metilintus (angl. hemimethylated) DNR CpG dinukleotidus [60]. De novo DNR metilinimas vyksta dėl metil-transferazių 3a ir 3b poveikio [61]. DNR metiltransferazė 3L pasižymi stimuliuojančiu poveikiu de novo metiltransferazei 3a [62, 63], o metiltrans-ferazės 2 funkcija išlieka nežinoma.
Somatinėse ląstelėse genų promotoriaus hipometilinimas yra retas reiškinys. Tačiau moksliniai tyrimai parodė, kad šio regiono hipermetili-nimas dažnai nustatomas navikiniame audinyje [64]. Naviką slopinančių genų promotorių metilinimas yra ankstyvas onkogenezės reiškinys, kuris intensyvėja iki fenotipinės naviko išraiškos [65]. Hipermetilinimas susijęs su visomis navikų patogenezinėmis grandimis, tokiomis kaip DNR pažaidų atitaisymas (hMLH1, BRCA1, MGMT ir kt.), ląstelės ciklo reguliavimas (p16, p14, p15 ir kt.), apoptozė (DAPK šeima, APAF-1 ir kt.), onkogenezės metabolizmas (GSTP1 ir kt.), hormoninio atsako reguliavimas (RAR 2 ir kt.), ląstelės adhezija (CDH1, CDH13 ir kt.) [66]. Pastebėta, kad kiekviena naviko lokalizacija pasižymi specifinių genų metilinimu, taip pat skirtingas genų metilinimas gali būti siejamas su onkologinio proceso išplitimu, specifiniu histologiniu tipu, prognoze ar atsaku į gydymą [8].
20 DNR hipometilinimas
Ląstelėje pericentromerinis heterochromatinas, sudarytas iš glaudžiai supakuotų pasikartojančių DNR sekų, dažnai būna metilintas. Taip minėtos sekos (LINE, SINE, IAP ir Alu) tampa neaktyvios ir yra užtikrinamas genomo integralumas ir stabilumas. Pasikartojančios sekos LINE, Alu atitinkamai sudaro daugiau nei 18 proc. ir 10 proc. žmogaus genomo [67, 68]. Globalus hipometilinimas – tai viso genominio metilcisteino sumažė-jimas maždaug nuo 4 proc. normalioje ląstelėje iki 2–3 proc. navikiniame audinyje [69]. Šis procesas pirmą kartą nustatytas 1983 metais storosios žarnos navikinėse ląstelėse [70]. Daugiau nei vienas trečdalis DNR hipometilinimo atvejų nustatoma pasikartojančiose sekose. Todėl hipometilinimas, nustatytas šiose sekose, netiesiogiai rodo globalaus hipometilinimo mastą, dažnai aptinkamą navikiniame audinyje [71]. Globalus hipometilinimas mokslinėje literatūroje siejamas su kolorektalinio, uroepitelio, kiaušidžių, gimdos kaklelio, prostatos, neuroendokrininių, hematologinių ir kitų navikų išsivystymu ir progresija [64].
Atskirų genų hipometilinimas – retas reiškinys onkologijoje. Tokiu būdu dažniausiai yra aktyvuojami audiniams specifiški genai, tokie kaip
MAGE (paprastai ekspresuojamas tik germinacinėse ląstelėse, tačiau tarp
onkologinių ligų nustatomas skrandžio, kolorektalinio ir kt. navikų atvejais),
SNCG (ląstelės tipui specifiškas genas, jo hipometilinimas nustatytas
krūties, kiaušidžių, skrandžio navikų atvejais) ir kt. [8]. 3.5.3. DNR metilinimo tyrimo metodai
DNR metilinimo tyrimo metodai skirstomi į dvi pagrindines grupes: bisulfitinius ir nebisulfitinius. Bisulfitinių tyrimų metodikos pagrindas yra DNR nemetilinto citozino keitimas uracilu dėl natrio bisulfito poveikio, o metilintas citozinas lieka nepakeistas. Nebisulfitinis tyrimo metodas parem-tas metilinimui jautrių restrikcinių fermentų funkcija, kurie kerpa DNR tam tikroje vietoje, priklausomai nuo metilinimo būklės, specialių antikūnių precipitacijos reakcijos ar prie specialių metilintų CpG salelių besijun-giančių baltymų funkcijos būdu.
MS-PGR bisulfitinio DNR metilinimo tyrimo metodo esmė – po konvertavimo metilinta DNR yra amplifikuojama polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metu su specifiniais pradmenimis [72]. Šis kokybinis ty-rimo metodas yra jautrus ir specifinis, juo nustatomas atskirų genų metili-nimas. Po DNR bisulfitinio konvertavimo CpG salelių metilinimas gali būti tiriamas naudojant ir sekvenavimo metodą. Šio metodo privalumai – gali būti tiriamas platus metilintų genų spektras, kiekybinis rezultatų vertinimas.
21
Kitas kiekybinis tyrimo metodas yra MS-HRM (angl.
Methylation-sensitive high resolution melting), kurio esmė – metilinta DNR, palyginus
su nemetilinta DNR, po bisulfitinimo įgauna skirtingas sekas, ir jos pasi-žymi skirtingomis tirpumo savybėmis [94]. Kombinuota bisulfitinio modifi-kavimo ir restrikcijos analizė (angl. COBRA combined bisulfite restriction
analysis) yra paremta PGR produktų po bisulfitinmo restrikcinių fermentų
poveikiu ties nepakeistomis CpG salomis [73]. Tai – kiekybinis atskirų genų tyrimo metodas, kuriam reikia nedidelio DNR kiekio ir kuriam medžiaga gali būti gaunama iš parafininių blokų [73].
Nebisulfitiniai tyrimo metodai paremti restrikcinių fermentų, specialių antikūnių ar baltymų funkcija kirpti ar jungtis prie DNR metilintų CpG salelių. Metilinta DNR gali būti tiriama tiek PGR, sekvenavimo ar atskirų genų rinkiniais, po to, kai prie metilintų CpG salų prisijungia 5-metilci-tozino antikūniai – CpG salelių specifiniai metilinimo baltymai (angl. MBD
methylation binding domain) ar specialūs metilinimui jautrūs restrikciniai
fermentai. Galimi tiek atskirų genų, tiek daugybinių metilintų genų tyrimai. 3.5.4. Histonų modifikacijos reikšmė
Histonai – baltymai, sudarantys nukleosomos (mažiausias chromatino struktūros vienetas) šerdį, kurios paviršiuje yra DNR grandinė. Histonai turi sferinį C-galą bei nestruktūrinį N-galą [74]. Dauguma modifikacijų vyksta histonų N-galuose. Galimos kelios kovalentinės histonų modifikacijos: fosforilinimas, acetilinimas, metilinimas, ubikvitinilinimas, sumoilinimas, karbonilinimas [75]. Šie procesai, keisdami DNR erdvinę poziciją, reguliuo-ja transkripciją, replikaciją ir pažaidų atitaisymą [75]. Histonų modifikacijos keičia chromatino prieinamumą arba specifinių baltymų, dalyvaujančių transkripcijos procese, funkciją [53]. Skirtingos ląstelių rūšys pasižymi savi-ta histonų modifikacija, pvz. embrioninės kamieninės ląstelės turi bivalen-tines sritis – aktyvią H3K4me3 ir slopinančią H3K27me3, esančias svarbių vystymuisi genų promotorių regione [76]. Taip vystymosi proceso metu yra užtikrinamas embrioninių kamieninių ląstelių fenotipinis plastiškumas. Diferencijuotos ląstelės pasižymi labiau rigidiška chromatino struktūra, užtikrinančia jų fenotipinę išraišką dalijimosi proceso metu.
Histonų funkcija dinamiškai reguliuojama specialių fermentų, kurie skatina arba slopina kovalentinių modifikacijų susidarymą. Dėl histonų acetiltransferazių (HAT) ir histonų metiltransferazių (HMT) acetilo ir metilo grupės yra prijungiamos prie histono, o dėl histonų deacetilazių (HDAC) ir demetilazių (HDM) poveikio jos yra pašalinamos [77, 78]. Histonų acetili-nimo ir deacetiliacetili-nimo proceso įtaka chromatino struktūrai grafiškai pavaiz-duota 3.5.4 pav. [54].
22
3.5.4 pav. Histonų acetilinimo ir deacetilinimo proceso įtaka
chromatino struktūrai. Žalia spalva pavaizduota atvira struktūra, kai genų transkripcija yra galima, raudonai – uždara chromatino
struktūra, kai genų transkripcija nevyksta.
DNR metilinimo ir histonų modifikacijos procesai yra tarpusavyje glaudžiai susiję. Tarpusavio sąveika lemia genų ekspresiją, chromatino organizaciją ir fenotipinę ląstelės išraišką [79]. Kelios histonų metiltransfe-razės (pvz. G9a, SUV39HI ir kt.), veikdamos DNR metiltransferazę, gali aktyvinti DNR metilinimo procesą [53]. Taip pat DNR metiltransferazių ir histonų deacetilazių sąveika gali lemti chromatino kondensaciją. DNR metilinimas specialiais baltymais (MeCP2) gali daryti įtaką histonų funk-cijos pokyčiams [80].
Tik histonų acetilinimas ir metilinimas šiuo metu siejamas su vėžio patogeneze ir klinikine reikšme [81]. Įvairių navikinių susirgimų metu daž-nai nustatomas histonų deacetilazės (HDAC-1, HDAC-2) funkcijos padidė-jimas, lemiantis histonų deacetilinimą [82, 83]. Moksliniai tyrimai rodo, kad onkologinių ligų metu keičiasi ir histonų acetiltransferazių funkcija [81]. Histonų metilinimas taip pat nulemtas onkogenezės metu, tačiau šio proceso metu, skirtingai negu nuo acetilinimo, prisijungusi metilo grupė ženkliau histono molekulinio krūvio nekeičia, tačiau veikia molekulės hidrofobiš-kumą, keisdama afinitetą transkripcinių baltymų prisijungimui [84]. Vienas labiausiai aprašomų yra EZH2 histono metilinimas, siejamas su BRCA-1 geno funkcija [85].
Histonų modifikacijos moksliniai tyrimai atskleidžia vis naujų gali-mybių susieti radinius su klinikine praktika.
3.5.5. Mikro-RNR vaidmuo onkogenezėje
Mikro-RNR istorija prasidėjo 1993 metais, kai grupė mokslininkų aprašė naujai nustatytas viengrandes RNR molekules [86]. Mikro-RNR – tai baltymo nekoduojančios trumpos (sudarytos iš 21–23 nukleotidų) RNR
23
sekos. Jų veikimo mechanizmas – specifinės mikro-RNR jungiasi su infor-macine RNR komplementiškumo principu, taip blokuodamos transliacijos procesą [87]. Šiuo metu yra žinoma, kad atskiros mikro-RNR gali reguliuoti daugelio iRNR funkciją [88]. Jų funkcija užtikrina palengvintą RNR procesą – vadinamąjį splaisingą, kurio metu iškerpamos nekoduojančios sekos, o koduojančios sekos jungiamos į vieną.
Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad nekoduojančios trumposios RNR sekos per specialių baltymų funkciją dalyvauja ir potransliacinių epigenetinių procesų reguliavime. Mikro-RNR gali reguliuoti tiek histonų kovalentines modifikacijas, tiek DNR metilinimo procesą. Grafiškai šis procesas pavaizduotas 3.5.5 pav. [89].
3.5.5 pav. Epigenetinės raiškos reguliavimo sąsaja su mikro-RNR funkcija.
Mikro-RNR funkcija reguliuoja tiek naviką slopinančius genus, tiek onkogenus [90]. Kai kurie autoriai mikro-RNR molekules priskiria naujos klasės onkogenams ar naviką slopinantiems genams [54]. Šiuo metu nustatytas didelis skaičius padidėjusio aktyvumo mikro-RNR, dalyvaujančių skirtingų navikų onkogenezėje. Atskirai paminėtinos kelios mikro-RNR-17, RNR-19a, RNR-20, RNR-92, RNR-107, mikro-RNR-221, mikro-RNR-223, mikro-RNR-372 ir mikro-RNR-373 ir kt. savo funkcija elgiasi kaip onkogenai [91–93]. Tačiau kai kurių trumpųjų RNR sekų funkcija naviko formavimosi ir progreso atveju būna sumažėjusi. Tokios mikro-RNR sekos priskiriamos naviką slopinančių genų kategorijai. Tokiu poveikiu pasižymi šios mikro-RNR: mikroRNR-31, mikroRNR-148b, mikro-RNR-181a ir kt. sekos [95–97].
Mažųjų RNR sekų nustatymas yra perspektyvi sritis onkologijoje. Vis daugėja duomenų apie jų, kaip diagnostinių, prognostinių ir predikcinių molekulinių žymenų svarbą.
3.5.6. Epigenetinės navikų terapijos galimybės
Histonų deacetilinimo inhibitoriais dažniausiai vadinama aktyvių medžiagų, veikiančių tokias histonų deacetilazės klases, kaip I-HDAC1, 2, 3 ir 8, II-HDAC 4, 5, 6, 7, 8, 9 ir 10, IV-HDAC-11, kategorija [98].
Deacetila-24
zių inhibitorių klasifikacija paremta jų chemine sudėtimi. Histonus veikian-čių medžiagų funkcija yra labai plati ir apima genų ekspresiją: ląstelės ciklo reguliavimą, ląstelės proliferaciją ir diferenciaciją, mitotinį aktyvumą, pažaidų atitaisymą, angiogenezę, apoptozę ir kt. Šios medžiagos taip pat pasižymi imunomoduliuojančiu poveikiu. Skirtingai nuo kitų antivėžinių terapijų, jos pasižymi transformuotos ląstelės mirties inicijavimu, nepriklau-somai nuo ląstelės ciklo periodo [99]. Histonų deacetilazės inhibitorių, tokių kaip varinostatas, valproinė rūgštis, azacitidinas, romidepsinas, resvaratrolis ir kt. preparatai monoterapija ar derinyje su chemoterapija yra tiriami I-IV fazės tyrimuose hematologiniams ir solidiniams navikams gydyti [98]. Kai kurie iš jų jau naudojami klinikinėje praktikoje, pavyzdžiui, azacitidinas mielodisplastiniam sidromui gydyti [100].
Histonų acetilazės inhibitoriai, savo poveikiu slopindami histonų aceti-linimą, tiriami kaip taikiniai navikams gydyti. Vienas iš jų – curcumin – tiriamas I–II fazės klinikiniuose tyrimuose mielomos, krūties, kolorektali-niams, kasos navikams gydyti [98].
Epigenetinių tyrimų taikiniai jau nukreipti ir į procesą – vadinamąjį histonų metilinimą, ir jį reguliuojančias histonų metiltransferazes bei deme-tilazes, tačiau jų aktyvumo rezultatai kol kas gaunami tik iš preklinikinių tyrimų.
3.6. Epigenetinių poveikių įtaka skrandžio onkogenezei 3.6.1. DNR metilinimas ir skrandžio onkogenezė
DNR metilinimas – svarbus veiksnys skrandžio vėžio išsivystymui ir progresijai. Šiuo metu žinoma apie 100 genų, kurių funkciją reguliuoja šis epigenetinis mechanizmas [101]. Skrandžio vėžio onkogenezę lemia tiek DNR hipometilinimas, tiek hipermetilinimas.
Globalus DNR hipometilinimas yra siejamas su H. pylori infekcija [102]. Pasikartojančių sekų, kaip LINE-1, Alu, hipometilinimas nustatomas jau ankstyvuose karcinogenezės perioduose [102]. Su atskirų genų promotorių hipometilinimu skrandžio vėžio atveju siejama keletas genų, iš kurių paminėtini: su signalo perdavimu susijęs genas HRAS, ląstelės ciklo reguliavimu – MOS, MYC, DNR sinteze – MTHFR [25,103-104]. Publikuoti tyrimai rodo, kad su ląstelės ciklo reguliavimu susijusio geno MOS hipometilinimas lemia didesnę naviko invaziją, limfmazgių pažeidimą ir yra susijęs su difuzine skrandžio vėžio forma [104].
DNR hipermetilinimas yra vienas aktyviausiai šiuo metu tyrinėjamų procesų, darančių įtaką skrandžio vėžio onkogenezei. Manoma, kad DNR
25
CpG salelių hipermetilinimas yra vienas anksčiausių procesų, vykstant
ląstelės maligninei transformacijai [102].
DNR CpG salų metilinimas siejamas su H. pylori infekcija. Iki 80 proc. pacientų, sergančių skrandžio adenokarcinoma, infekuoti arba praeityje turėjo H. pylori infekciją [105]. Tyrimai rodo, kad, esant H. pylori infekci-jai, CpG salelių metilinimas skrandžio audinyje nuo 5,4 iki 303 kartų dažnesnis, palyginti su gleivine be infekcijos požymių [106]. Su H. pylori infekcija siejamas genų promotorių metilinimas: p16, CDH1, CDKN2A,
LOX, HAND1, ARC, APC, COX2, hMLH1 ir kt. [106, 107]. Infekcijos
eradi-kacija ne visuomet lemia epigenetinio mechanizmo grįžtamumą. Publikuoti duomenys rodo, kad, esant gleivinės intestinės metaplazijos požymiams,
CDH1, APC, p16, COX2 genų metilinimas po H. pylori eradikacijos
suma-žėjo arba išnyko, tačiau hMLH1 metilinimo lygis nepakito [108].
Skrandžio adenokarcinomos vystymasis yra daugiapakopis procesas, todėl neatsitiktinai tiriamas genų promotorių metilinimas ir ikivėžiniuose skrandžio glevinės pokyčiuose. Daugiausia tirtas GSTP1, RASSF1A,
THBS1, TIMP-3, APC, CDH1 ir kt. CpG salų genų hipermetilinimas [108,
109]. Šių genų metilinimo dažnis didėja pereinant nuo lėtinio gastrito, intestinės metaplazijos, adenomos iki skrandžio adenokarcinomos [108].
Histologiniai skrandžio vėžio variantai skiriasi savo patogenezinėmis grandimis. Tai įrodo ir genų metilinimo skirtumai: difuzinio skrandžio vėžio atveju, palyginti su intestinaline forma, dažniau nustatomas CDH1, p14, intestinalinės formos atveju – p16, APC, RUNX3 genų metilinimas [110, 111].
Vis dažniau bandoma nustatyti ne tik genų promotorių metilinimo svarbą onkogenezei, bet ir šio molekulinio reiškinio prognozinę ir predikci-nę vertę. Metaanalizės duomenimis, 28 studijos nurodo 40 skirtingų genų metilinimo sąsają su pacientu išgyvenamumu [101]. Blogesnę ligos prog-nozę dažniausiai lemia naviką slopinančių genų metilinimas (APC, BNIP3,
BCL68 ir kt.), palankesnė prognozė yra, kai CpG salelių metilinimas
randa-mas PTGS2, MINT31, MLH1, MAL genuose [101].
DNR CpG salų metilinimas ateityje galėtų būti ir predikcinis veiksnys. Jau dabar žinoma, kad DAPK-1, TMSI metilinimas lemia chemoterapinio gydymo efektyvumą [12].
Reikšmingi darbai skrandžio vėžio genų metilinimo srityje atlikti ir Lietuvos sveikatos mokslų universitete. A. Ivanausko daktaro disertacinia-me darbe pirmą kartą nustatytas geno TPEF/HPP1 hiperdisertacinia-metilinimas skrandžio navikiniame audinyje [112]. Ankstesni tyrinėjimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete sudarė prielaidas tęsti genų promotorių metilinimo ypatumų mokslines paieškas.
26
3.6.2. Histonų modifikavimas ir skrandžio onkogenezė
Histonų metilinimo procesas skrandžio vėžio atveju siejamas su pakitusia onkogenų, naviką slopinančių, su ląstelės ciklu ir ląstelės adhezija susijusių genų raiška [113]. Histono H3K4me3 metilinimas sąlygoja genų
LAMB3 ir LAMC2 raiškos pakitimus [114]. Mokslinėje periodikoje
nurodo-ma, kad padidėjęs H3K4me3 metilinimas sietinas su didesne lokalia skran-džio vėžio invazija ir didesne rizika navikui recidyvuoti [115]. Histonų ace-tilazių ir deaceace-tilazių funkcijos balanso sutrikimas įtakoja skrandžio vėžio vystymąsi ir progresavimą; šio proceso veikiami H3, H4 histonai [116].
Dabartiniu metu daugėja duomenų apie histonų modifikacijos įtaką skrandžio onkogenezei ir vertinama histonų deacetilazės inhibitorių terapinė nauda ikiklinikiniuose ir klinikiniuose tyrimuose. Varinostato, histonų deacetilazės inhibitoriaus, ikiklinikiniai tyrimai parodė, kad derinyje su taksanais jis yra potencialiai veiksmingas gydant skrandžio adenokarcinomą [117, 118]. Šiuo metu vyksta I /II fazės klinikiniai tyrimai, kurių tikslas – įvertinti preparato derinio su chemoterapija efektyvumą, gydant išplitusį skrandžio vėžį.
3.6.3. Mikro-RNR ir skrandžio onkogenezė
Genų transkripcijos reguliaciniai sutrikimai, nulemti mikro-RNR funkcijos, yra dažnas reiškinys skrandžio vėžio onkogenezėje; jis susijęs su ląstelių proliferacija, invazija, rezistencija apoptozei ar metastazių formavi-musi [119]. Šiuo metu dešimtimis skaičiuojamos trumposios RNR sekos, dalyvaujančios skrandžio vėžio onkogenezėje. Su H. pylori nulemtu skran-džio vėžio vystymusi ir progresija siejama mikro-RNR-222, mikroRNR-223 raiška [120, 121].
Žinoma, kad skirtingų skrandžio anatominių lokalizacijų patogenezė yra skirtinga. Tai patvirtinama ir molekuliniu lygiu. Specifinės RNR trumposios sekos siejamos su skrandžio vėžio lokalizacija: padidėjusi mikro-RNR-375 raiška vyrauja distalinės skrandžio dalies adenokarcinomos atveju [122].
Kaip ir kitų onkologinių ligų atveju, trumposios RNR sekos gali būti ligos išplitimo molekuliniai indikatoriai. Yra duomenų, kad mikro-RNR-221, mikro-RNR-376C, mikro-RNR-744, mikro-RNR-421 padidėjusi raiška nustatoma esant ankstyvam onkoprocesui, todėl ateityje minėtosios sekos gali tapti potencialiais ankstyvos ligos diagnostikos biomarkeriais, juolab, kad pastarieji nustatomi kraujo serumo ar skrandžio sulčių mėginiuose [123].
Galima prognozine verte pasižymi toliau išvardintos mikro-RNR: miR101, miR200C, miR-335, miR-93, miR-107. Jos susijusius su naviko lokaliu plitimu ir metastazavimo rizika [124–128].
27
Šiek tiek didesnės nei 20 nukleotidų sekos ateityje gali nulemti ir spe-cifinio gydymo pasirinkimą. Jau dabar žinoma, kad mikro-RNR-32, 197, 210, 1229, 1238, 3131 ir kt. nustatomos fluorouracilui (vienas pagrindinių citotoksinių preparatų, naudojamų skrandžio vėžiui gydyti) rezistentiškose skrandžio vėžio ląstelių linijose [129]. Yanq ir bendraautoriai nustatė, kad mikro-RNR-21 raiška, moduliuodama PTEN/PI3K/Akt patogenezinę gran-dį, gali būti atsakinga už skrandžio vėžio ląstelių atsparumą alkilinančiam citotoksiniam vaistui – cisplatinai [130].
3.7. hMLH1, MGMT, DAPK, CASP8 genų funkcijos apžvalga Vienas iš onkogenezės apibrėžimų yra nekontroliuojama ląstelių proli-feracija. Šis procesas yra ženkliai pagreitinamas, kai sutrinka svarbių genų, reguliuojančių ląstelės ciklą, funkcija. Mokslininkai Kinzler ir Vogelstein 1997 metais įvardijo pagrindines genų grupes, reguliuojančias šiuos mecha-nizmus – tai su DNR pažaidų atitaisymu susijusių genų funkcija, kurie užtikrina mutacijų ir kitų DNR pažaidų atitaisymą prieš tolimesnį ląstelės dalijimąsi, bei naviką slopinantys genai, kurie indukuoja natūralią ląstelės mirtį – apoptozę, jei nustatomas sunkus genominis defektas [9].
Moksliniu tyrimu bandėme išsamiau pažvelgti į šių onkogenezei svarbių procesų (DNR pažaidų atstatymas ir apoptozė) epigenetinio regu-liavimo – DNR metilinimo aspektus skrandžio vėžio vystymosi procese.
DAPK-1 (angl. Death associated protein kinase) genas – vienas iš trijų DAPK šeimos genų, koduoja kalcio kalmodulino reguliuojamą
serino-treonino proteinkinazę. Jis lokalizuotas 9 q21.33 chromosomoje [131]. Šiuo metu yra žinoma, kad DAPK-1 baltymo funkcija glaudžiai siejasi su įvai-riomis apotozės grandimis. DAPK-1 genas dalyvauja interferono γ modu-liuojamoje apoptozės grandyje [132]. Kiti, vėliau identifikuoti – sąsajos taškai, tačiau ne mažiau svarbūs yra tumoro nekrozės faktorius α, TNFR1, FADD, augimo faktorius β netrin-1 receptorius UNC5H2, ekstraląstelinė signalo reguliavimo sistema ERK [133]. Taip pat žinoma, kad p53 grandies aktyvinimas dėl DNR pažeidžiančių veiksnių ar onkogenų funkcijos lemia padidėjusią DAPK-1 geno raišką; reguliavimo mechanizmas gali būti ir atvirkštinis, grįžtamojo ryšio principu [134].
Analizuojant DAPK-1 baltymo funkciją, pastebėta, kad jis dalyvauja autofaginiame ląstelės procese. Baltymo tikslas yra užtikrinti ląstelės katabolinę funkciją, o jai esant nepakankamai, kitas etapas yra apoptozė. Šie procesai rodo mūsų pasirinkto geno funkcijos platumą [133,134].
Sutrikęs epigenetinis DAPK-1 funkcijos reguliavimas yra dažnas reiš-kinys įvairių navikų išsivystymo ir progreso procesuose. Tai susiję su DNR
28
hipermetilinimu, histonų deacetilinimu ir specifinių mikro-RNR funkcijo-mis. DAPK-1 geno hipermetilinimas patvirtintas įvairiems solidiniams ir hematologiniams navikams: plaučių, šlapimo pūslės, galvos-kaklo, krūties, B ląstelių limfomos atveju, palyginus sveikus atitinkamų organų audinius su navikiškai pakitusiu audiniu [135–139].
Skrandžio vėžys nėra išimtis – geno promotoriaus metilinimas būdingas ir šiai naviko lokalizacijai. Tačiau, skirtingų autorių duomenimis, įvairiuose geografiniuose regionuose epigenetinio proceso dažnis labai skiriasi [10– 16]. DAPK-1 metilinimas dažnesnis H. pylori infekcijos atveju [108]. Lite-ratūroje pažymima, kad DAPK-1 genas susijęs, kaip anksčiau minėta, su p53 ir kitų grandžių funkcija ir atvirkščiai koreliuoja su mikrosatelitų nestabi-lumu [18]. Tačiau nėra duomenų apie DAPK-1 metilinimo sąsajas su vienu iš svarbiausių genų, lemiančių mikrosatelitų nestabilumą hMLH1 metili-nimu.
Šiuo metu daugėja duomenų, kad geno epigenetinis pokytis gali ateityje tapti neigiamu predikciniu veiksniu, nustatant atsaką į chemoterapinį gydy-mą fluoropirimidinu pagrindu [12]. Geno DAPK-1 promotoriaus metilini-mas siejami ir su pacientų prognoze. Moksliniai tyrimai rodo, kad geno me-tilinimas siejamas su trumpesniu pacientų bendru išgyvenamumu [12, 140]. Kitas mūsų pasirinktas tirti genas savo funkcija yra susijęs netiesiogiai su DAPK-1, per tarpinius baltymus, – CASP8 (angl. cysteine
aspartyl-specific proteases). Šis genas priklauso kaspazių šeimai. Genas yra
lokali-zuotas 2q3 chromosomoje. CASP8 geno funkcija glaudžiai siejasi su naviko nekrozės faktoriais, jų receptoriais, tokiais kaip: Fas, TRAIL. Taip pat geno koduojamas baltymas sąveikauja su proapototiniais baltymais FADD, DISC ir kt. [141, 142].
DAPK-1 ir CASP8 genų funkcija apoptozės procese pavaizduota
3.7.1 pav.
29
Studijos rodo, kad epigenetinis CASP8 geno procesas – metilinimas lemia jo inaktyvaciją [143]. Iš solidinių navikų tyrimų yra žinoma, kad geno metilinimas yra dažnas reiškinys plokščialąstelinio plaučių vėžio audinyje ir siekia apie 60 proc. ligos atvejų [143]. Geno metilinimas daro įtaką geno funkcijos sumažėjimui ir krūties, prostatos, gimdos kaklelio ir kt. navikų atvejams [144–146]. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto mokslininkų grupė tyrinėjo CASP8 geno metilinimo svarbą agresyvaus CNS naviko – glioblastomos prognozei. Nustatyta, kad metilinimo dažnis viršija 50 proc., ir epigenetinis procesas siejamas su blogesne pacientų prognoze [147].
Literatūroje trūksta duomenų apie šio geno svarbą skrandžio onko-genezei. Rytų Azijos regiono šaltiniuose radome keletą straipsnių, nagrinė-jančių geno metilinimo svarbą skrandžio vėžio atveju. Juose nurodomas metilinimo dažnis siekia keliolika procentų [19, 20]. Tačiau nėra duomenų, ar geno metilinimo dažnis skiriasi tarp regionų ir ar yra metilinimo sąsajų su kitais genais. Taip pat neaiški epigenetinio pokyčio svarba klinikiniams ir morfologiniams rodikliams.
Kita genų, pasirinktų epigenetiniams tyrimams, grupė savo funkcija siejama su DNR pažaidų atitaisymu.
MGMT (angl. O6-Methylguanine-DNA-methyltransferase) proteiną
ko-duojančio geno seka pirmą kartą aprašyta 1988 metais. Šis genas lokali-zuotas 10q26 chromosomoje [21]. MGMT geno koduojamo baltymo funk-cija – pašalinti alkilo grupę iš guanino O6 pozicijos [21]. MGMT sutrikusi
funkcija lemia galimą mutacijų atsiradimą. Toliau, vykstant geno repli-kacijai, alkilintas guaninas tampa nekomplementiškas timinui, ir tai lemia mutacijų atsiradimą.
MGMT geno metilinimas dažnas molekulinis reiškinys, nustatomas
glioblastomos, galvos-kaklo, storosios žarnos ir kt. navikų atvejais [21]. Moksliniai tyrimai, o taip pat ir atlikti Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitete, patvirtina MGMT geno metilinimo, kaip palankaus prognostinio mo-lekulinio žymens, svarbą CNS naviko-glioblastomos atveju [29, 147]. Geno metilinimas yra ir predikcinis molekulinis žymuo, kuriuo galima progno-zuoti kai kurių navikų atsaką į gydymą. Klinikiniai tyrimai parodė, kad pacientų, sergančių glioblastoma ir gydytų chemopreparatu temozolamidu, laikas iki ligos progresavimo buvo ilgesnis grupėje, kurios navikiniame audinyje buvo nustatytas MGMT geno promotoriaus metilinimas [29].
Mokslinės publikacijos rodo, kad skrandžio vėžio atveju MGMT geno promotoriaus metilinimas yra viena iš patogenetinių grandžių. Geno metilinimas siejamas su Kras mutacijų radimu navikiniame audinyje, o taip pat su pažengusia ligos stadija [22]. Molekulinis epigenetinis pokytis litera-tūroje siejamas ir su blogesne ligos prognoze [23].
30
Literatūroje nėra duomenų apie šio ir kitų genų galimas metilinimo tarpusavio sąsajas, metilinimo derinių įtaką klinikiniams, morfologiniams veiksniams, ligos prognozei. Mokslinė periodika neatsako ir į klausimą, ar
MGMT metilinimas yra vienodas prognostinis veiksnys skirtingų
morfolo-ginių tipų skrandžio navikams.
Su DNR pažaidų atitaisymo funkcija siejamas ir genas hMLH1 (angl.
mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)), lokalizuotas
3p21.3 chromosomoje. Geno koduojamas baltymas fiksuoja DNR klaidas, atsiradusias po replikacijos. Minėtas baltymas jungiasi su PMS2 baltymu, taip sudarydamas aktyvų kompleksą, koordinuojantį kitų baltymų, atitaisan-čių DNR pažaidas, funkciją. DNR pažaidos atstatomos pašalinant pakitusias DNR sekas, jas keičiant pataisytomis [148].
Geno funkcijos sutrikimas gali būti nulemtas tiek genetinių, tiek epige-netinių priežasčių. hMLH1 geno mutacijos daro įtaką paveldimumo sindro-mo, vadinamo Lyncho vardu, atsiradimui. Šis sindromas dar kitaip vadina-mas paveldimu nepolipoziniu kolorektiniu vėžiu (PNPKV) [149,150]. Paveldėjimo būdas – autosominis dominantinis. Esant šiam genetiniam pakitimui, didėja ne tik kolorektalinio, bet ir skrandžio vėžio rizika – tuomet ji siekia 5–8 proc. [151].
Geno funkcijos pokyčiai galimi ir dėl epigenetinių pokyčių. Vienas jų –
hMLH1 geno promotoriaus metilinimas. Šis epigenetinis mechanizmas
pasireiškia storosios žarnos, endometriumo, kiaušidžių, plaučių, uroepite-linės, galvos-kaklo ir kt. karcinomų atvejais [152-156].
Geno hMLH1 promotoriaus hipermetilinimas, o ne mutacijų nulemtas geno funkcijos kitimas, yra mikrosatelitų nestabilumo skrandžio vėžio atveju priežastis [24]. Literatūroje aprašomo epigenetinio proceso dažnis kinta nuo 14 iki 43 proc. [25-26].
Žiūrint į onkologijos mokslo raidą, mokslininkų pastangos vis labiau sutelkiamos į ankstyvą ikivėžinių būklių išaiškinimą, siekiant suprasti pro-cesus, vykstančius dar iki išsivystant onkologinei ligai. Yra žinoma, kad geno hMLH1 metilinimo dažnis atrofinio gastrito su žarnine metaplazija audinyje siekia 6–7 proc. [113, 157]. Literatūroje trūksta duomenų apie morfologinių atrofinio gastrito sunkumo kriterijų sąsajas su genų promo-torių metilinimu dažniu, bei galimus metilinimo skirtumus tarp atrofinio gastrito pažeistų atskirų skrandžio lokalizacijų.
Molekuliniai onkogenezę inicijuojantys ir palaikantys pokyčiai yra sisteminis procesas, vykstantis visame organizme. Tą įrodo mokslininkų, tarp jų ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU), publikuoti rezul-tatai, kad genų promotorių metilinimas skrandžio vėžio, kaip ir kitų soli-dinių navikų atvejais nustatomas ne tik navike, bet ir periferinio kraujo
31
leukocitų DNR [158]. Sisteminis šiuolaikinis mokslinis požiūris yra kreipia-mas į aplinkinį morfologiškai nenavikinį audinį.
Mokslininkas Slaughter 1953 metais publikuotame straipsnyje, nagrinė-damas burnos ertmės plokščialąstelinės karcinomos morfologinius pokyčius, pastebėjo, kad su naviku besiribojantis gleivinės audinys, pasižymintis hiperplastiniu ir atipiniu epiteliu, sąlygoja didesnio naviko atkryčio tiki-mybę. Šiuos pokyčius jis ir bendraautoriai įvardijo kaip lauko efektą (angl. „field effect“) aplink naviką [160]. Pastaraisiais metais, atsiradus modernių molekulinių tyrimų galimybei, lauko efekto termino apibrėžimas pasikeitė. Šiuolaikinis „lauko efekto“ apibrėžimas aprašytas 1995 metais, kai histolo-giškai normaliame aplinkiniame audinyje aptinkami molekuliniai pokyčiai, būdingi navikiniam audiniui [168]. Tačiau kol kas tikslūs molekuliniai pokyčiai ir jų tarpusavio ryšiai aplinkiniame nenavikiniame audinyje lieka iki galo neaiškūs. Vis dažniau siūloma į „lauko efektą“ žiūrėti kaip į onkogenezės vystymosi modelį. Todėl šiuolaikinių tyrimų tikslas - nustatyti aplinkiniame audinyje vykstančius molekulinius pokyčius ir įvardinti jų, kaip prognozinių žymenų vertę. Literatūroje skrandžio aplinkinio nenavi-kinio audinio epigenetinių tyrimų trūksta.
Apžvelgus ir išanalizavus literatūrą, manytume, kad šis darbas atspindi šiuolaikines mokslo vystymosi tendencijas skrandžio onkogenezės procesui atskleisti. Navikų vystymosi supratimas nulemia tolimesnes žinių klinikinio pritaikymo perspektyvas.
