3. MATERIALI
E
METODI
3.1 Campionamento e trattamento
Uve appartenenti alle cultivar Trebbiano e Sangiovese, sono state raccolte nel periodo di settembre-ottobre 2007, presso l’azienda-agriturismo Fibbiano a Terricciola (Pisa).
Sono state scelte bacche il più possibile simili tra loro per dimensione, colore e grado di maturazione, le quali sono state poste all’interno di celle in cui si è verificata la circolazione forzata di etilene (1000 ppm) o CO2 (30%).
Questi trattamenti gassosi sono stati realizzati a temperatura ambiente per la durata di 3 giorni. Al termine del trattamenti, gli acini, hanno proseguito il processo di appassimento a temperatura ambiente per 9 giorni.
Parallelamente altri acini sono stati fatti appassire per 12 giorni a 10°C. Le bacche di controllo invece hanno subito un processo di appassimento naturale a temperatura ambiente.
Le bucce sono state separate dalle polpe ed entrambe sono state congelate con N2, dopo di che i campioni sono stati conservati a -80°C.
Sia le bucce che le polpe, prima di subire la fase di estrazione, sono state fatte liofilizzare per 48 ore.
3.2 Estrazione dei polifenoli dalla buccia
Campioni liofilizzati di 0,5 g l’uno sono stati pestati in mortaio con N2 fino ad essere ridotti in polvere. Successivamente tramite l’impiego di uno stirrer, le sostanze fenoliche sono state estratte con agitazioni della durata di 30 minuti ciascuna, utilizzando 30 ml di soluzione di estrazione (metanolo/acqua
centrifugazione (11.000 giri per 15 minuti, 4°C) per separare la parte liquida da quella solida.
La parte solida è stata risospesa in altri 30 ml di soluzione e di nuovo estratta e centrifugata.
Il processo di estrazione e centrifugazione è stato ripetuto 3 volte per ogni campione.
Dopo ogni centrifugazione il surnatante è stato raccolto in un pallone. Il surnatante totale ottenuto è stato poi portato al volume di 16 ml tramite evaporatore rotante, poi filtrato tramite filtri 0,45 µm Minisart, diviso in due aliquote da 8 ml ciascuna e conservato a -80°C.
3.3 Analisi spettrofotometriche UV/VIS
• Fenoli totali
I fenoli totali sono stati quantificati tramite il metodo del Folin-Ciocalteu, adattato ai nostri campioni, in accordo con Barbolan et al., (2003).
In una provetta di vetro si aggiungono: - 25 µl di campione;
- 1,25 ml di acqua distillata;
- 125 µl di reagente Folin-Ciocalteu; - attendere 8 minuti;
- 500 µl di una soluzione di sodio carbonato al 20%; - 600 µl di acqua distillata
per un volume finale di circa 2,4 ml.
Dopo 30 minuti di attesa, durante i quali la reazione si realizza e si stabilizza, il contenuto in fenoli totali è stato determinato come mg equivalenti di acido gallico, dopo aver misurato l’assorbanza a 750 nm in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nel visibile.
• Flavonoidi totali
I flavonoidi totali sono stati quantificati in accordo con metodo di Kim et al., (2003).
In una provetta eppendorf si aggiungono: - 100 µl di campione estratto;
- 60 µl NaNO2 al 5% (attendere 5 minuti); - 40 µl di AlCl3 al 10% (attendere 5 minuti); - 400 µl NaOH 1 M;
- 200 µl di acqua distillata.
Il contenuto di flavonoidi è stato misurato tramite lettura dell’assorbanza a 510 nm ed espresso come mg equivalenti di catechina in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nel visibile.
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• Flavan-3-oli totali
I flavan-3-oli totali sono stati determinati dopo derivatizzazione con p-(dimetilammino)-cinnamaldeide (DMACA), in accordo con Nigel e Glories (1991).
In una provetta eppendorf sono stati aggiunti: - 10 µl di campione estratto;
- 90 µl di metanolo;
- 250 µl di HCl (0,24 N in MetOH)
- 250 µl di soluzione DMACA (0,2% in MetOH). La reazione è stata fatta avvenire a temperatura ambiente.
Il contenuto di flavan-3-oli è stato espresso come mg equivalenti di catechina, determinati dopo lettura spettrofotometrica a 640 nm in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nel visibile.
• Tannini condensati
I tannini condensati sono stati determinati tramite il metodo descritto da Waterman e Mole (1994).
In una provetta eppendorf si sono aggiunti: - 50 µl di campione stratto;
- 700 µl di “butanol reagent” (ottenuto unendo 128 mg di FeSO4 x 7 H2O con 5ml di HCl concentrato, portato al volume di 100 ml con n-butanolo).
La miscela così ottenuta è stata riscaldata alla temperatura di 95°C per 45 minuti; dopo avere aspettato che questa si fosse raffreddata, sono stati aggiunti 250 µl di n-butanolo.
Il contenuto totale di tannini condensati è stato espresso come mg equivalenti di cinanidina dopo aver letto l’assorbanza a 550 nm in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nel visibile.
• Esteri dell’acido tartarico e flavonoli
Il contenuto di esteri dell’acido tartarico e di flavonoli è stato determinato in accordo al metodi proposto da Romani et al., (1996). In una provetta eppendorf sono stati aggiunti:
- 25 µl di campione estratto; - 225 µl di etanolo al 10%;
- 250 µl di una soluzione di HCl 0,1% in etanolo 95%; - 1 ml di HCl 2%.
Il contenuto di esteri dell’acido tartarico è stato quantificato dopo lettura dell’assorbanza a 320 nm, espresso come mg equivalenti di acido caffeico; il contenuto in flavonoli invece è stato determinato tramite lettura a 360 nm ed espresso come mg equivalenti di quercitina. La lettura dell’assorbanza è avvenuta in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nell’ultravioletto.
• Antocianine
Il contenuto di antocianine è stato determinato con il metodo di Ribereau-Gayon (2000).
In una provetta eppendorf si sono aggiunti: - 100 µl di campione estratto;
- 100 µl di etanolo con HCl 0,1 %; - 1 ml di HCl 2% (pH 0.8).
Dopo aver ben agitato si è lasciata reagire la miscela per 30 minuti. In un’altra eppendorf si sono aggiunti:
- 100 µl di campione estratto; - 100 µl di etanolo con HCl 0,1 %;
- 1 ml di un tampone (fosfato bisodico0,2 M, acido citrico 0,1 M, 30/70 v/v) (pH 3.5).
Dopo aver misurato l’assorbanza di entrambe le soluzioni alla lunghezza d’onda di 520 nm tramite l’uso di cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nel visibile si è sottratto il valore di assorbanza ottenuto dalla soluzione a pH 3,5 da quello ottenuto dalla soluzione a pH 0,8.
Il contenuto di antocianine è stato ottenuto attraverso la relazione [C(mg/L)=∆d x 388], utilizzando un coefficiente di estinzione molare
3.4 Analisi statistica
I valori ottenuti dalle nostre analisi, eseguite in tre repliche, sono stati valutati tramite analisi della varianza (ANOVA) con il Tuckey-Kramer test per stabilire la significatività dei dati ottenuti.
Per l’analisi statistica dei fenoli totali, dei flavonoli totali dei flavan-3-oli totali, dei tannini condensati liberi, dei flavonoli totali e degli esteri dell’acido tartarico è stata utilizzata l’ANOVA a due vie.
