LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Gediminas Liubomirskas
Lawsonia intracellularis epidemiologiniai ir
diagnostiniai tyrimai naminių gyvūnų populiacijose
Lawsonia intracellularis epidemiological and diagnostic
analysis in livestock populations
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Raimundas Lelešius
2 DARBAS ATLIKTAS LSMU VA MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS
INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Lawsonia intracellularis epidemiologiniai ir diagnostiniai tyrimai naminių gyvūnų populiacijose“.
1. Yra atliktas mano paties.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS LSMU VA MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
(parašas)
1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Aktualumas veterinarijoje ... 101.2. L. intracellularis atradimo istorija ... 11
1.3. Etiologija ... 11
1.4. L. intracellularis specifiškumas atskiroms gyvūnų rūšims ... 12
1.5. Patogenezė ... 12
1.6. Patologiniai pakitimai ... 13
1.7. Epidemiologija... 13
1.8. Klinikiniai požymiai ... 14
1.9. Klinikinės diagnostikos metodai ... 15
1.10. Laboratorinė diagnostika ... 16
1.11. Gydymas ... 17
1.12. Profilaktika... 18
2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 19
2.1. Epidemiologiniai tyrimai ... 20
2.2. Klinikiniai tyrimai ... 21
2.3. Molekulinės biologijos metodai – polimerazės grandininė reakcija ... 21
2.3.1. DNR išskyrimas ... 21
2.3.2. Lizdinė PGR ... 22
2.4. Statistiniai metodai ... 23
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 24
3.1. Epidemiologinių tyrimų rezultatai ... 24
3.2. Klinikinių tyrimų rezultatai ... 24
4
3.4. Šunų PGR tyrimų rezultatai ... 26
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32
IŠVADOS ... 35
PADĖKA ... 36
5
SANTRAUKA
Lawsonia intracellularis epidemiologiniai ir diagnostiniai tyrimai naminių gyvūnų populiacijose Gediminas Liubomirskas
Magistro baigiamasis darbas
Baigiamojo darbo tikslas – nustatyti L. intracellularis paplitimą skirtingo amžiaus grupių arklių ir šunų populiacijose, išanalizuoti sukėlėjų svarbą šių gyvūnų rūšių sveikatingumui. Darbo apimtis 42 lapai, juose 5 lentelės, 9 paveikslai, panaudota 70 literatūros šaltinių.
Literatūros apžvalgoje aprašoma sukėlėjo etiologija, svarbesni atradimo istorijos duomenys, specifiškumas atskiroms gyvūnų rūšims, patogenezė, sukeliamos patologijos, epidemiologija, svarbiausi klinikiniai požymiai ir klinikinės bei laboratorinės diagnostikos metodai. Pateikiami svarbiausi gydymo bei profilaktikos principai.
Tiriamasis darbas buvo vykdomas 2013 – 2015 metais, jo metu LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto laboratorijoje lizdinės PGR pagalba pirmą kartą atlikti arklių ir šunų fekalijų mėginių tyrimai Lawsonia intracellularis atžvilgiu. Bendraujant su veterinarijos specialistais buvo kaupiami epidemiologiniai duomenys siekiant išsiaiškinti galimus L. intracellularis užsikrėtimo kelius ir paplitimo mastą.
Tyrimui buvo surinkti 106 šunų ir 46 arklių fekalijų mėginiai. Visi tirti arkliai buvo sveiki, o šunys suskirstyti į sergančius virškinimo trakto ligomis ir sveikus. Atlikus lizdinę PGR buvo nustatyta 18 (17,0 proc.) teigiamų užsikrėtimo atvejų šunims ir 3 (6,5 proc.) atvejai arkliams. Bakterijos identifikuotos dviem dviejų metų eržilams ir vienai keturių metų kumelei. Šunims užsikrėtimas dažniau pasireiškė sergančių grupėje nuo 1,5 mėn. iki 5 mėn. Tyrimai parodė, kad sergantys virškinamojo trakto ligomis šunys L. intracellularis bakterijomis yra užsikrėtę dažniau (19,6 proc.), nei sveiki (14,0 proc.) , tačiau duomenys statistiškai nesiskyrė. Papildomai ištyrus L. intracellularis teigiamų šunų grupę šunų parvoviruso atžvilgiu buvo pastebėta, kad 4 iš 11 (36,4 proc.) mėginių buvo užkrėsta mišria L. intracellularis ir parvovirusine infekcija.
Raktažodžiai: Lawsonia intracellularis, proliferacinė enteropatija, polimerazės grandinės reakcija, paplitimas, epidemiologija.
6
SUMMARY
Lawsonia intracellularis epidemiological and diagnostic analysis in livestock populations Gediminas Liubomirskas
Master‘s Thesis
The aim of this study was to establish the prevalence of Lawsonia intracellularis in different age groups of horses and dogs and analyze the importance of this pathogen for animal wellness. The work has 42 pages, including 5 tables, 8 images, and 70 literature sources.
The literature overview describes etiology of L. intracellularis, important historical aspects, species specificity, pathogenesis, pathology, epidemiology, clinical and laboratory diagnosis, key components of prevention and therapy.
The research was carried out in Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Microbiology and virology institute. The investigation of dogs and horses with respect to L. intracellularis infection was performed for the first time in Lithuania. Important epidemiological data were collected from veterinary professionals in order to determinate possible prevalence of L. intracellularis infection.
106 dog and 46 equine fecal samples were collected in the whole investigation. All equines were clinically healthy and dogs were divided in two groups: with clinical signs of gastrointestinal problems (diarrhea) and without gastrointestinal disorders. By means of nested PCR method 18 (17.0 %) infected dogs and 3 (6.5 %) infected horses were found. L. intracellularis identified in two two-year stallion and in one four years mare. Dog infection occurred more frequently in the group from 1,5 months to 5 months. Studies have shown that dogs with gastrointestinal diseases are infected more often (19.6 %) than clinical healthy dogs (14.0 %). In addition, clinically affected and L. intracellularis positive dogs were examined for canine parvovirus infection and observed that 4 of 11 samples (36.4 %) were contaminated with a mixed L. intracellularis and canine parvovirus infection.
Key words: Lawsonia intracellularis, proliferative enteropathy, polymerase chain reaction, prevalence, epidemiology.
7
SANTRUMPOS
PE – proliferacinė enteropatija;
APE – arklių proliferacinė enteropatija; DNR – deoksiribonukleorūgštis;
PGR – polimerazės grandininė reakcija; PO – peroraliai;
į.v. – į veną;
RNase A – endoribonukleazė kurios paskirtis suskaidyti viengrandę DNR; dNTPs – deoksiribonukleotidtrifosfatas; dATP – deoksiadenozintrifosfatas; dGTP – deoksiguanozintrifosfatas; dCTP – deoksicitozintrifosfatas; dTTP – deoksitimidintrifosfatas; bp – bazinės poros; UV – ultravioletiniai spinduliai;
8
ĮVADAS
Lawsonia intracellularis – pasauliniu mastu žinomas žarnyno proliferacinės enteropatijos etiologinis faktorius. Nuo 1930 metų buvo manoma, kad šis susirgimas būdingas tik kiaulėms, tačiau jau 1983 – aisiais aprašomi pirmieji šunų susirgimai, o 1996 – aisiais laboratorijoje patvirtinta, kad liga užsikrečia ir arkliai. Nuo šio momento ligos protrūkiai pastebimi Šiaurės ir Pietų Amerikos, Didžiosios Britanijos, Čekijos, Šveicarijos, Australijos žirgynuose (1).
L. intracellularis yra viduląstelinis parazitas, todėl jos nepavyksta išauginti tradicinėse mitybinėse terpėse, tačiau galima kultivuoti ląstelių kultūrose. Lietuvoje proliferacinės enteropatijos laboratorinės diagnostikos tyrimai atliekami tik LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Iki šiol tyrimai buvo atliekami tik su kiaulių mėginiais. Čia užsikrėtimas L. intracellularis bakterijomis diagnozuojamas naudojant lizdinės PGR metodą. Institute eilę metų kaupiami duomenys apie kiaulių PE būdingus klinikinius požymius, epidemiologiją, patologinius – anatominius pakitimus. Tyrimų metu nustatomas įvairaus amžiaus sveikų ir sergančių kiaulių užsikrėtimas L. intracellularis, vertinamas gaištamumas, sergamumas, plitimo rizikos veiksniai įvairiuose ūkiuose bei kompleksuose (2). Tuo tarpu L. intracellularis paplitimas arklių ir šunų populiacijose Lietuvoje iki šiol nebuvo nustatytas. Todėl apie šių sukėlėjų paplitimą duomenų nėra. Susirgimui būdingas žarnų gleivinės sustorėjimas bei enterocitų proliferacija. Sergantys gyvūnai dažniausiai kenčia nuo silpno arba stipraus viduriavimo skystomis, nemalonaus kvapo išmatomis (3), yra vangesni, svoriu atsilieka nuo savo bendraamžių. Be kiaulių, arklių ir šunų L. intracellularis nustatoma daugeliui kitų gyvūnų rūšių: triušiams, beždžionėms, elniams, katėms, lapėms (4).
Didžiausią pavojų L. intracellularis kelia 6 – 7 mėnesių amžiaus atjunkytiems kumeliukams (5). Šunims ši liga pastebėta 3 savaičių bei 7 mėnesių amžiaus (6). Sergantiems gyvūnams būdingas bendras organizmo silpnumas, dehidratacija, viduriavimas. Gydymui skiriami intraląsteliniu veikimu pasižymintys antibiotikai, atstatomas skysčių ir elektrolitų balansas. Profilaktikos tikslais, siekiant išvengti ligos arkliams, naudojamos intrarektinės vakcinos (7), tuo tarpu apie šunų vakcinaciją mokslinėje literatūroje duomenų nėra.
9 Darbo tikslas
Nustatyti L. intracellularis paplitimą skirtingo amžiaus grupių arklių ir šunų populiacijose, išanalizuoti sukėlėjo svarbą šių gyvūnų rūšių sveikatingumui.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti arklių ir šunų epidemiologinius ir klinikinius tyrimus L. intracellularis atžvilgiu ir jų rezultatų analizę.
2. Nustatyti ir palyginti L. intracellularis paplitimą sveikų arklių ir sergančių virškinimo trakto ligomis bei sveikų šunų populiacijose pritaikant polimerazės grandinės reakcijos metodą.
10
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Aktualumas veterinarijoje
Lawsonia intracellularis yra gerai žinomas kiaulių patogenas, sukeliantis šios rūšies gyvūnams proliferacinę žarnyno enteropatiją (8). Istoriškai jau nuo 1990 – ųjų metų ši liga laikoma endemiška kiaulių ūkiuose, rečiau pasitaiko kitoms gyvūnų rūšims (9,10). Per pastaruosius 6 metus pasauliniu mastu yra aprašyta nemažai PE protrūkių žirgynuose laikomiems kumeliukams (11-13). Be to yra duomenų apie ligos pasireiškimą suaugusiam 3,5 metų arkliui (14). Daugiausia tyrimų šia linkme atliekama JAV, o remiantis Kentukio Universitetinės veterinarinės diagnostikos laboratorijos 2010 – 2013 metų duomenimis (1 pav.) teigiamų ligos atvejų kasmet daugėja. Tuo tarpu šis susirgimas Lietuvos veterinarijos gydytojams – arklių ligų specialistams nėra pažįstamas. Todėl jaunų arklių sergamumo ir gaištamumo priežastys dėl L. intracellularis gali būti nenustatytos, o sukėlėjų vaidmuo neįvertintas. Mūsų šalyje brangių žirgų laikoma vis daugiau, esant šiuolaikinės globalinės ekonomikos sąlygoms prekyba žirgais gali laisvai vystytis net ir tarpkontinentiniu lygmeniu, dėl šios priežasties į Lietuvą gali patekti didesnio patogeniškumo ir virulentiškumo L. Intracellularis padermės.
Moksliniuose tekstuose paminėti keli PE atvejai šunims. 1983 metais liga diagnozuota dviem vienos vados Dalmatinų veislės šuniukams, kurie nugaišo nuo intensyvaus viduriavimo ir vėmimo (15). Leblanc ir kt. (6) 1993 m. nustatė susirgimą 7 mėn. Biglių veislės patelei. Šunims liga dažniau pasireiškia sporadiškai ir iki šiol retai diagnozuojama, tačiau sergančiam šuniui sukelia sunkią žarnyno patologiją ir ne retai gaišimą (15). Be kiaulių, arklių ir šunų L. intracellularis diagnozuota ir daugeliui kitų rūšių gyvūnų: žiurkėnams, triušiams, lapėms, žiurkėms, avims, elniams, emu, stručiams, taip pat primatams (4). Nors liga gali sirgti beždžionės (Japonijos makakos), žmonėms susirgimas nenustatytas (16,17). Esant tokiai situacijai L. intracellularis sukeliama proliferacinė enteropatija pasauliniu mastu vis labiau pripažįstama kaip rimtą susirūpinimą kelianti liga (18,19).
11 1 pav. Arklių PE atvejai diagnozuoti JAV „Kentukio Universitetinėje veterinarinės
diagnostikos laboratorijoje“ 2010 – 2013 m.
(http://eqmedical.com/lawsonia-intracellularis-infections-foals-rise#. Prieiga per internetą 2016.01.08)
1.2. L. intracellularis atradimo istorija
Proliferacinė enteropatija pirmą kartą paminėta 1931 – aisiais metais, tuo metu liga buvo įvardijama kaip tik kiaulėms būdinga žarnų adenomatozė (4). Toliau atlikinėjant tyrimus su laboratoriniais žiurkėnais buvo pastebėta, kad L. intracellularis užsikrėtusių graužikų perianalinė zona dėl viduriavimo intensyviai sutepama skystomis išmatomis. Pagal šį požymį liga pavadinta „wet tail disease“ (20). Ankstyvą 1970 – ųjų pavasarį G.H.K. Lawson (21) analizuodamas kiaulių PE protrūkius Didžiojoje Britanijoje iškėlė hipotezę, kad sukėlėjas žarnų epitelio ląsteles pažeidžia iš pradžių į jas patekdamas iš išorės, t. y. turi būdingą savybę įsiskverbti į ląstelės vidų. Ši mokslininko mintis nebuvo įrodyta iki 1993 metų, kol bakteriją pavyko išskirti iš užsikrėtusių kiaulių žarnų epitelio ir pagausinti žiurkės žarnų epitelio ląstelių kultūroje (22,23). Išskirta bakterija buvo pavadinta Lawsonia intracellularis, jos atradėjo Dr. Lawson garbei. Bakterija užauginta ląstelių kultūroje nepasižymi epitelio proliferacinėmis savybėmis, todėl buvo atliekami in vivo tyrimai eksperimentiniu tikslu užkrečiant įvairias gyvūnų rūšis: peles, triušius, arklius (24-27). Įvertinus patologinius pakitimus žarnyne buvo patvirtinta, kad enterocitų proliferacija yra tiesiogiai susijusi su sukėlėjo patekimu į ląstelės vidų ir replikacija joje (28).
1.3. Etiologija
1995 metais L. intracellularis priskirta Desulfovibrionaceae šeimai (29). Tai Gram neigiama, neformuojanti sporų, lenktos formos, viduląstelinė bakterija. Jos yra 1,25 – 1,75µm ilgio ir 0,25 –
12 0,43µm pločio, apgaubtos trisluoksniu išoriniu dangalu (8). Bakterija turi vieną žiuželį, jo pagalba gali judėti ir penetruoti žarnyno epitelio ląsteles (3). L. intracellularis lokalizuojasi viršutinėje pažeistos ląstelės dalyje prie savęs tarsi pritraukdama ribosomas ir mitochondrijas (30). Ši bakterija gali augti tik mikroaerofilinėje aplinkoje (22,31). Paprastose mitybinėse terpėse šios bakterijos nepavyksta pagausinti dėl sudėtingų procesų susijusių su trifosfatų apykaita mitochondrijose (32). Aplinkoje esant 5 – 15°C temperatūrai gali išgyventi iki 2 savaičių (33).
1.4. L. intracellularis specifiškumas atskiroms gyvūnų rūšims
Atlikinėjant laboratorinius tyrimus buvo pastebėta, kad užkrėtus L. intracellularis tos pačios rūšies gyvūnus iš kurių buvo gauta patologinė medžiaga, klinikiniai ir patologiniai pakitimai pasireiškia žymiai stipriau nei užkrečiant skirtingų rūšių gyvūnus (34). Kumeliukus ir kiaules užkrėtus šioms rūšims specifiška L. intracellularis kultūra pastebėta, kad visais atvejais pasireiškia sunkesni klinikiniai požymiai: gyvūnai ilgesnį laiką platina bakterijas, susiformuoja stipresnis imuninis organizmo atsakas (35). Tame pačiame straipsnyje teigiama, kad eksperimento metu užkrėtus kumeliukus kiaulių PE specifiniais sukėlėjais, o kiaules arklių PE sukėlėjais, tipiški klinikiniai požymiai pasireiškia silpniau, imuninis atsakas ne toks ryškus kaip užkrėtus rūšiai būdinga L. intracellularis paderme. Pagal šiuos duomenis galima manyti, kad L. intracellularis pasižymi rūšiniu specifiškumu, tačiau kryžminis užsikrėtimas tarp skirtingų rūšių individų taip pat yra įmanomas. 2013 – aisiais metais atlikti eksperimentiniai tyrimai parodė, kad bakterija gali būti specifiška daugiau nei vienai gyvūnų rūšiai: užkrėtus triušius ir žiurkėnus kiaulių ir arklių izoliatais buvo pastebėta, kad triušiai imlesni infekcijai sukeltai specifiška arklių L. intracellularis paderme nei kiaulių, o žiurkėnai imlesni specifiškai kiaulių L. intracellularis padermei (4).
1.5. Patogenezė
Bakterijos alimentiniu keliu patekusios į organizmą keliauja į plonųjų žarnų kriptas, čia aptinkamos po 12 valandų (36). In vitro atlikti tyrimai rodo, kad tiesiogiai užkrėtus ląstelių kultūrą L. intracellularis bakterijomis jau po 10 minučių pastebėtas glaudus ląstelių ir bakterijų ryšys, o po 3 valandų bakterijos aptinkamos ląstelių citoplazmoje apgaubtos vakuolėmis (37). Ištrūkusios iš vakuolių bakterijos enterocito viduje dalijasi skildamos pusiau po 2 – 6 dienų nuo užsikrėtimo (36). In vivo bandymais nustatyta, kad enterocitų hiperplazijos požymiai histologiškai ir makroskopiškai pastebimi 10 – 12 dieną po užsikrėtimo (37). Iš gausiai užkrėstų epitelio ląstelių bakterijos pasišalina per specialią membraninę iškyšą, o patekusios ant žarnų epitelio paviršiaus užkrečia naujas ląsteles (36). L. intracellularis stabdo užsikrėtusių ląstelių diferenciaciją, dėl to sutrinka transmembraninių nešiklių funkcija, o maisto medžiagos lieka nepasisavinamos (38,39). Transmembraniniai nešikliai, kurie atsakingi už maisto medžiagų pasisavinimą dėstosi ant
13 enterocitų apikalinės membranos kuri yra labiausiai pažeidžiama L. intracellularis bakterijų (39). Dėl šios priežasties užsikrėtusiems gyvūnams krenta svoris, mažėja paros priesvoris, būdingas bendras organizmo funkcijų susilpnėjimas (40).
1.6. Patologiniai pakitimai
Pažeidimai sukelti šio patogeno dažniausiai pastebimi klubinės žarnos pabaigoje, kartais storajame žarnyne (35). Pažeistoms žarnoms būdinga serozinio dangalo edema, nekrotizuoto audinio bei tirštų gleivių kaupimasis žarnos spindyje. Pažeisto epitelio ląstelės padidėja ir pailgėja. Bakterijos pastebimos viršutinėje pažeistos ląstelės citoplazmos dalyje (41). Sergantiems gyvūnams padaugėja besidalinančių žarnų epitelinių ląstelių skaičius, o sumažėja tauriškųjų ląstelių skaičius (4). Riba tarp nepažeistos ir pažeistos žarnos dalies aiškiai pastebima. Vyresnio amžiaus gyvūnai yra labiau linkę į hemoraginę proliferacinę enteropatiją nei jaunesni. Arkliams ir šunims kaip ir kiaulėms L. intracellularis pažeidžia žarnų kriptose esančias epitelio ląsteles, paspartėja jų mitotinis dauginimasis, todėl dažniausiai pasireiškia klubinės žarnos gleivinės hiperplazija (15,18). Šie pasikeitimai sąlygoja sumažėjusį absorbcinį pajėgumą bei susijusius klinikinius požymius.
1.7. Epidemiologija
Epidemiologiniai PE aspektai kiaulininkystės industrijoje yra ypač gerai išanalizuoti lyginant su žirgininkystės sektoriumi, nes dėl šios ligos kiaulių augintojai patiria didelius ekonominius nuostolius (2). L. intracellularis plitimui kiaulių kompleksuose yra palankios sąlygos, nes kiaulės, skirtingai nei arkliai, laikomos labai koncentruotai, todėl viena platinanti bakterijas kiaulė gali užkrėsti visus kitus garde laikomu individus. Be to subklinikine ligos forma sergančios kiaulės be pastebimų požymių gali platinti sukėlėją ir užkrėsti kartu laikomas kiaules (42). Nors JAV mokslininkai nustatė, kad atjunkyti kumeliukai taip pat gali platinti sukėlėją su išmatomis be būdingos ligai simptomatikos (43), tačiau nėra tyrimų patvirtinančių subklinikinės ligos įtaką L. intracellularis plitimui, nes iš esmės skiriasi kiaulių ir arklių laikymo technologijos.
Arkliams pirmieji ligos požymiai pasireiškia vėlyvą rudenį – žiemos pradžioje, kai kumeliukai būna 4 – 9 mėnesių amžiaus (44). Šiaurės Amerikoje PE dažniausiai diagnozuojama nuo rugpjūčio iki sausio mėnesio (5). Šio amžiaus kumeliukams ligos pasireiškimas JAV užfiksuotas ir sporadiškai ir protrūkio forma (12).
Ypač svarbiu veiksniu ligos pasireiškimui laikomas atjunkymas, nes tuo metu sumažėja motininių antikūnų titras. JAV žirgynuose kumeliukai atjunkomi 4 – 6 mėn. amžiaus. Šiuo laikotarpiu patirtas stresas, vakcinacija, dehelmintizacija yra pagrindiniai veiksniai mažinantys organizmo atsparumą ir didinantys užsikrėtimo galimybę.
14 Arkliams liga plinta kaip ir daugelis parazitinių ligų – fekaliniu – oraliniu keliu, per užterštą pašarą bei geriamą vandenį (32). Šis teiginys grindžiamas JAV atliktais moksliniais tyrimais, kurių metu eksperimentiniu tikslu užkrėsti kumeliukai patalpinti į gardus kartu su sveikais kumeliukais, o serologinių tyrimų metu, buvo nustatyti specifiniai antikūnai susidarę prieš L. intracellularis sveikų kumeliukų kraujyje. Tokiu būdu bandyta pagrįsti sukėlėjo plitimą alimentiniu keliu (34). Pusterla N. ir Gebhart J. (45) atliko tyrimą ir nustatė, kad atjunkyti kumeliukai susirgo PE šeriant juos šienu užterštu triušių išmatomis, kuriose buvo L. intracellularis bakterijų. Šie mokslininkų rezultatai rodo, kad kumeliukai gali užsikrėsti per kumelės išmatas arba po kontakto su L. intracellularis bakterijas nešiojančiais kitos rūšies gyvūnais (1,4).
Žiurkės ir kiti graužikai taip pat yra potencialūs sukėlėjų nešiotojai. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad endeminiuose kiaulių kompleksuose besiveisiančios žiurkės gali platinti iki 1010 L.
intracellularis bakterijų kiekviename grame išmatų (46). Eksperimentiniu būdu buvo nustatyta, kad vienai kiaulei sukelti klinikinį ligos pasireiškimą pakanka 105 bakterijų, o sukelti ligą arkliui – 1010 bakterijų (47).
Šunims būdingi sporadiniai ligos pasireiškimo atvejai. Bakterijomis užsikrečia alimentiniu keliu nuo sukėlėją nešiojančių individų, tačiau neatmetamas ir užsikrėtimas per apyvokos daiktus, nes bakterija aplinkoje gali išlikti iki dviejų savaičių (35). Kaimo vietovėse laikomi šunys gali turėti tiesioginį kontaktą su sergančių ar užsikrėtusių L. intracellularis kiaulių išmatomis. Medžioklei naudojami šunys patiria riziką kontaktuoti su užsikrėtusių šernų bei kitų laukinių gyvūnų išmatomis, dėl šio priežasties taip pat galimas užsikrėtimas (48). Mieste laikomus šunis šeimininkai vedžioja parkuose, daugiabučių bei gyvenamųjų namų apylinkėse. Ne retai šunys atitrūksta nuo šeimininkų ir smalsumo vedami uosto kitų šunų paliktas išmatas, kurios gali būti užkrėstos L. intracellularis bakterijomis. Esant tokiam užsikrėtimo modeliui apie bakterijos plitimo mastą galima tik spėti.
1.8. Klinikiniai požymiai
Tipiniai APE sukeltos L. intracellularis požymiai yra pilvinė edema, kuri pasireiškia 81 proc. visų atvejų (49). Edema gali pasireikšti kaip menkas pabrinkimas gerklės ar krūtinės srityje, arba masyvus audinių skysčių susikaupimas krūtinės, pilvo bei mašnelės srityje. Lengvas arba gausus viduriavimas pasireiškia 26 proc. užsikrėtusių arklių (49). Esant lengvai ligos eigai dehidratacija nepastebima, tačiau esant gausiam viduriavimui atsiranda elektrolitų, rūgščių bei šarmų disbalansas bei azotemija. Išoriškai pastebimas kūno svorio sumažėjimas, karščiavimas (>38,5° C), apatiškumas, diegliai, padidėjusi pilvo apimtis, pasišiaušęs kailis.
Užsikrėtę arkliai trumpai platina bakterijas 7 – 21 d. po užsikrėtimo, lyginant su kiaulėmis kurios į aplinką L intracellularis po užsikrėtimo išskiria iki 4 mėnesių (50). Ryškiausias pažeidimas
15 stebimas visoms imlioms L. intracellularis gyvūnų rūšims yra apibūdinamas kaip žarnų kriptose esančių epitelinių ląstelių hiperplazija (4). Taip liga apibūdinama remiantis aptiktais patologiniais – anatominiais požymiais skrodžiant gyvūnus po mirties. Plika akimi matomi hiperplazijos pažeidimai dažniausiai randami užpakalinėje plonosios žarnos dalyje, tačiau kartais pastebimi priekinėje ir vidurinėje tuščiosios žarnos dalyje, aklojoje bei proksimalinėje gaubiančiosios žarnos dalyje. Kraujo ir fibrino krešuliai kartais gali būti randami žarnų gleivinės paviršiuje (51). Ūmių ligos atvejų metu visoms gyvūnų rūšims stebimas žarnų gleivinės sustorėjimas, proliferacinių procesų plėtimasis bei staigus klinikinės būklės pablogėjimas, kuris neretai baigiasi mirtimi (4). Kumeliukams kaip ir kiaulėms gali pasitaikyti subklinikinė ligos eiga, kai užsikrėtęs individas su išmatomis platina bakterijas be charakteringų požymių, tačiau laikinai sumažėja kraujo serumo proteinų koncentracija bei pastebimas sumažėjęs dienos priesvoris lyginant su sveikais kumeliukais (34).
Šunims dažniausiai būdingas viduriavimas skystomis gelsvai žalsvomis nemalonaus kvapo išmatomis. Gali pasireikšti polifagija, pilvo pūtimas, nevalingas tuštinimasis (52). Atliekant ultragarsinį tyrimą dažniausiai nustatomas tuščiosios žarnos sienelės sustorėjimas, pagreitėjusi virškinamojo trakto peristaltika. Tačiau simptomai nespecifiniai ir remiantis klinikiniais požymiais negalima atskirti L. intracellularis nuo kitų virškinimo trakto susirgimų įtakotų tokių patogenų kaip rotavirusų, parvovirusų, koronavirusų, cirkovirusų, E. coli. (53).
1.9. Klinikinės diagnostikos metodai
Užsikrėtusiems arkliams būdingiausi klinikiniai požymiai yra viduriavimas, letargija, anoreksija, padidėjusi kūno temperatūra (41,0°C), periferinė poodinio audinio edema, sumažėjęs paros priesvoris, diegliai (4). Tiksliai diferencinei diagnostikai svarbu įvertinti kitas galimas virškinimo trakto sutrikimų priežastis: parazitozės, bakterinės infekcijos (Clostridium spp., Salmonella spp., Rhodococcus equi), rotavirusinė infekcija, koronavirusinė infekcija, skrandžio opaligė, žarnyno obstrukcija (54).
Diagnostinę reikšmę klinikinių atvejų metu turi ultragarsinis tyrimas. Jo pagalba sergantiems arkliams ir šunims galima vizualiai pamatyti ir įvertinti sustandėjusias žarnų sieneles (19). Jei plonosios žarnos sienelės storis didesnis nei 3 – 4 mm, gaubtinės 4 – 5 mm, nustatomas žarnų sienelės sustorėjimas (35). Yra atvejis kai kumeliukui buvo nustatyta APE, tačiau ultragarsu ištyrus plonąsias žarnas nebuvo pastebėtas jų sienelės sustorėjimas (5). Todėl šis tyrimo metodas nėra specifinis ir ne visais atvejais pasiteisina, tačiau praktinis panaudojimas yra įmanomas.
Žirgininkystės praktikoje informatyvus tačiau brangus yra hipoalbuminemijos bei hipoproteinemijos rodiklių įvertinimas (4). Sergantiems arkliams bendrųjų baltymų kiekis dažniausiai krenta žemiau 5,0 g/dl ribos, kai norma yra laikoma 5,7 – 7,9 g/dl, o albuminų
16 koncentracija krenta žemiau 2,0 g/dl, kai norma yra 2,5 – 3,8 g/dl (54). Hipoalbuminemiją mokslininkai grindžia sumažėjusiu pašarų suvartojimu, jų pasisavinimo nekokybiškumu virškinimo trakte, proliferaciniais pakitimais žarnyne (55). Nors šis tyrimas nėra specifinis ir gali rodyti hipoproteinemiją bei hipoalbuminemiją esant inkstų ligoms, storųjų žarnų uždegimui, salmoneliozei, tačiau leidžia gydytojui laiku pastebėti biocheminių parametrų pakitimus ir numatyti tolimesnį terapijos planą (47).
1.10. Laboratorinė diagnostika
L. intracellularis infekcijai diagnozuoti taikomi serologiniai tyrimai pagrįsti specifinių antikūnų nustatymu kraujo serume, bei molekulinės biologijos tyrimo metodas – polimerazės grandinės reakcija (PGR). Serologiniams tyrimams kraujas imamas iš gyvų, kliniškai sveikų ar sergančių gyvūnų, o specifinių antikūnų nustatymu remiamasi diagnozuojant užsikrėtimą suaugusiems arkliams (47). PGR tyrimams medžiaga gali būti imama iš kliniškai sveikų, sergančių arba nugaišusių gyvūnų. Dažniausiai tiriamos gyvo gyvūno fekalijos arba imamas nugaišusio gyvūno plonosios žarnos gabaliukas su specifinės patologijos požymiais. Esminis skirtumas tarp šių laboratorinėmis sąlygomis atliekamų diagnostinių tyrimų yra tai, kad serologijos pagalba nustatomi antikūnai rodantys gyvūno praeityje buvusį kontaktą su L. intracellularis, nors klinikiniai požymiai jam galėjo nepasireikšti, o PGR analizės pagalba galima nustatyti sukėlėjo platinimą esamu momentu (4,35).
Šią bakteriją galima identifikuoti atlikus patologinės medžiagos (žarnų epitelio skutmenų) dažymą Warthin – Starry dažymo metodu. (56). Audinio gabalėlis gali būti paimamas po gyvūno mirties arba atliekant biopsiją diagnostinės laparatomijos pagalba iš klubinės, tuščiosios arba gaubtinės žarnos. Paruoštame preparate matomos tamsios lazdelės formos bakterijos.
Atliekant imunohistocheminius tyrimus naudojami specifiniai L. intracellularis identifikacijai reikalingi antikūnai, ši technologija pastaruoju metu laikoma „auksiniu standartu“ atliekant patologinės medžiagos tyrimus po gyvūno mirties (57).
Naujausių mokslinių tyrimų duomenimis L. intracellularis diagnostikoje yra pritaikyta realaus laiko kilpinė izoterminė amplifikacija (Real – time loop – mediated isothermal amplification) (58). Šis metodas įvardijamas kaip alternatyva realaus laiko PGR tyrimui, jis yra daug pigesnis, bet nenusileidžia savo rezultatų kokybe PGR. Šio naujo molekulinės biologijos metodo esmė yra tiriamos DNR sekos pagausinimas specialiai parinktų pradmenų ir polimerazės pagalba, o rezultatai vertinami pagal reakcijos metu susidariusį tiriamo mėginio drumstumą (59). Tyrimo duomenimis šis metodas 10 kartų jautresnis nei realaus laiko PGR ir net 100 kartų jautresnis nei paprastoji PGR (58).
17
1.11. Gydymas
Pagrindinis gydymo tikslas yra sunaikinti sukėlėją ir užtikrinti organizmo homeostazę palaikant bendras organizmo funkcijas. L. intracellularis eliminacijai yra būtini antibiotikai pasižymintys viduląsteliniu veikimu (11). Arkliams kaip pasirinkimą galima naudoti makrolidus – eritromiciną – 25mg/kg, duoti PO kas 8 valandas derinant su rifampinu – 10mg/kg PO kas 12 – 24 valandas. Taip gydoma mažiausiai 3 savaites (60). Taip pat tinka azitromicinas, klaritromicinas. Teigiamų rezultatų duoda gydymas oksitetraciklinu dozė: 6,6 mg/kg į.v. kas 12 valandų. Taip gydoma 7 dienas, po to naudojamas doksiciklinas dozė: 10mg/kg PO kas 12 valandų 8 –17 dienų iš eilės (11). Siekiant išvengti antibiotikų sukelto viduriavimo makrolidai turėtų būti skiriami žindantiems kumeliukams sveriantiems 150 – 200 kg. Siekiant išvengti karščio šoko gydymo metu kumeliukai turėtų būti laikomi toliau nuo tiesioginių saulės spindulių bent savaitę po gydymo.
Tetraciklinai pasižymi nefrotoksiškumu, todėl būtinas paciento stebėjimas siekiant išvengti sindromų susijusių su inkstų nepakankamumu. Oksitetraciklinas kraujyje susijungia su albuminais, taigi esant hipoalbuminemijai šio antibiotiko kiekis kraujyje padidėja ir taip pat pasireiškia nefrotoksiškumas. Oksitetracikliną rekomenduojama leisti lėtai į veną, kad nesusidarytų chelatiniai ryšia su kalciu (61). Doksicikliną patogu sušerti, tačiau sumažėja jo pasisavinamumas. Chloramfenikolis gali sukelti arba paaštrinti enterokolitą, todėl svarbu atkreipti dėmesį į išmatų konsistenciją.
Tinkamiausias antimikrobinių medžiagų naudojimo laikas nėra nustatytas, jis priklauso nuo kiekvieno atvejo sunkumo. Nutraukti antibiotikų kursą galima tada, kai nelieka klinikinių požymių : viduriavimo, karščiavimo, apatiškumo, išmatose nebenustatoma sukėlėjo DNR. Užsikrėtusiam arkliui pasveikti ir pasiekti buvusį kūno svorį gali prireikti kelių mėnesių. Yra aprašytas atvejis kai kumeliukas sirgęs APE po 6 mėnesių terapijos visiškai pasveiko, o kūno svoris atsistatė į normos ribas (62).
Koloidinių skysčių terapija yra vienas iš pagrindinių komponentų gydant arklį nuo hipoalbuminemijos sukeltos L. intracellularis (61). Dažniausiai rekomenduojama jeigu bendrųjų baltymų kiekis sumažėja iki 3,5 mg/dl (63). Šie tirpalai yra didelio molekulinio tankio, todėl sunkiai praeina pro kraujagyslių membranas. Tirpalai stabilizuoja kraujo plazmos onkotinį slėgį, gerina kapiliarų perfuziją, didina kraujagyslių tūrį, nedidina edemos, ką savo ruožtu sukelia elektrolitų tirpalai. Šiai terapijai naudojama kraujo plazma, lėtai į veną leidžiant 20 ml/kg dozę (61). Atliekant šią procedūrą reikia stebėti arklio širdies ritmą, nes pasitaiko tachikardija, gali vystytis kvėpavimo sistemos nepakankamumas, diegliai. Atsiradę nepalankūs simptomai gali rodyti alerginę reakcija prieš svetimą kraujo plazmą, tokiu atveju būtina stabdyti procedūrą ir pagal esamą situaciją taikyti simptominę terapiją. Hidroksietilkrakmolas naudojamas kaip sintetinis koloidinis tirpalas. Dozė:
18 10ml/kg į veną kas 48 valandas (61). Šis preparatas mažina periferinę ir žarnų edemą, tačiau gali sukelti koaguliopatiją dėl sumažėjusio von Willebrand faktoriaus VIII koncentracijos, todėl geriau naudoti kraujo plazmos ir hidroksietilkrakmolo kombinacijas (60).
Siekiant išvengti dehidratacijos, elektrolitų disbalanso, azotemijos taikoma palaikomoji terapija elektrolitų tirpalais. Sergantiems gyvūnams dažnai pasitaiko metabolinė acidozė dėl bikarbonatų netekimo per virškinamąjį traktą. Tokiems gyvūnams peroraliai arba į veną reikia papildomai skirti natrio hidrokarbonato (61). Dėl skysčių netekimo viduriuojant arkliai dehidratuoja, gali išsivystyti azotemija, dėl šios priežasties reikia atlikti kraujo serumo kreatinino ir šlapalo biocheminius tyrimus. Taip pat parenteriniu būdu rekomenduojama skirti gyvūnui preparatų su amino rūgštimis, siekiant pagerinti kepenų veiklą.
1.12. Profilaktika
Pridisponuojančiu PE faktoriumi kumeliukams yra laikomas atjunkymas, kadangi patiriamo streso metu organizmo apsauginės funkcijos silpnėja. Parazitozės bei kiti antriniai susirgimai taip pat silpnina kumeliuko organizmą ir natūraliai sudaro tinkamas sąlygas pasireikšti ligai. Daugelyje literatūros šaltinių rekomenduojama pirmiausia iki minimumo sumažinti stresines situacijas bei pasirūpinti tinkamais dehelmintizacijos protokolais (64). Kumeliukams rekomenduojama 1 – 2 kartus per mėnesį profilaktiškai atlikti bendrąjį klinikinį tyrimą, nustatinėti bendrųjų baltymų koncentraciją kraujyje. Duomenys apie kumeliukų sveikatingumą bei svorį turėtų būti kaupiami ir reikalui esant lyginami su ankstesnių mėnesių rezultatais. Svarbu anksti pastebėti būdingus ligai požymius ir atskirti sergančius gyvūnus nuo sveikų. Pagal biosaugos reikalavimus reikia taikyti kenkėjiškų vabzdžių bei graužikų naikinimo programas, palaikyti švarą pašarų laikymo vietose ir neleisti ten patekti laukiniams gyvūnams. Apsisaugoti nuo šios ligos galima naudojant avirulentišką gyvą L. intracellularis vakciną (7). Vakcinacija arkliams atliekama taikant specialų protokolą: 30 ml liofilizuotos arba atvėsintos vakcinos suleidžiama 2 kartus į tiesiosios žarnos spindį, kas 30 dienų. Po vakcinacijos kumeliukams buvo pastebėtas bakterijų platinimas su išmatomis iki 12 dienų (64). JAV atlikti tyrimai rodo, kad vakcinuoti kumeliukai pasižymi didesniu paros priesvoriu, lyginant su nevakcinuotais, o ligos pasireiškimo tikimybė sumažinama iki minimumo (65).
Šunims apsaugoti nuo L. intracellularis vakcinos nėra, tačiau remiantis epidemiologiniu sukėlėjo plitimo modeliu didžiausia rizika patiriama dėl šunų šeimininkų sąmoningumo stokos. Mieste gyvenantys ir šunis laikantys žmones pavedžioję savo augintinį ne visada susirenka paliktas išmatas, o tai yra potencialus užsikrėtimo šaltinis kitiems šunims. Siekiant iki minimumo sumažinti užsikrėtimo riziką augintinį rekomenduotina vedžioti nuošalesnėje vietoje, užtikrinti, kad šuo neatitrūktų nuo šeimininko ir neturėtų galimybės kontaktuoti su kitų šunų išmatomis.
19
2.
TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
Darbas vykdytas 2013 – 2015 metais. Laboratoriniai tyrimai atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute. L. intracellularis paplitimo arklių ir šunų populiacijose įvertinimui paimti ir lizdinės PGR metodu įvertinti 46 arklių ir 106 sveikų bei sergančių virškinamojo trakto ligomis šunų fekalijų mėginiai.
Arklių fekalijų mėginiai surinkti iš stambaus Utenoje esančio žirgyno (n=35), bei LSMU VA stambiųjų gyvūnų klinikoje buvusių pacientų (n=11) 2015 m. birželio – lapkričio mėnesiais. Visi 46 sveikų arklių fekalijų mėginiai surinkti laikymo vietose.
Sergančių įvairaus amžiaus šunų mėginiai surinkti dviejose Kauno veterinarijos gydyklose. Gyvūnų išmatų mėginiai prisilaikant sterilumo principų buvo imami iš analinės angos. Iš viso paimti 56 fekalijų mėginiai. Sveikų įvairaus amžiaus šunų fekalijų mėginiai buvo surinkti Kauno, Prienų, Trakų bei Kėdainių rajonuose iš lauke laikomų šunų. Iš viso paimti 50 kliniškai sveikų šunų fekalijų mėginiai vienuolikoje gyvenviečių. Surinkti mėginiai buvo laikomi +4°C šaltkrepšyje, o pristačius į laboratoriją užšaldyti – 20°C temperatūroje ir laikyti iki tyrimo. Detalūs mėginių paėmimo duomenys pateikti pirmoje ir antroje lentelėse.
1 lentelė. Fekalijų mėginių ėmimas iš arklių.
Amžius Sveiki arkliai
2 mėn. 4 3 mėn. 1 1 m. 2 2 m. 14 3 m. 7 4 m. 7 5 m. 5 6 m. 1 7 m. 4 8 m. 1 Iš viso 46
20 2 lentelė. Fekalijų mėginių ėmimas iš šunų
Amžius Klinikinė būklė Sveiki Sergantys 1,5 mėn 0 8 2 mėn. 0 7 2,5 mėn 0 2 3 mėn. 0 5 4 mėn. 0 9 5 mėn. 0 3 6 mėn. 1 3 7 mėn. 0 1 8 mėn. 1 1 9 mėn. 0 1 1 m. 2 4 2 m. 3 9 3 m. 7 1 4 m. 7 1 5 m. 3 1 6 m. 4 0 7 m. 1 0 8 m. 5 0 10 m. 4 0 11 m. 3 0 12 m. 6 0 14 m. 1 0 17 m. 1 0 18 m. 1 0 Iš viso 50 56
2.1. Epidemiologiniai tyrimai
Apie arklių virškinimo trakto susirgimus, jų dažnumą, PE pasireiškimą kumeliukams buvo apklausiami veterinarijos gydytojai – arklių ligų specialistai. Šio tyrimo metu buvo kreipiamas
21 dėmesys į sveikus ir virškinimo trakto ligomis sergančius gyvūnus, kokie simptomai pasireiškia užsikrėtusiems L. intracellularis arkliams. Domėtasi retrospektyviais žirgyno duomenimis apie virškinimo trakto ligų pasireiškimo dažnumą, kokios profilaktikos priemonės ir gydymas taikytas. Domėtasi ar sergantys gyvūnai turėjo kontaktą su galimais ligos nešiotojais. Kokie laboratoriniai diagnostiniai tyrimai buvo atliekami siekiant nustatyti užsikrėtimą.
Šunų fekalijų mėginiai paimti esant virškinimo trakto sutrikimams (enteritas, helmintozės, pirmuonių sukelti sutrikimai, apsinuodijimas, pašaro netoleravimas). Domėtasi kokiu pašaru šeriami šunys, kokiomis sąlygomis laikomi, ar turi kontaktą su ūkiniais gyvūnais: kiaulėmis, arkliais.
2.2. Klinikiniai tyrimai
Prieš imant fekalijų mėginius iš gyvūnų pirmiausia buvo įvertinta jų klinikinė būklė. Atlikti bendrieji klinikiniai tyrimai siekiant atskirti sveikus individus nuo sergančių ( termometrija, odos elastingumo tyrimas, gleivinių apžiūra, įmitimo įvertinimas). Esant viduriavimui buvo vertinamos išmatos, jų turinys, spalva, konsistencija, priemaišos.
Klinikinių tyrimų metu fekalijų mėginiai buvo paimti iš kliniškai sveikų arklių ir kliniškai sveikų bei sergančių šunų, siekiant nustatyti L. intracellularis paplitimą šių gyvūnų rūšyse. Mėginiai buvo imami arklių ir šunų laikymo vietoje iškart po klinikinio tyrimo.
2.3. Molekulinės biologijos metodai – polimerazės grandininė reakcija
2.3.1. DNR išskyrimasDNR išskyrimas atliktas panaudojant DNR išskyrimo rinkinį – GeneJET Genomic DNA Purification Kit (kat. nr. K0721, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva). Pagal rinkinio gamintojų rekomendacijas pritaikytas DNR išskyrimo A protokolas.
Ši procedūra buvo atliekama pagal instrukciją. Į GeneJET 1,5 ml mėgintuvėlį įdedama 20 mg tiriamojo mėginio, užpilama 180 µl specialaus virškinamojo tirpalo ir 20 µl proteinazės K tirpalo. Šis mišinys maišomas iki vienalytės masės. Tada mėgintuvėliai patalpinami į termokratyklę 15 min prie 56°C temperatūros. Praėjus nustatytam laikui mėginiai išimami ir į mišinį įdedama 20 µl RNase A tirpalo, viskas išmaišoma ir 10 min. inkubuojama kambario temperatūroje. Į mišinį pridedama 200 µl lizuojančio tirpalo, maišoma 15 s. iki homogeninio mišinio susidarymo. Į mėgintuvėlį patalpinama 400 µl 50 proc. etilo alkoholio ir maišoma. Gautas mišinys perkeliamas į „GeneJET Genomic DNA purification“ rinkinio mėgintuvėlius sudarytus iš dviejų atskirų mėgintuvėlių, kuriuos skiria specialus filtras. Mėgintuvėliai centrifuguojami 1 min. 6000 x g. Apatinė mėgintuvėlio dalis su prasifiltravusiu mišinių išmetama, o viršutinė dalis su filtru
22 patalpinama į naują 2 ml surenkamąjį mėgintuvėlį. Ant viršaus užpilama 500 µl praplovimui skirto buferinio tirpalo ir centrifuguojama 1 min 8000 x g. Nufiltruotas mišinys su surenkamuoju mėgintuvėliu išmetamas, ant viršutinės mėgintuvėlio dalies užpilama 500 µl antrojo plovimui skirto buferinio tirpalo, centrifuguojama 3 min. 12000 x g. Po to viršutinė mėgintuvėlio dalis perkeliama į naują 1,5 ml mėgintuvėlį. Į mėgintuvėlį įlašinama 200 µl specialaus DNR išplovimui iš filtro reikalingo buferinio tirpalo (Elution Buffer). Paruošti mėgintuvėliai inkubuojami 2 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojami 1 min 8000 x g. Po šios procedūros viršutinė mėgintuvėlio dalis išmetama, o apatinėje dalyje surinktas DNR ekstraktas naudojamas PGR tyrimui arba užšaldomas – 20°C temperatūroje.
2.3.2. Lizdinė PGR
Tyrimams taikytas vieno mėgintuvėlio lizdinės PGR metodas. PGR panaudoti pradmenys iš L. intracellularis genomo p78 fragmento. Pirmiausia paruoštas mišinys su lizdinės PGR pradmenimis ir perkeltas į PGR mėgintuvėlius, bei paliktas išdžiūti per naktį. Šis mišinys paruoštas pridedant:
5 µl 22 proc. trechalozės (D-(+)-Trehalose dihydrate kat. nr.T9531, Sigma-Aldrich, JAV), 1 µl C pradmuo (20pmol/1,0 µl) 5’-TTACAGGTGAAGTTATTGGG-3’
1 µl D pradmuo (20pmol/1,0 µl) 5’-CTTTCTCATGTCCCATAAGC-3’
1 µl dNTPs mišinio (dNTP Mix (10 mM each), kat.nr. R0192, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva)
0,25 µl Taq DNR polimerazė (Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U/µL), kat. Nr EP0402, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva).
Sekančiame etape pasiruošiamas lizdinei PGR reikalingas reakcijos mišinys (47 µl/ vienam mėginiui):
26 µl vandens be nukleazių (water, nuclease-free, kat. nr. R0581, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva),
5 µl PGR buferinio tirpalo (10 Mm Tris- HCl [Ph 8,3] 50 Mm KCl, 1,5 Mm MgCl2, UAB
"Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva)
12 µl MgCl2 (25 Mm), (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva)
0,25 µl Ajon pradmuo (20pmol/1,0 µl) 5’TATGGCTGTCAAACACTCCG-3’ 0,25 µl Bujon pradmuo (20pmol/1,0 µl) 5’TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3’
0,5µl dATP(10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva)
23 0,5 µl dGTP (10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB "Thermo
Fisher Scientific Baltics", Lietuva)
0,5 µl dCTP(10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva)
0,5 µl dTTP(10mM) tirpalo (dNTP Set 100 mM Solutions, kat. Nr R0181, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva)
1 µl 10 proc. tritono (Triton™ X-100 for molecular laboratory grade, kat. nr. T8787,
Sigma-Aldrich, JAV)
0,5 µl Taq DNR polimerazė (Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U/µL), kat. Nr EP0402, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva).
Į paruoštus mėgintuvėlius sulašinamas PGR mišinys, o ant viršaus užlašinami 1 – 2 lašai aliejaus (Mineral oil – PCR Reagent, kat. nr. M8662, Sigma – Aldrich, JAV), kad mišinys neišgaruotų. Tada pridedama po 3 µl DNR išskirtos iš tiriamųjų mėginių.
PGR lizdinei atlikti naudota programa ir termocikleris Eppendorf Mastercycler. PGR metu buvo atlikta pirminė denatūracija (5 min. 95°C). Po to vienas paskui kitą 35 ciklai – 94;55;72°C trunkantys po 40 s, galutinė ekstensija 72°C trunka 7 min. bei atvėsinimas iki 21°C. Po pirmos PGR mėgintuvėliai pakaitinti 2 min. 65°C, po to apversti ir palaikyti 2 min, tada nucentrifuguoti ir vėl įdėti į termociklerį.
Teigiamais atvejais gautas 270 bp produktas, kuris buvo matomas atlikus elektroforezę, agarozės gelį apšvietus UV spinduliais.
2.4. Statistiniai metodai
Rezultatai apdoroti naudojantis Polaris Marketing Research, Inc. internetine statistikos programa (http://www.polarismr.com/help-center/stat-calculator-differences/). Statistiniai metodai buvo panaudoti siekiant įvertinti tyrimo rezultatų skirtumų patikimumą. Šios programos pagalba buvo įvertinta ar apsikrėtusių L. intracellularis gyvūnų skaičius statistiškai skiriasi tarp įvairių lyginamų grupių: kliniškai sveikų ir sergančių šunų, patelių ir patinų, arklių ir šunų. Rezultatai laikyti patikimais kai p<0,05.
24
3.
TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Epidemiologinių tyrimų rezultatai
Veterinarijos gydytojų – žirgų specialistų teigimu L. intracellularis Lietuvoje nėra diagnozuojama, gydytojai yra susipažinę, tačiau nesusidūrę su klinikine ligos forma.
Tyrimams išmatos buvo renkamos Utenos žirgyne. Čia laikoma apie 80 žirgų. Apie 90 proc. jų sudaro Prancūzų ristūnai, 10 proc. Amerikos ristūnai. Šiame žirgyne laikomi žirgai nuo 1,5 metų amžiaus. Prieauglis iki 12 mėnesių laikomas su kumele, po to atjunkomas ir įvedamas į atskirą bandą. Nauji žirgai 1 – 2 kartus per metus atvežami iš Prancūzijos. Žirgai vežiojami treniruoti į netoli esantį hipodromą, sergantys transportuojami į LSMU VA stambiųjų gyvulių klinikas. Pavasarį apie 10 žirgų nuolat dalyvauja Sartų lenktynėse.
Apklausos metu aptarnaujanti gydytoja atskleidė, kad Utenos žirgyne arklių fekalijų mėgininiai dažniausiai buvo renkami ir analizuojami parazitinių susirgimų kontrolės tikslais, o molekulinės biologijos tyrimai su išmatomis dėl L. intracellularis niekada nebuvo atliekami. Žirgyne du kartus per metus taikoma antiparazitinė profilaktika naudojant Equalan DUO geriamąją pastą ir kartą per metus atliekama vakcinacija nuo užkrečiamųjų ligų. Dažna virškinimo trakto problema laikoma skrandžio opaligė. Tai siejama su patiriamu stresu atjunkant bei treniruočių pradžia 1,5 metų amžiaus kumeliukams. Viduriuojantys panašaus amžiaus kumeliukai gydomi taikant simptominę terapiją elektrolitų tirpalais. Kadangi žirgyne nebuvo nustatyta L. intracellularis, tai profilaktikos priemonės nėra pritaikytos.
Tyrime dalyvavusius šunis šeimininkai šeria komerciniais arba namie gamintais pašarais. Rajonų vietovėse augintiniai laikomi aptvaruose arba pririšti, o mieste – butuose. Miesto šunys vedžiojami ir patiria riziką užsikrėsti L. intracellularis per kitų šunų paliktas išmatas. Rajonuose šunys dažniausiai nėra vedžiojami, kai kurie turi galimybę laisvai vaikščioti kiemo teritorijoje ar net už jos ribų. Gali kontaktuoti su kaimynystėje laikomais gyvūnais, patiria riziką užsikrėsti nuo ūkiniais tiksliais laikomų kiaulių ir kitų gyvūnų.
3.2. Klinikinių tyrimų rezultatai
Klinikinių tyrimų pagalba šunys suskirstyti į dvi grupes: sergantys virškinamojo trakto ligomis ir nesergantys. Sergantiems šunims pasireiškė viduriavimas skystomis išmatomis. Fekalijų mėginiai paimti esant virškinimo trakto sutrikimams (virozės, enteritai, helmintozės, pirmuonių įtakoti sutrikimai, apsinuodijimai, pašaro netoleravimas).
25 Tyrimo metu nebuvo pastebėta viduriuojančių arklių, todėl mėginiai buvo paimti iš sveikų įvairaus amžiaus grupių individų.
3.3. Arklių PGR tyrimų rezultatai
3 lentelė. Arklių fekalijų tyrimų PGR metodu L. intracellularis atžvilgiu rezultatai
Amžius Tirta mėginių, n PGR teigiami,
n %
iki 1 m. 5 0 0,0
1 – 5 m. 30 3 10,0
>5 m. 11 0 0,0
Viso 46 3 6,5
Iš viso buvo tirti 46 sveikų įvairaus amžiaus arklių fekalijų mėginiai. Rasti 3 užsikrėtimo atvejai viename žirgyne. Teigiami mėginiai nustatyti 1 – 5 m. amžiaus arkliams sudarė 6,5 proc. visų tirtų gyvūnų.
2 pav. Sveikų arklių užsikrėtimo L. intracellularis bakterijomis dažnumas pagal amžių
Iš 2 pav. pateiktų duomenų matome, kad daugiausia tirta dviejų, trijų bei keturių metų amžiaus arklių. Du teigiami L. intracellularis atvejai nustatyti 2 metų amžiaus grupės arkliams bei vienas atvejis nustatytas keturių metų arkliui.
26 3 pav. Užsikrėtusių L. intracellularis arklių pasiskirstymas pagal lytį
Lyties atžvilgiu daugiau užsikrėtimų užfiksuota eržilams – 2 vnt. (14,3 proc.) nei kumelėms – 1vnt. (3,1 proc.), tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05).
3.4. Šunų PGR tyrimų rezultatai
4 pav. Šunų L. intracellularis PGR tyrimo rezultatai. 1 stulpelis – molekulinės masės markeris, 2-13 stulpeliai – tiriamieji mėginiai
Mėginiams tirti naudota lizdinė PGR, keturi teigiami (antras iš kairės, penktas, šeštas, vienuoliktas) L. intracellularis lizdinės PGR DNR produktai (270 bp) matomi paveikslėlyje.
27 4 lentelė. Sveikų ir sergančių šunų fekalijų tyrimų PGR metodu L. intracellularis
atžvilgiu rezultatai
Šunų amžius
Klinikinė būklė
Sveiki šunys Sergantys virškinimo trakto ligomis šunys
Tirta mėginių PGR + % Tirta mėginių PGR + %
1,5 – 6 mėn. 0 0 0 34 6 17,6* 6 – 12 mėn. 2 0 0 6 2 33,3* 1 – 6 m. 22 3 13,6* 16 3 18,8* 6 – 12 m. 17 4 23,5* 0 0 0,0 > 12 m. 9 0 0 0 0 0,0 Iš viso 50 7 14,0* 56 11 19,6*
Pastaba. *Rezultatų skirtumai tarp grupių ir grupėje statistiškai nesiskyrė p>0,05.
Iš viso ištirti 106 įvairaus amžiaus grupių sergančių ir sveikų šunų fekalijų mėginiai (4 lentelė). Taikant statistinius metodus atlikta analizė palyginant rezultatus įvairiose šunų amžiaus grupėse, taip pat tarp sveikų ir sergančių gyvūnų.
Daugiausia mėginių sveikų šunų grupėje surinkta iš 6 mėnesių – 12 metų amžiaus šunų. Sergančių virškinimo trakto ligomis šunų mėginių daugiausia buvo surinkta 1,5 mėnesio – 6 metų amžiaus intervale. Tyrimai parodė, kad sergantys virškinamojo trakto ligomis šunys L. intracellularis bakterijomis yra užsikrėtę dažniau (19,6 proc.) nei sveiki (14,0 proc.), tačiau statistiškai šis skirtumas nėra patikimas (p>0,05). Sveikų ir sergančių 1 – 6 metų amžiaus šunų tirtų mėginių skaičius buvo panašiausias (n=22 ir n=16). Lyginant teigiamų atvejų procentines išraiškas matome, kad sergantys šunys dažniau buvo užsikrėtę (18,8 proc.) L. intracellularis nei sveiki (13,6 proc.), tačiau šis skirtumas taip pat nėra statistiškai patikimas (p>0,05). Didžiausia teigiamų atvejų procentinė dalis sveikų gyvūnų grupėje nustatyta 6 – 12 metų šunims (23,5 proc.), o sergančių grupėje 6 – 12 mėnesių šuniukams (33,3 proc.). Tačiau atliekant palyginimą grupėse skirtumai nebuvo statistiškai patikimi (p>0,05).
28 5 pav. Sveikų šunų užsikrėtimo L. intracellularis bakterijomis dažnumas pagal amžių
Iš 5 pav. pateiktos diagramos matome, kad teigiami atvejai užfiksuoti septyniose amžiaus grupėse iš šešiolikos (4 lentelėje šie mėginiai priskirti dviem grupėms.). Minėtose septyniose grupėse nustatyta po vieną teigiamą L. intracellularis užsikrėtusį šunį.
8 7 2 5 9 3 3 1 1 1 4 9 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Š un ų skai či us Amžius
Tirta šunų Teigiami atvejai
6 pav. Sergančių šunų užsikrėtimo L. intracellularis bakterijomis dažnumas pagal amžių
Iš 6 pav. pateiktų duomenų matome, kad teigiami užsikrėtimo atvejai užfiksuoti aštuoniose amžiaus grupėse iš penkiolikos (4 lentelėje priskirti trims grupėms). Trijose grupėse (1,5; 2; 4 mėnesių amžiaus) buvo nustatyta po du teigiamus užsikrėtimo atvejus.
29 7 pav. Sveikų ir sergančių šunų užsikrėtimo L. intracellularis bakterijomis dažnumas pagal lytį
Septintajame paveikslėlyje pateiktoje diagramoje vaizduojamas sveikų ir sergančių šunų PGR teigiamų L. intracellularis atvejų skaičius pagal lytį. Iš pateiktų duomenų matome, kad sergančių virškinimo trakto ligomis ir užsikrėtusių L. intracellularis patinų – 9 vnt. (26,5 proc.) yra daugiau nei sveikų L. intracellularis teigiamų patinų – 4 vnt. (11,4 proc.), tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05). Tyrimų duomenys rodo, kad sveikos patelės dažniau buvo L. intracellularis nešiotojos 3 vnt. (20,0 proc.) lyginant su sergančiomis virškinamojo trakto ligomis – 2 vnt. (9,1 proc.). Tačiau šis skirtumas taip pat nėra statistiškai patikimas (p> 0,05).
8 pav. PGR teigiamų L. intracellularis atvejų dažnumas patinams ir patelėms
Iš viso buvo tirti 106 šunų fekalijų mėginiai, iš jų 69 patinų – 13 vnt. teigiamų (18,8 proc.) ir 37 patelių – 5 vnt. teigiamų (13,5 proc.). Lyginant procentines išraiškas matome, kad užsikrėtusių
30 patinų yra 5,3 proc. daugiau nei patelių, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05). Viso tyrimo metu buvo nustatyta 18 teigiamų užsikrėtimo atvejų, tai sudaro 17 proc. visų tirtų mėginių.
5 lentelė. Sergančių šunų užsikrėtimo L. intracellularis ir parvovirusais palyginimas Nr. Klinikinė diagnozė Nustatytas patogenas Nustatyta L. intracellularis
1 Enteritas Šunų parvovirusas Taip
2 Enteritas Nenustatytas patogenas Taip
3 Enteritas Šunų parvovirusas Taip
4 Enteritas Šunų parvovirusas Taip
5 Enteritas Šunų parvovirusas Taip
6 Enteritas Nenustatytas patogenas Taip
7 Enteritas Nenustatytas patogenas Taip
8 Helmintai Nenustatytas patogenas Taip
9 Apsinuodijimas Nenustatytas patogenas Taip
10 Apsinuodijimas, enteritas Nenustatytas patogenas Taip
11 Enteritas Nenustatytas patogenas Taip
Tyrimų metu sergančių ir užsikrėtusių L. intracellularis šunų fekalijų mėginiai buvo papildomai analizuojami parvovirusinio enterito atžvilgiu. Pagal 5 lentelėje pateiktus duomenis, matome, kad 4 (36,4 proc.) mėginiai buvo užkrėsti mišria L. intracellularis ir parvovirusine infekcija, o likusiems 7 (63,6 proc.) – nustatyta tik L. intracellularis.
31 14% 6,5% 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% P apl iti m as t ar p sv ei kų gy vūn ų
Sveiki šunys Sveiki arkliai
9 pav. L. intracellularis paplitimas sveikų šunų ir arklių grupėse
Iš 9 pav. pateiktos lentelės matome, kad didesnis L. intracellularis paplitimas nustatytas sveikų šunų grupėje lyginant su arkliais. Šunų fekalijų mėginiai rinkti Kauno, Prienų, Trakų bei Kėdainių rajonuose, o arklių mėginiai rinkti tik viename Utenos žirgyne.
32
4.
REZULTATŲ APTARIMAS
Lawsonia intracellularis sukeliamos proliferacinės enteropatijos pasireiškimas pastaraisiais metais globaliniu mastu ypač padažnėjo žirgininkystės sektoriuje, tačiau apie arklių susirgimus Lietuvoje duomenų nėra (66). JAV susirgimas aprašytas tiek pavieniais atvejais, tiek ir protrūkio forma žirgynuose laikomiems kumeliukams. Dažniausiai liga pasireiškia prieaugliui iki vienerių metų, tačiau yra atvejų kai susirgimas diagnozuotas ir suaugusiam arkliui. Daugiausiai tyrimų susijusių su šia liga atlikta Šiaurės Amerikoje. Duomenų apie šunis sergančius PE yra žymiai mažiau nei arklius. Mokslinėje literatūroje minimi pavieniai ligos atvejai, todėl veterinarijos gydytojai neturi patirties šios ligos diagnozavime ir gydyme, be to tiksliam diagnozavimui naudojamos molekulinės biologijos tyrimo metodikos. Atsižvelgiant į esamą padėtį, L. intracellularis paplitimui nustatyti pirmą kartą Lietuvoje atlikti arklių ir šunų fekalijų mėginių tyrimai lizdinės PGR pagalba. Tyrimui atlikti buvo surinkti 106 šunų ir 46 arklių fekalijų mėginiai.
Tiriant 46 sveikų arklių fekalijų mėginius PGR buvo nustatyti 3 teigiami užsikrėtimo atvejai kurie sudaro 6,5 proc. visos tirtų mėginių imties. Nors tyrimo metu nebuvo pastebėti viduriuojantys arkliai, gauti rezultatai leidžia manyti, kad ligos pasireiškimas šiame žirgyne yra įmanomas. Aplink žirgyną nėra kiaulių kompleksų, tačiau liga gali būti užsikrečiama ir per pašarus kuriuos savo išmatomis užteršia graužikai (67) ar esant kontaktui su teritorijoje gyvenančiu šunimi. Aptarnaujančių žirgyną gydytojų duomenimis viduriavimas anksčiau yra pasireiškęs kumeliukams, ypač iki dviejų metų amžiaus, tačiau gydytojai tai sieja su streso įtaka, nes kumeliukai anksti pradedami treniruoti, patiria stresą atjunkymo metu. Kita vertus, šiame žirgyne kumeliukai atjunkomi vyresni (12 mėnesių amžiaus) nei JAV žirgynuose (4 – 6 mėn.) (7), todėl streso įtaka sukėlėjo plitimui ir ligos pasireiškimui yra mažesnė. Mokslinėje literatūroje minimi kliniškai sveiki arkliai, kuriems atlikus PGR tyrimus nustatomas užsikrėtimas. Tai rodo, kad nepasireiškus PE klinikai į aplinką nuolat išskiriamos L. intracellularis bakterijos (18). Šios mokslininkų įžvalgos pagrindžia galimybę APE sukėlėjui plisti žirgyne. Vertinant tyrimų duomenis matome, kad du teigiami L. intracellularis atvejai nustatyti dviejų metų amžiaus grupės arkliams bei vienas atvejis nustatytas keturių metų arkliui. Šie rezultatai įrodo, kad žirgyne L. intracellularis bakterijos yra paplitusios, tačiau klinikiniai požymiai tirtiems individams nepasireiškė. Tokio amžiaus arkliai PE serga labai retai, tačiau Šiaurės Amerikoje yra aprašytas 3,5 metų amžiaus arklio susirgimas dėl užsikrėtimo L. intracellularis. Turėję su šiuo arkliu kontaktą kiti individai buvo užsikrėtę L. intracellularis, platino šias bakterijas, tačiau jiems klinikiniai požymiai nepastebėti ir jie nesusirgo (14).
Mūsų tyrimų metu lyties atžvilgiu daugiau užsikrėtimų užfiksuota eržilams – 2 vnt. (14,3 proc.) nei kumelėms – 1vnt. (3,1 proc.), tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05) ir
33 galimai nulemtas atsitiktinumo. Remiantis duomenimis, kad kumeliukai iki 12 mėnesių amžiaus yra laikomi atskiruose aptvaruose kartu su motinomis, galime daryti prielaidą, kad kumelės turi galimybe dažniau būti PGR teigiamos L. intracellularis atžvilgiu nei eržilai, kurie su kumeliukais kontakto neturi. Maitinančios kumelės neišvengia kontakto su galimai užsikrėtusio kumeliuko išmatomis ir taip patiria riziką užsikrėsti pačios. Siekiant pagrįstai išanalizuoti galimą lyties predispoziciją reikalingi tolimesni tyrimai su didesnėmis tiriamų objektų imtimis.
Iš viso ištirti 106 įvairaus amžiaus grupių sergančių ir sveikų šunų fekalijų mėginiai. Tyrimai parodė, kad sergantys virškinamojo trakto ligomis šunys L. intracellularis bakterijomis yra užsikrėtę dažniau (19,6 proc.), nei sveiki (14,0 proc.), tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05). Ankstesniuose moksliniuose tyrimuose minima, kad sergančių virškinimo trakto ligomis, viduriuojančių šunų užsikrėtimo L. intracellularis procentinė išraiška svyruoja nuo 7,0 proc. iki 43,5 proc. (68). Lyginant rezultatus galima teigti, kad mūsų duomenys patenka į literatūroje paminėtų rezultatų intervalą.
Iš viso tirti 69 šunų patinų mėginiai – 13 vnt. teigiamų (18,8 proc.) ir 37 patelių mėginiai – 5 vnt. teigiamų (13,5 proc.). Buvo nustatyta, kad sergančių virškinimo trakto ligomis ir užsikrėtusių L. intracellularis patinų – 9 vnt. (26,5 proc.) yra daugiau nei sveikų L. intracellularis teigiamų patinų – 4 vnt. (11,4 proc.), tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05). Tyrimų duomenys rodo, kad sveikos patelės dažniau buvo L. intracellularis nešiotojos 3 vnt. (20,0 proc.) lyginant su sergančiomis virškinamojo trakto ligomis – 2 vnt. (9,1 proc.). Tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p> 0,05) ir gali būti atsitiktinis. Mokslinėje literatūroje L. intracellularis paplitimas skirtingų lyčių individų populiacijose nenagrinėtas.
Lyginant procentines išraiškas galima teigti, kad užsikrėtusių patinų yra 5,3 proc. (18,8 proc. – 13,5 proc.) daugiau nei patelių, tačiau šis skirtumas nėra statistiškai patikimas (p>0,05). Abiejose (sveikų ir sergančių) šunų grupėse buvo nustatyta 18 teigiamų užsikrėtimo atvejų, tai sudaro 17 proc. visų tirtų mėginių.
Remiantis mūsų tyrimo duomenimis, sveikų ir sergančių šunų užsikrėtimo skirtumas tėra 5,6 proc. (19,6 proc. – 14,0 proc.), tačiau negalima atmesti PE sukėlėjo svarbos šunų virškinimo trakto ligų atžvilgiu pavieniais atvejais. Panaši procentinė situaciją vyrauja lyginant šunų ir kačių patogeno Campylobacter spp. paplitimą sergančių virškinimo trakto ligomis ir sveikų mėsėdžių grupės (69).
Mūsų tirti sveiki šunys, kurie PGR metodu buvo teigiami, gali būti apibūdinami kaip potencialūs besimptomiai ligos sukėlėjų platintojai. Kiaulėms subklinikinė ligos forma yra plačiai paplitusi ir laikoma viena iš pagrindinių priežasčių ateityje pasireikšti klinikinei formai (68).
Tiriami šunys buvo įvairaus amžiaus, nuo 1,5 mėn. iki 18 metų. Vyriausiam sergančiam šuniui buvo 4 metai, o vyriausiam sveikam nešiotojui – 11 metų. Šie duomenys rodo, kad amžiaus
34 priklausomybės nuo užsikrėtimo intervalas yra žymiai platesnis nei kiaulėms, kurioms ši liga dažniausiai nustatoma 1 – 6 mėn. ir arkliams, kuriems liga dažniausiai diagnozuojama 7 – 8 mėn. (68).
Tyrimų metu virškinimo trakto sutrikimų turinčių ir L. intracellularis užsikrėtusių šunų fekalijų mėginiai buvo papildomai analizuojami šunų parvovirusinio enterito atžvilgiu. Abu patogenai sąlygoja viduriavimą. Šia tema yra publikuotas mokslinis tyrimas, kurio metu buvo nustatyta mišri infekcija šuniui kliniškai pasireiškusi viduriavimu su kraujingomis priemaišomis (70). Remiantis mūsų duomenimis, kad 36,4 proc. šunų buvo apsikrėtę L. intracellularis ir šunų parvovirusais, o 63,6 proc. – buvo nustatytas L. intracellularis galime teigti, kad PE sukėlėjas gali įtakoti virškinamojo trakto problemas tiek individualiai, tiek ir esant mišriam užsikrėtimui. Todėl iš klinikinių požymių sunku tiksliai nuspręsti, kuris patogenas užima pagrindinį vaidmenį susirgimo etiologijoje.
Tirti šunys yra laikomi skirtingų šeimininkų, šeriami komerciniu arba namie gamintu pašaru, todėl sunku nustatyti pagrindinę užsikrėtimo priežastį. Galima tik manyti, kad L. intracellularis yra gana plačiai paplitusi tarp įvairių rūšių imlių gyvūnų, o galimybė aplinkoje išsilaikyti iki dviejų savaičių yra svarbus faktorius didinantis galimybes patekti į šeimininko organizmą. Remiantis tyrimo rezultatais matome, kad šunys ir arkliai užsikrečia L. intracellularis, tačiau siekiant užtikrinti rezultatų patikimumą reikia atlikti tyrimus su didesnėmis šių gyvūnų grupėmis.
35
IŠVADOS
1. Remiantis epidemiologinių ir klinikinių tyrimų duomenimis arklių proliferacinė enteropatija nediagnozuota tiriamuoju laikotarpiu.
2. Epidemiologinių, klinikinių ir molekulinės biologijos tyrimų duomenys nepatvirtina, kad šunų užsikrėtimas Lawsonia intracellularis bakterijomis turi reikšmingą vaidmenį ligos pasireiškimui, eigai, klinikinių požymių sunkumui, gydymui, tačiau tyrimų duomenys nepaneigia, kad pavieniais atvejais šunų užsikrėtimas šiomis bakterijomis gali sukelti ligą ar įtakoti sergančių gyvūnų ligos eigą, sunkumą, išgijimą.
3. Remiantis lizdinės PGR tyrimų duomenimis buvo nustatyta, kad Lawsonia intracellularis bakterijos yra paplitusios tirtų arklių ir šunų populiacijose: 6,5 proc. (3 iš 46) arklių ir 17,0 proc. (18 iš 106) šunų buvo teigiami Lawsonia intracellularis atžvilgiu.
4. Remiantis klinikinių ir molekulinės biologijos tyrimų duomenimis nustatyta, kad Lawsonia intracellularis bakterijas rečiau išskyrė sveiki (14,0 proc., 7 iš 50) nei sergantys virškinamojo trakto ligomis šunys (19,6 proc., 11 iš 56), tačiau bakterijas išskiriančių sveikų ir sergančių šunų skaičius statistiškai nesiskyrė (p>0,05).
5. Lyginant skirtingos lyties arklių užsikrėtimą, lizdinės PGR metodu nustatyta, kad užsikrėtusių eržilų (14,3 proc., 2 iš 14) ir kumelių (3,1 proc., 1 iš 32) skaičius statistiškai nesiskyrė (p>0,05).
6. Lawsonia intracellularis bakterijomis buvo užsikrėtę tik 2 – 4 metų amžiaus arkliai, jiems nepasireiškė klinikiniai proliferacinės enteropatijos požymiai.
7. Tirtų sergančių virškinimo trakto ligomis šunų imtyje daugiau užsikrėtimo atvejų nustatyta 1,5 – 5 mėn. amžiaus individams, tačiau lyginant su likusia grupės dalimi šis rezultatas nebuvo statistiškai patikimas (p>0,05).
8. Papildomai ištyrus sergančių ir Lawsonia intracellularis teigiamų šunų grupę šunų parvoviruso atžvilgiu buvo pastebėta, kad sergantys šunys gali būti užsikrėtę abiem patogenais vienu metu (36,4 proc., 4 iš 11), tai rodo, kad viduriavimo etiologija gali būti mišri ir L. intracellularis nebūtinai užima svarbiausią vietą klinikinių požymių pasireiškimui. 9. Šunų lytis neturėjo įtakos įvairios klinikinės būklės individų užsikrėtimui Lawsonia
intracellularis bakterijomis: lyginant skirtingos lyties šunų užsikrėtimą, nustatyta, kad patinų (18,8 proc., 13 iš 69) ir patelių (13,5 proc., 5 iš 37) skaičius statistiškai nesiskyrė (p>0,05).
