LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

(1)

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

SIGITA DAUKANTAITĖ

SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH)

ŽOLĖS FLAVONOIDŲ FRAKCINĖ ANALIZĖ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. Dr. Valdas Jakštas

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Data:

SĖJAMŲJŲ GRIKIŲ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH)

ŽOLĖS FLAVONOIDŲ FRAKCINĖ ANALIZĖ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof.dr. Valdas Jakštas

Data

Recenzentas Darbą atliko:

Magistrantė Sigita Daukantaitė

Data Data

(3)

TURINYS

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ...6

SANTRAUKA ...7

SUMMARY ...9

ĮVADAS ...11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ...13

1.1. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) apibūdinimas... 13

1.2. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai požymiai ... 14

1.3. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) vaistinės augalinės žaliavos panaudojimas ... 15

1.4. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) vaistinės augalinės žaliavos preparatų farmakologinis poveikis organizmui ...16

1.5. Sėjamųjų grikių ( Fagopyrum esculentum Moench) sudėtis ... 17

1.6. Bendra flavonoidų apžvalga ... 18

1.6.1. Rutinas ir kiti flavonoidai vyraujantys grikių augalinėje vaistinėje žaliavoje ... 18

1.7. Grikių žolės mėginių paruošimas tyrimui ir analizės metodai...23

2. TYRIMO METODIKA ...26

2.1. Tyrimų objektas ... 26

2.2. Naudotos medžiagos ... 26

(4)

2.4. Tyrimo metodai ... 27

2.4.1. Etanolinės ištraukos ruošimas ... 27

2.4.2. Kietafazė ekstrakcija ... 27

2.5. Biologiškai aktyvių junginių kokybinis nustatymas ... 28

2.5.1. Flavonoidų kokybinis nustatymas ... 28

2.5.2. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 29

2.5.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 29

2.5.4. Kiekybiniam ir kokybiniam tyrimui taikytas efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodas ... 31

2.6. Statistinis duomenų įvertinimas ... 33

3. REZULTATAI ...34

3.1. Kokybinis flavonoidų nustatymas tiriamuosiuose objektuose ... 34

3.2. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis ... 35

3.3. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 36

3.3.1. Tirpiklio koncentracijos parinkimas ... 37

3.3.2. Ekstrakcijos laiko parinkimas ... 38

3.3.3. Ekstrakcijos temperatūros parinkimas ... 39

3.3.4. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas kokybiam ir kiekybiniam tyrimui ... 40

3.4. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas grikių žolės etanoliniuose ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 40

3.5. Kiekybinis ir kokybinis flavonoidų nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodu ... 41

3.6. Kiekybinis ir kokybinis flavonoidų nustatymas ESC-MS metodu, ekstraktus išvalius kietafazės ekstrakcijos metodu ... 43

(5)

3.7. Apibendrinimas ... 49

IŠVADOS ...51

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...52

(6)

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

EKG – elektrokardiograma

ESC–MS – efektyvioji skysčių chromatografija – masių spektrometrija

GFE – grikių flavonoidų ekstaktas

KE – kietafazė ekstrakcija

KMI - kūno masės indeksas

RE – rutino ekvivalentas

(7)

SANTRAUKA

Sigitos Daukantaitės baigiamasis magistro darbas „Sėjamųjų grikių (Fagopyrum

esculentum Moench) žolės flavonoidų frakcinė analizė“/ mokslinis baigiamojo darbo vadovas Prof.

dr. Valdas Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra (Kaunas).

Raktiniai žodžiai: Fagopyrum esculentum Moench, sėjamasis grikis, grikių žolės

ekstraktas, flavonoidai, ESC-MS, KE.

Tyrimo objektas: Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro (LAMMC) Vokės filialo

eksperimentiniuose bandymų laukuose užaugintos šešios skirtingos sėjamųjų grikių (Fagopyrum

esculentum Moench) žolės veislės: „Smuglianka“, „Anika“, „Čanita“, „Žaleika“, „Mara“ ir

„Kvietka“. Bandymai atlikti su 2014 m. rinktomis sezono žaliavomis. Iš jų pagaminti etanoliniai žolės ekstraktai.

Tyrimo tikslas: Įvertinti tiriamųjų žaliavų kiekybinę ir kokybinę flavonoidų sudėtį.

Nustatyti (Fagopyrum esculentum Moench) žolėje esančius flavonoidus.

Uždaviniai: 1. Optimizuoti ekstrakcijos ultragarsu sąlygas (skirtinga etanolio

koncentracija, ekstrakcijos ultragarso trukmė ir temperatūra) įvertinant bendrą flavonoidų kiekį rutino ekvivalentais (RE). 2. Spektrofotometrijos metodu įvertinti bendrą flanonoidų kiekį (RE) visuose šešiuose grikių veislės bandiniuose. 3. Pasirinkta ESC-MS metodika atlikti flavonoidų identifikavimą ir nustatyti jų kiekius grikių ėminiuose. 4. ESC-MS metodu palyginti kiekybinius flavonoidų pokyčius tuose pačiuose ėminiuose po tiriamųjų išvalymo kietafazės ekstrakcijos metodu.

Metodai: Ekstrakcijos sąlygų įvertinimas ir bendras flavonoidų kiekio įvertinimas atliktas

spektrofotometriniu metodu atliekant reakciją su AlCl3. Ėminių valymui taikyta kietafazė

ekstrakcija. Atskirų flavonoidų analizė atlikta ESC-MS metodu.

Rezultatai: Nustatyta, kad ekstraktų gamybai efetyviausia naudoti 80% etanolį, ekstrakciją

ultragarsu atlikti 30 min. 60oC temperatūroje. Spektrofotometrijos metodu įvertintas bendras flavonoidų kiekis, kuris svyruoja nuo 45,17 ± 2,33 mg RE \g („Mara“) iki 81,20 ± 1,27 mg RE/g („Čanita“). Atlikus analizę ESC-MS metodu visuose šešiose grikių veislės ėminiuose nustatyti ir identifikuoti 5 flavonoidai: rutinas, kvercitrinas, kvercetinas, izokvercitrinas, orientinas. Daugiausia randama rutino. Jo kiekis tiriamuosiuose varijuoja nuo 89,83 mg/g („Mara“) iki 102,27 mg\g („Čanita“). Kvercitrino aptinkama nuo 18,56 mg/g („Mara“) iki 23,27 mg/g („Smuglianka“), kvercetino – nuo 1,55 mg/g („Mara“) iki 1,89mg/g („Čanita“), izokvercitrino – nuo 2,04 mg/g

(8)

(„Žaleika“) iki 2,49 mg/g („Anika“), orientino – nuo 1,66 mg/g („Mara“) iki 2,15 mg\g („Anika“). Ekstraktų išvalymui pritaikius kietafazės ekstakcijos metodą, rutino sumažėja nuo 49,07% („Kvietka“) iki 66,26% („Smuglianka“), izokvercitrino nuo 78,12% („Kvietka“) iki 91,06% („Smuglianka“), kvercitrino nuo 72,74% („Kvietka“) iki 88,35% („Smuglianka“), orientino nuo 85,71% („Kvietka“) iki 93,37% („Mara“), kvercetino nuo 93,54% („Mara“) iki 100%.(„Smuglianka“, „Anika“, „Žaleika“).

(9)

SUMMARY

Master’s Thesis by Sigita Daukantaitė: “Fraction Analysis of Flavonoids in Buckwheat

(Fagopyrum Esculentum Moench) herb”/ Academic Advisor for the Thesis: prof. dr. Valdas

Jakštas; Department of Pharmacognosy of Faculty of Pharmacy of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences (Kaunas).

Keywords: Fagopyrum esculentum Moench, buckwheat, buckwheat herb extract, flavonoids, ESC-MS, KE.

Object of the research: Six different buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) herb

varieties grown in the experimental test fields of Vokė Branch of the Lithuanian Research Centre for Agriculture and Forestry (LRCAF): „Smuglianka“, „Anika“, „Čanita“, „Žaleika“, „Mara“ and „Kvietka“. Tests have been conducted with the raw materials collected in 2014. Standard herb extracts have been made of them.

Aim of the research: To evaluate quantitative and qualitative composition of flavonoids

in the raw materials subject to research. To identify flavonoids present in (Fagopyrum esculentum Moench) herb.

Tasks: 1. To optimize the conditions of ultrasonic extraction (different concentrations of

ethanol, durations of ultrasonic extraction, and temperatures) by evaluating total flavonoid quantity in rutin equivalents (RE). 2. To evaluate total flavonoid quantity (RE) in all six samples of buckwheat varieties by using spectrophotometry. 3. To identify flavonoids by applying the selected ESC-MS methodology and to determine their quantities in buckwheat samples. 4. To apply the ESC-MS method for comparison of quantitative changes in flavonoids in the same samples after purification of the samples subject to research by using solid phase extraction.

Methods: Evaluation of the extraction conditions and evaluation of the total flavonoid

quantity was performed by using the spectrophotometric method by causing reaction with AlCl3.

Solid phase extraction was applied for purification of the samples. Analysis of individual flavonoids was made by applying the ESC-MS method.

Results: It was found that the most efficient option for production of extracts was using

80% ethanol, to apply ultrasonic extraction for 30 min. at a 60oC temperature. The total flavonoid quantity was evaluated by using spectrophotometry and it ranged from 45.17 ± 2.33 mg RE \g („Mara“) to 81.20 ± 1.27 mg RE/g („Čanita“). Upon conducting analysis by applying the ESC-MS method to samples of all six varieties of buckwheat the following 5 flavonoids were found and identified: rutin, quercitrin, quercetin, isoquercitrin, orientin. The biggest quantity found was rutin.

(10)

The quantity thereof in the analysed samples varied from 89.83 mg/g („Mara“) to 102.27 mg\g („Čanita“). Found quantities of quercitrin ranged from 18.56 mg/g („Mara“) to 23.27 mg/g („Smuglianka“), quercetin raged from 1.55 mg/g („Mara“) to 1.89 mg/g („Čanita“), isoquercitrin ranged from 2.04 mg/g („Žaleika“) to 2.49 mg/g („Anika“), and orientin ranged from 1.66 mg/g („Mara“) to 2.15 mg\g („Anika“). Upon application of solid phase extraction method for purification of extracts, the quantity of rutin decreased from 9.07% („Kvietka“) to 66.26% („Smuglianka“), isoquercitrin decreased from 78.12% („Kvietka“) to 91.06% („Smuglianka“), quercitrin decreased from 72.74% („Kvietka“) to 88.35% („Smuglianka“), orientin decreased from 85.71% („Kvietka“) to 93.37% („Mara“), quercetin decreased from 93.54% („Mara“) to 100% („Smuglianka“, „Anika“, „Žaleika“).

(11)

ĮVADAS

Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) auginamas daugelyje pasaulio šalių. Jo auginimui nereikalingos ypatingos klimato ar priežiūros sąlygos, todėl žaliava plačiai paplitusi, auginama bei vartojama ir išsivysčiusiose, ir besivystančiose šalyse. Grikiuose gausu flavonoidų (rutino, kvercetino, viteksino ir pan.) Dideli flavonoidų kiekiai esantys grikių lapuose, stiebuose, žolėje, sėklose, žieduose ir kituose augalo dalyse daro ją turtinga maistine kultūra [1].

Dėl grikių žaliavoje esančių flavonoidų gausos ir jų universalios naudos sveikatai, jie vis dažniau tyrinėjami mokslininkų. Įrodyta, jog flavonoidai pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antivirusiniu ir priešvėžiniu poveikiu, yra veiksmingi kovojant su oksidaciniu stresu, naudojami širdies ir kraujagyslių ligų prevencijai. Tyrimai rodo, jog flavonoidai pasižymi apsauginiu poveikiu gydant daugelį infekcinių (bakterinių ar virusinių) ligų [2].

Nors visame pasaulyje ši augalų kultūra tyrinėta nemažai, apie Lietuvos klimate užaugusius grikius informacijos randama labai nedaug. Nors žaliava ir turtinga flavonoidais, tyrimų su ja atlikta vos keletas. Siekiant išsiaiskinti, kuri grikių veislė pasižymi didžiausia flavonoidų gausa, būtina atlikti išsamius žaliavos tyrimus. Nustačius geriausias sąlygas, kurių dėka išskiriami didžiausi įmanomi ieškomų medžiagų kiekiai galima padėti ateityje atliekamies tyrimams.

Flavonoidų kokybinei ir kiekybei analizei atlikti pasirinktas spektrofotometrinis metodas. Nustačius bendrus flavonoidų kiekius tolimesnei atskirų flavonoidų analizei pasirinktas dar labai mažai grikių analizei taikytas ESC-MS metodas, kuriuo kiekybiškai ir kokybiškai įvertinama žaliava. Ieškoma sąlygų, kuriomis geriausia paruošti grikių ekstraktą, kad būtų išgaunamas kuo didesnis flavonoidų kiekis.

(12)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Parinkti tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas pirminei flavonoidų paieškai, atlikti

(Fagopyrum esculentum Moench) žolėje esančių flavonoidų komplekso tyrimą.

Uždaviniai:

1. Parinkti tinkamiausias ekstrakcijos ultragarsu sąlygas (skirtinga etanolio koncentracija, ekstrakcijos ultragarso trukmė ir temperatūra) įvertinant bendrą flavonoidų kiekį rutino ekvivalentais (RE).

2. Spektrofotometrijos metodu įvertinti bendrą flanonoidų kiekį (RE) visuose šešiuose grikių veislės bandiniuose.

3. ESC-MS metodu atlikti flavonoidų identifikavimą ir nustatyti jų kiekius grikių ėminiuose.

4. ESC-MS metodu palyginti kiekybinius flavonoidų pokyčius tuose pačiuose ėminiuose po tiriamųjų išvalymo kietafazės ekstrakcijos metodu.

(13)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) apibūdinimas

Sėjamasis grikis (lot. Fagopyrum esculentum Moench) – rūgtinių (Polygonaceae) šeimai priklausantis augalas (1 pav.). Fagopyrum gentyje žinomos daugiau nei aštuoniolika grikių rūšių [4]. Kadangi gentis gali turėti labai daug skirtingų rūšių, todėl ir pats augalas turi net keletą skirtingų pavadinimų. Vien Euroazijoje auginamos daugiau nei 15 skirtingų grikio rūšių, pavyzdžiui : saldūs grikiai - Fagopyrum Esculentum Moench., kartūs grikiai - F. Tataricum., šiurkštūs - F. Sagittatum Gilib., kašmyriniai - F. Kashmirianum Munshi., laukinio tipo grikiai -

F.Cymosum [5]. Sėjamasis grikis buvo įtrauktas į nacionalinį registrą, kaip labai saugomas laukinis

augalas [6]. Grikiai buvo vienas iš pirmųjų pasėlių prijaukintų Azijoje. Kinijoje jie buvo naudojami kaip maisto pasėliai. Apie 1400-uosius metus jie išplito ir į Europą, o 1600-aisiais metais buvo atvežti kolonistų į Šiaurės Ameriką. Grikio sėkla savo išvaizda panaši į kviečio grūdą, todėl augalas buvo pavadintas grikiu (iš anglo saksų žodžių: Boc (buko) ir whoet (kviečių) [7].

(14)

1.2. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) morfologiniai

požymiai

Sėjamasis grikis - vienmetis žolinis augalas, kurio aukštis gali siekti net iki 70 cm. Grikio šaknis - liemeninė, o ties šakniastiebiu neretai būna labai šakota. Žiedyno kekės forma - trumpa ir suspausta, turi ilgą vaiskotį, o patys žiedai yra labai nedideli, galintys būti baltos arba rausvos spalvos ir iki 4 mm skersmens. Žydėjimas prasideda 4-6 savaitę (po sėjos) [8]. Stiebas yra cilindro formos, tuščaviduris, apie 2-6 mm. ilgio. Dažniausiai jis būna briaunotas, rausvai žalios arba švelniai rausvos spalvos. Grikio lapai širdiškos formos, pražanginiai, išdėstyti spirale, tamsiai žalios spalvos (šiek tiek blyškesni ant apatinio paviršiaus ir kiek tamsesnės spalvos lapo viršutinėje dalyje), iki 7 cm pločio ir 11 cm lapo ilgio [9].

Bendras morfologinis apibūdinimas tinka visoms grikių rūšims apibūdinti, tačiau priklausomai nuo grikio veislės ir apdorojimo būdų, gali priklausyti ir skirtinga tam tikrų atskirų jo dalių išvaizda. Dėl skirtingos veislės aiškiai matomi vizualūs sėklų išvaizdos skirtumai. Jos gali skirtis dydžiu, spalva ir skoniu. Grūdai gali būti stambesni ar smulkesni, neturėti ar turėti nedidelius sparnelius, dažniausiai visų jų paviršius matinis, o spalva gali kisti nuo pilkai rudos iki beveik juodos spalvos [10].

(15)

1.3. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) vaistinės augalinės

žaliavos panaudojimas

Europoje grikiai (Fagopyrum esculentum Moench) auginami jau nuo 16 amžiaus. Šis augalas daugiausia naudojamas kaip vienas pagrindinių žmogaus maisto šaltininių. Pagrindinės šalys, kurios pirmauja kaip didžiausios grikių augintojos yra Kinija, Rusija, Ukraina ir Kazachstanas, tačiau juos taip pat augina Prancūzija, Lenkija ir kt. [11].

1 lentelė. 2013 metų duomenys apie didžiausias grikių augintojas pasaulyje [12] Šalis (didžiausios grikių augintojos mažėjimo tvarka) Užauginama grikių produkcija (tonomis)

Apsėjamas plotas (hektarais)

1.Rusija 833936 905911 2.Kinija 733000 705000 3.Kazachstanas 276840 202008 4.Ukraina 179020 168400 5.Prancūzija 154800 44500 6.Lenkija 90874 70384 Bendras kiekis 2547014 2386212

Grikiai turtingi savo sudėtimi, todėl visai nenuostabu kodėl jie yra vieni tarp populiariausių auginamų žaliavų. Augalo sėklose randama iki 18 rūšių amino rūgščių , iš kurių net 8 rūšys yra būtinos žmogaus organizmui . Amino rūgščių kiekis augalinėje medžiagoje yra didesnis, nei ryžiuose, kviečiuose ir kukurūzuose [6]. Grikiai (Fagopyrum esculentum Moench) reikalingi dėl daugybės įvairių priežasčių: jie svarbūs augalininkystei dėl labai maistingų sėklų, grikių žolė naudojama augalinių vaistų gamybai, šio augalo dedama į miltus kaip kai kurių maisto produktų priedas, o šviežios žalios augalo dalys daugiausia vartojamos kaip maistas. Grikių žolė yra ypač žinoma dėl to, nes ji turtinga flavanoidais ir taninais. Moksliniais tyrimais buvo įrodyta, kad grikių žolės arbata apsaugo nuo kojų edemos atsiradimo, taip pat jos duodama pacientams, sergantiems lėtiniu venų nepakankamumu. Rekomenduojama vartoti grikių žolę gydant cukrinį diabetą bei žmonėms kenčiantiems nuo retinopatijos [13]. Fagopyrum esculentum Moench. yra naudojama ir

homeopatijoje dėl daugelio priežasčių: viduriavimui gydyti, egzemoms, įvairiems akių, galvos skausmams, niežuliui malšinti, gerklės skausmui slopinti, pykinimui bei slogai mažinti [14].

(16)

1.4. Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) vaistinės augalinės

žaliavos preparatų farmakologinis poveikis organizmui

Lėtinio venų nepakankamumo gydymas. Remiantis mokslininkų N. Ihme,

H. Kiesewetter, F. Jung, K. H. Hoffmann, A. Birk, A. Müller, K. I. Grützner atliktu tyrimu, įrodyta, kad grikių žolės arbata yra veiksminga priemonė gydant pacientus, sergančius lėtiniu venų nepakankamumu. Dvigubai aklo, atsitiktinių imčių, placebu kontroliuojamo klinikinio tyrimo metu 67 vyrai ir moterys (22-74 metų diapazone) buvo atsitiktinai suskirstyti į dvi grupes. 3 mėnesius viena tiriamųjų grupė vartojo grikių žolės arbatą, tuo tarpu kita - placebo arbatą. Pagrindinis veiksmingumo vertinimo kriterijus buvo blauzdos apimties ultragarsu tyrimas. Šlaunikaulio venų skersmenys buvo matuojami echoskopijos metodu, o kapiliarų pralaidumas buvo nustatomas odos fluorescencijos angiografijos būdu. Po 3 savaites trukusio tyrimo gauti rezultatai parodė, kad nors vidutinė dalinė kojų apimtis gydymo grikų arbata grupėje ir nepakito (nuo 2041 ml iki 2073 ml), tačiau ji padidėjo placebo grupėje iki 110 ml (nuo 1972 ml iki 2082 ml). Vidutinis šlaunikaulio skersmuo venose buvo sumažintas ir pagerintas kapiliarų pralaidumas, todėl tyrimo metu gautų rezultatų duomenimis padaryta išvada, kad gydymas grikių žolės arbata yra saugus būdas gydant kojų edemas ir mažinant lėtinio venų nepakankamumo simptomus [15].

Gliukozės, cholesterolio, trigliceridų, plazmos kortizolio ir azoto lygį kraujyje mažinantis poveikis. 2011 m Preeti Kothiyal, Parminder Ratan atlikto ikiklinikinio tyrimo metu

įrodytas grikių ekstrakto veiksmingumas mažinant stresą. Tiriamosioms žiurkėms buvo duodami 100 mg/kg grikių ekstraktai ir matuojama priverstinio plaukimo ištvermė. Buvo nustatyta, kad davus grikių ekstraktą žiurkėms ne tik padidino plaukimo laiką, bet ir parodė reikšmingai sumažėjusį gliukozės, cholesterolio, trigliceridų, plazmos kortizolio ir azoto lygį kraujyje[16].

Antro tipo cukrinio diabeto gydymas. D-chiro-inozitolis yra aktyvus junginys esantis

grikių (Fagopyrum tataricum (L.) Gaench) žaliavoje, kuris pasižymi panašiu į insuliną biologiniu aktyvumu. 2008 m atlikto tyrimo su pelėmis metu, buvo tiriamos D-chiro-inozitolio galimybės sumažinti gliukozės koncentraciją kraujo serume. Tiriamosios pelės buvo dirbtinai susargdintos cukriniu diabetu. Jos buvo maitinamos grikių sėlenų ekstraktu. Palyginus gautus rezultatus su kontroline pelių grupe tapo aišku, jog gliukozės kiekio kraujyje, plazmoje esančio C-peptido, gliukagono, bendrojo cholesterolio, trigliceridų ir kraujo šlapalo azoto kiekio kraujyje buvo gerokai daugiau toje pelių grupėje, kuri grikių ekstrakto nevartojo. Šis tyrimas aiškiai parodė, kad vartojamas D-chiro-inozitolis esantis grikių ekstrakte galėtų sumažinti gliukozės kiekį kraujo plazmoje [17].

(17)

1.5. Sėjamųjų grikių ( Fagopyrum esculentum Moench) sudėtis

Cheminė augalo sudėtis priklauso nuo daugybės veiksnių. Augalo sudėčiai įtakos turi: auginimo sąlygos, veislė ir žaliavos rinkimo laikotarpis. Grikių sėklų sudėtis ir maistinė vertė yra kur kas vertingesnė ir turtingesnė, nei kitų grūdinių kultūrų. Jie pasižymi kur kas didesniu tokių mineralų kaip magnis, kalis, fosforas, cinkas, manganas ir varis kiekiu [18]. Nors baltymų kiekis grikių sėklose yra daug didesnis nei ryžiuose, kviečiuose ir kukurūzuose, juos kiekiu lenkia tik avižos [12].

2 lentelė. Vidutinis bendras skirtingų amino rūgščių kiekis ir mineralinių medžiagų kiekis sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) sėklose [12, 19]

Amino rūgštis Kiekis (mg/g) Mineralinė sudėtis Kiekis (mg/100g)

Lizinas 51 Ca (Kalcis) 12,4 Metioninas 19 Cu (Varis) 0,52 Cistinas 22 Fe (Geležis) 2,86 Treoninas 35 K (Kalis) 450 Valinas 47 Mg (Magnis) 375 Izoleucinas 35 Mn (Manganas) 1,61 Leucinas 61 P (Fosforas) 394 Fenilalaninas 42 Zn (Cinkas) 2,51 Histidinas 22 - - Triptofanas 16 - -

Remiantis moksliniais tyrimais, grikis kaupia daug įvarių vitaminų. Daugiausia randama vitamino E (takoferolio) bei vitamino C (askorbo rūgšties). Augalo sudėtyje taip pat gausu B grupės vitaminų: B1 (tiamino 4,6 mg/g), B2 (riboflavino 1,46 mg/g), B3 (niacino18 mg/g), B5 (pantoteno

rūgšties, 10,56 mg/g), B6 (piridoksino 7,36 mg/g). Grikiuose randama ir vitamino A (karotinoidų

2,1mg/g) [12].

Grikiuose yra nuo 48,7% iki 55,2% tirpių angliavandenių, iki 3% lipidų, iki 12% aukštos biologinės vertės baltymų ir amino rūgščių. Grikiai taip pat yra daugybės biologiškai aktyvių medžiagų šaltinis. Jų sudėtyje yra daug fenolinių junginių, tokoferolių, karotinoidų, fitosterolių, skvaleno, glutationo ir melatonino [20]. Augalų žolėje kaupiasi tokie flavonoidai kaip kvercetinas, katechinas, epikatechinas, kvercitrinas, luteolinas ir kt. Grikių sėlenos pasižymi ypač

(18)

dideliu B grupės vitaminų gausa [18]. Didžiausią organinių medžiagų kiekį kaupia grikių grūdai (98,10%), 95,6 % kaupia grikių žiedai, 92,3% stiebai ir 86,6% lapai [21].

1.6. Bendra flavonoidų apžvalga

Tai viena didžiausių augalinių fenolinių junginių grupė, kurią sudaro daugiau nei 6000 junginių [22]. Dėl flavonoidų buvimo augalinėje medžiagoje priklauso daugelio augalų geltona ir oranžinė spalva. Flavonoidų pagrindą sudaro benzo-γ pirono žiedas. Flavonoidų molekulėje yra 2 benzolo žiedai, kuriuos jungia C3 fragmentas. Jie turi C6-C3-C6 molekulinę grupę [23]. Flavonoidai skirstomi į: flavonolius, flavonus, flavanonolius, izoflavonus, flavononus, flavan-3-olius, flavanonolius [22, 23].

Flavonoidai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir imuninę sistemą stiprinančiu poveikiu. Turtingos flavonoidais maisto dietos susijusios su vėžio, neurodegeneracinių ligų, širdies ir kraujagyslių ligų prevencija. Beveik visos flavonoidų grupės pasižymi stipriu antioksdciniu veikimu [22].

Piešvėžinis grikiuose esančių flavonoidų veikimas

.

Mokslinių tyrimų metu buvo nustatyta, kad grikių flavonoidų ekstraktas pasižymi priešvėžiniu poveikiu. In vivo metu buvo atliktas MTT (ląstelių gyvybingumo) testas, siekiant aptikti krūties vėžio MCF-7 ląstelių gyvybingumą vartojant skirtingos koncentracijos grikių flavonoidų ekstaktą. Visi ekstraktai parodė galimą citotoksiškumą ląstelių linijoms. Remiantis eksperimento duomenimis, nustatyta, kad visi 5 paruošti grikių flavonoidų ekstraktų mėginiai (T1, T3, T4, T6 ir T7) turėjo akivaizdų krūties vėžio ląstelių linijos MCF-7 ląstelių augimo slopinamąjį poveikį. MCF-7 ląstelių gyvybingumas, gydytiems flavonoidų ekstraktais T3 ir T4 buvo atitinkamai tik 43.82% ir 40.49%. Slopinanti 50% koncentracija (IC50s) T1, T6 ir T7 ekstraktuose buvo atitinkamai 0,346, 0,323 ir 0,289 mg / ml. Tyrime padaryta išvada, kad grikių flavonoidų ekstraktas gali sulėtinti navikinių ląstelių augimą [24].

Antro tyrimo metu nustatinėjamas kvercetino, kuris buvo išgautas iš F.tataricum poveikis. Iš grikio buvo gaminamas kvercetino ekstraktas ir in vitro tiriamas antinavikinis aktyvumas prieš žmogaus skrandžio karcinomos ląstelių liniją SGC-7901. MTT testas parodė, kad kvercetinas gali slopinti 293T, SGC-7901, hepatomos lastelių liniją (HepG2) ir hela ląstelių (HeLa) gyvybingumą [25].

(19)

Antidiabetinis grikiuose nustatytų flavonoidų veikimas. Jing Li, Fayong Gong, Fenglin Li atlikto tyrimo metu buvo įvertintas grikių flavonoidų ekstrakto teigiamas poveikis gydant 2 tipo cukriniu diabetu sergančias žiurkes. Tiriamosios žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į penkias tiriamųjų grupes: diabetu serganti kontrolinė žiurkių grupė, mažas grikių flavonoidų ekstrakto dozes vartojanti tiriamoji grupė, vidutines GFE dozes vartojanti tiriamoji grupė, aukštas GFE dozes vartojanti tiriamoji grupė, ir glibenklamidu gydyta tiriamoji grupė (kontrolinė grupė). Po 28 dienų gydymo buvo matuojamas kūno svoris, gliukozės kiekis kraujyje nevalgius (FBG), insulino koncentracija serume, bendras cholesterolis (TC), trigliceridų (TG), didelio tankio lipoproteinų cholesterolio (DTL-C), ir mažo tankio lipoproteinų cholesterolio (MTL-C) koncentracija. Rezultatai parodė, kad vartojant GFE gerokai sumažėjo FBG ir serumo insulino lygis. Be to, sumažėjo TC, TG, ir MTL-C koncentracija ir padidėjo DTL-C koncentracija. Šios išvados rodo, kad GFE pasižymi hipoglikeminiu ir hipolipideminiu poveikiu 2 tipo cukriniu diabetu sergančių žiurkių organizme, todėl tyrimai turi didelį potencialą tapti pagrindu tiriant GFE antidiabetinį poveikį žmonėms [26].

Fizinę ištvermę didinantis flavonoidų poveikis. Fusheng Miao, Wu, D., Guichao Ni 2016 metais atlikto tyrimo metu nustatyta, kad grikių flavonoidų ekstaktas yra efektyvus būdas norint mažinti nuovargį ir bandant didinti fizinį pajėgumą pelėms. Tiriamosios pelės buvo suskirstytos į 4 grupes: 3 grupės gavo atitinkamai 100, 200 ir 400 mg/kg kūno svorį atitinkantį grikių flavonoidų ekstakto kiekį , o kontrolinė grupė gavo fiziologinio druskos tirpalo. Po 28 dienų trukusio gydymo, pelėms atlikti išsamūs tyrimai: matuojamas bėgimo laikas, kraujyje esančios pieno rūgšties (BLA) kiekis, serumo kreatinkinazė (SCK), kepenų glikogenas, superoksido dismutazė (SOD), glutationo peroksidazė (GPx) ir katalazė (PTK). Rezultatai parodė, kad grikių flavonoidų ekstakto vartojimas prailgino pelių bėgimo testo laiką. Pagerinus fizinę ištvermę ir taip sumažinus raumenims sukeliamą žalą, mažėja ir SCK lygis. Vartojant didesnius grikių flavonoidų ekstakto kiekius ženkliai pagerėja visi tyrime tirti rodikliai, todėl įrodytas akivaizdus ekstrakto veiksmingumas didinant fizinį pajėgumą ir mažinat nuovargį [27].

Didelio masto, 25 metus trukęs tyrimas, paskelbtas 1995 metais žurnale "Archives of Internal Medicine", kuriame buvo nustatyta, kad flavonoidų vartojimas reikšmingai susijęs su ilgaamžiškumu. Mokslininkai ištyrė, jog flavonoidų vartojimas iki 25% sumažina mirtingumą nuo išeminės širdies ligos ir vėžio [22] .

(20)

1.6.1. Rutinas ir kiti pagrindiniai flavonoidai vyraujantys grikių vaistinėje

žaliavoje

3 pav. Rutino cheminė struktūra [28].

Rutinas (3 pav.) - natūralus bioflavonoidas (taip pat vadinamas rutozidu, kvercetino-3-O-rutinoze ir soforinu) yra (2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-dihidroksi-3-[α-L-ramnopuranozil-(1→6)-β-D-gliukopiranoziloksi]-4H-chromen-4-onas) flavonoido kvercetino glikozidas. Augalo pavadinimas kilęs nuo augalo Ruta graveolens, kuriame yra daug rutino. Kartais rutinas dar vadinamas vitaminu P, nors jis ir nevisiškai pasireiškia P vitamininiu poveikiu [29]. Šis flavonoidas yra būtinas tinkamai vitamino C absorbcijai; naudingas hipertenzijos gydymui; slopina kraujavimą ir kapiliarų įtrūkimus, nes jungiamajame audinyje stato apsauginį barjerą nuo infekcijos. Žalia grikių arbata naudojama dėl jos teigiamo poveikio gydant širdies ir kraujagyslių ligas, arbata mažina aterosklerozės riziką, beto pasižymi antioksidaciniu poveikiu [30].

Moksliniais tyrimais įrodyta, kad rutinas esantis grikių žaliavoje, pasižymi kūno svorį mažininančiu poveikiu. 2016 m mokslininkų atliktame dvigubai aklame, placebo kontroliuojamame tyrime dalyvavo 149 savanoriai (42 vyrai ir 107 moterys), kurie padalinti į dvi didelias tiriamųjų grupes. Viena dalis tiriamųjų vartojo grikių produktus, kurių sudėtyje gausūs rutino kiekiai, tuo tarpu kita grupė (placebo grupė), vartojo maistą, visiškai nepraturtintą jokiais flavonoidais. Kūno sudėties pokyčių matavimai (KMI, procentinis kūno riebalų kiekis (PKRK), kūno svoris (KS) ir t.t), hematologiniai bei šlapimo tyrimai buvo atliekami tyrimo pradžioje, 4, 8, 12 tyrimo savaitę, bei praėjus 3 savaitėms po tyrimo nutraukimo. Jau ketvirtą tyrimo savaitę PKRK rutinu turtingo maisto vartotojų grupėje buvo mažesnis nei placebo grupėje (p=0,038). 8–ą tyrimo savaitę tiobarbitūro rūgštį reaguojančios medžiagos (TRRM) lygis, KMI, KS, PKRK buvo žymiai mažesnis nei placebo grupėje. Daroma išvada, kad rutinu turtingų grikių vartojimas gali būti veiksminga, kūno svorį mažinanti, priemonė [31].

(21)

2016 metais atlikto tyrimo su žiurkėmis metu, siekta išsiaiškinti ar rutinas gali turėti teigiamą poveikį organizmui sergant diabetine kardiomiopatija (dažna cukriniu diabetu sergančių pacientų komplikacija). Tyrimas atliekamas su 4 savaites cukriniu diabetu sergančiomis žiurkėmis. 24 tyrimo savaites imituojamas toksinis lėtinę hiperklikemiją sukeliantis poveikis. Žiurkėms duodamas 50 mg/kg per dieną rutino kiekis ir stebimas poveikis. Tyrimo metu matyti aiškiai pakitę EKG parametrai, padidėjęs bendras antioksidacinis pajėgumas. Rutino vartojimas suteikė didelę apsaugą nuo su cukriniu diabetu susijusio oksidacinio streso atsiradimo, sumažinti degeneraciniai širdies pokyčiai, ir patobulinti EKG parametrai lyginant su diabetu sergančia kontroline žiurkių grupe. Sumažintas širdies ir kūno masės santykis. Būtent dėl šių parametrų (kurie, manoma yra pagrindiniai diabetinės kardiomiopatijos sukėlimo priežastis) pagerėjimo daroma išvada, kad rutinas yra veiksmingą priemonė gydant šią patologiją. Atliktas tyrimas taip pat priartina prie galimybės bandymą atlikti ir su žmonėmis [32].

Daugiau pagrindinių grikiuose vyraujančių flavonoidų (kaip ir rutinas priklausančių flavonolių grupei) nurodyta 3 lentelėje:

(22)

3 lentelė. Pagrindiniai grikiuose nustatyti flavonoidai, jų kiekiai ir poveikis organizmui Flavonoidas Cheminė junginio

struktūra Flavonoidų kiekis grikių žaliavoje Flavonolio poveikis organizmui Lite- ratū-ra Kvercetinas (C15H10O7) 1. Tirtuose Fagopyrum tataricum ekstraktuose rasti kvercetino kiekiai: sėklose - 6,12 mg/g, lapuose - 1,47 mg/g. Šaknyse kvercetino nerasta. 2. Tiriant (Fagopyrum esculentum Moench) grikių sėklų ekstaktus rasti 0,76 mg\g ir 2,78mg\g kvercetino kiekiai. Atlikto tyrimo su žiurkėmis metu įrodyta kvercetino nauda gydant smegenų oksidacinį stresą (kadangi kvercetino vartojimas mažina oksidacijos metu išsiskyrusių laisvųjų radikalų kiekį). [33] [34] [35] [20] Kvercitrinas (C21H20O11) 1. 5–iuose tirtuose sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) sėklų ekstraktuose,

kvercitrinas rastas tik dviejuose iš jų. Rasti 3,34 mg\g ir 0,58 mg\g kvercitrino kiekiai. Tyrimo metu įrodyta, jog kvercitrinas pasižymi puikiomis antiokscidacinėmis savybėmis. Dėl šios priežasties kvercitrinas aiškiai mažina oksidacinių DNR pažeidimų riziką. Ištirta, jog kvercetinas prisideda prie ultravioletinio B spinduliavimo sukelto oksidacinio žalos odai mažinimo. [36] [37] [20] Hiperozidas (C21H20O12) 1. Tyrime tirtuose (Fagopyrum esculentum Moench) sėklų ekstraktuose rasti 7,48 mg\g ir 2,58 mg\g hiperozido kiekiai. Atlikto tyrimo duomenimis padaryta išvada, jog hiperozidas gali slopinti kraujagyslių uždegiminius procesus venų endotelio ląstelėse. [38] [20] [39]

(23)

1.7. Grikių žolės mėginių paruošimas tyrimui ir analizės metodai

Norint tinkamai paruošti mėginius tolimesniems detekcijos tyrimams, pagrindiniu kriterijumi laikomas siekis – maksimalus paruošimui skirtų etapų skaičiaus sumažinimas. Dažniausiai taikoma 2 etapų procedūra, kurios metu siekiama atrasti ir pasitelkti kuo optimalesnį mėginio paruošimo metodą. Ruošiant kietos formos mėginius (žolę) svarbu tinkamai išdžiovinti tiriamąją žaliavą oru ar šaldant, malant, atliekant grūdimą ar homogenizaciją. Skystos formos mėginiai iš pradžių filtruojami, o tik tada centrifūguojami [40].

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas ir dabar išlieka pagrindiniu plačiausiai taikomu metodu flavonoidų nustatyme. Taip pat taikomi tokie kaip dujų ar plonasluoksnės chromatografijos, kapiliarinės elektroforezės metodai. Šiuo metu naujausiu analizės metodu laikoma vadinamoji tandeminė masių spektrometrija bei branduolių magnetinis rezonansas. Taikant šiuos minėtuosius metodus, analizė atlieka kartu pritaikant skysčių chromatografiją bei UV spektrofotometrinį metodą [40].

Kietafazė ekstrakcija. Kietafazė ekstrakcija (KE) – labai plačiai taikomas bandynių

ruošimo metodas, savo atlikimo metodika labai panašus į chromatografinį procesą. Šis ekstrakcijos būdas turi daugybę privalumų. Visų pirma - sukuriama galimybė paruošti bandinį tyrimui labiausiai apsaugotą nuo užteršimo. KFE atliekama per labai trumpą laiką, todėl taip taupomas ir bandinių paruošimo laikas. [41, 42]. Lyginant metodą su kitais bandynių paruošimo būdais (pvz. skysčių-skysčių ekstrakcija) randama dar daugiau metodo pranašumų:

 Didesnė sukoncentravimo laipsnio galimybė  Daug paprastesnė atlikimo technika

 Mažesnis paruošimui sunaudojamų tirpiklių skaičius  Didesnė izoliacija

 Daug didesnis atkuriamumas [43].

Ekstrakcijai skirtas aparatas vienu metu gali paruošti nuo 12 iki 24 bandinių. KFE atlikimui gali būti naudojama kietafazės ekstrakcijos šerdelė, t.y. švirkštas, kuris užpildytas nejudria faze. Analitės sorbuojamos iš skysčio, kuris teka per kietą sorbentą. Kaip sorbentai naudojami: poliniai silikagelio (SiO2), grafituotos anglies ir kt. Sorbentai parduodami diskuose, kolonėlėse arba kasetėse [42].

(24)

1. 2. 3. 4. 4 pav. Pagrindiniai kietafazės ekstrakcijos atlikimo žingsniai [30]

1 žingsnis - kondicionavimas. Kondicionavimui naudojamas pasirinktas organinis tirpiklis ( pvz: metanolis), kuris drėkina sorbento paviršių.

2 žingsnis - mėginio įvedimas. Tikslus bandinio tūris perkeliamas į vienkartinio švirkšto šerdelę. Šio žingsnio metu, tiriamoji medžiaga susikoncentruoja ant sorbento.

3 žingsnis - išplovimas. Buferio ir vandens pagalba pašalinami kai kurie nepageidautini matricos komponentai (analitė išlaikoma)

4 žingsnis – eliuavimas. Pasirenkamas tinkamas eliuentas, kurio pagalba išplaunama absorbuota medžiaga [42, 43].

Skysčių chromatografija- masių spektrometrija. Skysčių chromatografija- masių

spektrometrija yra metodas, kuris leidžia norimus junginius atskirti iš labai sudėtingų mišinių ir juos kiekybiškai kokybiškai įvertinti. Efektyvusis skysčių chromatografijos metodas išskiria junginius pagal medžiagų chemines ir fizikines savybes, masių spektrometrija junginius atskiria pagal masę. Būtent šis dvigubas selektyvumas daro ESC–MS metodą labai galingu analitiniu įrankiu [44].

Metodo privalumai:

 Didelis selektyvumas (derinami du pažangūs atskyrimo mechanizmai leidžia pasitikėti gautais rezultatais , jog analizuojami ir aptinkami būtent tie junginiai, kurių reikia)

 Greitis

 Jautrumas [44,45]. Metodo trūkumai:

(25)

 Sudėtingas metodas (kartais sunku optimizuoti abu mechanizmus, gali tapti sudėtinga efektyviai paleisti sistemas)

 Per didelis selektyvumas (metodas nustatytas taip, kad aptiktų specifines analites pagal labai „švarias“ chromatogramas, todėl jeigu ieškomajame junginyje yra komponentų, kurie neatpažystami, jie sukelia problemas bendram kiekybiniam ir kokybiniam aptikimui) [44]. Pažangesnių metodų, tokių kaip ESC–MS poreikis yra vis didesnis, kadangi tikslesni analizės metodai padeda daugelyje sričių, pavyzdžiui: metodas gali patikimai nustatyti ir išmatuoti teršalus ar jų likučius maisto produktuose. Maiste egzistuoja daug toksiškų ir nepageidaujamų medžiagų, kurie kelia potencialų pavojų žmonių sveikatai. Metodo pagalba atliekama kiekybinė analizė, identifikuojami teršalai [46].

(26)

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimų objektas

Tyrimų objektas - sėjamasis grikis (lot. Fagopyrum esculentum Moench) priklausantis grikių (Fagopyrum Mill) genčiai, rūgtinių (Polygonaceae) šeimai. Tiriamos šešios skirtingos grikių žolės veislės: „Smuglianka“ , „Anika“, „Čanita“, „Žaleika“, „Mara“ ir „Kvietka“. Bandymai atlikti su šių šešių veislių 2014 m rinktomis sezono žaliavomis. Žaliavos atliktiems tyrimams užaugintos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro (LAMMC) Vokės filialo eksperimentiniuose bandymų laukuose. Augalai tyrimui užauginti intensyvios žemdirbystės sistemoje. Žaliavos buvo džiovintos ≤50°C temperatūroje ir laikytos vėsioje patalpoje specialiuose popieriniuose maišeliuose iki pat tyrimo pradžios.

2.2. Naudotos medžiagos

Distiliuotas vanduo (ruošiamas LSMU laboratorijos vandens distiliatoriumi „Milipore“, JAV), acto rūgštis („Lachner“, Čekija), vandenilio chlorido rūgštis („Sigma-Aldrich”, Kanada), aliuminio chlorido heksahidratas ((„Sigma-Aldrich“, Vokietija) 5 g aliuminio chlorido miltelių tirpinami 50 ml distiliuoto vandens), etanolis 96% (AB „Vilniaus degtinė”, Lietuva), heksametilentetraminas ((„Roth“, Anglija) 2,5 g medžiagos tirpinama 50 ml distiliuoto vandens), rutino standartas („Genay“, Prancūzija), cinko milteliai, borato rūgštis, citrinų rugštis, amoniakas, švino acetatas, acetonitrilas (ESC grynumo, „Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija), 0,1% skruzdžių rūgštis, metanolis („Carl Roth GmbH + Co“, Karlsruhe), trifluoracto rūgštis (TFA) („Hohenbrunn“, Vokietija).

2.3. Naudota aparatūra

1. Analitinės svarstyklės (Vokietija); 2. Įvairių talpų mikropipetės (JAV);

3. Elektrinis smulkintuvas („IKA A11 basic“, Vokietija); 4. Centrifuga („Thermo Electron LED GmbH“, Voketija);

(27)

5. Ultragarsinė vonele („Elmasonic P120 H“, Vokietija); 6. Popieriniai filtrai (Vokietija);

7. Spektrofotometras („Spectronic Camspec M550“, Barley Hill Road Garforth Leeds, Anglija);

8. Drėgmės analizatorius („Presica HA 300“ , Switzerland);

9. Skysčių chromatografas („Waters Acquity UPLC“, Waters Corporation, Milford, MA, JAV);

10. Detektorius („Xevo TQD“, Waters Corporation, Milford, MA, JAV);

11. Chromatografinė kolonėlė („YMC – Triart C18“, YMC Europe GmbH, Vokietija); 12. Nailoniniai švirkštiniai filtrai („Q-Max RR“, Frisenette ApS);

13. Šerdelė („SUPELCO DPA-6S“, JAV); 14. Vaakuminis stovas („Supelco“, JAV).

2.4. Tyrimo metodai

2.4.1. Etanolinės ištraukos ruošimas

Pasveriamas 1 gramas (0,01 gramų tikslumu) džiovintos grikių žolės, užpilama 10 ml 70% etanoliniu tirpalu ir ekstrakcija atliekama ultragarso vonelėje esant 40°C temperatūrai 10 minučių. Gautas ekstraktas centrifuguojamas 7 min 5000 rpm. Centrifugatas nupilamas į atskirą mėgintuvėlį, procesas kartojamas tris kartus užpilant po 3 ml, 3 ml, 4 ml ekstrahento (iš viso tyrimui paruošta 10 ml grikių žolės ekstrakto). Gautas ekstraktas filtruojamas per sterilius 0,45 μm nailoninius filtrus. Paruošta grikių žolės ištrauka naudojama kokybiniam flavonoidų tyrimui atlikti.

2.4.2. Kietafazė ekstrakcija

Palyginamajam tyrimui naudotas kietafazės ekstrakcijos (KE) metodas. Tai toks estrakcijos metodas, kurio metu išvalomi analizuojamieji junginiai. Optimaliausiomis sąlygomis paruošti etanoliniai mėginiai papildomai išvalomi naudojant šį metodą, po to kiekybiškai ir kokybiškai įvertinami taikant efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodą

(28)

(ESC-MS), analizės metu parenkant tokias pačias analizės sąlygas, kokiomis įdedami tiriamųjų mėginiai juos prieš analizę (ESC–MS) išvalant švirkštiniais filtrais.

4 lentelė. Pradinės KE analizės sąlygos Nr. KE žingniai KE sąlygos 1. Šerdelės kondicionavimas 1ml 75% metanolis

2. Šerdelės kondicionavimas 1ml distiliuoto vandens su TFA, pH 2

3. Bandinio įleidimas 3 ml Grikių žolės ekstrakto 1:10 (1g ekstraktas\10 ml

vanduo)

4. Priemaišų plovimas 3ml distiliuoto vandens su TFA, pH 2

5. Švirkšto džiovinimas 5 min džiovinama vakuumu 6. Norimų komponentų išplovimas 1ml 75% metanolio

Kietafazė ekstrakcija (KE) atliekama su „SUPELCO DPA-6S“ 3 ml, 250 g (JAV) šerdele. Tiriamieji analizuojami 3-ose kietafazės ekstrakcijos žingsniuose. Analizuojama: 1 išplova (po bandynio (grikių žolės ekstrakto) įleidimo), 2 išplova (po priemaišų išplovimo su TFA), 3 išplova (kai 75% metanoliu išplaunami norimi junginiai) (3 pav.).

2.5. Biologiškai aktyvių junginių kokybinis nustatymas

2.5.1. Flavonoidų kokybinis nustatymas

Cianidinė reakcija. Į 2 ml pasigamintos ištraukos įlašinama 5–7 lašai koncentruotos HCl ir pridedama 10–15 mg metalinio magnio arba cinko. Po 3–5 min atsiranda raudona, oranžinė ar rožinė spalva. Norint pagreitinti reakciją rekomenduojama mišinį pakaitinti 2–3 min verdančioje vandens vonelėje. Flavonolius, flavononus ir flavonus metalinis magnis, esant vandenilio chlorido rūgščiai, redukuoja iki antocianų, kurie suteikia jiems oranžinę ar raudoną spalvą. Chalkonai ir auronai, pridėjus koncentruotos vandenilio chlorido rūgšties (be magnio), nusidažo raudonai, nes susidaro oksonio druskos [47].

(29)

Reakcija su borato ir citrinos rūgštimis. Į 1–2 ml tiriamosios ištraukos įpilama toks pat tūris 1% borato ir 1% citrinos rūgščių tirpalo 96% etilo alkoholio mišinio (1:1). Susidaro ryškiai geltona spalva su gelsvai žalia fluorescencija. 5-oksiflavonai ir 5-oksiflavonoliai reaguoja su borato rūgštimi, esant citrinos rūgščiai. Sudaro ryškiai geltonos ar gelsvai žalsvos spalvos fluorescuojančius junginius [47].

Reakcija su amoniako tirpalu. Į 1 ml tiriamosios ištraukos įpilama keletas lašų amoniako tirpalo. Ištrauka šildoma. Atsiradusi geltona spalva šildant pereina į oranžinę ar raudoną. Flavonai, flavononai, flavonoliai ir flavononoliai su amoniako tirpalu nusidažo geltona spalva, kuri pereina į oranžinę arba raudoną [47].

Reakcija su baziniu švino acetatu. Į 1 ml tiriamosios ištraukos yra įlašinama 3–5 lašai 2% švino acetato tirpalo. Atsiradusi gelsvai oranžinė spalva rodo, kad tiriamojoje ištraukoje yra flavonoidų [47].

2.5.2. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje

Sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench.) žolės nuodžiūvis nustatytas laboratoriniu drėgmės analizatoriumi Presica HA 300. Atsveriama 1,00 g susmulkintos žolės, tada džiovinama 120°C temperatūroje iki pastovios masės. Atlikti trys matavimai ir apskaičiuotas gautų duomenų aritmetinis vidurkis bei standartinis nuokrypis.

2.5.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Paruoštuose sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench.) žolės ekstraktuose buvo nustatomas bendras flavonoidų kiekis, kuris perskaičiuojamas rutino ekvivalentu (RE). Įvertinami flavonoidų kiekio skirtumai tarp skirtingų grikių žolės ėminių.

Bendras flavonoidų kiekis yra nustatomas, taikant aliuminio chlorido reakciją. Tyrimui gaminamas reagentas iš 0,2 ml ekstrakto, skiedžiant jį su 2 ml 96% (v/v) etanolio, tada įpilama 0,1 ml 30% acto rūgšties, 0,3 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo (50 ml distiliuoto vandens, ištirpinti 5 g aliuminio chlorido miltelių) , 2 ml išgryninto vandens ir 0,4 ml 5% heksametilentetramino tirpalo (50 ml distiliuoto vandens, ištirpinti 2,5 g hekrametilentetramino miltelių ). Pasigamintas reakcijos

(30)

mišinys laikomas 30 minučių. Praėjus numatytam laikui, absorbcija matuojama spektrofotometru ties 407 nm bangos ilgiu ir lyginami gauti rezultatai su tuščiu mėginiu.

Tuščias mėginys tyrimui paruošiamas: 0,2 ml ekstrakto skiedžiant 2 ml 96% (v/v) etanoliu, įpilama 0,1 ml 30% acto rūgšties ir galiausiai praskiedžiama 2,7 ml išgryninto vandens.

Bendras flavonoidų kiekis nustatomas pagal rutino kalibracijos kreivę ir yra išreiškiamas mg/g. Visi tiriamieji ir palyginamasis tirpalai kalibracinės kreivės sudarymui ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis. Ruošiami skirtingų koncentracijų (0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1 mg/ml) rutino tirpalai. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5 šių skirtingų tirpalo koncentracijų (5 pav.).

Duomenys įvertinami atsižvelgiant į rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:

y = 0,7276x + 0,0909

R2 = 0,9991

y = absorbcijos dydis

x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu (mg/ml)

(31)

2.5.4. Kiekybiniam ir kokybiniam tyrimui taikytas efektyviosios skysčių

chromatografijos – masių spektrometrijos metodas

Bandymai atliekami naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodą (ESC–MS). Juo, kokybiškai ir kiekybiškai įvertinami gauti rezultatai. Flavonoidų analizei atlikti naudojami optimaliausiomis sąlygomis pagaminti etanoliniai tiriamųjų ekstraktai. Jie kokybiškai ir kiekybiškai nustatomi naudojantis „Waters Acquity UPLC“ chromatografu (Waters Corporation, Milford, JAV) bei fotodiodų matricos detektoriumi „Xevo TQD“ (6 pav.).

6 pav. Efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos metodui atlikti naudotas „Waters Acquity UPLC“ chromatografas bei fotodiodų matricos „Xevo

TQD“ detektorius.

Veikliųjų junginių atskyrimui naudota 100×2.0 mmL, 1,9 µm „“YMC – Triart C18 kolonėlė (YMC Europe GmbH, Vokietija). Analizės metu injekuota 50 µl tiriamojo tirpalo. Bendro flavonoidų kiekio nustatymui, analičių išplovimui taikyta gradientinė sistema: 0,1% (v/v) skruzdžių rūgšties tirpalas (A) ir acetonitrilas (B). Tėkmės greitis – 0,500 ml\min. Eliuacijos sąlygos nurodytos žemiau pateiktoje 5 lentelėje.

(32)

5 lentelė. ESC-MS metodui atlikti parinktos eliuacijos sąlygos

Laikas 0,1% (v/v) skruzdžių

rūgšties tirpalas (A) (%)

Acetonitrilas (B) (%) Pradžia 95,0 5,0 1 min 95,0 5,0 5 min 70,0 30,5 7 min 50,0 50,0 7,50 min 0,0 100,0 8,00 min 0,0 100,0 8,10 min 95,0 5,0 10,0 min 95,0 5,0

Sudarytos 5 flavonoidų: rutino, izokvercitrino, kvercitrino, kvercetino ir orientino kalibracinės kveivės, įvertinti standartinių tirpalų kalibracinių kveivių regresijos koficientai (R2_{) bei}

tiesinės regresijos lygtys. Visos jos pavaizduotos 6 lentelėje.

6 lentelė. Flavonoidų regresijos koficientai (R2_{) ir tiesinės regresijos lygtys}

Junginio pavadinimas Regresijos koficientas R2 _{Tiesinės regresijos lygtis}

Rutinas 0,997 y = 1690,74x + 349,09

Izokvercitrinas 0,996 y = 3406,09x - 296,74

Kvercitrinas 0,995 y = 2200,8x + 803,68

Kvercetinas 0,993 y = 2377,2x + 49523

Orientinas 0,997 y = 1568,7x -224,04

Gauti duomenys įvertinami pagal identifikuotų flavonoidų standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtis. Flavonoidų koncentracijos apskaičiuojamos pagal chromatografinių smailių plotus.

(33)

2.6. Statistinis duomenų įvertinimas

Gautų duomenų statistiniai įvetinimai atlikti „MS Excel 2013“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS 20“ (Čikaga, JAV) programomis. „MS Excel 2013“ programa skaičiuoti gautų duomenų matematiniai vidurkiai, nustatytos duomenų standartinės santykinės paklaidos (SNN). „SPSS 20“ programa įvertinta koreliacija (išreiškiama Spirmeno koreliacijos koficientu). Koficientu (r) išreiškiamas statistinio ryšio stiprumas, (p) koficientu - statistinis reikšmingumas.

(34)

3. REZULTATAI

3.1. Kokybinis flavonoidų nustatymas tiriamuosiuose objektuose

Flavonoidų kokybės testai atliekami su etanoliniais grikių žolės ekstraktais. Reakcijų metodikos aprašytos „2.5.1. Flavonoidų kokybinis nustatymas“.

1) Cianidinė reakcija:

Tiriamieji

„Smuglianka“ 2014 m derlius „Anika“ 2014 m derlius „Čanita“ 2014 m derlius „Žaleika“ 2014m derlius „Mara“ 2014 m derlius „Kvietka“ 2014 m derlius

Rezultatai

Iš karto atsirado oranžinė spalva Po 3 minučių atsirado švelniai oranžinė spalva Iš karto atsirado oranžinė spalva Po 3 minučių atsirado švelniai oranžinė spalva Po 3 minučių atsirado švelniai oranžinė spalva Iš karto atsirado oranžinė spalva

2) Reakcija su borato ir citrinos rūgštimis:

Tiriamieji

Rezultatai

Gelsvai žalsvos spalvos junginys Gelsvai žalsvos spalvos junginys Gelsvos spalvos junginys Gelsvos spalvos junginys Gelsvos spalvos junginys Švelniai gelsvos spalvos junginys

3) Reakcija su amoniako tirpalu:

Tiriamieji

Rezultatai

Geltona spalva, šildoma labai greitai perėjo į raudoną spalvą Atsiradusi geltona spalva, šildoma perėjo į oranžiniai raudoną spalvą Atsiradusi geltona spalva, šildoma perėjo į oranžiniai raudoną spalvą Atsiradusi geltona spalva, šildoma perėjo į oranžiniai raudoną spalvą Atsiradusi geltona spalva, šildoma perėjo į oranžiniai raudoną spalvą Geltona spalva, šildoma labai greitai perėjo į raudoną spalvą

(35)

4) Reakcija su baziniu švino acetate:

Tiriamieji

Rezultatai

Atsiradusi geltona spalva, po kelų sekundžių įgavo oranžinę spalvą Atsiradusi ryškiai geltona spalva, po kelių sekundžių įgavo oranžinę spalvą Geltonos spalvos tirpalas, po kelių sekundžių įgavo gelsvai oranžinę spalvą Geltonos spalvos tirpalas, po kelių sekundžių įgavo gelsvai oranžinę spalvą Atsiradusi ryškiai geltona spalva, po kelių sekundžių įgavo oranžinę spalvą Atsiradusi ryškiai geltona spalva, po kelių sekundžių įgavo oranžinę spalvą

Teigiamos kokybinės flavonoidų reakcijos rodo, kad visuose ištirtuose grikių žolės mėginiuose yra flavonoidų, dėl šios priežasties yra tikslinga ištirti sėjamajo grikio preparatų bendrą flavonoidų kiekį.

3.2. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis

Prieš atliekant sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench.) žolės ekstraktų gamybą ir tyrimą buvo įvertinta šios vaistinės augalinės žaliavos kokybė. Ji atliekama nustatant nuodžiūvį. Laboratoriniu drėgmės analizatoriumi “Presica HA 300” nustatytos sėjamųjų grikių žolės nuodžiūvis. Jis pateiktas 7-ame paveiksle.

(36)

7 pav. Sėjamųjų grikių žolės nuodžiūvio įvairavimai tiriamuosiuose mėginiuose (2014m. derliuje) (n=3)

Remiantis gautais tyrimų duomenimis matyti, jog sėjamųjų grikių žaliavos nuodžiūvis 2014 m derliaus žolėje kinta nuo 6,95% ± 0,07% („Čanita“) iki 8,00% ± 0,21% („Mara“). Europos farmakopėjoje esančiame 01/2008:2184 straipsnyje nurodyta, jog nuodžiūvis negali viršyti 10% ribos, todėl daroma išvada, jog tyrimui surinkta sėjamųjų grikių žaliava (grikių žolė) atitinka nuodžiūvio reikalavimus.

3.3. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Tinkamas ekstrakcijos metodo ir ekstrahento koncentracijos parinkimas užtikrina visos ekstrakcijos efektyvumą. Dėl to, tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas lemia, jog bandymų metu bus išgautas didžiausias ir tiksliausias flavonoidų kiekis. Tinkamiausios sąlygos yra parenkamos įvertinanus kelis skirtingus žaliavų paruošimo faktorius, tokius kaip: skirtinga tirpiklių koncentracija, ekstrakcijos laikas ir temperatūra.

7,82 7,02 6,95 7,55 8 7,7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 N uo dž iū vi s (% )

(37)

3.3.1. Tirpiklio koncentracijos parinkimas

Norint ištirti tirpiklio įtaka ekstrakcijos efektyvumui, bandymui atlikti naudojami skirtingų etanolinių koncentracijų tirpalai. Tyrimui atlikti pasirinktas atsitiktinis žaliavos mėginys iš kurio paruošti trys mėginiai. Eksperimentui pasirinktos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 96% etanolinės koncentracijos. Tyrimas atliekamas pasveriant 1 g (0,01 g tikslumu) grikių žolės žaliavos, užpilant ją 10 ml atitinkamos koncentracijos etanoliniu tirpalu ir ekstrakciją atliekant ultragarso vonelėje esant 40°C temperatūrai 10 minučių. Tiriamųjų tirpalų absorbcijos dydžiai matuoti spektrofotometru ties 407 nm bangos ilgiu, o išsiskyrusių flavonoidų kiekis skaičiuotas pagal rutiną (8 paveikslas). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 40 50 60 70 80 96

Bendras flavonoidų kiekis mg RE/g

Eta n o li o k o n ce n tr a cija (% )

8 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas naudojant skirtingos koncentracijos etanolį (n=3)

Remiantis gautais rezultatais nustatyta, jog mažiausia flavonoidų išeiga gauta tada, kai ekstrakcijos tirpikliu naudojamas 40% etanolis (16,60 ± 1,06 mg RE/g). Didžiausia išeiga gauta bandymą atliekant su 80% etanolio tirpalu (34,70 ± 0,07 mg RE/g). Tolimesniems tyrimams atlikti pasirinktas 80% etanolis, nes nustatytas didžiausias bendras flavonoidų kiekis. Gauti rezultatai panašūs į anksčiau atliktų mokslininkų darbus, kuriuose norint išekstrahuoti biologiškai aktyvius junginius iš grikių grūdų, bandymams atlikti taip pat buvo naudojamas 80% etanolinis tirpalas [48].

(38)

3.3.2. Ekstrakcijos laiko parinkimas

Tinkamiausiam ekstrakcijos laiko nustatymui naudojami grikių žolės bandyniai, kurie paruošiami naudojant 80% etanolio tirpalą. Pati ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje „Elmasonic P120 H“, (Vokietija). Bandymui pasirinktas atsitiktinis žaliavos mėginys, iš kurio paruošti trys mėginiai. Siekiant nustatyti tinkamiausią ekstrakcijos laiką, sėjamojo grikio žolės bandyniai ekstrahuojami pasirinkus skirtingus laiko intervalus, t.y. kas: 5, 10, 20, 30, 40, 45 minutes. Tyrimas atliekamas pasveriant 1 g (0,01 g tikslumu) grikių žolės, užpilant ją 10 ml 80% etanoliniu tirpalu. Ekstrakcija atliekama ultragarso vonelėje esant 40°C temperatūrai. Tiriamųjų tirpalų absorbcijos dydžiai matuoti spektrofotometru ties 407 nm bangos ilgiu, o išsiskyrusių flavonoidų kiekis skaičiuotas pagal rutiną (9 paveikslas).

0 10 20 30 40 50 60 5 10 20 30 40 45

Ek str ak cijo s tr uk m ė (m in .)

9 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas ekstrahuojant ultragarso vonelėje skirtingais laiko intervalais (n=3)

Iš lentelėje pateiktų duomenų matyti, jog ilginant ekstrakcijos laiką, išsiskyrusių flavonoidų kiekis didėjo nuo 5–os (24,80 ± 0,09 mg RE/g ) iki 30–os minutės (49,70 ± 0,35 mg RE/g). Būtent 30–ą minutę ir pasiektas didžiausias flavonoidų kiekis. Vėliau, nuo 40–os iki 45–os minutės matomas bendras flavonoidų kiekio sumažėjimas nuo 48,80 ± 1,90 mg RE/g iki 46,10 ± 1,09 mg RE/g. Tolimesniems bandymams pasirinkta naudoti ekstrakcija ultragarsu, kurios trukmė yra 30 minučių.

(39)

3.3.3. Ekstrakcijos temperatūros parinkimas

Tinkamiausia ekstrakcijos temperatūra parenkama ekstrahavus tiriamąją žaliavą ultragarso vonelėje, kurioje parenkamos skirtingos 40°C, 50°C, 60°C, 70°C ir 80°C temperatūros. Bandymui pasirinktas atsitiktinis žaliavos mėginys, iš kurio paruošti trys mėginiai. Tyrimas atliekamas pasveriant 1 g (0,01 g tikslumu) grikių žolės žaliavos, užpilant ją 10 ml 80% etanoliniu tirpalu ir ekstrahuojant 30 minučių ultragarso vonelėje. Tiriamųjų tirpalų absorbcijos dydžiai matuoti spektrofotometru ties 407 nm bangos ilgiu, o išsiskyrusių flavonoidų kiekis skaičiuotas pagal rutiną (10 paveikslas). 0 10 20 30 40 50 60 70 40 50 60 70 80

Te m pe ra tū ra 0 C

10 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas esant skirtingai temperatūrai (n=3)

Gauti rezultatai rodo, jog flavonoidų kiekis svyravo nuo 41,69 ± 1,05 mg RE\g iki 55,06 ± 1,48 mg RE/g . Didžiausias flavonoidų kiekis gautas ekstrakcijai naudojant 60°C temperatūrą. Būtent dėl to tolimesniems bandymams ir pasirinkta naudoti ekstrakciją ultragarsu, kurios temperatūra yra 60°C.

(40)

3.3.4. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas kokybiam ir kiekybiniam tyrimui

Toliau atlikinėjamiems kiekybiniams flavonoidų tyrimams atlikti pasirinktas efektyviausias ekstrakcijos metodas. Sąlygos nustatytos pagal tyrimo metu gautą didžiausią išeigą, todėl tolimesniems tyrimams pasirinktas tirpiklis - 80% etanolis. Jo imama po 10 ml kiekvienam ekstraktui, ekstrakcijos trukmė - 30 minučių, ekstrakcija atlikta 60°C temperatūroje. Kiekvienam tyrimui imta 1g (0,01 g tkslumu) augalinės žaliavos. Gautas ekstraktas centrifuguojamas 7 min 5000 rpm. Gautas centrifugatas nupilamas ir procesas kartojamas tris kartus užpilant po 3 ml, 3 ml, 4 ml ekstrahento (iš viso tyrimui paruošta 10 ml grikių žolės ekstrakto). Gautas ekstraktas filtruojamas per 0,45 μm švirkštinį filtrą, atliekami kiekybiniai ir kokybiniai tyrimai.

3.4. Bendras flavonoidų kiekio įvairavimas grikių žolės etanoliniuose

ekstraktuose naudojant reakciją su AlCl

3

11–ame paveiksle pavaizduoti gauti rezultatai ištyrus 2014 metų derliaus intensyvios žemdirbystės sistemos grikių žolės ekstraktus.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

„Smuglianka“ „Anika“ „Čanita“ „Žaleika“ „Mara“ „Kvietka“

B en dr as fla vo no id ų kiek is m g RE/g

Tiriamoji grikių žolės veislė

11 pav. Bendras flavonoidų kiekio įvairavimas skirtingos veislės grikių žolėje (n=3)

Bendras flavonoidų kiekis išreikštas RE mg/g. Flavonoidų kiekis 2014 metų derliaus tirtuose mėginiuose svyruoja nuo 45,17 ± 2,33 mg RE \g („Mara“) iki 81,20 ± 1,27 mg RE/g

(41)

(„Čanita“). Kiek didesnis flavonoidų kiekis, lyginant jį su gautu mažiausiu kiekiu „Mara“ veislės žolėje, gautas „Kvietka“ žolės mėginyje ir jis yra lygus 46,30 ± 1,30 mg RE/g. Labai panašūs flavonoidų kiekiai gauti tiriant „Smulglianka“, „Anika“ ir „Žaleika“ žaliavas. „Smuglianka“ žolėje rasta 60,60 ± 0,85 mg RE/g flavonoidų, „Anika“ veislėje rastas nedaug didesnis bendras flavonoidų kiekis (62,30 ± 2,80 mg RE/g). Lyginant šias tris veisles, didžiausias bendras flavonoidų kiekis rastas „Žaleika“ veislės tirtame mėginyje ir jis lygus 69,90 ± 0,07 mg RE/g. Gautiems rezultatams įvertinti apskaičiuotas bendras statistinis visų duomenų vidurkis. Jis lygus 60,91 mg RE/g. Palyginus gautą vidurkio rezultatą su didžiausiu (81,20 ± 1,27 mg RE/g) ir mažiausių (45,17 ± 2,33 mg RE/g) kiekiu rastu tiriamuosiuose grikių žolės ekstraktuose matomi aiškūs kiekybiniai svyravimai. Iš to daroma išvada, jog net auginant tiriamąsias žaliavas tomis pačiomis sąlygomis, bendras flavonoidų kiekis priklauso ir nuo skirtingos tiriamųjų veislės, kadangi bendras flavonoidų kiekis vyraujantis tarp visų šešių tirtų mėginių yra skirtingas.

3.5. Kiekybinis ir kokybinis flavonoidų nustatymas efektyviosios skysčių

chromatografijos – masių spektrometrijos metodu

ESC-MS metodo pagalba idetifikuoti ir kiekybiškai įvertinti flavonoidai. Atlikus tyrimą, aptikti ir kiekybiškai nustatyti penki skirtingi flavonoidai (rutinas, kvercitrinas, izokvercitrinas, kvercetinas, orientinas). 0 20 40 60 80 100 120

B en dr as fla vo no id ų kiek is m g/g

Rutinas Kvercitrinas

12 pav. Bendras flavonoidų (rutino, kvercitrino) kiekis atlikus efektyvųjį skyčių chromatografijos - masių spektrometrijos metodą

(42)

Iš 12 paveiksle pateiktų duomenų matyti, kad vyraujantis flavonoidas visuose grikių žolės tiriamuosiuose yra rutinas. Bendras viso aptikto rutino kiekio vidurkis - 95,34 mg\g. Didžiausias rutino kiekis aptiktas „Čanita“ veislės bandinyje ir jis siekia 102,27 mg\g. Tuo tarpu mažiausias kiekis rastas „Mara“ veislės mėginyje ir jis lygus 89,83 mg/g. Kituose tiriamuosiuose bendras rutino kiekis buvo labai panašus: „Smuglianka“ veislėje - 94,68 mg/g , „Anika“ - 96,37 mg/g , „Žaleika“ - 97,26 mg/g , „Kvietka“ – 91,60 mg/g. Vertinant nustatytą bendrą flavonoidų kiekį su gautais bendro rutino kiekio rezultatais statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p=0,242), tačiau nustatytas labai stiprus koreliacinis ryšys (R=0,986). Antras kiekybiškai didžiausias flavonoidas rastas mėginiuose – kvercitrinas. Bendras šio flavonoido vidurkis vertinant visas 6 veisles – 21,10 mg/g. Didžiausias kvercitrino kiekis aptiktas „Smuglianka“ veislės bandinyje ir siekia – 23,27 mg/g. Mažiausias kiekis kaip ir kiekybiškai vertinant rutiną, rastas „Mara“ veislės bandinyje - 18,56 mg/g. Palyginus bendrą šio flavonoido kiekį su gautu bendru visų flavonoidų kiekiu gauta vidutinio stiprumo koreliacija R=0,580.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

B endra s fla vo no idų k iek is m g/g

Kvercetinas Orientinas Izokvercitrinas

13 pav. Bendras flavonoidų (kvercetino, orientino, izokvercitrino) kiekis atlikus efektyvųjį skyčių chromatografijos - masių spektrometrijos metodą

Daug mažesni kiekybiškai įvertinti orientino, izokvercitrino, kvercetino kiekiai (13pav.). Kvercetino kiekis tiriamuosiuose bandiniuose svyruoja nuo 1,55 mg/g iki 1,89 mg/g. Didžiausias jo kiekis nustatytas „Čanita“ veislės bandinyje, mažiausias – „Mara“ veislės bandinyje. Bendras kvercitrino statistinis vidurkis vidurkis – 1,73 mg/g. Izokvercitrino kiekiai tiriamuosiuose svyruoja