MIKROELEMENTŲ VARIO IR CINKO ĮTAKA ALZHEIMERIO LIGOS ETIOPATOGENEZEI

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS TOKSIKOLOGIJOS LABORATORIJA AUSTĖJA GERULYTĖ

MIKROELEMENTŲ VARIO IR CINKO ĮTAKA ALZHEIMERIO

LIGOS ETIOPATOGENEZEI

MEDICINOS MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Mokslinė vadovė: dr. Loreta Strumylaitė KAUNAS, 2019

2 TURINYS 1. SANTRAUKA ... 4 2. SUMMARY ... 5 3. PADĖKA ... 6 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 6

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6

6. SANTRUMPOS ... 6

7. ĮVADAS ... 7

8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 7

9. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8

9.1. AL apibrėžimas ir paplitimas... 8

9.2 AL tipai... 9

9.3 Ligos pagrindinės hipotezės... 10

9.4 Ligos rizikos veiksniai (RV) ... 11

9.5 Mikroelementų reikšmė AL patogenezėje ... 12

10. TYRIMO METODIKA ... 14

10.1 Atranka, tyrimo metodai ir tiriamoji populiacija ... 14

10.2 Klausimynas ... 15

10.3 Kraujo tyrimas ... 15

10.4 Statistinė analizė ... 15

11. REZULTATAI ... 16

11.1. Bendroji tiriamųjų charakteristika ... 16

11.2. Vario ir cinko koncentracijų įvertinimas tiriamųjų kraujo plazmoje ... 17

11.3. Vario ir cinko sąsajų kraujo plazmoje įvertinimas ... 18

11.4. Alzheimerio ligos priklausomybė nuo vario ir cinko ... 19

3

13. IŠVADOS ... 23

14. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 23

15. PRIEDAI ... 26

4

1. SANTRAUKA

Autorius: Austėja Gerulytė

Mokslinė vadovė: dr. Loreta Strumylaitė

Darbo tema: Mikroelementų vario ir cinko įtaka Alzheimerio ligos etiopatogenezei

Tyrimo tikslas: Įvertinti mikroelementų vario ir cinko reikšmę Alzheimerio ligos etiopatogenezėje. Tyrimo uždaviniai: 1. Įvertinti vario (Cu) ir cinko (Zn) koncentracijas Alzheimerio liga (AL) sergančių ligonių ir kontrolinės grupės žmonių kraujyje. 2. Įvertinti sąsajas tarp Cu ir Zn koncentracijų bei amžiaus. 3. Įvertinti sąsajas tarp Cu koncentracijų ir galimybės susirgti AL, atsižvelgiant į rizikos veiksnius. 4. Įvertinti sąsajas tarp Zn koncentracijų ir galimybės susirgti AL, atsižvelgiant į rizikos veiksnius.

Tyrimo metodika: 2017 gruodžio - 2019 vasario mėn. atliktas atvejo ir kontrolės tyrimas ligoninėse. Jame dalyvavo 36 pacientai, kuriems tyrimo laikotarpiu diagnozuota AL (atvejai), ir 74 pacientai, nesergantys AL (kontrolinė grupė). Visi tiriamieji apklausti pagal klausimyną, paimti kraujo ėminiai, kuriuose induktyviai susietos plazmos masių spektrometru nustatyta Cu ir Zn koncentracija kraujo plazmoje. Skaičiuotos medianos, Spirmeno koreliacija, tiesinė regresija ir logistinė regresija.

Rezultatai: Atvejo ir kontrolės grupių tiriamųjų Cu koncentracijos plazmoje buvo 93,27 µg/dl ir 105,45 µg/dl (p=0,08), o Zn koncentracija, atitinkamai, 63,60 µg/dl ir 74,48 µg/dl (p<0,001). Atvejo grupėje nustatytas tiesioginė koreliacija tarp Cu koncentracijos bei amžiaus (r=0,5, p=0,002). Įvertinus amžių ir lytį, nustatytas reikšmingas teigiamas ryšys tarp Cu ir Zn koncentracijų kontrolinėje grupėje (=0,69, p<0,001). Įvertinus amžių, lytį, atminties sutrikimų šeiminę anamnezę, mokymosi trukmę ir Zn koncentraciją, tiriamieji, kuriems nustatyta Cu >105,45 g/dl turėjo 5,6 karto mažesnę tikimybę susirgti AL (šansų santykis=0,18, PI=0,01), nei tiriamieji, kuriems rasta Cu koncentraciją ≤105,45 g/dl. Reikšmingo ryšio tarp Zn koncentracijos plazmoje ir tikimybės susirgti AL nenustatėme: tiriamųjų kategorijoje su Zn koncentracija >74,48 g/dl šansų santykis buvo 0,41, lyginant su tiriamųjų kategorija, kai Zn koncentracija ≤74,48 g/dl (p>0,05).

Išvados: Vario koncentracija Alzheimerio liga sergančiųjų ir kontrolinės grupių tiriamųjų kraujo plazmoje reikšmingai nesiskiria, o cinko koncentracija sergančiųjų kraujo plazmoje yra reikšmingai mažesnė negu kontrolinės grupės tiriamųjų. Teigiamas ryšys tarp vario koncentracijos bei amžiaus rastas tarp Alzheimerio liga sergančiųjų. Įvertinus amžių ir lytį, nustatytas reikšmingas ryšys tarp vario ir cinko koncentracijų kontrolinėje grupėje. Įvertinus rizikos veiksnius, didesnė vario koncentracija, mažina riziką sirgti Alzheimerio liga.

5

2. SUMMARY

Author: Austėja Gerulytė

Scientific supervisor: dr. Loreta Strumylaitė

Title: The impact of trace elements copper and zinc on etiopathogenesis of Alzheimer’s disease The aim: To determine the influence of copper and zinc in the etiopathogenesis of Alzheimer’s disease.

The objectives: 1) To assess the concentration of copper (Cu) and zinc (Zn) in patients with Alzheimer’s disease (AD) and in healthy controls. 2) To evaluate the link between Cu and Zn in blood plasma and age. 3) To assess the relationship between Cu in blood plasma and AD, considering potential risk factors. 4) To assess the relationship between Zn in blood plasma and AD, considering potential risk factors.

Methods: From December, 2017 to February, 2019 a hospital-based case-control study was conducted among 36 patients with newly diagnosed AD (cases), and 74 without AD (controls). All information on risk factors was collected using a questionnaire. Cu and Zn in blood plasma were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry. Medians, Spearman correlation coefficients, linear regression and logistic regression were calculated.

Results: Cu and Zn concentrations in plasma of cases and controls are 93.27 µg/dl and 105.45 µg/dl (p=0.08) and 63.60 µg/dl and 74.48 µg/dl (p<0.001) respectively. A positive Cu and age relationship is observed in the cases (r=0.5, p=0.002). After adjustment for age and gender a positive association was determined between Cu and Zn concentrations in a control group (=0.69, p<0.001). The subjects with Cu >105.45 g/dl had 5.6 times lower risk of AD (odds ratio=0.18, CI=0.01), than subjects with ≤105,45 g/dl, after adjustment for age, gender, family history of memory impairment, the length of education and Zn in plasma. A significant relationship between Zn and the risk of AD was not found: in category of Zn >74.48 g/dl the odds ratio was 0.41, comparing with category of Zn ≤74.48 g/dl (p>0.05).

Conclusions: Copper concentration in blood plasma of patients with Alzheimer’s disease does not differ from the controls, while zinc concentration in diseased patients is significantly lower. Positive copper/age association is determined among patients with Alzheimer’s disease. After adjustment for age and gender, a significant relationship is found between copper and zinc concentrations in controls: Higher concentration of copper is related to lower risk of Alzheimer’s disease.

6

3. PADĖKA

Padėka skiriama darbo vadovei dr. Loretai Strumylaitei ir Neuromokslų instituto Toksikologijos laboratorijos darbuotojoms: dr. D. Baranauskienei, doc. dr. R. Kregždytei, A. Švėgždienei ir visiems darbuotojams už pagalbą ir kantrybę atliekant ir organizuojant šį tyrimą.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

Interesų konflikto nebuvo.

5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

2017-10-09 išduotas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro leidimas, išdavimo Nr. BEC-MF-39.

6. SANTRUMPOS

MMSE (angl. Mini-Mental State Examination) – trumpas protinės būklės tyrimas, ŠS - šansų santykis,

PI – pasikliautinasis intervalas, RV - rizikos veiksniai,

ROS (angl. Reactive oxygen species) – reaktyvūs deguonies junginiai, APP – amiloido pirmtako baltymas,

7

7. ĮVADAS

Alzheimerio liga (AL) - tai svarbi senėjančios populiacijos problema visame pasaulyje. Nepaisant mokslo progreso Alzheimerio ligos diagnostikoje ir gydyme, manoma, kad 2030 m. apie 82 mln. žmonių sirgs demencija, o daugiau nei pusė šių žmonių sirgs AL, nes tai dažniausia demencijos forma [1].

2018 m. Lietuvoje demencija su AL sirgo 31712 asmenys. Pastaruosius 5-erius metus kiekvienais metais sergamumas AL didėjo 600-700 atvejų ir buvo 3,4 nauji AL atvejai 1000 gyventojų. Manoma, kad šios tendencijos tik ryškės, kadangi Lietuvoje daugėja vyresnio amžiaus žmonių [2].

Moksliniai tyrimai rodo, kad ypač ankstyvosios AL etiopatogenezėje svarbus paveldimas polinkis [3]. Nustatyta, kad moterys bei vyresni nei 60 m. amžiaus asmenys serga dažniau. Arterinė hipertenzija, cukrinis diabetas, hipercholesterolemija, hipodinamija, nutukimas, galvos smegenų insultas, galvos traumos, depresija, rūkymas taip pat yra tarp veiksnių, galinčių turėti įtakos AL atsiradimui [4].

Pastaruoju metu atlikti tyrimai rodo, kad mikroelementai (varis, cinkas, manganas, švinas, aliuminis ir kt.) dalyvauja AL išsivystymo procesuose, tačiau jų poveikis nėra galutinai išaiškintas. Manoma, kad mikroelementai glaudžiai išsidėsto šalia amiloidinių plokšelių, dalyvauja oksidacinio streso reakcijose [5, 6, 7, 8]. Eksperimentiniai tyrimai rodo, jog kai kurių mikroelementų koncentracijos padidėjimas atskirose smegenų dalyse ir kraujyje yra susijęs su mokymosi ir atminties sutrikimų progresavimu [6, 7, 9, 8, 10].

Kadangi atliktų tyrimų rezultatai nėra vienareikšmiai ir Alzheimerio ligos priežastys nėra galutinai ištirtos ir aiškios, šiame darbe bandysime išsiaiškinti, mikroelementų vario ir cinko, reikšmę AL išsivystymui.

8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo tikslas: Įvertinti mikroelementų vario ir cinko reikšmę Alzheimerio ligos etiopatogenezėje.

8

1. Įvertinti mikroelementų vario ir cinko koncentracijas Alzheimerio liga sergančių ligonių ir kontrolinės grupės žmonių kraujyje.

2. Įvertinti sąsajas tarp vario koncentracijos ir cinko koncentracijos tiriamųjų kraujyje ir amžiaus.

3. Įvertinti sąsajas tarp vario koncentracijos ir tikimybės susirgti Alzheimerio liga, atsižvelgiant į potencialius rizikos veiksnius (amžių, lytį, šeiminę anamnezę, išsilavinimą).

4. Įvertinti sąsajas tarp cinko koncentracijos ir tikimybės susirgti Alzheimerio liga, atsižvelgiant į potencialius rizikos veiksnius (amžių, lytį, šeiminę anamnezę, išsilavinimą).

9. LITERATŪROS APŽVALGA

9.1. AL apibrėžimas ir paplitimas

AL – tai neaiškios etiologijos neurodegeneracinė liga, kuri pasireiškia progresuojančiu atminties sutrikimu ir kitais pažinimo sutrikimais. Kadangi šios ligos priežastys ir patogenezė yra neaiškios, tai išlieka aktualia mokslinių tyrimų ir publikacijų tema visame pasaulyje.

1906 m. ši liga pirmą kartą buvo aprašyta vokiečių patologo Alois Alzheimer. Jis aprašė klinikinį atvejį, apibūdinantį 51 m. moterį su pirmąkart atsiradusiu ir progresuojančiu pažinimo funkcijų sutrikimu. Moteris pasižymėjo vis intensyvėjančia paranoja, miego ir atminties sutrikimais, agresija ir sumišimu iki pat savo mirties po 5 metų. Moteriai buvo atlikta autopsija ir stebėti saviti histologiniai pokyčiai smegenyse – tam tikros plokštelės ir neurofibriliniai tinkleliai. 1910 m. AL pradėta minėti mokslinėje literatūroje [11]. Jau daugiau kaip 100 m. ši liga yra tyrinėjama, ir mokslininkai iki šiol bando išsiaiškinti konkrečias AL priežastis ir patogenetinius mechanizmus, nes tai vis dar lieka paslaptimi. Intensyviai diskutuojama apie tai, kas gali turėti įtakos AL atsiradimui ir kokie procesai vyksta smegenyse sergant šia liga.

Šis sutrikimas išlieka aktuali problema, daugėjant vyresnio amžiaus žmonių visame pasaulyje. Statistika rodo, jog ji paveikia 1 iš 5 moterų ir 1 iš 10 vyrų, tačiau priežastis, kodėl moterų populiacija paveikiama dažniau yra neaiški [12]. AL yra dažniausia demencijos rūšis, nes net 60-70 proc. ligonių, kuriems diagnozuotas demencijos sindromas, serga AL [13]. Dažniausiai ši liga pasireiškia vyresnio amžiaus žmonėms. Tyrimų duomenimis tikimybė susirgti padvigubėja kas dešimtmetį po 60-ies metų [14]. Vien Lietuvoje 2017 m. buvo nustatyta 6988 demencijos su AL atvejų. Taip pat tais pačiais

9

metais suskaičiuota iš viso 31975 sergančiųjų AL mūsų šalyje [2]. Kiekvienais metais sergančiųjų daugėja, nes tai senėjančios populiacijos problema, kuriai sprendimas šiuo metu dar nėra rastas.

9.2 AL tipai

Ankstyvosios AL paveldėjimas paremtas autosominiu dominantiniu būdu. Jei giminėje buvo nustatyti 3 ankstyvosios AL atvejai daugiau nei dvejose kartose, šeima turės autosominį dominantinį ankstyvosios AL geną. Ši forma kliniškai pasireiškia asmenims nuo 30 iki 60 metų. Tačiau geno penetrantiškumas abejotinas, nes liga nepasireiškia visose AD AL alelį turinčiose šeimose [12]. Šį sutrikimą lemiantys genai yra 1 [15], 14 [16], 21-oje [17] chromosomose, tai - amiloido pirmtako baltymas (APP), presenilinas 1 (PSEN1), presenilinas 2 (PSEN2) [3]. Šios mutacijos lemia tik mažiau nei 1 proc. visų AL formų ir apie 60-70 proc. visų ankstyvosios AL atvejų, tačiau šių genų atradimas labai pagilino mokslininkų supratimą apie šią ligą.

Vėlyvoji AL aiškinama kaip sudėtingesnis procesas. Jos hipotezė yra labiau paremta aplinkos ir genetinių veiksnių visuma. Genetinis komponentas taip pat nėra labai penetrantiškas [18]. Tai - apolipoproteinas E (APOE), kuris yra 19 chromosomoje trijuose aleliuose (ℇ): 2,3,4. Pastarasis buvo atrastas 1993 m., išnagrinėta jo svarba tiek AL, tiek kraujagyslinės demencijos patogenezėje. 4-asis alelis siejamas su didesne ligos galimybe nei 2-asis ir 3-iasis. Roterdame atliktuose tyrimuose buvo nustatyta, jog asmenys turintys ε2/ε4 ir ε3/ε4 alelius turi dvigubai didesnį polinkį sirgti nei ε3/ε3 nešiotojai. Taip pat ε4/ε4 genotipo nešiotojai turėjo apie 8 kartus didesnę tikimybę sirgti AL nei ε3/ε3. Framingamo tyrime ε4 homozigotai turėjo 30,1 proc. didesnę tikimybę, o ε3/ε4 heterozigotai turėjo 3.7 proc..

Apolipoproteino E ε4 alelis nelemia AL tiesiogiai, jis rodo imlumą šiai ligai. Homozigotiniai pacientai yra labiau linkę susirgti AL, bet tai nereiškia, kad jie būtinai susirgs. 40 proc. visų sergančių AL pacientų net neturi šio geno. Taip pat APOE ε4 alelis siejamas su ankstesne vėlyvosios formos AL pradžia. Tyrimų duomenimis, papildoma ε4 alelio kopija paankstina ligos pasireiškimą 2,5 metais. Taip pat šis alelis gali lemti ligos sunkumo laipsnį, pavyzdžiui, greičiau sutrinka pažintinės funkcijos, didesnė hipokampo atrofija MRT vaizduose, daugiau psichiatrinių komplikacijų, daugiau amiloidinių plokštelių, gausesnė neurofibrilinė degeneracija taip pat trumpesnis išgyvenamumas [12].

10

9.3 Ligos pagrindinės hipotezės

Išskyrus vyresnį amžių ir apolipoproteino E (APOE) e4 alelį, AL priežastys yra nežinomos, kartu tai neleidžia sukurti efektyvių šios ligos gydymo būdų. Dėl to pastaraisiais dešimtmečiais vis didesnis dėmesys yra skiriamas išsiaiškinti šios ligos rizikos veiksnius (RV) ir vykdyti jų profilaktiką. Nors ligos patogenezė nėra aiški, mokslininkai yra suformavę kelias AL hipotezes, kuriomis vadovaujasi aiškinant AL patogenetinius mechanizmus.

Pirmoji yra amiloidinės plokštelės plokštelės hipotezė. Pirmąkart publikuota 1991 metais. Ji teigia, jog A peptidų sankaupos yra pagrindinė ligos priežastis, lemianti neuronų degeneraciją [19]. A peptidas yra dalis didesnio baltymo, vadinamu amiloido pirmtako baltymu (angl. amyloid

precursor protein, APP). Šis baltymas pirmąkart buvo išskirtas žmonių, sergančių Dauno sindromu ir

AL smegenyse 1984 m. [20]. Trys proteazės , ,  skaido APP. Amiloidinėje hipotezėje svarbios tik ,  proteazės. Sergant AL, dėl neaiškių priežasčių minėtą baltymą skaido ,  sekretazės. Visų pirma APP skaido β sekretazė į APPβs ir C99 APP produktus. Pastarąjį  sekretazė galiausiai skaido į A 40, 42 peptidus. Nepasaint to, kad A40 peptidų produktų yra daugiausiai (apie 80-90 proc.), peptidas A42 (apie ~5-1 proc.) yra hidrofiliškas ir linkęs kauptis smegenyse [20, 21]. Jų kaupimas siejamas su tipiniu AL pažintinių funkcijų sutrikimu ir neuronų degeneracija smegenyse. Tačiau pastaraisiais metais atsirado mokslinių tyrimų apie gydymo neefektyvumą pagal šiuos mechanizmus ir prieštaravimus šiai hipotezei [22, 23].

Tau hipotezė teigia, jog to pačio pavadinimo baltymas, kuris yra neuronų citoskeleto

sudedamoji dalis, yra hiperfosforilinamas. Sergant AL, susidaro neurofibriliniai rezginiai (angl. NFTs,

neurofibrillary tangles), kurie sutrikdo normalią neuronų homeostazę. Normos atveju Tau baltymas

yra tirpus junginys, hiperfosforilintas jis tampa netirpus ir sutrikdomas ląstelės transportas, sutrikdoma citoplazmos ir citoskeleto pusiausvyra. Šie procesai gali paskatinti neuronų žūtį ir demencijos, AL vystymąsi [24].

Šiuo metu viena iš labiausiai aptarinėjamų hipotezių mokslinėje literatūroje yra oksidacinio

streso hipotezė. Teorija teigia, jog patogeneziškai ji gali apjungti jau minėtas hipotezes ir sukelti AL

sąlygotą pažaidą, bet tai dar nėra aišku. Oksidacinis stresas organizme yra dažnas reiškinys, tačiau svarbiausia, kaip yra metabolizuojami susidarę reaktyvūs deguonies junginiai (angl. ROS). Organizmui senstant, ROS daugėja ir jie nėra taip efektyviai metabolizuojami, todėl gali sukelti baltymų, lipidų ir netgi DNR, RNR pažaidas. Smegenys yra labai jautrios deguonies metabolizmo pokyčiams, nes joms jis nuolat reikalingas. Rasta įrodymų, jog lipidų peroksidacija intensyvesnė, sergant AL. Sergančių pacientų įvairiose smegenų struktūrose (žievėje, hipokampe, smegenų skystyje ir kt.) ir organizmo skysčiuose (šlapime, kraujo plazmoje) rasta lipidų peroksidacijos produktų. Taip pat yra duomenų apie

11

baltymų peroksidacijos produktus, kurių ryšys su AL nebuvo išaiškintas, DNR ir RNR grandinės skilimai taipogi aptikti pacientų smegenyse. Moksliniai tyrimai teigia, jog AL sergančių pacientų organizme peroksidacijos pasekoje yra sumažėjęs antioksidantų (albumino, bilirubino, vitamino A, C, E ir kt.) kiekis. Bandymai rodo, jog oksidacinis stresas įvyksta labai ankstyvose AL stadijose, kas gali turėti įtakos amiloidinių plokštelių ir Tau baltymo formavimosi procese. Ši hipotezė gali apjungti amiloidinę ir Tau hipotezę ir sąlygoti AL patogenezinę grandinę [25]. Taip pat paminėtinos: cholinerginė ir kraujagyslinė hipotezės [22]. Tačiau amiloidinė hipotezė išlieka pagrindinė, kitos išlieka antraeilės, kol nėra patikimų mokslinių įrodymų. Pastaraisiais metais, po amiloidinės hipotezės paskelbimo praėjus 25 m. taip pat po nepavykusių klinikinių bandymų paveikti šį mechanizmą, pasirodė daug šiai hipotezei prieštaraujančių straipsnių ir mokslinių darbų [23].

9.4 Ligos rizikos veiksniai (RV)

Daug metų diskutuojama apie arterinę hipertenziją, cukrinį diabetą, hipercholesterolemiją ir kitus veiksnius AL patogenezėje. J. Li, Y.J. Wang ir bendraautorių metų tyrime buvo ištirti 837 pacientai. Nustatyta, kad pacientams, turintiems minėtų rizikos veiksnių, lengvas pažinimo sutrikimas sparčiau vystosi į AL ar kitą demencijos formą. Taip pat pacientams, kurie buvo gydyti dėl šių paminėtų ligų, pažinimo sutrikimai progresavo mažiau arba neprogresavo išvis. Remiantis šio tyrimo duomenimis, galima teigti, jog kraujagysliniai veiksniai skatina AL atsiradimą ir progresavimą [26].

2015 m. Australijos, Kanados ir Brazilijos mokslininkų apžvalginiame straipsnyje padaryta išvada, jog hipodinamijos ir netaisyklingų valgymo įpročių lemiamas nutukimas, cukrinis diabetas, atsparumas insulinui yra labai glaudžiai susiję, nes insulino koncentracijos sumažėjimas organizme lemia sutrikusį gliukozės metabolizmą smegenyse, kas gali paskatinti neurodegeneracinių ligų atsiradimą. Smegenys negauna signalo išskirti daugiau insulino, todėl dėl minėtų priežasčių vystosi lėtinis uždegimas ir oksidacinis stresas. Taigi galima teigti, jog nutukimas ir netaisyklingi gyvenimo įpročių nulemtas nutukimas ir CD gali lemti demencijos ir AL vystymąsi [27].

Svarbu paminėti galvos smegenų insultą kaip svarbų RV demencijos vystymuisi vyresnio amžiaus žmonėms. 2009 m. literatūros apžvalgoje teigiama, jog patyrus insultą vieną kartą tikimybė susirgti AL ar kita demecijos forma padidėja 2 kartus. Taip pat galimybė sirgti padidėja kartu turint APOE 4 alelį ir sumažėja laiku bėgant po insulto. Todėl persirgtas insultas gali būti svarbus veiksnys skatinantis pažinimo sutrikimų vystymąsi [28].

Jau nuo 9-ojo dešimtmečio depresija įvardinama kaip AL ir demencijos rizikos veiksnys. 2010 m. atliktame tyrime buvo ištirti 949 asmenys, iš kurių 13,2 proc. sirgo depresija ar turėjo

12

depresyvių tendencijų pagal tam tikrą klausimyną. Šiame tyrime nustatyta, jog tiriamieji, sirgę depresija, turėjo 50 proc. daugiau šansų susirgti AL [29].

Intensyvus rūkymas taip pat turi įtakos demencijos ir AL išsivystymui. 2011 m. amerikiečių mokslininkų tyrime nustatyta, jog rūkant 2 pakelius cigarečių per dieną tikimybė padidėja daugiau nei 2 kartus. Tiriamieji surūkę 0,5 pakelio per dieną ir mažiau susirgti turėjo tokią pačias galimybes kaip ir nerūkantys. [30] Taip pat atlikus autopsiją AL sergantiems vidutinio amžiaus rūkoriams pastebėta mažesnė smegenų masė ir daugiau amiloidinių plokšelių [31]. Šių tyrimų duomenimis, rūkymas paskatino AL išsivystymą ir amiloidinių plokštelių atsidėjimą smegenyse.

2000 m. atspausdintame tyrime, kuriame buvo tiriami karo veteranai su galvos traumomis ir be galvos traumų, buvo nustatyta, jog šis RV padidina AL ir kitų demencijų išsivystymo tikimybę. Tyrime buvo išsiaiškinta, jog vidutinio sunkumo galvos traumos jauniems vyrams padidina AL tikimybę 2 kartus, o sunkios galvos traumos 4,5 karto. Taigi šis veiksnys gali paskatinti Al atsiradimą [32].

Žmogaus išsilavinimas ir mokymosi trukmė taip pat svarbus veiksnys AL patogenezėje. Mokslininkai mano, jog tie žmonės, kurių mokymosi trukmė ilgesnė turi tam tikrą „pažintinį rezervą“ (angl. cognitive reserve), kuris jiems padeda kompensuoti ankstyvus simptomus, kuriuos sukelia degeneraciniai pakitimai smegenyse. Pagal šią teoriją daugiau metų mokantis, susidaro daugiau ryšių tarp neuronų. Naudojant naujas jungtis galima kompensuoti AL simptomus pradinėse stadijose, kai A amiloidas ir Tau baltymas pradeda kauptis smegenyse. Taip pat dirbant protinį darbą ir dalyvaujant protą stimuliuojančiose veiklose galima formuoti „pažintinį rezervą“. Todėl protinė veikla yra labai svarbi, išvengiant ar nutolinant AL pasireiškimą [4].

Taip pat paminėtini kiti svarbūs rizikos veiksniai kurie lėtina AL pasireiškimą. In vivo ištirti veiksniai, tokie kaip fizinis aktyvumas [33], socialiniai įgūdžiai [34], kavos vartojimas [35], gyvenimas miesto vietovėse [36] parodė neigiamas tendencijas AL ligos išsivystymui ir paplitimui tokiose populiacijose.

9.5 Mikroelementų reikšmė AL patogenezėje

Ši tema nagrinėta jau kelis dešimtmečius, tačiau vieningos nuomonės, kaip mikroelementai dalyvauja AL patologiniuose procesuose vis dar nėra. Varis (Cu), cinkas (Zn) pastaraisias metais sulaukė mokslininkų susidomėjimo kaip patogenetinis AL veiksnys. Tyrimai parodė, jog šių mikroelementų koncentracijos yra padidėjusios pacientų, sergančių neurodegeneracinėmis ligomis, cerebrospinaliniame skystyje. Taip pat tyrinėjant tokių pacientų smegenis po mirties rastos šių

13

elementų, taip pat ir geležies sankaupos A amiloidų centre ir periferijoje [5]. 2017 m. publikuotame eksperimentiniame tyrime su pelėmis buvo padaryta išvada, jog Cu toksiškumas sukelia mokymosi ir atminties sutrikimus. Iš viso tyrime dalyvavo 36 pelės, kurios buvo padalintos į kontrolinę ir ekspermentinę grupes. Ekspermentinė grupė kiekvieną dieną buvo maitinama Cu sulfatu (100 mg/kg per os) Labirinto testas buvo atliekamas 1, 30, 60 ir 90-ąją dieną. Buvo išmatuoti frontalinės ir hipokampo žievės laisva Cu koncentracija, oksidacinio streso žymenys ir glutamato koncentracija. Hipokampe glutamato ir frontalinėje žievėje buvo didesnė glutamato koncentracija. Šie pokyčiai koreliavo su padidėjusia Cu koncentracija smegenyse, oksidacinio streso žymenimis ir labirinto testo prastais rezultatais [10]. Todėl spėjama, jog Cu įtraukdamas glutamatą ir oksidacinio streso faktorių sukelia atminties ir mokymosi sutrikimus.

In vitro atlikti tyrimai parodė, jog netgi nedidelės Zn koncentracijos paskatina amiloidinių

plokštelių formavimąsi. Taip pat pacientų, sergančių AL, autopsijų duomenys rodo, jog Zn, Cu ir Fe sankaupos randamos amiloidinėse plokšelėse [6]. Šie mikroelementai taip pat dalyvauja oksidacijos – redukcijos reakcijose, nes yra linkę sudaryti reaktyvius deguonies junginius, kurie gali sukelti DNR pažaidą ir mitochondrijų disfunkciją. Taip pat ROS fone linkę susidaryti Cu A junginiai [5]. Italijos mokslininkų publikuotoje metaanalizėje teigiama, jog didžioji dalis tyrimų rado sumažėjusią Zn koncentracija AL sergančių serume, buvo tačiau palyginus su nesergančiais šis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas [37].

Svarbi ir mangano (Mn) įtaka AL patogenezei, 2014 m. publikuotame japonų ir kinų bendrame tyrime buvo ištirta Mn koncentracija tiriamuosius suskirsčius į grupes pagal jų pažinimo sutrikimo sunkumą. Didžiausia Mn koncentracija buvo tarp sergančiųjų demencija, palyginus su kontroline grupe ar sergančiaisiais lengvu pažinimo sutrikimu. Tyrimas, kuriame po 8 savaičių trukusio Mn dozių kurso buvo palygintas pelių protinis gebėjimas specialiame labirinte. Jis parodė, kad pelės, kurioms buvo skirta didesnė Mn dozė, pasirodė prasčiau nei mažesnių Mn dozių grupė ar kontrolinė grupė, kuri pasirodė geriausiai. Taip pat pat Mn maitintų pelių smegenyse rasta daugiau A40, A42 kompleksų [7]. Taigi mangano ekspozicija aplinkoje gali turėti ryšį su AL ir demecijos išsivystymu ir sunkumo laipsniu.

Švinas (Pb) taip pat gali būt susijęs su AL patogeneze. Kelly M. Bakulski ir bendraautorių straipsnyje Pb aprašytas kaip vaikų neurotoksinis veiksnys, taip pat jo kaupimasis ir ekspozicija turi įtaką pažinimo sutrikimų atsiradimui vėlesniame amžiuje. Tyrime, kuriame dalyvavo karo veteranai, buvo tiriama Pb koncentracija jų kauluose ir kraujyje, taip pat atlikti pažinimo testai. Nustatyta, jog Pb koncentracija veteranų kraujyje buvo labai susijusi su pažinimo ir atminties sutrikimais. Tyrimo dalyviams buvo sudėtinga išreikšti mintis tinkamais žodžiais, apibūdinti nupieštus objektus, įvardinti skirtumus tarp jų. Tai įrodo, jog švino ekspozicija buvo lemiamas veiksnys atsirasti tokiems

14

reiškiniams [9]. Taip pat buvo atlikti bandymai su gyvūnų modeliais su įterptomis A plokštelėmis, siekiant nustatyti Pb įtaką joms. 2 mėnesių amžiaus laboratorinėms transgeninėms pelėms buvo suleista 50mg Pb acetato/kg į peritoninį tarpą ir moliarinė koncentracija Na acetato kontrolinei grupei. Po 24h pelės buvo tiriamos, atliekant autopsiją. Grupė, kuriai buvo suleista Pb acetato turėjo 10-200 kartų didesnes koncentracijas įvairiose smegenų srityse, tokiose kaip, smegenėlės, voratinklinis rezginys, žievė, hipokampas ir taip pat jų kraujyje nei kontrolinė grupė. Svarbu paminėti, kad taip pat buvo ištirta A kompleksų kiekis cerebspinaliniame skystyje ir hipokampe. Pb paveiktų pelių grupės bandiniuose A kompleksų buvo daugiau kaip dvigubai nei kontrolinės, ypač daug kompleksų buvo hipokampe [8]. Todėl galima teigti, jog Pb gali paskatinti AL ir pažinimo sutrikimų vystymąsi ir paskatinti AL būdingus pokyčius smegenyse.

Remiantis pačių naujausių mokslinių tyrimų rezultatais, AL patogenezė vis dar nėra aiški, tačiau mikroelementų metabolizmas gali būti susijęs su amiloidine, Tau ir oksidacinio streso hipotezėmis.

10. TYRIMO METODIKA

10.1 Atranka, tyrimo metodai ir tiriamoji populiacija

Nuo 2017 m. gruodžio 1 d. iki 2019 m. kovo 1 d. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje Kauno Klinikos (LSMUL KK) ir Kauno klinikinėje (KKL) ligoninėse buvo atliekamas atvejo ir kontrolės tyrimas.

Atvejo grupę sudarė 36 71-94 metų amžiaus pacientai, kuriems KKL Geriatrijos skyriuje tyrimo laikotarpiu buvo diagnozuota AL. Kontrolinę grupę sudarė 74 52-93 metų amžiaus pacientai, nesirgę AL, ir tyrimo laikotarpiu besigydę LSMU Kauno klinikų Akių ligų skyriuje.

Visi tiriamieji buvo supažindinti su tyrimu ir pasirašė Tiriamo asmens sutikimo formą. Tyrimui atlikti gautas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centro leidimas (Nr. BEC-MF-39, 2017-10-09).

Tyrimo dalyviai buvo apklausti pagal klausimyną, o skyriaus bendrosios praktikos slaugytojos paėmė kraują į specialius vakutainerius, skirtus mikroelementų vario (Cu) ir cinko (Zn) nustatymui kraujo ėminiuose.

15

10.2 Klausimynas

Apklausai vykdyti naudotas klausimynas, į kurį buvo įtraukti klausimai apie socialinius - demografinius veiksnius (gyvenamąją vietą, išsilavinimą, mokymosi trukmę), persirgtas ligas (depresija, galvos traumos, smegenų auglys, skrandžio, plaučių, inkstų, širdies ir kraujagyslių bei endokrininės ligos), vartojamus vaistus, sunkių atminties sutrikimų ir prastos orientacijos aplinkoje šeiminę anamnezę, rūkymą, alkoholio vartojimą, fizinį aktyvumą, darbo aplinką ir dietą.

10.3 Kraujo tyrimas

Tiriamųjų kraujas (apie 5 ml) buvo paimtas patyrusių bendrosios praktikos slaugytojų laikantis sterilumo ir įprastų venos punkcijos metodo taisyklių. Iš viso paimti 103 kraujo ėminiai (93,6 proc. visų tiriamųjų), iš kurių nucentrifugavus paruošta kraujo plazma iki mikroelementų nustatymo laikyta šaldiklyje – 80 °C temperatūroje. Prieš nustatymą atšildyti plazmos mėginiai buvo skiesti tiesioginio skiedimo metodu - 0,1 ml plazmos buvo praskiesta 1 proc. azoto rūgštimi santykiu 1:25. Cu ir Zn koncentracija kraujo plazmoje nustatyta, naudojant induktyviai susietos plazmos masių spektrometro analizatorių NexION 300D ICP-MS (PerkinElmer, JAV).

10.4 Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta, taikant programą STATA 15 [StataCorp LP, 2016]. Pirmiausia naudojant Shapiro – Vilko testą įvertinta, ar kiekybiniai dydžiai pasiskirstę pagal normalųjį skirstinį. Kadangi Cu koncentracijos AL sergančiųjų kraujo plazmoje bei kontrolinės grupės tiriamųjų amžius, netenkino normalumo sąlygos aprašant rezultatus pateikiamos kiekybinių dydžių reikšmių medianos bei pirmo (25 proc.) ir trečio kvartilio (75 proc.) reikšmės. Nominaliniai dydžiai aprašyti pateikiant reikšmių dažnį ir santykinį dažnį. Kiekybiniai dydžiai, nepasiskirstę pagal Gausą lyginti naudojant Mano Vitney testą. Kokybinių dydžių dažniai dvejose imtyse lyginti naudojant Chi kvadrato testą.

Sąsajų tarp Cu ir Zn koncentracijų kraujo plazmoje bei amžiaus nustatymui naudota Spirmeno koreliacija, o prognozuojant vario koncentraciją kraujyje pagal cinko koncentraciją taikyta tiesinė regresija, kur nepriklausomieji kintamieji buvo (amžius, lytis, cinko koncentracija). Koreliacijos koeficiento stiprumas vertintas sekančiai: 1 - 0,9 – labai stipri, 0,7 – 0,9 - stipri, 0,7 - 0,5 – vidutinė, 0,5 - 0,3 – silpna, 0,3 – 0 – nereikšminga koreliacija [38].

16

Daugiafaktorinė logistinė regresija taikyta siekiant įvertinti galimybę susirgti AL (priklausomasis veiksnys) priklausomybę nuo Cu ar Zn koncentracijų (nepriklausomas veiksnys), apskaičiuojant šansų santykį (ŠS) ir jo 95 proc. pasikliautinąjį intervalą (PI), Cu ir Zn koncentracija susikirstyta į dvi grupes (Cu: ≤105,45 g/dl ir >105,45 g/dl, Zn: ≤74,48 g/dl mediana ir >74,48 g/dl) pagal mikroelementų koncentraciją kontrolinės grupės tiriamųjų kraujo plazmoje nustatytas medianas. Ryšiui įvertinti buvo sudaryti 3 modeliai, kuriuose atsižvelgta į šiuos nepriklausomus veiksnius: I modelis - amžių ir lytį (moteris, vyras); II modelis - I modelis + mokymosi trukmę (1-4, 5-8, 9–12, ≥13 metų) ir šeiminę sunkių atminties sutrikimų ar prastos orientacijos aplinkoje anamnezę (ne, taip, nežinau) ir III modelis - II modelis + mikroelemento koncentracija plazmoje (g/dl). Statistinėje analizėje taikytų kriterijų reikšmingumo lygmuo (p) buvo 0,05.

11. REZULTATAI

11.1. Bendroji tiriamųjų charakteristika

1 lentelė. Bendra tiriamųjų charakteristika

Rodiklis Atvejo grupė Kontrolinė

grupė p Amžius (mediana, Q1-Q3): 86,0 (82 - 88) 70,5 (62 - 79) <0.001 Lytis, n (%): Vyrai Moterys 8 (22,22) 28 (77,78) 29 (39,19) 45 (60,81) 0,08 Gyvenamoji vieta, n (%): Miestas Miestelis Kaimas 24 (70,59) 2 (5,88) 8 (23,53) 37 (50,00) 6 (8,11) 31 (41,89) 0,13 Mokymosi trukmė (m.), n (%): 1-4 5-8m. 9-13m. > 13 10 (30,3) 2 (6,06) 4 (12,12) 17 (51,52) 4 (5,41) 13 (17,57) 28 (37,84) 29 (39,19) <0,001

Šeiminė sunkių atminties sutrikimų ar prastos orientacijos aplinkoje

anamnezė, n (%): Ne Taip Nežinau 24 (70,59) 3 (8,82) 7 (20,59) 63 (85,14) 8 (10,81) 3 (4,05) 0,02 Rūkymas, n (%): Taip, kasdien Retkarčiais - - 9 (12,33) 2 (2,74) 0,09

17 Mečiau

Ne, niekada nerūkiau 29 (85,29) 5 (14,71)

14 (19,18) 48 (65,75) Alkoholis, n (%): Vartoju Nustojau vartoti Niekada nevartojau 15 (44,12) 8 (23,53) 11(32,35) 55 (75,34) 12 (16,44) 6 (8,22) 0,02 Reguliarus sportavimas, n (%): Taip Ne 5 (15,15) 28 (84,85) 27 (36,99) 46 (63,01) 0,02

Tiriamųjų, įtrauktų į tyrimą, bendra charakteristika pateikta 1 lentelėje. Atvejo grupės tiriamieji buvo vyresni nei kontrolinės grupės tiriamieji: 86 m. ir 70,5 m. (p<0,001), tačiau moterų ir vyrų skaičius abiejose grupėse reikšmingai nesiskyrė (p=0,08). Atvejo ir kontrolės tiriamieji skyrėsi pagal mokymosi metų trukmę (p<0,001), šeiminę sunkių atminties sutrikimų ar prastos orientacijos aplinkoje anamnezę (p=0,02). Kontrolinės grupės tiriamieji dažniau vartojo alkoholį ir reguliariai sportavo (p=0,02). Tuo tarpu pagal gyvenamąją vietą ir rūkymo paplitimą abiejų grupių tiriamieji reikšmingai nesiskyrė.

11.2. Vario ir cinko koncentracijų įvertinimas tiriamųjų kraujo plazmoje

Atvejo ir kontrolinės grupių tiriamųjų Cu ir Zn koncentracijos plazmoje parodytos 2 lentelėje. Alzheimerio liga sergančiųjų ir kontrolinės grupės tiriamųjų kraujo plazmoje rasta Cu koncentracija buvo normos ribose (70-140 g/dl) [39] (atitinkamai, 93,27 µg/dl ir 105,45 µg/dl) r reikšmingai nesiskyrė (p=0,08).

Zn koncentracijos abejose grupėse taip pat buvo normos ribose (70-120 µg/dl) [40]. Tačiau Zn koncentracija AL liga sergančiųjų kraujo plazmoje buvo reikšmingai mažesnė nei kontrolinės grupės tiriamųjų: 63,60 µg/dl ir 74,48 µg/dl (p<0,001).

2 lentelė. Vario (Cu) ir cinko (Zn) koncentracijos (g/dl) atvejo ir kontrolinės grupės tiriamųjų kraujo plazmoje

Atvejo grupė (n=36) Kontrolinė grupė (n=65) p Cu plazmoje (g/dl), (mediana, Q1-Q3) 93,27 (87,24 - 108,91) 105,45 (92,05 - 121,39) 0,08 Zn plazmoje (g/dl), (mediana, Q1- Q3) 63,60 (55,68 - 71,57) 74,48 (67,32 - 84,84) <0,001

18

11.3. Vario ir cinko sąsajų kraujo plazmoje įvertinimas

3 lentelėje pateikti koreliacijos koeficientai tarp Cu bei Zn koncentracijų kraujo plazmoje ir tiriamųjų amžiaus. Bendroje tiriamųjų grupėje stebėtas silpnas tiesioginis ryšys tarp Zn ir Cu koncentracijų (r=0,25, p=0,01) ir silpna priešinga koreliacija tarp Zn koncentracijos plazmoje ir tiriamųjų amžiaus (r=-0,28, p=0,01) bei atvejo grupėje nustatyta tiesioginė vidutinio stiprumo koreliacija tarp Cu koncentracijos plazmoje bei paciento amžiaus (r=0,5, p=0,002). Kontrolinėje grupėje rasta vidutinio stiprumo tiesioginė koreliacija tarp Cu ir Zn koncentracijų plazmoje (r=0,39, p=0,02).

3 lentelė. Spirmeno koreliacijos koeficientai (r) tarp tiriamųjų vario (Cu) koncentracijos

(g/dl), cinko (Zn) koncentracijos (g/dl) kraujo plazmoje ir amžiaus (m.)

Amžius Cu plazmoje r p r p Visi tiriamieji (n = 101) Cu plazmoje 0,05 0,65 Zn plazmoje -0,28 0,01 0,25 0,01 Atvejo grupė (n=36) Cu plazmoje 0,5 0,002 Zn plazmoje -0,18 0,3 -0,18 0,37 Kontrolinė grupė (n=65) Cu plazmoje 0,11 0,37 Zn plazmoje -0,06 0,64 0,39 0,02

r – Spirmeno koreliacijos koeficientas

4 lentelė. Tiesinės regresijos koeficientai (β) tarp vario (Cu) koncentracijos plazmoje (g/dl), kaip priklausomojo kintamojo ir cinko (Zn) koncentracijos (g/dl), kaip nepriklausomo kintamojo,

įvertinus lytį ir amžių

Zn plazmoje (g/dl) β p

Visi tiriamieji (n=101) 0,42 0,01

Kontrolė (n=65): 0,69 <0,001

Atvejai (n=36) -0,09 0,74

β - regresijos koeficientas, įvertinus amžių.

Kadangi kontrolinėje grupėje tarp Cu ir Zn koncentracijų plazmoje nustatytas reikšmingas tiesioginis ryšys, o sergantiems AL, priešingai, ryšys buvo neigiamas nors ir nereikšmingas, išsamesniam ryšio įvertinimui taikėme tiesinę regresiją. 4 lentelėje pateikti regresijos tarp Cu ir Zn, įvertinus lytį ir amžių, koeficientai ir jų p reikšmės. Įvertinus amžių ir lytį, nustatytas teigiamas ryšys

19

tarp Cu ir Zn koncentracijų kontrolinėje grupėje, t.y. Zn koncentracijai plazmoje padidėjus 1 g/dl, Cu koncentracija plazmoje padidėjo 0,69 g/dl. Atvejo grupėje ryšys tarp Cu ir Zn koncentracijų plazmoje buvo neigiamas, tačiau nereikšmingas (p=0,74).

11.4. Alzheimerio ligos priklausomybė nuo vario ir cinko

AL priklausomybė nuo Cu koncentracijos plazmoje parodyta 5 lentelėje. Įvertinus lytį ir amžių, tiriamieji, su Cu koncentracija >105,45 g/dl turėjo 5,6 karto mažesnę tikimybę susirgti AL negu tiriamieji su Cu koncentracija ≤105,45 g/dl (ŠS1=0,18, p=0,01). Papildomai įvertinus sunkių atminties sutrikimų ar prastos orientacijos aplinkoje šeiminę anamnezę ir mokymosi trukmę, tikimybė susirgti AL nežymiai pakito (ŠS2=0,16, p = 0,01), o, įvertinus dar ir Zn koncentraciją, išliko tokia pati, kaip ir I modelyje (ŠS3=0,18, p=0.02). Visuose modeliuose nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys tarp tikimybės susirgti AL ir Cu koncentracijos, t.y. didesnę Cu koncentraciją plazmoje turintys žmonės turėjo reikšmingai mažesnę tikimybę susirgti AL.

Stratifikavus atvejus pagal MMSE testo balus, reikšmingas ryšys tarp Cu koncentracijos plazmoje ir galimybė susirgti AL, išliko atvejų su ≤15 balais pagal MMSE testą grupėje. Įvertinus amžių ir lytį, nustatyta šiek tiek mažesnė ir nereikšminga tikimybė susirgti AL, esant Cu koncentracijai >105,45 g/dl (ŠS1=0,24, p=0,09). Tačiau į modelį papildomai įtraukus sunkių atminties sutrikimų ar prastos orientacijos aplinkoje šeiminę anamnezę, mokymosi trukmę ir Zn koncentraciją, tiriamieji su Cu koncentracija plazmoje >105,45 g/dl turėjo 8,3 karto didesnę tikimybę susirgti AL (ŠS3=0,13, p3=0.045). Analizuojant duomenis atvejų grupėje su MMSE > 15 balų, tikimybė susirgti AL reikšmingai sumažėjo (I modelis), tačiau įtraukus potencialius rizikos veiksnius (II ir II modeliai) reikšmingo ryšio nenustatėme (p>0,05).

Alzheimerio ligos priklausomybė nuo Zn koncentracijos plazmoje parodyta 6 lentelėje. Įvertinus amžių ir lytį (I modelis), papildomai įvertinus šeiminę sunkių atminties sutrikimų bei prastos orientacijos anamnezę ir mokymosi trukmę (II modelis) bei Cu koncentaciją plazmoje (III modelis), reikšmingo ryšio tarp Zn koncentracijos plazmoje ir galimybės susirgti AL nenustatėme (p>0,05). Reikšmingų sąsajų tarp Zn koncentracijos plazmoje ir tikimybės susirgti AL neradome ir skirtingose atvejų grupėse pagal pagal MMSE testo balus.

20

5 lentelė. Alzheimerio ligos priklausomybė nuo vario (Cu) koncentracijos plazmoje (g/dl) (šansų santykiai (ŠS) ir jų 95 proc. pasikliautinieji intervalai (PI))

Cu plazmoje (g/dl) Atvejo grupė (n=36) Kontrolinė grupė (n=65)

ŠS1 (95% PI) ŠS2 (95% PI) ŠS3 (95% PI)

≤105,45 24 (66,7) 33 (50,8) 1 1 1 >105,45 12 (33,3) 32 (49,2) 0,18 (0,05 - 0,66) 0,16 (0,04 - 0,7) 0,18 (0,04 - 0,79) p kitimui 0,01 0,01 0,02

Stratifikuota pagal MMSE≤15

≤105,45 10 (55,6) 33 (50,77) 1 1 1 >105,45 8 (44,4) 32 (49,23) 0,24 (0,05 - 1,25) 0,12 (0,02 - 0,84) 0,13 (0,02 - 0,96) pkitimui 0,09 0,03 0,045

Stratifikuota pagal MMSE>15

≤105,45 14 (77,78) 33 (50,77) 1 1 1 >105,45 4 (22,22) 32 (49,23) 0,17 (0,04 - 0,76) 0,29 (0,06 - 1,4) 0,34 (0,07 - 1,7) pkitimui 0,02 0,12 0,20

ŠS1 - šansų santykis, įvertinus amžių ir lytį.

MMSE (angl. Mini-Mental State Examination) - trumpas protinės būklės tyrimas.

ŠS2 - šansų santykis, įvertinus amžių, lytį, mokymosi trukmę ir sunkių atminties sutrikimų ir prastos orientacijos aplinkoje šeiminę anamnezę.

ŠS3 – šansų santykis, įvertinus amžių ir lytį, mokymosi trukmę ir sunkių atminties sutrikimų, prastos orientacijos aplinkoje šeiminę anamnezę ir cinko koncentraciją plazmoje (gdl).

6 lentelė. Alzheimerio ligos priklausomybė nuo cinko (Zn) koncentracijos plazmoje (g/dl) (šansų santykiai (ŠS) ir jų 95 proc. pasikliautinieji intervalai (PI))

Zn plazmoje (g/dl) Atvejo grupė (n=36) Kontrolė (n=65)

ŠS1 (95% PI) ŠS2 (95% PI) ŠS3 (95% PI)

≤74,48 28 (77,78) 32 (49,23) 1 1 1 >74,48 8 (22,22) 33 (50,77) 0,41 (0,13 - 1,29) 0,38 (0,11 - 1,28) 0,43 (0,12 - 1,54) pkitimui 0,13 0,12 0,20

Stratifikuota pagal MMSE<15

≤74,48 14 (77,78) 32 (49,23) 1 1 1 >74,48 4 (22,22) 33 (50,77) 0,73 (0,15 - 3,60) 0,46 (0,08 - 2,80) 0,51 (0,07 - 3,50) pkitimui 0,70 0,40 0,50

Stratifikuota pagal MMSE>15

≤74,48 14 (77,78) 32 (49,23) 1 1 1 >74,48 4 (22,22) 33 (50,77) 0,33 (0,08 - 1,28) 0,34 (0,08 - 1,50) 0,42 (0,09 - 1,90) pkitimui 0,11 0,16 0,27

21

ŠS2 - šansų santykis, įvertinus amžių, lytį, mokymosi trukmę ir sunkių atminties sutrikimų ir prastos orientacijos aplinkoje šeiminę anamnezę.

ŠS3 – šansų santykis, įvertinus amžių ir lytį, mokymosi trukmę ir sunkių atminties sutrikimų, prastos orientacijos aplinkoje šeiminę anamnezę ir vario koncentraciją plazmoje (g/dl).

12. REZULTATŲ APTARIMAS

Cu ir Zn – svarbūs mikroelementai žmogaus medžiagų apykaitoje. Cu dalyvauja palaikant normalias organizmo fermentų funkcijas, padeda palaikyti organizmo audinių struktūrą, prisideda prie hemoglobino, mielino, melanino gamybos. Jis dalyvauja oksidacinio streso reakcijose kaip antioksidantas, esant didesnėms jo koncentracijoms jis gali skatinti laisvųjų radikalų susidarymą. Zn svarbus imuniniams procesams, daugumos fermentų veiklai, baltymų struktūrai, dalyvauja DNR ir ląstelių dalijimosi procesuose, taip pat impulso perdavimui nervinėse ląstelėse.

Cu yra trečias mikroelementas pagal kiekį organizme po geležies ir Zn, nors organizme jo yra tik 75-100 mg. Cu yra kiekviename žmogaus organe: didžiausios jo atsargos yra kepenyse, mažesni jo kiekiai randami smegenų audinyje, širdyje, inkstuose ir raumenyse [41]. Cu kiekvieną dieną gauname apie 2 mg iš gyvulinės kilmės produktų (mėsa, pieno produktai), mažiau iš grūdinių kultūrų ir daržovių [42]. Zn mūsų organizme yra daugiau, maždaug apie 2-4 gramus. Daugiausiai jo yra smegenyse, raumenyse, kauluose ir kepenyse ir kitur [41]. Zn rekomenduojama norma moterims ir vyrams yra 8-11mg, jo gauname daugiausiai gyvūninės kilmės produktų (raudona mėsa, paukštiena, jūros gėrybės ir kt.), šiek tiek mažiau vandens ir daržovių [43].

Mūsų tyrimo rezultatai parodė, kad Cu koncentracijos atvejo ir kontrolės grupių tiriamųjų kraujo plazmoje buvo 93,27 ir 105,45 g/dl ir reikšmingai nesiskyrė (p=0,08). Panašūs rezultatai gauti italų mokslininkų atliktame tyrime, kuriame dalyvavo 84 AL sergantys pacientai ir 58 sveiki savanoriai. Nustatytos vario koncentracijos sergančiųjų ir nesergančiųjų AL kraujo plazmoje: atvejo grupėje - 98.24 ± 20.93 g/dl, o kontrolės - 88.97 ± 14.62 g/dl, (p=0,51) [44]. Kinijos ir Serbijos mokslininkų atliktoje metaanalizėje apibendrinti atradimai šioje srityje per paskutinius 30 metų. 26 išanalizuotuose tyrimuose nustatyta padidėjusi Cu koncentracija tarp AL sergančių pacientų, 6 studijos nurodė Cu koncentracijos sumažėjimą [45].

Mūsų tyrimas parodė, kad asmenys, su didesne vario koncentracija plazmoje turi mažesnę tikimybę susirgti AL. Rezultatai prieštaringi, nes Cu koncentracijos padidėjimas dažniau užfiksuotas AL sergančiųjų kraujyje. Panašių radinių kaip mūsų tyrime nebuvo rasta, bet anksčiau minėti tyrimai rodo, kad rezultatai yra nevienareikšmiai ir šioje srityje svarbūs tolimesni tyrimai.

22

Taip pat nustatėme, kad cinko koncentracija AL sergančiųjų kraujo plazmoje mūsų tyrime buvo reikšmingai mažesnė nei kontrolinės grupės tiriamųjų: 63,60 g/dl ir 74,48 g/dl. (p<0,001). Tame pačiame italų mokslininkų tyrime buvo nustatytos ir cinko koncentracijos AL sergantiems pacientams - 60.94 ± 16.43 g/dl, bei kontroliniams tiriamiesiems - 69.79 ± 18.5 g/dl. Rezultatai taip pat reikšmingai skyrėsi (p=0,02) [44]. Turkijos mokslininkų tyrime buvo palyginta cinko koncentracija žmogaus plaukuose ir serume. Ir plaukuose, ir serume cinko kiekis buvo reikšmingai mažesnis AL sergančių pacientų grupėje (47 ± 10 g/dl) nei kontrolinėje sveikų pacientų grupėje (52 ± 30 g/dl, p=0,04) [46]. Cinko koncentracija 18-os iš 22 tyrimų duomenimis buvo sumažėjusi AL sergančių pacientų gretose, tačiau rezultatai nebuvo statistiškai reikšmingi [45]. Mūsų tyrimo duomenimis, Zn koncentracija sergančių AL tarpe buvo patikimai mažesnė.

Taip pat mūsų tyrime buvo nustatyta, jog cinko koncentracija neturi įtakos susirgti AL. 2017 metais publikuotame straipsnyje apie cinko reikšmę neurodegeneracinėms ligoms aprašyti gausūs įrodymai, jog cinkas išsidėsto šalia amiloidinių plokšelių ir netgi skatina jų susidarymą [47]. Rezultatų duomenys yra prieštaringi, todėl reikalingi išsamūs tyrinėjimai šioje srityje.

Mūsų tyrimo rezultatai parodė sąsajas tarp Zn ir Cu koncentracijų plazmoje tarp kontrolinės grupės tiriamųjų, bet ne atvejo grupėje. Moksliniai tyrimai rodo, jog yra užfiksuotas vario ir cinko antagonizmas biologiniu požiūriu. Pavyzdžiui, Zn papildų vartojimas sukelia Cu koncentracijos plazmoje sumažėjimą [48]. Todėl rezultatai mokslinėje literatūroje prieštaringi. Mikroelementų ryšys su Alzheimerio liga dar nėra pilnai ištyrinėtas, todėl šioje srityje būtini nuodugnūs tyrimai.

Vienas iš atlikto tyrimo privalumų yra tai, kad siekdami įvertinti AL priklausomybę nuo mikroelementų Cu ir Zn, atlikome atvejo ir kontrolės tyrimą ligoninėse, kuris leidžia įvertinti priežastinius ryšius, susijusius su liga. Taip pat objektyviai įvertintos Cu ir Zn koncentracijos tiriamųjų plazmoje induktyviai susietos plazmos masių spektrometru.

Vienas iš šio tyrimo trūkumų yra santykinai nedidelė tiriamųjų imtis. Duomenys rinkti apie 12 mėn., tyrime sutiko dalyvauti visi KKL Geriatrijos skyriaus ligoniai, kuriems tyrimo laikotarpiu diagnozuota AL (n = 36). Tačiau šio skaičiaus neužteko pateikti reikšmingesnius rezultatus. Tai iš dalies apribojo ir nepriklausomų veiksnių, įtrauktų į logistinę regresiją, skaičių.

Kitas šio tyrimo trūkumas yra atminties klaidos būdingos atvejo ir kontrolės tyrimui ir ypač AL sergantiems ligoniams. Tai taip pat ribojo surinktos informacijos panaudojimą logistinėje regresijoje, kurią taikant įtraukti tik patys svarbiausi veiksniai.

Nepaisant minėtų trūkumų, manome, kad tyrimo rezultatai nėra atsitiktiniai ar dėl metodinių klaidų. Tačiau reikšmingesnėms išvadoms pateikti ir rezultatams paaiškinti, būtini tolimesni tyrimai, siekiant išsiaiškinti AL etiopategenezę.

23

13. IŠVADOS

1) Vario koncentracija Alzheimerio liga sergančiųjų ir kontrolinės grupių tiriamųjų kraujo plazmoje reikšmingai nesiskiria: 93,27 g/dl ir 105,45 d/dl, o cinko koncentracija Alzheimerio liga sergančiųjų kraujo plazmoje yra reikšmingai mažesnė negu kontrolinės grupės tiriamųjų: 63,60 g/dl ir 74,48 g/dl.

2) Įvertinus amžių ir lytį, nustatytas reikšmingas ryšys tarp vario ir cinko koncentracijų kontrolinės grupės tiriamiesiems: cinko koncentracijai plazmoje padidėjus 1 g/dl, vario koncentracija plazmoje galimai padidėja 0,69 g/dl. Sergantiems Alzheimerio liga ryšys tarp vario ir cinko koncentracijų plazmoje nenustatytas. Teigiamas ryšys tarp vario koncentracijos bei amžiaus rastas tarp Alzheimerio liga sergančiųjų.

3) Įvertinus rizikos veiksnius vario koncentracija didesnė nei 105,45 g/dl, lyginant su mažesne, galimai 5,6 kartus mažina riziką sirgti Alzheimerio liga.

4) Reikšmingo ryšio tarp cinko koncentracijos plazmoje ir tikimybės susirgti Alzheimerio liga neradome.

14. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Alzheimer's Association. 2018 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & dementia : the journal of the Alzheimer's Association 2018;14(3):367-429.

2. Higienos institutas. Statistinių duomenų apie mirties priežastis paieškos priemonė pagal pasirinktus parametrus: Alzheimerio liga ir kitos. 2017; Available at: http://www.hi.lt/lt/paieskos_priemone.html. Accessed Apr, 2019.

3. Bateman RJ, Xiong C, Benzinger TL, Fagan AM, Goate A, Fox NC, et al. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease. N Engl J Med 2012 Aug 30;367(9):795-804. 4. Alzheimer's Association. 2019 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & dementia : the journal of the Alzheimer's Association 2019;15(3):321-387.

5. Rana M, Sharma AK. Cu and Zn interactions with Abeta peptides: consequence of coordination on aggregation and formation of neurotoxic soluble Abeta oligomers. Metallomics 2019 Jan 23;11(1):64-84.

6. Maynard CJ, Bush AI, Masters CL, Cappai R, Li QX. Metals and amyloid-beta in Alzheimer's disease. Int J Exp Pathol 2005 Jun;86(3):147-159.

24

7. Tong Y, Yang H, Tian X, Wang H, Zhou T, Zhang S, et al. High manganese, a risk for Alzheimer's disease: high manganese induces amyloid-beta related cognitive impairment. J Alzheimers Dis 2014;42(3):865-878.

8. Gu H, Wei X, Monnot AD, Fontanilla CV, Behl M, Farlow MR, et al. Lead exposure increases levels of beta-amyloid in the brain and CSF and inhibits LRP1 expression in APP transgenic mice. Neurosci Lett 2011 Feb 18;490(1):16-20.

9. Bakulski KM, Rozek LS, Dolinoy DC, Paulson HL, Hu H. Alzheimer's disease and environmental exposure to lead: the epidemiologic evidence and potential role of epigenetics. Curr Alzheimer Res 2012 Jun;9(5):563-573.

10. Kalita J, Kumar V, Misra UK, Bora HK. Memory and Learning Dysfunction Following Copper Toxicity: Biochemical and Immunohistochemical Basis. Mol Neurobiol 2018 May;55(5):3800-3811. 11. Hippius H, Neundorfer G. The discovery of Alzheimer's disease. Dialogues Clin Neurosci 2003 Mar;5(1):101-108.

12. Rick Sherva, Neil W Kowall. Genetics of Alzheimer disease. 2018; Available at: https://www.uptodate.com/contents/genetics-of-alzheimer-disease#topicContent. Accessed Apr, 2019. 13. Barker WW, Luis CA, Kashuba A, Luis M, Harwood DG, Loewenstein D, et al. Relative frequencies of Alzheimer disease, Lewy body, vascular and frontotemporal dementia, and hippocampal sclerosis in the State of Florida Brain Bank. Alzheimer Dis Assoc Disord 2002 Oct-Dec;16(4):203-212.

14. Prince M, Bryce R, Albanese E, Wimo A, Ribeiro W, Ferri CP. The global prevalence of dementia: a systematic review and metaanalysis. Alzheimers Dement 2013 Jan;9(1):63-75.e2.

15. Levy-Lahad E, Wijsman EM, Nemens E, Anderson L, Goddard KA, Weber JL, et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science 1995 Aug 18;269(5226):970-973.

16. St George-Hyslop P, Haines J, Rogaev E, Mortilla M, Vaula G, Pericak-Vance M, et al. Genetic evidence for a novel familial Alzheimer's disease locus on chromosome 14. Nat Genet 1992 Dec;2(4):330-334.

17. Tanzi RE, Gusella JF, Watkins PC, Bruns GA, St George-Hyslop P, Van Keuren ML, et al. Amyloid beta protein gene: cDNA, mRNA distribution, and genetic linkage near the Alzheimer locus. Science 1987 Feb 20;235(4791):880-884.

18. C. Dirk Keene, Thomas J Montine, Lewis H Kuller. Epidemiology, pathology, and pathogenesis of Alzheimer disease. 2018; Available at: https://www.uptodate.com/contents/epidemiology-pathology-and-pathogenesis-of-alzheimer-disease. Accessed Apr, 2019.

19. Selkoe DJ, Hardy J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med 2016 Jun 1;8(6):595-608.

20.Murphy MP, LeVine H,3rd. Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide. J Alzheimers Dis 2010;19(1):311-323.

21. Kumar A, Singh A, Ekavali. A review on Alzheimer's disease pathophysiology and its management: an update. Pharmacol Rep 2015 Apr;67(2):195-203.

22. Hardy J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem 2009 Aug;110(4):1129-1134.

23. Kametani F, Hasegawa M. Reconsideration of Amyloid Hypothesis and Tau Hypothesis in Alzheimer's Disease. Front Neurosci 2018 Jan 30;12:25.

24. Mohandas E, Rajmohan V, Raghunath B. Neurobiology of Alzheimer's disease. Indian J Psychiatry 2009 Jan;51(1):55-61.

25

25. Wang X, Wang W, Li L, Perry G, Lee HG, Zhu X. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease. Biochim Biophys Acta 2014 Aug;1842(8):1240-1247.

26. Li J, Wang YJ, Zhang M, Xu ZQ, Gao CY, Fang CQ, et al. Vascular risk factors promote conversion from mild cognitive impairment to Alzheimer disease. Neurology 2011 Apr 26;76(17):1485-1491.

27. Verdile G, Keane KN, Cruzat VF, Medic S, Sabale M, Rowles J, et al. Inflammation and Oxidative Stress: The Molecular Connectivity between Insulin Resistance, Obesity, and Alzheimer's Disease. Mediators Inflamm 2015;2015:105828.

28. Savva GM, Stephan BC, Alzheimer's Society Vascular Dementia Systematic Review Group. Epidemiological studies of the effect of stroke on incident dementia: a systematic review. Stroke 2010 Jan;41(1):e41-6.

29. Saczynski JS, Beiser A, Seshadri S, Auerbach S, Wolf PA, Au R. Depressive symptoms and risk of dementia: the Framingham Heart Study. Neurology 2010 Jul 6;75(1):35-41.

30. Rusanen M, Kivipelto M, Quesenberry CP, Jr, Zhou J, Whitmer RA. Heavy smoking in midlife and long-term risk of Alzheimer disease and vascular dementia. Arch Intern Med 2011 Feb 28;171(4):333-339.

31. Tyas SL, White LR, Petrovitch H, Webster Ross G, Foley DJ, Heimovitz HK, et al. Mid-life smoking and late-life dementia: the Honolulu-Asia Aging Study. Neurobiol Aging 2003 Jul-Aug;24(4):589-596.

32. Alzheimer's Association. 2016 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement 2016 Apr;12(4):459-509.

33. Muller S, Preische O, Sohrabi HR, Graber S, Jucker M, Ringman JM, et al. Relationship between physical activity, cognition, and Alzheimer pathology in autosomal dominant Alzheimer's disease. Alzheimers Dement 2018 Nov;14(11):1427-1437.

34. Wilson RS, Krueger KR, Arnold SE, Schneider JA, Kelly JF, Barnes LL, et al. Loneliness and risk of Alzheimer disease. Arch Gen Psychiatry 2007 Feb;64(2):234-240.

35. Arendash GW, Cao C. Caffeine and coffee as therapeutics against Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis 2010;20 Suppl 1:S117-26.

36. Jia J, Wang F, Wei C, Zhou A, Jia X, Li F, et al. The prevalence of dementia in urban and rural areas of China. Alzheimers Dement 2014 Jan;10(1):1-9.

37. Ventriglia M, Brewer GJ, Simonelli I, Mariani S, Siotto M, Bucossi S, et al. Zinc in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis of Serum, Plasma, and Cerebrospinal Fluid Studies. J Alzheimers Dis 2015;46(1):75-87.

38. Mukaka MM. Statistics corner: A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Med J 2012 Sep;24(3):69-71.

39. University of Rochester Medical Center, Health Encyclopedia. Total Copper (Blood). 2018;

Available at:

https://www.urmc.rochester.edu/encyclopedia/content.aspx?contenttypeid=167&contentid=total_copp er_blood. Accessed Apr, 2019.

40. Mohammad Ali Mashhadi, Aliraza Bakhshipour, Zahra Zakeri, Alireza Ansari-Moghadam. Reference Range for Zinc Level in Young Healthy Population in Southeast of Iran. Health Scope 2016.

26

42. Bost M, Houdart S, Oberli M, Kalonji E, Huneau JF, Margaritis I. Dietary copper and human health: Current evidence and unresolved issues. J Trace Elem Med Biol 2016 May;35:107-115.

43. Wei Koe Wei, Chee Kong Yap, Rosimah Nulit, Hishamuddin Omar, Ahmad Zaharin Aris, Wan Hee Cheng, Mohd Talib Latif, Chee Seng Leow. Zn in vegetables: A review and some insights. Integr Food Nutr Metab 2019.

44. Siotto M, Simonelli I, Pasqualetti P, Mariani S, Caprara D, Bucossi S, et al. Association Between Serum Ceruloplasmin Specific Activity and Risk of Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis 2016;50(4):1181-1189.

45. Li DD, Zhang W, Wang ZY, Zhao P. Serum Copper, Zinc, and Iron Levels in Patients with Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis of Case-Control Studies. Front Aging Neurosci 2017 Sep 15;9:300.

46. Koc ER, Ilhan A, Zubeyde A, Acar B, Gurler M, Altuntas A, et al. A comparison of hair and serum trace elements in patients with Alzheimer disease and healthy participants. Turk J Med Sci 2015;45(5):1034-1039.

47. Portbury SD, Adlard PA. Zinc Signal in Brain Diseases. Int J Mol Sci 2017 Nov 23;18(12):10.3390/ijms18122506.

48. Guo CH, Wang CL. Effects of zinc supplementation on plasma copper/zinc ratios, oxidative stress, and immunological status in hemodialysis patients. Int J Med Sci 2013;10(1):79-89.

15. PRIEDAI

15.1. Lentelių sąrašas

1 lentelė. Bendra tiriamųjų charakteristika

2 lentelė. Vario (Cu) ir cinko (Zn) koncentracijos (g/dl) atvejo ir kontrolinės grupės tiriamųjų kraujo plazmoje

3 lentelė. Spirmeno koreliacijos koeficientai (r) tarp tiriamųjų vario (Cu) koncentracijos (g/dl), cinko (Zn) koncentracijos (g/dl) kraujo plazmoje ir amžiaus (m.)

4 lentelė. Tiesinės regresijos koeficientai (β) tarp vario (Cu) koncentracijos plazmoje (g/dl), kaip priklausomojo kintamojo ir cinko (Zn) koncentracijos (g/dl), kaip nepriklausomo kintamojo, įvertinus lytį ir amžių

5 lentelė. Alzheimerio ligos priklausomybė nuo vario (Cu) koncentracijos plazmoje (g/dl) (šansų santykiai (ŠS) ir jų 95 proc. pasikliautinieji intervalai (PI))

6 lentelė. Alzheimerio ligos priklausomybė nuo cinko (Zn) koncentracijos plazmoje (g/dl) (šansų santykiai (ŠS) ir jų 95 proc. pasikliautinieji intervalai (PI))