LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Karolina Jankauskaitė
Čekoslovakijos vilkšunių ir vokiečių aviganių veislės šunų eritrocitų morfologijos palyginamoji analizė
Morphological Comparative Analysis of Erythrocytes in Czechoslovakian Wolfdog and German Shepherd Dogs
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: lekt. dr. Jūratė Sabeckienė
Kaunas, 2019
2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Čekoslovakijos vilkšunių ir vokiečių aviganių veislės šunų kraujo morfologijos palyginamoji analizė“
:1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)
3
TURINYS
TURINYS ... 3
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Šunų veislės ... 10
1.1.1 Čekoslovakijos vilkšunių genetinė kompozicija ... 10
1.1.2. Vokiečių aviganių genetinė kompozicija ... 11
1.2. Eritrocitai ... 11
1.2.1. Eritrocitų morfometrija ... 11
1.2.2. Eritrocitų morfologija ... 12
1.2.3. Eritrocitų spalvos pokyčiai ... 13
1.2.4. Eritrocitų formos pokyčiai ... 13
1.2.5. Intraeritrocitinės struktūros ... 18
1.2.6. Eritrocitų išsidėstymas ... 20
1.2.7. Kiti eritocitų struktūros pokyčiai ... 21
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGOS ... 22
2.1. Kraujo tepinėlio ruošimo metodika ... 23
2.2. Morfometrinio tyrimo metodika ... 24
2.3. Morfologinio tyrimo metodika ... 24
2.4 Duomenų statistinė analizė ... 26
3. TYRIMO REZULTATAI ... 27
3.1. Eritrocitų morfometriniai duomenys ... 27
3.1.1 Eritrocitų skersmuo ... 27
3.1.2. Eritrocitų perimetras ... 33
4
3.1.3. Eritrocitų plotas ... 35
3.2. Eritrocitų morfologiniai duomenys ... 36
REZULTATŲ APTARIMAS ... 40
IŠVADOS ... 43
REKOMENDACIJOS ... 44
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45
5
SANTRAUKA
Čekoslovakijos vilkšunių ir vokiečių aviganių veislės šunų eritrocitų morfologijos palyginamoji analizė
Karolina Jankauskaitė Magistro baigiamasis darbas
Darbo tikslas buvo išanalizuoti eritrocitų kraujo morfologinius ir morfometrinius parametrus pasirinktoms giminingoms, Čekoslovakijos vilkšunių (ČSV) ir vokiečių aviganių (VA), šunų veislėms. Buvo surinkta 40 (20 Čekoslovakijos vilkšunių ir 20 vokiečių aviganių) kraujo mėginių.
Tyrime buvo analizuojamas eritrocitų dydžio kitimas priklausomai nuo amžiaus, lyties ir veislės, bei nustatomos dažniausiai pastebimos eritrocitų patologijos. Iki šiol dar nebuvo atlikta tyrimų nustatančių eritrocitų dydžių skirtumus giminingose šunų veislėse, tokiose kaip Čekoslovakijos vilkšuniai ir vokiečių aviganiai.
Gauti rezultatai rodo, kad abiejuose šunų veislėse eritrocitų skersmens imtis, įtraukiant ir makrocitinius bei mikrocitinius eritrocitus, yra nuo 4,8µm iki 9,5µm. Skersmens minimalios ir maksimalios reikšmės iki keturių metų amžiaus mažėja, paskui reikšmė nežymiai pakyla, tuomet eritrocitų skersmuo vėl pradeda mažėti iki dvylikos metų amžiaus. Patvirtinta regresinė priklausomybė, kad didėjant šunų amžiui eritrocitų dydis mažėja.
Nors pasirinktos šunų veislės yra giminingos, tačiau statistiškai reikšminga (p<0,01), kad ČSV eritrocitai visose amžiaus grupėse turi didesnę skersmens, perimetro ir ploto reikšmę nei VA veislės šunys: RBC perimetro vidurkis ČSV yra 23,56µm, VA 22,23µm, RBC ploto vidurkis ČSV yra 43,52µm², VA 39,73µm², p<0.01. Nebuvo nustatyta šunų lyties įtaka eritrocitų dydžiui.
Patologiniai eritrocitai rasti 55 proc. mėginiuose ir jų dažnis lyginant šunų veisles buvo vienodas. Daigiausia buvo keturlapio formos eritrocitų (30 proc.), o stomatocitai, leptocitai, kodocitai ir kiti patologiniai eritrocitai sudarė mžiau nei 30 proc. RBC pakitimai buvo diagnostiškai nereikšmingi rodikliai.
Šunų eritrocitų morfometrinių duomenų normos bei vidurkiai palengvintų hematologų darbą,
siekiant įvertinti makrocitinius ir mikrocitinius eritrocitus, anemijų atvejais.
6
SUMMARY
Morphological Comparative Analysis of Erythrocytes in Czechoslovakian Wolfdog and German Shepherd Dogs
Karolina Jankauskaitė Master ‘s Thesis
The aim of the thesis is to analyze the morphological and morphometrical parameters of erythrocytes in relative dog breeds - Czechoslovakian wolfdog (CZW) and German shepherd (GS).
We have collected 40 blood samples from 20 CZW and 20 GS. In our research we did the analysis in the dependencies between age, sex and breed. Furthermore, we analyzed the most common pathologies of red blood cells. Until now the size differences of the red blood cells in relative dog breeds such as CZW and GS were never determined.
The results show that the diameter of erythrocytes was between 4,8µm and 9,5µm. The minimal and maximal values of the diameter of RBC were decreasing till the age of 4 years, then the value has a slight increase till the age of 8 years and then till the age of 12 the value of RBC is decreasing.
We have confirmed the regressive dependency which shows that the older the dog – the smaller the erythrocytes.
Even thou sample breeds are close relatives, there is a statistical importance (p<0,01) that CZW red blood cells in different age categories has bigger values of diameter, perimeter and surface area than GS breed has: average diameter of RBC of CZW is 23,56 µm, GS is 22,23 µm, surface area of RBC of CZW is 43,52 µm², GS is 39,73 µm², p<0.01. It was found out that the gender does not impact the size of the erythrocytes.
55% of determined blood samples has pathological erythrocytes in both breeds. The most common is the “quatrefoil” erythrocytes (30%) while stomatocytes, leptocytes, codocytes and other pathological cells were found in less than 30% of the samples. The pathological differences in RBC were diagnostically unimportant indicators.
The morphological data of erythrocytes would highly increase the success rate of hematologist
research while trying to evaluate macrocites and microcites in cases of anemia.
7
SANTRUMPOS
RBC - raudonieji kraujo kūneliai (eng. Red blood cells) ATP - adenozintrifosfatas
MCV - vidutinis eritrocito tūris (eng. mean corpuscular volume) EDTA - antikoaguliantas (etilendiamintetraacetato rūgšties druska) DIK - diseminuota intravaskulinė koaguliopatija
VA - vokiečių aviganių veislės šunys
ČSV- Čekoslovakijos vilkšuniai veislės šunys
8
ĮVADAS
Eritrocitai gyvūnų organizme atlieka itin svarbią, deguonies pernešimo į organizmo audinių ląsteles, funkciją. Jų kiekybinio ir kokybinio tyrimo įvertinimo rezultatai visuomet buvo svarbūs fiziologinės ir bendros gyvūno būklės rodikliai (1). Dedama vis daugiau pastangų norint rasti naujų metodų vertinant raudonųjų kraujo kūnelių struktūrą ir morfologiją (2). Kraujo tepinėlio analizavimas ir morfometriniai rezultatai yra vienas iš būdų tiksliai ir pilnai įvertinti kraujo kūnelių sandaros pakitimus. Eritrocitų dydžio skirtumai yra identifikuojami pas skirtingas gyvūnų rūšis.
Šunų eritrocitų dydžio pasiskirstymas yra įgimtas arba organizmo biocheminių sutrikimų sukeltas reiškinys. Šiai dienai yra aišku, kad kai kurios veislės pasižymi mažesniais (mikrocitiniais) arba dideliais (makrocitiniais) eritrocitais.
Vokiečių aviganių veislės šunų kraujas yra tirtas užsienio mokslininkų ir rezultatai apie eritrocitų dydžius bei galimas patologijas plačiai publikuojami. Tuo tarpu Čekoslovakijos vilkšunių, šunų, kurie labiausiai savo išvaizda primena vilkus, kraujas yra labai siaurai tyrinėjamas tiek Lietuvos, tiek užsienio mokslininkų. Iki šiol nebuvo analizuojama ar skirtingos, tačiau giminingos, šunų veislės turi skirtingų dydžių eritrocitus. Taip pat šiuo darbu norima išsiaiškinti ar eritrocitų dydis yra kintamasis rodiklis, kokios yra eritrocitų dydžio priklausomybės keičiantis šunų amžiui, įvertinti ar eritrocitų dydžio pokytis matomas ir giminingos veislės šunų kraujyje.
Žmonių medicinoje eritrocitų skersmens dydžiai analizuojami jau nuo seno. Yra žinomos RBC
minimalios ir maksimalios reikšmės, kurios leidžia vertinti kitus raudonųjų kraujo kūnelių
nuokrypius ir makrocitines bei mikrocitines kraujo patologijas. Veterinarinėje medicinoje eritrocitų
skersmens pokyčiai nėra pilnai išanalizuoti. Yra žinomos tam tikros tendencijos, kad kai kurios šunų
veislės turi mažesnius arba didesnius eritrocitus, tačiau aiškių tendencijų ir aiškios priklausomybės
neanalizuojama. Ateityje susumavus tyrimų rezultatus ir nustačius kiekvienos veislės šunų eritrocitų
dydžius, kaip ir žmonių medicinoje, būtų galima tikslingiau spręsti apie kraujo patologijas. Nustatant
RBC dydžių skirtumų priklausomybes nuo amžiaus, lyties ir veislės, mes geriau suvoktumėme jų
įvairovę ir galėtumėme tinkamai vertinti makrocitines, normocitines ir mikrocitines anemijų rūšis.
9 Darbo tikslas: Išanalizuoti eritrocitų kraujo morfologinius ir morfometrinius parametrus pasirinktoms giminingoms Čekoslovakijos vilkšunių (ČSV) ir vokiečių aviganių (VA) šunų veislėms.
Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti eritrocitų morfometrinių parametrų skirtumus ČVS ir VA šunų veislėse.
2. Išanalizuoti lyties ir amžiaus įtaką eritrocitų morfometrinių parametrų kitimui ČVS ir VA šunų veislėse.
3. Išanalizuoti dažniausiai pasireiškiančias eritrocitų morfologijos patologijas.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Šunų veislės
1.1.1 Čekoslovakijos vilkšunių genetinė kompozicija
Nuo pat senų laikų žmonės aktyviai siekė prijaukinti laukinių gyvūnų rūšis, jas naudoti maisto gamybai, saugos užtikrinimui ar tiesiog pramogai. Laikui bėgant vis daugiau gyvūnų rūšių buvo veisiami naudojant selektyviąją atranką, siekiant dirbtinai sustiprinti pageidautinas gyvūno savybes.
Šiuo metu vyksta priešinga tendencija, kuomet šunys yra veisiami norint sugrąžinti genetinį vilkų fondą, dalyvaujant antropogeninėms hibridizacijos atvejams (3). Čekoslovakijos vilkšunis (ČSV) yra puikus to pavyzdys. Tai unikali šunų veislė, kuri kilo 1950 metais, kaip kariniams tikslams skirtas eksperimentas, iš hibridizacijos tarp vokiečių aviganių ir laukinių Karpatų vilkų (1pav.). Ši veislė buvo naudojama Čekoslovakijos sienų saugojimui šaltojo karo metais, o šiais laikais yra auginami civilių visame pasaulyje. 2015m. atlikti genotipo tyrimai įrodė, kad Čekoslovakijos vilkšunių artimiausi protėviai yra Karpatų vilkai ir vokiečių aviganiai (4). Identifikuojant ČSV genotipinį fondą atskleista, kad šie šunys turi savotišką genetinį kodą, parodantis ribotą vilkų chromosomų alelių integraciją į genotipą. ČSV genai skiriasi nuo abiejų protėvių, o taip pat ir nuo kitų analizuotų veislių, dėl galimo alelių dreifo arba mutacijos, nes nustatytas giminingo veisimo (eng. inbreeding) koeficientas buvo mažas (4) (3). Šunys, kurie yra genetiškai susiję su vokiečių aviganių veisle, turi autosominio recesyvinio LHX3 geno paveldėjimą. Šis genas turi įtakos hipofizės hormonų sintezei ir gali būti mažo ūgio priežastimi (5). Šiuo metu ČSV genetinį fondą turinčių registruotų šunų skaičius siekia 24982 vienetus pasaulyje ir yra sparčiai populiarėjanti veislė (3). Lietuvoje registruojama apie 70 ČSV veislės šunų.
1 pav. Čekoslovakijos vilkšunis kairėje ir Karpatų vilkas dešinėje (6)
11 1.1.2. Vokiečių aviganių genetinė kompozicija
Pirmieji šios veislės šunys buvo veisiami tiek centrinėje, tiek rytinėje Vokietijos dalyje 1889 metais. Vokiečių aviganiai (VA) pasižymi kaip labai produktyvūs ir geri darbo šunys, tinkami tiek saugai, tiek kariniams veiksmams, tiek įvairiai tarnybai (6). Jau nuo 1800 metų šiaurės vakarų Europos šalyse (Belgijoje, Vokietijoje, Olandijoje) labiausiai paplitęs šuo, kuris ganė avis, buvo vadinamas „Žemyninio aviganio šunimi“, tačiau paskui šunys buvo pavadinti pagal gyvenamosios vietos pavadinimą. Šiais laikais jų pirminę išvaizdą labiausiai atspindi olandų aviganis, tačiau visi šie šunys yra genetiškai panašūs. Šiandien VA yra viena iš labiausiai paplitusių šunų veislių pasaulyje, Amerikos šunų klubo duomenimis užimanti antrą vietą pasaulyje. Nepaisant vis didėjančio VA augintojų skaičiaus, moksliniuose tyrimuose buvo aprašyta daugiau nei 50 mutacijų, susijusių su paveldimomis ligomis, kurias paveldi VA (7). Veislės populiacijoje dažnai pasireiškia tokios patologijos kaip išorinis ausų uždegimas, osteoartritas, chroninis viduriavimas, nutukimas ar antsvoris bei agresija, o dažniausia mirties priežastis yra skeleto-raumenų sutrikimai (8).
1.2. Eritrocitai
1.2.1. Eritrocitų morfometrija
Žmonių ir gyvūnų morfometrinių ir hematologinių kiekybinio ir kokybinio tyrimo įvertinimo rezultatai visuomet buvo svarbūs fiziologinės ir bendros gyvūno būklės rodikliai (1). Morfometriniai tyrimai, matuojant raudonųjų kraujo kūnelių skersmenį, perimetrą ir plotą, rodo, kad eritrocitų dydžiai svyruoja ir yra nevienodi. Kūnelių perimetras skiriasi tarp veislių net ir tuomet kai šunys auginami tomis pačiomis sąlygomis, toje pačioje aplinkoje. Taip pat nustatyta, kad pas pateles eritrocitų perimetras didesnis nei pas vyriškos lyties šunis (1). Pastebimas reikšmingas eritrocitų dydžių skirtumas lyginant amžiaus variacijas, nes jaunų gyvūnų raudonosios kraujo ląstelės yra didesnės negu suaugusių gyvūnų(9). Lyginant gyvūnų rūšis šunų eritrocitai yra vieni iš didžiausių, o jų skersmuo vyrauja nuo 6 iki 8μm (10). Galvijų eritrocitai siekia nuo 5 iki 6μm, avių nuo 4 iki 5μm, ožkų eritrocitai yra patys mažiausi ir siekia tik nuo 2,5 iki 3,9μm (10). Lyginant eritrocitų dydžius pagal šunų veisles nustatyta, kad pudeliai pasižymi didesniais eritrocitais- makrocitais, o japoninės veislės (Akita Inu ir Šiba Inu) pasižymi raudonųjų kraujo kūnelių mikrocitoze (10).
Lyginant arabų kurto ir VA veislės šunis pagal morfometrinius parametrus buvo pastebėta, kad VA eritrocitai yra mažesnio skersmens nei arabų kurto veislės šunų raudonieji kraujo kūneliai.
Eritrocitų dydžio skirtumai ir įvairovė vadinama – anizocitoze. Ji pastebima dėl skirtingo
eritrocitų subrendimo laipsnio kraujyje. Raudonųjų kraujo kūnelių dydis pradeda kisti gyvūnui esant
9-12 savaičių amžiaus (10). Didžiausi jie tampa gyvūnui esant nuo 1 iki 2 metų amžiaus, o esant 2-
4 metų amžiaus pradeda mažėti. Lyginant eritrocitų dydį atsižvelgiant į gyvūnų lytį koreliacijų
12 nepastebima (9). Taip pat anizocitozė gali rodyti geležies trūkumą organizme, nes tuomet vyksta mažo diametro raudonųjų kraujo kūnelių eritropoezė. Esant regeneracinei anemijai kraujyje padidėja retikuliocitų kiekis, o pastarieji yra didesni už subrendusius eritrocitus (15). Taip pat anizocitozė pastebima po kraujo perpylimo.
Matuojant vidutinį eritrocito tūrį (MCV) arba stebint kraujo tepinėlį RBC galima skirstyti į mikrocitus ir makrocitus. Mikrocitai – tai mažesni nei standartiniai eritrocitai. Jų smulkus dydis gali būti sąlygotas anemijos, sutrikusio baltymo feritino sintezės arba dėl geležies kiekio stygiaus organizme dažniausiai esant lėtinės kilmės kraujavimams (16). Makrocitai – tai turintys didesnį tūrį ir vizualiai didesni eritrocitai. Pas kitas gyvūnų veisles jie yra dvigubai didesni už įprastus rūšiai eritrocitus ir dažnai gali atsirasti dėl regeneracinės anemijos, nes nesubrendę eritrocitai ar retikuliocitai yra didesni (15). Aliaskos malamutai gali turėti paveldėtą geną stomatocitozei, kuri dažniausiai pasireiškia makrocitoze, tačiau anemija ar kitos susijusios klinikinės patologijos šiems šunims nėra nustatytos (9).
Žmonių medicinoje vidutinis eritrocito skersmuo siekia 7,5ųm. Eritrocitų dydžio svyravimai vadinami poikilocitozė. Mikrocitais vadinami RBC kurių skersmuo yra mažiau nei 6,4ųm, jie atsiranda dėl paveldėto hemoglobino stuktūros pakitimo ar geležies trūkumo. Makrocitais vadinami eritrocitai turintys didesnį nei 8ųm, kituose šaltiniuose didesni nei 9ųm, skersmenį ir dažniausiai atsiranda sergant kepenų ligomis, neštumo metu ir esant kompensacinei eritropoezei po nukraujavimo ar hemolizinės anemijos. Eritrocitų dydžio pokytis nuo vidutinės reikšmės yra fiziologija. Sveikų žmonių kraujyje randama nuo 5 iki 7 proc. makrocitų arba mikrocitų ir tai yra fiziologinė norma (13). Morfometrijos rezultatų suvokimas ir tinkama identifikacija pagal tam tikras gyvūnų veisles, gali būti pagrindu ir veterinarijoje interpretuojant anemijas pagal makrocitines, normocitines ir mikrocitines rūšis (11).
1.2.2. Eritrocitų morfologija
Raudonieji kraujo kūneliai yra produkuojami kaulų čiulpuose pagal kraujo plazmoje esančių eritrocitų kiekio padidėjimą arba sumažėjimą. Jų kiekis padidėja dėl blužnies susitraukimų ir eritrocitų išstūmimo į kraujotaką, taip pat eritropoetino gamybos ir kaulų čiulpų funkcionavimo (12).
Eritropoetinas stimuliuoja kaulų čiulpus, to pasėkoje didėja eritrocitų koncentracija kraujyje ir taip išvengiama hipoksijos. Jis taip pat stimuliuoja trombocitų susidarymą, tačiau neveikia baltųjų kraujo kūnelių sekrecijos. Eritropoezė taip pat priklauso nuo hormonų sąveikos, antinksčių žievės, kiaušidžių, sėklidžių ir hipofizės liaukos funkcijų.(12).
Šunų, kaip ir visų žinduolių, raudonieji kraujo kūneliai (RBC) yra apvalaus disko formos
ląstelės su viduryje esančiu įgaubimu. Jos neturi branduolio ir kitų gyvūninei ląstelei būdingų
organelių (10). Tokios ląstelės vadinamos diskocitais. Šunų eritrocitai dėl įgaubimo turi didesnį
13 paviršiaus plotą dujų apykaitai, jie linkę lengvai keisti formą judėdami smulkiomis kraujagyslėmis.
(13). Eritrocitų viduje yra tankiai supakuotas hemoglobinas, kuris organuose vykdo deguonies transportavimą. Hemoglobinas ląstelėje susideda iš keturių žiedų. Kiekvienas žiedas prisijungdamas po vieną deguonies molekulę, kraujo cirkuliacijos dėka, ją nuneša į visas organizmo audinių ląsteles (14). Raudonieji kraujo kūneliai, be specifinės dujų transportavimo funkcijos, taip pat dalyvauja reguliuojant rūgščių, šarmų, elektrolitų ir vandens balansą kraujyje, palaiko homeostazę. Jie yra sietini su imuninėmis reakcijomis, dalyvauja pernešant lipidus, amino rūgštis, virusus ir vaistus.
Būtent dėl tokių svarbių eritrocitų funkcijų organizme vis daugiau pastangų dedama norint rasti naujų metodų vertinant raudonųjų kraujo kūnelių struktūrą ir morfologiją (2).
1.2.3. Eritrocitų spalvos pokyčiai
Eritrocitų spalvos pokyčiai dažniausiai yra sąlygoti eritrocitų prašviesėjimu – hipochromazija arba skirtingu spalvos pasiskirstymu – polichromazija.
Hipochromazija nustatoma kuomet eritrocitų ląstelės vidus yra šviesesnis nei morfologiškai tūrėtų būti, dėl mažos hemoglobino koncentracijose juose, kuris eritrocitams ir suteikia raudoną spalvą. Hemoglobino koncentracija raudonuosiuose kraujo kūneliuose gali būti sumažėjusi dėl geležies stygiaus, regeneracinės ar neregeneracinės, infekcinės ar neinfekcinės kilmės anemijų, taip pat dėl padidėjusios eritropoetino gamybos. Esant tokioms patologijoms eritrocitų morfometriniai parametrai tokie kaip perimetras, plotas ir skersmuo nepakinta (15).
Polichromazija nustatoma tuomet, kai tepinėlyje matomi nevisiškai subrendę eritrocitai, kurie yra melsvai raudoni. Tokie gali būti retikuliocitai, kurie dar vadinami polichromatofilai, nes ląstelėje turi mitochondrijas ir ribosomas, kurios ir duoda tepinėlyje melsvą spalvos pokytį, o dėl kaupiamo hemoglobino – rausvą atspalvį (15). Polichromazija yra ryški esant regeneracinei anemijai, kuomet yra padidėjęs kiekis retikuliocitų. Tai lemia suintensyvėjęs kaulų čiulpų, produkuojančių pirmines kraujo ląsteles, darbas (14). Tokios ląstelės dažniausiai atsiranda kaip kaulų čiulpų regresinis atsakas į pasireiškusią anemiją. Ryškesnė mėlyna spalva yra eritrocite dėl organelių (ribosomų) nusidažymo, nes jos yra randamos praėjus 12-24 val. po ląstelių išmetimo iš kaulų čiulpų (17).
Eritrocitų vaiduokliai (eng. Erythrocytic ghosts) – silpną membraną turintys eritrocitai, kuriuose yra minimalus kiekis hemoglobino. Tokių ląstelių buvimas kraujo tepinėlyje rodo arba labai neseną intravaskulinę hemolizę arba hemolizę in vitro, ypatingai kai tepinėliai nėra paruošiami iš kart po kraujo paėmimo (17) .
1.2.4. Eritrocitų formos pokyčiai
Eritrocitų formos pakitimus gali sukelti įvairios priežastys, įskaitant regeneracinį ląstelių
atsaką, metabolinius organizmo sutrikimus (geležies, lipidų stygių), oksidacinį sužalojimą, su
14 imunine sistema susijusį RBC sužalojimą. Taip pat jis gali įvykti dėl mechaninio suskaldymo, sepsio, į organizmą patekusių toksinų arba vaistų, per didelės ex vivo drėgmės ar tepinėlio paruošimo klaidų (antikoagulianto pertekliaus, netikslaus dažymo). Yra daug galimų tarpinių priežasčių, tokių kaip skirtingos fiziologinės ar patologinės gyvūno būklės. Daugelis eritrocitų pakitimų gali būti nespecifiniai ir būti susieti su organizme vykstančiai mechanizmais arba būti labai specifiniai ir iš esmės diagnozuoti paveldimą arba įgytą ligą (18).
Poikilocitozė – yra neįprastos formos eritrocitų buvimas periferiniame kraujyje. Jų nustatymas yra svarbus kraujo morfologijos įvertinimo dalis, nes raudonųjų kraujo kūnelių formos pokyčiai dažnai siejami su konkrečiomis ligomis, todėl gali palengvinti paciento ligos diagnozavimą ir gydymą. Poikilocitai gali atsirast dėl biocheminių pokyčių, toksinų, fizikinių eritrocitų pažeidimų, jie gali sutrumpinti eritrocitų išgyvenamumą ir prisidėti prie anemijos (19). Nustatyta, kad morfologiniai eritrocitų formų pokyčiai, lyginant tarp įvairių amžiaus grupių, lyčių ir vertinant pagal Weiss (1984m.) sistemą, nekoreliuoja ir nėra kliniškai reikšmingas rodiklis (1).
Eritrocitų formos pakitimai priklauso nuo eritrocitų membranos pokyčių. Ši membrana sudaryta iš baltymų, tokių kaip aktinas ir spektrinas, taip pat angliavandenių ir lipidų, kuriuos sudaro fosfolipidai ir cholesterolis esantis ląstelės sienelėje (20). Fosfolipidai kartu su cholesterolio intarpais sudaro dvigubą membranos sluoksnį. Dažnai eritrocitų formos pokyčiai ir yra susieti su šių medžiagų ląstelėje kiekių pakitimais (13). Norint nustatyti tikslius eritrocitų pakitimus būtina atmesti susidariusius artefaktus (12).
Keturlapio formos eritrocitai (eng. Quatrefoil), kituose šaltiniuose dar vadinami gėlės formos (eng. Flowers) eritrocitai, (2 pav.) - tai kraujo tepinėlyje randami keturlapį arba trilapį dobilą primenančios ląstelės. Remiantis 2013m. atliktais tyrimais, kol kas neįmanoma tiksliai nustatyti tokių eritrocitų modifikacijos kilmės ir prasmės (18) (20). Statistiškai tokie eritrocitai nėra susiję su šunų lytimi (21). Pastebėta, kad tokios patologijos RBC dažniau aptinkama esant mažam leukocitų ir neutrofilų skaičiui, taip pat esant vyresnio amžiaus šunims bei pasireiškus kitoms eritrocitų patologijoms (polichromazija, anisocitozė, Howell-Jolli kūnelių atsiradimui) (21). Dažniausiai kvadratiniai raudonieji kraujo kūneliai buvo pastebėti pas mišrios veislės šunis (25,9 proc., n=40), o pas vokiečių aviganių veislės šunis rasta 7,2 proc. taip pakitusių eritrocitų, kai n=11 (21). Pagal A.
Gavazza (18), keliuose neoficialiuose interviu su kitais veterinarijos gydytojais ir citologais arba
hematologais, buvo patvirtinta, kad karcinomos atvejais pastebimi kvadratiniai eritrocitai kraujo
tepinėliuose. Neoficialiuose interviu su kitais veterinarijos patologais neduodavo jokių rezultatų, nes
jie kvadratinių eritrocitų nepastebėdavo. Tačiau aiški priežastis arba tam tikra ligos ar požymio
koreliacija dar nebuvo tiksliai nustatyta (18). Žmonių medicinoje tokios formos eritrocitai buvo rasti
pacientams, sergantiems lėtinio nuovargio sindromu (20).
15
2 pav. Kvadrato formos (eng „Quatrefoil“) eritrocitai ir jų formavimosi mechanizmas (18) Akantocitai – RBC kurie turi netolygiai ir netaisyklingai išsidėsčiusias ataugas (3 pav.). Jos būna bukos, ištemptos projekcijos (12). Tai negrįžtamas eritrocito pakitimas, kuris pasireiškia dėl pakitusios membraninės cholesterolio ir fosfolipidų struktūros bei per didelio jų kiekio sienelėje. Tai yra patologinių eritrocitų požymis, kuris gali atsirasti dėl EDTA pertekliaus, todėl didelis akantocitų kiekis kraujo tepinėlyje gali būti sąlygotas artefaktų ir turėtų būti nepaisomas (19). Tačiau dažniausiai akantocitų buvimas kraujo tepinėlyje reškia in vivo eritrocito pakitimą, o ne artefaktą (12). Šie patologiniai kraujo kūneliai šunų hematologijoje pagausėja esant hemangiosarkomai, deseminuotai intravaskulinei koaguliopatijai (DIK) arba pasireiškus glomerulonefritui (22).
3 pav. Akantocitai kraujo tepinėlyje (19)
Echinocitai - eritrocitai su vienodai, tolygiai išsidėsčiusiomis ataugėlėmis. Jos gali būti
smailos arba bukos formos su mikroskopiškai išreiškiamais membranos paviršiaus šuoliais (19). Šis
eritrocitų patologinis procesas yra grįžtamas ir susidaro esant riebalų rūgščių apykaitos sutrikimams,
fosfolipidų kiekio pakitimams ir kitiems biocheminiams procesams (19). Jie taip pat gali susidaryti
kaip artefaktas esant per dideliam EDTA (etilendiamintetraacto rūgšties) antikoagulianto kiekiui, per
16 ilgą laiką džiovinant kraujo tepinėlį arba per ilgai laikant mėginį iki tepinėlio paruošimo (23). Tikslūs mechanizmai ir echinocitų kilmė nėra aiški, tačiau jie susiformuoja esant dehidratacijai, padidėjus kraujo pH ir intraląsteliniam kalcio kiekiui, taip pat kai ląstelei trūksta energijos dėl sumažėjusio ATP kiekio (24). Echinocitų susidarymas yra sietinas su membranos citoskeleto baltymo aktino deformacija, nes echinocituose šis baltymas randamas ląstelių kraštuose ir jo pasiskirstymas skiriasi nei kituose eritrocituose (25).
Šistocitai – RBC fragmentai su dvejomis arba keturiomis kampuotomis arba smailiomis ataugomis (26). Jie yra netolygios struktūros, neprimena eritrocitui būdingos disko formos ir yra mažesni nei tipiniai diskocitai. Jie susiformuoja esant eritrocitų oksidaciniams arba intravaskuliniams pažeidimams (13). Šistocitai atsiranda esant diseminuotai intravaskulinei koaguliopatijai (DIK), sužalojus eritrocitus organizme atsiradusiomis fibrino sankaupomis, esant kraujagyslių neoplazijoms (pvz. hemangiosarkoma) arba pasireiškus geležies trūkumui (13).
Sferocitai – neįgaubtos formos RBC, mažesni nei diskocitai. Jie yra tamsesni nei dažniausiai matomi RBC ir neturi būdingo centrinio iššviesėjimo, todėl jų membranos plotas yra mažesnis, nors tūris nepakitęs. Tokius eritrocitų pakitimus sunku aptikti kraujo tepinėliuose, tik šunų kraujyje jų būna dažniau (13). Sferocitozė gali išryškėti esant anemijai, splenomegalijai ir geltai. Sferatocitai atsiranda dėl eritrocitų membranos pažeidimo, kuris sietinas su membranos baltymų tokių kaip ankirino, beta-spektrino ir alfa spektrino sumažėjimui (27). Jie taip pat randami esant hemolizei, kuri pasireiškia įkandus juodajai gyvatei (Pseudechis porphyriacus). Tokių RBC kiekis pakilo esant penktai dienai po gyvatės igėlimo ir nukrito šešiasdešimt antrąją gydymo dieną (28). Sferatocitų gyvenimo trukmė yra trumpesnė negu ne patologinių eritrocitų, nes jie jautresni deformacijoms.
Jeigu eritrocite yra labai minimalus centrinis iššviesėjimas, toks eritrocitas laikomas daliniu sferocitu (13). Taip pat jų atsiradimą gali paskatinti netinkamos kraujo grupės perpylimas, nes tuomet deformuojasi eritrocitai veikiant skirtingų plazmos baltymų bei intraląstelinių parazitų (pvz: babesia canis).
Ecentrocitai – RBC turintys savybę hemoglobiną paskirstyti vienoje ląstelės pusėje, todėl matomas nevienodas spalvos pasiskirstymas ir eritrocitas atrodo turintis pūsleles. Toks raudonojo kraujo kūnelio pakitimas, ypatingai pas šunis, yra sietinas su oksidaciniais pažeidimais, dažniausiai tokiu atveju pastebimas ir Heinso kūnelių atsiradimas. Taip pat šis RBC formos pakitimas gali būti paveldimas dėl gliukozės-6-dehidrogenazės trūkumo organizme, todėl atsiranda eritrocito jautrumas oksidaciniai žalai (13). Kartais tokie eritrocitai buvo pastebėti šunims apsinuodijus česnako arba svogūno ekstraktais, vitamino K antagonistais ir sergant T limfocitų limfoma ar cukriniu diabetu.
Visa ši koreliacija gali būti sąlygota oksidacinių procesų į eritrocitus. Kliniškai sveikiems šunims
ecentrocitai yra retai randami ir jų buvimas kraujo tepinėlyje turi diagnostinę reikšmę (29).
17 Leptocitai – eritrocitai turintys perteklinės membranos kiekį, kuriame yra padidėjęs ląstelės paviršiaus ploto ir tūrio santykis (4 pav.). Tokie eritrocitai yra hipochromiški ir ploni. Gali priminti taikinio formą. Pakitę RBC dažnai gali neturėti klinikinės reikšmės ir būti siejami su per dideliu antikoagulianto EDTA (etilendiamintetraacto) pertekliumi ir per mažo kiekio kraujo mėgintuvėlyje, atsiranda esant geležies trūkumo anemijai ir kartais pasireiškus kepenų nepakankamumui, polichromatiniai eritrocitai kartais gali atrodyti kaip leptocitai (30).
4 pav. Kraujo tepinėlis su daugybe leptocitų ir sulankstytomis ląstelėmis (13)
Kodocitai – dubenėlio formos, plonos ląstelės, kuriose hemoglobino plotas yra atskirtas šviesia zona. Tokios ląstelės pastebimos šunims su cholesterolio koncentracijos padidėjimu kraujyje (13).
Mažas kiekis kodocitų yra dažnai randamas šunų kraujyje, ypač suintensyvėjus regeneracinei anemijai. Tokių RBC kiekis ženkliai padidėja esant įgimtiems eritropoezės sutrikimams (eng.
Congenital dyserythropoiesis). Kodocitų radimas kraujo tepinėlyje yra dažnas, todėl mažas jų kiekis yra diagnostiškai nereikšmingas rodiklis (30). Taip pat 2017 metais atliktas tyrimas parodė, kad 10proc. šunų užsikrėtusių leišmanioze ( Leishmania infantum), mikroskopuojant kraujo tepinėlį buvo aptiktas padidėjęs kiekis kodocitų (31).
Eliptocitai – ovalūs ir plokštesni RBC. Šunims tokie eritrocitai atsiranda sergant mielofibroze ir pasireiškus glomerulonefritui. Eliptocitozė taip pat išryškėja esant genetinei ligai dėl ląstelės citoskeleto baltymų (β spektrinų) defekto (32). Normalių eritrocitų membraną sudaro dvisluoksnis citoskeletas sudarytas iš kelių baltymų. Paveldėtą eliptocitozę sukelia mutacijos, dėl kurių atsiranda nestabilus citoskeletas. Tok nestabilumas yra sąlygotas α-spektrino ir β-spektrino sąveikos. Esant tokioms mutacijoms α-spektrinas yra sintetinamas intensyviau nei β-spektrinas, todėl ląstelės skeletas išsikraipo (33).
Dakrocitai – ašaros ar lašo formos eritrocitai su viena pailga, smailia ataugėle. Tokios ląstelės
dažnai pastebimos žmonėms su miolofibroze. Jie gali atsirasti šunims sergant glomerulonefritu, esant
splenomegalija arba po kraujo perpylimo procedūrų, taip pat šių ląstelių skaičius padidėja po
splenektomijos (34) (30). Dakrocitai išreiškiami atrajotojams esant geležies trūkumo anemija (32).
18 Stomatocitai – brandūs, normalios formos ir dydžio eritrocitai turintys pailgą, burnos formos, aiškios srities prašviesėjimą netoli ląstelės centro (5 pav.) (30) (17). Diagnostikos prasme mažas stomatocitų kiekis reikšmės neturi, nes gali susidaryti dėl tepinėlio paruošimo technikos (13).
Paveldėta stomatocitozė pasireiškia Aliaskos malamutų, vergšnaucerių veislės šunims ir tai yra susiję su autosominiu-recesyviniu genu. Aliaskos malamutai turintys stomatocitozę, taip pat serga chondrodisplazija, nors stomatocitai apima tik nedidelę dalį RBC (13). Manoma, kad tokie eritrocitai atsiranda dėl nenormalios fosfolipidų koncentracijos eritrocitų membranose. Miniatiūrinių šnaucerių veislės šunims stomatocitozė klinikinių simptomų neduoda, tačiau Drentės kurapkinio veislės šunims stomatocitozė sietina su hipertrofiniu gastritu, lėtiniu augimu, chroniniu viduriavimu, inkstų cistomis, polineuropatija (13).
5 pav.Cverg-šnaucerio kraujo tepinėlis su matomais stomatocitais (13)
Keratocitai – subrendę eritrocitai, kuriuose matoma vieną arba daug kartų plyšusios periferinės iššviesėjimo sritys (30). Dėl to susidaro viena - dvi smailios ataugėlės. Vizualiai žiūrint jos primena šalmą ir yra vadinamos „šalmo“ ląstelėmis. Keratocitai susidaro dėl eritrocito traumos ir yra panašūs į šistocitus. Tokie raudonieji kraujo kūneliai matomi esant įvairioms RBC anomalijoms (pvz: akantocitozei, echinozitozei). Taip pat jie pastebimi esant DIK, anemijai dėl geležies trūkumo, esant kraujagyslių neoplazijoms (pvz: hemangiosarkomai) ir pasireškus mielodisplaziniam sindromui (17).
1.2.5. Intraeritrocitinės struktūros
Hovel-Joly kūneliai – RBC viduje randami nedideli, vienalyčiai, tamsiai violetinės spalvos, panašūs į branduolius, dariniai. Jie retai randami šunų kraujo tepinėliuose. Tokių RBC skaičius padidėja esant regeneracinei anemijai, esant splenitui, po splenektomijos, po chemoterapijos, paveikus radiacijai, apsinuodijus eritroidiniais toksinais arba po gliukokortikoidų terapijos (13) (17).
Katėms esant kaulų čiulpų funkcijos sutrikimams ir pasireiškus neregeneracinei anemijai, taip pat
19 fiksuojamos Hovel-Joly struktūros (35). Svarbu šių kūnelių nesumaišyti su intraląsteliniais parazitais (pvz: babesia canis) (17).
Siderotinės granulės – ekscentriškai sujungtos bazofilinės struktūros netoli eritrocito pakraščio, dar vadinami Papenhaimerio kūneliais (6 pav.) (17) (36). Diagnostine prasme, tai yra geležies turintys intarpai eritrocite, kurie susidaro iš baltymo feritino agregatų arba esant geležies metabolizmo sutrikimams, nes geležies perteklius yra kaupiamas ląstelių ribosomose, lizosomose.
Jie gali atsirasti apsinuodijus švinu, esant hemolizinei anemijai. Subrendę eritrocitai, kuriuose matoma šių intarpų, vadinami siderocitais (17). Esant sideroblastinei anemijai taip pat randami geležies intarpai eritrocituose (36).
6 pav. Siderotinės granulės šuns kraujyje (17)
Heinso kūneliai – eritrocito membraną apimantys apvalios, dažniausiai už eritrocito ribų išsikišusios viengubos struktūros, maži arba didesni dariniai, siekiantys nuo 0,5 iki 1µm (30) (17).
Kai kuriais atvejais viename eritrocite gali būti keli Heinso kūneliai. Jie yra rausvai rožinės spalvos.
Šie kūneliai dažniausiai atsiranda dėl oksidacinės žalos, dėl kurios denatūruoja hemoglobinas ir susidaro methemoglobinas. Kačių kraujo tepinėliuose šie kūneliai sutinkami dažniau nei šunų (17).
Mikroskopuojant kraujo tepinėlį Heinso kūnelius gali būti sunku identifikuoti, todėl dažant metileno
mėlynuoju, tiek Heinso kūneliai, tiek mikrobranduoliai nusidažo mėlynai, tačiau kūneliai yra
šviesesni, o mikrobranduoliai tamsesnės mėlynos spalvos (7pav.) (17) (30). Šunims,
apsinuodijusiems toksiškais augalais arba svogūno ar česnako vaisiais. pasireiškia anemija kartu su
Heinso kūneliais (37). 2017 metais atliktoje klinikinio atvejo analizėje pastebėta, kad šuniui
užsikrėtus sistemine Scedosporium prolificans infekcija 46,6 proc. eritrocitų buvo su Heinso
kūneliais (38). Šios struktūros šunų kraujyje visuomet rodo patologiją ir yra diagnostiškai
reikšmingas rodiklis, jie gali išryškėti esant apsinuodijimams propilenglikoliu, naftalinu, vitaminu
K
3(menadionu)
,cinku, metileno mėlynuoju ar metioninu (17) (32).
20 7 pav. Heinso kūneliai dažyti Romonowsi-gimsa dažais ir metilo mėlynuoju (17)
Bazofilinės granulės kraujo tepinėlyje matomos kaip maži juodi taškeliai ar grūdeliai eritrocite. Tie grūdeliai, tai nestabilūs ribosomų agregatai, susijungę į bazofilines granules, kurie susidaro džiovinant ar laikant kraujo mėginį (15). Jie atsiranda regeneracinės anemijos atvejais.
Svarbu skirti ir identifikuoti bazofilines granules nuo sideroidinių granulių, bazofiliniai intarpai paprastai pasiskirsto visoje ląstelės citoplazmoje, o sideroziniai intarpai paprastai kaupiasi nepriklausomai (17). Atrajotojams jie yra susiję su nesubrendusiais eritrocitais, šunims esant apsinuodijimais švinu, nes sumažėja enzimo 5-nukleotidazės aktyvumas, o jis yra randamas ribosomose (15).
Mikrobranduoliai – RBC turintys apvalius, mažus branduolio likučius, kurie formuojasi ląstelėse trūkus branduoliui (17). Daugiausia šunų kraujyje jų yra randama regeneracinės anemijos atvejais, splenektomijos pasėkoje, esant blužnies funkciniams sutikimams, ar naudojant gliukokortikoidų terapiją bei po chemoterapijos (30).
1.2.6. Eritrocitų išsidėstymas
Eritrocitų išsidėstymas eilute yra panašus į monetų pasiskirstymą vienoje eilėje (8pav.) (15).
Tokios eritrocitų kombinacijos yra normalus reiškinys arkliams, kartais ir šunims, pasireškiančios
dėl padidėjusio, imunoglobulinų ar fibrinogeno kiekio kraujo serumuose. Gyvūnams su daugybine
melonoma visuomet pasireiškia eritrocitų išsidėstymas eilute (13).
21 8 pav. Eritrocitų išsidėstymas eilute kraujo tepinėlyje (13)
Agliutinacija tai eritrocitų sferinis, netaisyklingas, sulipimas. Raudonieji kraujo kūneliai agliutinuoja esant hemolizinei anemijai, tačiau dažniausiai agliutinacija įvyksta dėl netinkamo kraujo perpylimo į mėgintuvėlį. Norint diferencijuoti, reikia kraujo lašą sumaišyti su izotoniniu ar fiziologiniu NaCl 0,9proc. tirpalu. Jeigu agliutinacija yra dėl hemolizinės anemijos, tokiu atveju ji vis tiek išliks (13).
1.2.7. Kiti eritocitų struktūros pokyčiai
Mikroskopuojant šunų kraujo tepinėlius taip pat galime aptikti hemoglobino kristalus, kurie primena raudonus kvadratėlius, deimantus ar rombus (13). Tokių kristalų atsiradimo kilmė yra nenustatyta, todėl diagnostinė reikšmė maža (17). Eritrolizė tai kraujo tepinėlyje matomi hipochromiški kartais skaidrūs, lizuoti arba suirę eritrocitai, kuriuose matoma tik jų membrana.
Fiziologiški tokie eritrocitai yra greitai pašalinami iš gyvūno kraujotakos, tačiau jų radimas
tepinėliuose gali būti sąlygotas neseniai įvykusios intravaskulinės hemolizės arba in vitro
hemolizuotą kraują. Dėl lipemijos eritrocitai lengvai lizuojasi ruošiant kraujo tepinėlį, tačiau tokiu
atveju lizuoti eritrocitai panašūs į netolygias dėmes, jeigu hemolizė įvyksta dėl oksidacinių
pažeidimų, lizuotuose eritrocituose matomi Heinso kūneliai (13).
22
2. TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGOS
Tyrimas atliktas LSMU VA Veterinarinės patobiologijos katedroje. Buvo pasirinkta po 20 Čekoslovakijos vilkšunių ir vokiečių aviganių veislės, kliniškai sveikų, kilmės dokumentus turinčių šunų. Didžioji dalis šunų gyvena Lietuvoje. Tiriamieji šunys buvo skirstomi į amžiaus (1lentelė) ir lyčių (2 lentelė) grupes. Amžiaus grupės buvo pasirinktos atsižvelgiant į literatūros duomenimis rastus morfologinius eritrocitų pokyčius priklausomai nuo amžiaus.
Grupės: Jauni šunys (0m. - 2m.)
Vidutinio amžiaus šunys (3m. - 7m.)
Seni šunys (8m. -15m.)
ČSV skaičius 8 7 5
VA skaičius 6 10 4
1 lentelė. Tiriamųjų šunų skirstymas į tris amžiaus grupes
Patelė Patinas
ČSV skaičius 10 10
VA skaičius 11 9
2 lentelė. Tiriamųjų šunų skirstymas pagal lytį
Tiriamoji medžiaga, šunų kraujas, buvo imta gavus savininko sutikimus. Kraujas paimtas
šunims nejaučiant streso, juos nuraminus, laikant šeimininkams iš priekinių galūnių poodinės venos
(v. cephalica ). Dūrio vieta buvo dezinfekuojama spiritiniu tirpalu, kraujas imamas su 5,0ml švirkštu
su adata. Paėmus daugiau nei vieną mililitrą kraujo, jis nedelsiant buvo supilamas į transportavimui
naudojamus mėgintuvėlius violetiniu kamšteliu su EDTA antikoaguliantu. Mėgintuvėlis su krauju
švelniai vartytas 10 kartų, kad antikoaguliantas tolygiai susimaišytų su paimtu krauju. Užpildyti
mėgintuvėliai tą pačią dieną, šaltomis sąlygomis buvo vežami į laboratoriją.
23 Tyrimo atlikimo schema:
2.1. Kraujo tepinėlio ruošimo metodika
Kraujo tepinėliai daromi visiems 40 mėginių. Ruošiami po kraujo paėmimo tą pačią dieną norint, išvengti ex vivo artefaktų (39). Tyrimui naudoti aukštos kokybės, švarūs objektiniai stikleliai.
Naudojant vienkartinę pipetę arba stiklinę lazdelę dedamas 1-4 mm skersmens kraujo lašas, kuris buvo apie 1,0 cm nutolęs nuo stiklelio krašto, kad būtų vietos kur lašą braukiant paskirstyti (40).
Kitoje pusėje 30° kampu dedamas kitas švarus objektinis stiklelis ir braukiama tiesiai kraujo lašo link. Stiklelio kraštui palietus lašą, kraujas pasiskirsto per visą stiklelio spindį ir tuomet greitu, tolygiu judesiu uždėtas stiklelis braukiamas atgal. Gerai paruoštame tepinėlyje lašas tolygiai pasiskirsto išilgai objektinio stiklelio. Distalinė tepinėlio dalis yra ištęsto ovalo formos ir vadinama plunksniniu galu. Ši vieta mikroskopuojant yra reikšmingiausia, nes ląstelės pasiskirsčiusios vienu sluoksniu. Proksimalinė tepinėlio dalis, kurioje buvo kraujo lašas, vadinama tepinėlio kūnu. Šioje vietoje ląstelės būna kelių sluoksnių ir artėjant link kraujo lašo išsidėsto labiau koncentruotai, diagnostikos prasme šioje dalyje mikroskopavimas nėra reikšmingas. Padarytas tepinėlis pusę valandos buvo paliktas kambario temperatūroje, kad pilnai išdžiūtų prieš dažymą.
Dažymui naudojami greitieji „Hemacolor“ tipo dažai. Tepinėlis dažomas pagal gamintojo instrukcijas. Pradžioje mėginys merkiamas į fiksatorių su metanoliu, ten mirkomas tris kartus po 2sek., tuomet merkiama į dažus su eozinu ir ten merkiama taip pat tris kartus po 2sek. Trečias etapas tai tepinėlio dažymas metileno mėlynojo dažų mišiniu, čia laikoma po 2sek. šešis kartus. Tepinėlis švelniai nuplaunamas po tekančiu vandeniu ir pilnai išdžiovinamas. Mikroskopuojamas tą pačią dieną, kad neatsirastų ir nesusiformuotų papildomų ex vivo artefaktų.
TYRIMUI TINKAMŲ ŠUNŲ
PAIEŠKA IR ATRANKA KRAUJO MĖGINIŲ ĖMIMAS
KRAUJO TEPINĖLIO RUOŠIMAS ERITROCITŲ MORFOMETRINIAI
SKAIČIAVIMAI
PATOLOGINIŲ ERITROCITŲ ANALIZĖ
REZULTATŲ STATISTINĖ
ANALIZĖ
24
2.2. Morfometrinio tyrimo metodika
Kraujo tepinėlyje morfometriniai skaičiavimai buvo atlikti norint nustatyti eritrocitų plotą, perimetrą ir didžiausią bei mažiausią raudonojo kraujo kūnelio skersmens reikšmę. Morfometriniai eritrocitų parametrai buvo skaičiuojami su „Olympus DP72“ mikroskopu naudojant „Olympus CellSens Dimension“ programą. Kiekviename tepinėlyje, naudojant 100x objektyvą, buvo matuojama 50 atsitiktine tvarka pasirinktų eritrocitų. Skaičiavimams pasirinkti nepatologiniai eritrocitai ten kur nesiliečia vienas su kitu ir yra tipiškos apvalios formos. Išilgai ir skersai eritrocito brėžiamos linijos ir matuojamas raudonojo kraujo kūnelio skersmuo (1pav). Taip pat apibrėžiama eritrocito kraštinė ir išmatuojamas plotas µm
2ir perimetras µm. Eritrocitai matuojami dešimtyje skirtingų matymo laukų, kiekviename naujame matymo lauke po penkis eritrocitus. Gauti duomenys suvesti į „Microsoft Excel 2016“ sistemą. Didesni nei 8,4µm eritrocitai buvo vertinami kaip makrocitai, o mažesni nei 6,4µm mikrocitai.
9 pav. Eritrocitų skersmens ir perimetro skaičiavimas.
2.3. Morfologinio tyrimo metodika
Kraujo tepinėlio mikroskopavimas pradedamas nuo tamsiausios iki šviesiausios jo dalies.
Mikroskopinė analizė pirmiausia pradedama naudojant 10x objektyvą, tepinėlis yra nuosekliai
apžiūrimas dėl agliutinacijos, įvertinamas ląstelių pasiskirstymas ir persidengimas, pasirenkama
vietą kur eritrocitai geriausiai yra matomi, mažiausiai artefaktų ir tikslingiausia paskleisti imersinį
tirpalą. Taip pat naudojant 10x didinantį objektyvą apžiūrimas tepinėlio proksimalinės dalies kraštas,
šioje vietoje didžiausia tikimybė pastebėti kraujo parazitus tokius kaip mikrofiliarijas (Microfiliaria
spp.) (41). Naudojant 100x didinantį objektyvą kiekviename tepinėlyje, penkiuose matymo laukuose,
buvo vertinami eritrocitų mikroskopiniai pokyčiai ir patologijos. Vidutinė kiekvieno eritrocito
pakitimo vertė buvo lyginama su Weiss (1984m.) pateiktomis nuorodomis, naudojamomis apibūdinti
25 stebimų eritrocitų anomalijų reikšmes (1). Pokyčių dažnumas vertinamas remiantis pusiau kiekybine eritrocitų morfologijos vertinimo schema vidutiniam netipiškų ląstelių skaičiui apskaičiuoti (3 lentelė). Eritrocitų pokyčiai buvo fiksuojami nuo 1+ iki 4+ grupių 5 matymo laukuose 100x padidinimu (40).
Grupės 1+ 2+ 3+ 4+
Hipochromazija 1 iki 10 11 iki 50 51 iki 200 >200 Poikilocitozė 3 iki 10 11 iki 50 51 iki 200 >200 Kodocitai 3 iki 5 6 iki 15 16 iki 30 >30 Sferocitai 5 iki 10 11 iki 50 51 iki 150 >150 Echinocitai 5 iki 10 11 iki 100 101 iki 250 >250 Akantocitai 1 iki 2 3 iki 8 9 iki 20 >20 Šistocitai 1 iki 2 3 iki 8 9 iki 20 >20 Keratocitai 1 iki 2 3 iki 8 9 iki 20 >20 Eliptocitai 1 iki 2 3 iki 8 9 iki 20 >20 Drepanocitai 1 iki 2 3 iki 8 9 iki 20 >20 Stomatocitai 1 iki 2 3 iki 8 9 iki 20 >20
3 lentelė. Pusiau kiekybinė eritrocitų morfologijos įvertinimo schema remiantis vidutiniu netipiškų ląstelių skaičiumi (5 matymo laukuose, 100x).
Kraujo tepinėliuose taip pat buvo vertinamos intraeritrocitinės struktūros – mikrobranduolių buvimas, Heinso kūneliai ir eritrocitų išsidėstymas eilute.
Kraujo tepinėlio analizavimo schema:
T IR IA MŲJ Ų ŠU N Ų K R A U JO MĖG IN IA I
Eritrocitų morfometrija
Eritrocitų morfologija
skersmuo
perimetras
plotas
formos pokytis
intraeritrocitinės
struktūros
26
2.4 Duomenų statistinė analizė
Statistinė analizė buvo atliekama naudojant „ Microsoft Excel 2016“ ir „JMP“ statistikos
vertinimo programas. Vertinant eritrocitų morfometrinius skaičiavimus apskaičiuoti duomenų
vidurkiai, vidurkio paklaidos, standartiniai nuokrypiai, kurie nurodo atsitiktinio dydžio įgyjamų
reikšmių sklaidą apie vidurkį. Atlikta regresinė analizė, nubrėžtos aproksimacinės kreivės, kurios
leidžia lengviau įžvelgti duomenų pasiskirstymą.
27
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Eritrocitų morfometriniai duomenys
3.1.1 Eritrocitų skersmuo
Iš viso buvo ištirta 40 kraujo mėginių, iš kurių buvo 20 Čekoslovakijos vilkšunių ir 20 vokiečių aviganių veislės šunų. ČSV tarpe 50 proc. sudarė patelės (n= 10), 50 proc. sudarė patinai (n=10). VA tarpe didesnė dalis buvo patelių 55 proc. (n=11), o patinų 45 proc. (n=9). 9 pav. pavaizduotas RBC skersmens vidurkis lyginant šunų lytį. Statistiškai nereikšminga, kad lyčių skirtumas sąlygoja RBC skersmens pokyčius (p> 0,05). VA veislės patinų skersmuo siekia 7,001µm, o patelių 7,21µm. ČSV veislės patelių skersmuo siekia 7,41µm, o patinų 7,45µm. VA patelių RBC skersmens vidurkis didesnis nei patinų, o ČSV patinų skersmens vidurkis didesnis nei patelių.
9 pav. Šunų RBC skersmens dydžiai lyginant pagal lytį.
10 paveiksle vertinamas ČSV 100proc. (n=20) ir VA 100proc. (n=20) veislės šunų eritrocitų skersmens minimalių ir maksimalių reikšmių kitimas didėjant šunų amžiui. Pas ČSV maksimali skersmens reikšmė svyruoja nuo 8,6µm iki 9,4µm (standartinis reikšmių nuokrypis 0,3920µm), o minimali nuo 5,5µm iki 6,1µm (nuokrypis 0,5040µm), pas VA maksimali svyravo nuo 8,2µm iki 9,5µm (standartinis reikšmių nuokrypis 0,6988µm), minimali nuo 4,8µm iki 5,9µm. (standartinis reikšmių nuokrypis 0,4810µm).
7,45 7,001
7,41 7,21
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
ČSV VA
RBC skersmuo
µm
Šunų vei sl ės
Patelė Patinas
28 10 pav. RBC skersmens minimalių ir maksimalių reikšmių pasiskirstymas
Didėjant ČSV šunų amžiui iki 5 metų, maksimali RBC skersmens reikšmė palaipsniui mažėjo nuo 9,2µm iki 8,6µm, o pas VA veislės šunis mažėjo iki 4 metų nuo 9,5µm 8,4µm. Nuo 5 metų amžiaus iki 8 metų amžiaus pas ČSV skersmens maksimali reikšmė šiek tiek pakilo nuo 8,6µm iki 8,9µm, o pas VA nuo 8,4µm iki 8,9µm. Nuo 8 iki 12 metų amžiaus pas VA maksimali RBC skersmens reikšmė nežymiai sumažėjo, paskui vėl pakilo iki 9,1µm, o pas VA nuo 9 iki 12 metų amžiaus skersmuo sumažėjo nuo 8,9µm iki 8,5µm. Minimalios RBC skersmens reikšmės pas ČSV iki 4 metų amžiaus palaipsniui mažėjo nuo 6,0µm iki 5,5µm, o pas VA veislės šunis nuo 5,9µm taip pat iki 5,5µm. Pas ČSV nuo 4 metų amžiaus minimali skersmens reikšmė palaipsniui didėjo iki 10 metų amžiaus nuo 5,5µm iki 6,1µm, o pas VA palaipsniui didėjo nuo 4 metų amžiaus iki 7 metų amžiaus nuo 5,5µm iki 5,9µm ir toliau didėjant amžiui iki 12 metų palaipsniui mažėjo nuo 5,9µm iki 4,9µm. Pas ČSV minimali skersmens reikšmė pradėjo mažėti nuo 10 iki 12 metų amžiaus nuo 6,1µm iki 5,9µm. Galime daryti prielaidą, kad didėjant amžiui maksimali RBC skersmens reikšmė mažėjo.
Atlikta regresinė analizė, kurioje skersmuo buvo įtrauktas kaip priklausomas kintamasis, o amžius
kaip nepriklausomas kintamasis, patvirtina šią iškeltą prielaidą (p=0,0053, kai p<0,01). Šiuo atveju
negalima tvirtai teigti, kad į regresine analizė yra įtraukti visi galimai statistiškai reikšmingi
nepriklausomi kintamieji, dėl ko tikslus poveikis gali skirtis nuo šiame darbe gauto rezultato. Tačiau
modelio ir nepriklausomojo kintamojo statistinis reikšmingumas aiškiai parodo tendenciją, kad
amžius statistiškai reikšmingai koreliuoja su skersmens maksimalia reikšme.
29 Lyginama RBC skersmens vidurkiai pagal amžiaus grupes ČSV ir VA šunų veislėms (11pav.) ČSV jauni šunys turėjo didžiausią RBC skersmens vidurkį 7,61µm (vidurkio paklaida ±0,3411µm), o tokios pat amžiaus grupės VA veislės šunų RBC skersmuo siekė 7,35µm (paklaida ±0,2529µm).
ČSV ir VA jaunų šunų amžiaus grupėje skersmens vidurkiai buvo mažiausi lyginant su kitomis amžiaus grupėmis, rezultatai statistiškai reikšmingi p<0,05. Vidutinio amžiaus šunų grupėje ČSV skersmens vidurkis 7,31µm (mx ± 0,0588µm), o VA 7,16µm (mx ± 0,050µm). Senų šunų amžiaus grupėje eritrocitų skersmens vidurkis buvo dar mažesnis ir pas ČSV siekė 7,30µm (mx ± 0,057µm), o pas VA 6,89µm (mx ± 0,0797µm), statistiškai reikšminga, kad senų šunų eritrocitai yra mažesni nei kitose amžiaus grupėse p<0,05. VA veislės šunų RBC skersmens vidurkiai visose amžiaus grupėse yra mažesni nei ČSV amžiaus grupėje (p= 0,002; p<0,01).
11 pav. RBC skersmens vidurkių pasiskirstymas skirtingose amžiaus grupėse
Vertinamas ČSV jaunų šunų amžiaus grupės, vieno šuns, pilnos imties, 50 eritrocitų 100 skersmens reikšmių pasiskirstymas (12 pav.). Mažiausias eritrocito skersmuo fiksuotas 5,9µm, o didžiausias 9,1µm. Daugiausia eritrocitų, 11 proc. (n=11), buvo 7,9µm, 8 proc. (n=8) eritrocitų skersmuo siekė 7,4µm ir 6,9µm, 7 proc. (n=7) eritrocitų skersmuo siekė 7,5µm ir 7,1µm. Jaunų šunų amžiaus grupės skersmens vidurkis siekė 7,414µm. Standartinis reikšmių nuokrypis 0,6411µm.
Nustatyta, kad 2 proc. (n=2) RBC buvo mikrocitiniai (mažesni nei 6,4 µm) ir 8 proc. (n= 8) makrocitiniai (didesni nei 8,2µm).
7,6191
7,3117 7,3038
7,3575 7,1615
6,8952
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Jauni šunys (0-2m) Vidutinio amžiaus šunys (3- 7m)
Seni šunys (8-12m)
R B C sk er sm ens v idurk is, µm
ČSV VA
30 12 pav. ČSV jauno šuns pilnos imties eritrocitų skersmens pasiskirstymas
Vertinamas VA jaunų šunų amžiaus grupės, vieno šuns, pilnos imties, 50 eritrocitų, 100 skersmens reikšmių pasiskirstymas (13 pav.). Mažiausias eritrocito skersmuo fiksuotas 5,6µm, o didžiausias 9,1µm. Daugiausia eritrocitų, 11proc. (n=11), buvo 6,7µm. 10proc. (n=10) eritrocitų skersmuo siekė 7,2µm. 8 proc. (n=8) eritrocitų skersmuo siekė 8,6µm. VA jauno šuns amžiaus grupės skersmens vidurkis siekė 7,206µm. Standartinis reikšmių nuokrypis 0,6445µm. Nustatyta, kad 2 proc. (n=2) RBC buvo mikrocitiniai ir 5 proc. (n= 5) makrocitiniai.
13 pav. VA jauno šuns pilnos imties eritrocitų skersmens pasiskirstymas
Vertinamas ČSV vidutinio amžiaus šunų grupės, vieno šuns pilnos imties 50 eritrocitų, 100
(100 proc.) skersmens reikšmių pasiskirstymas (14 pav.). Mažiausias eritrocito skersmuo fiksuotas
31 5,7µm, o didžiausias 9,4µm. Daugiausia eritrocitų, 10 proc. (n=10), buvo 7,9µm, 8 proc. (n=8) 6,9µm. Vidutinio amžiaus šunų grupės skersmens vidurkis siekė 7,471µm. Standartinis reikšmių nuokrypis 0,722µm. Rasta, kad 7 proc. (n=7) RBC buvo mikrocitiniai (mažesni nei 6,4 µm) ir 10 proc. (n= 10) makrocitiniai (didesni nei 8,2µm).
14 pav. ČSV vidutinio amžiaus šuns pilnos imties eritrocitų skersmens pasiskirstymas Vertinamas VA vidutinio amžiaus šunų grupės, vieno šuns pilnos imties, 50 eritrocitų, 100 proc. (n=100) skersmens reikšmių pasiskirstymas (15 pav.). Mažiausias eritrocito skersmuo fiksuotas 5,7µm, o didžiausias 8,8µm. Daugiausia eritrocitų, 12proc. (n=12), buvo 7,5µm., 7 proc. (n=7) eritrocitų skersmuo siekė 7,1µm, o 6 proc. (n=6) eritrocitų skersmuo siekė 6,9µm, 7,3µm ir 7,5µm.
Jauno šuns amžiaus grupės skersmens vidurkis siekė 7,264µm. Standartinis reikšmių nuokrypis 0,6081µm. Nustatyta, kad 10 proc. (n=10) RBC buvo mikrocitiniai (mažesni nei 6,4 µm) ir 3 proc.
(n= 3) makrocitiniai (didesni nei 8,2µm).
32 15 pav. VA vidutinio amžiaus šuns pilnos imties eritrocitų skersmens pasiskirstymas
Vertinamas ČSV senų šunų amžiaus grupės, vieno šuns pilnos imties, 50 eritrocitų, 100 proc.
(n=100) skersmens reikšmių pasiskirstymas (16 pav.). Mažiausias eritrocito skersmuo fiksuotas 5,7µm, o didžiausias 9,1µm. Daugiausia eritrocitų, 9 proc. (n=9), buvo 7,1µm ir 7,6µm. Taip pat 8proc. (n=8) eritrocitų skersmuo siekė 7,1µm, o 7 proc. (n=7) eritrocitų skersmuo siekė 7,3µm. Seno šuns amžiaus grupės skersmens vidurkis siekė 7,397µm. Standartinis reikšmių nuokrypis 0,6479µm.
Nustatyta, kad 7 proc. (n=7) RBC buvo mikrocitiniai (mažesni nei 6,4 µm) ir 5 proc. (n= 5) makrocitiniai (didesni nei 8,2µm).
16 pav. ČSV seno amžiaus šuns pilnos imties eritrocitų skersmens pasiskirstymas Vertinamas VA senų šunų amžiaus grupės, vieno šuns pilnos imties, 50 eritrocitų, 100proc.
(n=100) skersmens reikšmių pasiskirstymas (17 pav.). Mažiausias eritrocito skersmuo fiksuotas
33 4,7µm, o didžiausias 8,1µm. Daugiausia eritrocitų, 8proc. (n=8), buvo 6,5µm ir 6,7µm., 7proc. (n=7) eritrocitų skersmuo siekė 6,3µm, 6,7µm ir 7,5µm. Seno šuns amžiaus grupės RBC skersmens vidurkis siekė 6,668µm. Standartinis reikšmių nuokrypis 0,6549µm. Nustatyta, kad 46 proc. (n=46) RBC buvo mikrocitiniai (mažesni nei 6,4 µm), makrocitų nefiksuojama ( RBC didesnių nei 8,2µm).
17 pav. VA seno amžiaus šuns pilnos imties eritrocitų skersmens pasiskirstymas 3.1.2. Eritrocitų perimetras
Lyginant ČSV ir VA veislių šunų eritrocitų perimetro dydžio pokyčius pagal amžiaus grupes pastebimas laipsniškas reikšmės mažėjimas šunų amžiui didėjant (10pav). ČSV perimetro vidurkis siekia 23,5595µm (vidurkio paklaida ±0,2767µm), o VA perimetro vidurkis 22,229µm (vidurkio paklaida ± 0,2071µm). ČSV eritrocitų perimetras visose amžiaus grupėse yra didesnis negu VA veislės šunų (P<0.01). ČSV jaunų šunų grupėje vidutinė perimetro reikšmė 23,9µm vidutinio amžiaus grupėje 23,5µm, o senų šunų grupėje 22,9µm (standartinis vidurkio nuokrypis 0,2767µm).
Perimetro reikšmė sumažėjo per 1,0 µm. VA veislės jaunų šunų grupėje vidutinė perimetro reikšmė
buvo 23,6µm, vidutinio amžiaus 22,1µm, o senų šunų 21,75µm. Perimetro reikšmė didėjant amžiui
sumažėjo per 1,85µm (standartinis nuokrypis nuo vidurkio 0,2071µm).
34 18 pav.. RBC perimetro reikšmių kitimas didėjant amžiui
19 diagramoje pavaizduotas ČSV ir VA šunų RBC perimetro vidurkių reikšmės lyginant pagal lytį. VA patelių RBC perimetras siekė 22,47µm, ir yra didesnis nei patinų – 21,86µm. ČSV veislės šunų patelių RBC perimetras vidutiniškai siekė 23,94µm ir yra didesnis nei ČSV veislės patinų – 23,17µm. Statistiškai nereikšminga, kad eritrocitų perimetro reikšmės skiriasi nuo lyties.
19 pav. RBC perimetro vidurkiai pagal šunų lytį
23,94092 22,4728
23,17809 21,86340
18 19 20 21 22 23 24 25 26
ČSV VA
Eritrocitų perimetras
µm
Šu nų v ei sl ės
Patinas Patelė
35 3.1.3. Eritrocitų plotas
Vertinant ČSV ir VA veislės šunų RBC ploto pasiskirstymą pagal amžiaus grupes, matomas reikšmės mažėjimas didėjant šunų amžiui. ČSV RBC ploto vidurkis 43,52µm² (vidurkio paklaida
±0,6338µm²) standartinis nuokrypis nuo vidurkio 2,8346µm². VA RBC ploto vidurkis 39,732µm² (vidurkio paklaida ± 0,7437µm²) standartinis reikšmių nuokrypis nuo vidurkio 3,326µm², VA ČSV plotas kiekvienoje amžiaus grupėje yra didesnis nei VA (11pav.). Jaunų šunų grupėje ČSV ploto vidutinė reikšmė 45,5µm², o VA 44,5µm². Vidutinio amžiaus šunų grupėje ČSV vidutinė RBC perimetro reikšmė 42,1µm², o VA 39,0µm². Senų šunų amžiaus grupėje ČSV RBC perimetras siekia 42,0 µm², o VA 38,1µm². Didžiausias, 3,1µm², perimetro reikšmės skirtumas lyginant veisles pastebimas vidutinio amžiaus šunų grupėje. Statistiškai reikšminga, kad eritrocitų plotas jaunų šunų amžiaus grupėje yra didžiausias (p< 0.01)
11 pav. RBC ploto kitimas didėjant amžiui
36
3.2. Eritrocitų morfologiniai duomenys
Ketvirtoje lentelėje, literatūros duomenimis rasti ir įvardinti patologinių eritrocitų formų pakitimai, jų diagnostinis reikšmingumas ir pagrįstumas. Daugelis RBC formos pakyčių yra diagnostiškai nereikšmingi rodikliai dėl galimai susidariusių artefaktų. Kai kurių eritrocitų su galimai patologinėmis formomis buvimas kraujyje yra fiziologinė norma. Diagnostiškai svarbiausi RBC pakitimai yra Heinso kūneliai, eliptocitai, ecentocitai ir šistocitai.
4 lentelė. Kraujo tepinėlių analizavimo metu nustatytų patologinių eritrocitų reikšmingumas patognostiniame vertinime.
Eritrocitų patologijos
Diagnostiškai
reikšminga/nereikšminga Pagrįstumas
Echinocitai Reikšminga/nereikšminga
Gali parodyti biocheminių procesų pakitimus organizme arba EDTA kiekio perteklių mėgintuvėlyje.
Akantocitai Reikšminga/nereikšminga
Pagausėja esant hemangiosarkomai, DIK metu, pasireiškus glomerulonefritui arba esant per dideliam EDTA kiekiui
Keturlapiai
eritrocitai Nežinoma Jų kiekis padidėja senų šunų kraujyje Kodocitai Nereikšminga Gali būti randami sveikų šunų kraujyje Stomatocitai Nereikšminga Mažas tokių eritrocitų kiekis yra fiziologija ir
klinikinės reikšmės neturi.
Ecentocitai Reikšminga Rodo oksidacinius pažeidimus
Leptocitai Reikšminga/nereikšmina
Gali rodyti geležies trūkumo anemiją.
Dažniausiai atsiranda dėl per didelio EDTA kiekio.
Šistocitai Reikšminga Gali rodyti geležies trūkumą organizme.
Dakriocitai Reikšminga/
nereikšminga
Pavienius galima rasti šunų kraujyje, padidėjęs kiekis gali atsirasti dėl glomerulonefrito, hipersplenizmo.
Eliptocitai Reikšminga Gali rodyti paveldėtas ligas arba glomerulonefritą
Heinso kūneliai Reikšminga Rodo oksidacinius pažeidimus Mikrobranduoliai Nereikšminga Randami sveikų gyvūnų kraujyje Eritrocitų
išsidėstymas eilute Nereikšminga Randami sveikų gyvūnų kraujyje
Agliutinacija Reikšminga/Nereikšminga Gali rodyti autoimuninės kilmės anemiją arba
netinkamą kraujo paėmimą.
37 Nustatant patologinių eritrocitų formos pokyčius pas VA ir ČSC veislių šunis (n=40) rastas vienodas skaičius kraujo tepinėlių su pakitusiais ir sveikais RBC (12 pav). Pas ČSV rasta, kad 45proc. (n=9) tirtame šunų kraujyje yra patologinių eritrocitų. O pas 55 proc. (n=11) eritrocitai be pakitimų. Pas VA kraujo tepinėliai su sveikais eritrocitais rasti pas 55 proc. (n=11) šunis, 45proc.
(n=9) šunys turėjo patologinių eritrocitų.
12 pav. Sveikų ir pakitusių eritrocitų procentinė išraiška pas ČSV ir VA
13 pav. vertinamas patologinių eritrocitų kiekis ČSV ir VA šunų kraujo tepinėliuose (13 pav.).
Visi patologiniai eritrocitai pasireiškė mažiau negu 35 proc. šunų. Dažniausiai pas ČSV ir VA veislės šunis kraujo tepinėliuose buvo aptikti keturlapio dobilo formos eritrocitai 30 proc. (n=6). Akantocitų pas ČSV kraujo tepinėliuose rasta 30 proc. (n=6), o pas VA keik mažiau 25 proc. (n=5). Kodocitai ir stomatocitai pas VA šunis buvo pastebėti 25 proc. (n=5) kraujo tepinėliuose, o pas ČSV 10 proc.
(n=2). Pas ČSV veislės šunis taip pat dažnai pasireiškė echinocitai 20 proc.(n=4), leptocitai 25 proc.
(n=5), o šistocitai, dakriocitai ir mikrobranduoliai buvo pastebėti 15 proc. (n=3) šunų kraujo tepinėlių. Pas VA echinocitai stebimi 15proc. (n=3), dakriocitai 20 proc. (n=4) šunų. Pas ČSV 5 proc. (n=1) šunų buvo pastebėti ecentocitai ir eritrocitų išsidėstymas eilute, o pas VA 5 proc. (n=1) buvo matomi taip pat ecentocitai, šistocitai, eliptocitai, Heinso kūneliai, mikrobranduoliai ir RBC išsidėstymas eilute. Kraujo tepinėliuose Pas ČSV nebuvo pastebėti leptocitai
45 45
55 55
0 10 20 30 40 50 60 70 80
ČSC VA
P roc entai
Be pakitimų Su pakitimais
38 13 pav. ČSV ir VA kraujo tepinėliuose rasti eritrocitų formos pokyčiai.
Žemiau pateiktose nuotraukose iliustruojamos rastų pakitusių RBC formos. Daugiausia buvo rasta keturlapio formos eritrocitų, kurie dažniau pastebėti senų šunų kraujo tepinėliuose (14 pav.).
Keratocitai, dakriocitai kraujo tepinėliuose rasti daugiau nei 15 proc. šunų, o Heinso kūneliai rasti tik vienam šuniui ir tai rodo oksidacinius ląstelių pažeidimus, o tame pačiame kraujo tepinėlyje išryškėję dakrocitai gali būti randami esant hemangiosarkomai arba eritrocitų anomalijoms (15 pav.).
Pavienių dakrocitų buvimas šunų kraujo tepinėliuose yra fiziologiškai normalu ir nėra diagnostiškai reikšmingas rodiklis, didelis jų kiekis gali rodyti inkstų ligas (15 pav.). Kodocitai ir stomatocitai pas VA šunis buvo pastebėti 25 proc. kraujo tepinėlių ir gali būti sveikų šunų kraujyje, padidėjęs jų kiekis randamas esant geležies trūkumo anemijoms arba kaip artefaktas esant per dideliam kiekiui EDTA kraujo mėgintuvėlyje (16 pav).
20
30 30
10 10 5
25
15 15 10
0 15
5 5
15 20
30
25 25
5 0
5 20
5 5 5 5
0
