LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS BIOCHEMIJOS LABORATORIJA JOLITA KUŠELIAUSKYTĖ
PLUMBAGINO IR JO DERINIŲ SU TEMOZOLOMIDU POVEIKIO
GLIOBLASTOMOS C6 LĄSTELIŲ GYVYBINGUMUI TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Medicinos studijų programa, valstybinis kodas 601A30002
Darbo vadovė: Prof. dr. Daiva Majienė
KAUNAS 2019
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 4 2. SUMMARY ... 5 3. PADĖKA ... 6 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 65. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6
6. SANTRUMPOS ... 7
7. SĄVOKOS ... 7
8. ĮVADAS ... 8
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
10.1. Glioblastoma ... 10
10.2. Glioblastomos etiologija, epidemiologija ir morfologija ... 10
10.3. Glioblastomos klinikiniai simptomai, diagnostika ir gydymas ... 11
10.4. Temozolomidas ... 13
10.5. 1,4 – naftochinonai ... 14
10.6. Plumbaginas ... 14
10.7. Juglonas ... 15
10.8. C6 glioblastomos ląstelių linija ... 15
11. METODIKA ... 16
11.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra ... 16
11.1.1. Naudotos medžiagos ... 16
11.1.2. Naudota aparatūra ... 16
11.2. Ląstelių sėjimo metodika ... 17
11.3. Ląstelių tankio nustatymas ... 17
11.4. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu ... 18
3
11.6. Statistinė duomenų analizė ... 19
12. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 20
12.1. MTT metodu nustatytas temozolomido, plumbagino ir jų derinių poveikis C6 ląstelių gyvybingumui ... 20
12.2. Propidžio jodido/Hoechst 33528 metodu nustatytas plumbagino ir temozolomido poveikis C6 ląstelių gyvybingumui ... 23
13. IŠVADOS ... 27
14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 27
4
1. SANTRAUKA
PLUMBAGINO IR JO DERINIŲ SU TEMOZOLOMIDU POVEIKIO GLIOBLASTOMOS C6 LĄSTELIŲ GYVYBINGUMUI TYRIMAS
J. Kušeliauskytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. D. Majienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Neuromokslų institutas, Kaunas.
Raktiniai žodžiai: plumbaginas, temozolomidas, C6 ląstelių kultūra.
Tyrimo tikslas – ištirti ir palyginti įvairių koncentracijų plumbagino ir jo derinių su temozolomidu įtaką žiurkių glioblastomos C6 ląstelių kultūros gyvybingumui.
Metodai: ląstelių gyvybingumą įvertinome propidžio jodido ir Hoechst 3325 metodu bei matuodami ląstelių gebą metabolizuoti MTT dažą.
Tyrimų uždaviniai:
1. Nustatyti plumbagino skirtingų koncentracijų poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui;
2. Nustatyti temozolomido skirtingų koncentracijų poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui;
3. Ištirti skirtingų koncentracijų plumbagino derinių su temozolomidu poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui.
Tyrimų rezultatai: gauti rezultatai parodė, kad priklausomai nuo koncentracijos plumbaginas ir temozolomidas mažina C6 ląstelių gyvybingumą. 4 – 10 µM plumbaginas negyvybingų ląstelių skaičių atitinkamai padidino 24 – 69%. Temozolomidas negyvybingų ląstelių skaičių padidino 22 – 63% veikiant C6 ląsteles 0,5 – 1,5 mM koncentracija.
Derinyje su plumbaginu ir temozolomidu ląstelių gyvybingumas, veikiant tomis pačiomis koncentracijomis, buvo mažinamas stipriau, nei veikiant kiekviena medžiaga atskirai. Stipriausią citotoksinį poveikį nustatėme veikiant su 500 µM temozolomidu ir 6 µM plumbaginu, kai nekrozinių ląstelių buvo 61%.
Išvados: priklausomai nuo koncentracijos tiek plumbaginas, tiek temozolomidas mažina C6 ląstelių gyvybingumą. Tačiau plumbagino ir temozolomido deriniai stipriau mažina glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumą, nei kiekvienas jų veikdami atskirai.
Rekomendacijos: tirti kitų 1,4-naftochinonų derinių su temozolomidų įtaką glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumui.
5
2. SUMMARY
THE INVESTIGATION OF PLUMBAGIN AND ITS COMBINATION WITH TEMOZOLOMIDE ON GLIOBLASTOMA C6 CULTURE CELLS VIABILITY
J. Kušeliauskytė Master Thesis/ Scientific supervisor prof. dr. D. Majienė Lithuanian University of Health Sciences, Institute of Neurosciences, Kaunas
Key words: plumbagin, temozolomide, C6 cell culture.
The aim of research: to investigate and compare the effect of different concentrations of plumbagin and its combination with temozolomide on rat glioblastoma C6 cell culture.
Methods: cell viability was evaluated using propidium iodide and Hoechst 33258 assay and measuring the ability of cells to metabolize MTT dye.
Goals of the study:
1. To identify the effect of different concentrations of plumbagin on C6 cell culture viability.
2. To identify the effect of different concentrations of temozolomide on C6 cell culture viability.
3. To investigate the effect of different concentrations of plumbagin combination with temozolomide on C6 cell culture viability.
Results: our results have shown that plumbagin induced dose-dependent reduction in viability of C6 cells. 4 – 10 µM concentration plumbagin increased the number of non-viable cells by 24 – 69%. Temozolomide increased the number of non-viable C6 cells by 22% to 63% at concentrations of 0,5 to 1,5 mM.
In combination with plumbagin and temozolomide cell viability was reduced more efficiently than using each substance alone at the same concentrations. We determined the strongest cytotoxic effect using 500 µM temozolomide and 6 µM plumbagin when the number of necrotic cells increased by 61%.
Conclusions: plumbagin and temozolomide ir concentration-dependent manner reduce the viability of C6 cell culture. However, combinations with plumbagin and temozolomide significantly reduce the viability of glioblastoma C6 cells comparing with the effect of each substance acting individually.
Recommendations: to study the effect of other 1,4-naphthochinone combinations with temozolomide on glioblastoma C6 cell culture viability.
6
3. PADĖKA
Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems ir prisidėjusiems, ruošiant šį magistrinį darbą. Labiausiai dėkoju savo darbo vadovei, prof. dr. Daivai Majienei už pastabas, patarimus ir pagalbą atliekant tyrimus ir analizuojant gautus rezultatus. Taip pat esu dėkinga Neuromokslų Instituto, Biochemijos laboratorijos kolektyvui už patarimus bei pastabas atliekant baigiamąjį darbą. Neuromokslų Instituto, Biochemijos laboratorijos vedėjai prof. dr. Vilmantei Borutaitei dėkoju už suteiktą galimybę atlikti mokslinį – magistrinį darbą, naudotis įrenginiais bei reagentais.
4. INTERESŲ KONFLIKTAS
Magistro darbo autoriui darbo atlikimo metu interesų konflikto nebuvo.5. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Etikos komiteto leidimas šiam darbui nebuvo reikalingas.7
6. SANTRUMPOS
CNS – centrinė nervų sistema GBM – multiforminė glioblastoma TMZ – temozolomidas
PSO – pasaulinė sveikatos organizacija KT – kompiuterinė tomografija
MRT – magnetinio rezonanso tyrimas DTIC – dakarbazinas
MTIC - imidazol-4-karboksamidas DMSO – dimetilsulfoksidas
DMEM – ląstelių auginimo terpė (angl. Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) HBSS – Hankso subalansuotas druskos tirpalas (angl. Hanks’ balanced salt solution) MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas
PBS – fosfatinis druskos buferis (angl. Phosphate Buffer Saline) DNR – deoksiribonukleorūgštis
Pb – plumbaginas
ROS – aktyvūs deguonies junginiai ET – endoplazminis tinklas
FBS - fetalinis veršelio serumas (angl. Fetal bovine serum)
7. SĄVOKOS
Anaplastinė – nediferencijuota, nepanaši į jokį normalų audinį Glioma – pirminis smegenų navikas8
8. ĮVADAS
Europoje ir Jungtinėse Amerikos valstijose antroji pagal dažnį mirties priežastis 2018 metais buvo vėžiniai susirgimai [1,2]. Nepaisant to, kad pastaraisiais dešimtmečiais pagerėjo ankstyva vėžio diagnostika ir gydymas, 2018 metais nuo vėžio mirė 1,93 mln. Europos gyventojų [2,3]. 2018 metais nustatyti 64600 nauji centrinės nervų (CNS) sistemos vėžio atvejai Europoje. Nuo CNS vėžio 2018 metais mirė 53000 Europos gyventojų. Lietuvoje 2018 metais diagnozuota 3900 naujų CNS vėžio atvejų [3].
Multiforminė glioblastoma (GBM) yra labiausiai paplitusi pirminė piktybinė smegenų vėžio forma. Vidutinis išgyvenamumas yra 7-15 mėnesių nuo diagnozės nustatymo [4]. Glioblastoma pasižymi sparčiu augimu, plačia infiltracija ir stipria kraujagyslių proliferacija į aplinkinę smegenų parenchimą. Tradicinis gydymas apima naviko rezekciją, po kurio seka radioterapija ir chemoterapija. Nepaisant technologinės pažangos šiose gydymo srityse vis tiek išlieka dažnas naviko recidyvas, atsparumas gydymui ir blogėjanti neurologinė būklė [4,5].
Temozolomidas (TMZ) yra alkilinantis agentas pasižymintis puikiu biologiniu praeinamumu ir gerai prasiskverbiantis per hematoencefalinį barjerą. Jis pasižymi priešnavikiniu efektyvumu ir daugiausiai yra naudojamas gydant naujai diagnozuotą ar pasikartojančią aukšto lygio gliomą. Nors TMZ šiuo metu yra viena efektyviausių chemoterapinių medžiagų gydyti GBM, ne visiems pacientams šis vaistas yra efektyvus. Priešnavikinis TMZ aktyvumas trunka tik kelis mėnesius, po to daugeliu atvejų atsiranda atsparumas jam. Dėl to reikia ieškoti naujų preparatų, kurie sustiprintų temozolomido poveikį [6,7].
Plumbaginas (5-hidroksi-2-metil-1,4-naftochinonas) yra natūralus 1,4-naftochinonas, kuris išskiriamas iš vaistinio augalo Plumbago zeylanica L. šaknų. Jis pasižymi ryškiu priešvėžiniu aktyvumu įvairiems žmogaus navikams, įskaitant krūties, kiaušidžių, prostatos, skrandžio, gaubtinės žarnos vėžį ir gliomas [8–13].
Remiantis literatūros duomenimis bei anksčiau Biochemijos laboratorijoje atliktais tyrimais su 1,4-naftochinonais [14], šiame tyrime toliau nagrinėsime plumbagino, temozolomido ir plumbagino derinio su temozolomidu poveikį glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumui.
9
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Ištirti ir palyginti įvairių koncentracijų plumbagino ir jo derinių su temozolomidu įtaką žiurkių glioblastomos C6 ląstelių kultūros gyvybingumui.
DARBO UŽDAVINIAI
1. Nustatyti plumbagino skirtingų koncentracijų poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui; 2. Nustatyti temozolomido skirtingų koncentracijų poveikį C6 ląstelių kultūros
gyvybingumui;
3. Nustatyti skirtingų koncentracijų plumbagino derinių su temozolomidu poveikį C6 ląstelių kultūros gyvybingumui.
10
10. LITERATŪROS APŽVALGA
10.1. Glioblastoma
Terminas „glioma“ yra bendrinis, naudojamas apibūdinant pirminius smegenų navikus. Pirminiai smegenų navikai klasifikuojami pagal pirmtakes ląsteles. Tai astrocitiniai navikai (astrocitoma, anaplastinė astrocitoma ir glioblastoma), oligodendrogliomos, ependimomos ir mišrios gliomos. Tai yra dažniausi centrinės nervų sistemos navikai, kurie sudaro beveik 80% visų piktybinių smegenų navikų [15]. Multiforminė glioblastoma yra piktybiškiausias ir dažniausiai pasireiškiantis pirminių astrocitomų tipas. Ji sudaro daugiau nei 60% visų smegenų navikų suaugusiems [16]. Nepaisant šiuolaikinių gydymo būdų, glioblastoma vis dar yra mirtina liga su nepalankia prognoze. Pacientų vidutinis išgyvenamumas yra maždaug 14-15 mėnesių nuo diagnozės nustatymo [17].
Morfologinė gliomų diagnozė grindžiama Pasaulinės Sveikatos Organizacijos (PSO) nustatytais kriterijais. CNS navikų stadijavimas apima jų morfologiją, piktybiškumo laipsnį (I-IV laipsniai), proliferacinį indeksą, atsaką į gydymą ir išgyvenamumo laiką.
Piktybiškumo laipsniai: I – gerybiniai navikai
II – pusiau gerybiniai navikai III – pusiau piktybiniai navikai IV – piktybiniai navikai [18]
I laipsnio gliomos yra susijusios su pažeidimais, kurie turi mažą proliferainį potencialą ir gali būti išgydyti operaciniu būdu, o II-IV laipsnio gliomos yra labiau piktybinės ir invazinės [19]. Esant IV laipsnio navikui išgyvenamumas vidutiniškai sieka 6-12 mėn. [18]. Multiforminė glioblastoma yra agresyviausia, invazinė ir nediferencijuota naviko rūšis ir klasifikuojama kaip IV laipsnio glioma [4,5].
10.2. Glioblastomos etiologija, epidemiologija ir morfologija
Europoje ir Šiaurės Amerikoje kiekvienais metais glioblastoma suserga 2-3 iš 100000 žmonių. Vyrai serga dažniau nei moterys, santykiu 1.26 : 1 [18]. Glioblastoma vidutiniškai pasireiškia 64 metų amžiaus žmonėms, bet gali atsirasti bet kuriame amžiuje, net ir vaikystėje [17]. Glioblastoma serga 1,1 – 3,6 iš 100000 kūdikių. Tarp vaikų ir suaugusiųjų glioblastomų nėra jokių morfologinių skirtumų, tik vaikams būdingas didesnis proliferacijos indeksas (Ki – 67 indeksas). Didesnis sergamumas nustatytas tarp europiečių, ypač gyvenančių pramoniniuose rajonuose [18].
11 Glioblastomos gali būti klasifikuojamos kaip pirminės (de novo), atsiradusios be žinomo pirmtako, arba kaip antrinės, kai žemo lygio navikas bėgant laikui virsta glioblastoma. Dažniausiai nustatomos pirminės. Šie pacientai būna vyresni ir jų prognozė yra blogesnė, nei sergančiųjų antrine glioblastoma [20]. Yra nustatyti 4 glioblastomos potipiai: klasikinis, pro-nervinis, nervinis, mezenchiminis. Skiriasi kiekvieno iš jų progresavimo greitis ir išgyvenamumas [21]. Norint nustatyti potipį reikalinga invazinė biopsija ar chirurginė rezekcija ir genominė analizė. Manoma, kad nustatant molekulinius potipius galima būtų parinkti efektyvesnį adjuvantinį gydymą [22].
2016 metais PSO pristatė naują centrinės nervų sistemos klasifikaciją, kurioje glioblastoma suskirstyta atsižvelgiant į izocitrato dehidrogenazės (IDH) mutacijos buvimą. Glioblastomos skirtomos į turinčias IDH mutaciją (IDH-mutant) ir neturinčias šios mutacijos (IDH-wildtype). IDH mutacijos neturinti GBM kliniškai atitinka pirminę (de novo) glioblastomą ir vyrauja vyresniems nei 55 metų žmonėms bei turi blogesnę prognozę. Tuo tarpu IDH mutaciją turinti glioblastoma yra glaudžiai susijusi su antrine GBM ir nustatoma jaunesniems pacientams [23].
Nors glioblastoma dažniausiai atsiranda galvos smegenyse, ji taip pat gali atsirasti smegenų kamiene, smegenėlėse ar nugaros smegenyse [18].
Glioblastoma ląstelės pasižymi polimorfizmu ir anaplazija. Glioblastomos ląstelės yra gausiai vaskuliarizuotos. Naujai atsiradusios kraujagyslės yra morfologiškai panašios į inkstų glomerulus. Šiose kraujagyslėse susidaro trombai, kurie vėliau sukelia endotelinių ląstelių pažeidimus ir proliferaciją. Viena iš būdingiausių glioblastomos savybių – nekrozės židiniai. Histologiškai paprastai nustatomi du nekrozės tipai, priklausomai nuo nekrozės židinio lokalizacijos ir dydžio. Pirmasis tipas pasireiškia dideliais nekrozės plotais naviko centre, kurie atsiranda dėl nepakankamo naviko aprūpinimo krauju pirminėse glioblastomose. Antrąjį tipą sudaro maži, nevienodos formos nekrozės židiniai, apsupti radialiai išsidėsčiusių glijos ląstelių, pirminėse ir antrinėse glioblastomose. Didelis šių navikų piktybiškumas yra susijęs su padidėjusiu atipijos laipsniu, branduolio hiperchromija, padidėjusiu mitoziniu indeksu, nekrozinių židinių ir atipinių kraujagyslių atsiradimu [18].
10.3. Glioblastomos klinikiniai simptomai, diagnostika ir gydymas
Daugiau nei pusei pacientų sergančių glioblastoma simptomai atsiranda per 3-6 mėnesius, tačiau jei navikas išsivysto iš mažo piktybiškumo astrocitomos, simptomai tęsiasi ir blogėja kelių metų laikotarpyje [15]. Pacientams, sergantiems GBM, atsiranda įvairių simptomų ir požymių, kuriuos sukelia trys mechanizmai:
1. Tiesioginis poveikis, kai nekrozė sunaikina smegenų audinį ir sukelia židininę neurologinę simptomatiką ir pažinimo sutrikimus. Požymiai ir simptomai priklauso nuo
12 to, kurias smegenų dalis veikia navikas. Pavyzdžiui, jeigu navikas yra temporalinėje smegenų skiltyje, tai pacientai skundžiasi klausos ir regėjimo sutrikimais (miglotas matymas, dvejinimasis akyse). Jei navikas yra kaktinėje skiltyje, tai atsiranda asmenybės pokyčiai. Jeigu navikas yra didelis, gali atsirasti pusiausvyros sutrikimai ir šlapimo nelaikymas [24].
2. Antrinis pažeidimas - dėl padidėjusio intrakranijinio spaudimo, kurį sukelia didelė naviko masė ir aplinkinė edema. Padidėjęs intrakranijinis spaudimas sukelia galvos skausmus, kurie pasireiškia 30-50% pacientų sergančių glioblastoma [15].
3. Priklausomai nuo lokalizacijos, apie 20-40% pacientų, atsiranda traukuliai [25].
Dėl šių nespecifinių simptomų glioma dažnai yra klaidingai diagnozuojama kaip infekcija, uždegiminis procesas, kraujotakos ar imuninės ligos [18].
Glioblastomų diagnostikai naudojami rentgenologiniai tyrimai, tokie kaip kompiuterinė tomografija (KT) arba magnetinio rezonanso tyrimas (MRT). MRT metu naudojant gadolinio kontrastą išryškėja beveik visos glioblastomos, todėl tai yra pagrindinis tyrimas glioblastomų diagnostikai. Matoma netaisyklingos formos masė, kuri periferijoje yra hiperintensinė, o centre turi hipointensinę nekrozės zoną. Pagrindinis GMB bruožas yra nekrozė. Nuotraukose taip pat gali būti matoma vazogeninė edema, kraujavimas ir skilvelių deformacija ar poslinkis [26]. Galutinė diagnozė nustatoma histopatologiniu tyrimu. Tiriamas operacijos netu pašalintas navikas arba jo dalys, naudojant tradicinius histologinius, citologinius ir histocheminius metodus. Kai operacinis naviko pašalinimas negalimas, atliekama aspiracinė naviko punkcija plona adata [18].
Kadangi glioblastoma infiltruoja aplinkinius audinius, visiška naviko rezekcija yra neįmanoma, o radioterapija ne visada veiksminga, todėl taikomas kompleksinis gydymas [18]. Pagrindinis glioblastomos gydymo būdas yra chirurginis, po jo atliekama chemoterapija ir radioterapija. Chirurginis gydymas, chemoterapija ir radioterapija prailgina jaunų žmonių išgyvenamumą iki 202 savaičių [20]. Šiuo metu pagrindinė glioblastomos gydymo schema yra pooperacinė radioterapija ir temozolomidas [27].
Atliktame tyrime vidutinis išgyvenamumo laikas sergančiųjų glioblastoma buvo 12 mėnesių. 2 ir 5 metų išgyvenamumas atitinkamai buvo 21,3% ir 13,8%. Pacientų, kuriems buvo atlikta operacija ir taikyta pooperacinė radioterapija, vidutinis išgyvenamumo laikas buvo 11 mėnesių. Tuo tarpu pacientų, gydytų radioterapija ir TMZ vidutinis išgyvenamumo laikas buvo 23 mėnesiai. Pacientų, gydytų operacija ir pooperacine radioterapija 2 ir 5 metų vidutinis išgyvenamumas buvo atitinkamai 17,2% ir 11,8%, o gydytų radioterapija ir TMZ – 38,2% ir 19,1% [28].
13 10.4. Temozolomidas
Temozolomidas (TMZ) priklauso naujos klasės alkilinančioms medžiagoms, žinomoms kaip imidazotetrazinai. Šiuos junginius sudaro imidazolo žiedas. Struktūriškai ir funkciškai jie panašūs į dakarbaziną (DTIC), kuris yra triazeno pogrupio narys. TMZ pirmą kartą susintetino 1984 metais Stevensas ir jo kolegos. Jie buvo pirmieji, kurie nustatė, kad TMZ turi priešvėžinį aktyvumą.TMZ yra maža molekulė, kurios molinė masė 194 g/l. Dėl to ji lengvai absorbuojama virškinimo trakte ir, kadangi yra lipofilinė, gali pereiti hematoencefalinį barjerą [29]. Taip pat TMZ yra labai stabilus esant rūgščiam skrandžio sulčių pH. Tačiau sureagavęs su šiek tiek šarminiu kraujo ir audinių pH, TMZ savaime hidrolizuojasi į aktyvųjį metabolitą imidazol-4-karboksamidą (MTIC), kuris greitai skyla į reaktyvųjį metildiazonio joną [30]. Smegenų navikuose vyrauja didesnis šarminis pH, lyginant su sveikais aplinkiniais audiniais, dėl to TMZ aktyvacija pirmiausia ir įvyksta navikiniame audinyje [23].
Metildiazonio jonas, susidaręs skilus MTIC, daugiausia metilina guanino liekanas deoksiribonukleorūgšties (DNR) molekulėje, todėl susidaro O6- ir N7-metilguaninas. Susiformavęs O6
-metilguaninas yra atsakingas už TMZ citotoksinį poveikį [29]. Genominėje DNR prie guanino O6
pozicijos prisijungia metilo grupė, todėl replikacijos metu prisijungia timinas vietoj citozino. Gauta nenormali guanino-timino pora sukelia pauzę DNR replikacijoje, todėl yra aktyvinama DNR klaidų taisymo sistema. Tačiau šis taisymo mechanizmas atsilieka nuo DNR pažaidos greičio ir masto ir įvyksta apoptozė [30]. N7-metilguaninas yra mažai toksiškas, nes DNR neatitikimo klaidas taisantys
fermentai gali sėkmingai iškirpti šiuos nukleotidus nepažeisdami DNR [29].
Išgėrus TMZ jis greitai absorbuojamas, o jo biologinis prieinamumas yra apie 100%. Maistas minimaliai veikia TMZ absorbciją [30].
Patys dažniausi nepageidaujami reiškiniai yra:
pykinimas, vėmimas [31] galvos skausmas [32] silpnumas [30]
vidurių užkietėjimas [30]
limfopenija [33]
Šie reiškiniai dažniausiai būna lengvo ar vidutinio sunkumo. Kartais pasireiškia ir reti tačiau gyvybei pavojingi šalutiniai reiškiniai, tokie kaip Stevens–Johnson’s sindromas [34] ir aplastinė anemija [35].
14 10.5. 1,4 – naftochinonai
Naftochinonai yra antriniai metabolitai, kurie yra išskiriami iš įvairių augalinių, bakterinių ir grybinių šaltinių. Daugiausiai šie junginiai naudojami dėl savo dažomųjų savybių, tačiau iš tiesų jie turi kitų biologinių savybių [36].
Naftochinonai struktūriškai susiję su naftalenu ir turi dvi karbonilo grupes 1,4 padėtyse ir todėl pavadinti 1,4- naftochinonais [37]. Be jų dažomųjų savybių nustatyta, kad 1,4- naftochinonai ir jų dariniai turi svarbias biologines savybes, tokias kaip antimaliarinis, antibakterinis, priešgrybelinis ir priešvėžinis aktyvumai [38].
Tarp natūralių naftochinonų yra: lavsonas, kurį galima išgauti iš henna lapų ir stiebų (Lawsonia inermis L.) [38], plumbaginas, daugiausiai išgaunamas iš Plumbago scandens L šaknų ir naudojamas raupsų ir tuberkuliozės gydyme [39], lapacholis, kuris gali būti išgaunamas iš Tabebuia
spp., Tecoma spp. ir Tecomella undulata šerdies [40], juglonas, kuris išgaunamas iš juodojo
riešutmedžio (Juglans nigra), europietiško riešutmedžio (Juglans regia), Amerikos baltojo riešutmedžio (Juglans cinerea) šaknų, lapų, riešutų ir medienos [41].
10.6. Plumbaginas
Plumbaginas (Pb) yra natūralus naftochinonas išskirtas iš tradicinių liaudies vaistų Plumbago zeylanica [42]. Plumbaginas yra žinomas dėl savo didelio terapinio ir minimalaus šalutinio poveikių [43]. Plumbaginas turi įvairių farmakologinių poveikių, įskaitant priešgrybelinį [44], antibakterinį [45], antimaliarinį [46], priešuždegiminį [47], priešvėžinį [12] poveikius. Neseniai buvo nustatyta, kad jis yra selektyviai toksiškas vėžinėms ląstelėms in vitro ir in vivo [42]. Plumbago zeylanica šaknys daugiau nei 2500 metų buvo naudojamos Indijos medicinoje įvairių ligų gydymui [48]. Įrodyta, kad plumbaginas slopina proliferaciją ir sukelia apoptozę prostatos vėžio, kasos, krūties, plaučių, storosios žarnos ir gimdos kaklelio vėžio ląstelėms [49–54]. Vienas pagrindinių plumbagino citotoksiškumo mechanizmų yra susijęs su prooksidaciniu aktyvumu [55]. Keliuose tyrimuose įrodyta, kad plumbagino poveikis padidina reaktyviųjų deguonies junginių kiekį (ROS). ROS kiekio padidėjimas ląstelėse sukelia DNR grandinės trūkius ir greičiausiai prisideda prie ląstelių mirties [56].
Prie apoptozės veda du vienas su kitu susiję keliai: išorinis kelias (žūties receptorių) ir vidinis kelias (mitochondrinis) [57]. Pirmasis kelias susijęs su kaspazės-8, o antrasis su kaspazės-9 aktyvavimu. Aktyvuota kaspazė-8 ar kaspazė-9 gali suaktyvinti tolimesnius baltymus, tokius kaip kaspazė-3 [58]. Veikiant kaspazei-3 atsiranda DNR grandinės trūkiai, ląstelės branduolys susitraukia,
15 susiraukšlėja, formuojasi citoplasminės pūslelės ir apoptoziniai kūnai. Galiausiai gretimos parenchiminės ląstelės, neoplastinės ląstelės ir makrofagai fagocituoja apoptozinius kūnus [57]. Manoma, kad plumbagino sukeliama vėžinių ląstelių apoptozė yra susijusi su mitochondrinio kelio aktyvacija, kurią sukelia padidėjęs ROS kiekis [59].
2018 metais atliktame tyrime su prostatos vėžiu nustatyta, kad plumbaginas stimuliuoja greitą ROS gamybą prostatos vėžinėse ląstelėse. Didindamas intraląstelinį ROS lygį plumbaginas didina endoplazminio tinklo (ET) stresą reguliuojančių baltymų ekpresiją DU145 ląstelėse. Svarbu tai, kad ROS gamybos blokavimas atvirkščiai veikė plumbagino sukeltą ET streso aktyvaciją ir ląstelių apoptozę. In vivo plumbagino vartojimas (2 mg/kg), prasidedantis po 15 dienų po hormonams atsparios prostatos karcinomos ląstelių implantacijos, sumažino tiek naviko svorį tiek tūrį 70%. Pelių gydymas plumbaginu taip pat buvo susijęs su padidėjusiu ET streso aktyvumu. Šie duomenys rodo, kad plumbaginas sukelia prostatos vėžio ląstelių apoptozę per ROS sukeltą ET streso kelią [48].
10.7. Juglonas
Juglonas (5-hidroksi-1,4-naftochinonas) yra natūralus naftochinonas priklausomas Juglandaceae šeimos augalams ir randamas įvairių rūšių riešutmedžių (Juglans regia ir Julans nigra) lukštuose, lapuose ir šaknyse [60]. Šios skirtingos riešutmedžio dalys buvo naudojamos kaip pagrindas tinktūroms, turinčioms teigiamą poveikį sveikatai, pavyzdžiui priešuždegiminį, antibakterinį, priešgrybelinį ir priešvėžinį [61]. Priešvėžinis juglono aktyvumas buvo nustatytas keliose vėžio modelių sistemose, įskaitant plaučių, skrandžio, žarnyno ir glijos vėžius [62–64]. LSMU Neuromokslų instituto biochemijos laboratorijoje buvo nustatyta, kad juglonas gali sukelti gliomos ląstelių žūtį, sumažinti proliferaciją ir invaziškumą, veikiant mažomis, fiziologiškai pasiekiamomis koncentracijomis [14].
10.8. C6 glioblastomos ląstelių linija
Naujausia molekulinė charakteristika, kuri palygino genų ekspresijos pokyčius tarp C6 gliomos ir žiurkių astrocitų, kilusių iš kamieninių ląstelių, parodė, kad genų ekpresijos pokyčiai, pastebėti C6 lstelių linijoje, buvo labiausiai panašūs į tuos, kurie nustatyti žmogaus smegenų navikuose [65]. Palyginus su astrocitais, c6 ląstelės taip pat turėjo padidėjusią šių genų ekspresiją: glijos fibrilinio rūgščiojo baltymo (angl. glial fibrillary acidic protein), PDGFβ (angl. platelet-derived
16
receptor). Žmogaus gliomose taip pat randama padidėjusi šių genų ekspresija [66]. C6 ląstelių modelis
toliau yra plačiai naudojamas įvairiems tyrimams, susijusiems su smegenų navikų biologija [67]. Tai apima naviko augimo, invazijos, migracijos, neovaskuliarizacijos, augimo faktoriaus reguliavimo ir gamybos bei biocheminius tyrimus [68].
11. METODIKA
11.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra
11.1.1. Naudotos medžiagos
1) Ląstelių auginimo terpė (DMEM) (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium; Sigma Aldrich) 2) Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich)
3) Fosfatinis druskos buferis (PBS) (Sigma-Aldrich)
4) Sudėtinis antibiotikų tirpalas (Penicilino – streptomicino tirpalas) (Sigma-Aldrich) 5) Triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich)
6) Dimetilsulfoksidas (DMSO; Sigma Aldrich)
7) HBSS (Hanks’ balanced salt solution; Sigma Aldrich) 8) Propidžio jodidas (C27H34I2N4) (Sigma-Aldrich)
9) Bisbenzimido dažai (Hoechst 33342) (Sigma-Aldrich)
10) 5-hidroksi-2-metil-1,4-naftochinonas – plumbaginas (97%) (Sigma-Aldrich) 11) C6H6N6O2 – temozolomidas (≥98%) (Sigma-Aldrich)
11.1.2. Naudota aparatūra
1) Spektrofotometras ,,UNICOM UV/VIS”
2) Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) HF-1200 GD, A&D Company 3) Fluorescencinis mikroskopas OLYMPUS IX71S1F-3
17 11.2. Ląstelių sėjimo metodika
Tyrimui buvo naudojama C6 ląstelių kultūra išgauta iš žiurkės smegenų auglio Glioblastoma
multiforme. Ląstelės buvo kultivuojamos mitybinėje terpėje, turinčioje DMEM + GlutaMAX™. Į terpę
buvo dėta FBS 10% ir antibiotiko Penicilino/Streptomicino tirpalo (10000 IU/ml – 10000 μg/ml), tam kad nesidaugintų mikroorganizmai. Ląstelės buvo laikomos termostate, 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2.
11.3. Ląstelių tankio nustatymas
Ląstelių skaičiavimui yra naudojamas hemocitometras (Neubauer) (1 pav.) ir triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma Aldrich). 20 μl triptano mėlio dažų tirpalo sumaišoma su 20 μl ląstelių suspensijos ir sušvirkščiama ant hemocitometro kameros po dengiamuoju stikleliu. Stebima pro šviesinį mikroskopą ir skaičiuojamas ląstelių skaičius keturiuose langeliuose. Skaičiuojamos tik baltos ląstelės. Mėlynai nusidažiusios ląstelės neskaičiuojamos, nes pažeidus ląstelių membraną triptano mėlis praeina pro membraną ir jas nudažo mėlynai, tai reiškia jog šios ląstelės yra negyvos.
1 pav. Hemocitometro kamera. Ši kamera yra padalinta į devynis kvadratus 1.0 mm x 1.0 mm, kurie yra atskirti vienas nuo kito trigubomis linijomis. Kiekvienas kvadratas yra 1 mm² ploto [69]
Ląstelių skaičius 1 mililitre apskaičiuojamas pagal formulę: n = (a+b+c+d)*4*2*5000, kur:
n – ląstelių skaičius 1 ml;
a, b, c, d – ląstelių skaičius langeliuose; 5000 = c (konstanta);
18 11.4. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu
MTT arba 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas yra saugus, plačiai naudojamas dažas skirtas kolorimetriniu metodu ląstelių gyvybingumui nustatyti. Tarp visų fermentais grįstų tyrimų MTT yra geriausiai žinomas metodas siekiant nustatyti mitochondrijų dehidrogenazės aktyvumą gyvose ląstelėse. Taikant šį metodą MTT virsta netirpiais purpuriniais formazano kristalais ((E,Z)-5-(dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformazanas) veikiant NAD(P)H dehidrogenazėms.
Į kiekvieną šulinėlį sėjome po 20 000 ląstelių ir jas paveikėme plumbagino, temozolomido ir plumbagino/temozolomido skirtingų koncentracijų tirpalais (koncentracijos nurodytos atitinkamuose paveikslėliuose žemiau). Plumbaginas buvo ištirpintas 70% etanolyje ir kontrolėje naudoto etanolio koncentracija svyravo nuo 0,14% iki 1,4% atitinkamai 1 – 10 µM plumbagino. Temozolomidas buvo ištirpintas DMSO ir kontrolėje naudoto DMSO koncentracija svyravo nuo 0,25% iki 1% atitinkamai 0,25 – 1,5 mM temozolomido.
Po 24 h nuo ląstelių, kurios augo 96 šulinėlių lėkštelėje nupilta DMEM terpė ir šulinėliai du kartus praplauti su PBS. Pašalinus buferį į šulinėlius buvo dedama po 180 µl HBSS ir 20 µl 5 mg/ml MTT dažo. Ląstelės 2 valandas inkubuotos 37°C temperatūroje. Tuomet pašalinus dažą susiformavę kristalai ištirpinti 100 µl 0,2% DMSO tirpale. 15 minučių lėkštelė buvo laikoma tamsoje. Tuomet atlikti matavimai spektrofotometru, absorbcija buvo matuojama prie 550 nm bangos ilgio ir 620 standartinio bangos ilgio [70].
11.5. Ląstelių gyvybingumo nustatymas propidžio jodidu/Hoechst 33342 metodu
Ląstelių gyvybingumą papildomai vertinome fluorescencinės mikroskopijos metodu, veikdami ląsteles propidžio jodido ir Hoechst 33342 dažais. Tyrimui pasirinkome skirtingas plumbagino, temozolomido ir jų derinių koncentracijas ir lyginome gautus duomenis su atitinkamomis kontrolėmis. Į kiekvieną šulinėlį sėjome po 30 000 ląstelių ir jas stebėjome po 24 h. Propidžio jodidas nekrozinius ląstelių branduolius nudažo raudona spalva, o Hoechst 33258 gyvybingų ląstelių branduolius nudažo mėlyna spalva. Fluorescenciniu mikroskopu (OLYMPUS IX71S1F-3) fotografavome atsitiktinai parinktus 5 laukelius kiekviename šulinėlyje. Ląstelės, kurių branduoliai homogeniški, buvo vertinamos kaip sveikos ir gyvybingos ir UV šviesoje jos švytėjo mėlynai. Ląstelių branduoliai UV šviesioje švytintys raudonai, buvo vertinami kaip nekroziniai.
19 11.6. Statistinė duomenų analizė
Statistinė analizė atlikta iš 5-8 atskirų eksperimentų. Visi rezultatai pateikti kaip vidurkis ± vidutinė standartinė paklaida. Eksperimentinių grupių statistiniam palyginimui taikytas vienkryptės ANOVA testas naudojant SigmaPlot 12.5 versiją Windows OS (Systat Software Inc.). Pasikliautinis lygmuo p < 0,05 laikytas kaip statistiškai reikšmingas.
20
12. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
12.1. MTT metodu nustatytas temozolomido, plumbagino ir jų derinių poveikis C6 ląstelių gyvybingumui
Pirmose eksperimentų serijose buvo norima nustatyti kaip plumbaginas, temozolomidas ir jų deriniai veikia C6 ląstelių kultūros gyvybingumą. Šiuos gyvybingumo tyrimus atlikome MTT metodu. Rezultatai pateikti 2, 3, 4 paveiksluose matuojant ląstelių gyvybingumą po 24 valandų.
2 pav. Temozolomido poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų, *p ˂ 0,05 vs kontrolė
2 paveiksle matome, kad lyginant su kontrole 0,25 mM temozolomido statistiškai reikšmingo poveikio C6 ląstelių gyvybingumui neturėjo (atitinkamai 82,1% ).
Paveikus ląsteles 0,5 mM koncentracijos temozolomidu stebėtas statistiškai reikšmingas poveikis, ląstelių gyvybingumas sumažėjo iki 77,5%. Ląsteles paveikus 0,75 – 1,5 mM temozolomidu, pastebimas statistiškai reikšmingas ląstelių gyvybingumo sumažėjimas (68% – 36,9%).
Naskręt-Barciszewska ir kitų autorių atliktame tyrime su žmogaus širdies ląstelėmis (HaCaT), žmogaus gimdos kaklelio vėžio ląstelėmis (HeLa), žmogaus gliomos ląstelių linija (U118MG, T98G)
21 buvo stebėtas panašus 250 – 1000 µM koncentracijos temozolomido poveikis kaip ir mūsų atliktame tyrime [71].
3 pav. Plumbagino poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų, p* ˂ 0,05 vs kontrolė
3 paveiksle pateiktame tyrime matome, jog lyginant su kontrole 1 - 2,5 µM koncentracijos plumbagino statistiškai reikšmingo poveikio C6 ląstelių gyvybingumui neturėjo (86,7% - 82,3%).
Ląsteles paveikus 4 – 6 µM plumbagino, matomas statistiškai reikšmingas ląstelių gyvybingumo sumažėjimas (78,5 % - 66,6%). 8 µM koncentracijos plumbaginas gyvybingų ląstelių skaičių sumažino perpus (49,1%). Ląstelių gyvybingumas, paveikus jas 10 µM plumbaginu, sumažėjo daugiau nei 3 kartus (32,6%).
Cao ir kiti autoriai tyrė plumbagino poveikį žmogaus stemplės vėžio KYSE150 ir KYSE450 ląstelėms ir pastebėjo, kad 5-10 µM koncentracijos plumbaginas ląstelių gyvybingumą po 24 valandų sumažina 75% - 20%. Taip pat nustatyta, kad plumbaginas efektyviau veikia stemplės vėžio ląsteles nei šiuo metu stemplės vėžio gydymui taikoma cisplatina ir fluoruracilas [72].
Chen ir kiti autoriai nustatė, kad 4 – 8 µM koncentracijos plumbaginas gliomos U87 ir U251 ląstelių gyvybingumą sumažino atitinkamai 90% - 58% [73]. Mūsų tyrime matome, kad ląstelių gyvybingumas sumažėjo 78,5% - 49,1% veikiant tomis pačiomis plumbagino koncentracijomis. Taigi
22 galime teigti, kad plumbaginas stipriau veikia glioblastomos C6 ląsteles, nei gliomos U87 ir U251 ląsteles.
4 pav. Temozolomido ir plumbagino derinio poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų, *p ˂ 0,05 vs kontrolė
4 paveiksle pateiktas temozolomido ir plumbagino derinio poveikis ląstelių gyvybingumui lyginant su kontrole. Paveikus ląsteles 4 µM koncentracijos plumbaginu kartu su 250-750 µM koncentracijos temozolomidu gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo statistiškai reikšmingai (nuo 72,6% iki 62,7%). 6 µM koncentracijos plumbaginas derinyje su 250-750 µM koncentracijos temozolomidu gyvybingų ląstelių skaičių sumažino statistiškai reikšmingai (49,4% - 32,3%).
Ląstelių gyvybingumas sumažėja dėl sumažėjusio ląstelių skaičiaus arba dėl sumažėjusio ląstelių metabolinio aktyvumo. Taigi, norint išsiaiškinti ląstelių gyvybingumo sumažėjimo priežastį panaudojome propidžio jodido/Hoechst 33258 metodą.
23 12.2. Propidžio jodido/Hoechst 33528 metodu nustatytas plumbagino ir temozolomido poveikis C6 ląstelių gyvybingumui
Antroje eksperimentų serijoje buvo vertinamas plumbagino ir temozolomido poveikis ląstelių gyvybingumui fluorescencinės mikroskopijos metodu. Propidžio jodidas paveikia DNR, bet nepraeina pro ląstelės membraną ir nekrozinius glioblastomos ląstelių branduolius nudažo raudona spalva. Hoechst 33258 dažas paveikia ląstelės DNR ir praeina pro membraną ir nudažo gyvybingų ląstelių branduolius mėlyna spalva. Skaičiuodami ląsteles nustatėme gyvybingų ir negyvybingų ląstelių santykį procentais.
5 pav. Nuotraukos parodo temozolomido ir plumbagino poveikį C6 ląstelėms po 24 valandų. A nuotraukoje matome kontrolę, B – 500 µM temozolomido poveikis, C – 6 µM plumbagino poveikis,
D – 500 µM temozolomido ir 6 µM plumbagino poveikis.
Šio metodo rezultatai pateikti 6, 7 ir 8 paveiksluose vertinant gyvybingų ir negyvybingų ląstelių santykį procentais po 24 valandų.
24
6 pav. Temozolomido poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų, *p ˂ 0,05 vs kontrolė
6 paveiksle pateiktas temozolomido poveikis ląstelių gyvybingumui, skaičiuojant gyvybingų/negyvybingų ląstelių santykį matomame lauke. 250 µM temozolomido gyvybingų ląstelių skaičiaus nemažino (82,2% gyvybingų ląstelių). 500 µM koncentracijos temozolomidas gyvybingų ląstelių skaičių sumažino statistiškai reikšmingai (iki 78%).
25
7 pav. Plumbagino poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų, *p ˂ 0,05 vs kontrolė
7 paveiksle matome, jog 1 - 2,5 µM plumbagino gyvybingų ląstelių skaičių sumažino iki 88,0% - 81,7%, o negyvybingų ląstelių skaičių padidino (12,0% - 18,3%), tačiau tai nebuvo statistiškai reikšminga. 4 – 6 µM plumbagino negyvybingų ląstelių skaičių padidino apie 2 - 3 kartus (23,7% - 34,9%). Ląsteles paveikus 8 µM plumbagino gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo daugiau nei iki 50%. 10 µM plumbaginas turėjo stipriausią citotoksinį poveikį C6 ląstelėms, negyvybingų ląstelių skaičių padidino iki 68,6%, o gyvybingų ląstelių skaičių sumažino iki 31,4%. Taip pat apskaičiavome plumbagino IC50 = 7,6 ± 0,62 µM.
Somasundaram ir kiti autoriai nagrinėjo plumbagino poveikį krūties adenokarcinomos ląstelių linijoje HCC1937/wt BRCA1. 5 – 10 µM plumbagino koncentracija gyvybingų ląstelių skaičių sumažino 75% - 51% [74]. Lygindami su savo atliktu tyrimu galime teigti, kad tokios pačios plumbagino koncentracijos stipriau veikia glioblastomos C6 ląsteles, nei krūties adenokarcinomos HCC1937/wt BRCA1 ląsteles.
26
8 pav. Temozolomido ir plumbagino derinio poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 valandų, *p ˂ 0,05 vs kontrolė
250/4 µM – 500/4 µM temozolomido ir plumbagino derinys gyvybingų ląstelių skaičių sumažino (71% - 66,8%) ir negyvybingų ląstelių skaičių padidino (29% - 33,2%). Daugiau nei per pusę gyvybingų ląstelių sumažino, o negyvybingų ląstelių padidino 250/6 µM temozolomido ir plumbagino derinys. Stipriausią citotoksinį poveikį C6 ląstelėms turėjo 500/6 µM temozolomido ir plumbagino derinys, kuris negyvybingų ląstelių kiekį padidino iki 61,4%. 6 µM koncentracijos plumbaginas derinyje su temozolomidu turėjo stipresnį citotoksinį poveikį C6 ląstelėms, nei 4 µM plumbagino derinys su temozolomidu. 500/4 µM – 500/6 µM temozolomido ir plumbagino deriniai gyvybingų ląstelių skaičių sumažino statistiškai reikšmingai lyginant atitinkamai su 4 µM ir 6 µM koncentracijos plumbaginu.
Jing ir kiti autoriai atliko tyrimus su skrandžio vėžio ląstelėmis SGC-7901. Jie nustatė, kad veikiant ląsteles plumbagino derinyje su priešvėžiniais preparatais (cisplatina, TNF-α ), plumbaginas didina šių preparatų citotoksiškumą 20 – 40 kartų. [75]
Kawiak ir kiti autoriai tyrė plumbagino, tamoksifeno ir jų kombinacijos poveikį krūties vėžio MCF-7 ir T47D ląstelėms. Tyrimas parodė, kad paveikus krūties vėžio ląsteles plumbagino ir
27
tamoksifeno deriniu gyvybingumas sumažėja net iki 25%, o norint pasiekti tą patį efektą naudojant tik plumbaginą ar tamoksifeną reikia žymiai didesnių koncentracijų [76].
Gowda ir kiti autoriai nustatė, kad plumbagino ir celekoksibo derinys efektyviau mažina melanomos UACC 903 ląstelių gyvybingumą nei kiekvienas jų atskirai [77].
Mūsų ir kitų autorių atlikti tyrimai įrodo, kad naudojant plumbaginą kartu su kitais chemoterapiniais preparatais didėja jų citotoksinis poveikis vėžinėms ląstelėms.
13. IŠVADOS
1. Plumbaginas priklausomai nuo koncentracijos mažina C6 ląstelių gyvybingumą. Statistiškai reikšmingai ląstelių gyvybingumą sumažino 4 – 10 µM plumbaginas. 10 µM plumbaginas turėjo stipriausią citotoksinį poveikį, negyvybingų ląstelių skaičių padidino iki 69%.
2. Priklausomai nuo koncentracijos temozolomidas mažina C6 ląstelių gyvybingumą. Statistiškai reikšmingą poveikį turėjo 0,5 – 1,5 mM koncentracijos temozolomidas.
3. Plumbagino deriniai su temozolomidu citotoksiškai veikia C6 ląstelių gyvybingumą. Stipriausias citotoksinis poveikis stebėtas veikiant ląsteles 6 µM plumbagino ir 500 µM temozolomido deriniu, kai nekrozinių ląstelių skaičius padidėjo iki 61%.
14. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Tolesniuose tyrimuose galima būtų tirti kitų 1,4 – naftochinonų (menadiono juglono) derinių su temozolomidu įtaką glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumui. Taip pat tikslinga tirti kitas priešvėžinėmis savybėmis pasižyminčias natūralias medžiagas derinyje su temozolomidu siekiant stipresnio citotoksinio efekto C6 ląstelių gyvybingumui.
28
15. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. World Health Organization [Prieiga per internetą]. [cituojama pagal 2019 m. kovo 31 d.]. Gauta: http://www.euro.who.int/en/health-topics/noncommunicable-diseases/cancer/data-and-statistics.
2. Arem H, Loftfield E. Cancer Epidemiology: A Survey of Modifiable Risk Factors for Prevention and Survivorship. Am J Lifestyle Med. 2018;12(3):200–10.
3. Colombet M, Dyba T, Randi G, Soerjomataram I, Visser O, Bray F, et al. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: Estimates for 40 countries and 25 major cancers in 2018. Eur J Cancer. 2018;103:356–87.
4. Riaz N, Wolden SL, Gelblum DY, Eric J. Effective treatment of glioblastoma requires crossing the blood– brain barrier and targeting tumors including cancer stem cells: The promise of nanomedicine. 2016;118(24):6072–8.
5. Ozdemir-Kaynak E, Qutub AA, Yesil-Celiktas O. Advances in glioblastoma multiforme treatment: New models for nanoparticle therapy. Front Physiol. 2018;9(MAR):1–14.
6. Oshiro S, Tsugu H, Komatsu F, Ohmura T, Ohta M, Sakamoto S, et al. Efficacy of temozolomide treatment in patients with high-grade glioma. Anticancer Res. 2009;29(3):911–8. 7. Joo JD, Kim H, Kim YH, Han JH, Kim CY. Validation of the effectiveness and safety of temozolomide during and after radiotherapy for newly diagnosed glioblastomas: 10-year experience of a single institution. J Korean Med Sci. 2015;30(11):1597–603.
8. Aziz MH, Dreckschmidt NE, Verma AK. Plumbagin, a medicinal plant-derived naphthoquinone, is a novel inhibitor of the growth and invasion of hormone-refractory prostate cancer. Cancer Res. 2008;68(21):9024–32.
9. K.A. M, M.K. S, P. R, F. L, L. R, H.S. H, et al. Plumbagin inhibits invasion and migration of breast and gastric cancer cells by downregulating the expression of chemokine receptor CXCR4. Mol Cancer. 2011;1–14.
10. Subramaniya BR, Srinivasan G, Sadullah SSM, Davis N, Subhadara LBR, Halagowder D, et al. Apoptosis inducing effect of Plumbagin on colonic cancer cells depends on expression of COX-2. PLoS One. 2011;6(4).
11. Lai L, Liu J, Zhai D, Lin Q, He L, Dong Y, et al. Plumbagin inhibits tumour angiogenesis and tumour growth through the Ras signalling pathway following activation of the VEGF receptor-2. Br J Pharmacol. 2012;165(4 B):1084–96.
12. Sinha S, Pal K, Elkhanany A, Dutta S, Cao Y, Mondal G, et al. Plumbagin inhibits tumorigenesis and angiogenesis of ovarian cancer cells in vivo. Int J Cancer. 2013;132(5):1201–
29 12.
13. Niu M, Cai W, Liu H, Chong Y, Hu W, Gao S, et al. Plumbagin inhibits growth of gliomas in vivo via suppression of FOXM1 expression. J Pharmacol Sci. 2015;128(3):131–6.
14. Meskelevicius D, Sidlauskas K, Bagdonaviciute R, Liobikas J, Majiene D. Juglone Exerts Cytotoxic, Anti-proliferative and Anti-invasive Effects on Glioblastoma Multiforme in a Cell Culture Model. Anticancer Agents Med Chem. 2016;16(9):1190–7.
15. Hanif F, Muzaffar K, Perveen K, Malhi SM, Simjee SU. Glioblastoma Multiforme: A Review of its Epidemiology and Pathogenesis through Clinical Presentation and Treatment. Asian Pacific J Cancer Prev J Cancer Prev. 2017;18(1):3–9.
16. Rock K, McArdle O, Forde P, Dunne M, Fitzpatrick D, O’Neill B, et al. A clinical review of treatment outcomes in glioblastoma multiforme - The validation in a non-trial population of the results of a randomised Phase III clinical trial: Has a more radical approach improved survival? Br J Radiol. 2012;85(1017):729–33.
17. Thakkar JM, Dolecek TA. Epidemiologic and Molecular Prognostic Review of Glioblastoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2014;23(10):1985–96.
18. Urbanska K, Sokolowska J, Szmidt M, Sysa P. Glioblastoma multiforme - An overview. Wspolczesna Onkol. 2014;18(5):307–12.
19. JOVČEVSKA I, KOČEVAR N, KOMEL R. Glioma and glioblastoma - how much do we (not) know? Mol Clin Oncol. 2013;1(6):935–41.
20. Al-Rawi SA, Saleh BO, Al-Naqqash MA. Serum anti-müllerian hormone levels in evaluation of chemotherapy effect on ovarian reserve in women with breast cancer: A follow-up study. Saudi Med J. 2018;39(7):733–5.
21. Wang H, Xu T, Jiang Y, Xu H, Yan Y, Fu D, et al. The Challenges and the Promise of Molecular Targeted Therapy in Malignant Gliomas. Neoplasia. 2015;17(3):239–55.
22. Vitucci M, Hayes DN, Miller CR. Gene expression profiling of gliomas: Merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br J Cancer. 2011;104(4):545–53. 23. Louis DN, Perry A, Reifenberger G, von Deimling A, Figarella-Branger D, Cavenee WK, et al.
The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathol. 2016;131(6):803–20.
24. Young RM, Jamshidi A, Davis G, Sherman JH. Current trends in the surgical management and treatment of adult glioblastoma. Ann Transl Med. 2015;3(9):121.
25. Schiff D, Lee EQ, Nayak L, Norden AD, Reardon DA, Wen PY. Medical management of brain tumors and the sequelae of treatment. Neuro Oncol. 2015;17(4):488–504.
26. Johnson DR, Fogh SE, Giannini C, Kaufmann TJ, Raghunathan A, Theodosopoulos P V., et al. Case-based review: Newly diagnosed glioblastoma. Neuro-Oncology Pract. 2015;2(3):106–21.
30 27. Iacob G, Dinca E. Current data and strategy in glioblastoma multiforme. J Med Life.
2009;2(4):386–93.
28. Witthayanuwat S, Pesee M, Supaadirek C, Thamronganantasakul K, Krusun S. Survival Analysis of Glioblastoma Multiforme. 2018;19(2009):2613–7.
29. SANJIV S. AGARWALA JMK. Temozolomide, a Novel Alkylating Agent with Activity in the Central Nervous System, May Improve the Treatment of Advanced Metastatic Melanoma. Oncologist. 2000;5(2):144–51.
30. Thomas RP. LRSN. Advances in the management of glioblastoma the role of TMZ and MGMT testing-CP.pdf. Clin Pharmacol Adv Appl. 2012;1–9.
31. Hagen C, Schroeder HD, Hansen S, Hagen C, Andersen M. Temozolomide treatment of a pituitary carcinoma and two pituitary macroadenomas resistant to conventional therapy. Eur J Endocrinol. 2009;161(4):631–7.
32. Bae SH, Park MJ, Lee MM, Kim TM, Lee SH, Cho SY, et al. Toxicity profile of temozolomide in the treatment of 300 malignant glioma patients in Korea. J Korean Med Sci. 2014;29(7):980– 4.
33. ISHIKAWA E, YAMAMOTO T, SAKAMOTO N, NAKAI K, AKUTSU H, TSUBOI K, et al. Low peripheral lymphocyte count before focal radiotherapy plus concomitant temozolomide predicts severe lymphopenia during malignant glioma treatment. Neurol Med Chir (Tokyo). 2010;50(8):638–44.
34. Deluche E, Leobon S, Touraine F, Clavère P. Two cases of cutaneous drug eruption associated with temozolomide therapy for glioblastoma. Curr Oncol. 2014;21(6):e779–81.
35. Oh J, Kutas GJ, Davey P, Morrison M, Perry JR. Aplastic anemia with concurrent temozolomide treatment in a patient with glioblastoma multiforme. Curr Oncol. 2010;17(4):124–6.
36. Ramos-Peralta L, Lopez-Lopez LI, Silva-Belmares SY, Zugasti-Cruz A, Rodriguez-Herrera, Anguilar-Gonzalez CN. Naphthoquinone : Bioactivity and Green Synthesis. Basic Sci Technol Adv Educ Programs. 2015;(January 2016):542–50.
37. Carranza Ing José Cárdenas Valdés VC, Itzel LÓPEZ LÓPEZ L, Daniel NERY FLORES QFB S, Yesenia SILVA BELMARES S, Sáenz Galindo A. Naphthoquinones: Biological Properties and Synthesis of Lawsone and Derivatives — a Structured Review Naftoquinonas: Propiedades Biológicas Y Síntesis De Lawsona Y Derivados – Una Revisión Estructurada. 2145;121–4004. 38. Saeed SMG, Sayeed SA, Ashraf S, Naz S, Siddiqi R, Ali R, et al. A new method for the
isolation and purification of Lawsone from Lawsonia Inermis and its ROS inhibitory activity. Pakistan J Bot. 2013;45(4):1431–6.
31 migration and invasion and inducing activity on cholangiocarcinoma cell apoptosis. 2018;11(August):430–5.
40. Jain M, Kapadia R, Jadeja RN, Thounaojam MC, Vijaysinh RD, Mishra SH. Traditional uses, phytochemistry and pharmacology of Ficus carica: A review. Asian Pac J Trop Biomed. 2012;52(11):1487–503.
41. Aithal KB, Kumar S, Rao BN, Udupa N, Rao SBS. Tumor growth inhibitory effect of juglone and its radiation sensitizing potential: In vivo and in vitro studies. Integr Cancer Ther. 2012;11(1):68–80.
42. Wei Y, Yang Q, Zhang Y, Zhao T, Liu X, Zhong J, et al. Plumbagin restrains hepatocellular carcinoma angiogenesis by suppressing the migration and invasion of tumor-derived vascular endothelial cells. 2017;8(9):15230–41.
43. Sung B, Oyajobi B, Aggarwal BB. Plumbagin Inhibits Osteoclastogenesis and Reduces Human Breast Cancer-Induced Osteolytic Bone Metastasis in Mice through Suppression of RANKL Signaling. Mol Cancer Ther. 2012;11(2):350–9.
44. Futuro DO, Ferreira PG, Nicoletti CD, Borba-Santos LP, Da Silva FC, Rozental S, et al. The antifungal activity of naphthoquinones: An integrative review. An Acad Bras Cienc. 2018;90(1):1187–214.
45. Jeyachandran R, Mahesh A, Cindrella L, Sudhakar S, Pazhanichamy K. Antibacterial activity of plumbagin and root extracts of Plumbago Zeylanica L. Acta Biol Cracoviensia Ser Bot. 2009;51(1):17–22.
46. Pradeepa V, Sathish-Narayanan S, Kirubakaran SA, Senthil-Nathan S. Antimalarial efficacy of dynamic compound of plumbagin chemical constituent from Plumbago zeylanica Linn (Plumbaginaceae) against the malarial vector Anopheles stephensi Liston (Diptera: Culicidae). Parasitol Res. 2014;113(8):3105–9.
47. Checker R, Patwardhan RS, Sharma D, Menon J, Thoh M, Sandur SK, et al. Plumbagin, a vitamin K3 analogue, abrogates lipopolysaccharide-induced oxidative stress, inflammation and endotoxic shock via NF-κB suppression. Inflammation. 2014;37(2):542–54.
48. Huang H, Xie H, Pan Y, Zheng K, Xia Y, Chen W. Plumbagin Triggers ER Stress-Mediated Apoptosis in Prostate Cancer Cells via Induction of ROS. Cell Physiol Biochem. 2018;45(1):267–80.
49. Hafeez B Bin, Jamal MS, Fischer JW, Mustafa A, Verma AK. Plumbagin, a plant derived natural agent inhibits the growth of pancreatic cancer cells in in vitro and in vivo via targeting EGFR, Stat3 and NF-κB signaling pathways. Int J Cancer. 2012;131(9):2175–86.
50. Ehman EC, Johnson GB, Villanueva-meyer JE, Cha S, Leynes AP, Eric P, et al. Plumbagin inhibits prostate carcinogenesis in intact and castrated PTEN knockout mice via targeting PKCε,
32 Stat3 and epithelial to mesenchymal transition markers. 2017;46(5):1247–62.
51. Lavery A, Kirby RS, Chowdhury S. Plumbagin, a medicinal plant-derived naphthoquinone, is a novel inhibitor of the growth and invasion of hormone refractory prostate cancer. 2016;68(21):9024–32.
52. Jaiswal A, Sabarwal A, Narayan Mishra JP, Singh RP. Plumbagin induces ROS-mediated apoptosis and cell cycle arrest and inhibits EMT in human cervical carcinoma cells. RSC Adv. 2018;8(56):32022–37.
53. Qiao H, Wang TY, Yan W, Qin A, Fan QM, Han XG, et al. Synergistic suppression of human breast cancer cells by combination of plumbagin and zoledronic acid in vitro. Acta Pharmacol Sin. 2015;36(9):1085–98.
54. Gomathinayagam R, Sowmyalakshmi S, Mardhatillah F, Kumar R, Akbarsha MA, Damodaran C. Anticancer mechanism of plumbagin, a natural compound, on non-small cell lung cancer cells. Anticancer Res. 2008;28(2 A):785–92.
55. Kapur A, Beres T, Rathi K, Nayak AP, Czarnecki A, Felder M, et al. Oxidative stress via inhibition of the mitochondrial electron transport and Nrf-2-mediated anti-oxidative response regulate the cytotoxic activity of plumbagin. Sci Rep. 2018;8(1):1–16.
56. Sand JM, Hafeez B Bin, Jamal MS, Witkowsky O, Siebers EM, Fischer J, et al. Plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone), isolated from Plumbago zeylanica, inhibits ultraviolet radiation-induced development of squamous cell carcinomas. Carcinogenesis. 2012;33(1):184– 90.
57. Susan E. Apoptosis: A Reveiw of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 2007;35(4):496– 516.
58. Ni F, Huang X, Chen Z, Qian W, Tong X. Shikonin exerts antitumor activity in Burkitt’s lymphoma by inhibiting C-MYC and PI3K/AKT/mTOR pathway and acts synergistically with doxorubicin. Sci Rep. 2018;8(1):1–10.
59. Zhou S-F, Pan S-T, Qin Y, Zhou Z-W, He Z, Zhang X, et al. Plumbagin induces G2/M arrest, apoptosis, and autophagy via p38 MAPK- and PI3K/Akt/mTOR-mediated pathways in human tongue squamous cell carcinoma cells. Drug Des Devel Ther. 2015;1601.
60. Soto-Maldonado C, Vergara-Castro M, Jara-Quezada J, Caballero-Valdés E, Müller-Pavez A, Zúñiga-Hansen ME, et al. Polyphenolic extracts of walnut (Juglans regia) green husk containing juglone inhibit the growth of HL-60 cells and induce apoptosis. Electron J Biotechnol. 2019;39:1–7.
61. Al-nadaf AH, Bastoni HM, Hamdan DF. Microwave-assisted efficient extraction of. 2018;12(3):182–90.
33 evaluation of lipophilic 1,4-naphthoquinone derivatives against human cancer cell lines. Molecules. 2015;20(7):11994–2015.
63. Zhang XB, Zou CL, Duan YX, Wu F, Li G. Activity guided isolation and modification of juglone from Juglans regia as potent cytotoxic agent against lung cancer cell lines. BMC Complement Altern Med. 2015;15(1):1–8.
64. Bayram D, Özgöçmen M, Armagan I, Sevimli M, Türel GY ŞN. Investigation of apoptotic effect of juglone on CCL-228-SW 480 colon cancer cell line. J Cancer Res Ther. 2019;15:68– 74.
65. Sibenaller ZA, Etame AB, Ali MM, Barua M, Braun TA, Casavant TL, et al. Genetic characterization of commonly used glioma cell lines in the rat animal model system. Neurosurg Focus. 2005;19(4):1–9.
66. Guo P, Hu B, Gu W, Xu L, Wang D, Huang HJS, et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. Am J Pathol. 2003;162(4):1083–93. 67. Karmakar S, Olive M, Banik N, Ray S. Intracranial stereotaxic cannulation for development of
orthotopic glioblastoma allograft in Sprague-Dawley rats and histoimmunopathological characterization of the brain tumor. Neurochem Res. 2007;(32):2235–42.
68. Assadian S, Aliaga A, Del Maestro RF, Evans AC, Bedell BJ. FDG-PET imaging for the evaluation of antiglioma agents in a rat model. Neuro Oncol. 2008;10(3):292–9.
69. Hemocytometer for Cell Counting [Prieiga per internetą]. Weber Scientific. [cituojama pagal 2019 m. kovo 13 d.]. Gauta: http://www.weberscientific.com/hemocytometer-for-cell-counting. 70. Johan van Meerloo, Gertjan J.L. Kaspers and JC. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay.
Cancer Cell Cult. 2003;(March):237–45.
71. Naskręt-Barciszewska MZ, Głodowicz P, Gurda D, Barciszewska A-M, Nowak S. A New Epigenetic Mechanism of Temozolomide Action in Glioma Cells. PLoS One. 2015;10(8):e0136669.
72. Cao YY, Yu J, Liu TT, Yang KX, Yang LY, Chen Q, et al. Plumbagin inhibits the proliferation and survival of esophageal cancer cells by blocking STAT3-PLK1-AKT signaling article. Cell Death Dis. 2018;9(2).
73. Chen G, Yue Y, Qin J, Xiao X, Ren Q, Xiao B. Plumbagin suppresses the migration and invasion of glioma cells via downregulation of MMP-2/9 expression and inaction of PI3K/Akt signaling pathway in vitro. J Pharmacol Sci. 2017;134(1):59–67.
74. Somasundaram V, Hemalatha SK, Pal K, Sinha S, Nair AS, Mukhopadhyay D, et al. Selective mode of action of plumbagin through BRCA1 deficient breast cancer stem cells. BMC Cancer. 2016;16(1):1–16.
34 75. Jing L, Lin S, Lu FR, You Q, Rui C, Jia L, et al. Plumbagin inhibits cell growth and potentiates apoptosis in human gastric cancer cells in vitro through the NF-B signaling pathway. Acta Pharmacol Sin. 2012;33(2):242–9.
76. Kawiak A, Domachowska A, Jaworska A, Lojkowska E. Plumbagin sensitizes breast cancer cells to tamoxifen-induced cell death through GRP78 inhibition and Bik upregulation. Sci Rep. 2017;7(March):1–9.
77. Gowda R, Kardos G, Sharma A, Singh S, Robertson GP. Nanoparticle-Based Celecoxib and Plumbagin for the Synergistic Treatment of Melanoma. Mol Cancer Ther. 2016;16(3):440–52.
