3. MATERIALI E METODI
3.1 SOGGETTI SPERIMENTALI
Per questo lavoro di tesi sono stati impiegati come soggetti sperimentali ratti maschi albini, del ceppo Wistar, dell’età di circa 80 giorni e di peso corporeo medio di 340 grammi.
Gli animali erano stabulati singolarmente in gabbie di acciaio inossidabile poste in una stanza nella quale l’illuminazione seguiva il normale ciclo luce-buio diurno, e la cui temperatura era mantenuta costante a 20 ± 1 °.C. I ratti avevano sempre libero accesso al cibo e all’acqua.
3.2 PROCEDURE COMPORTAMENTALI
3.2.1 Apparecchiatura Sperimentale
Come apparato sperimentale di condizionamento è stato impiegato un modello di base di Skinner box (Modular Operant Cage, Coulbourn Instruments Inc.). Le dimensioni di questo apparecchio erano 29 x 31 x 26 cm. Il soffitto e due lati paralleli erano di pannelli di alluminio. Gli altri due lati, di cui uno apribile, erano di plastica trasparente. Il pavimento era composto di barrette di acciaio inossidabile, connesse con un dispositivo atto a produrre scosse elettriche (Grid Floor Shocker, Coulbourn Instruments Inc., Model E13-08). L’apparato era connesso con un dispositivo per programmare gli stimoli (Scatola di comando Arco 2340 – Ugo Basile) per determinare il numero e la durata delle scosse elettriche e la durata degli intervalli tra esse. L’apparato era posto in una cabina acusticamente isolata (3.5 x
1.8 x 2.1 m), mantenuta a una temperatura costante di 20± 1° C. Nella stanza l’intensità dell’illuminazione era di 60 lux.
Fig.3: Foto dell’apparato di condizionamento.
3.2.2 Procedura di condizionamento
Per ciascun animale da condizionare, il test del CFC è stato effettuato tra le ore 10.00 e le ore 13.00 per ridurre le influenze circadiane. L’ animale è stato estratto manualmente dalla gabbia di stabulazione, posto in un contenitore di plastica a pareti opache e trasportato dalla stanza di stabulazione alla appropriata stanza acusticamente isolata. Dopodichè, il soggetto è stato introdotto nell’apparato di condizionamento, dove veniva lasciato indisturbato per 3 min. Al termine, veniva somministrata una serie di 7 scosse elettriche (durata di 1 s, intensità di 1mA) intervallate 30 s l’una dall’altra. Trascorsi 2 minuti dal termine
della stimolazione, l’ animali era riportato nella propia gabbia di stabulazione, spendendo così un tempo totale di 8 minuti all’interno dell’apparato di condizionamento.
3.3 MANIPOLAZIONI CHIRURGICHE
3.3.1 Estrazione dei cervelli
Trascorse 48 ore dal condizionamento, gli animali, dopo essere stati anestetizzati con l’etere, un anestetico volatile, sono stati sacrificati per mezzo di decapitazione. In particolare, per questa tesi, abbiamo sacrificato sette animali sottoposti al contextual fear conditioning, che rappresentano i soggetti condizionati e sette animali naïve, mai entrati nell’apparato di condizionamento, che rappresentano il nostro controllo. Il cervello di questi animali è stato rimosso dalla scatola cranica e durante questa operazione veniva versata sul cervello soluzione fisiologica molto fredda. La bassa temperatura, oltre a rallentare i processi ossidativi, rende il tessuto nervoso più consistente.
3.3.2 Sezioni dei cervelli
Dopo essere stato rimosso dalla scatola cranica, il cervello di ciascun animale è stato posto su una superficie piana e sono state effettuate due dissezioni utilizzando una lametta ben affilata e sgrassata con alcool etilico al 95%. Abbiamo così ottenuto tre sezioni: una anteriore, una comprendente le strutture medio-temporali e una posteriore comprendente il cervelletto e le strutture sottostanti. Tutte le sezioni di tessuto cerebrale sono state poste in criovials e istantaneamente congelate in azoto liquido; successivamente sono state traferite e stoccate a -80° C.
Per i successivi esperimenti di biologia molecolare abbiamo utilizzato solo le sezioni medio-temporali, poiché comprendono le strutture dell’ippocampo e dell’amigdala, coinvolte nei fenomeni di apprendimento e memoria e in particolare nel contextual fear conditioning.
3.4 ESTRAZIONE DELL’RNA
L’RNA totale è stato isolato dalle sezioni medio-temporali dei cervelli di animali condizionati e naïve, ottimizzando la metodologia descritta da Chirwing, Przybyla, MacDonald e Rutter (1979), come descritto da Traina, Valleggi, Bernardi, Rizzo, Calvani, Nicolai, Mosconi, Durante e Brunelli (2004). Per minimizzare la contaminazione da RNAsi, sono state utilizzate soluzioni trattate con DEPC (dietilpirocarbonato). I campioni sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra-Turrax, immediatamente dopo essere stati immersi nel tampone GITC. L’omogenato è stato caricato su un gradiente di CsCl 5,7M. Il gradiente è stato centrifugato in ultracentrifuga Beckman L8-70M con rotore Kontron TY65 a 40.000 rpm a 20 °C per 24 ore. Il pellet è stato solubilizzato in H20DEPC e precipitato con 0,1
volumi di Sodio Acetato 3 M pH 6,4 e 2,2 volumi di Etanolo Assoluto per una notte a –20 °C. In seguito il campione è stato centrifugato a 13.000 rpm in centrifuga con rotore Kontron A8.24 per 30 minuti e il pellet lavato con Etanolo al 70% per eliminare i sali residui. L’RNA è stato quindi solubilizzato in un opportuno volume H20DEPC. I campioni sono stati conservati a
SOLUZIONI UTILIZZATE: Tampone GITC guanidina tiocianato 4 M sodio citrato 25 mM pH 7,0 β-mercaptoetanolo 0,1 M N- lauril sarcosinato 0,5% (p/v) Cloruro di Cesio 5,7M cloruro di cesio 5,7 M sodio acetato 25 mM pH 6,4
3.5 ISOLAMENTO DELL’mRNA PolyA
+Per l'isolamento dell’mRNA poliA+ è stato usato il PolyATtract mRNA Isolation Systems (Promega). Il sistema utilizza un primer oligo(dT) biotinilato che ha la capacità di ibridare ad alta efficienza con la regione al 3' poliA+ presente nella maggior parte dei mRNA maturi eucariotici. Gli ibridi possono poi essere recuperati usando streptavidina (che ha la capacità di legarsi alla biotina) associata a particelle paramagnetiche (PMP), ed un supporto magnetico. Circa 1 mg di RNA totale in un volume di 500 µl di H2ODEPC è stato denaturato
per 10 min a 65°C; sono stati aggiunti 3 µl di Biotinylated Oligo(dT) Probe e 13 µl di SSC 20x (NaCl 3 M; Na-citrato 0,3 M); il tutto è stato incubato a temperatura ambiente fino a raffreddamento per permettere la reazione di appaiamento. Contemporaneamente le particelle PMP sono state lavate e risospese in SSC 0,5x ed aggiunte poi alla reazione di appaiamento lasciando incubare a temperatura ambiente per circa 10 min per permettere il legame tra la biotina e la streptavidina. Catturate le particelle PMP e lavate con SSC 0,1x, sono stati in seguito eluiti gli mRNA risospendendo le particelle PMP in H2ODEPC e catturandole con il magnete, è stata recuperata e trasferita la
fase acquosa, contenente l’mRNA, in una nuova provetta priva di RNAsi. L’mRNA è stato poi precipitato e risospeso in 10 µl di H2O
3.6 CONTROLLO DELLA QUALITÀ DELL’mRNA
PolyA
+Gli mRNA polyA+ sono stati utilizzati per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA utilizzando la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH). Al fine di rendere la sottrazione efficiente è necessario valutare il grado di contaminazione dell’mRNA da parte dell’rRNA (Sävenstrand, Broschè, Ängehagen, Strid, 2000).
Per valutare la contaminazione dell’mRNA è stata effettuata una retrotrascrizione reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) su una piccola quantità di ciascun mRNA poliA+, utilizzando 2 set di primers specifici per l’rDNA di ratto (5,8 S; 18 S), le cui sequenze sono state trovate in banca dati (dati non mostrati).
3.7 COSTRUZIONE DELLE LIBRERIE
SOTTRATTIVE
Per ottenere sequenze di cDNA differenzialmente espresse è stato utilizzato il metodo della ibridazione soppressiva sottrattiva (suppression subtractive hybridization, SSH), la cui attuazione è stata resa possibile dall’impiego del PCR-Select
cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences). Questa metodologia permette di ottenere librerie di cDNA arricchite di trascritti presenti soltanto in uno dei due campioni comparati (Diatchenko, Lau, Campbell, Chenchik, Moqadam, Huang, Lukyanov S., Lukyanov K., Gurskaya, Sverdlov and Siebert, 1996) e presenta la peculiarità di riuscire ad isolare anche sequenze poco espresse (Gurskaya, Diatchenko, Chenchik, Siebert, Khaspekov, Lukyanov K., Vagner, Ermolaeva, Lukyanov S. and Sverdlov, 1996).La tecnica della SSH comprende due ibridazioni sottrattive, seguite da due reazioni di PCR. Nella figura 3 è rappresentato in modo schematico il processo della SSH: ci riferiamo con il termine tester al cDNA ottenuto dall’mRNA isolato dal cervello di ratto condizionato e con il termine driver all’cDNA ottenuto dall’mRNA del controllo (naïve). Tester A Tester B Ligation con adattatore 1 Ligation con adattatore 2R I IBRIDAZIONE I IBRIDAZIONE II IBRIDAZIONE d d c c b b a a Driver in eccesso Tester Driver denaturato in eccesso a, b, c, d, + e Amplificazioni utilizzando il primer (I PCR) Amplificazioni utilizzando i primers e (II PCR)
A Nessuna amplificazione o Amplificazione lineare B C D Effetto Soppressivo Nessuna amplificazione Amplificazione esponenziale E
Fig.4: Rappresentazione schematica della tecnica della SSH.
Il cDNA è stato sintetizzato a partire da 2 µg di mRNA di entrambi i campioni ed è stato digerito con l’enzima di restrizione Rsa I, che produce frammenti blunt-end. Il cDNA del tester è stato suddiviso in due aliquote ed a ciascuna è stato legato un diverso adattatore: 1 e 2R. Gli adattatori, mancando del gruppo fosfato al 5’, si legano solo all’estremità 5’ del cDNA.
Sono seguite due ibridazioni sottrattive successive. La prima è stata effettuata aggiungendo a ciascun tester denaturato, driver denaturato in eccesso. Durante questa fase la maggior parte dei trascritti del tester non differenziali, si lega al driver e la rimanente frazione del tester, che rimane a singolo filamento risulta arricchita di sequenze
differenzialmente espresse. Inoltre in questo passaggio la concentrazione delle sequenze poco e molto espresse viene normalizzata, perché, essendo la cinetica di ibridazione di secondo ordine, la riassociazione delle molecole più concentrate è più veloce. La seconda ibridazione è stata effettuata unendo, senza denaturare, i prodotti della prima ibridazione e aggiungendo driver denaturato in eccesso. Durante questo passaggio, oltre ad arricchirsi di sequenze differenzialmente espresse, la frazione a singolo filamento del tester 1 ibriderà con la stessa frazione nel tester 2R, formando una popolazione di sequenze differenzialmente espresse a doppio filamento caratterizzate dal fatto di essere asimmetricamente fiancheggiate dai due adattatori. Questo, insieme all’effetto soppressivo, rende possibile la loro amplificazione selettiva tramite due PCR successive utilizzando come primers sequenze complementari ai due adattatori.
primer sequenza legenda
PCR primer 1 5’–CTAATACGACTCACTATAGGGC- 3’ NESTED primer 1 5’ –TCGAGCGGCCGCCCGGCAGGT- 3’ NESTED primer 2R 5’ –AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT- 3’
Questa tecnica ha, quindi, permesso la costruzione di due librerie sottrattive:
Libreria Forward: ottenuta utilizzando come tester il cDNA trattato e come driver il cDNA controllo
Libreria Reverse: ottenuta utilizzando come tester il cDNA controllo e come driver il cDNA trattato
La libreria forward contiene i prodotti dei geni che sono attivati o modulati positivamente in seguito a CFC, mentre la libreria reverse contiene i prodotti dei geni inibiti o modulati negativamente in seguito a CFC.
E’ stata valutata l’efficienza di sottrazione per mezzo di una PCR utilizzando primer della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (G3PDH), gene costitutivo, come suggerito dal protocollo del PCR-Select
cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences).Gli amplificati ottenuti dalla seconda amplificazione sono stati inseriti nel vettore di clonaggio PCR® II-TOPO vector (TOPO TA Cloning® kit, Invitrogen).
I cloni sono stati recuperati in microtetraplates da 96 pozzetti contenenti 65 µl di LB A+, sono stati messi a crescere una notte in agitazione orizzontale a 37°C e, dopo l’aggiunta di 50 µl glicerolo, sono stati conservati a –20°C.
3.8 SCREENING PRIMARIO DELLE LIBRERIE
(COLONY PCR SCREENING)
3.8.1 Amplificazione delle sequenze differenziali
1µl di colonia è stato messo a crescere per 2 ore in 50 µl di LB A+ liquido a 37°C su agitatore orizzontale. La coltura è stata amplificata mediante PCR utilizzando EuroTaq (EuroClone), in un volume di 25 µl usando le seguenti condizioni: 1 µl della coltura è stato utilizzato come stampo, poi sono stati aggiunti 2,5 µl di tampone 10x PCR EuroClone; 0,25 µl di dNTP Mix 10 mM; 0,25 µl di Primer M13F 10 µM; 0,25µl di Primer M13R 10 µM; 2,5 µl di soluzione 25 mM di MgCl2; 0,25 µl di EuroTaq DNA Polymerase, 5U/µl; H2O sterile a volume. La reazione così composta è stata posta nel termociclizzatore (Applied Biosciences GeneAmp PCR System 2700) ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 10 min seguita da 30 cicli così composti: 94°C per 30 sec, 55°C per 30 sec, 72°C per 90 sec; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione finale a 72°C per 10 min.
I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio al 2% (vedi fig.5 par 4.1).
Primer M13 sequenze
M13 L 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’
M13 R 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
3.8.2 Spot Blot del prodotto di PCR
1 µl del prodotto di PCR di ciascun clone è stato denaturato (95oC per 1 min) e trasferito su membrana Hybond N+ (Amersham Biosciences). Le membrane così ottenute sono state fissate mediante Hoefer™ UVC 500 cross-linker (Amersham Biosciences).
Lo screening primario, mediante la tecnica degli Spot Blot, ha permesso di eliminare i cloni falsi positivi, interpretando i risultati secondo il protocollo descritto nel PCR Select Differential Screening kit User Manual (BD Biosciences). Dopo aver individuato i cloni candidati ad essere differenzialmente espressi, si è passati all’isolamento del DNA plasmidico e quindi al sequenziamento, effettuato con sequenziatore automatico.
3.8.3 Marcatura delle sonde
Le membrane sono state ibridate utilizzando come sonde i cDNA che costituiscono le liberie forward (sonda T-C) e reverse (sonda C-T) marcate con marcatura non radioattiva, utilizzando DIG DNA Labelling Kit (ROCHE).
Per la marcatura del cDNA circa 0,1-1µg del prodotto della seconda PCR sono stati digeriti con Rsa I per eliminare gli adattatori 1 e 2R da ogni sequenza di cDNA .
Per la marcatura del cDNA sono stati denaturati circa 0,1-1 µg di cDNA digerito in 15 µl di H2O (100°C) e dopo averli raffreddati in ghiaccio sono stati aggiunti:
2 µl di esanucleotidi, 2 µl di dNTP, 1 µl di Klenow. Dopo una incubazione per tutta la notte a 37°C, la reazione polimerasica è stata interrotta aggiungendo 2 µl di Na2EDTA 0,2 M (pH 8,0).
Il cDNA è stato precipitato con 2,5 µl di LiCl 4 M, 75 µl di Etanolo Assoluto freddo; questa reazione è stata lasciata per 1 ora a -80°C. Successivamente il cDNA è stato centrifugato a 12.000 g per 40 min a 4°C ed il pellet è stato lavato 2 volte con etanolo al 70%. Dopo i lavaggi il pellet, asciugato all'aria, è stato solubilizzato in 50 µl di H2O sterile.
3.8.4 Ibridazione su filtro
La membrana è stata preibridata per circa 2 ore nell'apposito termostato (20 ml di soluzione di preibridazione per circa 100 cm2 di membrana) alla temperatura di 68°C.
La sonda marcata è stata denaturata in H2O a 100°C per 10 minuti e poi posta immediatamente in ghiaccio. Successivamente è stata preparata la soluzione di ibridazione aggiungendo la sonda marcata (25 ng/ml) a una nuova soluzione di preibridazione. Si è proceduto quindi con l’ibridazione.
Nella soluzione di preibridazione e in quella di ibridazione sono stati aggiunti i “competitori”, ovvero oligonucleotidi con sequenza complementare a quella degli adattatori utilizzati per la costruzione delle librerie sottrattive (vedi fig.3) ad una concentrazione finale pari a 0,1 µM.
Questo è stato necessario al fine di evitare ibridazioni tra eventuali adattatori rimasti nelle sonde T-C e C-T ed il cDNA in esame.
La sonda è stata recuperata e le membrane sono state sottoposte ad una serie di lavaggi a diversa stringenza, in dipendenza dell'omologia della sonda e della sua composizione (% in G+C).
La membrana è stata lavata due volte in SSC 2x/SDS 0,1% per 20 min a temperatura ambiente, in agitatore orizzontale.
Poi, aumentando la stringenza, è stata lavata due volte in SSC 0,1x/SDS 0,1% per 20 min a 68°C, in agitatore orizzontale. Quindi è stata equilibrata per 5 min con il tampone 1 e incubata per 1 ora in lenta agitazione con il tampone 2. Successivamente è stata posta per 30 min in lenta agitazione in una soluzione contenente l'anticorpo anti-digossigenina, diluito 1:10.000 nel tampone 2. In seguito sono stati effettuati, 3 lavaggi di 15 min nel tampone 1 a cui è stato aggiunto Tween 20 ad una concentrazione finale pari allo 0,3%; quindi la membrana è stata equilibrata per 5 min con il tampone 3.
Utilizzando il metodo della visualizzazione chemioluminescente si è proceduto in camera oscura cospargendo la membrana, adagiata in una pellicola trasparente, con Lumigen CPD* (ROCHE) diluito 1:100 nel tampone 3 (circa 1 ml per membrane di 100 cm2).
Il tutto è stato lasciato al buio per 5 min a temperatura ambiente, quindi è stata tolta la soluzione in eccesso. Sulla membrana è stata posta una lastra radiografica Hyperfilm
β
-max (Amersham Biosciences). Questa è stata lasciata in esposizione per circa 2 ore. Successivamente la lastra radiografica è stata sviluppata e fissata con le soluzioni Kodak (seguendo le istruzioni fornite dalla ditta).SOLUZIONI UTILIZZATE
:
Tampone 1
NaCl 0,15M
Acido maleico 0,1M
Portare a pH 7,5 con NaOH e autoclavare
Sciogliere il Blocking reagent fornito dalla ditta nel tampone 1 Conservare a –20°C Soluzione di preibridazione SSC 5x Blocking reagent 1% SLS 0,1% SDS 0,02% Tampone 2
Blocking Stock Solution, diluita 1:10 nel tampone 1
Tampone 3 Tris-HCl 100 mM, pH=9,5 NaCl 100 mM SSC 20x NaCl 3 M Na-Citrato 0,3 M
Portare a pH 7,0 con acido citrico e autoclavare
SDS 10%
3.9 Preparazione del DNA plasmidico su piccola
scala (MINIPREP)
Il DNA plasmidico è stato estratto e purificato utilizzando Wizard PLUS SV Minipreps DNA Purification System.
I cloni sono stati inoculati in grainer contenenti 10 ml di LB liquido e ampicillina alla concentrazione di 50 µg/ml e fatti crescere a 37°C su agitatore rotante per una notte. Per ogni clone, 5 ml di coltura sono stati centrifugati a 10000 rpm per 5 minuti, in centrifuga da tavolo ALC 4226 in un rotore ALC 5531 (questo tipo di centrifuga viene utilizzato per tutta la preparazione). Successivamente le cellule sono state risospese delicatamente in 250 µl di Cell Suspension Solution, fornito nel kit. Sono stati poi aggiunti 250 µl di Cell Lising Solution, fornito nel kit; il campione è stato delicatamente mescolato per inversione, e lasciato a temperatura ambiente per 5 min. Sono stati aggiunti 10 µl di Alcaline Protease Solution e il campione è stato delicatamente mescolato per inversione e lasciato a temperatura ambiente per 5 min.
La Alcaline Protease inattiva le endonucleasi e altre proteine rilasciate durante la lisi delle cellule batteriche che potrebbero danneggiare la qualità del DNA isolato. Al campione sono poi stati aggiunti 350 µl di Wizard Plus SV Neutralization solution ed immediatamente il campione è stato mescolato delicatamente per inversione. Il tutto è stato centrifugato a 14.000 g per 1 min. Il surnatante così ottenuto è stato posto delicatamente sulle colonnine fornite nel kit e centrifugato a 14.000 g per 1 min. Sono stati aggiunti 750 µl di Column Wash solution, fornito nel kit, e centrifugato a 14.000 g per 1 min. La
procedura di lavaggio è stata ripetuta utilizzando 250 µl di Column Wash solution e centrifugando le colonnine a 14.000 g per 2 min. Le colonnine sono state poste in provette sterili e si è proceduto all’eluizione del DNA con 75 µl di H2O sterile. L’operazione è stata ripetuta una seconda volta Si è proceduto alla quantizzazione del materiale allo spettrofotometro e su gel di agarosio.
SOLUZIONI UTILIZZATE
:
Ampicillina
soluzione stock 10mg/ml solubilizzata in Etanolo 70% LB (Luria-Bertani) liquido Triptone 1,0% Yeast extract 0,5% NaCl 1,0% pH 7,0 con NaOH
3.10 ANALISI DELLE SEQUENZE
Le sequenze nucleotidiche dei cloni selezionati sono state analizzate mediante comparazione in banca dati (GenBank) con i programmi disponibili in rete:
FASTA:(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/)
BLAST: (http://www.ch.embnet.org/software/aBLAST.html) ADVANCED BLAST:
3.11 ANALISI DI ESPRESSIONE TRAMITE RT-PCR
RELATIVA
La retrotrascrizione con la successiva PCR (RT-PCR) permette l’amplificazione di mRNA cellulare: vista l’elevata sensibilità, l’RT-PCR permette di valutare anche cambiamenti piccoli ma fisiologicamente rilevanti nell’espressione genica (Gause W.C. and Adamovicz, 1995).
L’ RT-PCR relativa consente di comparare la quantità di un trascritto tra più campioni mediante la coamplificazione della sequenza di interesse e di un controllo interno al fine di normalizzare le differenze tra i vari campioni dovute alla qualità dell’ RNA totale, alla variabilità dell’efficienza dell’RT o ad una quantizzazione non accurata (Gause and Adamovicz, 1995). Per questo tipo di PCR quantitativa è necessario che i primers per l’amplificato del gene di interesse (target) e quelli per il controllo interno siano compatibili e che i pesi molecolari del target e del controllo interno siano simili ma tali da permettere la distinzione degli amplificati su gel d’agarosio. Per questo tipo di analisi è necessario che la reazione di PCR venga analizzata durante la fase lineare dell’amplificazione prima che entrambi i prodotti di amplificazione raggiungano la fase di plateau ossia di saturazione (Prediger, 2001)
La retrotrascrizione è stata eseguita con il kit SuperScript™ II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) e con l’ Oligo(dT)12-18 Primer
(Invitrogen) seguendo le istruzioni fornite dalla ditta, partendo da RNA totale (2 µg) isolato dal cervello di ratto condizionato
e dal controllo. Al fine di evitare errori di quantificazione dovuti ad una diversa concentrazione di RT o errori di pipettamento, è stato opportuno utilizzare un controllo interno, che viene coamplificato con il gene in esame. Come controllo interno è stata utilizzata la G3PDH che, essendo un gene costitutivo, presenta un’uguale espressione nel trattato e nel controllo. Per amplificare le sequenze dei cloni in esame sono stati utilizzati primers gene-specifici; le sequenze dei primers sono riportate nella tabella X. I primers sono stati scelti in modo da amplificare un frammento di peso molecolare di 452 pb per la G3PDH, di 315 pb per 1VA11, 298 pb per 1VB12 e 348 pb per 1VC10.
Per ogni reazione di amplificazione da 25 µl sono stati utilizzati 1 µl di retrotrascritto come stampo; 2,5 µl del tampone di reazione 10x; 0,625 µl di soluzione di MgCl2 50mM; 0.5 µl di dNTP Mix 10mM; 1,25 µl di ogni primer 10µM, 0.25 µl Euro Taq (EuroClone) 5U/µl, H2O sterile a volume. La reazione così composta è stata posta nel termociclizzatore ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 4 min seguito da cicli così composti: 94°C per 30 sec, 60°C per 30 sec, 72°C per 30 sec per un campione di cDNA trattato e un campione di cDNA controllo; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione a 72°C per 7 min a tutti i campioni.
Per conoscere il punto di saturazione, ovvero il punto in cui l’aumento del prodotto di amplificazione non è più proporzionale alla quantità di stampo iniziale, è stata effettuata una PCR dalla quale sono state sottratte aliquote di campione al termine di cicli successivi; le aliquote sono state immediatamente trasferite in un termociclizzatore adiacente dove hanno subito la fase di estensione finale di 7 min a 72°C. In
questo modo è stato possibile stabilire il numero di cicli appropriato per una valutazione quantitativa relativa mediante questa tecnica (nel nostro caso 24 cicli). Per ogni gene in analisi sono state fatte prove multiple di RT-PCR relativa utilizzando come stampo cDNA ottenuti sia da retrotrascrizioni diverse sia diverse estrazioni (in particolare per il gene 1va11 sono state ripetute 4 prove mentre per i geni 1vb12 e 1vc10 sosno state fatte 5 prove)
I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio 3% colorato con Etidio Bromuro. Il gel è stato fotografato e gli amplificati sono stati quantizzati mediante il programma di acquisizione per immagini Quantity One-4.4.1 (basic) BioRad.
Tab. 3: Sequenze dei primer utilizzati per le RT-PCR relative.
PRIMER SEQUENZE
G3PDH L 5’- ACCACAGTCCCATGCCATCAC-3’ G3PDH R 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ 1VA11 L 5’-CACAAAGTCCCTTTGGGAAG-3’ 1VA11 R 5’-CGAAGCCCACATAATCCAAT-3’ 1VB12 L 5’-TCTCCGGAAAGGGTTTTCTT-3’ 1VB12 R 5’-CTCGCCCATCAGTTCACTTT-3’ 1VC10 L 5’-GGCTCCAGAGAGAAGGGAAT-3’ 1VC10 R 5’-AAACTGTTGGGTTATCATTGGAA-3’ 3.11.1 Analisi statistichePer normalizzare i campioni relativamente alla quantità di RNA totale utilizzato e alla efficienza della sintesi di cDNA, è stato fatto il rapporto tra le intensità delle bande di amplificazione dei vari
campioni e l’intensità delle bande dei prodotti di amplificazione della G3PDH. Questo rapporto è stato calcolato per 4 esperimenti indipendenti per 1VA11; per 5 esperimenti indipendenti per 1VB12 e 1VC10. E’ stata effettuata poi l’analisi statistica con il Mann-Whitney test per il clone 1VA11 e con il T-test per i cloni 1VB12 e 1VC10.
