LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Justina Dambrauskaitė
HIPERTROFINĘ KARDIOMIOPATIJĄ LEMIANČIOS MUTACIJOS MYBPC3
GENE PAPLITIMO IŠTYRIMAS LIETUVOS KAČIŲ POPULIACIJOJE
PREVALENCE OF MYBPC3 GENE
MUTATION CAUSING HYPERTROPHIC
CARDIOMYOPATHY RESEARCH IN LITHUANIAN CATS POPULATION
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Lekt. Dr. Kristina Morkūnienė
2 DARBAS ATLIKTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Hipertrofinę kardiomiopatiją lemiančios mutacijos MYBPC3 gene paplitimo ištyrimas Lietuvos kačių populiacijoje“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Justina Dambrauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
___________________________________________________________________________________
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA...5 SUMMARY...6 SANTRUMPOS...7 ĮVADAS...8 1. LITERATŪROS APŽVALGA...9 1.1. HKM etiologija...9 1.2. HKM genetinė kilmė...10 1.3. A31P mutacija...121.4. MYBPC3 geno koduojamo baltymo funkcija...13
1.5.1. Sarkomerų struktūra...14 1.5. Paveldimumas...15 1.6. HKM patologija...16 1.7. HKM klinika...18 1.8. HKM diagnostika...19 1.8.1. Echoskopinis tyrimas...19 1.8.2. Elektrokardiografinis tyrimas...20 1.8.3. Rentgeninis tyrimas...20 1.8.4. Magnetinis rezonansas...20 1.8.5. Hemodinaminiai tyrimai...20 1.8.6. Post mortem...21 1.9. Gydymas...21
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODIKA...23
2.1. Tiriamoji medžiaga...23
2.2. DNR išskyrimas iš burnos epitelio ląstelių...24
2.3. MYBPC3 geno polimorfizmo metodika...24
2.4. PGR produkto karpymas restrikcijos fermentais...26
2.5. Elektroforezė agarozės gelyje...26
2.6. Duomenų rinkimas ,,X“ klinikoje...26
4
3. TYRIMŲ REZULTATAI ...28
4. TYRIMO REZULTATŲ APIBENDRINIMAS...35
5. IŠVADOS...37
5 HIPERTROFINĘ KARDIOMIOPATIJĄ LEMIANČIOS MUTACIJOS MYBPC3 GENE PAPLITIMO
IŠTYRIMAS LIETUVOS KAČIŲ POPULIACIJOJE Justina Dambrauskaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Hipertrofinė kardiomiopatija (HKM) - tai viena dažniausiai pasitaikančių širdies ligų kačių tarpe. Nustatyta genetinė ligos etiologija, manoma, kad tai šeiminis susirgimas įvairių veislių katėms. Šiame darbe aptarta ligos etiologija, patologija, pasireiškimo klinika, diagnostikos metodai ir gydymas.
Tiriamasis darbas atliktas 2018-2019 metais LSMU Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute.
Atlikto tyrimo metu buvo siekiama išsiaiškinti MYBPC3 geno missense A31P mutacijos paplitimą Lietuvos kačių populiacijoje bei jos priklausomybę nuo veislės ir lyties. Tyrimo metu PGR-RFIP metodu buvo ištirta 130 individų. Po reakcijos susidaręs 242 bp PGR produktas karpytas AvaI restrikcijos fermentu, fragmentai elektroforezės metu buvo atskirti 2,5 proc. agarozės gelyje.
Taip pat, buvo atlikta retrospektyvi ,,X“ smulkiųjų gyvūnų klinikoje surinktų duomenų analizė. Surinkta informacija lyginta su tyrimo metu gautais rezultatais.
Meino meškėnų veislės kačių grupei heterozigotinis genotipas (G/C) nustatytas 0,23 dažniu, tai sudaro 13,8 proc. visos tirtos kačių populiacijos. Atlikus tyrimus nustatyta statistiškai reikšminga priklausomybė tarp Meino meškėnų veislės ir mutacijos dažnio.
Retrospektyviai išanalizavus informaciją gautą klinikoje, nustatyta, kad HKM 2017 metų sausio – 2019 metų lapkričio mėnesių laikotarpiu buvo dažniau diagnozuojama patinams (87 proc.) bei dažniau sirgo jaunesnio amžiaus katės, priklausančios 1 – 3 metų amžiaus grupei.
Raktažodžiai: Hipertrofinė kardiomiopatija, MYBPC3 genas, A31P mutacija, Meino meškėnai, katės, paplitimas.
6 PREVALENCE OF MYBPC3 GENE MUTATION CAUSING HYPERTROPHIC
CARDIOMYOPATHY IN LITHUANIAN CATS POPULATION
Justina Dambrauskaitė Master‘s Thesis
SUMMARY
Hypertrophic cardiomyopathy is one of the most common heart diseases between cats. It is established as the familial illness for cats of different breeds. In this study HCM etiology, pathology, clinical presentation, diagnostic methods and treatment are discussed.
The study was performed in the LUHS‘s Institute of biological systems and genetical researche in 2018-2019.
Purpose of this research was to figure out prevalence of MYBPC3 gene missense A31P mutation in Lithuanian cats population as well as its dependance on breed and gender.
During this study, 130 idividuals were tested using the PGR-RFIP method. Obtained 242 bp PCR product was cut with the Aval restriction enzyme and separated during electrophoresis in a 2,5 % agarose gel.
Besides that, retrospective analysis was performed on information from the small animals clinic ,,X“. Information from a clinic was compared with the studies results.
Frequency calculated of G/C genotype in the Maine coon researched population was 0.23, it is equal to 13.8 % of all researched cats population. Statisticly significant dependance between Maine coon breed and A31P mutation was determined. Information analyzed retrospectively showed that HCM was diagnosed for males (87 %) more often than females. The HCM diagnosis was more frequently noted in younger (1 – 3 years old) cats.
Key words: Hypertrophic cardiomyopathy, MYBPC3 gene, A31P mutation, Maine coon, cats, prevalence.
7
SANTRUMPOS
HKM – hipertrofinė kardiomiopatija
MYBPC3 – genas, koduojantis širdies mioziną surišantį baltymą C
SŠN – stazinis širdies nepakankamumas ATE – arterinis tromboembolizmas MRT – magnetinio rezonanso tyrimas
IGF-1 – insuliną primenantis augimo faktorius 1 DKM – diliatuota kardiomiopatija
EKG – elektrokardiografinis tyrimas cTn-I – širdies troponinas I
cMyBP-C – širdies mioziną surišantis baltymas C
ACTC1 – genas, koduojantis širdies α-aktiną
MYH7 – genas, koduojantis β-miozino sunkiąją grandinę
MYL2 – genas, koduojantis skilvelinę norminę miozino lengvąją grandinę MYL3 – genas, koduojantis skilvelinę svarbiąją miozino lengvąją grandinę TNNT2 – genas, koduojantis širdies troponiną T
TNNI3 – genas, koduojantis širdies troponiną I TPM1 – genas, koduojantis α-tropomioziną
8
ĮVADAS
Hipertrofinė kardiomiopatija (HKM) yra viena dažniausių kačių miokardo ligų, pasireiškianti širdies masės padidėjimu, kuris yra susijęs su kairiojo skilvelio hipertrofija. Anksčiau kačių HKM buvo laikoma idiopatine liga, tačiau 2005 metais K.M. Meurs remdamasi žmonių medicinoje atliekamais tyrimais, nustatė mutaciją MYBPC3 gene. A31P vadinama mutacija - tai nukleotidų sekos pasikeitimas, kuris nulemia HKM pasireiškimą tarp Meino meškėnų veislės kačių (1). Nors manoma, kad A31P mutacija yra būdinga tik Meino meškėnų veislės katėms, tačiau 2010 metų tyrime ji buvo nustatyta ir vienai Britų trumpaplaukių veislės katei (2).
Dėl dažno HKM pasireiškimo kačių tarpe aiškus ligos atsiradimo mechanizmas yra labai aktualus veterinarinėje medicinoje. Todėl yra svarbu įvertinti A31P mutacijos paplitimą kačių populiacijose, jos priklausomybę nuo skirtingų faktorių, tokių kaip veislė bei lytis. Mutacijos nustatymas leidžia imtis prevencinių priemonių kačių, esančių rizikos grupėje dėl HKM, gyvenimo gerovės ir sveikatos užtikrinimui. Be to, reikalinga analizuoti HKM būdingas patologijas, pasireiškiančius klinikinius simptomus, diagnostinius metodus ir gydymą.
Darbo tikslas: Ištirti hipertrofinę kardiomiopatiją lemiančios mutacijos MYBPC3 gene paplitimą Lietuvos kačių populiacijoje.
Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti hipertrofinės kardiomiopatijos poveikį organizmui, kokios mutacijos gali nulemti šios ligos išsivystimą bei kokie metodai naudojami identifikuoti ligą.
2. Ištirti MYBPC3 gene esančią mutaciją A31P PGR-RFIP metodu ir išanalizuoti mutacijos paplitimą tarp Meino meškėnų bei kitų veislių kačių.
3. Išanalizuotismulkiųjų gyvūnų klinikos ,,X“ duomenis dėl klinikinių HKM susirgimų pasiskirtymo pagal lytį bei amžių.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.HKM etiologija
Hipertrofinė kardiomiopatija (HKM) yra dažniausia paveldima širdies liga, žmonių tarpe. Ji paveikia 1 iš 500 individų (3). 60 procentų atveju ji paveldima kaip autosominis dominantinis sutrikimas, tačiau nustatytos ir de novo mutacijos sporadiškai sukeliančios HKM (4). Nustatyta daugiau nei 450 mutacijų trylikoje skirtingų sarkomerų ir miofilamentų genų, sukeliančių žmonių genetinę HKM (5).
HKM tai viena dažniausiai pasitaikančių miokardo ligų taip pat ir kačių tarpe (6). Todėl mutacijų, sukeliančių HKM, veikimo mechanizmas aktualus tiek veterinarijoje, tiek ir žmonių medicinoje, bandant geriau suprasti ligos pasireiškimą (7). Retrospektyviai atliktame tyrime Šveicarijoje buvo nustatyta, kad net 47,5 proc. kačių, rodančių pirminius arba antrinius kardiovaskulinės ligos simptomus, buvo diagnozuota HKM (8).
Ligos pasireiškimas priklauso nuo amžiaus. Ligos vyravimas tarp jaunų (6-12 mėnesių amžiaus) kačių buvo nustatytas 4,3 proc., o tarp vyresnio amžiaus kačių (≥ 9 metų amžiaus) 29,4 proc. (7, 9) Vidutiniškai diagnozuojama6 metų katėms (6, 7, 10). Tačiau kai kurioms specifinėms veislėms ligos diagnozavimui būdingas ir jaunesnis amžius. Sfinksų veislės katėms HKM diagnozuojama maždaug 2 – 4,2 metais (6, 9, 11). Taip pat, Meino meškėnams liga diagnozuojama dažnai anksčiau – apie 2,5 – 3,1 gyvenimo metus (6, 11, 12) bei Britų trumpaplaukiams apie 2,7 metus (13). Vieno tyrimo metu nustatyta, kad Skudurinukių veislės katėms būdingas ligos pasireiškimas jau nuo 5 mėnesių (14). Tačiau Persų ir Kartezianinės veislės katėms ligos pasireiškimas nustatytas net vyresniame amžiuje nei šiaip įprasta kačių populiacijai (11). Svarbu tai, kad dažnai veislinės katės echoskopiniui tyrimui yra atvežamos jaunesniame amžiuje, kai tuo tarpu paprastos neveislinės katės dažnai atvežamos tik jau matant ligos simptomus (15).
Manoma, kad HKM nors ir šiek tiek dažniau būdinga patinams, tačiau yra būdinga ir patelėms, tačiau patinams dažniausiai pasireiškia ankstesniame amžiuje ir ūmesne forma (12).
Nors ir mutacijos yra atsakingos už didžiąją dalį sukeliamų HKM katėms, tačiau kaip ir žmonių medicinoje yra ir kitų dar iki galo neišaiškintų veiksnių ligos etiologijoje, kadangi ne visos katės,
10 kurioms nustatomas genetinis paveldimumas, suserga HKM ir taip pat ne visoms katėms, kurios serga HKM yra nustatomas genetinis polinkis (7).
Analogiškai žmonių ligai tikimąsi, kad ir kačių HKM bus identifikuoti papildomi genai ir mutacijos. Genetinių priežasčių identifikavimas tiek žmonių medicinoje, tiek veterinarijoje yra svarbus žingsnis HKM lengvesniam identifikavimui ir gydymui (16).
Be pirminių priežasčių ligą gali sukelti ir antrinės, kurias reiktų atskirti, nes jos nėra susijusios su genetiniais pakitimais ir tokių kačių palikuonys nepaveldėtų šio sutrikimo. Antrinėmis ligos priežastimis gali būti per didelė kairiojo skilvelio apkrova, dėl kraujo tekėjimo obstrukcijų, sisteminės hipertenzijos, hipersomatotropizmo, hipertiroidizmo. Tačiau pastebėta, kad hipertiroidizmas sukelia tik neryškią tarpskilvelinės pertvaros hipertrofiją (17).
1.2.HKM genetinė kilmė
Kačių HKM ilgai buvo vadinama idiopatine liga. Tačiau pastaruoju metu vis daugiau linkstama prie kitokios – genetinės HKM diagnozės. Manoma, kad genetinė HKM pasireiškia Amerikiečių trumpaplaukių, Meino meškėnų, Persų, Norvegų miškų, Skudurinukių ir Sfinksų veislės katėms.
Remiantis žmonių medicinoje naudojamais tyrimais HKM diagnozavimo srityje, sarkomeros baltymus koduojančio geno sekoskaitos analizės metodu 2005 metais buvo pirmą kartą nustatyta kačių HKM genetinė kilmė (7, 17). Pirmą kartą A31P mutacija MYBPC3 gene buvo aptikta tiriant Meino meškėnus. Šių kačių DNR buvo atlikta sekoskaita ir išanalizuota ieškant kas galėjo sukelti tokį didelį ligos pasireiškimo dažnį. Išmatavus baltymų kiekius, buvo nustatyta, kad mioziną surišančio baltymo C (cMyBP-C) kiekis buvo žymiai mažesni lyginant su sveikomis katėmis. Todėl būtent MYBPC3 genas buvo pasirinktas mutacijų paieškai (1).
Manoma, kad maždaug 34 proc. pasaulio Meino meškėnų populiacijos turi missense A31P mutaciją (2).
Dažnas ligos pasireiškimas Meino meškėnams, kuriems nenustatyta mutacija, rodo, kad tikriausiai tai ne vienintelė mutacija sukelianti šiai veislei būdingą HKM.
Kita, ligą sukelianti mutacija, MYBPC3 gene, buvo nustatyta po dviejų metų Skudurinukių veislės katėms. Missense R820W mutacija nustatyta MYBPC3 gene, kuriame citozinas (C) buvo pakeistas į timiną (T). Tokia nukleotidų pakaita nulėmė arginino pasikeitimą į triptofaną (8). Ši mutacija, kurios metu argininas pasikečia į triptofaną MYBPC3 gene, buvo nustatyta ir žmonėms, sergantiems HKM (18). Tai taip pat didelį pasireiškimą turinti mutacija, nustatoma 30 proc. Skudurinukių populiacijos
11 (19, 20). Bei kaip ir Meino meškėnams, manoma, kad tai nėra vienintelė mutacija, sukelianti ligą Skudurinukėms, kadangi HKM pasireiškia ir R820W mutacijai neigiamoms katėms (21). Esant organizme abiems pakitusiems aleliams, demonstruojami skirtingi fenotipai – arba HKM arba diliatuota kardiomiopatija (DKM), kartu su kairiojo skilvelio kontraktiliškumo sumažėjimu bei staigaus gaišimo pasireiškimu.
Buvo nustatytas ir trečias variantas, sukeliantis HKM dažniausiai Meino meškėnams. A74T -kuomet argininas, esantis 74 pozicijoje, pakeičiamas treoninu. Tačiau nėra įrodyta, kad ši pakaita sukelia HKM (5, 20).
2010 metais atliktame tyrime buvo ištirtos 83 Meino meškėnų veislės katės ir 68 įvairių veislių kontrolinei grupei priskirtos katės. Iš jų 28 (35 proc.) Meino meškėnams buvo nustatyta A74T mutacija. Genotipiškai teigiamos mutacijai katės buvo ištirtos kliniškai ir 79 proc. iš jų buvo nustatytas sveikas fenotipas – nenustatyta HKM ligos požymių. Keturios iš tų kačių buvo homozigotės mutacijos atžvilgiu.
A74T mutacija buvo rasta ir 42 (62 proc.) kitų veislių katėms (Persų, Norvegų miškų ir kitų veislių katėms). Ištyrus kliniškai, buvo nustatyta, kad 21 iš mutaciją turinčių kačių buvo sveikos, be jokių ligos požymių. 9 iš jų buvo heterozigotės ir 4 homozigotės (turėjo du mutavusius alelius). Kitai daliai mutaciją turinčių kačių buvo matomi fenotipiniai pokyčiai: koncentrinė ar regioninė hipertrofija, kairiojo skilvelio sienos storis varijavo tarp 6,1–9,8 mm.
Lyginant A31P mutaciją su A74T pastebėta, kad A31P mutacija būdinga tik Meino meškėnų veislės katėms, A74T mutacija nustatoma ir kitoms veislėms bei neveislinėms katėms, kurioms taip pat pastebėta koreliacija tarp genotipo ir fenotipo.
Prieita išvados, kad A74T mutacija nėra specifinė Meino meškėnams ar kuriai kitai veislei ir taip pat nėra visiškai specifiška HKM ligai (7).
Buvo atlikta daugiau tyrimų, siekiant išsiaiškinti kitus mutacijų, sukeliančių HKM, variantus. Buvo pasirinkti aštuoni su žmonių HKM asocijuojami genai (ACTC1, MYH7, MYL2, MYL3, TNNT2,
TNNI3 ir TPM1) ir atliekama sekoskaita 14 grynaveislių kačių (trim Britų trumpaplaukėms, Norvegų
miškų, Sibiro ir Sfinksams bei dviem Meino meškėnams, turintiems A31P mutaciją), sergančių HKM bei dviems sveikoms (HKM neigiamoms), negrynaveislėms katėms. Buvo rasti trisdešimt trys skirtingi variantai, tačiau nei vienas nesukėlė vienos amino rūgšties pakaitos kita, kitokį poliškumą turinčia amino rūštimi, taip pakeičiant struktūrą. Todėl tokie pasikeitimai nelaikomi patogeniškais (22).
12
1.3.A31P mutacija
Pirmą kartą A31P mutacija Meino meškėnams nustatyta 2005 metais. Viena pirmų užuominų rodančių mutacijos, sukeliančios HKM, buvimą nustatyta elektroforeziškai ištyrus homogenizuotą Kalifornijos universiteto katinų kolonijos miokardo audinį. Analizuojant ištirtus gelius, pastebėtas smarkus cMYBP-C miomezino sumažėjimas, kartu su β-miozino sunkiosios grandinės migracija. Taip pat, kadangi jau buvo identifikuota ne viena mutacija žmonių MYBPC3 gene, buvo nuspręsta atlikti ir kačių MYBPC3 geno sekoskaitą.
DNR nukleotidų sekos pokytis buvo nustatytas 11 chromosomoje esančio MYBPC3 geno trečiojo egzono 31 kodone 91 nukleotide, kuriame konservatyvus guaninas (G) buvo pakeistas citozinu (C). Toks nukletidų sekos pasikeitimas kodone sąlygojo GCC tripleto, kuris koduoja alaniną, pasikeitimą į CCC, koduojantį proliną.
Yra du būdai įvardinti šią mutaciją: pirmas - p.A31P, kuriame pateikiamas kodono numeris ir kokios amino rūgštys susikeičia bei antras – c.91G>C, kuriame nurodytas DNR nukleotido numeris ir tarp kokių nukleotidų įvyksta pakaita (1).
Buvo iškart pastebėtas A31P mutacijos paplitimas Meino meškėnų tarpe. Vieno tyrimo metu 34 proc. ištirtų Meino meškėnų turėjo šią mutaciją ir 10 proc. iš jų buvo homozigotai. Šio tyrimo metu taip pat teigiama, kad mutacija pastebima tik Meino meškėnų veislės katėms (23). Tačiau atlikus tyrimą 2010 metais A31P mutacija aptikta ir vienai Britų trumpaplaukių veislės katei (2). Toks didelis mutacijos paplitimas leido iškelti prielaidą, kad galbūt mutacija yra lengvesnio pobūdžio nei buvo manyta ankščiau arba kitu atveju būtų sunku įsivaizduoti kaip veislė išliktų (16).
Kaip ir žmonėms, katėms HKM sukelianti mutacija gali turėti skirtingą penetrantiškumą. Nustatytas mutacijos pasireiškimas 6-8 proc. heterozigotinį genotipą turinčioms katėms ir 58-80 proc. homozigotėms. Todėl net ir toje pačioje šeimoje esančios vienos katės gali turėti minimalius širdies pokyčius, o kitos smarkiai besivystančią ligą. Tokie genotipų – fenotipų skirtumai parodo, kad gali būti ir kitokių genetinių bei aplinkos veiksnių, darančių įtaką tam tikro fenotipo išsivystimui (24).
Nedidelis ligos pasireiškimas buvo patvirtintas tyrimais, kurių metu katės turinčios A31P mutaciją buvo ištirtos kliniškai dėl HKM (7). 2010 metais atliktame tyrime buvo kliniškai ištirtos 83 Meino meškėnų veislės katės, iš kurių 18 (22 proc.) nustatyta A31P mutacija. Didžiajai daliai mutaciją turinčių kačių nebuvo echoskopiškai nustatyti pokyčiai, rodantys HKM.
Tokie rezultatai tyrėjams leido teigti, kad ligos pasireiškimas esant A31P mutacijai yra žemas ir, kad yra dar bent viena kita priežastis sukelianti HKM Meino meškėnų veislė katėms.
13 Tačiau katėms, kurioms nustatyta homozigotinis genotipas, ligos pasireiškimas skiriasi lyginant su heterozigotinėmis. 2011 metų tyrimo duomenimis didžioji dalis ištirtų homozigotinę mutaciją turinčių kačių turėjo HKM pokyčių. Bei didžioji dalis tirtų Meino meškėnų, jaunesnių nei 6 metai, susirgo sunkia HKM, nes turėjo homozigotinę mutaciją. Tyrimo metu nustatyta, kad šansų santykis sirgti HKM homozigotinėms katėms yra labai didelis (25).
Kito tyrimo duomenimis echoskopuojant M-režimu ir Doplerio metodu buvo ištirtos 96 Meino meškėnų veislės katės. Iš 44 mutaciją turėjusių kačių HKM aiškūs pokyčiai buvo nustatyti 4 heterozigotinį ir 4 homozigotinį genotipą turinčioms katėms. Be to, šio tyrimo metu buvo pastebėta, kad tik 10 iš 34 heterozigotinių kačių buvo vyresnės nei 4 metai. Manoma, kad tai galėjo būti viena iš priežasčių, kodėl nebuvo nustatyta daugiau HKM ligai būdingų pokyčių.
Iš 44 mutaciją turėjusių kačių 13 buvo patinai ir 31 patelė. Tai galėjo būti viena iš tyrimo paklaidų, kadangi ištirta, kad moteriškos lyties Meino meškėnams HKM išsivysto vėlesniu gyvenimo laikotarpiu bei jos serga lengvesne ligos forma (26).
Panašūs rezultatai gauti ir tiriant Skudurinukių veislės kates dėl R820W mutacijos. Vieno tyrimo metu ištyrus 326 Skudurinukių veislės kates buvo nustatyta, kad 156 katės neturėjo mutacijos, 68 buvo heterozigotės, o 12 homozigotės, su dviem mutavusiais aleliais. Vėliau, išsiuntus apklausas kačių šeimininkams, buvo išsiaiškinta, kad 15 kačių nugaišo dėl HKM. Katėms, kurioms nebuvo nustatyta mutacija, arba kurios buvo heterozigotės gaišimas dėl širdies sutrikimų nebuvo dažnas, tačiau iš 12 homozigotinę mutaciją turėjusių kačių 7 nugaišo dėl HKM ligos sukeltų pakitimų. Tokių kačių vidutinis amžius 5,6 metai, tačiau HKM nustatyta ir katėms nuo 5 mėnesių iki 10,9 metų (27).
Tiek Meino meškėnų, tiek Skudurinukių veislės katėms, kurioms nustatyta homozigotinė mutacija MYBPC3 gene, yra didesnė rizika, kad išsivystys sunkios formos HKM bei, kad liga pasireikš jauname amžiuje. Tačiau katėms su heterozigotine mutacija yra mažesnė rizika susirgti HKM, bent iki 4-5 metų amžiaus (16).
1.4. MYBPC3 geno koduojamo baltymo funkcija
Kol kas nustatyti du genetiniai pakitimai, sukeliantys HKM, yra randami tame pačiame gene
MYBPC3, kuris koduoja mioziną surišančio baltymo C (cMyBP-C) širdinę izoformą. Ši izoforma
sudaro 2 proc. miofibrilinių proteinų širdyje ir yra svarbi raumens ląstelių regeneravime. Žmonėms ir žiurkėms ši izoforma išreikšta tik kardiomiocituose. Yra žinomos dar dvi izoformos, kurios apribotos skeleto raumenims (28). Lyginant su skeleto raumenų izoforma širdinė turi papildomus signalinius
14 domenus su trimis fosforilinimo jungtimis (29). Mutacijos MYBPC3 gene gali būti susijusios nebūtinai tik su HKM, tačiau ir su kitomis kardiomiopatijomis.
cMyBP-C yra modularinis polipeptidas, priklausantis intraląstelinei imunoglubulinų šeimai. Tai sarkomerinis baltymas, randamas storajame skersaruožio raumens filamente. Manoma, kad baltymas cMyBP-C atlieka tiek struktūrinę tiek reguliacinę funkcijas.
Jis dalyvauja sugrupuojant sarkomeras, skatindamas storųjų filamentų polimerizaciją per C -terminalinius domenus, jungiančius specifines titino ir lengvojo meromiozino sritis.
Ištyrus mutacijos paveiktas kates, pastebėtas cMyBP-C ir miomezino baltymų kiekio sumažėjimas.
cMyBP-C yra širdies raumenį reguliuojantis baltymas, kuris daro įtaką širdies susitraukimų galiai ir greičiui. Be to, prisideda prie širdies sistolinės ir diastolinės funkcijos bei širdies gebėjimo padidinti susitraukimus veikiant inotropiniui stimului (30).
Iki šiol nėra tiksliai žinomas MYBPC3 mutacijos sukeliamas sarkomerų funkcijos sutrikimo mechanizmas (28).
1.4.1. Sarkomeros struktūra
Miofibrilės yra pagrindinis skeleto ir širdies miocitų komponentas. Jos susideda iš susitraukinėjančių vienetų – sarkomerų, kurios turi tam tikrą išsidėstymą. Sarkomeras sudaro M diskas viduryje ir jį įtvirtina Z diskas. Storieji filamentai tęsiasi nuo M disko į abu sarkomeros galus, tuo tarpu plonieji filamentai tęsiasi vidurio link nuo Z disko. Šie filamentai iš dalies persidengia ir sąveikauja vieni su kitais. Kuomet Ca jonų koncentracija miocituose padidėja, storieji filamentai pasislenka arčiau plonųjų, taip susiaurindami sarkomerą. Toks raumens sarkomeros susiaurėjimas sukelia mikroskopinį susitraukimą (28).
Pagrindinis storųjų filamentų komponentas – miozinas. Miozinas yra heksomeras, susidedantis iš dviejų storųjų grandinių, dviejų nepakeičiamų plonųjų grandinių ir dviejų reguliacinių plonųjų grandinių.
Širdies sarkomeras - tai susitraukinėjimo vienetas, esantis kiekviename kardiomiocite. Jis sudarytas iš ,,slenkančių’’ proteinų.
Ant miozino filamentų yra išsidėsčiusios galvutės, kurios prisijungia prie aktino fiksacijos centrų, tam, kad būtų sukuriamas judėjimas - ,,slinkimas”. Dėl šios sarkomerų funkcijos kardiomiocitai vykdo širdies susitraukinėjimą.
1 paveikslėlyje matomas mioziną surišantis baltymas C (pavaizduotas mėlynos spalvos ,,burbuliukais”) prisijungia prie kitų baltymų, kad būtų palaikomas stabilumas. Aktinas (pavaizduotas
15 raudonų ,,burbuliukų” pavidalu) ir miozinas (žaliai pilki filamentai) yra susijungę ir atlieka ,,slinkimo” funkciją (31).
1 pav. Širdies sarkomeros modelis. Iliustracijos aut.: Spirito P., Seidman C.E., McKenna W.J., Maron
B.J. The management of hypertrophic cardiomyopathy. N Engl J Med 336. 775 psl. 1997.
1.5.Paveldimumas
Mutacija laikoma dominantine, pasireiškiančia su skirtingu ekpresyvumu. Tai reiškia, kad ligos pasireiškimas labai įvairuoja ir yra individualus kiekvienai susirgusiai katei. Ne kiekviena heterozigotinį pakitimą turinti katė susirgs ir net jei liga išsivysto, ji pasireiškia vėliau nei homozigotėms katėms bei silpnesne forma.
Tačiau nustatyta išimčių ir homozigotų tarpe – katės su homozigotine mutacija pragyveno iki pat senatvės be jokių ligos požymių (32).
Kadangi jau yra nustatytos pagrindinės HKM priežastys dviems kačių veislėms, veisėjai turi galimybę sumažinti genetinės ligos pasireiškimą tirdami Meino meškėnų ir Skudurinukių veislės kates. Būtų idealu, jei visos veisiamos katės būtų patikrintos ir jei turėtų mutaciją nebebūtų veisiamos. Tačiau manoma, kad tokiu atveju gali smarkiai sumažėti veislių genetinis „baseinas“ ir taip gali atsiverti kelias kitų genetinių ligų paplitimui, dėl kurių nėra galimybės išsitirti.
16 Kadangi nustatytas didelis ligos pasireiškimas, esant mutacijai, rekomenduojama neveisti heterozigotinių kačių su kitomis heterozigotėmis ir išvis atsisakyti homozigotinių kačių naudojimo veisimui, kadangi veisiant kiekvienas tos vados kačiukas turėtų A31P mutaciją (16).
1.6.HKM patologija
Liga pasireiškia širdies masės padidėjimu, kuris susijęs su kairiojo skilvelio hipertrofija. Tai gali pasireikšti kaip tarpskilvelinės pertvaros arba laisvosios kairiojo skilvelio sienos sustorėjimas. Taip pat, kartu gali pasireikšti kairiojo prieširdžio ertmės išsiplėtimas, dešiniojo skilvelio hipertrofija, dešiniojo prieširdžio ertmės išsiplėtimas. HKM ligos atveju širdis ima vis prasčiau atlikinėti savo funkcijas (6).
Dažniausiai nustatoma asimetriška miokardo hipertrofija. Pakitimai skirstomi į penkis tipus: A - kuomet hipertrofuoti yra širdies speneliniai raumenys, B atveju nustatoma tarpskilvelinės pertvaros bazinės dalies, o C atveju visos tarpskiltelinės dalies hipertrofija. D – tipas, kai matoma hipertrofija visame kairiojo skilvelio miokarde, E – kairiojo skilvelio laisvosios sienos hipetrofija (33).
Sveikos katės širdies kairiojo skilvelio miokardo matmenys dažniausiai yra mažiau nei 5 mm, nustačius daugiau nei 6 mm galima įtarti, kad katė yra serganti (34).
Įvertinus miokardo sienelės arba tarpskiltelinės srities storį, galima įvertinti ligos laipsnį. Gali būti silpnas, vidutinis arba sunkus (1 lentelė) (33). Tačiau svarbu atkreipti dėmesį ir į katės dydį ir pagal tai analizuoti gautus rezultatus. Kačių, kurių svoris virš 6 kg miokardo matmenys skirsis lyginat su mažesnių kačių (34).
1 lentelė. HKM laipsnis pagal miokardo storį
LIGOS LAIPSNIS MIOKARDO STORIS (mm)
SILPNAS 6–6,5
VIDUTINIS 6,6–7,5
SUNKUS ≥7,6
Širdis, paveikta HKM, dažniausiai turi tokį patį arba net stipresnį susitraukinėjimą lyginant su sveika širdimi. Pagrindinė anomalija yra ne sistolinė, o diastolinė disfunkcija (35). Diastolė - tai periodas tarp aortos vožtuvo užsivėrimo ir dviburio vožtuvo užsivėrimo, kurio metu širdis prisipildo kraujo (36).
17 Katėms, turinčioms HKM, sutrinka Ca jonų valdymas ir jautrumas, energetika, dėl patologinių pokyčių baltymuose. Energijos trūkumas gali padidėti dėl miokardo išemijos. Tai viena iš žinomų komplikacijų žmonėms su HKM, todėl manoma, kad tai turėtų pasireikšti ir katėms (37, 38).
Padidėjęs kolageno kiekis (fibrozė) dėl išemijos, padaro skilvelį standesnį (39, 40, 41). Raumenų hipertrofija gali smarkiai sumažinti skilvelio ertmę (42).
Diastolinė disfunkcija trukdo skilvelio prisipildymui. Standus skilvelis prisipildo tik esant aukštesniam spaudimui kairiajame prieširdyje. Mitralinė regurgitacija gali padidinti kairiojo prieširdžio spaudimą dar labiau. Esant padidėjusiam spaudimui kairysis prieširdis diliatuoja. Padidėjęs spaudimas prieširdyje nusikelia dar toliau atgal į plaučių venas bei kapiliarus. Kuomet spaudimas pasiekia maždaug 24 mmHg, skysčiai prasiskverbia į plaučius ir taip sukelia plaučių edemą. Tokia būklė vadinama staziniu širdies nepakankamumu (SŠN). Skirtingai nei šunims, katėms kairės pusės stazinis širdies nepakankamumas yra lydimas pleuros efuzija. Mechanizmas, sukeliantis pleuros efuziją nėra iki galo žinomas (37).
Diliatuotas prieširdis predisponuoja trombų, galinčių sukelti arterinį tromboembolizmą, formavimąsi. Manoma, kad yra trys faktoriai, prisidedantys prie trombų formavimosi. Pirmasis - kraujo stazė diliatuotam prieširdyje, antras – nenormali anti - trombotinės sistemos veikla bei endokardo pažeidimai, sukelti dėl aukšto prieširdžių spaudimo ir diliatacijos (43). Bei trečias, hiperkoaguliacija, kuri galimai daro įtaką fibrinogeno kiekio ir Faktoriaus VIII veiklos didėjimui (44). Arterinis trombas arba atskilusi jo dalis gali patekti į kraujo cirkuliaciją. Tuomet jis užstringa tam tikroje arterinės sistemos vietoje. Taip embolizacija kartu su kolateralių arterijų vazokonstrikcija sukelia išemiją distaliniuose audiniuose (43).
Širdis, paveikta HKM, yra linkusi į ventrikulines aritmijas. Aritmijos gali nulemti staigius širdies ritmo bei širdies našumo pasikeitimus. Tai gali daryti įtaką smegenų hiperfuzijai, kuri pasireiškia alpimu.
Visgi sunkiausia pasekmė – skilvelių virpėjimas. Tai chaotiškas miokardo veikimas, kurio metu nevyksta efektyvus kraujo tekėjimas, toks sutrikimas yra letalus, jei nėra suteikiama skubi pagalba. Kadangi skilvelių virpėjimas dažnai ištinka be jokių įspėjamųjų ženklų, jis dažnai vadinamas tiesiog staigiu gaišimu (45).
18
1.7.HKM klinika
Katės sergančios HKM gali demonstruoti įvairią simptomatiką. Daugumai nustatomas širdies ūžesys. Taip pat, pastebimas kosėjimas, sunkus kvėpavimas, tai gali išsivystyti dėl susiformavusios kardiogeninės plaučių edemos arba dėl susikaupusių skysčių plaučių pleuroje. Jaučiamas kietas ir stiprus pulsas femoralinėje arterijoje (34). Tačiau, jei pasireiškia tromboembolija - pulso gali visai nesijausti, pėdos gali būti šaltos, nevaldomos (33).
Klinikinis pasireiškimas gali būti suskirstytas į keturias grupes: asimptomatinę, SŠN, arterinį tromboembolizmą (ATE) ir sinkopę arba staigų gaišimą (46). Šios kategorijos gali pasireikšti kiekviena atskirai, tačiau gali pasireikšti ir keletas kartu: pavyzdžiui dažnai nustatoma ATE kartu su SŠN (47).
Asimptomatėms katėms gali būti pastebima nenormali auskultacija. Gali būti girdimas sistolinis širdies ūžesys, kuris gali būti sukeltas dėl kairiojo skilvelio kraujotakos obstrukcijos arba mitralinės regurgitacijos, susidariusio kraujo sūkuriavimo (48). Tačiau ne visoms katėms, turinčioms HKM, yra nustatomas širdies ūžesys. Skirtingų tyrimų metu nustatytas ūžesių pasireiškimas, sergant HKM, svyruoja nuo 31,3 proc. iki 96,4 proc. (13, 49).
SŠN yra dažniausia HKM komplikacija. Ji pasireiškia dispnėja, sunkiu kvėpavimu, dažnai kvėpuojant atvira burna. Skirtingai nei šunims, katėms kosėjimas nėra tiek dažnai pastebimas (48). Sunki SŠN gali pasireikšti gleivinių cianoze (10).
Nustatyta, kad ATE pasireiškia maždaug 12 proc. HKM sergančių kačių. 75 proc. atvejų yra paveikiamos abi užpakalinės galūnės, dėl tromboembolizmo distalinėje aortos dalyje (43, 47). Tai pasireiškia išskirtine klinika, kuomet paralyžiuojamos užpakalinės galūnės, matomos išblyškusios arba cianotiškos pėdutės, galūnės būna šaltos ir skausmingos. Nėra jaučiamas femoralinis pulsas bei pastebima žemesnė rektinė temperatūra. Tokie pat simptomai pastebimi ir esant vienos femoralinės arba brachialinės arterijos tromboemblizmui, kitų arterijų embolizmo atvejais simptomai yra mažiau tipiniai ir pasireiškia pagal paveiktą organą (43).
Kokia tiksli ligos eiga nėra gerai žinoma. Manoma, kad staigus būklės pablogėjimas gali atsirasti dėl kraujagyslių praeinamumo sutrikimų, atsiradusių dėl tromboembolizmo ar arterinių spazmų, dėl smarkaus širdies raumens masės padidėjimo, kurio dėka širdis negali palaikyti normalaus kraujo tekėjimo (50).
Šios ligos diagnozavimas dažnėja su kačių amžiumi. Tačiau nustatyta, kad katėms, kurioms išsivysto HKM, ligos simptomai pasireiškia jau per pirmuosius penkerius gyvenimo metus. Kai kuriais
19 atvejais liga vystosi lėtai ir pasireiškia vidutinio sunkumo simptomais, kuriuos galima gydyti, tačiau kitais atvejais gali pasireikšti aortiniu tromboembolizmu ir staigiu gaišimu (34).
1.8.HKM diagnostika
1.8.1. Echoskopinis tyrimas
Hipertrofinei kardiomiopatijai diagnozuoti dažniausiai pirmiausiai pasitelkiama echoskopija. Echoskopija - tai svarbus diagnostikos metodas, nes leidžia neinvazyviai ištirti širdies struktūras (51). Svarbu tiriant HKM atkreipti dėmesį į papiliarinio raumens, kairiojo skilvelio sienos, kairiojo skilvelio ertmės, kraujo tėkmės pakitimus (52). Rekomenduojama tiriant echoskopiškai, išmatuoti kairiojo skilvelio sienos storį (53). M-režimo echoskopija padeda įvertinti miokardo sienelės storumą ir išmatuoti skilvelio diametrą skirtingais širdies darbo ciklo periodais. Šiuo metodu gali būti pastebimi pakitimai dviburiame vožtuve (51). Echoskopuojant šiuo metodu, kursorius nustatomas taip, kad eitų per tarpskilvelinę pertvarą ir spenelinius raumenis. Taip nustatomas tarpskilvelinės pertvaros ir kairiojo skilvelio laisvosios sienelės miokardo storis (54).
Visgi nenusprendžiama, ar HKM turėtų būti diagnozuojama nustačius sustorėjimą nors ir vienoje intraventrikulinės pertvaros arba kairiojo skilvelio laisvosios sienos vietoje ar reikia, kad sustorėjimas būtų apėmęs bent 50 proc. sienelės segmento (34, 37, 55).
Ir nors echoskopija yra vienas pagrindinių diagnozavimo metodų, ji ne visuomet gali tiksliai parodyti susidariusius pakitimus ligos eigos pradžioje (56). Taip pat, tyrimui atlikti gali būti reikalinga sedacija, ypač jei gyvūnas yra jautresnis stresinėms situacijoms (51).
Katės, kurioms nustatyta liga, turėtų būti neveisiamos, kad mutacija nebūtų perduodama palikuonims. Tyrimai ultragarsu veisėjams yra svarbūs tik tuomet, jei katės nebuvo ištirtos genetiškai dėl A31P mutacijos (32).
Nors miokardo kontraktiliškumo pakitimas yra vienas pagrindinių bruožų nustatinėjant diliatuotą kardiomiopatiją arba aritmogeninę dešiniojo skilvelio kardiomiopatiją kačių tarpe, tačiau pastebėtas sistolinis sutrikimas ir katėms su HKM, tiriant jas Doplerio vaizdo gavimo technika (57). Tiriant šiuo metodu, HKM atveju reikia įvertinti kairiojo skilvelio ištekamąją anga, kraujo iš skilvelio tėkmę bei miokardo susitraukimo greitį.
Doplerio metodu matuojamas kraujo pratekėjimas per kairįjį skilvelį. Diastolinis prisipildymas pasireiškia dviem etapais: ankstusis prisipildymas per miokardo atsipalaidavimo fazę bei arterinis prisipildymas per arterinio susitraukimo fazę. Šių bangų prisipildymo skirtumas sumažėja esant
20 nesmarkiai diastolės disfunkcijai ir pseudo normalizuojasi esant jau sunkesnio tipo diastoliniam sutrikimui (58).
1.8.2. Elektrokardiografinis tyrimas
Elektrokardiografinis tyrimas (EKG) yra aktualus diagnostinis tyrimas, padedantis nustatyti širdies padidėjimą. Katėms, sergančioms HKM, yra pastebimas aritmijų bei kitų laidžiosios sistemos sutrikimų pasireiškimas. Taikant EKG, esant kairiojo skilvelio hipertrofijai gali būti matoma padidėjusi R-banga (>0,9 mV) arba pailgėjusi QRS komplekso amplitudė (>0,045 s.).
Subklinikine ligos forma sergančioms katėms gali pasitaikyti skilvelinės arba supraventrikulinės aritmijos.
Tačiau EKG nėra laikomas specifiniu diagnostiniu metodu HKM nustatyme (37). 1.8.3. Rentgeninis tyrimas
Rentgeninis tyrimas yra svarbus norint įvertinti ar nėra susidariusi plaučių edema arba pleuros efuzija katėms, kurioms nustatytas SŠN. Tačiau tai nėra tyrimas specifiškas HKM diagnozavimui (37). Kairiojo skilvelio hipertrofija nėra visuomet aiškiai matoma, kadangi 10-23 proc. atvejų kardiomegalija ar ryškūs širdies dydžio pokyčiai nėra nustatomi. Be viso to, kardiomegalija yra nustatoma ir kitų širdies ligų atvejais (46, 59).
1.8.4. Magnetinis rezonansas
Labiau pažengusi technika – širdies magnetinio rezonanso tyrimas (MRT). MRT suteikia galimybę vizualizuoti visas miokardo dalis, pastebėti fibrozės apimtus plotus bei tiksliai įvertinti širdies masę bei dydį. Tai dažnai žmonių medicinoje naudojamas tyrimas, tačiau dėl didelės tyrimo kainos rečiau taikomas veterinarijoje (37).
1.8.5. Hemodinaminiai tyrimai
Kraujo tėkmės pakitimai ar kraujo stazės širdies kamerose gali padidinti raudonųjų kraujo kūnelių agregaciją ir trombų formavimąsi. Jei trombas patenka į sisteminę cirkuliaciją jis gali užkimšti arteriją ir taip sukelti galūnių parezę, skilvelines aritmijas (6). Hemodinaminių tyrimų svarba nustatant HKM aptariama ir 2014 metų tyrime. Šio tyrimo duomenimis kačių, su jau pasireiškusia HKM, kraujyje nustatytas didesnis trombocitų aktyvumas lyginant su sveikų kačių kraujyje nustatytu aktyvių trombocitų skaičiumi. Normaliai trombocitai nėra stimuliuojami, jei nėra vidinių ar išorinių traumų (60).
Smarkus širdies troponino I (cTn-I) pakilimas kraujyje rodo nuolatinį miocitų pažeidimą, kuris gali būti vienas HKM požymių. Tačiau tai dažniausiai rodo antrinės kilmės HKM (6).
Lyginant cTn-I 16 HKM sergančių kačių, su 18 sveikų kontrolinės grupės kačių, buvo nustatytas reikšmingas skirtumas. Kačių, turinčių sutrikimą, serume buvo nustatyti didesni troponino I kiekiai. Jie
21 siekė nuo 0,2 iki 4,1 ng/ml, tuo tarpu kontrolinės grupės kačių serume troponino kiekis buvo nuo 0,2 iki 0,25 ng/ml (61).
Visgi, tai nėra specifinis tyrimas kačių HKM susirgimo diagnostikai, nes padidėjęs cTn-I kiekis pastebimas nustatant įvairias širdies ligas tiek žmonių medicinoje, tiek veterinarijoje (6).
Be viso to, pastebėta, kad katės, kurioms nustatoma HKM, yra didesnės, labiau linkusios į nutukimą, jų kraujyje gali būti nustatytas didesnis gliukozės bei IGF-1 (insuliną primenančio augimo faktoriaus - 1) kiekis, pastebėtas spartesnis jų augimas jaunesniame amžiuje (62).
1.8.6. Post mortem
Dažnai diagnozė patvirtinama jau po gyvūno gaišimo atlikus autopsiją ir įvertinus širdies pakitimus. Post mortem diagnozė gali būti pagrįsta įvertinant makroskopinius ir mikroskopinius požymius, tiriant širdies audinius autopsiškai ir histologiškai. Pirmiausia širdis įvertinama vizualiai. Kairysis skilvelis ir/arba prieširdis gali atrodyti padidėję, prieširdyje gali būti randami trombai, o ant skilvelio sienelės gali matytis pabalusi fibrozės zona, palietus gali būti jaučiamas sukietėjimas. Širdies apekso pašalinimas leidžia išmatuoti tarpskilvelinės pertvaros ir kairiojo skilvelio laisvosios sienos storius. Nėra nustatyta matavimo ribų dėl pomirtinio miokardo sienos storumo, tačiau kairysis skilvelis laikomas hipertrofiniu, kuomet bendras tarpskilvelinės pertvaros ir kairiojo skilvelio laisvosios sienos storumas yra daugiau nei keturis kartus storesnis už dešiniojo skilvelio laisvąją sieną (63). Kitas svarbus parametras yra širdies masė. Normali kačių širdies masė yra mažesnė nei 20 gramų, kačių, paveiktų HKM, širdis dažniausiai sveria daugiau (40). Tačiau tai nėra labai tikslus vertinimas, kadangi priklausomai nuo katės veislės, dydžio širdies masė taip pat gali varijuoti. Dėl kačių bendros kūno masės skirtumų, jų širdies masė gali būti išreikšta kaip gramais vienam kačių kūno masės kilogramui. Dažniausiai normali kačių širdies masė yra apie 4g/kg (64).
Vertinant histologiškai HKM atveju matoma kardiomiocitų hipertrofija ir netvarkingas jų išsidėstymas. Kardiomiocitai dažniausiai matomi didesni bei jie gali būti degeneravę. Jie išsidėstę netvarkingai, palyginus su sveikos širdies kardiomiocitais, kurie išsidėstę paraleliai vienas kitam (63, 65). Gali būti matomos fibrozės zonos. Išeminėse zonose matoma aterosklerozė (38, 65).
1.9.Gydymas
Asimptominės katės dažnai gydomos β1-adrenerginių receptorių antagonistais. Tačiau nėra tyrimų įrodančių, kad vaistai padidina išgyvenamumą (66). Katės su smarkia SŠN forma gali būti gydomos diuretikais bei atliekant torakocentezę, siekiant sumažinti plaučių edemą ir pleuros efuziją.
22 Lėtinė SŠN gali būti gydoma kombinuojant diuretikus su AKF-inhibitoriais, kartu derinant mažai druskos turinčią dietą. Katėms, kurios yra ATE rizikos grupėje, dažnai skiriami antikoaguliantai, kraujo krešėjimą trikdantys vaistai (37). Antikoaguliantai gali sutrukdyti naujų trombų formavimuisi, tačiau neištirpdo jau susidariusių trombų. Tačiau to ir nenorima, kadangi staiga atstatyta kraujotaka išeminiuose audiniuose gali į bendrą kraujotaką pernešti gyvybei pavojingus metabolitus. Katėms, jau rodančioms ATE simptomus, dažnai pirmiausiai paskiriami opioidiniai vaistai skausmo mažinimui. Tolimesnis gydymas yra palaikomasis.
Nei vienas iš minėtų gydymų negali atstatyti tinkamos širdies struktūros, tačiau gydymas yra svarbus, nes sumažina komplikacijų pasireiškimą (43).
23
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODIKA
2.1.Tiriamoji medžiaga
Tiriamasis darbas atliktas 2018-2019 metais LSMU Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute, K. Janušausko genetikos laboratorijoje.
Biologiniai mėginiai – burnos gleivinės epitelio ląstelės, imti iš įvairių veislių kačių: Meino meškėnų, Škotų nulėpausių, Rusų mėlynųjų, Devon reksų ir kitų. Iš viso paimta 130 mėginių. Mėginiui paimti naudoti vatos tamponėliai. Tamponėliu perbraukiama per burnos gleivinę 8-10 kartų. Tuomet tamponėliai džiovinami 30-60 s, dedami į vienkartines pakuotes, kurios yra suženklinamos. Iš gyvūnų augintojų surinkta informacija apie auginamo gyvūno veislę bei lytį (2 lentelė). Visi tyrimai buvo atlikti laikantis Nacionalinių ir Europos Sąjungos teisės reikalavimų: Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo Nr. VIII –500/1997; ir Europos konvencijos dėl stuburinių gyvūnų, naudojamų eksperimentiniams ir kitiems moksliniams tikslams apsaugos.
2 lentelė. Tirtų individų pasiskirstymas pagal veislę
Nr. VEISLĖ VEISLĖS TRUMPINYS TIRTŲ INDIVIDŲ SKAIČIUS 1. Meino meškėnai MM 78 2. Škotų nulėpausiai ŠN 20 3. Persai P 3 4. Devon reksai DR 1 5. Britų trumpaplaukiai BT 10 6. Mišrūnai MX 13 7. Bengalai B 3 8. Siamo S 2
24
2.2.DNR išskyrimas iš burnos epitelio ląstelių
1) Vatos tamponėlis su burnos gleivinės epitelio nuograndomis įdedamas į 1,5 ml mėgintuvėlį su 300µl Chelex (Sigma-Aldrich) tirpalu ir mirkomas jame apie 30-60 sekundžių.
2) Tamponėlis pašalinamas. Mėgintuvėlis su mėginiu perkeliamas į kaitinimo bloką ir inkubuojamas 15 minučių 99 °C temperatūroje.
3) Po inkubacijos mėgintuvėlis su mėginiu trumpai išmaišomas „Vortex“ maišykle ir centrifuguojamas maksimaliu greičiu 5 minutes.
4) Atsargiai, neįtraukiant nuosėdų, supernatantas, kartu su jame esančia DNR, nusiurbiamas į švarų mėgintuvėlį.
5) Išskirta DNR saugoma -20 °C temperatūroje.
2.3.MYBPC3 geno polimorfizmo tyrimo metodika
Kačių MYBPC3 geno polimorfizmo tyrimas atliktas PGR-RFIP metodu. Šio tyrimo pagalba galima identifikuoti mutavusį alelį, kuris susidaro kuomet įvyksta missense mutacija, guaninui pasikeičiant į citoziną c.91G>C trečiojo egzono 31 kodone, kuri pasireiškia kaip Meinų meškėnų veislei būdinga hipertrofinė kardiomiopatija.
Pradmenys sukurti remiantis Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro (angl. National Center for Biotechnology Information, toliau – NCBI) duomenų bazėje esančia kačių MYBPC3 geno seka (NC_018732.3). PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje (AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700). PGR metodas paremtas cikliškai pasikartojančiais žingsniais: denatūracija, hibridizacija, sinteze. Tyrime naudotas PGR režimas nurodytas 3 lentelėje. Pradmenys amplifikuoja 242 bp fragmentą.
25
3 lentelė. Pradmenys, PGR reakcijos sąlygos, PGR produkto dydis ir naudotas restrikcijos fermentas
Genetinis defektas Pradmenys PGR profilis PGR produk to dydis Restrikcijos fermentas Hipertrofi nė kardiomio patija (HKM) F: 5’-agccttcagcaagaagcca-3’ R: 5’-caaacttgaccttggaggagc-3’ 95°C 3 min 242 bp AvaI 94°C 30 s 35 cycles 56°C 30 s 72°C 40 s 72°C 7 min
Į mėgintuvėlį pilama 10µl DNR ir 15µ PGR mišinio. PGR reakcijos komponentai yra: tiesioginis ir atvirkštinis pradmuo (Thermo Fisher Scientific), buferis (10X DreamTaq Green Buffer (su 20 mM MgCl2); Thermo Scientific), dNTP (dNTP Mix, 2 mM; Thermo Scientific), vanduo be RNazių (Water, be nukleazių, Thermo Scientific), Taq polimerazė (DreamTaqDNA Polymerase 5U/μl; Thermo Scientific) ir tiriamoji DNR. Komponentų kiekis vienai reakcijai atlikti nurodytas 4 lentelėje.
4 lentelė. PGR komponentai kačių MYBPC3 geno tyrimui
Nr. PGR komponentai Vienai reakcijai atlikti
(µl)
1. Dejonizuotas vanduo ddH20 7,7µl
2. Buferis 10*PCR (su MgCl2) 2,5µl
3. dNTP miksas (2nM) 2,5µl
4. Pirminis pradmuo (darbinė konc. 20pmol) 1µl
5. Atvirkštinis pradmuo (darbinė konc. 20pmol) 1µl
26
2.4.PGR produkto karpymas restrikcijos fermentais
Tinkamas restrikcijos fermentas (AvaI) parinktas naudojantis „CLC Sequence Viewer 8“ programą. 10µL PGR produkto karpoma su 10µl restrikcinio mišinio (7,5µl dejonizuoto vandens, 0,5µl buferio, 0,5 μl AvaI (Thermo Scientific)). Paliekama termostate nakčiai 37°C temperatūroje.
2.5.Elektroforezė agarozės gelyje
Karpytas PGR produktas elektroforezės būdu frakcionuojamas 2,5 proc. agarozės gelyje (1X TAE), dažytame 10µl etidžio bromidu (CS-300V Cleaver; Scientific Ltd) 100V 45 minutes. Tuomet analizuojamas UV šviesoje (bangos ilgis 300 nm) „MiniBisPro“ videodokumentavimo prietaisu (Herolab) (5 lentelė).
5 lentelė. MYBPC3 geno c.91G>C DNR fragmentų dydžiai, bp po karpymo restrikcijos fermentais
Bp Homozigotiniai pagal nepakitusį alelį (G/G) Heterozigotiniai (G/C) Homozigotiniai pagal mutavusį alelį (C/C) 242 - - 63 - - 179 - -
2.6.Duomenų rinkimas ,,X“ klinikoje
Duomenys, retrospektyviai analizei atlikti, buvo renkami ,,X“ smulkių gyvūnų klinikoje. Rinkti duomenys apie pacientus, kurie į kliniką kreipėsi dėl širdies problemų. Retrospektyviai analizei atlikti surinkta informacija apie kačių, turinčių širdies problemų, ligos istorijas nuo 2017 metų sausio mėnesio iki 2019 metų lapkričio mėnesio. Vizito metu buvo surenkama anamnezė apie gyvūnus. Pacientams buvo atliekami bendrieji bei specialieji tyrimai.
27
2.7.Statistinė duomenų analizė
Interpretuoti rezultatus buvo naudojama IBM SPSS Statistics programinė įranga. Buvo apskaičiuoti amžiaus grupių dažniai, naudojant Descriptive statistics FREQUENCIES funkciją, apskaičiuotas amžiaus vidurkis, atliekant Compute variable MEAN funkciją, priklausomybei tarp skirtingų kintamųjų reikšmingumui paskaičiuoti naudota Descriptive statistics Crosstabs CHI-SQUARE funkcija. Tikrinta mutacijos priklausomybė nuo veislės ir lyties. Rezultatai buvo laikomi reikšmingais, kai p<0,05.
28
3. TYRIMŲ REZULTATAI
Tyrime naudoti pradmenys amplifikavo 242 bp fragmentą, kuris buvo frakcionuojamas 2,5 proc. agarozės gelyje. Jei nustatyta, kad katė homozigotė pagal nepakitusį alelį, tuomet agarozės gelio nuotraukoje matomas 242 bp dydžio fragmentas. Jei nustatytas heterozigotinis genotipas gelio nuotraukoje buvo matomi išsifrakcionavę trys fragmentai. (2 pav.)
2 pav. G ir C alelių analizė 2,5 proc. agarozės gelyje. A– G/G genotipas; B –G/C genotipas; C – 50 bp
DNR liniuotė (Thermo Fisher Scientific)
Iš viso buvo ištirta 130 individų. Jie buvo padalinti į dvi dalis – kontrolinę ir eksperimentinę grupes. Mėginiai tyrimams surinkti iš įvairių Lietuvos regionų. Kontrolinę grupę sudarė įvairių veislių (Škotų nulėpausės, Britų trumpaplaukės, Siamo, Devon Rex, Persai, Bengalai ir mišrūnės) katės, eksperimentinę grupę nuspręsta sudaryti tik iš Meino meškėnų veislės kačių (3 pav.).
29
3 pav. MYBPC3 geno c.91G>C mutacijai tirti pasirinktų veislių pasiskirstymas
Išanalizavus gautus rezultatus heterozigotinis genotipas (G/C) nustatytas 18 (23,1 proc.) eksperimentinės grupės kačių ir nenustatytas nei vienai kontrolinės grupės katei. Homozigotinio (C/C) genotipo su abiem mutavusiais aleliais nebuvo rasta nei pas vieną tiriamąjį gyvūną.
Įvertinta mutacijos priklausomybė nuo veislės. Gautas statistiškai reikšmingas rezultatas (P=0,0002, p < 0,05) (4 pav.). 78 20 10 2 3 13 1 3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 MM ŠN BT S B MX DR P K ač ių sk aičiu s (v nt. ) Veislės
30
4 pav. Genotipų pasiskirstymas tarp eksperimentinės ir kontrolinės grupių
Paskaičiuoti genotipų dažniai atskirai eksperimentinės (Meino meškėnai) ir visų tirtų (130) kačių grupėms. Iš apskaičiuotų duomenų matoma, kad abiem atvejais genotipas (G/G), lemiantis mutacijos nebuvimą yra dažnesnis. Tačiau lyginant eksperimentinės grupės ir visų tirtų kačių genotipų dažnius, eksperimentinėje grupėje heterozigotinio genotipo dažnis yra didesnis (6 lentelė).
Paskaičiuoti alelių dažniai eksperimentinėje (Meino meškėnai), kontrolinėje grupėse bei tarp visų individų. Visose grupėse dažniausiai pasikartojantis alelis yra G, kontrolinėje grupėje - tai vienintelis nustatomas alelis. Eksperimentinėje (0,115) ir visų individų (0,07) grupėse nustatyti ir C alelio dažniai (7 lentelė). 60 18 52 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Homozigotniai pagal nepakitusį alelį Heterozigotiniai K ač ių sk aičiu s (v nt. ) Genotipai Eksperimentinė gr. Kontrolinė gr.
31
6 lentelė. Genotipų dažnių lentelė
Meino meškėnų veislės kačių genotipų dažniai Visų tirtų kačių genotipų dažniai
G/G 0,769 G/G 0,862
G/C 0,231 G/C 0,138
C/C 0 C/C 0
7 lentelė. Alelių dažnių lentelė
Aleliai Meino meškėnai Kontrolinė grupė Visi tirti individai
G 0,885 1 0,93
C 0,115 0 0,07
Kitas aktualus rezultatų vertinimo aspektas: pakitimo pasiskirstymas pagal lytį. Buvo ištirtos 75 patelės, tai sudarė 57,7 proc. visų tiriamų individų bei 55 patinai, tai sudarė 42,3 proc. visų tiriamų individų. Tyrimo metu buvo nustatyta heterozigotinis genotipas (G/C) 14 patelių (78 proc.) ir 4 (22 proc.) patinams (5 pav.). Įvertinus duomenis, buvo gautas statistiškai nereikšmingas rezultatas (P= 0,705)
5 pav. Diagrama, vaizduojanti mutacijos pasiskirstymą pagal lytį 22%
78%
Mutacijos pasiskirstymas pagal
lytį
32 Surinkus duomenis smulkiųjų gyvūnų klinikoje ,,X“ nustatyta, kad 15 kačių 2017 metų sausio mėnesio – 2019 metų lapkričio mėnesio periodu buvo diagnozuota HKM.
Analizuojant informaciją, surinktą ,,X” klinikoje, buvo pastebėta, kad liga dažniau diagnozuota vyriškos lyties individams – nustatyta 13 patinų (dažnis 0,867). Tai sudarė 87 proc. visos imties. Rečiau liga buvo diagnozuojama patelėms (dažnis 0,133). Nustatyti 2 ligos atvejai, tai sudarė 13 proc. (6 pav.).
6 pav. Klinikinių HKM susirgimų pasiskirtymas pagal lytį ,,X“ smulkiųjų gyvūnų klinikoje
Paskaičiuotas amžiaus, kurio metu buvo diaznozuota HKM, dažnis. Dažniausiai liga diagnozuota jauniausiai amžiaus grupei priklausančioms katėms (dažnis 0,467) (8 lentelė), rečiau liga diagnozuojama vyresnio amžiaus katėms. Nustatytas vidutinis amžius dianozuojant HKM – 4,8 metai (7 pav.). 87% 13%
Sergamumo HKM pasiskirstymas
pagal lytį
patinai patelės33
8 lentelė. Amžiaus dažnių lentelė
Amžiaus grupės, metai
Skaičius individų, kuriems nustatyta HKM Dažnis 1-3 7 0,467 3-6 5 0,333 6-9 0 0 9-12 2 0,133 >12 1 0,067
7 pav. Individų, kuriems diagnozuota HKM, skaičius pagal amžių ir jų amžiaus vidurkis
7 5 0 2 1 4.8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 3 6 9 12 >12 Kiek k ar tų n us taty ta HKM ( vn t.)
Amžiaus grupės (metai)
Skaičius individų, kuriems nustatyta HKM
34
4. TYRIMO REZULTATŲ APIBENDRINIMAS
Norint sužinoti MYBPC3 geno A31P mutacijos paplitimą Lietuvos kačių populiacijoje ištirta 130 individų. Mėginiai surinkti iš 8 skirtingų veislių kačių – Meino meškėnų (78 katės), Škotų nulėpausių (20 kačių), Britų trumpaplaukių (10 kačių), Siamo (2 katės), Bengalų (3 katės), Devon Rexų (1 katė), Persų (3 katės) ir Mišrūnių (13 kačių). Tuomet veislės padalintos į dvi grupes: eksperimentinę (78 katės), kurią sudarė tik Meino meškėnai ir kontrolinę (52 katės), kurią sudarė visų kitų veislių katės.
Mutacija nustatyta 18 Meino meškėnų veislės kačių. Tai sudaro 13,8 proc. visos tirtos kačių populiacijos ir 23,1 proc. tirtos Meinų meškėnų populiacijos. A31P mutacija nenustatyta nei vienai kontrolinės grupės katei. Įvertinus mutacijos priklausomybę nuo veislės, gautas statistiškai reikšmingas rezultatas (P= 0,0002; p < 0,05).
Paskaičiavus genotipų dažnius, pastebėta, kad G/G, genotipas be mutacijos, pasitaikė žymiai dažniau tiek tiriamojoje grupėje (0,769), tiek tarp visų tirtų individų (0,862). Vertinant heterozigotinio genotipo dažnį G/C, nustatyta, kad eksperimentinėje grupėje (0,231) šio genotipo dažnis didesnis lyginant su dažniu tarp visų tirtų individų (0,138).
Lyginat su kitų autorių gautais rezultatais yra matomas panašumas. J. Mary ir kiti savo 2010 metų darbe nustatė mutacijos priklausomybę nuo veislės. Iš 2744 tirtų Meino meškėnų veislės kačių 41,5 proc. buvo nustatyta A31P mutacija. Tačiau šio tyrimo metu mutacija buvo nustatyta ir vienai Britų trumpaplaukių veislės katei (2). M.T. Godiksen nurodo, kad HKM, sukeliančios mutacijos paplitimas Meino meškėnų populiacijoje yra tarp 9,5 proc. ir 26,3 proc. (25).
Mėginiai buvo surinkti tiek iš patinų (55 katės), tiek iš patelių (75 katės). Mutacija nustatyta 14 Meino meškėnų patelių ir 4 patinams. Patelės su pakitusiu genotipu sudarė 10,8 proc. visos tirtos kačių populiacijos, o patinai 3,1 proc. Tačiau atlikus statistinę analizę, tikrinant mutacijos priklausomybę nuo lyties, gautas statistiškai nereikšmingas rezultatas (P= 0,705; p > 0,05).
Analizuojant informaciją, surinktą ,,X” klinikoje, buvo pastebėta, kad liga dažniau diagnozuota patinams (dažnis 0,867). Tai sudarė 87 proc. visos imties. Rečiau liga buvo diagnozuojama patelėms (dažnis 0,133). Jų susirgimai sudarė 13 proc.
Pagal J.R. Payne ir kitų duomenimis ligos vyravimas tarp patinų (62,6 proc.) didesnis nei tarp patelių, todėl manoma, kad lytis gali būti vienas iš predispozicijos faktorių, lemiančių mutacijos pasireiškimą (10). M. Longeri ir kitų tyrimo rezultatų analizė taip pat parodė ligos pasireiškimą nuo lyties – HKM nustatyta 78,9 proc. patinų ir tik 21,1 proc. patelių (20). S.C. Riesen ir kitų manymu
35 HKM yra būdinga abejoms lytims vienodai, tačiau patinams simptomai atsiranda anksčiau ir dažnai jie serga sunkesne ligos forma (8).
Analizuojant 2017 metų sausio – 2019 metų lapkričio mėnesių duomenis iš ,,X“ klinikos įvertinta HKM priklausomybė nuo amžiaus. Šiuo laikotarpiu liga dažniausiai buvo diagnozuojama jaunesnės amžiaus grupės 1 – 3 metų katėms (46,7 proc.), šiek tiek mažiau vidutinei amžiaus grupei priklausančioms 3 – 6 metų katėms (33,3 proc.) ir mažiausiai vyresnio amžiaus 9 – 12 ir daugiau metų katėms (20 proc.). Taip pat nustatytas amžiaus vidurkis, kuomet buvo diagnozuota HKM – 4,8 metai.
J.R. Payne ir kitų duomenimis ligos vyravimas tarp jaunų (6-12 mėnesių amžiaus) kačių buvo nustatytas 4,3 proc., o tarp vyresnio amžiaus kačių (≥ 9 metų amžiaus) 29,4 proc. Tačiau manoma, kad amžius gali varijuoti priklausomai nuo veislės. Meino meškėnų, Sfinksų, Britų trumpaplaukių ir Skudurinukių veislės katėms būdingas ligos diagnozavimo amžius nuo 5 mėnesių iki 4,2 metų (10). Manoma, kad todėl tyrimo metu gautas didesnis, jaunesniai amžiaus grupei priklausančių kačių, sergamumas.
Svarbu atsižvelgti ir į tai, kad HKM dažniau diagnozuota patinams. Nustatyta, kad vyriškos lyties atstovai linkę susirgti šia liga ankstesniame amžiuje (8).
Nustačius vidutinį sergančių amžių gauta 4,8 metai. J.R. Payne duomenimis vidutinis HKM diagnozavimo amžius kačių populiacijoje 6 metai (10).
36
5. IŠVADOS
1.1. HKM atveju kačių širdis ima vis prasčiau atlikinėti savo funkciją, tai pasireiškia dėl tarpskilvelinės pertvaros arba laisvosios kairiojo skilvelio sienos sustorėjimo. Sutrinka Ca jonų apykaita bei širdies aprūpinimas energija dėl baltymų patologijų.
1.2. Manoma, kad HKM yra genetinės kilmės liga įvairių veislių katėms. Tačiau iki šiol yra tiksliai išsiaiškintos tik dvi mutacijos: viena A31P Meino meškėnams, kita R820W Skudurinukėms. Tačiau tiek ir šioms dviems veislėms, manoma, kad gali būti ir kitų mutacijų, lemiančių HKM atsiradimą. 1.3. Ligai identifikuoti dažniausiai atliekamas diagnostikos metodas - echoskopija, nes tyrimo metu galima neinvazyviai įvertinti širdies struktūras. Pati tiksliausia ir labiausiai pažengusi ligos identifikavimo technika – MRT, kuri suteikia galimybę vizualizuoti visas miokardo dalis, pastebėti fibrozės apimtus plotus bei tiksliai įvertinti širdies masę bei dydį.
2. Remiantis tyrimo duomenimis galima teigti, kad MYBPC3 geno nukleotidų pakaita, lemianti HKM yra specifiška ir paplitusi tik tarp Meino meškėnų veislės kačių. Tarp kitų tirtų veislių nebuvo nustatytas A31P mutacijos paplitimas.
3.1. Retrospektyviai išanalizavus smulkiųjų gyvūnų klinikos ,,X“ duomenis nustatyta, kad dažniausiai HKM sirgo jaunesnio amžiaus grupei priklausantys gyvūnai.
3.2. Įvertinus ligos priklausomybę nuo lyties, buvo pastebėta, kad didžioji dalis gyvūnų, kuriems buvo nustatyta HKM buvo patinai ir tik maža dalis patelių.
37
LITERATŪROS SĄRAŠAS
(1) Meurs K.M., Sanchez X., David R.M., Bowles N.E., Towbin J.A., Reiser P.J., Kittleson J.A., Munro M.J., Dryburgh K., Macdonald K.A., Kittleson M.D. A cardiac myosin binding protein C mutation in the Maine Coon cat with familial hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 2005. 14(23):3587-93.
(2) Mary J., Chetboul V., Carlos Sampedrano C., Abitbol M., Gouni V., Trehiou-Sechi E., Tissier R., Queney G., Pouchelon J.L., Thomas A. Prevalence of the MYBPC3-A31P mutation in a large European feline population and association with hypertrophic cardiomyopathy in the Maine Coon breed. Journal of Veterinary Cardiology 12. 2010. 155-161.
(3) Maron B.J. Hypertrophic cardiomyopathy: A systematic review. J Am Med Assoc. 2002. 287:1308–1320.
(4) Nanni L., Pieroni M., Chimenti C., et al. Hypertrophic cardiomyopathy: Two homozygous cases with ‘‘typical’’ hypertrophic cardiomyopathy and three new mutations in cases with progression to dilated cardiomyopathy. Biochem Biophys Res Commun. 2003. 309:391–398
(5) Alcalai R., Seidman J.G., Seidman C.E. Genetic basis of hypertrophic cardiomyopathy: From bench to the clinics. J Cardiovasc Electrophysiol. 2008. 19:104–110.
(6) Ferasin L. Feline cardiomyopathy. Publikuotas group.bmj.com 2012. (https://www.researchgate.net/profile/Luca_Ferasin/publication/267637749_Feline_Cardiomyopathy/li nks/545657720cf2cf5164802f30/Feline-Cardiomyopathy.pdf žiūrėta: 2019-11-15) .
(7) Wess G., Schinner C., Weber K. Association of A31P and A74T polymorphisms in the myosin binding protein C3 gene and hypertrophic cardiomyopathy in Maine Coon and other breed cats. J Vet Intern Med. 2010. 24:527-532.
(8) Riesen S.C., Kovacevic A., Lombard C.W., Amberger C. Prevalence of heart disease in symptomatic cats: an overview from 1998 to 2005. Schweizer Archiv für Tierheilkunde 149. 2007. 65-71.
(9) Luis Fuentes F., Wilkie L.J. Asymptomatic hypertrophic cardiomyopathy: diagnosis and therapy. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 47. 2017. 1041-1054.
38 (10) Payne J.R., Brodbelt D.C., Luis Fuentes V., Cardiomyopathy prevalence in 780 apparently healthy cats in rehoming centres (the CatScan study). Journal of Veterinary Cardiology 17 (Suppl. 1). 2015. 244-257.
(11) Trehiou-Sechi E., Tissier R., Gouni V., Misbach C., Petit A.M.P., Balouka D., Carlos Sampedrano C., Castaignet M., Pouchelon J.L., Chetboul V., Comparative echocardiographic and clinical features of hypertrophic cardiomyopathy in 5 breeds of cats: a retrospective analysis of 344 cases (2001-2011). Journal of Veterinary Internal Medicine 26. 2012. 532-541.
(12) Riesen S.C., Kovacevic A., Lombard C.W., Amberger C. Echocardiographic screening of purebred cats: an overview from 2002 to 2005. Schweizer Archiv für Tierheilkunde 149. 2007. 73-76. (13) Granström S., Nyberg Godiksen M.T., Christiansen M., Pipper C.B., Willesen J.T., Koch J. Prevalence of Hypertrofic Cardiomyopathy in a Cohort of British Shorthair Cats in Denmark. Journal of Veterinary Internal Medicine 25. 2011. 866-871.
(14) Lefbom B.K., Rostenthal S.L., Tyrell W.D., Saunders T.G., Ferguson M.J., Rush J.E., Lesser M.B. Severe hypertrophic cardiomyopathy in 10 young Ragdoll cats (abstract). Journal of Veterinary Internal Medicine 15. 2001. 308.
(15) Häggström J., Luis Fuentes V., Wess G. Screening for hypertrophic cardiomyopathy in cats. Journal of Veterinary Cardiology 17 (Suppl. 1). 2015. 134-149.
(16) Kittleson M.D., Meurs K.M., Harris P.S., PhDc The Genetic Basis of Hypertrophic Cardiomyopathy in Cats and Humans. J Vet Cardiol. 17(Suppl 1). 2015. 53–73.
(17) Connolly D. J., Guitian J., Boswood A., Neiger R. Serum troponin I levels in hyperthyroid cats before and after treatment with radioactive iodine. Journal of Feline Medicine and Surgery 7. 2005. 289-300.
(18) Ripoll V.T., Monserrat I.L., Hermida P.M., Ortiz M., Rodriguez G.I., Govea C.N., Gómez N.C., Rosell A.J., Gámez M.J.M., Pons L.G., Cremer L.D., Torres M.J. The R820W mutation in the MYBPC3 gene, associated with hypertrophic cardiomyopathy in cats, causes hypertrophic cardiomyopathy and left ventricular non-compaction in humans. Int J Cardiol. 2010. 145(2):405-407. (19) Casamian-Sorrosal D., Chong S.K., Fonfara S., Helps C. Prevalence and demographics of the MYBPC3- mutations in ragdolls and Maine coons in the British Isles. Journal of Small Animal Practice 55. 2014. 269-273.
39 (20) Longeri M., Ferrari P., Knafelz P., Mezzelani A., Marabotti A., Milanesi L., Pertica G., Polli M., Brambilla P.G., Kittleson M. et al. Myosin-binding protein c DNA variants in domestic cats (A31P, A74T, R820W) and their association with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine 27. 2013. 275- 285.
(21) Borgeat K., Stern J., Meurs K.M., Luis Fuentes V., Connolly D.J. The influence of clinical and genetic factors on left ventricular wall thickness in Ragdoll cats. Journal of Veterinary Cardiology 17 (Suppl. 1). 2015. 258- 267.
(22) Meurs K.M., Norgard M.M., Kuan M., Haggstrom J., Kittleson M. Analysis of 8 sarcomeric candidate genes for feline hypertrophic cardiomyopathy mutations in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine 23. 2009. 840-843.
(23) Fries R., Heaney A.M., Meurs K.M. Prevalence of the myosin-binding protein C mutation in Maine Coon cats. Journal of Veterinary Internal Medicine 22. 2008. 893-896.
(24) Kittleson MD., Meurs KM., Harris SP. The genetic basis of hypertrophic cardiomyopathy in cats and humans. J Vet Cardiol. 17(Suppl 1). 2015. 53-73.
(25) Godiksen MT., Granstrøm S., Koch J., Christiansen M. Hypertrophic cardiomyopathy in young Maine Coon cats caused by the p.A31P cMyBP-C mutation--the clinical significance of having the mutation. Acta Vet Scand. 2011. 53(1):7.
(26) Carlos Sampedrano C., Chetboul V., Mary J., Tissier R., Abitbol M., Serres F., Gouni V., Thomas A., Pouchelon JL. Prospective echocardiographic and tissue Doppler imaging screening of a population of Maine Coon cats tested for the A31P mutation in the myosin-binding protein C gene: a specific analysis of the heterozygous status. J Vet Intern Med. 2009. 23(1):91-9.
(27) Borgeat K., Casamian-Sorrosal D., Helps C., Luis Fuentes V., Connolly DJ. Association of the myosin binding protein C3 mutation (MYBPC3 R820W) with cardiac death in a survey of 236 Ragdoll cats. J Vet Cardiol. 2014. 16(2):73-80.
(28) Knöll R. Myosin binding protein C: implications for signal-transduction. Journal of Muscle Research and Cell Motility 33. 2012. 31-42.
(29) Carrier L., Mearini, G., Stathopoulou, K., Cuello, F. Cardiac myosin-binding protein C (MYBPC3) in cardiac pathophysiology. Gene 573. 2015. 188-197.
(30) Sadayappan S., Tombe PP. Biophys. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Rev. 2012. 4(2):93-106.
